München, den 03. Mai 2008

Standardisierung der HbA1c Bestimmung

- Theorie und Praxis

Albrecht Pfäfflin

Zentrallabor/Med.Klinik Abt. IV, Tübingen

Fallbeispiel

• Patient wird am selben Tag in verschiedenen Laboratorien bzgl. HbA1c untersucht:

Labor A: 7,3%

Labor B: 7,7%

Labor C: 8,5%

• Therapie beibehalten oder intensivieren?

Ergebnisse Ringversuch 1/2003 des Referenzinstitut für Bioanalytik der DGKL

Plan

• Einleitung• Methoden-Vergleichbarkeit • Möglichkeiten zur Standardisierung

– Referenzmethode– Mittels Kalibration– Designated comparison method (DCM)

• Probleme• Zusammenfassung

• Einleitung

Plan

stabiles Addukt von D-Glukose

am N-terminalen Ende der ß-Kette des HbA0

=N-(1-deoxyfructosyl)haemoglobin

Definition HbA1c:

• Erstbeschreibung (1955) von Glykiertem Hämoglobin

• Differente Methoden ergeben nicht-vergleichbare Werte

• Durch einheitliche Kalibration: interlabor-Variations-Koeffizienten (VK) von 16% auf 9% gesenkt.

• Trotzdem sind die Werte nicht ausreichend vergleichbar

• 1994 Gründung des National Glycohemoglobin Standardization Program (NGSP)– 2001: im Rahmen der NGSP-Aktivitäten: VK auf <5% gesenkt.

Literatur: Kunkel 1955 Science ; Weykamp CC 1995 Clin Chem; Little 2001 Clin Chem

Rückblick:

Warum ist HbA1c nicht einfach standardisierbar?

• Analyt aufgrund physikalischer Eigenschaften charakterisiert

• unspezifische Substanzen können diese Eigenschaften imitieren

• Vergleichbarkeit innerhalb einer Methode gut

• Vergleichbarkeit zwischen Methoden schlecht

• alle müssten das wirklich wollen

• Verantwortung des Laborleiters/der Laborleiterin, welchen Kalibrator er/sie verwendet.

• ca. 70 verschiedene kommerzielle Methoden zur HbA1c-Messung

Warum ist HbA1c nicht einfach standardisierbar?

• Methoden-Vergleichbarkeit

Plan

Webseite Instand: VK bei Ringversuchen

• VK=(SD/MW)*100 SD=Standardabweichung MW= Mittelwert

• Bei Zielwert HbA1c 10%: SD von 0,7% • „kritische Differenz“: 3 SD nicht sicher unterscheidbar:

Werte zwischen 9,0 und 11,0 % nicht sicher unterscheiden

• Fazit: der VK sollte möglichst klein sein; • 2% sind vorgeschlagen von EASD, ADA, IDF• Ziel: um Unterschiede von 0,5% sicher zu erkennen• Diese Präzision ist interlaboratorisch schwer erreichbar

Rechenbeispiel: Variationskoeffizient (VK) von 7%

Gesetzliche Vorgaben: Deutschland: Richtlinien der Bundesärztekammer

Vom 24.08.2001Weiterhin übergangsweise gültig bis 31.03.2010Richtigkeit 8%, Unpräzision 6%, max. Abweich.

Einzelwert/Ringversuch: 20%

Vom 23.11.2007Gültig seit 01.04.2008Zulässiger quadratischer Mittelwert der Messabweichung (Streuung

der Messwerte um den wahren Wert): 10%Max. Abweichung Ringversuch: 18%

Plan

• Möglichkeiten zur Standardisierung– Referenzmethode– mittels Kalibration– Designated comparison method (DCM)

• Von IFCC-Experten entworfene, geprüfte und publizierte Goldstandard-Methode zur Bestimmung von HbA1c

Referenzmethode für HbA1c

Definition:

Literatur: Jeppsson et al. (2002) Approved IFCC Reference Method for the measurement of HbA1c in Human Blood. CCLM 40(1)78-89

Referenzmethode für HbA1c

Prinzip:

Hemolysate

Enzymatic Cleavage

HPLC-CapillaryElectrophoresis

HPLC-MassSpectrometry

Fig.1 Flow chart of the reference method procedure

Vorbereitung: EDTA-Blut wird mit NaCl-Lösung gewaschen und hämolysiert

Dann: Mittels Endopeptidase Glu-C werden 6 Aminosäuren abgespalten

Val

HbAo-peptide

HbA1c-peptide

Gluc

Glu-C

His Leu Thr Pro Glu Glu Lys Ser

Val His Leu Thr Pro Glu Glu Lys Ser

. . . .

. . . .

Fig.2 Principle for the proteolytic digestion of the haemoglobin chains

•Prinzip: Analyt wird ionisiert, verdampft und mittels Masse-Ladungsverhältnis analysiert

Literatur: Kobold et al Clin Chem, 1997

Referenzmethode für HbA1cESI-MS ( =Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie):

Fig. 4 Electrospray mass spectra of synthetic N-terminal peptidesof the b-chain of hemoglobin

Referenzmethode für HbA1c

Probleme (I) der Referenzmethode:

Die Werte sind ca 1,5% niedriger

Literatur: Miedema 2004 Diabetologia

Referenzmethode für HbA1c

Die Referenzmethode soll gar nicht in den Routinelabors angewendet werden (zu aufwändig)

Unklar: ob diese exakte Analytik tatsächlich die prädiktive Aussage der alten DCCT/UKPDS-Messungen hat

die Methode gibt es seit 6 Jahren, aber in der Praxis hat sich nichts wesentliches geändert

Probleme (II) der Referenzmethode:

•Mittels einer Probe mit bekanntem Zielwert: sollen die verschiedenen Methoden abgeglichen werden

• Japanese diabetes society (JDS): Kalibratoren wurden produziert und einheitlich verwendet. Methoden für die Produktion eines Referenzmaterials sind beschrieben. •Problem: Aufwendige Herstellung der Kalibratoren

Einheitliche Kalibrierung für HbA1c

Prinzip:

Literatur: Finke Clin Chem Lab Med 1998

•Mittels einer (willkürlichen) “Referenz”-methode werden Methodenvergleiche durchgeführt, dadurch können Regressionsgleichungen ermittelt werden, um die Werte ineinander umzurechnen.

•Vorteil: bietet sich an, da der Analyt mit unterschiedlichen Methoden gemessen wird, und Referenzmaterialien unzureichend verfügbar sind.

Designated Comparison method

Prinzip:

•NGSP seit 1994•“Referenz”-methode:

Biorex 70-Ionenaustauschchromatographie in speziellen Referenzlaboratorien durchgeführt.

•Problem: die Methode ist unspezifisch

Designated Comparison method

Wesentliche praktische Anwendung:

Designated Comparison method

•CPRL: zentrales Labor, produziert den Kalibrator und erfüllt harte QC-Richtlinien•PRL: primäre Referenzlaboratorien•SRL: sekundäre Referenzlaboratorien

•Müssen jeweils in definierten Zeiten eine definierte Anzahl von Proben messen und dabei definierte QC-Kriterien erfüllen.

•Herstellerzertifikation•Ringversuchswesen

Designated Comparison method

Was macht das NGSP:

•Swedish standardization scheme

•“Referenz”-methode:

Mono S-HPLC

•Problem: die Methode ist auch unspezifisch, deutlich überlegen gegenüber Biorex 70

Designated Comparison method

Weitere praktische Anwendung:

Vergleich Referenzmethode vs. Designated Comparison method/einheitliche Kalibrierung

Literatur: Hoelzel Clin Chem 2004

• Probleme

Plan

Organisationsstrukturen

• Klinisch-Chemische Vereinigungen: – IFCC, daraus Referenzmethoden-Entwicklung– AACC, daraus NGSP hervorgegangen– DGKL

• Klinische Vereinigungen: – ADA– EASD– IDF– DDG

Literatur: Mosca et al. Clin Chem Lab Med, 2007

• IFCC-working-group HbA1c– Gegründet 1995– Referenzmaterialien hergestellt 1998– Entwicklung der Referenzmethode 2002– Verschiedene Vergleichsstudien wurden

durchgeführt– Sekundäres Referenzmaterial wurde hergestellt

Literatur: Consensus Committee, Diabetes Care, 30, 2007

• Aktuelles consensus-statement 2007:

• ADA/EASD/IDF/IFCC– HbA1c-Werte weltweit einheitlich reportieren– IFCC-Referenzmethode ist Basis für Standardisierung– Soll als mmol/mol und % (NGSP) angegeben werden– Falls Studien dokumentieren:

Umrechnung des HbA1c-Wertes in „mean blood glucose“

Harmonisierungsbestreben von verschiedenen Organisationen

Es gibt zwischen den verschiedenen Organisationen einen Dialog:

Die IFCC-Werte– Könnten zu unzureichender Behandlung führen

(e.g. Hanas R., Diabetes care 2002)

– Wesentliche Studien wurden nicht mit der Referenzmethode durchgeführt

…die Referenzmethode ist Fortschritt, aber...

Problem: Referenzmaterial

• Aufwendige Herstellung– mehrere

Aufbereitungsschritte

– komplexe Qualitätskontrolle

• sonst nicht generell für verschiedene Methoden geeignet

Literatur: Finke Clin Chem Lab Med 1998

Rückführbarkeit auf Referenzmethode/Referenzmaterial

• Durch eine Standardisierung werden negative Einflüsse nicht eliminiert

(Hb-Varianten, unspezifische Veränderungen z.B. Carbamylierung, weitere Glykierungsprodukte)

• Werte werden nur heruntergerechnet.

• Bessere Vergleichbarkeit so nur bedingt erreichbar.

Persistierende Probleme bei Standardisierung

• Interlabor-Präzision 2%• Dokumentiert (Weycamp, Clin Chem 2008):

Präzision innerhalb eines Netzwerks <0,9% möglich

• RiLiBÄK bis 2010: 6% Unpräzision, 8% Unrichtigkeit

Forderungen

Gegebenheiten

• Zusammenfassung

Plan

Zusammenfassung

• Es gibt eine Referenzmethode– aufwändig– verändert die Werte– Routinemässig nicht anwendbar

• Standardisierung unter freiwilligen Bedingungen weltweit ist schwierig

Perspektive

• Was setzt sich durch?– Von der analytischen Seite ist zu fordern, den

Analyten so spezifisch und standardisiert wie möglich zu messen.

– Von klinischer Seite sowenig wie möglich ändern

– Praktische Empfehlung: bislang weiter möglichst im selben Labor messen

Danke für die Aufmerksamkeit

Standardisierung ist Sisiphosarbeit