Možnosti diagnostiky zápalových ochorení čreva v skríningunepriamou imunofluorescenciou (NIF)P. Gomolčák, K. Beráková,P. Gomolčák, K. Beráková, D. PaulenováD. Paulenová

Cytopathos, spol. s r.o. Bratislava Košice, 25.septembra 2010

Princíp a definícia Princíp a definícia

NIFNIFDetekcia cirkulujúcich

orgánovo špecifických a orgánovo nešpecifických

protilátok na tkanivových rezoch, bunkových náteroch a

bunkových kultúrach nepriamou

imunofluorescenčnou metódou(NIF) je IN SITU vyšetrenie, pri ktorom dokazujeme prítomnosť

protilátok v sére pacienta demaskovaním komplexu pomocou fluorochrómom

značenej protilátky.

29%

9%62%

Choroby traviacej sústavy Špecif a nešpecif ochoreniaIné vyšetrenia

3%11%

20%

66%

Crohnova choroba Ulcerózna kolitídaCeliakia Iné špecif. a nešpec. ochorenia

Podiel ochorení tráviacej sústavy v biopsií

Podiel špecifických a nešpecifických zápalových ochorení čreva na všetkých

ochorenia tráviacej sústavy

Cytopathos, spol. s r.o.01.01.2010 – 31.08.2010

Chronické zápalové ochorenia neurčitej etiológie sú vysoko komplexné a úzko integrované zahrňujúce

väzby:

-genetické

-environmentálne

-neuroendokrinné

IBD je chronické ochorenie čreva IBD je chronické ochorenie čreva neznámej etiológie zahrňujúce dve neznámej etiológie zahrňujúce dve

hlavné entity : hlavné entity :

Ulcerózna kolitída (UC) Crohnová choroba (CD)

klinických prejavov laboratórnej diagnostiky radiológie endoskopie histopatológie serológie

Diagnostika IBD a diferenciácia medzi CD a UC sú založené na kombinácii

výsledkov:

10 – 17 % pacientov nedeterminovaná kolitída (IC).

Prítomnosť protilátok a autoprotilátok (ASCA, ANCA, cirkulujúci komplement fixačný faktor, anti-F(ab)2, a iné),

potenciálne autoantigény (hTM5, IFP, kardiolipin, pankreatický proteín a iné),

aktivovaný komplement, mikrocievach mukózy, črevnom epiteli v spojení s IgG1 protilátkami,

neboli nájdené orgánovo – špecifické protilátky.

Nerovnováha Th1/Th2 lymfocytov, Th1 odpoveď s vysokou produkciou IL-12, IL-18, a interferon-γ pri CD,

Th2 odpoveď CD1d-restricted NK T bunkami s vysokou produkciou IL-13 pri UC

aktivácia dendritických buniek,

Črevná flóra „No bacteria, no colitis“

AUTOIMUNITNÝ IMUNITOU OVPLYVNENÝ

Zhonghui Wen., Claudio Fiocchi:

Inflamatory bowel disease: Autoimmune or immune-mediated pathogenesis Clin. Develop. Immunology., 9/10, 2004, Vol. 11(3/4), pp195-204.

AutoprotilátkyAutoprotilátky pri IBD pri IBD

ANCA (NSA) – neutrophil – specific antibodiesANCA (NSA) – neutrophil – specific antibodies ASCA – Anti Saccharomyces ceravisiae antibodiesASCA – Anti Saccharomyces ceravisiae antibodies AGCA (GAB) – Anti goblet cells antibodiesAGCA (GAB) – Anti goblet cells antibodies APACA (AICA) - Anti pancreas acinus cell antibodies APACA (AICA) - Anti pancreas acinus cell antibodies AhTMA – anti human tropomyosin antibodies AhTMA – anti human tropomyosin antibodies

AECA (AEndA) – Anti endothelial cells antibodiesAECA (AEndA) – Anti endothelial cells antibodies

ANA - anti nuclear antibodiesANA - anti nuclear antibodies

pANCA pANCA (NSA) (NSA) neutrophil – specific antibodiesneutrophil – specific antibodies

Pacienti s UC, ktorí majú zároveň PSC - frekvencia NSA takmer 85 %. Pacienti s UC bez súčasnej PSC - frekvencia NSA je okolo 15 %. Takmer 50 %pacientov nedeterminovanou kolitídou nemá ANCA ani ASCA protilátky.Budúce štúdie by mali objasniť, či táto skupina pacientov nereprezentuje samostatnú klinickú entitu.

Hlavné autoantigény asociované s UC sú lokalizované na periférii jadier neutrofilov. NSA väčšinou nereagujú s azurofílnymi granulárnymi komponentami PR3 a MPO.

atyp. pANCA cANCA

Orgánovo – špecifické autoprotilátky

Vybrané autoimunitné ochorenia a asociovane protilátky (upravené)

zdroj: EUROIMMUN

Diagnóza TYP Prevalencia Antigén

Ulceratívna kolitída       pANCA 50% - 80% cathepsin G, laktoferín

        cANCA 43% BPI

Crohnova choroba       pANCA 10% - 20% neznámy

Wegenerova granulomatóza            

  iniciačná fáza     cANCA 50% PR3

        pANCA 15% MPO

  aktívna fáza     cANCA 90% PR3

  remisia     cANCA 30% - 40% PR3

Churg-Strauss syndrom       pANCA 60% MPO

        cANCA 0% - 30% PR3

Mikroskopická palyangitída       pANCA 75% MPO

        cANCA 15% PR3

Pauci-imunna nekrotizujúca GN (RPGN)       pANCA 60% - 90% MPO

PSC       pANCA 60% cathepsin G

        cANCA 35% BPI

RA       pANCA 20% laktoferín, elastáza, cathepsin G, lyzozým

Reumatoídna vaskulitída       pANCA 50% laktoferín, elastáza, cathepsin G, lyzozým

SLE       pANCA 25% laktoferín, elastáza, lyzozým

Feltyho syndrom       pANCA 50% laktoferín, elastáza, cathepsin G, lyzozým

AGCA (GAB)Anti goblet cells antibodies

AUTOANTIGÉN

V roku 1959 Broberger a Perlmann autoprotilátky proti zložkám mucínuprodukovaného črevnými GC

Metódou voľby pre dôkaz AGCA je nepriama IFL metóda na nefixovanom ľudskom fetálnom čreve skupiny „0“. Fetálne črevo eliminuje nešpecifickú reakciu proti bakterialným a potravinovým antigénom. V pozitívnych prípadoch sú AGCA viditeľné v epitelových bunkách sliznice čreva. Testy môžeme vykonávať aj na bukových kultúrach adenokarcinómu hr. čreva línia HT29-18-N2, ktoré diferencijú do mucin produkujúcich buniek.

AGCA (GAB)AGCA (GAB)Anti goblet cells Anti goblet cells antibodiesantibodies

Goblet cells majú makro aj mikroskopicky rovnakú lokalizáciu ako ochorenie.V tenkom čreve sú menej časté, ale jedna vedľa druhej v hrubom čreve smerom k rektu. Najvyšší výskyt pohárikovitých buniek je v kryptách. Deplécia GC je charakteristickejším znakom pri UC ako pri CD.

Doposiaľ nie je jasné čí AGCA majú primárnu alebo sekundárnu úlohu v patogenéze UC.Sú AGCA jednoducho epifenoménom spojeným s T-ly riadenou deštrukciou GC?Primárny efekt je oveľa pravdepodobnejší, pretože AGCA majú nízky výskyt u pacientov s rozvinutou aktívnou formou UC. Sekundárny efekt môže spočívať v porušení funkcie mucínu ako ochrannej bariery.

HT29-18-N2

CK

Vi Ak

TropomyozínAhTM5

TM

Tropomyozíny sú IFP nájdeme vo všetkých eukaryotických bunkách a sú asociované s aktínom.

Nárast protilátok bol zaznamenaný pri UC, RA, SS

Popísaných je 5 izoform hTM1 – 5

izoformy hTM1, hTM2 a hTM3 sa vyskytujú hlavne v hladkej svalovine tenkého čreva a v stenách ciev nie však v epiteli.

izoforma hTM4 je lokalizovaná v bunkách endotelu a bazálnej membráne epitelu hrubého čreva

TropomyozínAhTM5

AhTM5 sú špecifické IgG protilátky v sére pacientov s UC, ktoré indukujú vznik C3b depozít a deštruujú epitel čreva.

-hTM5 je predominantná izoforma epitelu hrubého čreva a niektorých

extraintestinálnych orgánov

-nevyskytuje sa v epiteli tenkého čreva, a ezofágu, žlčových kanálikoch

- silno reaguje s epitelom kože, extrahepatálnych žlčovodov, veľkých

interlobárnych duktoch a s epitelom močového mechúra.

IF test 79 % senzit., 100 % špecifitu

ULCERATÍVNA KOLITÍDA

AGCA pANCA/NSA

76 %28 % 83 %

10 %

2 %

ASCA

AICA

0 %

1 %

darcovi krvi

IgM

13 %4 % 2 %6 %

IgA IgG

ASCA

8 % 23 %69 %

IgA IgG

AGCA

3 % 39 %58 %

IgA IgG

pANCA

hTM5 64%

asociovaný s aktivitou ochorenia

APACA APACA (AICA)(AICA)pancreas acinus cell pancreas acinus cell antibodiesantibodies

Protilátky proti sekréčnym komponentom pankreasu sú pravdepodobne epifenoménom , ktorý môže byť spôsobený krížovou reakciou s iným antigénom napr. bakteriálneho pôvodu a sú zodpovedné za spustenie

a udržanie zápalu čreva s adjuvantným efektom v dôsledku čoho sú pacienti silno imunizovaní proti baktériam črevnej flóry.

AICA môžu mať význam pri vyhľadávaní pacientov so skorým alebo stredným stupňom CD.

AICA protilátky neboli nájdené ani u jedného pacienta s UC resp. negat. kontrol.

APACA (AICA)pancreas acinus cell antibodies

Typ II.Typ I.

Drop-like staining Speckled staining

Seibold, F., Scheurlen, M., Muller, A. et al. Impaired pancreatic function in patients with Crohns disease with and withoutpancreatic abnormalities. J Clin Gastroenterology, 1996, 22(3), 202-206.Seibold, F., Mork, H., Tanza, S.et al.: Pankreatic autoantibodies in Crohns disease: a family study. Gut, 1997, 40, 481-484.

-obidva typy sú špecifické pre CD

- vyskytujú sa aj u prvostupňových príbuzných pacientov s IBD

ASCAASCASaccharomyces Saccharomyces ceravisiae ceravisiae

ASCA je skôr asociovaná s ťažkým ochorením tenkého čreva, s penetráciou CD a môže byť diagnostikovaná aj roky pred manifestáciou klinických

prejavov.

ASCA protilátky sú namierené proti zbytkom manózy polysacharidu mannan v bunkovej stene kvasiniek Saccharomyces cerevisiae.

Objavujú sa tiež žvýšené hodnoty protilátok proti pektínu a iným polysacharidom.

CROHNOVA CHOROBA

ASCA

ASCAAICA

39 % 80 % 67 %

7 %

pANCA/NSA

0 % 2 %

darcovia krvi

9 % 36 %55 %

IgA IgG

AICA

IgM

26 % 2 %

IgA IgG

31 % 14 %55 %

6 %

8 %

2 %

anti-laminaribiosid carbohydrat – IgG (ALamCA) S.c.

anti-mannobiosid cyrbohydrat – IgG (AManCA) S.c.

anti-chitobiosid carbohydrat – IgA (AChiCA)

Anti-glykanové protilátkynové možnosti diagnostiky IBD.

Pacienti s IBD s pozitivitou protilátok ALamCA, AChiCA, alebo ASCA

mali CD so senzitivitou 77,4 % a špecifitou 90,6 %.

Pri pozitívite najmenej dvoch týchto protilátok sa špecifita zvýši na 99,1 %.

44 % ASCA negatívnych sér pacientov s CD obsahuje ALamCA, alebo AChiCA.

Ďakujeme Ďakujeme

za pozornosťza pozornosť