Nº4 VOL 44 2012y de sus mascotas en la provincia de La Pampa, Argentina Ana L. Tamborini, Luis M. Casabona, María R. Viñas, Valeria Asato, Alicia Hoffer, María I. Farace, María

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Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 138-143240

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REVISTA ARGENTINA DE

MICROBIOLOGIAPUBLICACION DE LA ASOCIACION ARGENTINA DE MICROBIOLOGIA

Aparece en Biological Abstracts, Chemical Abstracts, Veterinary Bulletin, Index Veterinario, EMBASE (Excerpta Medica) Medline (index Medicus), Tropical Diseases Bulletin, Abstracts on Hygiene and Communicable Diseases, Literatura Latinoamericana enCiencias de la Salud (LILACS), Periódica, LATINDEX, SciELO, Science Citation Index Expanded y Redalyc.

A. Amoroso (Bélgica)J. Arbiza (Uruguay)J. A. Ayala (España)

P. Feng (EE. UU.)E. García López (España)

M. Gottschalk (Canadá)R. Guerrero (España)

M. J. Mendes Giannini (Brasil)M. Philipp (EE. UU.)

F. Queiroz Telles (Brasil)

A. Restrepo (Colombia)G. San Blas (Venezuela)G. Schumunis (EE. UU.)

A. Steinbüchel (Alemania)M. Tolmasky (EE.UU.)

Secretaría: Deán Funes 472, C1214AAD Buenos Aires; Tel/FAX: 54-11-4932-8858, 54-11-4932-8948; E-mail: [email protected], http://www.aam.org.ar

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Franqueo PagadoConcesión N° 4195

Tarifa ReducidaConcesión N° 628

DIRECTORA

Silvia Carla PredariInstituto de Investigaciones Médicas Alfredo Lanari - UBA

SECRETARIO DE REDACCIÓN

José A. Di ConzaFacultad de Famacia y Bioquímica - UBA - CONICET Facutad de Bioquímica y Ciencias Biológicas - UNL

COMITÉ EDITOR

Susana CarnovaleFacultad de Medicina - UBA

Mauricio G. CaroboneFacultad de Medicina - UBA - CONICET

Inés E. García de SalamoneFacultad de Agronomía - UBA

Ana M. JarFacultad de Ciencias Veterinarias - UBA

Claudia I. MenghiHospital de Clínicas - Facultad de Farmacia

y Bioquímica - UBA

Héctor R. Morbidoni Facultad de Ciencias Médicas - UNR - CIUNR

Beatriz N. Passerini de Rossi Facultad de Farmacia y Bioquímica - UBA

ASESORES CIENTÍFICOS

C. BantarJ. C. BasilícoM. I. Berría

H. M. BianchiniN. Binsztein

M. M. BraccoR. CamposG. CarballalA. Cataldi

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SUSCRIPCIÓN (cuatro números anuales) Socios AAM $ 200 Argentina no socios $ 400 América Latina U$S 150 Otros países U$S 300

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MICROBIOLOGIA

VOLUMEN 44 Nº 4 • OCTUBRE-DICIEMBRE DE 2012

ÍNDICE

EDITORIALAcceso abierto: ¿un modelo realmente abierto para investigadores de países en desarrollo?Beatriz Passerini de Rossi

MICROBIOLOGÍA BÁSICA*Frecuencia de genes de virulencia de Escherichia coli en lechones neonatos de un criadero intensivo de ArgentinaFabrisio E. Alustiza, Natalia Y. Picco, Romina V. Bellingeri, Horacio R. Terzolo, Adriana B. Vivas*Identificación molecular del endosimbionte secundario Hamiltonella defensa en el pulgón amarillo de los cereales, Metopolophium dirhodumMarta C. Telesnicki, Claudio M. Ghersa, María A. Martínez-Ghersa, Joel D. Arneodo

MICROBIOLOGÍA CLÍNICA Y ENFERMEDADES INFECCIOSAS*Detección de rinovirus por RT-PCR en tiempo real en muestras respiratorias de niños de Buenos Aires, ArgentinaDébora N. Marcone, Cristina Videla, Carmen Ricarte, Guadalupe Carballal, Santiago Vidaurreta, Marcela EchavarríaCampylobacter spp.: prevalencia y caracterización feno-genotípica de aislamientos de pacientes con diarrea y de sus mascotas en la provincia de La Pampa, ArgentinaAna L. Tamborini, Luis M. Casabona, María R. Viñas, Valeria Asato, Alicia Hoffer, María I. Farace, María C. Lucero, Alejandra Corso, Mariana Pichel*Aislamiento de Serratia rubidaea de una infección mixta posterior a la mordedura de un caballoMirta L. Litterio, Solange Arazi, Claudia Hernández, Horacio LopardoAcanthamoeba sp.: un caso de queratitis no relacionada con el uso de lentes de contactoClaudia Menghi, María C. Caride, Claudia GattaHidatidosis retroperitoneal secundaria a quiste hidatídico de localización hepáticaKatherina A. Vizcaychipi, Sonia Sosa, Federico Camicia, Graciela Santillán, María Casalins, María del Carmen Nigro

AGENTES ANTIMICROBIANOS*Primera evaluación en Argentina de GenoType® MTBDRplus para la detección de Mycobacterium tuberculosis multidrogo-resistente desde aislamientos y especímenes clínicosBelén R. Imperiale, Martín J. Zumárraga, Gabriela Weltman, Roxana Zudiker, Ángel A. Cataldi, Nora S. MorcilloEvaluación de diversos métodos fenotípicos para la detección de carbapenemasas KPC en Klebsiella pneumoniaeFederico G. Nicola, Jimena Nievas, Jorgelina Smayevsky*Caso de transmisión familiar de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina adquirido en la comunidad portador del gen Inu(A) en la ciudad de Santa Fe, ArgentinaEmilce de los A. Méndez, María L. Roldán, María R. Baroni, María A. Mendosa, Sabrina A. Cristóbal, Stella M. Virgolini, Diego FacconeIncidencia y distribución estacional de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina en pacientes adultos ambulatorios en una clínica de la provincia de Buenos Aires: período 2006-2011María T. Verón, María G. Ojeda, Fabián Avino, Anabella Spelzzini, Ana L. Barboza, Yesica Petrozzino

ARTÍCULO ESPECIALEscherichia coli verocitotoxigénico: varias cuestiones... y los tambos tambiénDaniel Fernández, Nora L. Padola

IMÁGENES MICROBIOLÓGICAS*Infección de un hospedador natural por un podovirus antártico marinoJosé L. López, Walter P. Mac Cormack

Índice general del volumen 44Índice de temasÍndice de autoresAgradecimiento a los revisoresInstrucciones para los autoresGuía para la preparación de los manuscritos

* En inglés

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EDITORIALOpen Access: is it really an open model for researchers in developing countries?Beatriz Passerini de Rossi

GENERAL MICROBIOLOGY*Frequency of virulence genes of Escherichia coli among newborn piglets from an intensive pig farm in ArgentinaFabrisio E. Alustiza, Natalia Y. Picco, Romina V. Bellingeri, Horacio R. Terzolo, Adriana B. Vivas*Molecular identification of the secondary endosymbiont Hamiltonella defensa in the rose-grain aphid Metopolophium dirhodumMarta C. Telesnicki, Claudio M. Ghersa, María A. Martínez-Ghersa, Joel D. Arneodo

CLINICAL MICROBIOLOGY AND INFECTIOUS DISEASES*Rhinovirus detection by real-time RT-PCR in children with acute respiratory infection in Buenos Aires, ArgentinaDébora N. Marcone, Cristina Videla, Carmen Ricarte, Guadalupe Carballal, Santiago Vidaurreta, Marcela EchavarríaCampylobacter spp.: prevalence and pheno-genotypic characterization of isolates recovered from patients suffering from diarrhea and their pets in La Pampa Province, ArgentinaAna L. Tamborini, Luis M. Casabona, María R. Viñas, Valeria Asato, Alicia Hoffer, María I. Farace, María C. Lucero, Alejandra Corso, Mariana Pichel*Isolation of Serratia rubidaea from a mixed infection after a horse biteMirta L. Litterio, Solange Arazi, Claudia Hernández, Horacio LopardoAcanthamoeba sp.: a case report in a non-contact lens wearerClaudia Menghi, María C. Caride, Claudia GattaRetroperitoneal hydatidosis secondary to hepatic hydatid cystKatherina A. Vizcaychipi, Sonia Sosa, Federico Camicia, Graciela Santillán, María Casalins, María del Carmen Nigro

ANTIMICROBIAL AGENTS*First evaluation in Argentina of the GenoType® MTBDRplus assay for multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis detection from clinical isolates and specimensBelén R. Imperiale, Martín J. Zumárraga, Gabriela Weltman, Roxana Zudiker, Ángel A. Cataldi, Nora S. MorcilloEvaluation of phenotypic methods for the detection of KPC carbapenemases in Klebsiella pneumoniaeFederico G. Nicola, Jimena Nievas, Jorgelina Smayevsky*A case of familial transmission of community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus carrying the Inu(A) gene in Santa Fe city, ArgentinaEmilce de los A. Méndez, María L. Roldán, María R. Baroni, María A. Mendosa, Sabrina A. Cristóbal, Stella M. Virgolini, Diego FacconeIncidence and seasonal distribution of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in adult outpatients at a clinic in Buenos Aires province: period 2006 to 2011María T. Verón, María G. Ojeda, Fabián Avino, Anabella Spelzzini, Ana L. Barboza, Yesica Petrozzino

SPECIAL ARTICLEVerocytotoxigenic Escherichia coli: several aspects… and also the dairy farmsDaniel Fernández, Nora L. Padola

MICROBIOLOGICAL IMAGES*Natural host infection by Antarctic marine podovirusJosé L. López, Walter P. Mac Cormack

General index of volume 44Subject indexAuthors indexAcknowledgement to reviewersInstructions to authorsManuscript preparation checklist

* In English


MICROBIOLOGIA

VOLUMEN 44 Nº 4 • OCTOBER-DECEMBER 2012

INDEX

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ISSN 0325-7541Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 247-249EDITORIAL

Acceso abierto: ¿un modelo realmente abierto parainvestigadores de países en desarrollo?

Open Access: is it really an open model forresearchers in developing countries?

Una ciencia es tanto más útil cuanto más universalmente pueden comprenderse sus producciones; y, al contrario, lo será menos

en la medida en que estas sean menos comunicables.

Leonardo Da Vinci

El propósito de este editorial es analizar las oportunidades que brinda el modelo de acceso abierto (AA) (open access, OA) a los investigadores de países en desarrollo. El AA es el acceso inmediato, vía Internet, sin requerimientos de suscripción o pago, al texto completo de artículos de investigación científica de revistas especializadas con revisión por pares. Existe en dos modalidades: “AA gratis”, en la que el acceso sin costo elimina las barreras económicas de acceso a la información, y, “AA libre”, que es “AA gratis” con el agregado de algunos derechos de uso del material. Las tres declaraciones más importantes del ámbito internacional que sostienen y definen el AA son la Declaración de Budapest (2002), la de Bethesda (2003) y la de Berlín (2003) (5). El listado más completo de revistas científicas de AA, en todos los campos e idiomas, puede consultarse en el Directory of Open Access Journals (DOAJ, http://www.doaj.org).

Entre las causas del surgimiento del movimiento de AA debemos mencionar aspectos económicos relacionados con el costo de las suscripciones a revistas científicas tradicionales y el deseo de los autores de conservar los derechos sobre los trabajos publicados (copyright). El desproporcionado incremento de los costos de las suscripciones a revistas científicas iniciado en la década de los 80 dio lugar a la denominada crisis de las publicaciones seriadas e impactó fuertemente en los gastos de las bibliotecas universitarias. Con el modelo clásico, los investigadores solo tienen acceso a artículos científicos si su universidad paga una suscripción a las revistas en que se publican. En cambio, el modelo de AA garantiza al lector el acceso a la literatura científica de manera gratuita y abierta. Con respecto al derecho de autor o copyright, las revistas de AA ofrecen nuevos modelos que difieren de los utilizados por las revistas tradicionales, en las que el autor transfiere el copyright a la editorial. Entre los nuevos modelos se destacan las diferentes licencias Creative Commons (www.creativecommons.org), desarrolladas por una ONG sin fines de lucro que busca restablecer un equilibrio entre los derechos de los autores, las editoriales y el acceso del público al conocimiento. A diferencia del clásico “todos los derechos reservados”, Creative Commons invita a compartir las obras bajo la idea de “algunos derechos reservados” (5).

El avance de las nuevas tecnologías e Internet permitieron el desarrollo del modelo de AA. Existen dos vías de publicación de AA, la denominada “ruta dorada” (golden road), donde el autor publica en revistas de AA que proveen acceso inmediato en su sitio web, y la que se conoce como “ruta verde” (green road), donde el autor publica en cualquier revista y luego es responsable de archivar una versión del artículo en su repositorio institucional o en repositorios centrales como PubMedCentral (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/). Existen además revistas de AA híbridas, que proveen la “ruta dorada” solo a aquellos artículos cuyos autores paguen por dicho AA. Por otra parte, algunas revistas facilitan el acceso a sus archivos o depositan los artículos en repositorios después de un período de restricción (5). Debido a que el movimiento internacional de AA está impulsando leyes y mandatos para que los resultados de las investigaciones financiadas con fondos públicos estén disponibles en AA (Declaración de Berlín), un creciente número de editores de revistas científicas internacionales ya permiten que los autores depositen sus artículos en repositorios de AA, además de publicarlos en las respectivas revistas (1).

Con respecto a las nuevas tecnologías y su potencial para facilitar la difusión del conocimiento científico, la RedCLARA (Cooperación Latino Americana de Redes de Avanzada, http://www.redclara.net/) es fundamental para la investigación en América Latina. Esta red brinda la infraestructura necesaria para el

248 Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 247-249

crecimiento de las redes nacionales de investigación de la zona, y facilita el desarrollo de colaboraciones regionales e intercontinentales. Para conectarse a la RedCLARA, las instituciones científicas deben integrar y estar conectadas a la Red Nacional de Investigación y Educación (RNIE) de su país de origen. A la fecha, se encuentran conectadas a RedCLARA las RNIE de Argentina, Brasil, Chile, Colombia, Costa Rica, Ecuador, El Salvador, Guatemala, México, Nicaragua, Panamá, Perú, Uruguay y Venezuela. Innova|Red (http://www.innova-red.net/) es la RNIE de Argentina, que reemplaza a RETINA, que era un proyecto de la Asociación Civil Ciencia Hoy. Innova|Red, que es un proyecto de Innova-T –una ONG fundada por el CONICET–, mantiene conectada y comunicada a la comunidad académica y científica de Argentina con la comunidad académica internacional y los centros de investigación a nivel mundial.

Los avances del movimiento internacional de AA y del uso de repositorios digitales multidisciplinarios y de repositorios institucionales –bibliotecas digitales que reflejan la producción de la propia institución– han contribuido a disminuir la brecha informativa para los investigadores e instituciones de países en desarrollo. Los repositorios de las universidades sirven como indicadores tangibles de la calidad de la institución, al incrementar su visibilidad y prestigio a nivel público (1).

En América Latina se observa un avance sostenido de portales que ofrecen acceso libre vía web al texto completo de publicaciones científicas de la región. Se destacan, entre otros, los portales multidisciplinarios de revistas científicas SciELO (Scientific Electronic Library Online, http://www.scielo.org) y Redalyc (Red de Revistas Científicas de América Latina y el Caribe, España y Portugal, http://www.redalyc.org), que suman AA a más de 1000 revistas científicas arbitradas de la región, además de revistas de España y Portugal.

Estos portales, luego de una década de servicios, han iniciado el desarrollo de indicadores bibliométricos y cienciométricos que permitirán disponer de indicadores regionales, a fin de complementar los indicadores internacionales, de marcado sesgo anglosajón. Estos últimos son elaborados por el Institute for Scientific Information (Thomson Reuters ISI) y Scopus (Elsevier), y utilizados para la evaluación de las revistas, e indirectamente, de quienes publican en ellas (1, 2).

En Argentina, el Portal de Publicaciones Científicas y Técnicas (PPCT, [email protected]) de AA con soporte editorial del Centro Argentino de Información Científica y Tecnológica (CAICYT) del CONICET brinda desde 2010 un servicio de apoyo editorial, a través del Open Journal Systems (OJS, http://pkp.sfu.ca/ojs), a los comités editoriales de las revistas que reúnan determinados requisitos de calidad. El OJS es un software de código abierto para la administración de revistas de AA creado por el Public Knowledge Project. Este software provee la infraestructura técnica no solo para la presentación en línea de artículos de revistas, sino también para el flujo editorial completo, incluyendo el envío de artículos, rondas múltiples de revisión por pares e indexación.

Desde 2009, la Revista Argentina de Microbiología (RAM), editada por la Asociación Argentina de Microbiología (AAM), es una publicación de AA híbrida. Los autores pagan por la publicación de sus artículos, los cuales son depositados, sin período de resguardo, en SciELO Argentina (http://www.scielo.org.ar), en la página web de la AAM (http://www.aam.org.ar), en PubMed y en otros portales, y también son publicados en la versión impresa de la revista, que responde al modelo tradicional de suscripción anual.

Una de las ventajas más importantes del modelo de AA es que los documentos se hacen mucho más visibles para la comunidad científica internacional. Si un documento de investigación, además de ser interesante o novedoso, figura en Internet y es de fácil accesibilidad, será difundido con inmediatez e inevitablemente tendrá más probabilidad de ser citado que otro que tenga las mismas características de contenido pero poca visibilidad debido al acceso restringido del modelo tradicional. Esto es fundamental tanto para los autores como para las revistas, cuyo factor de impacto (FI) es un reflejo de su prestigio. El primer FI de la RAM correspondiente al año 2010, dado a conocer en julio de 2011 en el Journal Citation Reports (JCR, http://admin-apps.isiknowledge.com), fue de 0,494, y el nuevo FI es de 0,500. Estos FI pueden considerarse “humildes” al compararlos con los de las revistas anglosajonas más prestigiosas de igual área temática (cuyos FI son superiores a 1), pero se encuentran entre los FI más elevados de las revistas nacionales. Evidentemente, el objetivo del Comité Editor es incrementarlo a través de la implementación de un software de código abierto, que permitirá optimizar los procesos de producción editorial y, fundamentalmente, la colaboración de los investigadores en sus papeles de autores y revisores. Además, es prioritario que los investigadores citen los artículos relacionados ya publicados en la RAM, especialmente en los últimos dos años (3).

Por último debemos analizar el dilema fundamental: ¿quién paga los costos de publicación? En el editorial “Ciencia, cultura de la cita y dinero” del número anterior de la RAM se hacía referencia a que existen editoriales (algunas tradicionales y muchas de AA) en las que los investigadores se ven obligados a pagar sumas importantes de dinero si quieren publicar en sus revistas. Esta situación es paradojal puesto que los autores, quienes proveen el contenido que será evaluado luego para determinar el FI de las revistas, deben

249Acceso abierto: ¿un modelo realmente abierto para investigadores de países en desarrollo?

pagar por ello (2). Peter Suber, director del Harvard Open Access Project, sostiene que la literatura de AA no se produce

sin gastos, aunque es menos costosa que la literatura de publicación convencional, y busca para cubrirlos métodos mejores que el cobro a los lectores mediante una suscripción, conocido por generar barreras para el conocimiento (5). En muchos casos, las revistas de AA cobran una tarifa de producción por cada artículo aceptado, que debe pagar el autor o el promotor del autor. Algunas revistas de AA que cobran estas tarifas suelen eximir de dicho pago a los autores que tienen dificultades económicas. Las revistas de AA con subvenciones institucionales, de la universidad o del colegio profesional al que pertenecen, tienden a no cobrar estas tarifas de producción. Harold Varmus, Premio Nobel de Fisiología y Medicina 1989, fundador de PubMedCentral y cofundador de Public Library of Science (PLOS), es uno de los principales promotores del modelo de AA y del pago por los autores (4).

Actualmente, muchos investigadores de países en desarrollo ven limitada la posibilidad de publicar en revistas de AA internacionales debido a los elevados costos (2000-3000 USD, por ejemplo, en revistas de Wiley Online Library tales como Microbiology Open o FEMS Microbiology Letters), que no pueden ser afrontados con los subsidios de que disponen. Por ello, una parte importante de la producción científica latinoamericana permanece en los circuitos comerciales de distribución de aquellas revistas tradicionales que no cobran a los autores, por lo que queda inaccesible y, por lo tanto, invisible para quienes no suscriben a esas revistas (1).

En conclusión, el modelo de AA brinda al lector acceso inmediato y gratuito al texto completo de artículos de investigación de revistas con revisión por pares, lo cual aumenta la visibilidad de la investigación y del autor ante la comunidad científica internacional. Este modelo elimina las barreras económicas de acceso a la información y algunas barreras de copyright, conforme a la idea de “algunos derechos reservados”. Sin embargo, los costos de publicación son una barrera importante, especialmente para los investigadores de países en desarrollo. El modelo de AA es gratis para el lector pero no para el autor. Con respecto a esta barrera para los autores, Peter Suber considera que existen muchas posibilidades de creatividad para encontrar maneras de cubrir los gastos de las revistas científicas de AA y que, en ese sentido, aún estamos lejos de haber agotado la inteligencia y la imaginación (5).

BEATRIZ PASSERINI de ROSSICátedra de Microbiología

Facultad de Farmacia y Bioquímica

Universidad de Buenos Aires

E-mail: [email protected]

Babini D. Acceso abierto a la producción científica de 1.

América Latina y el Caribe. Identificación de principales

instituciones para estrategias de integración regional.

Rev iberoam cienc tecnol soc. 2011; 6: 31-56.

Carobene M. Ciencia, cultura de la cita y dinero. Rev 2.

Argent Microbiol 2012; 44: 135-7.

Predari SC. Y finalmente…la Revista Argentina de 3.

Microbiología impactó. Rev Argent Microbiol 2011; 43: 165-7.

Q&A: Harold Varmus. FAS Public Interest Report, 4.

2012. Disponible en línea en: http://www.fas.org/blog/

pir/2012/07/05/qa-harold-varmus/

Suber, P. Open Access Overview: focusing on open 5.

access to peer/reviewd research articles and their

preprints. Last revised October 7, 2012. Disponible

en línea en: http://www.earlham.edu/~peters/fos/

overview.htm.

Frequency of virulence genes of Escherichia coli among newborn piglets from an intensive pig farm in Argentina

FABRISIO E. ALUSTIZA1*#, NATALIA Y. PICCO1#, ROMINA V. BELLINGERI1, HORACIO R. TERZOLO2, ADRIANA B. VIVAS1#

Laboratorio de Biotecnología, Departamento de Anatomía Animal, Facultad de Agronomía y Veterinaria, Universidad Nacional de Río Cuarto, Ruta 36 km 601(5800) Río Cuarto, Córdoba, Argentina; 2Grupo de Sanidad Animal, Estación Experimental

Agropecuaria INTA Balcarce, Ruta 226 Km 73,5 (7620) Balcarce, Buenos Aires, Argentina.*Correspondence. E-mail: [email protected]

ABSTRACT

The enterotoxigenic and porcine enteropathogenic Escherichia coli (ETEC and PEPEC) strains are agents

associated with swine neonatal diarrhea, causing economic losses in swine production. The main goal of

this study was to identify virulence genes of ETEC, verotoxigenic (VTEC) and PEPEC in intestinal strains

responsible for swine diseases, by molecular typing using PCR in newborn piglets from an intensive farm

system. Two hundred and sixty seven rectal swabbings from 7-15 days- old Landrace x Large White

crossbred piglets were taken, and 123 randomly selected samples, biochemically compatible with E. coli,

were tested for E. coli virulence genes by PCR. A frequency (%) compatible with: 68 ETEC, 24 VTEC, and

8 EPEC were found. Of all E. coli strains studied, 19.51 % carried at least one virulence gene. These data

showed conclusively that, in spite of the application of strict sanitary measures in the intensive farm, genes

encoding virulence factors of intestinal pathogens compatible with ETEC are still detected; therefore these

strains will probably keep circulating among animals.

Key words: virulence genes, Escherichia coli, piglets, intensive farm

RESUMEN

Frecuencia de genes de virulencia de Escherichia coli en lechones neonatos de un criadero

intensivo de Argentina. El objetivo del trabajo fue identificar genes de virulencia de cepas intestinales de

Escherichia coli de los grupos enterotoxigénico (ETEC), verotoxigénico (VTEC) y enteropatogénico porcino

(PEPEC), responsables de patologías en cerdos, mediante tipificación molecular por PCR. Para ello se

trabajó en un criadero intensivo, donde se tomaron 267 hisopados rectales de lechones cruza Landrace

por Large White de 7-15 días de edad. Del total de aislamientos obtenidos se seleccionaron al azar 123

de ellos, bioquímicamente compatibles con E. coli, los que fueron analizados por PCR. La frecuencia de

genes compatibles con ETEC, VTEC y PEPEC fue de 68 %, 24 % y 8 %, respectivamente. De las cepas

de E. coli seleccionadas, el 19,51 % portaban al menos un gen codificante de un factor de virulencia.

Estos hallazgos muestran de manera concluyente que la aplicación de estrictas medidas sanitarias en el

criadero en estudio no logró evitar la presencia de genes que codifican factores de virulencia de patógenos

intestinales compatibles con ETEC. Es probable que las cepas circulen entre los animales.

Palabras clave: genes de virulencia, Escherichia coli, lechones, criadero intensivo

Swine neonatal diarrhea is one of the major causes of death and economic losses in swine production. The enterotoxigenic (ETEC), verotoxigenic (VTEC) and porcine enteropathogenic (PEPEC) strains are one of the most representative pathogenic variants

of E. coli (9, 11, 12). There are a number of virulence factors associated with ETEC strains, such as the production of heat-labile (LT) and heat-stable (ST) toxins with two variants (STa and STb) (2).

The mechanism of pathogenicity of ETEC is to

# These authors contributed equally to this work.

INFORME BREVEISSN 0325-7541


251

first colonize the small intestine, followed by toxin production. This colonization is achieved under other virulence factors known as fimbriae. The main fimbriae are F4 (K88), F6 (P987) and F18. Each fimbriae interacts with specific glucidic residues from the mucus layer (5, 9). These virulence factors are not required for vegetative replication or bacterial commensalism, due to the fact that E. coli is one of the most successful commensal microorganisms which is related to a great diversity of hosts (2). However, such virulence factors provide the microorganism with greater ability to colonize intestinal surfaces in the host and cause disease through damage of cells and tissue (2, 5, 9).

The intensification of swine production has led producers to carry out breeding practices under strictly controlled sanitary conditions, such as temperature control, reduction of contact between animals and waste, improvement of effluent treatment, parturition control with human intervention, and use of autovaccines with local strains. However, all these practices are not enough to achieve ideal sanitary conditions, mainly due to the environmental survival capacity of E. coli strains.

Authors from different countries have described the recent situation of swine production regarding the prevalence of E. coli (2, 6, 10, 14, 15). In Argentina, as in other countries, enteric colibacillosis is a very common disease among newborn piglets

(3). However, little is known about the distribution of strains carrying virulence factors in Argentina. The objective of this study was to identify genes encoding virulence factors causing intestinal disease in swine, in possible ETEC, VTEC and PEPEC strains by molecular typing using PCR in newborn piglets in an Argentine intensive farm system. The results of our study may offer valuable information about the presence of virulence factors compatible with ETEC, VTEC and PEPEC in a breeding facility.

Farm description. The crossbred pigs used in this study, Landrace x Large White, came from a single-source, a 2500 multi-site swine production system having high-health status, without clinical signs of diarrhea. The farm is located in Santa Eufemia - Cordoba Province, in the central region of Argentina. The piglets were housed in pens in a nursery site with plastic floor separated by metal partitions, allowing contact between animals and their mothers.

Sample collection. Two hundred and sixty seven samples were taken from randomly selected 7-15 day-old piglets by rectal swabbing. In order to guarantee a safe, correct and careful handling of the animals, we proceeded according to specifications of the Universidad Nacional de Rio Cuarto Ethics Committee (4). When samples were taken, animals were apparently healthy; they did not show any signs or symptoms of diarrhea. Samples were collected every season during a 2-years period (March 2008 - December 2010).

Table 1. Primers used in the amplification reaction of virulence genes

Virulence Factor gene

Primer Sequency (5´ - 3´) Amplicon size (pB) Reference

General Verotoxin (VTg)

VTg -FVTg-R

GAGCGAAATAATTTATATGTCGAAATCCCCTCTGTATTTGCC

322 13

Heat-labile Toxin (LT)

LT-BLT-FN

CCGAATTCTGTTATATATGTCGGCGACAGATTATACCGTGC

696 1

Heat-stable Toxin type b (STb)

STb-FSTb-R

ATCGCATTTCTTCTTGCATCGGGCGCCAAAGCATGCTCC

175 1

Heat-stable Toxin type a (STa)

STa-ASTa-B

TCTTTCCCCTCTTTTAGTCAGACAGGCAGGATTACAACAAAG

166 11

Intimin (Eae)eae-MBReae-V3F

TCCAGAATAATATTGTTATTACGCATTGATCAGGATTTTTCTGGT

510Access GenBank:

AF453441

Fimbria 18 (F18)F18-FNF18-RN

GGGCTGACAGAGGAGGTGGGGCCCGGCGACAACTTCATCACCGG

411 14

Fimbria 4 (F4)K88-AK88-B

GGTGATTTCAATGGTTCGGTCATTGCTACGTTCAGCGGAGCCG

772 8

Fimbria 6 (F6)P987 AP987 B

GCGCCCGCTGAAAACAACACCAGCGTACCGGCCGTAACTCCACCG

467 8

E. coli virulence genes among piglets in Argentina


The swabs were transported in a Stuart’s transport medium to the Bacteriology Laboratory of the Facultad de Agronomía y Veterinaria, Universidad Nacional de Río Cuarto. The samples were cultured on Mac Conkey Agar. After growth, lactose positive colonies were biochemically characterized by using tests described for the Enterobacteriaceae family, according to Bergey’s Manual (7).

DNA extraction. For DNA extraction, the confluent growth area of the plate was extracted and diluted in 300 µl of sterile bi-distilled water in Eppendorf tubes. After dilution, the sample was boiled for 3 min, and centrifuged at 11 000 x g at 4 °C for 2 min. The supernatant was used as a template for the PCR reaction.

PCR reaction. The primers listed in Table 1 were used for the reaction. Each of them codified different virulence factors of E. coli under the following conditions of reaction: amplification carried out with 7 µl of template and 6µl of reaction buffer (Green go Taq 5X) (pH = 8.5), which includes MgCl2 (1.5 mM); then 0.6 µl of dNTP (10 mM), 0.5 µl for each primer (300 ng/µl), and 0.2 µl of Taq DNA polymerase (5 U/µl) added and taken to final volume with distilled sterile water (30 µl). PCR cycling conditions were: initial denaturalization at 94 °C for 2 min; 30 amplification cycles (denaturalization at 93 °C for 1.5 min, suitable annealing for 1 min, then extension at 72 °C for 1 min), and final extension for 7.5 min.

PCR products were electrophoresed in agarose gel at 2 %, with TAE buffer (tris-acetate-EDTA). A marker of 100-1000 bp molecular weight was used. Reference E. coli strains were run for each gene as a positive control, and distilled water was used as a negative control. Gel was stained with Ethidium Bromide and visualized under UV light.

Two hundred and sixty seven samples were processed. Of the E. coli isolates, 123 were randomly selected and analyzed by PCR. Figure 1 shows PCR

products of the evaluated virulence genes: F4 (lane 2), VTg (lane 3), STb (lane 4), F18 (lane 5), LT (lane 6), eae (lane 8), F6 (lane 9) and STa (lane 10).

Knowing that the real pathogenic mechanism of ETEC strains is the production of toxins and that adherence to the enterocyte is carried out through fimbriae, it is necessary to correlate toxin production with the presence of fimbriae-coding genes. The frequency of fimbriae and enterotoxins are shown in Table 2.

A remarkable circulation of ETEC-compatible genes with a cumulative frequency of 68 % is shown in Table 2, being the thermostable toxin b (STb) the prevailing virulence factor with a frequency of 28 %, followed

Figure 1. Agarose gel electrophoresis of PCR products.

Lanes: 1, 100-bp DNA ladder; 2, E. coli F4+ (772 bp); 3, E. coli

VTg+ (322 bp); 4, E. coli STb+ (175 bp); 5, E. coli F18+ (411 bp);

6, E. coli LT+ (696 bp); 7, negative control (distilled water); 8,

E. coli eae+ (510 bp); 9, E. coli F6+ (467 bp); 10, E. coli STa+

(166 bp).

Table 2. Frequency of intestinal virulence genes for fimbriae and enterotoxins among positive strains

Genes encoding virulence factor Frequency (%) Compatible with Cumulative frequency (%)

F4 8

F18 4P987 16 ETEC 68

STb 28

LT 8

STb, F18 4

Eae 8 PEPEC 8

STa, VTg 12

Eae, VTg 8 VTEC 24

P987, VTg 4

253

by fimbriae 6 (P987) with 16 % and thermolabile toxin (LT) with 8 %. As shown in Table 2, the frequency of isolates carrying genes coding for fimbriae 4 (F4) were 8 %, fimbriae 18 (F18) and the association between both thermostable toxin b and fimbriae 18 (STb, F18) were 4 %, respectively. Circulating genes compatible with PEPEC (Eae) 8 %, and VTEC (VTg) 24 %, were also found.

Relationships were observed between the presence of general verotoxin and fimbriae 6 (VTg, P987) with a frequency of 4 %. No association was found between the heat-stable toxins (both a and b) and the heat-labile toxin.

No seasonal differences were observed among the frequency of virulence genes studied.

There is no information about the prevalence or frequency of E. coli virulence genes causing intestinal disease in swine in Argentina. This study provides updated information about the presence and circulation of E. coli among newborn piglets in an intensive system.

No animals with clinical symptoms of diarrhea were detected. Genes coding for heat-stable a and b toxins, and fimbriae F4, F6 and F18 are consistent with the presence of ETEC, indicating a great circulation of this pathogen among animals (frequency = 68 %). These genes have high pathogenic potential and may trigger piglet diarrhea, under some conditions (2, 5, 9). Therefore, the absence of the disease may be related to the application of adequate environmental, hygienic and sanitary measures.

The gene coding for general verotoxin (VTg) is present in 24 % of the samples, showing clear evidence about its circulation. Since bacteria carry the VTg gene, the etiologic agent of Hemolitic Uremic Syndrome (HUS), they might represent a potential risk to public health, mainly to susceptible hosts. There is an increased risk of transmission to hosts through carriers, persons, who are infected because they work in close contact with animals. Several frequencies of isolates compatible with ETEC / VTEC and PEPEC strains have been found and described (24 % and 8 %, respectively). Among others, in Brazil, diarrheic piglets under 11 days presented 65.7 % of ETEC, and non-diarrheic ones presented 42.8 %. However, 25.7 % and 9.5 % of PEPEC strains were observed in animals with and without diarrhea, respectively analyzed by PCR (10). In Spain, strains of ETEC obtained through serotyping were found with the following percentages: 31.9 % of F6, 11.6 % of F5, 10.1 % of F41 and 8.7 % of F4 (6). In Slovakia, at least one virulence gene was found by PCR in 80 % of the isolates from diarrheic and non-diarrheic piglets, as well as 65 % of ETEC and 17 % of PEPEC (14). In Germany Wieler et al. (15) found by PCR and colony hybridization that 17.6 % (49/278) of the animals were

infected with enterotoxigenic E. coli [ETEC: 10.1 % (28/278) ETEC-ST-Ia, and 8.6 % (24/278) ETEC-LT-I]. In China, Cheng et al. (2) found by PCR 67.92 % of ETEC strains in nursing piglets from different farms. As for Argentina, Cicuta et al. (3) found 24.5 % of ETEC STa positive and 2.9 % of LT; and 2.1 % of VTEC from 164 samples of 23 intensive farms in several regions of the country analyzed by PCR. The results of our study show a greater circulation of ETEC compatible genes than that observed in the studies above. Our results, however, are consistent with those obtained by Cicuta et al. (3), which were obtained from 123 samples from a pig farm in the central region of Argentina.

In conclusion, this study observed a frequency of 68 % in ETEC compatible genes, which may appear to be high, considering that the selected pig farm complies with all needed requirements and adequate sanitary conditions for intensive farming. The presence of 24 % of genes encoding for general verotoxin is considered to pose serious risk on Public Health. These kinds of studies have not been performed for a long time in our country. These results offer updated information about virulence genes of Escherichia coli responsible for intestinal disease among piglets in the central region of Argentina.

Acknowledgements: we are grateful to Iliana A. Martinez

and Veronica Muñoz for language assistance. We would also

like to thank the intensive farm “Santa Eufemia” (AGD) and

Mariano Ruffo and Juan Matteucci, as well as Ana Rita Moreira

and Enrique Louge Uriarte for technical assistance and E.

coli reference strains provision. This study was financially

supported by Agencia Nacional de Promoción Científica y

Tecnológica PICT Start Up 35779-2005 and PPI Universidad

Nacional de Río Cuarto.

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ISSN 0325-7541Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 255-258

Molecular identification of the secondary endosymbiont Hamiltonella defensa in

the rose-grain aphid Metopolophium dirhodum

MARTA C. TELESNICKI1, CLAUDIO M. GHERSA1, MARÍA A. MARTÍNEZ-GHERSA1, JOEL D. ARNEODO2*

1 IFEVA-Facultad de Agronomía Universidad de Buenos Aires,CONICET, Ciudad Autónoma de Buenos Aires; 2IMYZA-INTA Castelar/CONICET, Pcia. de Buenos Aires, Argentina.

*Correspondence. E-mail: [email protected]

ABSTRACT

This is the first report of the association between the rose-grain aphid Metopolophium dirhodum, a potentially important cereal pest and the facultative symbiont Hamiltonella defensa. The infection with this gamma-proteobacterium was determined by PCR in laboratory-reared and field-collected specimens of an Argentinian population of the aphid. Partial bacterial 16S, IGS and 23S rRNA genes were sequenced and compared to other available Hamiltonella sequences by phylogenetic analysis. The present study provides new information on previously unknown M. dirhodum microbiota.

Key words: Aphididae, facultative symbiont, gamma-proteobacteria, PCR, sequencing

RESUMEN

Identificación molecular del endosimbionte secundario Hamiltonella defensa en el pulgón amarillo de los cereales, Metopolophium dirhodum. Esta es la primera comunicación sobre la asociación entre el áfido Metopolophium dirhodum, una plaga potencialmente importante de cereales, y el simbionte facultativo Hamiltonella defensa. La infección con esta gamma proteobacteria se determinó mediante PCR en ejemplares de una población argentina del áfido, tanto en individuos criados en laboratorio como en ejemplares colectados en campo. Se secuenció parte de los genes 16S y 23S del ARNr, y el espacio intergénico, y se realizó una comparación con otras secuencias disponibles de Hamiltonella a través de un análisis filogenético. Este estudio proporciona nueva información sobre la hasta ahora desconocida microbiota de M. dirhodum.

Palabras clave: Aphididae, simbionte facultativo, gamma proteobacteria, PCR, secuenciación

Almost all aphid species harbor the obligate, vertically transmitted bacterial endosymbiont Buchnera aphidicola, which synthesizes essential amino acids lacking in the insect’s diet. In addition to this primary symbiont, aphids may host one or more accessory bacteria, called secondary or facultative endosymbionts. These are also transmitted from mother to offspring, but occasionally move horizontally within and between species (11). Among them, the gamma-proteobacterium Hamiltonella defensa has been shown to confer parasitoid resistance in the pea aphid Acyrthosiphon pisum by blocking larval development of endoparasitoid wasps Aphidius ervi and Aphidius eadyi (6). Initially discovered infecting the whitefly Bemisia tabaci (4), H. defensa

was later found in aphids belonging to the genera Acyrthosiphon, Amphorophora, Aphis, Chaitophorus, Cinara, Hyperomyzus, Macrosiphum, Microlophium, Periphyllus, Sitobion, Uroleucon, Pemphigus and Geopemphigus (1, 5, 10, 11, 13). H. defensa has also been reported in the psyllid Cacopsylla pyri and the whitefly B. argentifolii (11, 15). Due to its positive effects on insect fitness, the occurrence of this microorganism in other economically or ecologically important insect species still needs to be explored.

The rose-grain aphid Metopolophium dirhodum (Walker, 1849) is a common cereal pest that may cause yield reductions by direct feeding and by spreading virus diseases. Although this aphid is of palaearctic origin, it is now globally distributed (3).

INFORME BREVE


Its presence in South America was first recorded during the late 1960s and the 1970s, when it caused considerable damage to wheat crops (2). Despite the relative abundance and economic significance of M. dirhodum, basic knowledge concerning its biology and physiology remains incomplete. Data on the insect-associated microorganisms are particularly lacking. A preliminary PCR survey on the microorganisms associated to a natural population of M. dirhodum in Buenos Aires, Argentina, revealed both the presence of Buchnera and a different species of bacterium (unpublished). On this basis, further studies involving PCR and partial genome sequencing were conducted to elucidate the identity of the accessory bacterium. Thus, this paper presents the first report of the secondary endosymbiont H. defensa in M. dirhodum.

Individuals of M. dirhodum were collected in January and February 2011 from a spontaneous population growing on Lolium multiflorum and other Poaceae at the Instituto de Investigaciones Fisiológicas y Ecológicas Vinculadas a la Agricultura (IFEVA)-University of Buenos Aires experimental field (34° 35’S, 58º 29’W). The insects were further raised on wheat plants at 22 °C ± 1 °C and LD 12:12 h photoperiod. Additional M. dirhodum specimens were sampled in October 2011 at the same IFEVA field and immediately processed. Total DNA was extracted from whole single aphids following a CTAB-based protocol modified after Doyle & Doyle (9). DNA yield and quality were determined using a NanoDrop 1000 spectrophotometer (NanoDrop Technologies, Wilmington DE, USA).

Amplification of nearly complete 16S rRNA gene, intergenic spacer region and partial 23S rRNA was performed with universal eubacterial primer pair 10F/480R (13). These primers amplify most bacterial taxa except Buchnera, in which the 16S gene is not linked to the 23S gene by an IGS (13). Hamiltonella specific forward primer PABSF and general reverse primer 16SB1 (4, 8) were used to amplify part of the 16S rRNA gene. Reactions were carried out on an Eppendorf Mastercycler® (Eppendorf AG, Hamburg, Germany) thermal cycler under the following conditions: 30 cycles of 94 °C for 1 min, 54 °C for 1 min and 68 °C for 3 min when using primer pair 10F/480R; and 30 cycles of 94 °C for 1 min, 55 °C for 1 min and 72 °C for 2 min when using primer pair PABSF/16SB1. Amplicons were run in agarose (1 %) gel and stained with ethidium bromide. Nine laboratory-reared and three randomly field-collected M. dirhodum specimens were tested by PCR with both primer sets. Negative controls consisted of total DNA extracted from the aphid Schizaphis graminum, which is known not to contain secondary symbionts (13).

Total DNA extracted from a single laboratory-reared aphid which tested positive for Hamiltonella was used for amplification with primers 10F and 480R. The amplified product was purified from agarose gel and cloned into E. coli DH5α cells using PCR 2.1 TOPO TA cloning kit (Invitrogen, Carlsbad CA, USA). Transformed bacteria were grown on ampicillin-containing LB medium and plasmid DNA was purified with the QIAprep® Spin Miniprep Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Germany). Two clones were sequenced at the Instituto de Biotecnología (INTA Castelar, Argentina) in an ABI PRISM 3500 XL genetic analyzer (Applied Biosystems, Foster City CA, USA). Sequencing was performed with plasmid primers M13F and M13R (Invitrogen, Carlsbad CA, USA), and a new primer set designed for the central portion of the insert: HintForw (5’-CATTTGAAACTGGGTCGCTA-3’) and HintRev (5’-TGTCCTAGGCCTCTAGACGAA-3’). The sequence obtained was compared to other H. defensa sequences from different insect hosts and geographical origins available in genome databases.

The twelve M. dirhodum individuals assessed were positive in PCR assays targeting either eubacteria or H. defensa (Figure 1), showing the expected amplicon sizes of ca. 2.25 kb and 1.6 kb, respectively.

Figure 1. PCR detection of eubacteria (primer pair 10F/480R)

and Hamiltonella defensa (primer pair PABSF/16SB1) in

Metopolophium dirhodum specimens. M= molecular weight

marker (GeneRuler™ 1 kb DNA ladder, Fermentas), 1 and

2= laboratory-reared aphids, 3= field-collected aphid, 4=

Schizaphis graminum negative control, 5= laboratory-reared

aphid from which partial bacterial genome sequence was

obtained, 6= water.

None of the S. graminum negative controls or water revealed any amplification signal. Thus, the specific PCR with PABSF/16SB1 demonstrated the occurrence of the secondary endosymbiont H.

257Hamiltonella in Metopolophium dirhodum

defensa in both laboratory-reared and field-collected insects. Although an extensive sampling should be performed to determine whether this secondary endosymbiont is fixed in the M. dirhodum population studied, its presence in every specimen analyzed provides evidence of high infection frequency. In this context, previous works had reported intermediate frequencies of H. defensa in A. pisum populations, while H. defensa was shown to be fixed in Uroleucon ambrosiae collected across the United States (13).

Complete sequence identity was observed between the two clones analyzed. The partial 16S rDNA, intergenic spacer region and partial 23S rDNA sequence of a total of 2254 bp corresponding to clone HdMd2 is available at the GenBank under Accession Number JQ293090. Based upon available Hamiltonella 16S rDNA sequences, a phylogenetic analysis was conducted with the neighbor-joining method (12) using MEGA version 4 (14). For this purpose, only sequences longer than 1300 bp were considered. The bootstrap consensus tree (Figure 2) inferred from 1000 replicates strongly supported (100 %) the inclusion of clone HdMd2 from M. dirhodum in the Hamiltonella group. Furthermore, the new Hamiltonella sequence was more closely related to sequences obtained from the other aphid species and the psyllid C. pyri, as validated by a significant bootstrap value (87 %). The secondary endosymbionts isolated from whiteflies B. tabaci

and B. argentifolii formed a different cluster within Hamiltonella. The high degree of similarity among sequences is not unexpected, because this is a conserved region, but also because the horizontal transfer of facultative endosymbionts is a well documented feature (11). In this sense, partial Hamiltonella sequences show high nucleotide identity even between isolates from taxonomically distinct hosts.

The molecular identification of H. defensa in the genus Metopolophium extends the reported host range of this endosymbiont. To the author’s knowledge, this is also the first study on microbiota associated to M. dirhodum. Since hymenopteran Aphidius ervi has already been cited parasitizing M. dirhodum in the field (7), the defensive role of H. defensa in this aphid species and the effect of these tritrophic interactions on the population dynamics of the pest deserve further research.

Aknowledgements: to Agr. Eng. (MSc.) Rubén La Rossa

(IMYZA-INTA, Argentina) for confirming the identity of aphids.

The authors would also like to thank Dr. Ricardo Salvador,

Lic. Viviana Barrera, Dr. Marcelo Berretta, Mr. José Niz and

Mr. Marcelo Farinon (IMYZA-INTA) for technical advice. This

work was funded by Consejo Nacional de Investigaciones

Científicas y Técnicas (CONICET, Argentina), Instituto

Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA, Argentina) and

Universidad de Buenos Aires (UBA, Argentina).

Figure 2. Neighbor-joining phylogenetic analysis showing the position of Hamiltonella isolated from M. dirhodum (in bold).

The tree is based on available Hamiltonella 16S rRNA gene sequences (light grey shaded area), with the two additional aphid

secondary endosymbionts Regiella insecticola and Serratia symbiotica as related outgroups. Branches with <50% bootstrap

support are collapsed. Taxonomic names for Hamiltonella isolates refer to host species. Associated labels correspond to

GenBank accession numbers. Bootstrap values (1000 replicates) reported as percentages are indicated at the nodes. The

scale bar represents the number of base substitutions per site.


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Rhinovirus detection by real-time RT-PCR in children with acute respiratory infection in Buenos Aires, Argentina

DÉBORA N. MARCONE1, CRISTINA VIDELA1, CARMEN RICARTE1, GUADALUPE CARBALLAL1, SANTIAGO VIDAURRETA2, MARCELA ECHAVARRÍA1*

1Unidad de Virología y Laboratorio de Virología Clínica y 2Departamento de Pediatría, Centro de Educación Médica e Investigaciones Clínicas (CEMIC) Hospital Universitario. Av. Galván 4102, Buenos Aires, Argentina.


ABSTRACT

Human rhinoviruses (HRV), the major cause of common colds, have a significant genetic diversity and are classified into 3 species (A, B, C) with more than 100 serotypes. HRV species C, described in 2006, can only be detected using molecular methods. The objectives of this paper were to adapt a real-time reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) assay for HRV detection and to further determine the frequency of HRV in respiratory samples from children under 2 years of age, with acute respiratory infection (ARI), from Buenos Aires, Argentina. Two real-time RT-PCR assays amplifying the 207 base pair of the 5’ non-coding region were compared. The original protocol includes locked nucleic acid analogues and a pyrimidine derivative in the forward primer, while the adapted protocol avoided those molecules. Of 67 respiratory samples, 17 (25.4 %) were positive with the original protocol, and 20 (29.9 %) with the adapted one. Discrepant results were confirmed by sequencing analysis. An expanded gold standard was defined to determine the performance of both assays, and was used to describe the clinical characteristics of positive patients. Better sensitivity and specificity were obtained with the adapted protocol. Considering the expanded gold standard, HRV were detected in 23/67 (34.3 %) patients with ARI: 8/18 (44.4%) outpatients and 15/49 (30.6 %) hospitalized. Wheezing episodes were more frequent in HRV positive patients (43.5 %) than in HRV negative patients (18.2 %) (p = 0.041). This study describes the utility and clinical sensitivity of an adapted real-time RT-PCR assay for HRV detection.

Key words: rhinoviruses, real-time RT-PCR, acute respiratory infection, children

RESUMEN

Detección de rinovirus por RT-PCR en tiempo real en muestras respiratorias de niños de Buenos Aires, Argentina. Los rinovirus humanos (RVH) constituyen la principal causa de resfrío común y poseen una gran diversidad genética, con más de 100 serotipos clasificados en tres especies (A, B, C). Los RVH C fueron descritos en 2006 y solo pueden detectarse utilizando métodos moleculares. El objetivo del presente trabajo fue adaptar un protocolo de transcripción reversa seguida de reacción en cadena de polimerasa (RT-PCR) en tiempo real para detectar RVH y posteriormente determinar su frecuencia en muestras de niños menores de 2 años con infección respiratoria aguda (IRA). Se compararon dos protocolos de RT-PCR en tiempo real, que amplifican 207 pares de bases de la región 5’ no codificante. El protocolo original incluyó un cebador directo con análogos de nucleótidos bloqueados (LNA) y un derivado pirimidínico en su secuencia, mientras que el protocolo adaptado no los incluyó. De 67 muestras, 17 (25,4 %) fueron positivas con el protocolo original y 20 (29,9 %) con el protocolo adaptado; los resultados discrepantes se confirmaron por secuenciación. Se definió un gold standard expandido para determinar el desempeño de ambos ensayos y describir las características clínicas de los pacientes RVH positivos. La mejor sensibilidad y especificidad se obtuvo con el protocolo adaptado. Considerando el gold standard expandido, se detectó RVH en 23/67 (34,3 %) pacientes con IRA: 44,4 % (8/18) ambulatorios y 30,6 % (15/49) internados. Los episodios de sibilancias fueron más frecuentes en pacientes RVH positivos (43,5 %) que en RVH negativos (18,2 %) (p = 0,041). El presente estudio describe la utilidad y la sensibilidad clínica de esta RT-PCR en tiempo real adaptada para detectar RVH.

Palabras clave: rinovirus, RT-PCR en tiempo real, infección respiratoria aguda, niños

INTRODUCTION

Human rhinoviruses (HRV) belong to the Picornaviridae family, genus Enterovirus (25) and

were formerly classified in the genus Rhinovirus. To date, more than 100 serotypes have been described and classified into 3 species: A, B and C (22, 23). Their genome is a single 7, 2-kb positive RNA strand

ARTICULO ORIGINAL


with a single open-reading frame (31).HRV are the most frequent cause of common

colds and are also associated with acute otitis media in children and sinusitis in adults (27, 28).

Recent studies have established that HRV can infect the lower airways causing pneumonia and bronchiolitis in children (12, 26), asthma exacerbation in school-aged children and adults, exacerbation of cystic fibrosis (32) and chronic obstructive pulmonary disease in adults (24).

HRV have been identified as an important predictor of recurrent wheezing (14) and asthma development in high-risk children (10). Asymptomatic HRV infection can also occur in infants, children and adults (11, 34, 36).

Isolation of HRV in cell culture is difficult, insensitive and time consuming (36). The development of molecular methods has increased the feasibility of HRV detection. Several reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) assays have been developed for a sensitive detection and differentiation of HRV. Some of them target gene regions that are common for both HRV and enteroviruses (HEV) (1, 7, 13, 15, 30), but other RT-PCR assays are only specific for HRV (8, 16, 33). The 5’ non-coding region (5’NCR) of the viral genome contains highly conserved sequences, thus presenting a convenient area for amplification. However, part of this region is shared with HEV.

There is a significant sequence variation between HRV strains due to the imprecise replication of the RNA by the virus-encoded RNA dependent RNA polymerase and frequent intra and interspecies recombination events (25, 31).

The frequency of HRV detected by molecular methods in hospitalized children with acute respiratory infection (ARI) ranges from 6 % to 35 % (2, 5, 6, 17).

Although HRV is frequently detected in coinfection with other respiratory viruses, the role of this simultaneous presence is not yet established: some authors have proposed that viral coinfection increases the severity of disease, while others have not found differences between coinfection and single infections (2).

The goal of this study was to adapt a real-time RT-PCR for HRV detection described by Lu et al. in 2008 (16). This method allows detection of all HRV species and showed high sensitivity and specificity. In our study, we avoided the use of locked nucleic acid analogues and a pyrimidine derivative (molecules difficult to obtained in Argentina) in the forward primer, while maintaining a good performance of HRV detection. The frequency of HRV, viral coinfection and clinical features was determined in hospitalized and outpatient children under 2 years of age with ARI in Buenos Aires, Argentina.

MATERIALS AND METHODS

Samples

Nasopharyngeal aspirates (NPAs) from 67 patients under

2 years of age with ARI who attended the emergency room

or were hospitalized at CEMIC University Hospital, Buenos

Aires, Argentina, from June to November, 2007, were studied.

NPAs were sent in viral transport media to the Clinical Virology

Laboratory at CEMIC for viral diagnosis. Remaining NPAs

were anonymized and stored at -70 ºC until the HRV studies

were performed. This study was approved by the Institutional

Review Board from CEMIC.

Stored data included: age, clinical characteristics such as

upper respiratory tract infection (URTI), recurrent wheezing

episodes, bronchiolitis, pneumonia, hospitalization days,

oxygen therapy, mechanical ventilation requirement, and

admission to intensive care unit (ICU). In addition, the results

of other viral tests such as respiratory syncytial virus (RSV),

influenza (Flu), adenovirus (AdV) parainfluenza (PIV) by indirect

immunofluorescence and human bocavirus (hBoV) and human

metapneumovirus (hMPV) by PCR were included (3).

PCR controls

Serial 10-fold dilutions of a positive control (HRV 31, ATCC®

VR-506), kindly provided by Dr. Freymuth (Caen University

Hospital, France), were used in two different runs to determine

the limit of detection of each RT-PCR protocol. Positive HEV

controls: serotype 1, 2 and 3 poliovirus 2006 vaccine strains and

HEV 68 (highly similar to HRV) were used to test the specificity

of both RT-PCR assays to detect HRV.

RNA extraction

Viral RNA was manually extracted from 140 ul of the NPA

using the QIAamp Viral RNA kit (Qiagen GmbH, Hilden,

Germany), following manufacturer’s instructions.

RT-PCR assays

Two real-time RT-PCR assays amplifying 207 base pair (bp)

of the 5’ non-coding region (5’ NCR) of HRV were compared.

Protocol A: the real-time RT-PCR protocol recommended

by Lu et al. in 2008 (16). Primers (forward: 5’-CPX GCC ZGC GTG

GC-3’; reverse: 5’-GAA ACA CGG ACA CCC AAA GTA-3’) and

probe (5’-FAM-TCC TCC GGC CCC TGA ATG YGG C-BHQ1-3’)

were kindly provided by Dr. Erdman (CDC, Atlanta, USA). The

forward primer includes locked nucleic acid (LNA) analogues

(X = LNA-dA; Z = LNA-dT) and a pyrimidine derivative (P is

a degenerate base mimicking a C/T mix). This protocol was

performed using iScript One-Step RT-PCR Kit for probes (Bio-

Rad, CA, USA): each 25 μl reaction mixture containing 12.5 μl of

2X reaction mix, 0.25 μl of 100 μM forward and reverse primers,

0.25 μl of 10 μM probe, 0.5 μl of iScript reverse transcriptase,

6.25 μl of nuclease free water, and 5 μl of nucleic acid extract.

RT-PCR cycling conditions were the following: an initial reverse

transcription at 48 ºC for 10 min, 95 ºC for 5 min for polymerase

activation, and then 45 cycles of 95 ºC for 15 s and 55 ºC for 1

min, on a SmartCycler II (Cepheid, CA, USA).

261Rhinovirus detection by real-time RT-PCR

Protocol B: was an adaptation of protocol A. The

sequence of the forward primer was: 5’-CYA GCC TGC GTG

GC-3’, avoiding the use of LNA analogues and the pyrimidine

derivative. The reverse primer and probe were the same as in

protocol A. This protocol was performed using the One-step

RT-PCR kit (Qiagen) that includes two enzymes (Omniscript

and Sensiscript) for the RT and a HotStart Taq DNA polymerase

for amplification. The RT-PCR cycling conditions were the

following: an initial reverse transcription at 50 ºC for 30 min,

95 ºC for 15 min for polymerase activation, and then 45 cycles

of 95 ºC for 15 s and 55 ºC for 1 min, on a SmartCycler II (20).

In addition, protocol B was evaluated with the iScript One-

Step RT-PCR Kit for probes (Bio-Rad) and SuperScrip III

platinum one-step quantitative RT-PCR kit (Invitrogen, Brazil)

to test the performance of different commercial kits. Both kits

include an MMLV reverse transcriptase for the RT step and a

Hot-Start Taq polymerase for the amplification.

Protocol for HEV: a nested RT-PCR for HEV detection was performed in samples with discrepant results with protocol A and B (4). This RT-PCR amplifies a region of 306 bp to 311 bp of the 5’NCR. The RT was performed using an MMLV reverse transcriptase and a recombinant RNasin ribonuclease inhibitor (Promega, WI, USA), and a Taq DNA polymerase recombinant (Invitrogen) for PCR amplification.

Sequencing

Sequencing was performed in samples that were positive

with only one protocol in order to confirm the presence of

HRV. The 207 bp product (obtained with protocol A or B) was

purified using ethanol precipitation and sequenced in both

senses using Authomatic Sequencer 3730XL (Macrogen,

Seoul, Korea). Alignment and analysis of the sequences were

performed using Blast 2.2.24 (37).

Expanded Gold Standard

A true positive for HRV was defined as a sample that was

positive with both, protocol A and B, or with only one protocol,

but further confirmed as HRV by sequencing. A true negative

for HRV was defined as a sample that was negative with both

protocols or with a positive test for HRV with only one protocol

but further confirmed as HEV by PCR. This expanded gold

standard was used to determine the performance of protocols

A and B and for the evaluation of the clinical characteristics in

children with ARI.

Statistical analysis

Performance of protocols A and B, including sensitivity (SE),

specificity (SP), positive (PPV), negative predictive value (NPV)

and receiver operating curves (ROC) with their respective 95

% confidence interval (CI95 %) were calculated using the

expanded gold standard. Rocgold was used to independently

test the equality of the ROC area of each method against a

gold standard curve. For each comparison, Rocgold reports

the raw and the Bonferroni adjusted significance probability.

Fisher’s Exact Test was used to analyze patients’ clinical

and epidemiological data. Mann-Whitney test was used to

compare medians. Statistical significance was assumed for

p values less than 0.05. Statistical analyses were performed

using STATA 7.0 (StataCorp).

RESULTS

Both RT-PCR protocols (A and B) were able to detect HRV in respiratory samples. Of 67 samples, 17 (25.4 %) were positive with protocol A, and 20 (29.9 %) with protocol B. All three commercial RT-PCR reagent kits (Qiagen one-step RT-PCR kit, iScript One-Step RT-PCR Kit for probes and SuperScrip III platinum one-step quantitative RT-PCR kit) proved to be adequate for protocol B.

The limit of detection for HRV was the same with both protocols, and a dilution of 10-5 was achieved of the HRV control. Protocols A and B did not detect poliovirus serotypes 1-3; however, both protocols detected the HEV 68 control.

When testing clinical samples, 1 of 17 HRV positive samples detected with protocol A was negative for HRV with protocol B, and was later confirmed as HEV by a specific RT-PCR. Of the 17 positive samples detected with protocol A, 3 were negative for HRV with protocol B, but were later confirmed as HRV by sequencing. Seven of 20 HRV positive samples detected with protocol B were negative for HRV with protocol A. These 7 samples were later confirmed as HRV by sequencing (Table 1).

When the expanded gold standard was applied, protocol A missed 7 samples and protocol B 3 samples. Therefore, sensitivity (SE) was 70 % and 87 %, respectively. Specificity (SP) was 98 % for protocol A and 100 % for protocol B. The performance

Table 1. Comparison of two real-time RT-PCR vs. the Expanded Gold Standard for HRV detection, in 67 NPAs from children with ARI. Buenos Aires, Argentina

Protocol Expanded Gold Standard Total

Positive (n = 23) Negative (n = 44) (n = 67)

APositive 16 1 17

Negative 7 43 50

BPositive 20 0 20

Negative 3 44 47

A true positive for HRV was defined as a sample that was positive with both, protocol A and B, or with only one protocol, but further confirmed as HRV by sequencing. A true negative for HRV was defined as a sample that was negative with both protocols or with a positive test for HRV with only one protocol but further confirmed as HEV by PCR. This expanded gold standard was used to determine the performance of protocols A and B and for the evaluation of clinical characteristics in children with ARI.


of both protocols including SE, SP, PPV and NPV are shown in Table 2. Protocol B performed better in the detection of HRV. However, no statistically significant differences were observed in the ROC Area between both protocols.

The clinical characteristics of children with ARI and true positive HRV cases (expanded

gold standard) are shown in Table 3. The overall frequency of HRV was 23/67 (34.3 %): 8/18 (44.4 %) outpatients and 15/49 (30.6 %) hospitalized children were HRV positive. The median length of stay was 5 days. All 15 children received oxygen therapy with a median of 4 days. Of 49 hospitalized patients, 1 (2.0 %) was admitted to the ICU due to respiratory illness for 4 days and received mechanical ventilation during 3 days; he was only diagnosed HRV.

Median age was 10 months (range 1-48 months) for HRV positive patients, and 8 months (range 1-36 months) for HRV negative patients. Clinical characteristics associated with HRV infection include: URTI, wheezing, bronchiolitis and pneumonia. All HRV positive patients had rhinitis, 70 % had difficulty breathing, and 30 % fever.

HRV was statistically associated with recurrent episodes of wheezing, which was observed in 10 of 23 children (43.5 %), compared to 8 of 44 (18.2 %) children with wheezing and without HRV (p = 0.041). Fever and bronchiolitis were statistically more frequent in HRV negative patients.

HRV were detected throughout the studied period (June to November 2007).

Of 67 patients studied, 32 (47.7 %) were negative for HRV but positive for other respiratory viruses, and 12 (17.9 %) patients were negative for any respiratory viruses studied. The frequency for each respiratory virus is shown in Table 4.

DISCUSSION

Over the last years, HRV have gained wider recognition as clinically relevant pathogens causing not only mild respiratory infections, but also severe respiratory disease. Association with recurrent episodes of wheezing, asthma and severe lower respiratory disease has also been reported (10, 12, 14, 24, 26).

The diagnosis of the classical respiratory viruses was usually done by IF using specific monoclonal antibodies. However, given the high diversity of HRV, there are no specific monoclonal antibodies available for their diagnosis. The development and use of molecular methods for all HRV have improved the diagnosis.

Many molecular assays have been designed for HRV detection; RT-PCR protocols usually target the conserved 5’NCR region (a region that shares common areas for HRV and HEV). However, it has been difficult to obtain a sensitive RT-PCR protocol capable of detecting all HRV strains. Protocols designed before 2006 may be less sensitive since they did not include the sequences from HRV species C in their design.

In 2008, Lu et al. (USA) described a real-time RT-PCR assay (herein known as protocol A) that targets a conserved region in the 5’NCR and is able to detect all HRV species (A, B, C) (16). These authors tested 48 HEV laboratory strains. Of these, 34 HEV were non- reactive, and 14 (including echovirus 1, 3, 5, 6, 13, 21; poliovirus types 1 and 2; enterovirus types 68 and 71; coxsackievirus types A4, A6, A24 and B1) showed slightly positive reactions. Lu et al. suggested that these reactions with HEV appeared to be related to the virus titer, rather than to any particular virus type. Using the RT-PCR reported by these authors, Faux et al. (Australia) using the RT-PCR published by Lu et al., also confirmed that all HRV species were detected, but it was negative for several HEV tested (9).

In order to improve the performance, protocol A included LNA analogues and a pyrimidine derivative in the forward primer. Specifically, these LNA analogues were able to increase the melting temperature of the primer. Therefore, a balanced midpoint temperature was achieved for both primers. We have adapted the protocol described by Lu et al., avoiding the use of LNA analogues and pyrimidine derivative in the forward primer (protocol B). These reagents are only produced by one company, and are therefore difficult to obtain outside the USA.

Protocol B showed higher SE, SP, PPV and NPV compared to protocol A, although this difference was not statistically significant. Another advantage of protocol B is that it can be run with different commercial enzymes kits. On the contrary, protocol A failed entirely

Table 2. Performance parameters of two real-time RT-PCR for HRV detection

Protocol SE (CI95%) SP (CI95%) PPV (CI95%) NPV (CI95%) ROC Area (CI95%) X2 (1gl) p X2 p Bonferroni

A 69.6 (58.6-80.6) 97.7 (94.2-100.0) 94.1 (88.5-99.8) 86.0 (77.7-94.3) 0.837 (0.7-0.9)2.05 0.153 0.458

B 87.0 (78.9-95.0) 100.0 (100.0-100.0) 100.0 (100.0-100.0) 93.6 (87.8-99.5) 0.935 (0.9-1)

SE: Sensitivity; SP: Specificity; PPV: positive predictive value; NPV: negative predictive value; CI95%: confidence interval 95%


Table 4. Detection of respiratory viruses in 67 children with ARI and HRV diagnosis

Respiratory HRV positive HRV negative Total virus n (%) n (%) n (%)

RSV 0 - 14 (31.8) 14 (28.4)hBoV 6 (26.1) 3 (6.8) 9 (20.9)hMPV 3 (13.0) 4 (0.9) 7 (13.4)AdV 0 - 3 (6.8) 3 (4.5)Flu 0 - 2 (4.5) 2 (3.0)PIV 0 - 1 (2.3) 1 (1.5)RSV + hBoV 1 (4.3) 4 (0.9) 5 (1.5)hBoV + hMPV 0 - 1 (2.3) 1 (3.0)Negative 13 (56.5) 12 (27.3) 25 (17.9)

Total (n) 23 44 67

HRV: human rhinovirus; RSV: respiratory syncytial virus; hBoV: human bocavirus; hMPV: human metapneumovirus; AdV: adenovirus; Flu: influenza; PIV: parainfluenza.

Table 3. Clinical characteristics of 67 children under 2 years of age with ARI

HRV Positive (n = 23) HRV Negative (n = 44) n (%) n (%) pMedian age. month (range) 10 (1-48) 8 (1-36) 0.074(1)

Gender, Male 15 (65.2) 29 (65.9) 0.999(2)

Hospitalized 15 (65.2) 34 (77.3)0.385(2)

Outpatient 8 (34.8) 10 (22.7)

Clinical diagnosis

Pneumonia 3 (13.0) 6 (13.6) 0.999(2)

Bronchiolitis 5 (21.7) 22 (50.0) 0.036(2)

Wheezing episodes 10 (43.5) 8 (18.2) 0.041(2)

URTI 5 (21.7) 8 (18.2) 0.753(2)

Clinical findings

Rhinitis 23 (100.0) 44 (100.0) 0.999(2)

Fever 7 (30.4) 26 (59.1) 0.039(2)

Difficulty breathing 16 (69.6) 35 (79.5) 0.381(2)

Acute otitis media 2 (8.7) 6 (13.6) 0.705(2)

Clinical severity of Hospitalization

Median Days 5 6 0.034(1)

ICU admissions 1 (4.3) 7 (15.9) 0.406(2)

Median Days in ICU 4 14 0.149(1)

Requiring mechanical ventilation 1 (4.3) 5 (11.4) 0.652(2)

Median Days under mechanical ventilation 3 9.5 0.218(1)

Requiring oxygen 15 (65.2) 30 (68.2) 0.298(2)

Median Days of oxygen requirement 4 4 0.244(1)

URTI: Upper respiratory tract infection; ICU: Intensive care unit.(1) Mann-Whitney test was used.(2) Fisher bilateral test was used.


when using the SuperScript III platinum kit. We chose the Qiagen OneStep RT-PCR kit to perform protocol B because it includes two Reverse Transcriptases: an Omniscript and a Sensiscrip, which are optimized for high and low amounts of RNA, respectively. Both enzymes exhibit high affinity for RNA, thus facilitating transcription through secondary structures, such as IRES, present in the 5’NCR of HRV.

In our study, the overall frequency of HRV in children with ARI was 34.3 %: 30.6 % in hospitalized patients and 44.4 % in outpatients. These results are similar to those previously reported in other countries (2, 5).

Two previous publications on HRV in hospitalized children with recurrent wheezing from Argentina reported frequencies of 23 % - 25 % (18, 19), with a conventional RT-PCR. The higher frequency detected in our study may be due to differences in the studied population, or to the use of a more sensitive RT-PCR assay. Some RT-PCR may be less sensitive in detecting certain HRV strains; the use of more specific and sensitive real-time RT-PCR protocols may be necessary to better establish the frequency and epidemiology of these viruses.

Protocol B has been recently performed in our laboratory to study 347 children under 6 years of age with ARI, and enrolled throughout a whole year (June 2008 to May 2009). Results showed an HRV frequency of 43 % in hospitalized and 26 % in outpatient children (21, 35).

In the present study, the only sign statistically associated with HRV was recurrent wheezing episodes (p = 0.041). Likewise, Piotrowska et al. (29) conclude that HRV are the major cause of wheezing among children under 2 years of age.

Of the 23 patients with HRV, 43.5 % were diagnosed to be coinfected with other respiratory virus, and 7 (30.4 %) of them were hospitalized. HRV coinfection was most frequently with hBoV, followed by hMPV and RSV. One hospitalized patient, who required oxygen therapy, had a triple coinfection: HRV, RSV and hBoV.

In conclusion, the adapted protocol B proved to properly detect HRV in respiratory samples. Further studies including a larger series of patients with ARI and sequencing HRV samples to identify HRV types are needed to better determine the epidemiology and impact of these viruses in Argentina.

Acknowledgments: the authors would like to thank David

Veyer for his work in HRV detection; pediatricians, residents and

nurses from CEMIC University Hospital for patients’ recruitment

and sample collection; Natalia Del Rio for technical assistance;

Fernando Poletta and Juan A. Gili for statistical assistance,

and Valeria Melia for language revision of the manuscript. This

work was granted by PICT 2006-650 from National Scientific

and Technologic Agency (ANPCYT). DNM is a PhD student and

CR a technician, both from the National Research Council of

Argentina (CONICET); ME is a researcher from both CONICET

and CEMIC.

Conflict of interestCompeting interest: None declaredEthical approval: Yes

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Campylobacter spp.: prevalencia y caracterización feno-genotípica de aislamientos de pacientes con diarrea

y de sus mascotas en la provincia de La Pampa, Argentina

ANA L. TAMBORINI1*, LUIS M. CASABONA 1, MARÍA R. VIÑAS2, VALERIA ASATO2, ALICIA HOFFER 2, MARÍA I. FARACE2, MARÍA C. LUCERO2, ALEJANDRA CORSO2, MARIANA PICHEL 2

1Servicio de Bacteriología, Establecimiento Asistencial “Dr. Lucio Molas”, Raúl B. Díaz y Pilcomayo, Santa Rosa, La Pampa (L6300); 2Departamento de Bacteriología, Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas

ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”, Av. Vélez Sarsfield 563 (1281) CABA, Argentina.*Correspondencia. E-mail: [email protected]

RESUMEN

Se investigó la prevalencia de Campylobacter spp. en 327 pacientes con diarrea y en 36 animales (perros, gatos y pollos) que convivían con pacientes en los que se detectó este patógeno; el estudio se llevó a cabo en Santa Rosa, La Pampa, Argentina. Se aisló Campylobacter spp. en 50/327 pacientes y en 12/36 animales, Campylobacter jejuni fue la especie más frecuente. Se detectó resistencia a ciprofloxacina (65 %) y a tetraciclina (32 %) en una selección de 35 aislamientos de origen humano. En el análisis por electroforesis de campo pulsado de 13 aislamientos de C. jejuni se identificaron siete subtipos genéticos. Dos subtipos agruparon aislamientos de pacientes y de sus respectivos perros, y un tercer subtipo agrupó 1 aislamiento humano y 2 de pollos de ese paciente. Si bien las aves son reconocidas como el principal reservorio, es importante fortalecer la vigilancia de Campylobacter spp. en mascotas, las cuales pueden ser portadores asintomáticos del patógeno.

Palabras clave: Campylobacter spp., diarrea, mascotas, subtipos genéticos

ABSTRACT

Campylobacter spp.: prevalence and pheno-genotypic characterization of isolates recovered from patients suffering from diarrhea and their pets in La Pampa Province, Argentina. The prevalence of Campylobacter spp. was investigated in 327 patients suffering from diarrhea and in 36 animals (dogs, cats and chickens) owned by the patients that presented infection by Campylobacter in Santa Rosa, La Pampa, Argentina. Campylobacter spp. was isolated in 50/327 patients and in 12/36 animals, being Campylobacter jejuni the most common species. Resistance to ciprofloxacin (65 %) and tetracycline (32 %) was found among 35 isolates of human origin studied. Seven genetic subtypes were observed among 13 C. jejuni isolates by pulsed field gel electrophoresis. Two subtypes grouped isolates belonging to patients and their respective dogs whereas another subtype grouped one isolate of human origin and two isolates from the patient´s chickens. The results of this investigation highlight the need to strengthen surveillance of Campylobacter spp. not only in poultry, which is recognized as the main reservoir, but also in pets, which were shown to be asymptomatic carriers of the pathogen.

Key words: Campylobacter spp., diarrhea, pets, genetic subtypes

La campilobacteriosis es una zoonosis de distribución mundial. Campylobacter spp. se halla habitualmente como comensal del tracto gastrointestinal de animales domésticos y salvajes, entre los cuales las aves de corral constituyen el principal reservorio y vehículo de transmisión del

patógeno (1, 6). Muchos casos de enteritis humana por Campylobacter spp. han sido asociados al contacto con animales o al consumo de agua contaminada, de leche cruda o de alimentos de origen animal parcialmente cocidos. Las especies termotolerantes, Campylobacter jejuni y Campylobacter coli, son



267

las más frecuentemente aisladas en casos de diarrea aguda en el hombre (6). En nuestro medio, la distribución de este microorganismo en el ambiente y en otros huéspedes animales (mascotas) no ha sido ampliamente estudiada (6, 8).

Entre los años 2009 y 2010, Campylobacter spp. fue reconocido como el principal agente etiológico en pacientes con diarrea en el Establecimiento Asistencial “Dr. Lucio Molas” (datos no publicados). A partir de estos antecedentes, se plantearon como objetivos del presente trabajo conocer la prevalencia de Campylobacter spp. como causal de diarrea aguda en humanos y caracterizar feno-genotípicamente los aislamientos recuperados de muestras clínicas de origen humano y de aves (pollos) y animales domésticos (perros y gatos) que convivían con los pacientes infectados, considerados estos últimos como posibles vías de transmisión del microorganismo. Este estudio comprendió la población de distintos barrios de la ciudad de Santa Rosa (La Pampa, Argentina) y fue de tipo descriptivo, de corte transversal. Desde el 1 de octubre de 2010 hasta el 1 de octubre de 2011 se realizaron 327 coprocultivos de muestras correspondientes a pacientes con diarrea aguda, que concurrieron al Servicio de Bacteriología del Hospital “Dr. Lucio Molas”, previa consulta médica y consignación de datos filiatorios. El rango etario de los pacientes estuvo comprendido entre 2 meses y 59 años, el 61,7 % de ellos eran menores de 4 años.

Las muestras de materia fecal fueron procesadas para la búsqueda de enteropatógenos bacterianos. En aquellos pacientes con aislamiento positivo para Campylobacter spp., se realizó una visita a las viviendas, una encuesta y posteriormente hisopados rectales de mascotas y aves que compartían el espacio físico con los pacientes.

Las muestras de los pacientes y los hisopados de origen animal se cultivaron en medio selectivo para Campylobacter spp. (Campylosel Agar-bioMèrieux, Marcy/Etoile, Francia) y se incubaron en atmósfera de microaerofilia (GENbox microaer bioMèrieux) durante 48 h a 42 ºC. La identificación presuntiva se realizó mediante un examen en fresco de las colonias aisladas y coloración de Gram. Los aislamientos se caracterizaron por pruebas bioquímicas convencionales: catalasa, citocromo oxidasa, hidrólisis del indoxil acetato e hidrólisis del hipurato (5). Las especies identificadas fenotípicamente fueron confirmadas por PCR múltiple como C. jejuni y C. coli, según el protocolo de PCR de la Red WHO Global Foodborne Infections Network América del Sur (14). La extracción de ADN se realizó por hervido a partir de aislamientos caracterizados fenotípicamente como C. jejuni y C. coli.

Se determinó la sensibilidad a los antimicrobianos por el método de dilución en agar según el documento M45-A2 del CLSI; las drogas evaluadas fueron eritromicina, tetraciclina, ciprofloxacina, gentamicina y nitrofurantoína (3). Para la interpretación de los resultados con las primeras tres drogas se utilizaron los puntos de corte sugeridos en la Tabla 4 del citado documento, mientras que para la nitrofurantoína y la gentamicina, no incluidas en dicha tabla, se utilizaron los puntos de corte para Enterobacteriaceae de la Tabla 2A, M100-S22 (4), como lo sugiere la literatura internacional. Por consenso y en el marco del Programa Nacional de Vigilancia de la Resistencia a los Antimicrobianos WHONET – Grupo Campylobacter, se enviaron al INEI-ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” los cinco primeros aislamientos de cada mes de origen humano; además, se remitió una selección de aislamientos de origen animal vinculados con los casos.

A fin de determinar la posible relación genética entre los aislamientos, se analizó una selección de 13 aislamientos de C. jejuni y 2 de C. coli de origen humano y/o provenientes de animales con evidencia de contacto (Tabla 1). Se aplicó el protocolo estandarizado de electroforesis en campo pulsado (PFGE) de la red PulseNet Internacional con la enzima de restricción SmaI, considerada como una técnica de poder discriminatorio para la subtipificación molecular de Campylobacter spp. (11, 13). Los resultados obtenidos fueron analizados usando el software BioNumerics v. 4.6 (Applied Maths) y los dendrogramas se construyeron aplicando el coeficiente de Dice, método UPGMA. La interpretación de los perfiles genéticos fue realizada teniendo en cuenta la robustez de la técnica de subtipificación, la diversidad genética del microorganismo en estudio, la prevalencia de cada patrón en el país y el contexto epidemiológico del estudio (2).

Con fines comparativos y de interpretación de resultados, los perfiles genéticos obtenidos se compararon con aquellos ingresados en la Base de Datos Nacional (BDN) de subtipos de C. jejuni y C. coli. Esta base contiene información recopilada desde el año 2005 hasta 2011 de casos esporádicos y asociados a brote, y de aislamientos de origen animal (aves) procedentes de diferentes provincias argentinas, en el marco de la Red Nacional de Diarreas y Patógenos Bacterianos de Transmisión Alimentaria.

Se aisló Campylobacter spp. en 50 de 327 muestras de origen humano (15,2 %). Otros enteropatógenos identificados fueron Shigella spp. (12,5 %), Salmonella spp. (8 %), Escherichia coli enteropatógeno (EPEC) (2,4 %) y Escherichia coli

Campylobacter spp. en humanos y mascotas


enterohemorrágico (EHEC) (0,9 %). Las especies de Campylobacter encontradas fueron C. jejuni (n = 48) y C. coli (n = 2). Los resultados de la prueba de hidrólisis del hipurato de dos aislamientos de C. jejuni fueron de difícil interpretación, pero su identificación fue confirmada por PCR. De los 50 pacientes cuyos aislamientos fueron positivos para Campylobacter spp., 39 (78 %) eran menores de 4 años; 40 (80 %) tenían animales (perros, gatos, pollos), 6 (12 %) no tenían animales y 4 (8 %) no pudieron ser encuestados. De 36 animales

hisopados se aisló Campylobacter spp. en 12 muestras (33,3 %); 11 de estas contenían C. jejuni y la otra C. coli.

Se observó un 65 % de resistencia a ciprofloxacina y un 32 % de resistencia a tetraciclina en los 35 aislamientos de origen humano analizados. No se detectó resistencia a eritromicina, nitrofurantoína y gentamicina (Tabla 2). Los aislamientos de origen animal presentaron el mismo perfil de sensibilidad que aquellos genéticamente relacionados de origen humano (Figura 1).

Tabla 2. Perfil de sensibilidad a los antimicrobianos de aislamientos de C. jejuni y C. coli de origen humano (n = 35)

ATB % R CIM50 (μg/ml) CIM90 (μg/ml) Rango (μg/ml)

ERI 0(1) 0,5 2 0,25 -2

CIP 65(1) 8 32 0,06 -32

TET 32(1) 0,25 128 0,06 - 512

NIT 0(2) 1 1 0,25 -2

GEN 0(2) 0,5 0,5 0,25 -1

ATB: antimicrobiano; ERI: eritromicina, CIP: ciprofloxacina, TET: tetraciclina, NIT: nitrofurantoína, GEN: gentamicina; R: resistente según, (1) los puntos de corte para Campylobacter spp. establecidos por el CLSI (3); (2) los puntos de corte para Enterobacteriaceae establecidos por el CLSI (4). No se detectaron aislamientos con sensibilidad intermedia.

Tabla 1. Selección de aislamientos de C. jejuni y C. coli de origen humano y animal analizados por PFGE

N.º Aislamiento Identificación Fecha de aislamiento Origen Edad (años)

324/10(1) C. jejuni 04/10/10 Humano 59

332/10(2) C. jejuni 07/10/10 Humano 2

375/10(2) C. jejuni 07/10/10 Animal (perro)

379/10(3) C. jejuni 10/11/10 Humano 2


49/11(4) C. jejuni 01/02/11 Humano 1

51/11(4) C. coli 02/02/11 Animal (perro)

116/11(5) C. jejuni 11/04/11 Humano 51

111/11(5) C. jejuni 14/04/11 Animal (pollo)


129/11(6) C. jejuni 25/04/11 Humano 4


143/11(7) C. coli 11/05/11 Humano 1

144/11(7) C. jejuni 11/05/11 Animal (gato)


(1) Este paciente tenía contacto con una mascota (perro), pero el aislamiento de origen animal no fue recuperable para el análisis por PFGE; (2), (3), (4), (5), (6), (7) cada número agrupa aislamientos de origen humano y de sus respectivas mascotas y/o pollos.

269Campylobacter spp. en humanos y mascotas

En el análisis por PFGE-SmaI de 13 aislamientos de C. jejuni se identificaron siete subtipos genéticos. Dos de los subtipos, denominados ARDBRS16.00128 y ARDBRS16.0022, agruparon aislamientos de un paciente y de su correspondiente mascota (perro), el patrón ARDBRS16.022 agrupó, además, un aislamiento recuperado de un ave no relacionada. El subtipo ARDBRS16.0080 agrupó un aislamiento de origen humano, dos de aves de dicho paciente y uno de una mascota (gato) correspondiente a otro paciente. Los restantes aislamientos presentaron cuatro perfiles genéticos diferentes, dos de ellos con mayor similitud al patrón ARDBR16.0022 (Figura 1). Al comparar con la BDN, se observó que 2 de los 7 subtipos genéticos de C. jejuni, ARDBRS16.0022 y ARDBRS.0080, habían sido determinados en otras provincias de Argentina en aislamientos de origen

humano, en particular en Buenos Aires, Córdoba, Neuquén, Río Negro y Santa Fe; estas tres últimas provincias eran las de mayor representación dentro de la BDN. Los dos aislamientos de C. coli mostraron patrones de PFGE diferentes entre sí, los que fueron identificados anteriormente en aislamientos humanos y de aves de otras provincias.

En el período analizado, Campylobacter spp. fue el enteropatógeno más frecuentemente aislado en los casos de diarrea del Hospital “Dr. Lucio Molas”. La especie predominante fue C. jejuni, y los menores de 4 años fue el grupo etario más afectado. Estos datos son comparables con los comunicados en otros países (1). La PCR múltiple permitió confirmar las especies de Campylobacter spp. caracterizadas fenotípicamente y resultó útil para la identificación de aislamientos con resultados de difícil interpretación

Figura 1. Análisis de los patrones genéticos de aislamientos de C. jejuni (dendograma 1) y de C. coli (dendograma 2) de

origen humano y animal obtenidos por PFGE-SmaI y perfiles de resistencia a antimicrobianos. Se indican con recuadros los

aislamientos de C. jejuni de origen humano y animal que fueron agrupados en clusters o grupos con idéntico perfil de PFGE.

CIP: ciprofloxacina, TET: tetraciclina, R: resistente, S: sensible.

Dendograma 2

Dendograma 1


en la prueba de hidrólisis del hipurato (7). Los altos porcentajes de resistencia a

ciprofloxacina y a tetraciclinas detectados coinciden con los observados a nivel nacional (9). Otros autores sugieren que los niveles de resistencia a fluoroquinolonas podrían estar relacionados con el uso de estos antimicrobianos en veterinaria (12). No se detectaron aislamientos resistentes a eritromicina ni a nitrofurantoína, mientras que en el resto del país se han informado muy bajos porcentajes de resistencia a macrólidos (3 %) y no se ha registrado resistencia a nitrofuranos (9). Sobre la base de estos resultados preliminares, la eritromicina podría utilizarse en nuestra población como droga de primera elección para el tratamiento de aquellas diarreas graves por Campylobacter spp. que lo requieran, en concordancia con informes de otras partes del mundo (10, 12).

La relación genética observada entre los aislamientos de pacientes y de sus mascotas sugiere la posible exposición a una misma fuente de infección a través de la alimentación, o bien, la transmisión de C. jejuni entre los pacientes y sus mascotas, como lo demostraron Wolfs et al. al informar el primer caso comprobado genéticamente de transmisión de C. jejuni entre animales y seres humanos (15). La identificación de subtipos genéticos de C. jejuni compartidos por distintos huéspedes y encontrados en diferentes provincias y años sugiere la circulación en el país de aislamientos con potencial de diseminación y transmisibilidad entre distintos huéspedes.

Estos resultados plantean la necesidad de fortalecer la vigilancia y el control de Campylobacter spp., considerando no solo el estudio de las aves reconocidas como principal reservorio a nivel mundial, sino también el de otros animales que podrían estar en contacto con las personas, como las mascotas (perros y gatos), ya que estas fueron evidenciadas como portadores asintomáticos del patógeno. El contacto con estos animales podría constituir un factor de riesgo para la infección, agravado en zonas con hábitos higiénicos deficientes.

A partir de los hallazgos presentados, es importante promover la integración de las áreas de trabajo de laboratorio, clínica humana y veterinaria, con el objetivo de contar con estudios epidemiológicos completos de vigilancia e investigación de brotes en el país, que permitan determinar fuentes de infección y vías de transmisión del microorganismo, para la toma de medidas oportunas de prevención y control.

Agradecimientos: al personal del Servicio de Bacteriología

del Hospital “Dr. Lucio Molas” por su colaboración. Al Dr.

Marcos Mayer y a la Dra. Claudia Elorza, por la revisión del

manuscrito.

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Isolation of Serratia rubidaea from a mixed infection after a horse bite

MIRTA R. LITTERIO1*, SOLANGE ARAZI2, CLAUDIA HERNÁNDEZ1, HORACIO LOPARDO1

Servicios de 1Microbiología y 2Control Epidemiológico e Infectología, Hospital de Pediatría “Prof. Dr. Juan P. Garrahan”. Combate de los Pozos 1881 (1245) Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.


ABSTRACT

Horse bite infections are very rarely reported in the medical literature. Here we present a case of a severe

facial infection in a 2-year-old boy after a horse bite, from which Serratia rubidaea and Enterobacter cloacae

were isolated. Some pieces of grass were found inside the wound and were removed before performing a

surgical toilet. The presence of these two gram-negative bacteria associated with a horse bite infection,

as well as other organisms such as anaerobes, Pseudomonas, gram-positive cocci, Actinobacillus spp.,

previously described in other works, should be taken into account when selecting the antibiotics for

prophylactic treatment of farm animal bites.

Key words: Serratia rubidaea, horse bite, pediatrics

RESUMEN

Aislamiento de Serratia rubidaea de una infección mixta posterior a la mordedura de un caballo. Los

casos de infecciones por mordedura de caballo son muy infrecuentemente comunicados en la literatura. Aquí

se presenta un caso de infección facial grave posterior a la mordedura de un caballo en un niño de 2 años.

De esa herida se aislaron Serratia rubidaea y Enterobacter cloacae. Algunos trozos de pasto se encontraron

dentro de la herida y se extrajeron antes de realizar la limpieza quirúrgica. La presencia de esos dos bacilos

gram negativos como microorganismos asociados a una infección posterior a una mordedura de caballo,

del mismo modo que la de otros microorganismos descritos en la literatura (anaerobios, Pseudomonas,

cocos gram positivos, Actinobacillus spp.), debe tomarse en cuenta a la hora de elegir antibióticos para

realizar un tratamiento profiláctico de pacientes que sufran una mordedura por animales de granja.

Palabras clave: Serratia rubidaea, mordedura, caballo, pediatría

Animal bites frequently cause only minor injury in humans. Only 1 to 2 % of victims require hospitalization. Most of these injuries are produced by dogs and cats because they share their habitat with humans (6). Infection rates are variable depending on the animal, the nature of the wound, the treatment and the delay in seeking medical care. Most primary infections are polymicrobial, reflecting the oral microbiota of the animal. However, few species may penetrate into deep tissues, including bones and joints, producing bacteremia. Horse bite infections are very rarely reported in the medical literature.

Here we present a case of severe facial infection in a 2-year-old boy after a horse bite, from which Serratia rubidaea and Enterobacter cloacae were isolated.

A previously healthy 2-year-old boy was bitten on his left cheek by a horse. He was admitted to hospital, where a surgical toilet was performed. Some pieces of grass were found inside the wound and removed before performing the toilet. The wound was sutured and prophylactic ampicillin-sulbactam was administered. Rabies and tetanus vaccines were applied. The patient was discharged on oral amoxicillin-clavulanic acid treatment. Three days later, he was readmitted due to



273

worsening of the wound, around which swelling and erythema were observed. A purulent discharge in the absence of fever subsequently appeared. This purulent material was removed and cultured at the microbiology laboratory. Another surgical toilet followed by suturing was performed and the patient was discharged again on oral amoxicillin-clavulanic acid (50 mg/kg/d). Outcome was good and the patient was followed-up by the department of plastic surgery.

Following the current guidelines of our laboratory for the initial procedures of samples obtained by punction-aspiration or biopsy, the purulent material from the wound was cultured in the following media: chocolate agar incubated at 35 °C in 5 % CO2, sheep blood agar and thioglycolate broth both incubated in air, anaerobic 5 % laked blood agar and brain heart infusion, supplemented with vitamin K, hemin, and yeast extract in anaerobiosis. Two different isolates (E. cloacae and S. rubidaea) were observed in anaerobic conditions, while only one of them (E. cloacae) was isolated in aerobically incubated media. Identification was performed by conventional tests, api20E and Vitek 1 (bioMèrieux, Argentina). E. cloacae and S. rubidaea were identified using all three methods. Key tests to suspect Serratia spp. were: DNase positive, gelatinase positive and lipase positive in egg-yolk agar media. The strain did not show pigment and produced acid from adonitol, L-arabinose and D-arabitol. Vitek 1 (biochemical profile number 7624757230, 99 % probability) and API 20E (biochemical profile number 120716357, 88 % probability), confirmed our initial suspicion. Our results were also confirmed by the Argentinean Reference Center of Bacteriology (Servicio de Bacteriología Especial, INEI-ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”).

Susceptibility tests were performed with the disk diffusion method following the CLSI guidelines (2) and with the Etest (bioMèrieux, Argentina). The organism was susceptible to colistin, ampicillin, ampicillin-sulbactam, piperacillin, piperacillin-tazobactam, cefoxitin, cefotaxime, cefepime, ceftazidime, imipenem, meropenem, gentamicin, amikacin, aztreonam, ciprofloxacin, trimethoprim-sulfamethoxazole, and resistant to cephalotin.

Susceptibility to colistin initially determined using the disk diffusion method (14 mm) was confirmed with the Etest (0.5 µg/ml).

S. rubidaea is unusually recovered from clinical samples in microbiology laboratories. The pieces of grass inside the wound may be the source of S. rubidaea considering its ability to colonize vegetables. We would like to highlight the isolation of this organism for the following reasons: 1) its infrequent occurrence in samples from human infections, 2) because microbiologists should be aware that animal bite infections may be due not only to oropharyngeal-

colonizing organisms, but also to skin-colonizing organisms or, as in the present case, to organisms found in the environment, and 3) the unusual susceptibility of the S. rubidaea isolate to colistin, a drug that showed to be ineffective against organisms of the genus Serratia with the exception of Serratia fonticola (12).

The literature cited in PubMed related to horse bite infections was reviewed and 42 references were found. Only seven of them described cases of patients bitten by horses. The infection was due to mixed organisms in four cases, Actinobacillus species were involved in three cases, whereas Enterobacteriaceae were present in four (including the present report). Only two cases were due to Pasteurella spp., anaerobic bacteria were isolated in only one case, and two species of viridians streptococci were found (1, 3-5, 7, 9, 10) (Table 1) in another case. Two other cases involving both a donkey and a zebra, were reported (Table 1). One reported a case of infection due to Streptococcus agalactiae and Pseudomonas aeruginosa after a zebra bite (13). The other was a case of Staphylococcus hyicus infection after a donkey bite (8).

Actinobacillus lignieresii and other Actinobacillus spp., gram-positive aerobic cocci, Pseudomonas, Enterobacteriaceae, Pasteurella, and anaerobic bacteria could be the causal agents of infections after horse bites.

The genus Serratia includes several species that are seldom a cause of primary infections, being instead frequently involved in nosocomial human infections. S. rubidaea, a red-pigmented species, has been mainly described as an environmental colonizer. The habitats of S. rubidaea are not well known. It has been isolated from coconuts and vegetables but not from water, insects, or other animals (11). Its clinical significance in human infections cannot be excluded since it has been reported in association with some cases of invasive diseases (11). As animal bite wounds may be infected by bacteria colonizing the victim’s skin, by organisms living in the offender’s mouth, as well as by those coming from the environment, we suspect that the grass extracted from the wound could have been the source of this organism.

Susceptibility to amoxicillin and resistance to first- and second-generation cephalosporins have previously been described for this species (12).

Taking into account that the genus Serratia is almost uniform in its natural resistance to colistin, we highlight the susceptibility to colistin of this isolate. A large study describing natural antimicrobial susceptibilities of unusual Serratia species failed to include data about colistin or polymyxin B (12). As information about natural resistance to colistin in S. rubidaea is lacking, we are not able to determine if this case was an exception or if S. rubidaea is naturally susceptible to polymyxins.

Serratia rubidaea and horse bite


The good outcome of the patient in the present work in spite of using an ineffective drug for one of the two isolated pathogens (amoxicillin-clavulanic acid) could be explained either by the fact that the patient underwent extensive surgical toilet or because E. cloacae would only be colonizing the zone around the wound.

Table 1. Wound infections produced by horses and similar animals

Animal Bacteria Age and sexUnderlying disease

Reference

HorseStreptococcusanginosus + Streptococcus mutans

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HorseActinobacillus lignieresii + Escherichia coli + anaerobes

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Donkey Staphylococcus hyicus subsp. hycus 20 y, F No Osterlund et al. 1997 (8)

Zebra S. anginosus + Pseudomonas aeruginosa 44 y, F No Toovey et al. 2004 (13)

Horse Serratia rubidaea + Enterobacter cloacae 2 y, M No This study

(1) ND: not determined


The presence of these two gram-negative bacteria as organisms associated with a horse bite infection, as well as other organisms previously described in other works (anaerobes, Pseudomonas, gram-positive cocci, Actinobacillus spp.) (Table 1), should be taken into consideration when selecting the antibiotics to be use in the prophylactic treatment of farm animal bites.

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Acanthamoeba sp.: un caso de queratitis no relacionadacon el uso de lentes de contacto

CLAUDIA MENGHI*, MARÍA C. CARIDE, CLAUDIA GATTA

Laboratorio de Parasitología Clínica, Cátedra de Microbiología Clínica, Hospital de Clínicas, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires. Av. Córdoba 2351

(1113) Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.*Correspondencia. E-mail: [email protected]

RESUMEN

La queratitis por Acanthamoeba sp. generalmente se relaciona con el uso de lentes de contacto y en menor proporción se vincula con el contacto con agua contaminada. Se caracteriza por una disminución de la capacidad visual y la presencia de un fuerte dolor ocular. Al examen clínico, puede confundirse con una infección herpética. Si la infección no es diagnosticada y tratada a tiempo en forma adecuada, puede culminar en la perforación de la córnea y, eventualmente, en la pérdida del ojo. En este trabajo se informa uno de los pocos casos registrados de queratitis por Acanthamoeba sp. no relacionada con el uso de lentes de contacto.

Palabras clave: Acanthamoeba sp., queratitis bilateral, agua contaminada

ABSTRACT

Acanthamoeba sp.: a case report in a non-contact lens wearer. Acanthamoeba sp. keratitis is generally related to wearing contact lenses, and, to a lesser extent, to contaminated water. It is characterized by reduced visual capacity and the presence of severe ocular pain. Clinically, it can be mistaken for a herpes infection. If it is not diagnosed, and timely and adequately treated, it can result in corneal perforation and, eventually, in vision loss. One of the few registered cases of Acanthamoeba sp. keratitis not related to the use of contact lenses is herein reported.

Key words: Acanthamoeba sp., bilateral keratitis, contaminated water

Acanthamoeba spp. fueron identificadas como agentes causantes de encefalitis granulomatosa crónica (3, 11, 12). La meningoencefalitis también puede atribuirse a la infección con esta ameba cuando se produce como consecuencia de una infección subcutánea crónica. Otros autores describieron la capacidad de este organismo de producir una ulceración progresiva de la córnea, que puede culminar en ceguera (2, 8, 10). El porcentaje más elevado de casos de queratitis amebiana se relaciona con el uso de lentes de contacto y un bajo porcentaje se vincula con el contacto con agua contaminada (6, 9, 13). Borochovitz et al. describen un caso de osteomielitis como resultado de una invasión ósea por Acanthamoeba sp., tras un injerto de hueso mandibular (1). Esta ameba infecta generalmente a

individuos inmunodeprimidos por HIV o cualquier otra causa de inmunosupresión. En los tejidos se pueden observar las formas de trofozoíto o de quiste de esta ameba.

Las queratitis por Acanthamoeba spp. se caracterizan por la disminución de la capacidad visual y la presencia de un fuerte dolor ocular. En el examen oftalmológico mediante microscopía confocal por lo general se observa un infiltrado estromal que, frecuentemente, tiene una forma de anillo característica y está compuesto, principalmente, por neutrófilos. Cuando los hallazgos clínicos son inespecíficos, la queratitis puede confundirse con una infección herpética. Si la infección no es diagnosticada y tratada a tiempo en forma adecuada, evoluciona a una queratitis ulcerativa crónica progresiva, que




puede culminar en la perforación de la córnea con la consiguiente pérdida visual y, eventualmente, del ojo.

Caso clínico. Paciente de 21 años oriunda de Santiago del Estero, Argentina. A principios de agosto de 2011 utilizó agua de un aljibe de una zona rural para el aseo diario. No presentaba lesiones traumáticas previas de córnea ni tampoco era usuaria de lentes de contacto.

Al cabo de unos días presentó inflamación y dolor en el ojo izquierdo; el médico le indicó tratamiento con dexametasona - tobramicina y cloranfenicol 0,5 % - clorhidrato de fenilefrina 0,125 % - sulfato de neomicina 0,5 %. A la semana siguiente comenzó con dolor en el ojo derecho, se realizó el tratamiento con clorhexidina 0,02 %, ciclopentolato 1 %, nepafenac 0,1 % y se indicó control a las 24 h. Se envió al laboratorio una muestra de raspado de córnea para su análisis y los resultados fueron negativos. Se suspendió el tratamiento con clorhexidina 0,02 %. Al no mejorar el cuadro, la paciente fue derivada al Hospital de Clínicas “José de San Martín” de la Ciudad Autónoma de Buenos Aires con un diagnóstico de queratitis bilateral de etiología desconocida. Ingresó al hospital el 30 de agosto de 2011 y, ante la sospecha de infección por Acanthamoeba sp., se le indicó sulfato de atropina cada 12 h, polihexametil biguanida (PHMB) 0,02 % cada hora, clorhexidina 0,02 % cada 2 h y doxiciclina 100 mg cada 24 h, con control a las 24 h. Se realizó un raspado de córnea del ojo izquierdo y se envió al laboratorio de Parasitología Clínica para la búsqueda de quistes de Acanthamoeba sp. El resultado fue negativo. Los resultados de los estudios bacteriológicos y micológicos también fueron negativos. En el estudio con microscopía confocal se observó la presencia de una lesión en forma anular, sugestiva de queratitis por Acanthamoeba sp. (Figura 1). Se indicó tratamiento con clorhidrato de moxifloxacina 5 mg/ml cada 8 h, clorhexidina 0,02 %, PHMB 0,02 % y fluconazol 0,2 % cada 2 h. La paciente

refirió dolor intenso y se le administró doxiciclina 100 mg cada 24 h y dextropopoxifeno e ibuprofeno 600 mg, 1 comprimido cada 12 h. El 5 de setiembre se le realizó una queratectomía profunda del ojo izquierdo con recubrimiento conjuntival y se envió al laboratorio una muestra de biopsia de córnea, en la que pudo observarse la presencia de quistes de Acanthamoeba sp. teñidos con coloración tricrómica (Figura 2). Otra porción de la misma muestra se envió a un instituto privado de oftalmología para el diagnóstico molecular (PCR), que resultó positivo para Acanthamoeba sp. y negativo para hongos.

A la semana siguiente se le realizó queratectomía profunda con recubrimiento conjuntival del ojo derecho por presentar lesiones con las mismas características y evolución que en el ojo izquierdo, para posteriormente poder realizar un trasplante de córnea.

La paciente evolucionó sin complicaciones de la cirugía y con tratamiento con clorhidrato de moxifloxacina 5 mg/ml cada 8 h y fluconazol 300 mg diarios. Luego, regresó a Santiago del Estero, donde debía seguir con los correspondientes controles.

Generalmente, la queratitis por Acanthamoeba sp., está asociada con traumatismo de córnea y al uso inadecuado de lentes de contacto. De hecho, se considera que las lentes de contacto son la principal puerta de entrada de la infección. El lavado ocular con agua contaminada constituye, en menor proporción, otra causa de infección. Recientemente se diagnosticó el primer caso de queratitis por Acanthamoeba sp. en Bahía Blanca (provincia de Buenos Aires, Argentina), que fue confirmado por aislamiento y tipificación molecular (5).

Acanthamoeba spp. también se aisló de suelos, agua mineral embotellada, piletas, unidades de aire

Figura 1. Ojo izquierdo: lesión sugestiva de queratitis por

Acanthamoeba sp.

Figura 2. Quistes de Acanthamoeba sp. teñidos con coloración

tricrómica de biopsia de córnea (aumento 1000X)

277Acanthamoeba sp. en no usuarios de lentes de contacto

acondicionado, aparatos de diálisis y polvo. El uso de lentes de contacto es el principal factor

de riesgo, y solo un 10 % de los casos de infección ocurre luego de un trauma y de la exposición a polvo o a aguas contaminadas (4). En Malasia se registró un caso de queratitis por Acanthamoeba sp. en un individuo que sufrió un trauma en el ojo derecho y había estado en contacto con partículas de polvo o arena; previamente el sujeto se había lavado el ojo con agua estancada (7).

Es muy probable que la paciente a la que alude el presente informe haya adquirido la infección al lavarse los ojos con el agua contaminada de un aljibe.

El hecho de que no fuera usuaria de lentes de contacto y que el resultado del raspado de córnea fuera negativo retrasó el diagnóstico. Probablemente, como consecuencia de la ubicación profunda de la ameba en el tejido. En cambio, cuando se analizó la biopsia de la córnea, el resultado fue positivo para Acanthamoeba sp., tanto por coloración tricrómica como por los métodos moleculares.

Debido a su creciente frecuencia en nuestro medio, la queratitis por Acanthamoeba sp. debe ser considerada como parte del diagnóstico diferencial en los casos sospechosos de queratitis infecciosas.

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Recibido:24/4/2012-Aceptado:1/8/2012

Hidatidosis retroperitoneal secundaria a quiste hidatídico de localización hepática

KATHERINA A. VIZCAYCHIPI1*, SONIA SOSA1, FEDERICO CAMICIA2, GRACIELA SANTILLÁN1, MARÍA CASALINS3, MARÍA DEL CARMEN NIGRO3

1Departamento de Parasitología, INEI-ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”. Av. Vélez Sarsfield 563 (1281) Ciudad Autónoma de Buenos Aires; 2Departamento de Microbiología, Parasitología e Inmunología, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires; 3Servicio de Clínica Médica, Hospital Zonal General de Agudos

“Simplemente Evita”, La Matanza, Buenos Aires, Argentina.*Correspondencia. Email: [email protected]

RESUMEN

La hidatidosis es una enfermedad de distribución mundial, producida por un platelminto parásito del género

Echinococcus. El caso que se presenta corresponde a una paciente con una tumoración fluctuante en el

espacio retroperitoneal lumbar, secundaria a un quiste hepático. El diagnóstico inicial de certeza fue dado

por el hallazgo de ganchos rostelares de protoescólices en el líquido aspirado de un absceso. Este trabajo

describe el cuadro clínico, el diagnóstico y el tratamiento médico-quirúrgico de esta paciente. Se analiza

cómo la elaboración de un diagnóstico certero requiere de un análisis adecuado de los antecedentes

epidemiológicos, las manifestaciones clínicas, los estudios de imágenes y las pruebas de laboratorio, ya

que el conjunto de estos datos confirman el caso.

Palabras clave: Echinococcus granulosus, absceso, quiste retroperitoneal

ABSTRACT

Retroperitoneal hydatidosis secondary to hepatic hydatid cyst. Hydatid disease is a worldwide

zoonosis. It is caused by a parasitic platyhelminth of the genus Echinococcus. We present a patient with a

fluctuating lumbar tumor in the retroperitoneal space, secondary to a hepatic cyst. The initial diagnosis was

made by identification of rostellar hooks from protoscoleces in the fluid aspirated from the abscess. We

herein describe the clinical manifestations, diagnosis and medical and surgical treatment of this unusual

case and conclude that the development of an accurate diagnosis requires a proper analysis of the patient’s

epidemiological history, clinical manifestations, imaging studies and laboratory tests. A multidisciplinary

approach and differential diagnosis is paramount to be able to establish a cause of the disease to deliver

appropriate treatment.

Key words: Echinococcus granulosus, abscess, retroperitoneal cyst

La hidatidosis es una enfermedad de distribución mundial cuyo agente etiológico es un parásito del Phylum Plathyhelmintes, clase Cestoda, género Echinococcus, especie Echinococcus granulosus. Hasta el momento, E. granulosus es la única especie informada en la República Argentina. Tiene un ciclo zoonótico que se extendería en un 30 % del territorio argentino, abarcando de este modo más de 1 200 000 km2. Desde 2010 hasta la semana epidemiológica 29 del año 2012 se notificaron al Sistema Nacional de

Vigilancia de la Salud, según criterio epidemiológico, 506 casos de hidatidosis en todo el país; sin embargo, el número podría ser mayor debido a la escasa notificación de la enfermedad (Sistema Nacional de Vigilancia Laboratorial, SIVILA).

Un individuo con hidatidosis puede permanecer asintomático durante meses o años. Las manifestaciones clínicas se producen cuando el quiste aumenta de tamaño, lo cual origina síntomas por compresión. Las complicaciones más frecuentes



279

asociadas a la rotura de un quiste hidatídico hepático pueden ser las siguientes: a) shock anafiláctico; b) hidatidosis secundaria, con diseminación de protoescólices y formación de nuevos quistes y c) hidatidosis complicada con una infección bacteriana, lo que da lugar a la formación de un absceso (2, 4, 10, 12, 14).

El caso clínico que se presenta corresponde a una paciente con una tumoración fluctuante en el espacio retroperitoneal lumbar, secundaria a un quiste hepático. El diagnóstico de certeza pudo finalmente establecerse a partir del hallazgo de ganchos rostelares de protoescólices en el líquido aspirado de un absceso. Este trabajo describe el cuadro clínico, el diagnóstico y el tratamiento médico-quirúrgico de esta paciente.

Caso clínico. Mujer de 36 años con residencia en la provincia de Buenos Aires, oriunda de un área rural de Santiago del Estero. La paciente se traslada cada año a su lugar de origen. En junio de 2010 se le efectúa una colecistectomía (sin etiología informada); mediante ecografía y pruebas serológicas se obtiene como diagnóstico hidatidosis hepática. Comienza tratamiento con albendazol (10 mg/kg/día), con buena tolerancia, pero lo abandona al mes. Desde entonces consultó varias veces al hospital por una lumbalgia que no responde al tratamiento con analgésicos. La paciente es internada en el Servicio de Clínica Médica del Hospital Zonal General de Agudos “Simplemente Evita” debido a la agudización del dolor y a la aparición de una tumoración en la

Figura 1. a- Tomografía abdominal (año 2011): se observan dos masas en hígado. b- Tomografía de abdomen (año 2011): nódulo

hepático más imagen cercana al hígado que contacta con la pared posterior del abdomen. c- Tomografía de abdomen y pelvis

(año 2011): masa de pared abdominal versus retroperitoneal con drenaje percutáneo a nivel lumbar derecho.

a b

c

Hidatidosis retroperitoneal


zona lumbar derecha, para su estudio y tratamiento. A su ingreso, los exámenes de laboratorio

mostraban los siguientes valores: hematocrito, 30 %; hemoglobina, 9,1 g/dl; leucocitos, 8900/mm3; plaquetas, 411 000/mm3; tiempo de protrombina, 90 %; KPTT, 66 segundos; fosfatasa alcalina, 1114 UI; TGP, 85 UI; TGO, 38 UI; glucemia, 125 mg/dl; urea y creatinina, dentro de los valores normales.

En la ecografía de partes blandas y de abdomen de rastreo se observó una formación ovoidea hipoecoica de contornos lobulados, de aspecto sólido heterogéneo, de 82 x 56 x 27 mm, compatible con un absceso encapsulado que se localizaba en la parte inferior de la pared costal lateral derecha, sin compromiso hepático. Esta formación era vecina

a dos imágenes quísticas hepáticas complejas, una de ellas en el domo subdiafragmático, de 60 x 40 x 30 mm, y la otra localizada en el segmento VI del hígado, de 40 x 40 x 40 mm, adyacente al quiste en la pared torácica, fluctuante a la compresión y con depósitos cálcicos puntiformes. El Servicio de Cirugía realizó un drenaje percutáneo de esta formación y se envió material para cultivo. Se inició un tratamiento antibiótico empírico con trimetoprima sulfametoxazol. Se complementó el estudio posdrenaje con una tomografía axial computarizada (TAC) de tórax, abdomen y pelvis (Figura 1 a y b), con contraste oral y endovenoso. Se observó una masa retroperitoneal, de igual densidad y características que el absceso drenado. En un nuevo cultivo de la zona de drenaje se observó desarrollo de grupo Streptococcus viridans. Como consecuencia se rotó el antibiótico a amoxicilina por vía oral.

El Departamento de Parasitología del INEI-ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” realizó el estudio directo del líquido hemato-purulento y la serología

de hidatidosis. La microscopía óptica calibrada del material del absceso y del drenaje evidenciaron ganchos rostelares de protoescólices, cuyo estudio morfométrico demostró que medían un promedio de longitud total de 21,95 µm (medidos con objetivo 100X y utilizando un ocular con regla micrométrica). El tamaño, la forma y las proporciones de las partes de los ganchos eran característicos del E. granulosus (5) (Figura 2). Los estudios de serología para hidatidosis mostraron test de IgG-ELISA positivo, con un valor de DO de 0,501 (valor de cut-off < 0,210 DO: negativo; entre 0,211 y 0,290 DO: indeterminado; ≥ 0,290 DO: positivo). El ensayo de Western-blot (WB) fue positivo, se visualizaron las bandas inmunogénicas de 57 y 67 kDa, características del antígeno 5.

Una fistulografía descartó la comunicación del absceso con la cavidad abdominal. El cuadro clínico presentado por la paciente se interpretó como absceso hepático con extensión retroperitoneal, que se infecta con bacterias y origina un absceso subcutáneo, por lo que se drenó quirúrgicamente. A los 30 días de internación, la paciente estaba clínicamente estable y afebril; se retiró el drenaje por su escaso débito. Con el objeto de evaluar la presencia de otros quistes hidatídicos se realizaron controles tomográficos; estos evidenciaron en el hígado imágenes hipodensas de aspecto quístico parcialmente calcificadas a nivel del lóbulo derecho en los segmentos VII y VI (Figura 1c), compatibles con un quiste hidatídico. Se observó pequeña colección subhepática en la zona del segmento VI, con cambios inflamatorios en la grasa que la rodeaba, posiblemente relacionados con la infección del quiste. Por la buena evolución clínica y resolución parcial de las lesiones, se decidió mantener conducta expectante y no intervenirla quirúrgicamente.

Figura 2. a y b- Material de absceso y drenaje de espacio retroperitoneal lumbar: se evidencian ganchos rostelares de

protoescólices de E. granulosus. (Observación en fresco).

22 µm

1000X

a b

400X

281Hidatidosis retroperitoneal

Actualmente la paciente se encuentra en tratamiento con mebendazol (200 mg/kg/día), con controles laboratoriales y tomográficos.

La hidatidosis retroperitoneal secundaria a un quiste hidatídico hepático es poco frecuente. Esta se origina con la ruptura quirúrgica o traumática del quiste seguida de una infección bacteriana, que da lugar a un absceso retroperitoneal (5, 6, 7, 11). La baja frecuencia de lesiones quísticas y tumorales en esta localización hace que la experiencia en este tipo de patologías, en la gran mayoría de los casos, sea limitada (1, 8). El quiste hidatídico retroperitoneal se presenta como una tumoración quística abdominal, dolorosa o no, con dolor abdominal en el flanco y masa subcutánea lumbar; este cuadro clínico puede tener varios meses de duración (1, 3, 9, 10, 14); como fue el caso presentado en este informe.

En la práctica, el diagnóstico de hidatidosis se basa en tres pilares:

1- Examen físico y análisis de antecedentes epidemiológicos (como haber vivido en regiones rurales, con animales ungulados; en contacto con perros alimentados con vísceras o si existen otros familiares con hidatidosis).

2- Diagnóstico por imágenes, que permite establecer el estadio del quiste sobre la base de las alteraciones estructurales que caracterizan a sus diferentes momentos evolutivos (la clasificación de Gharbi es la más utilizada para este fin). El diagnóstico por imágenes permite evaluar la ubicación y el número de quistes, como así también sus eventuales complicaciones.

3- Pruebas serológicas (ELISA, WB, IFI, HAI). Las técnicas de ELISA y de WB se consideran las de elección, esta última es usada como prueba de confirmación ante resultados de ELISA positivos. La fuente de antígenos más importante para el inmunodiagnóstico es el líquido hidatídico de quistes de hospedadores intermediarios. Este líquido es un mosaico antigénico en donde se destacan dos componentes mayoritarios: el antígeno 5 (Ag 5) y el antígeno B (Ag B).

Las pruebas serológicas permiten un diagnóstico específico. Estas requieren de la reacción antígeno/anticuerpo, lo que demanda la capacidad de respuesta inmunológica del huésped y el contacto de este sistema inmunocompetente con los antígenos (fisura o rotura de la capa germinativa). Una serología negativa no descarta el diagnóstico de hidatidosis, esto se debe a que las técnicas serológicas pueden presentar resultados falsos negativos, aproximadamente un 10 - 20 % de los pacientes con quistes hepáticos y un 40 % de aquellos con quistes pulmonares no producen anticuerpos séricos detectables, lo mismo ocurre con quistes calcificados o localizados en zonas

de bajo flujo sanguíneo. Estas pruebas deben ser utilizadas e interpretadas en correlación con los datos epidemiológicos, las manifestaciones clínicas y el diagnóstico por imágenes. Si una serología es positiva y la ecografía es negativa, debe efectuarse una tomografía computarizada, por la posibilidad de que no se visualicen quistes peritoneales o retroperitoneales (8, 11, 15).

Con respecto al tratamiento, deben considerarse diversos factores relacionados con el paciente, como la edad, la presencia de comorbilidades, las posibilidades de seguimiento. También se debe tener en cuenta si la parasitosis evoluciona asintomática o presenta manifestaciones clínicas, la localización y las características quísticas, como así también la experiencia del equipo médico tratante.

Actualmente, las opciones de tratamiento son las siguientes: a) Tratamiento farmacológico. El benzimidazol (albendazol) es la droga de elección a una dosis de 10-15 mg/kg/día, con un tiempo mínimo de tratamiento de 3 meses, que puede prolongarse hasta 6 meses, excepto que se presente intolerancia o alteración de los datos del laboratorio (hemograma, hepatograma, test de embarazo en las mujeres en edad fértil). b) Cirugía. Este continúa siendo el tratamiento de elección, está indicado en todo quiste hidatídico pulmonar (sintomático o no), en quistes hidatídicos hepáticos sintomáticos (complicados o no) de cualquier tamaño, y en quistes asintomáticos de más de 7-10 cm. La cirugía mínimamente invasiva ha mejorado la recuperación posquirúrgica, con técnicas como la laparoscopía, toracoscopía o el PAIR (punción, aspiración, inyección y reaspiración). Al margen de estas opciones, en ciertos casos la recomendación profesional es la de esperar y observar (8).

Según los lineamientos planteados en la Norma técnica y manual de procedimientos para el control de la hidatidosis (año 2009) y en el documento denominado Diagnóstico de hidatidosis, guía para el equipo de salud (año 2012), se debe considerar un caso sospechoso de hidatidosis a:

a. Toda persona, sintomática o no, con presencia de tumoración quística (única o múltiple) localizada en el abdomen, tórax o en otra localización, asociada con antecedentes epidemiológicos.

b. Toda persona con sospecha de hidatidosis por catastros poblacionales efectuados con ecografía.

Teniendo en cuenta lo anterior, un caso sospechoso se considera confirmado cuando hay evidencia diagnóstica por imágenes (ecografía, radiografía y/o tomografía axial computarizada), por serología mediante WB, por la visualización microscópica directa de protoescólices o ganchos rostelares, o de restos de membranas, o bien por el estudio histopatológico de la pieza extraída por cirugía.


El diagnóstico de certeza de hidatidosis solo puede hacerse por la visualización macroscópica del quiste en el acto quirúrgico o de estructuras quísticas observadas microscópicamente (2, 8), como fue el caso del presente informe.

Las localizaciones inusuales de los quistes hidatídicos y sus posibles complicaciones, como rotura o infección, son poco frecuentes (10). La falta de información sobre estos casos podría terminar en un diagnóstico erróneo. La elaboración de un diagnóstico certero requiere de un análisis adecuado de los antecedentes epidemiológicos, las manifestaciones clínicas, los estudios de imágenes y las pruebas de laboratorio, ya que es el conjunto de todos estos datos el que permite confirmar el caso.

Agradecimientos: los autores agradecen al Dr. Antonio

DÁlessandro, por la lectura y corrección del manuscrito. A

los Dres Caminiti N. y Bigati D., del Hospital Zonal General

de Agudos “Simplemente Evita”, La Matanza, Buenos Aires.

A Pablo O. Sánchez. A Gerardo Ricoy, Graciela Céspedes y

Ariana Gutiérrez, del Departamento de Parasitología del INEI-

ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”.

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First evaluation in Argentina of the GenoType® MTBDRplus assay for multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis

detection from clinical isolates and specimens

BELÉN R. IMPERIALE1, MARTÍN J. ZUMÁRRAGA2, GABRIELA WELTMAN3, ROXANA ZUDIKER3, ÁNGEL A. CATALDI2, NORA S. MORCILLO1*

1Laboratorio de Referencia del Programa de Control de la Tuberculosis de la Provincia de Buenos Aires, Hospital Dr. Antonio Cetrángolo, Italia 1750, Florida (1602) Buenos Aires; 2Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (CICV/INTA), Los Reseros and Nicolás Repetto, Hurlingham (1686) Buenos Aires; bioMèrieux, Arias 3751 (1430), Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.


ABSTRACT

Tuberculosis (TB) and multidrug and extensively drug-resistant (DR) TB are important public health problems that are spreading worldwide. The aims of this study were to determine the sensitivity and specificity of the GenoType® MTBDRplus assay from smear-positive clinical specimens and isolates and to explore its possible application in routine work. Clinical samples were previously decontaminated using NaOH-N-acetyl-L-cystein or NaOH-ClNa hypertonic solution for Ziehl-Neelsen staining and cultures. The leftover sediments of smear-positive samples were stored at –20 ºC, 70 of which were selected to be included in this study according to their DR profile. Thirty DR Mycobacterium tuberculosis isolates were also assessed. Sequencing was used as gold standard to detect mutations conferring isoniazid (INH) and rifampicin (RIF) resistance. Valid results were obtained in 94.0 % of the samples and 85.5 % (53/62) of the INH-R samples were properly identified. Mutations in the katGS315T gene and inhA C-15T gene promoter region were present in 59.7 % (37/62) and 25.8% (16/62) of the INH-R samples, respectively. The system could also identify 97.7 % (41/42) of the RIF-R samples; the mutations found were rpoBS531L (66.7 %, 28/42), D516V (19.0 %, 8/42), H526Y and S531P/W (4.8 %, 2/42 each one), and S522L/Q (2.4 %, 1/42). A 98.8 % concordance between the GenoType assay and sequencing was obtained. GenoType® MTBDRplus has demonstrated to be easy to implement and to perform in clinical laboratories and useful for a rapid detection of DR M. tuberculosis from decontaminated sputa and clinical isolates. Therefore, this assay could be applied as a rapid tool to predict INH-R and/or RIF-R in DR risk cases.

Key words: molecular detection, multidrug-resistant tuberculosis, GenoType® MTBDRplus

RESUMEN

Primera evaluación en Argentina de GenoType® MTBDRplus para la detección de Mycobacterium tuberculosis multidrogo-resistente desde aislamientos y especímenes clínicos. La tuberculosis (TBC), y la TBC multi y extensivamente drogo-resistentes (DR) son importantes problemas de salud pública mundial. El objetivo de este estudio fue determinar la sensibilidad y especificidad del sistema GenoType® MTBDRplus a partir de esputos (baciloscopía positiva) y aislamientos clínicos de Mycobacterium tuberculosis, explorando su aplicación clínica. Previo a la tinción de Ziehl-Neelsen y al cultivo, las muestras fueron descontaminadas mediante NaOH-N-acetyl-L-cisteina o la solución hipertónica NaOH-NaCl. Los sedimentos remanentes se conservaron a –20 ºC, y 70 de ellos fueron incluidos en este estudio según su perfil de DR. Treinta cepas de M. tuberculosis DR fueron también evaluadas. La secuenciación fue utilizada como método de referencia para la detección de mutaciones que confieren resistencia a isoniacida (INH) y rifampicina (RIF). Se obtuvieron resultados válidos en el 94,0 % de las muestras, identificándose al 85,5 % (53/62) de las INH-R. La mutación katG S315T estuvo presente en 59,7 % (37/62), y la mutación C-15T del promotor del gen inhA en 25,8 % (16/62) de las mismas. El sistema identificó el 97,7 % (41/42) de las muestras RIF-R. Las mutaciones encontradas fueron rpoB S531L (66,7 %, 28/42), D516V (19,0 %, 8/42), H526Y y S531P/W (4,8 %, 2/42 cada una de ellas) y S522L/Q (2,4 %, 1/42). La concordancia entre el GenoType y la secuenciación fue del 98,8 %. El sistema GenoType® MTBDRplus resultó ser útil, fácil de realizar e implementar para la detección rápida de M. tuberculosis DR. Por lo tanto, este ensayo podría ser aplicado como una herramienta rápida para el diagnostico de TBC DR, principalmente en aquellos casos asociados a factores de riesgo.

Palabras clave: detección molecular, tuberculosis multidrogo-resistente, GenoType® MTBDRplus

ARTICULO ORIGINALISSN 0325-7541



INTRODUCTION

Tuberculosis (TB) and especially multidrug-resistant TB (MDR-TB), TB resistant to isoniazid (INH) and rifampicin (RIF), and the most recently described extensively drug- resistant TB (XDR-TB) caused by MDR Mycobacterium tuberculosis, which is also resistant to kanamycin, amikacin or capreomycin and one fluoroquinolone, are important public health problems that are spreading worldwide (16, 17). Currently, the World Health Organization (WHO) estimates that approximately 500,000 new cases of MDR-TB occur each year (32), 5 to 7 % of which might evolve to XDR (29, 31). These alarming figures have highlighted the urgency for rapid screening methods to detect DR in a short turnaround time, especially in those patients with high risk of having MDR/XDR-TB, such as potential institutional transmission and cases with HIV co-infection (30).

Argentina is a country with middle incidence TB rate (23.2 per 100,000 inhabitants in 2010), (14) being Buenos Aires the province having the highest number of cases, 4,298 and an incidence of 28.1 per 100,000 inhabitants. Moreover, 80 % of these cases are concentrated in the overcrowded suburban areas of Buenos Aires City (23).

According to the last national drug-resistance (DR) surveillance, it was observed that 15.5 % of patients with a previous anti-TB treatment history and 2.2 % of the new cases were caused by MDR strains and that the prevalence of INH resistance is about 17 % (26).

INH and RIF are two of the main anti-tuberculosis first line drugs used in the standard treatment regimes for TB. Resistance to INH is generally the first step for developing MDR-TB and resistance to RIF is commonly a marker of MDR-TB, since more than 90 % of the M. tuberculosis RIF-R strains are also resistant to INH. Furthermore, INH is currently used for chemoprophylaxis in children with a proven fully drug-susceptible TB contact.

When resistance to INH and RIF occurs with or without associated resistance to any other drug, the case is defined as a MDR-TB case (16, 17).

As it was previously described, DR in M. tuberculosis is mainly caused by point mutations in certain genes (3). A base-pair change in codon 315 of the katG gene is the most common mutation associated to INH-R, followed by mutations in position -15 of the inhA gene promoter region (4, 10, 13). Mutations within the hot spot region of the rpoB gene of M. tuberculosis, mainly in codons 516, 526 and 531 are responsible for about 95 to 97.0 % of RIF-R (5, 18, 21).

In our setting, detection of DR-TB is mainly based on phenotypic drug susceptibility testing (DST).

Faster methods for rapid detection of DR-TB to avoid incorrect anti-TB treatment and to prevent transmission of resistant forms of the disease in the community are urgently needed.

The GenoType® MTBDRplus assay is a rapid molecular method that can be used from M. tuberculosis clinical isolates or directly from pulmonary smear-positive clinical specimens. This method has been designed to identify RIF-R by the detection of the most common mutations within the hot spot region of the rpoB gene. For the INH-R detection, the katG gene including codon 315 and the promoter region of the inhA gene, position –15 are examined.

The GenoType® MTBDRplus assay is based on DNA-Strip technology, and the whole procedure is divided into three steps: DNA extraction, a multiplex amplification with biotinylated primers, and a reverse hybridization. Hybridization includes the following steps: chemical denaturation of PCR products, hybridization of the single-stranded, biotin-labeled amplicons to membrane-bound probes, stringent washing, addition of a streptavidin/alkaline phosphatase conjugate and a conjugate-mediated reaction. A banding pattern is obtained with easy and fast interpretation of the results (7).

The aims of this study were: a) to determine the sensitivity and specificity of the GenoType® MTBDRplus assay directly applied from smear-positive clinical specimens and isolates, in comparison to conventional drug susceptibility testing (DST) methods and sequencing of katG, inhA (promoter region) and rpoB genes of M. tuberculosis; b) to explore its possible application in routine work and under clinical conditions.

MATERIALS AND METHODS

It was a retrospective study that included smear-positive

clinical specimens and M. tuberculosis isolates obtained

from patients diagnosed in the Reference Laboratory of

Tuberculosis Control Program at Dr. Cetrangolo Hospital of

Buenos Aires Province.

Clinical isolates. A total of 30 previously characterized DR

strains of M. tuberculosis were assessed.

Clinical specimens. In order to obtain isolates, clinical

samples were decontaminated by the NaOH-N-acetyl-

L-cystein or by the hypertonic solution of NaCl following

previously described protocols (20). The concentrated

sediment was used for preparing smears for Ziehl-Neelsen

staining (15) and for cultures in solid [Löwenstein-Jensen (LJ),

and Stonebrink (Sk)], and liquid media BACTEC MGIT 960

system (BD, Buenos Aires, Argentina) (8).

The leftover sediments of smear-positive samples were

stored at –20ºC to be used with the GenoType assay.

Drug-susceptibility testing to first anti-TB drugs were

285Evaluation of the GenoType® MTBDRplus assay

performed –from cultures and in all specimens- by the indirect

proportion method on LJ, the BACTEC MGIT 960 SIRE kit (BD,

Argentina) and in some cases by the microplate colorimetric

method (2, 9, 19).

According to the drug resistance pattern obtained by the

DST, 70 frozen leftover sediments of smear-positive samples

were selected to be tested by the GenoType system.

Table 1 shows the total number of clinical specimens and

isolates included in the study and their drug-resistant profiles.

The fully drug-susceptible (DS) reference strain M.

tuberculosis H37Rv ATCC 29274 was used as control for DST.

M. tuberculosis identification

The molecular technique spoligotyping (27), which is

specific for the differentiation of most of the members of the

M. tuberculosis complex, was performed on clinical isolates

(30 prior clinical isolates plus the 70 cultures grown from the

decontaminated sputa tested) to confirm that they were all M.

tuberculosis.

DNA sequencing

This technique was used as a gold standard molecular method

to detect mutations conferring INH and RIF resistance. The M.

tuberculosis clinical isolates and the cultures obtained from the

decontaminated sputa included in the study were sequenced.

To characterize the mutations conferring INH and RIF-R

in the samples included in the study, M. tuberculosis clinical

isolates and cultures obtained from the decontaminated sputa

were sequenced. To accomplish the above mentioned aim, a

435 bp fragment containing codon 315 of the katG gene, 648

bp of the inhA promoter (including position –15) and 250 bp of

the flanking region of the “hot spot“ rpoB gene were amplified

and sequenced.

Both DNA strands were sequenced in all cases. H37Rv ATCC

27294 was used as wild type (WT) control for sequencing.

Table 2 shows the primers used for PCR and sequencing

of the studied genes. These primers and the PCR protocols

used for sequencing were adopted from previous studies (13).

The MyCyclerTM thermal cycler (BioRad Richmond, CA, USA)

was used to perform the PCR reactions. PCR products were

purified by the QIAquick PCR purification kit (QIAGEN GmbH,

Hilden, Germany) and quantified on a 0.8 % agarose gel

(BioRAD). The purified PCR products were later sequenced

using a DNA sequencer 3130xl Genetic Analyzer (Applied

Biosystems, Buenos Aires, Argentina). Double- stranded DNA

was sequenced for each isolate in order to avoid discrepancies

and the results were analyzed by the Basic Local Alignment

search Tool (National Center for Biotechnology Information,

Bethesda, MD, USA).

GenoType® MTBDRplus assay

The previously mentioned 100 samples were tested by the

GenoType assay according to the manufacturer’s instructions

(Hain Lifescience).

In order to obtain DNA from the clinical specimens, the

decontaminated sputa stored at -20ºC were thawed and 500

µl of each were centrifuged during 15 min at 10,000 x g, then

the pellet was resuspended in 100 µl of molecular biology-

Table 1. Samples included in the study and their drug-resistant profile

Drug resistanceMaterial INH RIF MDR XDR DS Total

dS+ 15 1 12 2 16 46

dS++ 4 1 2 0 6 13

dS+++ 1 0 5 0 5 11

Isolates 7 4 19 0 0 30

Total (%) 27 (27) 6 (6) 38 (38) 2 (2) 27 (27) 100 (100)

The pluses indicate bacillary load within the clinical specimen (+: about 1x104 bacilli per ml of sputum; ++: ≥ 1x105 bacilli/ml; +++: ≥ 1x106

bacilli/ml); dS: decontaminated sputa; INH: isoniazid; RIF: rifampicin; MDR: multidrug-resistant; XDR: extensively drug-resistant; DS: drug-susceptible.

Table 2. Primers used for PCR and DNA sequencing of M. tuberculosis drug-resistant genes

Gene Primers (5´-3´)

katG FR

GCAGATGGGGCTGATCTACGAACGGGTCCGGGATGGTG

inhAP

F

R

AATTGCGCGGTCAGTTCCACAC

CTGCGCGATGCCCGTTGAGC

rpoB FR

GTCGCCGCGATCAAGGATGACCCGCGCGTACAC

F: primer forward; R: primer reverse


grade water, heated at 95 ºC for 20 min, sonicated (LysorTM

LCx Probe System, Abbott Laboratories) for 15 min and

centrifuged for 5 min at 13,000 x g.

To obtain DNA from clinical isolates, 2 colonies from solid

media were resuspended in 300 µl of molecular biology-grade

water and heated at 95 ºC during 20 min, then the samples

were centrifuged for 5 min at 13,000 x g.

The PCR mixture contained 5 µl of crude extracted DNA, 35

µl of a primer nucleotide mixture (provided by the kit), 5 µl of 10X

PCR buffer containing 15 mM MgCl2, 2 µl of 25 mM MgCl2, 1 U

hot start Taq polymerase (QIAGEN, GmbH, Hilden, Germany)

and molecular-grade water to a final volume of 50 µl.

The thermal cycler parameters consisted of 15 min of initial

hot start Taq polymerase activation and DNA denaturization

at 95 ºC, followed by 10 cycles of 30 s at 95 ºC and 2 min at

58 ºC; then 20/30 cycles (isolates/clinical samples) of 25 s at

95 ºC, 40 s at 53 ºC and 40 s at 70 ºC; finally, 8 min at 70 ºC

for elongation.

RESULTS

Molecular identification of the samplesAll 100 specimens, both the 30 previously obtained

isolates and the 70 sputa cultured as part of the routine laboratory procedures, were identified as M. tuberculosis by spoligotyping.

GenoType® MTBDRplus assay resultsValid results were obtained in 94 out of 100 (94 %)

samples included in the study.

Six decontaminated smear-positive sputa classified as one plus (+, about 10,000 bacilli per ml of sputum) from 2 INH-R specimens, 1 RIF-R, 2 MDR and 1 XDR did not show any signals on the GenoType strip for any one of the three different genes.

Table 3 shows the mutations found by the GenoType assay for the samples that yielded valid results.

By using the GenoType assay, we could properly identify 85.5 % (53/62) of the INH-R samples detected by DST.

The mutation S315T in the katG gene was present in 59.7 % (37/62) of the INH-R samples, whereas the mutation C-15T of the inhA gene promoter region was in 25.8 % (16/62) of the INH-R specimens.

In 2 INH-R samples, the GenoType assay detected an unknown mutation in katG315 but AGC315AGA mutation was later confirmed by sequencing.

Regarding the rpoB gene mutations, the GenoType system identified 97.7 % (41/42) of the RIF-R samples. The S531L was the main mutation found in the rpoB gene (66.7 %, 28/42) of the RIF-R samples; 19 % (8/42) presented the D516V mutation, mutations H526Y and S531P/W were both found in 4.8 % (2/42) each one, and the S522L/Q mutation was present only in one sample (2.4 %, 1/42).

All DS clinical specimens and H37Rv strains assessed in the study showed the WT sequence for all the fragments of the three genes included in the strips.

Being a retrospective study, the specificity was evaluated by taking into account the DS isolates

Table 3. Mutations found in clinical specimens and strains with GenoType®MTBDRplus assay

DR(1) N

Mutated genes WT profile

KatG InhAP rpoB INH RIF

S315T C-15T D516VS522L/S522Q

H526Y S531LS531P/S531W

N N

INH(2) 25 13 5 0 0 0 0 0 7 25

RIF 5 0 0 0 1 1 2 1 5 0

MDR 36 23 11 8 0 1 26 1 2 0

XDR 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1(3)

MTS 27 0 0 0 0 0 0 0 27 27

Total(%)

94(100.0)

37(59.7)

16(25.8)

8(19.0)

1(2.4)

2(4.8)

28(66.7)

2(4.8)

41 53

Overalldetection

(%) 53 (85.5) 41 (97.7)

N: number; WT: wild type; INH: isoniazid; RIF: rifampicin; MTS: fully drug-susceptible; DR: drug-resistance; MDR: multidrug-resistant;

XDR: extensively drug-resistant; 1: DR based on phenotypic drug-susceptibility testing (indirect proportion method on Löwenstein

Jensen and the BACTEC MGIT 960 SIRE kit); 2: two dS carried another mutation in katG315; 3: one sample showing M. tuberculosis XDR

profile by DST had the GAC516GTC mutation of the rpoB by sequencing, which was detected as WT by the GenoType assay.


from clinical specimens, the reference strain H37Rv and considering the DR patterns of the isolates. For instance: one resistant strain to RIF only should have wild type (WT) katG and inhA promoter genes, while a strain only resistant to INH should show a WT rpoB gene. No false positive signals were observed in any case, therefore the specificity of the GenoType assay in this study was considered to be 100 %.

Concordance between GenoType® MTBDRplus assay and DNA sequencing

DNA sequencing results were obtained in 84 out of the 100 samples studied by the GenoType assay.

A 98.8 % global concordance between the GenoType assay and DNA sequencing was obtained. When the mutation was present in C-15T of inhA or in katG315 the concordance between both methods was 100 %, but a 97.2 % concordance was obtained for detection of rpoB mutations: one sample showing M. tuberculosis XDR profile by DST carried the GAC516GTC rpoB mutation by sequencing, which was detected as WT by the GenoType assay.

The kappa (ĸ) coefficient for the concordance between both methods was calculated using the MedCalc® Software v 9.5.2.0 (Mariakerke, Belgium) and it was 0.996, indicating an excellent agreement between both methods (ĸ > 0.8) and a very good concordance (24).

This misdetected sample by GenoType was confirmed as carrying the GAC516GTC mutation by sequencing it twice. The RIF-R detected by phenotypic DST methods was also confirmed by therapeutic evidence, based on patient response to anti-TB specific treatment.

DISCUSSIONIn this study, the evaluation of the clinical

performance of GenoType® MTBDRplus was carried out with the main objective of comparing its sensitivity and specificity to conventional DST and to explore its possible application in routine work under clinical conditions. The overall sensitivity of the GenoType assay obtained in this study was 94 % because 6 decontaminated sputum samples did not show any signals in the GenoType strips. The presence of inhibitors in the 6 clinical samples was discarded by β-actin gene amplification (25) and no GenoType PCR products from any of the samples were evidenced on an agarose gel. Therefore, a possible explanation for the negative GenoType results could be an insufficient amount of mycobacteria in those six samples. Since the global sensitivity of this kit is around 10,000 mycobacteria in 500 μl of decontaminated sputa used for DNA extraction, a loss of DNA during the extraction process or its relative inefficiency would

explain, at least partially, the decreased sensitivity. Valid sequencing results for the different genes were obtained from all these samples. Nevertheless, global specificity and concordance were very good, accounting for 100 % and 98.8 %, respectively.

As previously reported by other authors, in this study the katG gene mutation S315T and the rpoB gene mutation S531L were the most prevalent mutations found to be responsible for INH-R and RIF-R, respectively (17, 18, 20, 21).

The GenoType® MTBDRplus assay was demonstrated to be easy to implement and perform in clinical laboratories and useful for a rapid detection of M. tuberculosis resistant to INH and RIF from both decontaminated sputa and clinical isolates. Therefore, this assay could be applied as a rapid screening tool to predict INH-R and RIF-R, especially in those cases at high risk of becoming infected by a DR or a MDR strain. The screening would also be useful in other situations such as HIV co-infection, immunosuppression or malignancies and both adult and children household contacts of MDR-TB cases.

This assay has been used worldwide (1, 6, 11, 12, 22, 24, 28) and it has been recently endorsed by WHO to be used as a molecular screening tool for rapid detection of MDR-TB cases (30).

However, it is worth noting that this test cannot totally replace the conventional phenotypic DST method in clinical practice (30) because DST is still necessary to confirm XDR-TB. As it was shown in this study, a few DR cases could not be detected by the Genotype assay. The most plausible explanation may reside in the fact that only the most common mutations conferring drug-resistance are detected by the strip. Moreover, different drug-resistance mechanisms such as those implying efflux pumps might be involved in the occurrence of this phenomenon. Based on the sensitivity and specificity values found in this study, the method could be reliable with a result showing “resistance” to any given drug. Only those cases with invalid results (band pattern showing heteroresistance) or those designated as “susceptible” to a drug but being highly suspicious for drug-resistance should be confirmed by a phenotypic DST method. Consequently, only few cases should require confirmation after obtaining either drug-resistant or drug-susceptible results by the GenoType assay. The importance of adding a molecular test for drug-resistance detection at a clinical level is also evident at the moment of considering rapidness and optimal assignment of economic and personnel resources. When the GenoType assay is applied as screening tool, there is proven time-saving in technicians’ work and also a reduction in the costs of commercial DST methods, which together compensate for the cost of molecular techniques used as their replacement. The whole healthcare system could benefit from the


implementation of rapid diagnostic tools, leading to a shorter hospitalization time, with all the implications brought about to the affected families by this particular socio-economic setting.

Acknowledgements: we especially thank Hain Lifescience

for kindly providing us the GenoType® MTBDRplus kit assay. AC

is a career member and BI is a fellow from CONICET, Argentina.

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Evaluación de diversos métodos fenotípicos para la detección de carbapenemasas KPC en Klebsiella pneumoniae

FEDERICO G. NICOLA*, JIMENA NIEVAS, JORGELINA SMAYEVSKY

Laboratorio de Bacteriología, Micología y Parasitología; Departamento de Análisis Clínicos - Centro de Educación Médica e Investigaciones Clínicas. Galván 4102 (1431) Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina

*Correspondencia. E-mail: [email protected]

RESUMEN

Se investigó el desempeño de diversos métodos fenotípicos para la detección de carbapenemasas KPC en 44

aislamientos de Klebsiella pneumoniae con sensibilidad disminuida a los carbapenems, 30 productores y 14 no

productores de KPC. Se determinó la sensibilidad a imipenem, meropenem y ertapenem por dilución en agar y

difusión por discos. Se evaluaron los siguientes métodos fenotípicos: sinergia entre discos de carbapenems y

discos con los inhibidores amoxicilina/ácido clavulánico (AMC) y ácido aminofenilborónico (APB); inhibición por

“discos combinados” (según una técnica de predifusión diseñada a tal fin en nuestro laboratorio), comparando el

efecto de los carbapenems solos o asociados con los inhibidores mencionados; y el test de Hodge modificado,

para el cual se propone una lectura cuantificada. El método de Hodge detectó todos los aislamientos KPC

positivos con los tres carbapenems evaluados, mientras que fue negativo para todos los aislamientos KPC

negativos con imipenem y meropenem, y produjo dos resultados falsos positivos con ertapenem. Cuantificando

la lectura de este método se pudieron discriminar objetivamente los resultados verdaderos positivos (≥ 8 mm)

de los falsos positivos (< 5 mm). Se observó sinergia entre carbapenems y APB con todos los aislamientos

KPC positivos, aunque esto requirió ajustar la distancia entre discos. En los aislamientos KPC negativos no

se observó sinergia entre carbapenems y APB. Empleando el método con discos combinados con imipenem

o meropenem más APB se detectaron la mayoría de los aislamientos KPC positivos y no se observaron falsos

positivos. Por el contrario, las combinaciones carbapenem más AMC no fueron sensibles ni específicas.

Palabras clave: carbapenemasas KPC, detección fenotípica, Hodge cuantificado, predifusión

ABSTRACT

Evaluation of phenotypic methods for the detection of KPC carbapenemases in Klebsiella pneumoniae.

We evaluated phenotypic methods for the detection of KPC carbapenemases in 44 clinical isolates of K.

pneumoniae having reduced susceptibility to carbapenems, 30 of which were KPC-positive and 14 KPC-negative.

Both the agar dilution and disk diffusion methods were performed for imipenem, meropenem and ertapenem.

The following phenotypic methods were assayed: the double disk synergy test, using boronic acid or clavulanic

acid as inhibitors, “combined” disks of carbapenem plus inhibitor (boronic acid, clavulanic acid and both boronic

plus clavulanic acid), by using a pre-diffusion technique and the modified Hodge test. The double disk diffusion

test using boronic acid could detect all KPC-positive isolates, but adjustment of disk distance was necessary for

achieving such performance. The simulation of combined disks by our pre-diffusion technique detected all KPC-

positive strains for all 3 carbapenems when using boronic acid as inhibitor, clavulanic acid was less susceptible

and specific as compared with boronic acid. The modified Hodge test using any carbapenem was clearly positive

for all KPC-producing isolates. This test was negative for all KPC-negative strains when imipenem or meropenem

were used, but 2/14 isolates yielded a weak positive result when using ertapenem. By measuring the enhanced

growth of E. coli ATCC 25922 observed in this test, we could objectively discriminate true-positive (≥ 8 mm) from

false-positive results (< 5 mm). Our results show that the use of phenotypic methods is effective for the rapid

detection of KPC producers in K. pneumoniae isolates with reduced susceptibility to carbapenems.

Key words: KPC carbapenemase detection, phenotypic methods, modified Hodge test, pre-diffusion

technique

ARTICULO ORIGINALISSN 0325-7541


291

INTRODUCCIÓN

Los carbapenems son antibióticos β-lactámicos de amplio espectro con actividad bactericida frente a bacterias gram positivas y gram negativas, tanto aeróbicas como anaeróbicas (41). Debido a estas propiedades, los carbapenems han sido inicialmente considerados como antibióticos de reserva para ser empleados solo frente a casos puntuales. Sin embargo, dado el aumento general de la resistencia a los antibióticos, cada vez se los ha utilizado con mayor frecuencia y hoy en día son parte de la terapéutica empírica inicial en diversas circunstancias (1, 24, 29, 40).

Este uso habitual de los carbapenems ha llevado al aumento de la resistencia a estos antibióticos, principalmente en Pseudomonas aeruginosa y en el complejo Acinetobacter baumannii-calcoaceticus, microorganismos en los que pueden estar involucrados múltiples mecanismos de resistencia (22, 27, 28, 34).

Hasta hace relativamente pocos años la resistencia a carbapenems en las enterobacterias era una verdadera rareza microbiológica, mediada principalmente por la presencia conjunta de β-lactamasas de espectro extendido (BLEE) e impermeabilidad (21, 23). No obstante, hace algo más de diez años se describieron las primeras enterobacterias productoras de carbapenemasas, es decir, β-lactamasas capaces de hidrolizar eficientemente a los carbapenems (35, 38). Poco tiempo después se documentaron en diversas partes del mundo brotes epidémicos producidos por enterobacterias productoras de carbapenemasas, por lo general del tipo KPC (Klebsiella pneumoniae carbapenemasa) (9, 12, 14). Los estudios sobre la epidemiología molecular de las carbapenemasas revelaron que estas se encuentran en elementos móviles fácilmente transmisibles, lo que resalta la importancia epidemiológica de este nuevo mecanismo de resistencia (24, 35, 38). En ciertas regiones, como en la costa este de EE.UU., los aislamientos de Klebsiella pneumoniae productores de carbapenemasas KPC ya son endémicos (5, 12, 14).

En nuestro país, hasta hace algunos años el principal mecanismo de sensibilidad disminuida a los carbapenems en enterobacterias continuaba siendo la conjunción de BLEE e impermeabilidad (31). Sin embargo, algunas publicaciones recientes dan cuenta de la emergencia de enterobacterias productoras de carbapenemasas del tipo KPC (17, 32).

Estas enzimas pertenecen al grupo 2f de la clasificación de Bush-Medeiros (clase A de Ambler) y son parcialmente inhibidas por ácido clavulánico, sulbactama y tazobactama (7, 8, 35). Hace poco se informó que este tipo de enzimas también resultan inhibidas por el ácido borónico (y

derivados análogos), un conocido inhibidor de las cefalosporinasas de tipo AmpC (grupo 1 o clase C) (13, 32). Asimismo, se ha comunicado que bacterias con carbapenemasas podrían ser categorizadas como “sensibles” con los métodos habituales de estudio de sensibilidad a los antibióticos (2, 30, 36). Esta situación condujo a la revisión de los puntos de corte por parte del CLSI en junio de 2010 (10). Aun así, detectar la presencia de carbapenemasas y categorizar correctamente la sensibilidad a carbapenems en aislamientos clínicos sigue siendo un problema para muchos laboratorios de microbiología (15).

Si bien las técnicas moleculares son consideradas los métodos de referencia para confirmar la presencia de los genes de las diferentes carbapenemasas, estas técnicas no suelen estar disponibles en el contexto de la práctica clínica habitual. Por tal motivo se han propuesto diversos ensayos fenotípicos para detectar presuntivamente la presencia de carbapenemasas en aislamientos clínicos. Uno de ellos es el método de Hodge modificado, que permite inferir una actividad enzimática sobre un determinado antibiótico en un aislamiento dado. También existen otros métodos fenotípicos basados en la capacidad de ciertas sustancias para inhibir a estas enzimas, como el ácido borónico y el ácido clavulánico, que inhiben a las carbapenemasas de clase A, o el EDTA, que inhibe a las de clase B (7, 13, 15, 16, 25, 32, 33).

De modo similar a lo acontecido en otros centros de salud de Argentina, a partir de mediados de 2009 hemos observado en nuestra institución la emergencia de enterobacterias resistentes a carbapenems (principalmente K. pneumoniae) productoras de carbapenemasa KPC-2, según el resultado de la PCR específica para amplificar genes kpc y la ulterior secuenciación del producto amplificado (3).

Los objetivos de este trabajo fueron evaluar diferentes métodos fenotípicos para la detección de aislamientos de K. pneumoniae productores de carbapenemasas tipo KPC y describir los resultados de las pruebas de sensibilidad habituales, teniendo en cuenta los nuevos puntos de corte del CLSI.

MATERIALES Y MÉTODOS

Microorganismos

Se estudiaron aislamientos clínicos únicos de K.

pneumoniae con sensibilidad disminuida a carbapenems,

definida por la formación de halos de inhibición ≤ 21 mm

en presencia de imipenem (IMI), meropenem (MER) o

ertapenem (ETP). Se incluyeron 30 aislamientos productores

de carbapenemasas KPC, según el resultado de la PCR


recién citada. Los cebadores específicos para genes kpc

utilizados fueron KPC-f CCGTCTAGTTCTGCTGTC y KPC-r

CGTTGTCATCCTTGTTAG; las condiciones de amplificación

fueron 30 ciclos de 1 min a 95 ºC, 30 s a 52 ºC y 2 min

a 72 ºC. Se obtuvo así un fragmento de amplificación de

800 pb, tal como ya fue documentado en un estudio previo

(3). A fin de poder comparar apropiadamente los métodos

fenotípicos evaluados en este estudio, se incluyeron

también 14 aislamientos no productores de enzimas KPC

de acuerdo con los resultados de la citada PCR (3). En el

estudio previo antes mencionado, todos los aislamientos

habían sido negativos en ensayos de inhibición con EDTA,

y en los KPC negativos, además, se había confirmado por

PCR específicas la presencia de BLEE del grupo CTX-M-2

y la ausencia de carbapenemasa OXA-48, utilizando los

iniciadores ya descritos (35).

Los microorganismos KPC positivos fueron recuperados

de las siguientes muestras: sangre (n = 10), orinas (n = 7),

piel y partes blandas (n = 6), líquidos abdominales (n = 3),

aspirados traqueales (n = 2) y catéteres (n = 2).

Las cepas Escherichia coli ATCC 25922 y P. aeruginosa

ATCC 27853 fueron incluidas como controles de calidad de

las pruebas de sensibilidad.

A - Pruebas de sensibilidad

Concentración inhibitoria mínima: se determinaron

las CIM de IMI, MER y ETP según el método de dilución en

agar, de acuerdo con las normativas del CLSI (11).

Método de difusión por discos: se determinó la

sensibilidad a IMI (10 µg, Oxoid, Reino Unido), MER (10 µg,

Oxoid) y ETP (10 µg, BD, EE.UU.), según las recomendaciones

del CLSI para esta metodología (11).

B - Ensayos fenotípicos

Método de Hodge modificado y cuantificación de la

prueba: se ensayó el método de Hodge modificado para

los tres carbapenems mencionados anteriormente, según

recomendaciones del CLSI (11). Además, con la intención de

objetivar la interpretación de los resultados obtenidos con

este método, se cuantificó el sobredesarrollo de la cepa E.

coli ATCC 25922 en el halo de inhibición hacia el disco del

carbapenem. Para ello, se midió la distancia en milímetros

en que el desarrollo de esta cepa se adentraba hacia el

disco del carbapenem sobre la estría del aislamiento en

estudio (Figura 4).

Método de difusión de doble disco: se evaluó la

existencia de sinergia entre cada carbapenem (IMI,

MER y ETP) y el ácido clavulánico o el ácido borónico

mediante el método de difusión de doble disco (25, 31).

Se hisoparon placas de agar Mueller-Hinton (Laboratorios

Britania, Argentina) con una suspensión 0,5 Mc Farland del

aislamiento en estudio. Luego se colocó un disco de ácido

3-aminofenilborónico 300 µg (APB) (Laboratorios Britania)

a una distancia de 2 cm, centro a centro, frente a los discos

de cada carbapenem. La misma metodología se realizó con

discos de amoxicilina / ácido clavulánico 20/10 µg (AMC)

(Oxoid). Se incubaron las placas 20-24 h en estufa a 35 ºC.

El agrandamiento del halo de inhibición del carbapenem

hacia el lado del disco con el inhibidor se interpretó como

un resultado positivo. En aquellos aislamientos cuyos halos

de inhibición alrededor de los discos de carbapenems

fue menor de 14 mm, este ensayo se repitió ajustando

la distancia entre los discos de los carbapenems y los

inhibidores a 1,2 cm (centro a centro).

Método de “discos combinados” obtenidos

mediante una técnica de predifusión: se determinaron

los halos de inhibición del desarrollo bacteriano obtenidos

con cada carbapenem solo y con la combinación de cada

carbapenem con APB, con AMC y con ambos a la vez (25,

31). Dado que tales discos con la combinación carbapenem

más inhibidor no están disponibles comercialmente y

que los laboratorios de microbiología clínica no suelen

contar con los inhibidores como droga (de manera de

poder adicionarlos a los discos de los carbapenems),

estas combinaciones fueron generadas utilizando una

metodología diseñada por nosotros a tal fin, basada en la

técnica conocida como predifusión de discos (4, 19, 37), tal

como se describe a continuación.

En primer lugar, se colocaron dos discos de AMC sobre

una placa de agar Mueller-Hinton sin inocular y se incubó

en estufa a 35 ºC por un lapso de 4 h. Seguidamente, se

retiraron los discos de AMC y se colocaron dos discos de

APB, uno encima de donde había estado uno de los discos

de AMC y el otro en un lugar diferente; se incubó nuevamente

la placa en estufa por otras 4 h adicionales (Figura 1, pasos

1 y 2). Posteriormente, tras retirar los discos de APB, se

inoculó la placa mediante hisopado de una suspensión 0,5

Mc Farland del aislamiento en estudio y luego se colocaron

4 discos del carbapenem correspondiente (con una placa

diferente para cada carbapenem), de modo tal que un disco

del carbapenem quedó en un lugar previamente no utilizado

(carbapenem solo), otro donde solo estuvo un disco de APB

(carbapenem + APB), otro donde estuvo un disco de AMC

(carbapenem + AMC) y el cuarto donde se habían colocado

sucesivamente primero un disco de AMC y luego uno de

APB (carbapenem + AMC + APB) (Figura 1, paso 3).

Las placas fueron luego incubadas en estufa a 35 ºC

durante 18-20 h, y se midieron entonces los halos de

inhibición correspondientes. Una diferencia de 4 mm entre

el halo de inhibición del carbapenem más inhibidor/es

respecto del halo del carbapenem solo se consideró un

resultado positivo en este ensayo.

Los tiempos y temperaturas de la técnica de predifusión

antes descrita se eligieron sobre la base de una serie de

ensayos previos con discos de AMC y las cepas E. coli

ATCC 25922 y E. coli ATCC 35218 (datos no mostrados).

Bajo las condiciones de predifusión mencionadas, con

ambas cepas ATCC se obtuvieron halos de inhibición de

igual tamaño (± 1-2 mm) que los obtenidos con el método

de difusión estándar (realizado en forma simultánea).

Esto se incluyó como control de calidad de la técnica de

predifusión en cada ensayo realizado.

293

AMC

4 h en estufa 35 ºC

AMC AMC

AMC AMC

AMC

Figura 1. Técnica de predifusión para el método de inhibición con “discos combinados”

Paso 1. Colocación de discos de amoxicilina-clavulánico (AMC) sobre una placa de agar Mueller-Hinton (sin inocular) y posterior

descarte de esos discos

Paso 2. Colocación de discos de ácido fenilborónico (APB) y posterior descarte de esos discos

Paso 3. Inoculación de la placa con una suspensión 0,5 Mc Farland del aislamiento en estudio y colocación de los discos de

los carbapenems (Carb) (una placa para cada carbapenem)

Hisopado con suspensión 0,5 McFarland del aislamiento en estudio

Colocación de los discos del carbapenem

AMC AMC

APB

APB

18-20 h

Estufa 35 ºC

AMC AMC

APB

APB

Carb

Carb Carb

Carb

AMC AMC

APB 4 h en estufa 35 ºC

AMC AMC

APB

APB

APB

APB

APB


Referencias

Aislamientos KPC negativos

Aislamientos KPC positivos

Puntos de corte de sensibilidad (gris) y resistencia (negro) según el CLSI, en 2009

Puntos de corte de sensibilidad (gris) y resistencia (negro) según el CLSI, en junio de 2010

Figura 2. Valores de CIM de los carbapenems obtenidos con el método de dilución en agar

R R S

S

0

2

4

6

8

10

12

<0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64 128

Figura 2C. Distribución de CIM de ertapenem

N.º de aislamientos


CIM de imipenem (µg/ml)

CLSI

CLSI

CLSI

CLSI

junio2010

junio2010

2009

2009

0

2

4

6

8

10

12

<0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64 128

Figura 2B. Distribución de CIM de meropenem

R

R S

S


CLSI CLSIjunio2010 2009

CIM de meropenem (µg/ml)

CIM de ertapenem (µg/ml)

0

2

4

6

8

10

12

<0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64 128

Figura 2A. Distribución de CIM de imipenem

R R S S

295

RESULTADOS

A- Pruebas de sensibilidad

En las Figuras 2A, 2B y 2C se muestra la distribución de los valores de CIM obtenidos con los carbapenems IMI, MER y ETP, respectivamente. Se aprecia que la CIM de IMI fue ≤ 1 µg/ml (punto de corte de sensibilidad propuesto por el CLSI en junio de 2010) en 13 de 30 aislamientos KPC positivos; lo mismo ocurrió con MER en 8 aislamientos. Ningún aislamiento KPC positivo mostró una CIM de ETP por debajo del nuevo punto de corte de sensibilidad (≤ 0,25 µg/ml). Las medianas de las CIM de IMI, MER y ETP en los aislamientos KPC positivos fueron 4 µg/ml, 2 µg/ml y 4 µg/ml, respectivamente. Por su parte, las medianas de las CIM de dichos antibióticos en los aislamientos KPC negativos fueron, en igual orden, 2 µg/ml, 4 µg/ml y 8 µg/ml.

En las Figuras 3A, 3B y 3C se muestra la distribución de los tamaños de los halos de inhibición obtenidos al evaluar la sensibilidad frente a los tres carbapenems. Los 30 aislamientos KPC positivos mostraron halos ≤ 21 mm, tanto con IMI (media: 15 mm; rango: 6-21 mm) como con ETP (media: 11,9 mm; rango: 6-19 mm). Asimismo, 28 de 30 aislamientos KPC positivos dieron

halos ≤ 21 mm al ser expuestos a MER (media: 15,6 mm; rango: 6-24 mm); de los dos restantes, uno dio un halo de 22 mm y el otro de 24 mm, este último fue el único aislamiento que hubiese sido categorizado como sensible con los nuevos puntos de corte del CLSI (10).

En el grupo de los 14 aislamientos KPC negativos, los halos fueron ≤ 21 mm en 10 aislamientos con IMI (media: 20,4 mm; rango: 17-25 mm), en 13 con MER (media: 14,4 mm; rango; 10-22 mm) y en los 14 con ETP (media: 7,8 mm; rango: 6-15 mm).

B- Ensayos fenotípicos

En la Tabla 1 se muestran los resultados obtenidos con el método de Hodge modificado, el método de sinergia con doble disco y el método de inhibición con “discos combinados” (según técnica de predifusión antes detallada).

Todos los aislamientos KPC positivos dieron positivo con el método de Hodge con los tres carbapenems estudiados. Los 14 aislamientos KPC negativos fueron Hodge negativos cuando se utilizaron IMI o MER, mientras que 2/14 resultaron Hodge positivos solo con ETP (Tabla 1). Al cuantificar este método, en todos los aislamientos KPC positivos

Tabla 1. Detección presuntiva de carbapenemasas tipo KPC con distintos métodos fenotípicos

Aislamientos Carb

Resultados positivos según el método ensayado

Hodge

modificado

Sinergia con doble disco

Inhibición con discos combinados (predifusión) (2)

Distancia entre el carbapenem y el

APB

Distancia entre el carbapenem y el

AMC

2 cm 1,2 cm 2 cm 1,2 cm Carb + AMC

Carb + APB

Carb + APB + AMC

KPC positivos (n = 30)

IMI 30 / 30 25 / 30 9 / 9 (1) 11 / 30 2 / 9 (1) 12 / 30 28 / 30 28 / 30

MER 30 / 30 26 / 30 9 / 9 (1) 9 / 30 2 / 9 (1) 4 / 30 27 / 30 29 / 30

ETP 30 / 30 14 / 30 26 / 26 (1) 5 / 30 9 / 26 (1) 4 / 30 24 / 30 26 / 30

KPC negativos (n = 14)

IMI 0 / 14 0 / 14 NA 0 / 14 NA 0 / 14 0 / 14 0 / 14

MER 0 / 14 0 / 14 0 / 7 (1) 1 / 14 3 / 7 (1) 0 / 14 0 / 14 3 / 14

ETP 2 / 14 0 / 14 0 / 13 (1) 3 / 14 5 / 13 (1) 4 / 14 0 / 14 4 / 14

Carb = carbapenem; IMI = imipenem; MER = meropenem; ETP = ertapenem; APB = ácido fenilborónico; AMC = amoxicilina / ácido clavulánico(1) Aislamientos con halos de inhibición ≤ 14 mm con el carbapenem correspondiente.NA: No aplicable (no hubo aislamientos KPC negativos con halos de inhibición por imipenem ≤ 14 mm).(2) Se consideró resultado positivo cuando la diferencia entre el halo de inhibición del carbapenem con el inhibidor (o los inhibidores) y el halo del carbapenem solo fue ≥ 4 mm.


R S S R

Figura 3C. Distribución de halos de inhibición con ertapenem

Nº

de a

isla

mie

ntos

Halos de inhibición para ertapenem (mm)

0

1 2

3 4

5 6

7

6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

S R S R

Figura 3B. Distribución de halos de inhibición con meropenem

Nº

de a

isla

mie

ntos

Halos de inhibición para meropenem (mm)

0 1

2 3

4 5

6 7

6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

Referencias

Aislamientos KPC negativos

Aislamientos KPC positivos

Puntos de corte de sensibilidad (gris) y resistencia (negro) según el CLSI, en 2009

Puntos de corte de sensibilidad (gris) y resistencia (negro) según el CLSI, en junio de 2010

Figura 3. Distribución de los halos de inhibición de los carbapenems según el método de difusión con discos

S R S R

Nº

de a

isla

mie

ntos

Figura 3A. Distribución de halos de inhibición con imipenem

Halos de inhibición con imipenem (mm)

0 1 2 3 4 5 6 7

6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

CLSI CLSIjunio2010 2009

CLSI CLSIjunio20102009

CLSI CLSIjunio20102009

297

el sobredesarrollo de E. coli ATCC 25922 fue ≥ 8 mm (media: 13,2 mm; rango: 8-18 mm) con cualquiera de los tres carbapenems (Figura 4). Por el contrario, en los aislamientos KPC negativos, cuando el test de Hodge se realizó con IMI o MER, en la mayoría de los casos no se observó sobredesarrollo (resultado = 0 mm para esta determinación) y en algunos se observaron ligeras distorsiones en la zona de inhibición de E. coli ATCC 25922, de 1-2 mm, al medir según esta propuesta (media: 1 mm; rango: 0-2 mm). Por su parte, al utilizar el ETP en este método, las distorsiones fueron un poco más frecuentes (media: 1,8 mm; rango: 0-4 mm), y en dos aislamientos se observaron sobredesarrollos de 4 mm (Figura 4), justamente en los dos aislamientos considerados falsos positivos con esta prueba (Tabla 1).

Con el método de sinergia con doble disco, al utilizar una distancia fija de 2 cm entre los discos del inhibidor y el carbapenem, se observó sinergia con APB en la mayoría de los aislamientos KPC positivos cuando el antibiótico evaluado fue IMI o MER (Figura 5A), y solo en alrededor de la mitad de ellos cuando el carbapenem evaluado fue el ETP. Solo un tercio de los aislamientos KPC positivos, aproximadamente, mostraron sinergia entre AMC e IMI o MER, y apenas

5 mostraron sinergia entre AMC y ETP (Tabla 1). Con los aislamientos en que los halos de inhibición por carbapenems fueron ≤ 14 mm se volvió a realizar el ensayo de sinergia a una distancia de 1,2 cm entre los discos del carbapenem y del inhibidor (AMC o APB), y se observó sinergia en todos estos aislamientos KPC positivos con APB (Figura 5B), no así con AMC (Tabla 1).

Figura 4. Método de Hodge modificado. El círculo negro demarca el halo de inhibición circular esperado con E. coli ATCC 25922. Las líneas rojas muestran el sobredesarrollo de E. coli ATCC 25922 hacia el disco del carbapenem (ertapenem en este caso), y los valores en milímetros obtenidos al cuantificarlo. En esta fotografía se muestran los notorios sobredesarrollos observados con un aislamiento KPC positivo y el control positivo (18 y 15 mm). También se muestra el leve sobredesarrollo (4 mm) obtenido con uno de los dos aislamientos KPC negativos considerados como falsos positivos por el método de Hodge con ertapenem.

Figura 5. Método de sinergia con doble disco

Figura 5A. En esta fotografía se muestra el efecto sinérgico entre el disco de ácido fenilborónico (APB) con los carbapenems al colocar los discos a una distancia de 2 cm (centro a centro). Se han demarcado con círculos negros los halos de inhibición circulares esperados, para facilitar su observación. En la parte superior de la fotografía se muestra cómo el efecto sinérgico deja de apreciarse al alejar los discos.

Figura 5B. En esta fotografía se aprecia que cuando los halos de inhibición obtenidos con los carbapenems fueron muy pequeños (< 14 mm), la sinergia con APB solo se pudo observar al colocar los discos a una distancia de 1,2 cm (centro a centro) y no cuando dicha distancia fue de 2 cm. El recuadro es un acercamiento de esa parte de la placa para apreciar mejor el leve efecto sinérgico observado entre los discos.


Por su parte, en los aislamientos KPC negativos no se observó sinergia entre los carbapenems y APB, pero sí se verificó sinergia entre MER y AMC en 3/14 aislamientos, y entre ETP y AMC en 5/14 aislamientos, incluso combinando los resultados de los ensayos a 2 cm y a 1,2 cm de distancia entre discos.

Utilizando nuestro método de “discos combinados” por predifusión, la diferencia en el tamaño de los halos de inhibición del carbapenem más APB respecto del carbapenem solo fue ≤ 2 mm con todos los aislamientos KPC negativos. Por su parte, en los aislamientos KPC positivos se observó una diferencia ≥ 4 mm entre el halo formado por acción del carbapenem más APB respecto del carbapenem solo (Figura 6) en 28, 27 y 24 casos con IMI, MER y ETP, respectivamente (Tabla 1).

Las combinaciones carbapenem más AMC resultaron claramente menos sensibles para detectar aislamientos KPC positivos (Tabla 1). Los discos con la triple combinación carbapenem + APB + AMC no aumentaron significativamente la sensibilidad, pues solo se detectaron dos aislamientos KPC positivos adicionales en el caso del MER y del ETP, y mostraron menor especificidad, ya que se obtuvieron resultados falsos positivos en 3/14 y en 4/14 aislamientos KPC negativos al incluir al MER o al ETP, respectivamente, en la triple combinación.

DISCUSIÓN

En los últimos años se ha informado la emergencia de K. pneumoniae productora de carbapenemasas de tipo KPC en diversos países, incluyendo la Argentina (5, 12, 17, 32). En nuestra institución hemos comprobado la reciente emergencia de aislamientos de K. pneumoniae resistentes a carbapenems; esta resistencia está mediada por una carbapenemasa KPC, cuyas características epidemiológicas y moleculares hemos descrito en publicaciones anteriores (3, 18). En esos estudios documentamos la diseminación en nuestra institución de un clon preponderante de K. pneumoniae portador de carbapenemasa KPC-2. No obstante, también observamos la presencia de esta enzima en otros clones de K. pneumoniae así como en aislamientos de Enterobacter cloacae y de Citrobacter freundii, lo que evidencia la enorme capacidad de transferencia de este mecanismo de resistencia (3, 18). Entonces, la rápida y eficaz detección de estas bacterias resulta crítica, no solo para la adecuada terapéutica del paciente, sino para instaurar medidas de control tendientes a evitar su diseminación (18, 25, 26).

Nuestros resultados coinciden con los obtenidos en estudios previos al poner de manifiesto que los aislamientos con sensibilidad disminuida a los carbapenems, presuntamente por impermeabilidad y producción de BLEE, exhiben una clara diferencia en las actividades de los distintos carbapenems (21). Así, estos aislamientos muestran mayor resistencia a ertapenem y menor resistencia a meropenem, mientras que el imipenem, por lo general, se presenta como el carbapenem más activo (barras grises en las Figuras 2 y 3), situación comúnmente conocida en nuestro país como “escalera fenotípica”. Por el contrario, en los aislamientos con carbapenemasa tipo KPC, tal comportamiento no se observa claramente (barras negras en Figuras 2 y 3). No obstante, los resultados de las pruebas de sensibilidad no permiten discriminar fehacientemente si la resistencia a los carbapenems se debe a una carbapenemasa o a la conjunción de BLEE más impermeabilidad. Esta distinción es importante, tanto para encarar la adecuada terapéutica del paciente como para establecer las medidas de control de la infección más pertinentes (5, 15). En ese sentido, los resultados observados con el imipenem permiten inferir la presencia de este tipo de carbapenemasa en aquellos aislamientos con mayor expresión de resistencia, es decir, aquellos en los que la CIM fue ≥ 8 µg/ml (13/30 aislamientos KPC positivos; Figura 2A) o los que mostraron halos de inhibición ≤ 16 mm (17/30 aislamientos KPC positivos; Figura 3A).

Por otra parte, tal como ha sido descrito por diversos investigadores, los métodos de sensibilidad

Figura 6. Método de “discos combinados” mediante una técnica de predifusión. Se muestra un ejemplo de halos obtenidos para el carbapenem solo (MER), combinado con ácido clavulánico (MER + AMC), combinado con ácido fenilborónico (MER + APB) y con la triple combinación que incluyó al carbapenem, al ácido clavulánico y al ácido fenilborónico (MER + AMC + APB).

299

utilizados habitualmente en bacteriología clínica pueden presentar deficiencias para la correcta detección de enterobacterias productoras de carbapenemasas (2, 30, 36). Es por ello que en junio de 2010, el CLSI debió emitir un documento de actualización de los puntos de corte de sensibilidad para los carbapenems, tratando de mitigar esa situación (10).

En nuestro trabajo hemos podido observar que una gran proporción de los aislamientos KPC positivos hubieran sido considerados como sensibles a los carbapenems con los puntos de corte anteriores (10). Esta situación queda en gran medida subsanada al considerar los nuevos puntos de corte (10, 11) cuando se aplica el método de difusión, que es la metodología para evaluar la sensibilidad a los antibióticos más difundida en nuestro país y en el resto de Latinoamérica. No obstante, según los resultados de las CIM determinadas por dilución en agar, 13/30 y 8/30 aislamientos KPC positivos aún serían considerados como sensibles con los puntos de corte actuales para IMI y MER, respectivamente. Observaciones similares han realizado otros autores que trabajaron con el método epsilométrico o sistemas automatizados (15, 30, 36). Esto resulta sumamente preocupante dados los cambios en las recomendaciones del CLSI al respecto, en el sentido de que ya no se considera necesario ensayar el método de Hodge modificado ni ninguna otra prueba fenotípica para investigar la presencia de carbapenemasas, sino que basta informar la sensibilidad de acuerdo a la CIM de los carbapenems (11).

Las dificultades respecto de la determinación de sensibilidad a carbapenems recién comentadas constituyen un claro ejemplo en donde los puntos de corte para establecer la sensibilidad tomados sobre la base de índices farmacocinéticos-farmacodinámicos, pero independientes de los mecanismos de resistencia subyacentes, pueden ser peligrosamente erróneos. El propio CLSI sugiere que aún frente a microorganismos con KPC podrían emplearse carbapenems para el tratamiento, ya sea aumentando las dosis o utilizando dosificación continua, sobre la base del resultado de CIM obtenido (11). Esto podría representar un riesgo para pacientes con infecciones por bacterias productoras de KPC, en los que se han descrito fallas terapéuticas al utilizar carbapenems, aún cuando las CIM se ubican en el rango de sensibilidad actual (15, 20, 39). Esta situación podría deberse a una expresión inicialmente baja del gen kpc, sumada a un marcado efecto inóculo en estos aislamientos, tal como ha sido descrito por algunos autores (6, 15). De hecho, en ensayos preliminares donde determinamos las CIM de los carbapenems utilizando diferentes inóculos, observamos un marcado incremento en las CIM,

de 2 a 8 diluciones, al aumentar 10 o 100 veces el inóculo utilizado (datos no mostrados, manuscrito en preparación). Es posible que este fenómeno pueda explicar, en parte, nuestro hallazgo de un mejor desempeño del método de difusión (inóculo de 108 UFC/ml) comparado con el de la CIM en agar (inóculo de 104 UFC/spot) para clasificar como resistentes a aislamientos KPC positivos.

Se han propuesto diversos métodos fenotípicos para la detección presuntiva de carbapenemasas de clase A, tales como los aquí evaluados: Hodge modificado, sinergia enfrentando discos de carbapenems y de ácido fenilborónico e inhibición con discos combinados carbapenem/ácido fenilborónico (13, 16, 25, 31). Nuestros resultados muestran que los métodos fenotípicos son una herramienta sencilla y útil, que permite sospechar la presencia de carbapenemasas KPC en aislamientos de enterobacterias en el laboratorio. Tanto el método de Hodge modificado (con IMI o MER) como el método de sinergia entre discos del carbapenem y discos de APB o el método de inhibición con discos del carbapenem solo y con “discos combinados” (los que incluían el carbapenem más APB) fueron útiles para la detección fenotípica de aislamientos con este tipo de carbapenemasas. Por su parte, el ácido clavulánico demostró ser un inhibidor menos sensible y específico que el APB para ser empleado en estos ensayos.

Se ha descrito que si bien el método de Hodge es sensible para detectar la presencia de β-lactamasas, en particular carbapenemasas en enterobacterias, puede presentar resultados falsos positivos en aislamientos con sensibilidad disminuida a carbapenems por combinación de BLEE más impermeabilidad (15, 31). Nuestros resultados tienden a corroborar esas observaciones, ya que se observaron resultados positivos con todos los aislamientos KPC positivos y también falsos resultados positivos en unos pocos aislamientos KPC negativos, aunque únicamente con ETP (Tabla 1 y Figura 4). No advertimos esa falta de especificidad del ensayo de Hodge modificado cuando se utilizaron IMI o MER, quizás porque solo hemos podido incluir 14 aislamientos KPC negativos. No obstante, tal como describieron Endimiani et al. (15), la distorsión en el halo de E. coli ATCC 25922 obtenida con los aislamientos KPC positivos era claramente distinguible, no así la apreciada con los dos aislamientos KPC negativos, que fueron considerados falsos positivos con este método. Midiendo los milímetros de este sobredesarrollo (tal como se describe en Materiales y Métodos) fuimos capaces de cuantificar y así objetivar esta apreciación subjetiva. Consideramos que esta estrategia es sumamente interesante, ya que permite


una mejor definición en la interpretación del método de Hodge, lo que podría disminuir la probabilidad de obtener resultados falsos positivos y mejoraría la especificidad y eficacia de este método. De hecho, todos los aislamientos KPC positivos mostraron sobredesarrollos ≥ 8 mm, mientras que los KPC negativos nunca superaron los 4 mm. Sobre la base de estos resultados se podría sugerir un punto de corte tentativo para interpretar como positivo un resultado del método de Hodge cuando el sobredesarrollo en el halo de inhibición de E. coli ATCC 25922 es mayor que 5-8 mm.

El bajo número de aislamientos KPC negativos incluidos en este estudio limita el alcance de estos hallazgos, a la vez que refleja la epidemiología actual en nuestro medio. De hecho, todos los aislamientos KPC negativos incluidos fueron recuperados en los años 2007-2008, mientras que a partir del 2009 todos nuestros aislamientos con sensibilidad disminuida a carbapenems fueron productores de enzimas de tipo KPC (3, 18). En un contexto donde los aislamientos productores de KPC son más frecuentes que aquellos con sensibilidad disminuida a carbapenems por impermeabilidad más producción de BLEE, el valor predictivo positivo del método de Hodge es mayor (menor probabilidad que un resultado positivo sea falso).

El método de sinergia entre discos de carbapenems y APB resultó altamente específico, ya que no se obtuvieron falsos positivos con este método en aislamientos con sensibilidad disminuida a carbapenems por impermeabilidad más BLEE. No obstante, para alcanzar la máxima sensibilidad, la distancia debió ajustarse de acuerdo al diámetro de inhibición de los carbapenems. Tal como se presenta en la Tabla 1, realizando esta prueba a una distancia fija de 2 cm entre el disco de APB y el de carbapenem, no se pudo demostrar sinergia en algunos aislamientos KPC positivos, justamente en aquellos con halos de inhibición muy pequeños (6-14 mm). Ajustando la distancia entre discos a 1,2 cm (centro a centro) se pudo evidenciar un efecto sinérgico entre el APB y los tres carbapenems en todos estos aislamientos KPC positivos, aunque con cierta dificultad (Figura 5B). De este modo, concluimos que este método resulta altamente sensible y específico, pero la técnica e interpretación es sin duda subjetiva y dependiente del operador, y además, se requiere ajustar la distancia entre los discos de acuerdo al tamaño del halo de inhibición de los carbapenems.

El método de inhibición con discos combinados ha demostrado ser muy eficaz para detectar otras β-lactamasas, en particular BLEE, por lo que es sugerido por el CLSI para ese fin (11) y es ampliamente utilizado en los laboratorios de microbiología clínica.

Por ello resulta plausible, al menos en teoría, que la misma metodología pueda ser de utilidad para detectar carbapenemasas de clase A, en particular KPC (25).

Al momento de realizar este estudio no estaban comercialmente disponibles en nuestro país los discos combinados de carbapenems e inhibidores, ya sea AMC o APB, dos inhibidores de estas carbapenemasas. Por tal motivo ideamos un método alternativo para simular tales discos combinados, basado en la técnica de predifusión, como se describió en Materiales y Métodos. La combinación de carbapenems con APB según esta metodología resultó muy específica y aceptablemente sensible para la detección de carbapenemasas tipo KPC. La combinación de carbapenems con AMC fue notoriamente menos efectiva para este fin. Con la triple combinación de carbapenems con AMC y APB, si bien en general se obtuvieron halos 1-2 mm más grandes que con el carbapenem más APB (datos no mostrados), tomando como punto de corte una diferencia ≥ 4 mm respecto del halo del carbapenem solo, la combinación de estos dos inhibidores permitió detectar solo dos aislamientos KPC positivos adicionales con MER y ETP. No obstante, 3/14 y 4/14 aislamientos KPC negativos también serían considerados positivos para MER y ETP, respectivamente, lo que determina una disminución de la especificidad del método (Tabla 1).

Podemos afirmar que utilizando la metodología de inhibición con discos combinados se logra objetivar un resultado positivo según un punto de corte medible (ej: diferencias ≥ 4 mm), lo que tiende a disminuir la dependencia del observador, la cual existe con el método de sinergia con doble disco. Aun cuando en nuestro estudio incluimos controles internos, reconocemos que la metodología de predifusión utilizada en este estudio es sumamente “artesanal”, está sujeta a posibles errores no evidenciables y es muy laboriosa como para su implementación de rutina en laboratorios de microbiología clínica. No obstante, los promisorios resultados obtenidos son un aliciente para el desarrollo formal de este tipo de discos por parte de los fabricantes de reactivos diagnósticos.

En definitiva, podemos concluir que los métodos fenotípicos para la detección de bacterias con carbapenemasas KPC son confiables y fáciles de implementar en los laboratorios de microbiología clínica. Esto resulta de enorme importancia desde el punto de vista terapéutico, epidemiológico y de control de infecciones. Una rápida y eficaz detección de este tipo de microorganismos, tanto frente a casos probados de infección como frente a la sospecha de portadores de bacterias con carbapenemasas, permite no solo ajustar adecuadamente la terapia del paciente individual, sino también instaurar precozmente

301

múltiples medidas de prevención con la intención de limitar, evitar o controlar la diseminación de estas carbapenemasas, tan fácilmente transmisibles.

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A case of familial transmission of community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus carrying the

lnu(A) gene in Santa Fe city, ArgentinaEMILCE DE LOS A. MÉNDEZ1*, MARÍA L. ROLDÁN1, MARÍA R. BARONI1,2, MARÍA A. MENDOSA1, SABRINA A.

CRISTÓBAL1, STELLA M. VIRGOLINI2, DIEGO FACCONE3

1Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas, Universidad Nacional del Litoral, Ciudad Universitaria, Paraje “El Pozo” (3000), Santa Fe; 2Hospital de Niños “Dr O. Alassia”, Mendoza 4115 (3000), Santa Fe;3 Servicio

Antimicrobianos, INEI - ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”, Av. Vélez Sársfield 563 (1282) Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.


ABSTRACT

Community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus (CA-MRSA) is increasingly recognized as an important pathogen causing skin and soft tissue infections as well as necrotizing pneumonia. We describe a case of familial transmission of CA-MRSA between a 6-month-old boy and his mother in Santa Fe City, Argentina. Both isolates showed an identical antimicrobial susceptibility profile, carried type IV SCCmec and harboured the pvl and the lnu(A) genes. Isolates showed indistinguishable SmaI-PFGE patterns confirming their genetic relationship. These results corroborate the intrafamilial transmission of CA-MRSA and might associate this strain with the repetitive events of furunculosis within the family.

Key words: CA-MRSA, familial transmission, PVL, SCCmec IV

RESUMEN

Caso de transmisión familiar de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina adquirido en la comunidad portador del gen lnu(A) en la ciudad de Santa Fe, Argentina. Staphylococcus aureus resistente a la meticilina adquirido en la comunidad (SARM-AC) es reconocido como un patógeno importante que causa infecciones de piel y partes blandas y neumonía necrotizante. Describimos un caso de transmisión familiar de SARM-AC entre un niño de 6 meses de edad y su madre en la ciudad de Santa Fe, Argentina. Ambos aislamientos mostraron idéntico perfil de sensibilidad a los antimicrobianos, tenían el SCCmec tipo IV, y contenían los genes pvl y lnu(A). Los aislamientos presentaron patrones de SmaI-PFGE indistinguibles entre sí, lo cual confirmó su relación genética. Estos resultados corroboran la transmisión intrafamiliar de SARM-AC; asimismo, este aislamiento podría asociarse con los eventos repetitivos de furunculosis en la familia.

Palabras clave: SARM-AC, transmisión familiar, LPV, SCCmec IV

Community-acquired methicillin-resistant Sta-phylococcus aureus (CA-MRSA) is a common cause of primary skin infections, mainly furunculosis and abscesses, but can also cause necrotizing tissue in-fections and fulminant pneumonia in young and pre-viously healthy people (5, 6). Several cases of intrafa-milial CA-MRSA transmission have been described in the last decades, especially in families with young children (1, 8, 9, 10). Most CA-MRSA isolates har-bour the virulence factor Panton-Valentine leukoci-din (PVL) and the mecA gene which is carried in the staphylococcal cassette chromosome mec (SCC-mec) type IV or V (5). Resistance to macrolides, lin-

cosamides and streptogramins in S. aureus is mainly mediated by erm (MLS phenotype) and msrA (MSB phenotype) genes. However, an unusual mechanism of lincosamide resistance mediated by lnu(A) gene (L phenotype) has been occasionally described in clini-cal isolates (7, 11). In this report we describe a case of familial transmission of PVL producing CA-MRSA carrying SCCmec IV and the unusual lnu(A) gene.

Case report. In October 2010, a previously healthy 6-month-old boy was admitted to a private hospital in Santa Fe City, presenting with fever, shortness of breath, dysphagia and productive cough that had started 6 days earlier. The patient had no risk




factors associated to hospital infection, such as immunosuppression, corticoid treatment, diabetes, recent influenza, presence of any permanent indwelling catheter or percutaneous device, residence in a long-term care facility or others (e.g., daycare center) or previous S. aureus colonization/infection.

Laboratory data showed hemoglobin levels of 8.2 g/dl and a white blood cells count of 36,000/µl (86 % neutrophils, 2 % eosinophils, 10 % lymphocytes, 2 % monocytes). Arterial blood gas was: pH = 7.4, Pa CO2 32.9 mmHg. Erythrocyte sedimentation rate was 30 mm/h and was positive for C-reactive protein. Chest X-ray and lung ecography showed a 10 mm pleural displacement and a pleural drainage tube insertion was required.

Despite empirical treatment with ceftriaxone 100 mg/kg for 4 days and since the patient’s condition continued to worsen, he was transferred to a high-complexity public hospital for further treatment.

At the hospital, he was diagnosed with severe community-acquired pneumonia presenting with septic shock and he was transferred to the Intensive Care Unit (ICU) where he was intubated and ventilated.

Staphylococcus aureus (MRSA-1) was recovered from pleural fluid culture but not from blood cultures. The isolate was identified by the Vitek System (bioMèrieux, Marcy l’Etoile, France) and the coagulase test. Susceptibility testing was performed by the disk diffusion method according to CLSI standards (3). MRSA-1 isolate was categorized as susceptible to erythromycin, ciprofloxacin, cotrimoxazole, rifampin, and linezolid, but resistant to β-lactam antibiotics and gentamicin. Although a susceptible inhibition zone was observed around the clindamycin disk, the lincomycin inhibition zone was of 9 mm, suggesting the presence of a mechanism of resistance to lincosamides. The minimal inhibitory concentration (MIC) of vancomycin was 0.75 μg/ml by Etest (bioMèrieux). Considering these results, the antibiotic therapy was switched to intravenous vancomycin (40 mg/kg bid) plus rifampin (10mg/kg bid).

The patient remained ventilator-dependent for 4 days. He showed clinical improvement and intravenous antibiotic therapy was continued for 20 days. On day 24th of hospitalization he was discharged on oral cotrimoxazole treatment (10 mg/kg/day for 15 days).

In an attempt to detect the infection source, household contact information was evaluated, revealing a history of repetitive furunculosis affecting the mother and all siblings. The mother was screened by taking a sample from an abdominal furuncle, obtaining a methicillin-resistant S. aureus (MRSA-2). MRSA-2 showed identical antibiotic

susceptibility profile than MRSA-1, and the same MIC value to vancomycin. Detection of mecA and pvl genes was positive in both MRSA-1 and MRSA-2 isolates by polymerase chain reaction (PCR) as previously described (6, 13). Both isolates, MRSA-1 and MRSA-2, harbored the SCCmec type IV characterized by the multiplex PCR assay described by Oliveira (12). Interestingly, the lnu(A) gene was also detected in both isolates using lnuA-F: 5´- GGC GTA GAT GTA TTA ACT GG-3 ,́ and lnuA-R2: 5´-GAA AAA GAA GTT GAG CTT C-3 ,́ specific primers and confirmed by DNA sequencing. The presence of the unusual lnu(A) gene has been sporadically described in others countries, while only an MRSA-outbreak in a neonatal ward has been reported in Argentina (4, 7, 11).

The clonal relationship determined by pulsed field gel electrophoresis (PFGE) using SmaI enzyme for genomic DNA digestion showed that both isolates displayed indistinguishable electrophoretic patterns (2). These results confirm the genetic relationship between both isolates and the familial transmission of CA-MRSA harbouring SCCmec type IV and positive pvl gene.

The patient and household contact had no history of surgical procedures or of antimicrobial therapies. A repetitive history of furunculosis affecting the mother and all the siblings was registered; however no additional MRSA-positive samples were recovered.

The fact that both CA-MRSA isolates harbored the lnu(A) gene, limits the use of clindamycin as an option for the treatment of primary skin infections. However, it is important to note that none of the family had previously received clindamycin treatment.

In the present work, we confirm the familial transmission of CA-MRSA between a child and his mother, highlighting the importance of the search of contact carriage in community-onset MRSA infections.

Acknowledgment: this work was partly supported by

research grants from the Universidad Nacional del Litoral,

Santa Fe, Argentina (CAI+D 2009).

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Incidencia y distribución estacional de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina en pacientes adultos

ambulatorios en una clínica de la provincia de Buenos Aires: período 2006 - 2011

MARÍA T. VERÓN*, MARÍA G. OJEDA, FABIÁN AVINO, ANABELLA SPELZZINI, ANA L. BARBOZA, YESICA PETROZZINO

Servicio de Infectología y Microbiología Clínica, Clínica Privada Independencia.Luis María Drago 5681 (1605) Munro, Provincia de Buenos Aires, Argentina.

Correspondencia. E-mail: [email protected]

RESUMEN

En la última década aumentaron los aislamientos de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina

adquiridos en la comunidad (SARM-AC). Se describe la incidencia anual, distribución estacional,

resistencia a los antimicrobianos y fenotipos de SARM en pacientes adultos ambulatorios atendidos

en una institución privada del Gran Buenos Aires. Desde enero de 2006 hasta diciembre de 2011 se

estudiaron 173 cepas de S. aureus, 77 (45 %) fueron SARM. Durante dicho período, la incidencia anual

por 100 materiales procesados aumentó desde 0,13 en 2006 hasta 0,62 en 2011 a expensas del fenotipo

resistente a la oxacilina, con picos en primavera-verano hasta diciembre de 2008; después de esa fecha

se observaron picos en otoño-invierno. La resistencia al resto de los antimicrobianos se distribuyó del

siguiente modo: eritromicina, 24 (31 %); clindamicina, 22 (29 %); gentamicina, 23 (30 %); ciprofloxacina,

13 (17 %); trimetoprima-sulfametoxazol, 3 (4 %); cloranfenicol, 2 (3 %); rifampicina, 2 (3 %); y minociclina,

0. Se hallaron 16 fenotipos, el más frecuente fue el resistente a la oxacilina, con 53 % (41 aislamientos).

La frecuencia de este fenotipo aumentó de 31 % a 65 %. En virtud de los resultados de este análisis, se

cambió el tratamiento empírico de las infecciones y se implementaron medidas de prevención entre los

contactos.

Palabras clave: Staphylococcus aureus resistente a la meticilina, adultos, adquirido en la comunidad,

incidencia, series de tiempo

ABSTRACT

Incidence and seasonal distribution of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in adult

outpatients at a clinic in Buenos Aires province: period 2006 to 2011. In the last decade there was a

significant growth of community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus (CA-MRSA). We

herein describe the annual incidence, seasonal distribution, antimicrobial resistance and phenotypes

of MRSA in adult outpatients. From January 2006 to December 2011, 173 strains of S. aureus were

studied, 77 (45 %) of which were MRSA. The annual incidence per 100 processed materials increased

from 0.13 in 2006 to 0.62 in 2011 due to the oxacillin-resistant phenotype, showing peaks in spring-

summer until December 2008 and subsequent peaks in autumn-winter. The antimicrobial resistance

profile was: erythromycin 24 (31 %), clindamycin 22 (29 %), gentamicin 23 (30 %), ciprofloxacin 13 (17

%), trimethoprim-sulfamethoxazole 3 (4 %), chloramphenicol 2 (3 %), rifampicin 2 (3 %), and minocycline

0. Sixteen phenotypes were identified; the oxacillin-resistant phenotype being the most common,

accounting for 53 % (41 isolates) and exhibiting an increase ranging from 31 % to 65 %. The empirical

treatment of infections was changed and prevention measures were implemented among contacts.

Key words: methicillin-resistant Staphylococcus aureus, adult, community-acquired, incidence, time

series



307Incidencia de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina

Staphylococcus aureus es el patógeno bacteriano humano más frecuente como agente responsable de infecciones de piel y partes blandas. También está implicado en infecciones cardiovasculares y osteoarticulares, en neumonías y en infecciones asociadas a cuerpos extraños y sepsis.

Los primeros aislamientos de S. aureus resistente a la meticilina (SARM) surgieron en la década de los 60, y durante los 40 años subsiguientes produjeron infecciones intrahospitalarias. A fines de los años 80, en el noroeste de Australia emergieron los primeros SARM no multirresistentes (sensibles a gentamicina), que se diseminaron velozmente a todo el oeste de ese país; una situación similar vivió Japón desde 2003, cuando se describió el primer aislamiento clínico de SARM adquirido en la comunidad (SARM-AC). A fines de la década de los 90 emergieron en EE.UU. los primeros SARM-AC. Estos aislamientos se describieron inicialmente en niños, luego se propagaron con gran rapidez a otras poblaciones que compartían un factor común: la proximidad de sus miembros (convictos, hombres que tenían sexo con hombres, atletas de deportes de contacto, poblaciones de nativos americanos). Más tarde se diseminaron fuera de las poblaciones cerradas y se propagaron en la población general. La mayoría de las infecciones son de piel y partes blandas, aunque se han descrito infecciones invasivas graves, como neumonía y fascitis necrotizante (3, 11).

Las cepas de SARM-AC se distinguen de las adquiridas en el hospital (SARM-IH) por sus características genéticas y la sensibilidad a múltiples clases de antimicrobianos. Los SARM-AC portan el gen mecA y tienen la capacidad de producir la leucocidina de Panton-Valentine (LPV), una citotoxina que provoca destrucción de los leucocitos y necrosis tisular, lo que a su vez facilita la producción de abscesos. Los SARM-IH portan un gran cassette cromosómico mec (SCCmec) del tipo I, II o III, que confiere multirresistencia a grupos de antibióticos no β-lactámicos (macrólidos, aminoglucósidos, quinolonas). Los SARM-AC poseen los SCCmec de tipo IV y V, más pequeños y más fácilmente trasmisibles (5), pero que confieren menos resistencia a los antibióticos no β-lactámicos. En un estudio realizado en Argentina sobre 33 pacientes atendidos en un hospital de agudos, en 39 aislamientos de SARM-AC se comprobó la presencia de los genes mecA con el cassette cromosómico SCCmec de tipo IV, que codifica la LPV y la γ-hemolisina (9).

Las infecciones por SARM-AC han aumentado en Argentina en la última década, tanto en poblaciones pediátricas como en adultos. En un hospital pediátrico se estimó que la tasa de bacteriemias por SARM-AC era de 1,08 casos por cada 1000 ingresos hospitalarios (7); en otro hospital se encontró que el 14 % de las bacteriemias de la comunidad en adultos

eran por SARM-AC (1). Varios trabajos realizados en la Argentina y en otros países documentan el aumento de la incidencia de SARM-AC a través del tiempo y la distribución estacional de estos agentes infecciosos, con predominio en los meses cálidos del año (2, 5, 6, 8). Diversos informes sugieren que SARM-AC podría estar reemplazando a las cepas de SARM-IH, con consecuencias potencialmente catastróficas para la salud (12). Dada la rápida diseminación y la virulencia de estos microorganismos, se necesitan estrategias orientadas a controlar su diseminación en la población y a realizar un tratamiento antimicrobiano adecuado y precoz, para mejorar la evolución de las infecciones (5, 10).

El objetivo de este trabajo fue describir la evolución a lo largo de 6 años (2006 -2011) de la incidencia de SARM por 100 materiales procesados y caracterizar los fenotipos de resistencia a los antimicrobianos hallados en una población de pacientes adultos, evaluados en forma ambulatoria.

El estudio se realizó en el Servicio de Infectología y Microbiología Clínica de la Clínica Privada Independencia (Munro, Partido de Vicente López, Provincia de Buenos Aires). Este es un centro privado de 202 camas de internación y servicio de consultorios externos para pacientes adultos y pediátricos. Los datos de edad, sexo, fecha de ingreso de la muestra al laboratorio, tipo de muestra, origen de la muestra (paciente ambulatorio o internado), microorganismo aislado y resultado del antibiograma (si correspondía) habían sido recolectados por la auxiliar del laboratorio de Microbiología Clínica en forma prospectiva y sistemática, y luego registrados en una base de datos institucional, a medida que las muestras ingresaban para el procesamiento bacteriológico. Este estudio se basa en la revisión retrospectiva de la cohorte almacenada desde enero de 2006 hasta diciembre de 2011, por lo que constituye un estudio observacional, descriptivo, de series de tiempo.

Se seleccionaron todos los cultivos positivos para S. aureus de acuerdo con los métodos microbiológicos de referencia (gold standard) obtenidos en forma consecutiva de pacientes adultos ambulatorios en el laboratorio de Microbiología. Se excluyeron los cultivos positivos para gérmenes diferentes de S. aureus. La sensibilidad a los antibióticos se determinó por el método de difusión con discos (técnica de Kirby-Bauer), según las recomendaciones de los sucesivos CLSI. Se ensayaron los antibióticos oxacilina (OXA), eritromicina (ERI), clindamicina (CLI), gentamicina (GEN), ciprofloxacina (CIP), rifampicina (RIF), cloranfenicol (CLO), trimetoprima-sulfametoxazol (TMS) y minociclina (MIN). Para calcular la incidencia por 100 materiales procesados (MP) se utilizó como denominador el número total de cultivos realizados en pacientes adultos en forma ambulatoria.


La población global de pacientes fue dividida en dos grupos: los portadores de S. aureus sensible a la meticilina (SASM) y los portadores de SARM. Ambos grupos fueron comparados por las variables edad, sexo y tipo de muestra de la cual provenía el aislamiento, dividida esta última variable, a su vez, en muestras provenientes de “posibles infecciones” (lo que incluyó a todas las muestras, excepto a los hisopados de narinas y fauces) y muestras provenientes de “colonizaciones” (todos los hisopados nasales y de fauces). El objetivo de este análisis fue determinar la distribución de variables potencialmente confundidoras o modificadoras de efecto. Finalmente, los hisopados nasales/fauces fueron excluidos de dicha comparación, ya que en ellos solo se investigó SARM, pero estos fueron incluidos en los análisis posteriores, dado que nuestro objetivo fue describir la incidencia global de SARM tanto en materiales provenientes de colonizaciones como de infecciones.

Para determinar la distribución estacional de los aislamientos, los datos se ordenaron según las estaciones climáticas (semestres), los números absolutos de SARM y sus fenotipos de resistencia. Para construir las curvas de series de tiempo, colocamos en el numerador el número absoluto de SARM x 100 y en el denominador el total de materiales procesados por estación climática. Para

el análisis, se utilizaron gráficos de control por atributo (p-chart) y se calculó un error tipo alfa de 5 %. Se utilizó un gráfico de barras apiladas para observar la evolución estacional de los fenotipos de SARM. El análisis estadístico se realizó para las variables continuas a través de la media y el desvío estándar; los datos se compararon utilizando el t-test para las distribuciones normales o el test de Wilcoxon para las distribuciones no normales. Para las variables categóricas, los datos se analizaron a través de proporciones y se compararon utilizando el test de chi cuadrado. El ordenamiento de los datos se realizó con software Microsoft Excel y para su análisis estadístico se utilizó SPC Macros (version 1.11.1 Copyright 2002 Intermountain Health Care), Stacalc y Epitable Calculador (Epi Info 6.0).

Desde enero de 2006 hasta diciembre de 2011 se cultivaron 28 284 muestras de pacientes adultos ambulatorios, de las cuales 173 (0,61 %) fueron positivas para S. aureus y 77 (0,27 %) para SARM. En la Tabla 1 se detallan las características de los pacientes. La edad promedio de los pacientes de donde se aisló SARM fue 5,12 años menor que la del grupo de donde se aisló SASM. Hubo más chances de aislar SASM en el urocultivo (odds ratio: 5,48; IC 95 %: 2,13 - 14,68), lo que constituyó un dato estadísticamente significativo.

Tabla 1. Características de los pacientes ambulatorios con aislamientos de Staphylococcus aureus en el período 2006 - 2011

Variables Total SASM SARM Valor de p

N.o de aislamientos (%)(IC 95 %)

17396 (55)

(47,8-63,9)77(45)

(36,9-52,2)NS

Edad media (±DS)(IC 95 %)

39,08 (± 14,01)44,67 (± 13,67)(42,81-46,53)

39,55(±15,17)(37,02-42,08)

< 0,05

Sexo femenino (%)(IC 95 %)

95 (55)47(49)

(38,6-59,4)48 (62)

(50,6-73,1)NS

Tipo de muestra (%) (IC 95 %)

Posibles infecciones

Orina 41 (24)34 (35)

(25,9-45,8)7 (9)

(3,7-17,8)< 0,05

PB/Ab/Hi/Sec/(1) 27 (16)12 (13)

(6,6-20,8)15 (19)

(11,3-30,9)NS

Otros materiales(2) 74 (43)44 (46)

(35,6-56,3)30 (39)

(28-50,8)NS

Colonizaciones

Hisop. nasal / fauces 31 (18) 6 (6)(3) 25 (32) No corresponde

(1) Incluye cultivos de partes blandas por punción e hisopados, abscesos y secreciones de heridas; (2) Hemocultivos, 6; flujo vaginal, 5; punción articular, 3; lavado broncoalveolar, 2; uñas, 2; esperma, 2; fístula, 1; otros, 52; (3) se informaron los aislamientos por solicitud del médico tratante.


La frecuencia de SARM / S. aureus en el total del período estudiado fue de 45 % (77/173); su distribución anual fue la siguiente: 2006 = 25 % (7/28), 2007 = 27 % (8/30), 2008 = 40 % (10/25), 2009 = 30 % (10/33), 2010 = 61 % (19/31), 2011 = 88 % (23/26). Estos datos muestran un incremento mayor del triple. En 2011 se registraron casi dos aislamientos de SARM por mes. La frecuencia del fenotipo resistente a la OXA en el período 2006-2008 fue de 10 % (8/83; IC 95 %: 4,3 % - 18,1 %), lo que representa 1/3 del total de aislamientos SARM, mientras que en el período 2009 - 2011 fue de 37 % (33/90; IC 95 %: 26,8 % - 47,5 %), es decir, 2/3 del total de aislamientos SARM. Esto demuestra que el incremento a partir de 2009 fue a expensas del fenotipo resistente a OXA. Este comportamiento es similar al comunicado en otros trabajos (5).

En la Figura 1 se observan las variaciones estacionales de la incidencia de SARM por 100 MP, tomando como valor de referencia el valor de la media, de 0,27. La incidencia anual de aislamientos de SARM / S. aureus por 100 MP fue en 2006 de 0,13/0,52; en 2007 de 0,15/0,57; en 2008 de 0,21/0,52; en 2009 de 0,21/0,71; en 2010 de 0,43/0,70; y en 2011 de 0,62/0,70. La incidencia ascendente de SARM comparada con la incidencia relativamente estable de S. aureus nos indica que hay un aumento en la carga de colonización y/o infección por SARM a través del tiempo en la población estudiada. Desde 2010, la incidencia está por encima de la media y sus límites de confianza al 95 %, por lo que el aumento registrado debe considerarse estadísticamente significativo (p < 0,05).

La distribución estacional de SARM-AC fue analizada en varias investigaciones y se halló que SARM predomina en los meses de verano y otoño (6, 8). Antes de la primavera de 2008 y el verano de 2009, los aislamientos de SARM tenían picos de incidencia en primavera-verano y valles en otoño-invierno, tal como fue descrito en un estudio multicéntrico realizado entre 2006 y 2007 en una población pediátrica de Argentina (8). Es de destacar que aun cuando en el período octubre 2007-marzo 2008 la incidencia fue de 0,34 (lo que supera los límites históricos), en el período invernal siguiente esta disminuyó a 0,16, lo que la ubica por debajo de la media. A partir de 2009 se produjo un cambio en la distribución estacional, con picos de incidencia en otoño-invierno. Una explicación razonable sería que estamos viviendo un aumento global de colonizaciones e infecciones por SARM-AC, donde las incidencias no dependen de las estaciones climáticas, sino de la migración de pacientes colonizados de un hemisferio al otro. Cuando es verano en el hemisferio norte es invierno en el hemisferio sur, por lo que podrían aumentar las migraciones de verano por vacaciones, debido al traslado de los pacientes y los microorganismos de un país a otro. Podríamos decir que la distribución de nuestros aislamientos a partir del año 2009 coincide en el tiempo, pero no en la estación climática, con lo que refieren las publicaciones de los Estados Unidos.

Los patrones de resistencia a los antibióticos diferentes de la OXA en las 77 cepas de SARM


fueron los siguientes: ERI, 24 (31 %); CLI, 22 (29 %); GEN, 23 (30 %); CIP, 13 (17 %); TMS, 3 (4 %); CLO, 2 (3 %); RIF, 2 (3 %); y MIN, 0. Los porcentajes anuales de resistencia a CLI nunca fueron inferiores al 10 % (2006 = 5/7, 2007 = 1/8, 2008 = 3/10, 2009 = 2/10, 2010 = 7/19 y 2011 = 4/23), por lo cual este agente no sería una alternativa apropiada para el tratamiento empírico inicial, pero podría ser útil para el tratamiento una vez determinada la sensibilidad del aislamiento. Con respecto a CIP, desde 2010 las resistencias cayeron por debajo del 10 % (2006 = 4/7, 2007 = 5/8, 2008 = 2/10, 2009 = 1/10, 2010 = 1/19 y 2011 = 2/23), de manera que este es un antibiótico útil para el tratamiento empírico inicial, si tenemos en cuenta la sugerencia de Kaplan, de modificar la utilización de un antimicrobiano si la resistencia supera el 10-15 % (4). El último aislamiento resistente a TMS fue detectado en el verano de 2008 (2006 = 2/7 y 2008 1/10), lo que convierte a este antimicrobiano en la mejor opción para el tratamiento empírico inicial. No se observó resistencia a MIN, pero no la recomendamos como tratamiento empírico por ser bacteriostática, a menos que el paciente no tenga otras alternativas. Estos hallazgos son similares a los documentados en otras publicaciones (5).

Se hallaron 16 fenotipos diferentes entre los 77 aislamientos SARM (Figura 2). En los siete primeros períodos estacionales encontramos que el fenotipo R-OXA tuvo una frecuencia de 31 % (8/26, IC 95 %: 14,3 % - 51,2 %) y en los últimos seis períodos

de 65 % (33/51, IC 95 %: 50 % - 77,5 %), es decir que la frecuencia se duplicó. Esta diferencia fue estadísticamente significativa y demuestra que la variación estacional a partir del año 2009 se puede atribuir al aumento de los aislamientos del fenotipo R-OXA. El resto de los fenotipos fueron de aparición esporádica, con frecuencias menores del 10 %. Se destaca que los fenotipos R-OXA-ERI-CLI y R-OXA-GEN son de aparición reciente, con aislamientos a partir de 2010 y 2011, por lo cual creemos que habría que controlar su evolución.

La mayor debilidad de este trabajo es que no se pudo determinar si el origen del aislamiento fue nosocomial o de la comunidad debido a que no se almacenaron los datos de antecedentes patológicos de los pacientes, por lo cual la única forma de clasificarlos era en “población ambulatoria” y “población internada”. Sin embargo, consideramos que las conclusiones son útiles para implementar medidas para el control de diseminación y cambios en el tratamiento empírico inicial de SARM-AC en nuestra población.

Este estudio muestra que la incidencia de SARM por 100 MP está en ascenso a expensas del aumento del fenotipo R-OXA, el cual presenta picos en los meses fríos del año a partir de 2009, y que los antimicrobianos más útiles para el tratamiento empírico inicial son TMS y CIP, ya que presentan una actividad mayor del 90 %.

A partir de estos hallazgos se adoptaron las siguientes medidas para el control de la diseminación

Figura 2. Evolución estacional de los fenotipos de resistencia de los 77 aislamientos SARM de los pacientes ambulatorios


y el tratamiento de las infecciones por SARM-AC en la población ambulatoria:

información a todos los médicos de nuestra •institución sobre los hallazgos de este estudio;cambio de tratamiento empírico inicial ante •la sospecha de infección estafilocócica de la comunidad. Tratamiento ambulatorio: TMS como primera elección, CIP como segunda elección. Pacientes que requieren internación: VAN, hasta ser evaluado por el Servicio de Infectología;cultivo de las lesiones y detección de los •portadores por cultivo de hisopado nasal; descontaminación nasal de los portadores en •forma simultánea al tratamiento antimicrobiano, tras la detección de resistencia a la mupirocina;baño diario con clorhexidina jabonosa para el •paciente y sus convivientes durante 5 - 7 días.

Agradecimientos: a la Dra. Sonia Arduino por su colaboración en la redacción del manuscrito.

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Escherichia coli verocitotoxigénico: varias cuestiones… y los tambos también

DANIEL FERNÁNDEZ, NORA L. PADOLA*

Laboratorio de Inmunoquímica y Biotecnología, Centro de Investigación Veterinaria de Tandil, CONICET- CICPBA, Facultad de Ciencias Veterinarias, UNCPBA. Pinto 399 (7000) Tandil, Argentina.

*Correspondencia. E-mail. [email protected]

RESUMEN

Escherichia coli verocitotoxigénico (VTEC) es causante de brotes y casos esporádicos de colitis

hemorrágica (CH) y síndrome urémico hemolítico (SUH). En Argentina el SUH es endémico, con 500

nuevos casos por año y una incidencia de 17/100 000 niños menores de 5 años. El serotipo aislado

con mayor frecuencia es el O157:H7, aunque hay serotipos no-O157 que están asociados con la

enfermedad en el hombre. VTEC produce verocitotoxinas y factores de virulencia accesorios como

intimina, enterohemolisina y una proteína autoaglutinante llamada Saa. Diversos estudios realizados

en varios países han confirmado que los bovinos de diferente edad son los principales reservorios de

VTEC, y han demostrado altas prevalencias tanto de serotipos O157:H7 como no-O157, muchos de ellos

involucrados en brotes de SUH y CH a nivel mundial. La transmisión de VTEC al hombre se produce por

el consumo de carne mal cocida, de verduras y agua contaminadas por heces de portadores, así como

por el contacto persona-persona y con el medio ambiente contaminado. Los tambos pueden contribuir

al riesgo de infección por VTEC en humanos mediante el consumo de leche cruda, de productos lácteos

o carne contaminada proveniente de bovinos lecheros, y también a través del propio medio ambiente

del tambo. Existe una amplia distribución y una alta prevalencia de serotipos VTEC en bovinos lecheros

de Argentina, por lo cual es importante aplicar medidas de control y manejo que eviten la transmisión de

cepas entre animales, ambiente y humanos.

Palabras clave: Escherichia coli, bovino, tambo, toxina Shiga

ABSTRACT

Verocytotoxigenic Escherichia coli: several aspects….and also the dairy farms. Verocytotoxigenic

Escherichia coli (VTEC) is associated with outbreaks and sporadic cases of hemorrhagic colitis (HC) and

hemolytic-uremic syndrome (HUS), the most severe form of these human diseases. In Argentina HUS is

endemic, with 500 new cases per year and an incidence of 17/100,000 in children under 5 years of age.

VTEC O157:H7 is the most frequently isolated serotype, although there are non-O157 serotypes that have

been associated with human disease. VTEC produces verocytotoxins and accessory virulence factors

such as intimin, an enterohemolysin and an autoagglutinating protein called Saa. Cattle are VTEC carriers

and several studies in Argentina have confirmed that bovines are the main reservoir of serotypes O157:H7

and non-O157, many of them involved in HUS and HC worldwide. Transmission of VTEC to humans

occurs through consumption of undercooked meat, vegetables and water contaminated by feces of

carriers, person-to-person and contaminated environment contact. Dairy farms can contribute to the

risk of VTEC infection in humans through the consumption of raw milk, dairy products, and contaminated

meat from dairy cattle and through contamination of the dairy environment. There is wide distribution and

high prevalence of VTEC serotypes in dairy cattle in Argentina; therefore, it is important to improve the

measures of control and management and to prevent the transmission of VTEC strains among animals,

environment and humans.

Key words: Escherichia coli, cattle, dairy farms, Shiga toxin

ARTICULO ESPECIALISSN 0325-7541


313

INTRODUCCIÓN

Escherichia coli es la bacteria anaerobia facultativa más abundante de la flora normal del tracto gastrointestinal y es una de las primeras especies bacterianas que colonizan al mamífero recién nacido, el cual adquiere las primeras cepas del canal del parto y de las heces de su madre (4).

A pesar de esta simbiosis entre la bacteria y el huésped, hay diversas cepas de E. coli que pueden transformarse en patógenas tras adquirir genes de virulencia móviles localizados en islas de patogenicidad, bacteriófagos integrados y/o plásmidos (4). Es decir que si bien la cepas de E. coli patógenas poseen un genoma similar al de las que normalmente viven en el intestino de un mamífero, las primeras portan genes extras que contienen la información necesaria para producir un efecto perjudicial.

Los aislamientos de E. coli que causan enfermedad entérica se dividen en 6 virotipos o patotipos, agrupados según sus factores de virulencia y los mecanismos por los cuales causan enfermedad. Estos son E. coli enterotoxigénico [enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC)], E. coli enterohemorrágico [enterohemorragic Escherichia coli (EHEC)], E. coli enteropatógeno [enteropathogenic Escherichia coli (EPEC)], E. coli enteroinvasivo [enteroinvasive Escherichia coli (EIEC)], E. coli enteroagregativo [enteroaggregative Escherichia coli (EAggEC)] y E. coli de adherencia difusa [diffusely adhering E. coli (DAEC)] (10, 55, 60, 90). Las cepas de cada virotipo presentan mecanismos de patogenicidad específicos, serotipos distintos y producen infecciones y síndromes diferentes.

UNA DEFINICIÓN PARA EHEC

Son un subgrupo de cepas de E. coli verocitotoxigénicas (VTEC) que se caracterizan por compartir caracteres clínicos, patogénicos y epidemiológicos con la cepa prototipo O157:H7 (47). Su nombre se debe a la capacidad que tienen las cepas de este virotipo de producir colitis hemorrágica (CH) y síndrome urémico hemolítico (SUH) en el hombre. Actualmente, un informe de la American Academy of Microbiology define a EHEC como sinónimo de VTEC (http://academy.asm.org/images/stories/documents/EColi.pdf).

FACTORES DE VIRULENCIA DE VTEC

Entre los factores de virulencia de VTEC se encuentra la producción de potentes citotoxinas denominadas verocitotoxinas (VT), Shiga toxinas o shiga-like toxins, las que están codificadas en el

genoma de profagos integrados en el cromosoma bacteriano (68). Las VT son factores de virulencia críticos de VTEC y responsables de la sintomatología observada en el SUH. Existen dos tipos de VT: VT1 y VT2, esta última con múltiples variantes.

Algunas VTEC expresan la proteína de membrana externa intimina (codificada por el gen eae del cromosoma bacteriano), responsable de la lesión conocida como Attaching and Effacing (A/E), que le permite a la bacteria adherirse y borrar las microvellosidades intestinales. Aquellas bacterias que no poseen intimina pueden presentar una proteína autoaglutinante denominada Saa, la que está codificada en un megaplásmido de 60 MDa (Mp) y tendría funciones en la adherencia bacteriana (69). El Mp o plásmido enterohemorrágico se encuentra presente en E. coli O157 y en algunos serotipos no-O157. Algunas cepas VTEC producen una enterohemolisina codificada en el gen exhA del Mp. El rol del Mp de O157 en la adherencia de este serotipo fue inicialmente sugerido por Karch et al. (41), quienes encontraron que la presencia de este plásmido se correlaciona con la expresión de fimbrias y la adherencia a células Henle 407, pero no a células Hep-2. En modelos animales, Tzipori et al. (91) demostraron que la presencia o ausencia del plásmido no afecta la capacidad de VTEC de colonizar el colon o causar lesión A/E en cerdos gnotobióticos.

Jenkins et al. (39) demostraron que no existe una asociación significativa entre VTEC aisladas de pacientes con SUH y la presencia del gen saa, sin embargo, se ha informado que algunos serotipos VTEC saa-positivos y eae-negativos son capaces de colonizar el tracto gastrointestinal del hombre y causar SUH (1, 6).

Existen nuevos factores de adherencia que no se detectan rutinariamente en las cepas VTEC, como el Iha (proteína de membrana externa) (85) y el Efa-1 (factor de adherencia de EHEC) (62, 82). Efa-1 es una adhesina producida por cepas no-O157, necesaria para la adherencia a la línea celular CHO in vitro y para la hemaglutinación, la autoagregación y la colonización del intestino de bovinos (62, 82). En un estudio realizado en Argentina, Galli et al. (26) detectaron el gen iha en el 85 % de las cepas aisladas de bovinos, mientras que el gen efa1 no fue detectado en ninguno de los aislamientos.

El gen efa1/lifA está presente en la mayoría de los patógenos productores de lesión A/E, pero no es necesario para la formación de dicha lesión. Este gen está presente en una isla de patogenicidad denominada PAI O122, y está involucrado en la represión de la activación de los linfocitos del huésped (45) y en la adhesión a cultivos celulares (62). La presencia de este gen ha sido asociada in

Escherichia coli verocitotoxigénico y tambos


vivo con la capacidad de las bacterias que lo portan de colonizar el tracto intestinal del bovino y de inducir diarrea en terneros jóvenes (82). Se ha informado también la existencia de adhesinas fimbriales y afimbriales (AFA-8, F17, CS31A) (83).

ARGENTINA A LA VANGUARDIA DE CASOS DE SUH

En el hombre, los síntomas clínicos asociados a infección con VTEC aparecen luego de 3 a 5 días de ingerir la bacteria (32) y pueden causar diarrea acuosa, CH, púrpura trombocitopénica trombótica (PTT) y SUH (42).

Las manifestaciones gastrointestinales comienzan con diarrea acuosa, dolor abdominal grave y, ocasionalmente, náuseas y vómitos (49). La fiebre no es una característica de la infección (87). En uno o dos días la diarrea acuosa puede progresar a CH, con evidencia de edema y erosión de la mucosa colónica (32). La CH es una manifestación clínica caracterizada por dolores abdominales, presencia de sangre en las heces y, ocasionalmente, fiebre (50). En la mayoría de los casos, los síntomas desaparecen en una semana, sin secuelas evidentes. Sin embargo, pueden ocurrir complicaciones como PTT, SUH, falla renal aguda y muerte (61, 68) (Figura 1).

El SUH se caracteriza por la presencia de insuficiencia renal aguda, anemia hemolítica microangiopática y trombocitopenia grave, con microangiopatía de localización renal selectiva y manifestaciones de lesión isquémica en el sistema nervioso central, retina, miocardio, páncreas e intestino (77, 86).

Los primeros casos de SUH en Argentina fueron estudiados por el Dr. Carlos Giannantonio a partir de 1964, aunque no fue hasta 1983 que se atribuyó

a VTEC la etiología de la enfermedad (28). López et al. (49) demostraron que el serotipo O157:H7 estaba presente en menos de la mitad de los casos de SUH en niños de Argentina, lo cual sugirió la presencia de serotipos no-O157. Esto fue confirmado por Rivas et al. (75), aunque con una prevalencia de VTEC no-O157 menor del 30 %.

El SUH es la principal causa de insuficiencia renal aguda y la segunda causa de insuficiencia renal crónica y trasplante renal en niños de la Argentina (74, 93), donde adopta características de enfermedad endémica. Actualmente, nuestro país presenta el registro más alto de SUH de todo el mundo, con aproximadamente 420 casos declarados anualmente y una incidencia de 17/100 000 en niños menores de 5 años (76). Se registra un aumento estacional del número de casos en primavera y verano, y afecta principalmente a niños de entre 6 meses y 5 años. Generalmente los pacientes son niños eutróficos, de clase media, con buenas condiciones sanitarias y ambientales (93).

TRANSMISIÓN DEL RESERVORIO AL HOMBRE

El bovino: principal reservorioLos rumiantes son el principal reservorio de VTEC

(1, 21, 38, 79). Esta bacteria puede transmitirse al hombre a través de la ingestión de alimentos o agua contaminados con heces de animales, o por medio del contacto directo con estos animales o con su medio ambiente (8, 57, 58, 66, 67).

En contraste con lo que ocurre en el humano, los bovinos infectados con VTEC O157:H7 y no-O157 se mantienen tolerantes a la enfermedad, por lo cual la mayoría de los serotipos de VTEC implicados en

Figura 1. Desarrollo de la infección por VTEC. Adaptado de: Mead PS, Griffin PM. Escherichia coli O157:H7. Lancet 1998; 10: 1207-12.

315Escherichia coli verocitotoxigénico y tambos

enfermedad en humanos no causan enfermedad en bovinos. Sin embargo, VTEC O157:H7 puede causar ileocolitis fatal en terneros recién nacidos, aunque no se han detectado lesiones vasculares extraintestinales ni manifestaciones sistémicas de enfermedad (9, 71).

Las causas de la naturaleza refractaria de los bovinos a la enfermedad por VTEC son aún contradictorias: según Pruimboom-Brees et al. (71), puede deberse a la ausencia del receptor (Gb3) de las VT en la mayoría de los tejidos de estos animales. Sin embargo, otros estudios demuestran que los bovinos expresan receptores para VT, pero en tejidos diferentes y con una nueva distribución celular. Se ha demostrado que las células apicales no unen VT1, lo que probablemente se corresponde con la pérdida de este receptor a medida que las células migran y se diferencian. La unión de la VT al epitelio intestinal bovino contrasta con la ausencia de este receptor en el epitelio intestinal humano y esto podría ser significativo durante la colonización del bovino (71).

VTEC puede ser incorporado por los terneros recién nacidos de sus madres, de otros animales y del medio ambiente. Los terneros de menor edad han sido considerados la categoría de mayor prevalencia de VTEC (63), pero en otro estudio se encontraron mayores prevalencias en vaquillonas (13). Si bien se desconocen las razones por las que ciertos grupos etarios de bovinos son más afectados, factores tales como diferencias en el desarrollo ruminal, en la respuesta inmune, en la dieta y en aspectos de manejo podrían ser relevantes (92). Los periodos de excreción fecal de VTEC en el bovino son intermitentes, con variaciones en la duración de la eliminación; se ha informado que esta es más prolongada en animales de menor edad (92).

Las condiciones climáticas representan otro factor de influencia en la excreción de VTEC en bovinos (15). Diversos estudios de estacionalidad en otros países están referidos solo a VTEC O157:H7 y documentan una excreción fecal baja en invierno, la que se incrementa en primavera y alcanza niveles pico en los meses de verano. Esta tendencia también fue demostrada en Argentina por Fernández et al. (21, 22) con respecto a la detección de VTEC no-O157 y de los genes codificantes de VT. Los brotes humanos de infecciones imitan este modelo de excreción, y tienen principalmente lugar en los meses cálidos (19, 64). Si bien la estacionalidad de VTEC no ha sido atribuida a un factor en especial, Edrington et al. (19) demostraron una relación entre el modelo de excreción estacional en bovinos y las horas de luz en el día. Estos autores corroboraron que la melatonina se excreta en forma similar al modelo de excreción de VTEC O157:H7, con una mayor secreción durante

los meses de verano. Esta hormona tendría un efecto inmunosupresor en el bovino, lo que explicaría la mayor excreción de VTEC durante meses calurosos. Por otra parte, la glándula tiroides también podría estar influenciada por los cambios relacionados con la estacionalidad, dado que se detectan en suero menores niveles de hormonas tiroideas en épocas cálidas, por lo que podría existir una relación entre estas hormonas y la variación estacional de VTEC (43). Sin embargo, Schultz et al. (81) no encontraron diferencias en la eliminación de VTEC O157:H7 entre bovinos con baja concentración de hormonas tiroideas en suero y animales con niveles normales de estas hormonas.

El tipo de alimentación es otro de los factores que influencian la colonización por VTEC en bovinos (23, 51), ya que se ha observado que dietas a base de granos inducen una resistencia ácida de VTEC en el rumen y permiten que la bacteria sobreviva al pH del abomaso, con incremento de su excreción fecal (7). Sin embargo, aunque algunos investigadores atribuyen una mayor excreción de VTEC a dietas ricas en fibra, otros no encontraron diferencias significativas al comparar ambas dietas (30, 31, 36).

El estrés dietario es otro factor implicado en la variación de la excreción de VTEC, ya que en animales bien alimentados, la actividad metabólica de la flora ruminal anaeróbica produce una concentración de ácidos grasos volátiles que limita el número de coliformes, mientras que durante el ayuno, este efecto inhibitorio se vería disminuido y los animales excretarían una mayor cantidad de VTEC (92).

De la vaca al hombre El consumo de alimentos de origen bovino (sobre

todo, carne mal cocida y leche sin pasteurizar) contaminados con VTEC son las principales vías de transmisión de la bacteria al hombre (33). También el consumo de agua contaminada y el contacto directo con animales portadores de estas bacterias, o con pasturas o aguas recreacionales, han sido causantes de casos esporádicos y brotes de enfermedad (42, 48, 72) (Figura 2). Otros alimentos crudos como frutas y vegetales (alfalfa, lechuga, espinaca y rábano) y sidra de manzana contaminados con VTEC han sido responsables de enfermedad en el hombre (17, 33).

En Argentina, Parma et al. (67) detectaron VTEC en el 29 % de muestras de hamburguesas y en el 25 % de muestras de carne picada; los serotipos aislados fueron O20:H19, O91:H21, O113:H21, O116:H21, O117:H7, O171:H2 y OX3:H21. Otro estudio en Argentina determinó que el 8,4 % de las muestras de hamburguesas congeladas fueron VTEC positivas y documenta el hallazgo de los serotipos O8:H16, O113:H21 y O39:H4 (30), mientras que Chinen et al. (11) analizaron 279 muestras de carne y detectaron VTEC


O157:H7 en el 3,8 % de las muestras de carne picada, el 4,8 % de las muestras de chorizo fresco y el 3,3 % de las muestras de chorizo seco. En la ciudad de Tandil, en particular, Sanz et al. (80) analizaron muestras de carne picada y hamburguesas, y detectaron VTEC en el 43 % de ellas.

La lechería argentina: niveles de producción para tener en cuenta

Luego de Brasil, Argentina es el segundo productor de leche de América Latina y se ubica en el décimo primer lugar a nivel mundial en exportaciones globales, tercero en el rubro leche en polvo entera y, recientemente, ha incorporado el suero deshidratado y la leche condensada a sus exportaciones (SAGPyA, Lácteos - Dirección de Industria Alimentaria - Centro de la Industria Lechera. http://www.sagpya.mecon.gov.ar/).

La producción nacional creció a lo largo del siglo XX, pero en la última década, a partir de la estabilidad económica, la tasa de crecimiento alcanzó el 7,2 % anual acumulativo, con lo que pasó de 5937 millones de litros en 1991 hasta un récord de 10 329 millones de litros en 1999, y nuevamente en 2006, unos 10 162 millones de litros (http://www.sagpya.mecon.gov.ar/). En 2009, se produjeron en el país alrededor de

10 100 millones de litros de leche, una cifra apenas superior a la registrada en 2008. Esto permitió un pleno abastecimiento al mercado doméstico y más exportaciones (http://www.sagpya.mecon.gov.ar/).

Las estadísticas oficiales argentinas distinguen, dentro de la producción total de leche, una cierta cantidad (7,16 % en 2006) que se procesa fuera de la industria formal, y por ello se la denomina “leche informal”. En el pasado se la denominaba “leche cruda”, y de allí que en muchos casos se la relacionara con la leche fluida, aunque en realidad su destino mayoritario es la producción familiar de quesos y en mucha menor medida, el consumo directo. En 2006 se alcanzó el mayor volumen histórico destinado a este rubro (727,5 millones de litros), lo cual debería poner en alerta sobre las condiciones sanitarias y fiscales de este mercado.

Actualmente, el país produce alrededor de 800 millones de litros de leche al mes, con un pie de cría que cuenta con 50 millones de bovinos, dentro de los cuales 5 millones están destinados a la producción de leche (http://www.sagpya.mecon.gov.ar/).

Si bien VTEC ha estado asociado al consumo de hamburguesas contaminadas, producto de los grandes brotes que han involucrado casas

Figura 2. Vías de transmisión de VTEC al hombre. Adaptado de: Fairbrother JM, Nadeau E. Escherichia coli: on-farm

contamination of animals. Rev Sci Tech 2006; 25: 555-69.


de comidas rápida en todo el mundo, los tambos –como se mencionó anteriormente– también pueden contribuir al riesgo de infección por VTEC en humanos a través del consumo de leche cruda, de productos lácteos elaborados con leche sin pasteurizar, de carne contaminada proveniente de bovinos lecheros –ya sean vacas de descarte o terneros (18)–, o bien por contacto directo con animales o con el medio ambiente del tambo (70). Esto constituye un factor importante si se tienen en cuenta los niveles de producción de leche en Argentina recién citados.

En Argentina, entre el año 2008 y 2009, la ingestión de lácteos contaminados con VTEC ocupó el segundo lugar con respecto a su relación con los casos de SUH, vinculado con un 16,39 % de estos (dato proporcionado por la Dirección de Epidemiología del Ministerio de Salud de la Provincia de Buenos Aires). La contaminación de la leche se produciría por contaminación fecal durante el ordeño, debido a que VTEC comúnmente no se excreta en leche y, sin embargo, ha sido aislado de muestras de leche cruda, ya sea de bovinos individuales o de leche del tanque (56).

En Argentina, Fernández et al. (22) determinaron una prevalencia de VTEC en vacas en ordeñe del 32 %, en tanto que Sanz et al. (79) documentaron valores de 32,8 % y 44 % para bovinos en pastoreo y de matadero, respectivamente, de la misma zona de nuestro país. Estas prevalencias varían no solo de acuerdo con la región geográfica, sino también con las distintas estrategias de diagnóstico utilizadas, por lo cual se debe tener especial cuidado al comparar prevalencias entre diferentes países.

Los pequeños tambiénLa prevalencia de VTEC en terneros de guachera

en tambos de Argentina (43 %) y en terneros recién nacidos (25 %) (Fernández et al., datos no publicados) sugiere que esa población bovina se encuentra expuesta a esta bacteria desde el nacimiento e indicaría un papel importante de la transmisión vertical de VTEC. En terneros, al igual que en bovinos adultos, también se observó mayor prevalencia de VTEC en épocas cálidas (21). La mayor prevalencia observada en bovinos de menor edad comparada con aquella de vacas en ordeño también se detectó en bovinos de matadero de Argentina (54) y en bovinos de otras partes del mundo (13, 92), y puede deberse a diferentes factores, como por ejemplo, una mejor colonización del tracto gastrointestinal favorecida por el estrés por destete, un menor desarrollo del sistema inmunológico, cambios en la dieta y el pH intestinal, o cambios anatómicos y fisiológicos del tracto gastrointestinal.

Épocas de calor: época de mayor riesgo En épocas cálidas, no solo se presenta un mayor

riesgo de transmisión de VTEC al hombre dado por la mayor excreción de esta bacteria por parte del bovino, sino que además, en un estudio realizado en Argentina por Fernández et al. (21), se pudo observar un alto porcentaje de cepas portadoras del gen vt2 en todas las estaciones del año, con un aumento de cepas portadoras de los genes vt1+vt2 y una disminución de aquellas portadoras de vt1 en estaciones cálidas. Este factor es importante si se tiene en cuenta que el genotipo vt2 es más citotóxico que vt1, puesto que algunos datos epidemiológicos indican que las cepas productoras de VT2 son más frecuentemente aisladas en los casos de SUH, y que los casos de SUH se producen con más frecuencia en los meses cálidos (73).

Las razones específicas de estas fluctuaciones se desconocen, pero las diferencias en la dieta y el manejo de los animales en las diferentes estaciones pueden tener un impacto sobre la selección de cepas que causan enfermedades en los seres humanos. Además, las secuencias de estos genes se encuentran en elementos genéticos móviles y pueden tener diferentes patrones de movilidad (82).

Varios autores establecieron una relación entre la edad de los bovinos y el gen vt e indicaron que vt1 predomina en terneros y vt2 en bovinos adultos (12, 14). Sin embargo, Fernández et al. (21) mostraron un incremento en primavera y verano de los porcentajes de bacterias portadoras de genes vt1+vt2 en terneros y vacas, lo que sugiere que el tipo de vt está influenciado por la estación de año, más que por la edad de los animales.

Distintos nombres y apellidos para una misma familia

En cepas de VTEC aisladas de vacas en ordeño de Argentina, el principal perfil de virulencia encontrado fue vt1, vt2, saa, ehxA, lo cual concuerda con los resultados obtenidos en bovinos de matadero y en carcasas en Argentina (54), y en bovinos de carne y lecheros en Brasil (65). Sin embargo, Padola et al. (66) encontraron una alta prevalencia de cepas con perfil vt2, eae y ehxA, lo cual demuestra la variabilidad de cepas dependiendo del sistema de producción estudiado.

La mayor parte de los estudios realizados en bovinos de tambo se han centrado en la detección selectiva de VTEC O157. En Argentina, utilizando métodos no selectivos, se detectó una baja prevalencia de este serogrupo en vacas en ordeño (0,2 %) y terneros de guachera (0,8 %) (21), mientras que en frigoríficos, Masana et al. (53) encontraron VTEC O157 en el 4,1 % y 2,6 % de las muestras de heces y carcasas, respectivamente, utilizando


metodología selectiva para este serotipo. Por otra parte, Tanaro et al. (84) detectaron el serotipo O157 en 3,8 % de las muestras de heces de bovinos de Argentina. Estos datos indican que O157:H7 es un serotipo poco común en vacas de Argentina, aunque ha sido aislado de heces humanas, animales y alimentos por otros autores en este país (11, 60, 75).

En la Argentina, VTEC no-O157 se ha aislado en todas las categorías de bovinos de tambo, y muchos de estos serotipos (O5:H-, O11:H-, O15:H-, O26:H11, O55:H-, O91:H21, O103:H-, O103:H2, O105:H18, O111:H-, O113:H21, O130:H11, O141:H19, O145:H-, O153:H25, O163:H19, O172:H-, O174:H21 y O178:H19) han sido aislados previamente de pacientes humanos con SUH, diarrea o CH en varios países (6, 22, 24, 29, 40, 89). Los serotipos EHEC O91:H21, O113:H21, O130:H11 y O178:H19 fueron los más frecuentemente aislados de vacas en Argentina (22). Estos serotipos también fueron encontrados con alta prevalencia en heces de bovinos de matadero y en carcasas (54).

Se ha informado la presencia de los serotipos O8:H16, O91:H21, O113:H21, O171:H2, O178:H19, ONT:H- y ONT:H21 en bovinos lecheros de Argentina y en ganado de carne de este país (6, 22, 57, 66).

El serotipo enterohemorrágico O26:H11 se encontró en terneros recién nacidos de Argentina (Fernández et al, datos no publicados). Este serotipo es el más comúnmente asociado a casos de diarrea y SUH en Europa, aunque también se han descrito casos de enfermedad en el hombre en otras partes del mundo, incluyendo Sudamérica (27).

En terneros de guachera y recién nacidos también se detectó el serotipo EHEC O145:H-, que fue aislado por primera vez en Argentina en bovinos de feedlot por Padola et al. (66) y que ha sido anteriormente involucrado en brotes de SUH en Japón (46). Actualmente, este serotipo es el segundo en importancia aislado de casos de SUH en Argentina, después de O157:H7.

El aislamiento de una gran variedad de serotipos en todas las categorías de bovinos de tambo de Argentina, mucho de ellos EHEC y portadores de todos los factores de virulencia, sugiere un alto riesgo para la salud pública.

El medio ambiente y VTECEl medio ambiente puede proveer una forma de

transmisión y diseminación de VTEC entre los bovinos de diferentes edades debido a la contaminación fecal repetida y a la supervivencia y crecimiento de la bacteria en aquel (13).

La principal vía de contaminación del medio ambiente del tambo con VTEC son las heces de los bovinos excretadas directamente sobre el suelo y las pasturas, otros animales domésticos, animales silvestres e insectos. Otra forma de ingreso de

VTEC al ambiente es a través del agua de efluentes de los tambos, especialmente luego de períodos prolongados de lluvia (88).

Al igual que en las heces bovinas, VTEC posee la capacidad de sobrevivir durante largos períodos en el suelo, el agua y el sedimento de los bebederos. Esa supervivencia depende de varios factores, como exposición a la luz solar, temperatura, competencia con la microflora nativa, disponibilidad de nutrientes, concentración de electrolitos y pH del medio (2).

La secreción oral también es una posible fuente de contaminación de aguas para consumo animal, ya que VTEC O157 ha sido aislado de tonsilas, rumen, retículo y abomaso de bovinos infectados. El microorganismo puede ser regurgitado en los pre-estómagos durante el proceso de rumia, contaminando de esta manera el medio ambiente acuático (20).

Los líquidos efluentes del tambo pueden ser otro medio de supervivencia de VTEC, y este proceso se encuentra marcadamente influenciado por la temperatura del medio ambiente. Las altas temperaturas generalmente están asociadas a una disminución en la concentración de VTEC O157:H7 en efluentes, mientras que con temperaturas menores la supervivencia de la bacteria es mayor. Este fenómeno podría deberse a una disminución de la actividad metabólica de la flora competitiva del medio acuático (84, 94).

La contaminación con VTEC de los alimentos para bovinos (por ejemplo, granos, pasturas, silo de pastura y silo de maíz) puede ocurrir durante el transporte y por la contaminación de los comederos. También puede darse una contaminación precosecha a causa de la utilización de heces bovinas como abonos, o poscosecha, mediante la contaminación por heces de aves, roedores e insectos durante el almacenamiento (47).

Se observó que VTEC O157:H7 es más ácido-resistente que otras cepas de E. coli, lo cual le da mayor capacidad de sobrevivir en alimentos ácidos, como los silajes (5). Se ha demostrado una larga persistencia de VTEC O157:H7 en suelo de potreros, y su persistencia se asoció con condiciones del medio ambiente y cantidad de VTEC inoculados (25). Fremaux et al. (25) determinaron que el serotipo O26:H11 puede sobrevivir por más de un año en el suelo, por lo que representa un factor importante en la contaminación inicial y recontaminación del bovino.

Entre los factores que son importantes para la persistencia de VTEC en el suelo y que pueden afectar la supervivencia de esta bacteria en el ecosistema se pueden citar factores abióticos (pH y estructura del suelo) y parámetros bióticos (predación, competencia y antagonismo) (44).


También son importantes otros factores, como el nivel de lluvias, la radiación solar y las variaciones de temperatura (95, 96). Se ha observado que VTEC puede sobrevivir en superficies inorgánicas durante períodos prolongados. La importancia de la persistencia de estos microorganismos en el medio ambiente es que, como ya fue mencionado, cada vez con más frecuencia el contacto con el medio ambiente contaminado con VTEC ha sido implicado en casos de enfermedad humana (8).

El bajo porcentaje de aislamiento de VTEC en el medio ambiente podría deberse a una baja concentración de la bacteria en este, o a que E. coli tiene la capacidad de entrar en estado de células viables pero no cultivables (VNC) cuando se encuentra en un ambiente estresante (70). Las bacterias VNC son células metabólicamente activas, pero incapaces de multiplicarse y formar colonias en los medios regularmente utilizados en los laboratorios, a menos que sean incubadas en presencia de metabolitos antioxidantes, ácido pirúvico y la enzima catalasa, con una alta disponibilidad de nutrientes. En este caso, el uso de métodos tradicionales de diagnóstico de VTEC basados en el cultivo de las muestras podría dar resultados falsos negativos, lo que representa un potencial riesgo para la salud si se emplean para la detección de contaminación. Por lo tanto, es indispensable la búsqueda del patógeno con técnicas que no requieran el cultivo del microorganismo, como PCR directa. Los métodos basados en PCR pueden detectar de manera específica y sensiblemente E. coli O157 y otras VTEC, aun en bajas concentraciones, si bien no distinguen células vivas de muertas (70).

Y finalmente, los lácteos En estudios realizados en leche de tanque en otros

países, se detectó solo el serotipo O157:H7 (35, 54). Otros autores no detectaron E. coli O157:H7 a partir de muestras de leche y productos lácteos (16).

En varios estudios se ha documentado una baja detección de VTEC a partir de leche almacenada en tanques, lo que resulta poco esperable teniendo en cuenta la alta prevalencia de este patógeno en los establecimientos de ordeño. Esto podría deberse al gran factor de dilución que representa la mezcla en el tanque de almacenamiento de la leche proveniente de todas las vacas del tambo, obtenida durante uno o más ordeños (34, 59). Además, algunos componentes de la leche (en especial, el sistema lactoperoxidasa) tienen un efecto inhibitorio sobre las bacterias contaminantes, y si bien el citado sistema actúa preferentemente sobre bacterias gram positivas, tiene poder bactericida sobre las gram negativas, incluyendo a E. coli (52). Estudios con leche contaminada

artificialmente demostraron que el agregado de los componentes del sistema lactoperoxidasa produce la inactivación de VTEC O157. Este sistema es más efectivo cuando el inóculo inicial y la temperatura son bajos, condiciones existentes en un tanque de almacenamiento, en donde la leche es mantenida a temperaturas cercanas a los 3 °C y en donde cabe esperar, además, una baja concentración de E. coli O157:H7 debido al efecto de dilución (78).

Varios trabajos han demostrado la capacidad de E. coli O157:H7 para sobrevivir en productos lácteos fermentados y quesos, por lo que VTEC también ha sido detectada en productos lácteos sin pasteurizar, como por ejemplo, yogurt, quesos, manteca y crema (37). La presencia de E. coli O157:H7 en leche destinada a la fabricación de estos productos, aun cuando se encuentre en bajas concentraciones, puede constituir una amenaza a la salud del consumidor (78). En Argentina, Balagué et al. (3) y Gómez et al. (30) aislaron VTEC de queso de pasta blanda, principalmente de serotipos no-O157.

PARA TENER EN CUENTA

Como ya se ha manifestado, VTEC puede causar enfermedad en el hombre. Si bien la mayoría de los casos han sido causados por el consumo de carne mal cocida, no se debe subestimar la importancia que tiene el consumo de lácteos contaminados en la transmisión de VTEC y el contacto con bovinos de tambo portadores de VTEC. Esto constituye un riesgo, principalmente para trabajadores rurales y personas que visitan los tambos en diversos países del mundo.

Se ha verificado que todas las categorías de bovinos de tambo de Argentina y de otros países pueden ser portadoras de VTEC O157:H7 y no-O157, y que el medio ambiente y las instalaciones del tambo constituyen un hábitat no animal de este grupo bacteriano.

Como fue descrito anteriormente, la detección de serotipos EHEC en épocas cálidas y la determinación de la estacionalidad en la presencia de cepas portadoras de vt2, concuerdan con datos epidemiológicos que describen un aumento de casos en niños en los meses de verano, y alertan sobre la patogenicidad de estas cepas.

Considerando la amplia distribución de VTEC en bovinos de tambo, las altas tasas de prevalencia descritas y el aislamiento de serotipos EHEC en bovinos lecheros de Argentina, es importante establecer la aplicación de medidas de control y de manejo tendientes a evitar la transmisión de cepas entre animales y la contaminación del ambiente. Entre estas medidas se debería considerar la higiene de los lugares en donde se encuentran las diferentes


categorías de bovinos, evitar el contacto de animales de diferente edad, considerar el adecuando tratamiento de los efluentes del tambo y realizar una adecuada rutina de ordeño para disminuir la probabilidad de contaminación de la leche.

Agradecimientos: los autores agradecen al Dr. Alberto Parma por la revisión del manuscrito y por su guía incondicional en el estudio de reservorios de VTEC. Los estudios que involucran a los autores fueron financiados por FONCyT (PICT 2005 Proy 38058; PICT 2010 Bicentenario Proy 1655), CIC y SECAT-UNICEN.

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Recibido: 3/4/2012 - Aceptado: 19/6/2012

Natural host infection by Antarctic marine podovirus Infección de un hospedador natural por un podovirus antártico marino

IMÁGENES MICROBIOLÓGICAS

Viruses are the most numerous and diverse biological entities in the oceans, with numbers (~107-108/ml) often exceeding those exhibited by their bacterial hosts (~106/ml) by several orders of magnitude (1). Bacteriophages are found wherever microbial life is present and play a significant role in aquatic ecosystems. They affect microbial abundance, production, respiration, diversity, genetic transfer, nutrient cycling and particle size distribution. Viral infection is a stochastic process and depends on the abundance of viruses and hosts (1). Theoretical considerations regarding this mechanism suggest that viruses might selectively kill the most abundant members of the prokaryotic community and, in so doing, they influence species richness (3). A number of studies support this hypothesis (4). More recently, virus-mediated genetic exchange through generalized transduction as an additional mechanism potentially involved in shaping prokaryotic community structure has received attention as well (2).

In this work, we studied, using a transmission

electron microscope, the phage community structure from Potter Cove, a small fjord located in the southwest of 25 de Mayo (King George) Island, South Shetland Islands, Antarctica. Surface water samples (35 liters) were aseptically collected on surface during an Antarctic summer campaign in 2008 and serially filtered onto 1.5 μm, 0.2-μm-pore-size filters (140 mm diameter; MSI, USA fiber glass and cellulose acetate, respectively), and Zeta Plus (an electropositive membrane). Adsorbed viruses were eluted from filters by using 1M NaCl and ultrasound. Particles were then negatively stained for microscopic study.

Figure 1 shows the bacterial infection by a podovirus particle. At sample collection time, the infection appears to be a frequent event because the probability of obtaining this picture could be very small if the viral prevalence was low. We can propose that, at least in summer, Potter Cove marine water could be inhabited by a large podoviral population. Furthermore, the ecological role of this highly prevalent viral population has to be studied in the future.

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José L. López1*, Walter P. Mac Cormack2, 3

1 Cátedra de Virología y 2 Cátedra de Biotecnología, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Junín 956 (1113) Ciudad Autónoma de Buenos Aires; 3 Instituto Antártico Argentino, Cerrito 1248 (1010) Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. E-mail: [email protected]

Figure 1. Antarctic marine podovirus natural

host infection. Podovirus head (1), podovirus

short inserted tail (2) and bacterial wall (3).

Head and tail in a long-tailed phage (4 and 5).

ISSN 0325-7541Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 324

Número 1

EDITORIALSalvador Mazza: un rebelde con causaC. I. Menghi

MICROBIOLOGÍA CLÍNICA Y ENFERMEDADES INFECCIOSAS*Enfermedad causada por micobacterias no tuberculosas: diagnóstico y evaluación del tratamiento en el norte del Gran Buenos AiresB. Imperiale, M. Zumárraga, A. Gioffré, B. Di Giulio, A. Cataldi, N. Morcillo

Bacteriemias de origen comunitario en pacientes adultos que acuden al servicio de urgencias de un hospital universitarioM. J. Artico, M. Rocchi, A. Gasparotto, V. Ocaña Carrizo, M. Navarro, V. Mollo, N. Avilés, V. Romero, S. Carrillo, A. Monterisi

*Los efectos oxidantes de la D-glucosamina in vitro reducen la adhesión y formación de biofilms de Staphylococcus epidermidisV. Aiassa, A. I. Barnes, I. Albesa

Onicomicosis: epidemiología, agentes causales y evaluación de los métodos diagnósticos de laboratorioJ. R. Nazar, P. E. Gerosa, O. A. Díaz

*Evaluación del desempeño de un equipo comercial para el diagnóstico de influeza A (H1N1) en comparación con el protocolo de RT-PCR en tiempo real diseñado por los Centros de Control y Prevención de Enfermedades (CDC)M. G. Barbás, S. V. Gallego, G. M. Castro, E. Baumeister, S. Kademian, J. de León, A. Cudolá

AGENTES ANTIMICROBIANOSResistencia a cefalosporinas de espectro extendido en enterobacterias sin AmpC inducible. Evaluación de los nuevos puntos de corteM. Nastro, L. Montoto Piazza, E. Saposnik, S. García, C. Barberis, C. Vay, C. H. Rodríguez, A. Famiglietti

MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS*Especies de Penicillium presentes en salamines uruguayosU. Galvalisi, S. Lupo, J. Piccini, L. Bettucci

MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL Y AMBIENTAL*Predación selectiva de bacterias entéricas por protistas en un ambiente acuáticoM. S. Domínguez, A. H. Escalante, A. M. Falabella, A. S. Zamora

ARTÍCULO ESPECIAL*Bioprospección de microorganismos marinos: aplicaciones biotecnológicas y métodosH. M. Dionisi, M. Lozada, N. L. Olivera

IMÁGENES MICROBIOLÓGICASLesiones vesículo-ampollosas en un paciente oncológico inmunodeprimidoT. García Lozano, E. Aznar Oroval, J. Cruz Mojarrieta, F. Messeguer Badía

Instrucciones para los autoresGuía para la preparación de los manuscritos

* En inglés

1

3

10

16

21

26

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36

43

49

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Volumen 44 – Año 2012INDICE GENERAL DEL VOLUMEN 44

325


Número 2

EDITORIALLa nano, el mano y la microbiología clínicaHéctor R. Morbidoni, Ana M. Jar

MICROBIOLOGÍA BÁSICADetección del gen ompA de Chlamydophila pecorum en aves en cautiverio, en ArgentinaMaría C. Frutos, FernandO Venezuela, Ximena Kiguen, Viviana Ré, Cecilia Cuffini

Dos aislamientos de Salmonella Infantis multirresistentes se comportan como hipoinvasivos pero con elevada proliferación intracelularJosé A. Di Conza, Marta E. Mollerach, Gabriel O. Gutkind, Juan A. Ayala

MICROBIOLOGÍA CLÍNICA Y ENFERMEDADES INFECCIOSASObtención y evaluación preliminar de un virus canarypox recombinante como candidato a vacuna antirrábicaFlavia Zanetti, Liliana Rudak, Matías Micucci, Daniela Conte Grand, Andrea Luque, Susana Russo, Oscar Taboga, Oscar Pérez, Gabriela Calamante

Caracterización genotípica de aislamientos de Escherichia coli obtenidos de cerdos con diarrea posdestete y enfermedad de los edemasFabiana A. Moredo, Javier Cappuccio, Lucas Insarralde, Carlos J. Perfumo, María A. Quiroga, Gerardo A. Leotta

CHROMagar KPC. Comparación con el método propuesto por los Centers for Disease Control and Prevention (CDC) para el estudio de portación rectal y evaluación de falsos positivosLaura Errecalde, Sandra Cogut, Mariana Erbin, Liliana Jordá Vargas, Eugenia Cattani, Tamara Posse, Silvia Tutzer, Ricardo Hermes, Sara Kaufman

*Dos casos de infección del tracto urinario causados por cepas de Escherichia coli O157:H7 productoras de toxina ShigaMaría del P. Gadea, Natalia Deza, María I. Mota, Carolina Carbonari, Mitila Robatto, Beatriz D ASTEC, Victoria Balseiro, Cristina Bazet, Eduardo Rügnitz, Valérie Livrelli, Felipe Schelotto, Marta Rivas, Gustavo Varela

Aporte de la técnica de PCR en el diagnóstico de Mansonella ozzardi en zonas endémicas de la ArgentinaMaría F. Degese, Marta G. Cabrera, Silvio J. Krivokapich, Lucía Irazu, Marcelo A. Rodríguez, Eduardo A. Guarnera MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS Portación y caracterización de Staphylococcus aureus en manipuladores de alimentosGraciela B. Jordá, Raúl S. Marucci, Adriana M. Guida, Patricia S. Pires, Eduardo A. Manfredi

MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL Y AMBIENTAL*Uso del escobajo como sustrato para el crecimiento de hongos de la pudrición blanca, la producción de enzimas ligninolíticas y la decoloración de tinturasLaura Levin, Luis Diorio, Emmanuel Grassi, Flavio Forchiassin

Biodegradación de fenol en cultivos estáticos por Penicillium chrysogenum ERK 1: habilidades catalíticas y fitotoxicidad residualErika A. Wolski,Viviana Barrera, Claudia Castellari, Jorge F. González

ARTÍCULO ESPECIALBioprospección de microorganismos marinos. Potencialidades y desafíos para ArgentinaHebe M. Dionisi, Mariana Lozada, Nelda L. Olivera

IMÁGENES MICROBIOLÓGICASEndosimbiosis de Arcobacter butzleri en Acanthamoeba castellanii Heriberto Fernández, María Paz Villanueva, Gustavo Medina

Querión de CelsoMónica Saiz, Lorena P. Uribe, Andrés Gallardo Martínez


* En inglés

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65

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327Índice General del Volumen

Número 3

EDITORIALCiencia, cultura de la cita y el dineroMauricio Carobene

MICROBIOLOGÍA BÁSICA* Agregaciones celulares in vivo de Leptospira interrogans producidas por un aislamiento porcino capaz de formar biofilm.Bibiana Brihuega, Luis Samartino, Carmelo Auteri, Agustín Venzano, Karina CaimiComparación de la eficiencia de extracción de ácidos nucleicos utilizando distintos kits comerciales y empleando la qPCR. Efecto de las sustancias inhibidorasHugo R. Poma, Carolina Davies, Dolores Gutiérrez Cacciabue, María C. Mora, Miguel Á. Basombrío, Verónica B. Rajal* Sideróforos de Stenotrophomonas maltophilia: detección y determinación de su naturaleza químicaCarlos A. Garcia, Beatriz Passerini De Rossi, Eliana Alcaraz, Carlos Vay, Mirta Franco

MICROBIOLOGÍA CLÍNICA Y ENFERMEDADES INFECCIOSASObtención y evaluación de un derivado proteico purificado de una cepa argentina de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosisAndrea Gioffré, Gabriela Echeverría-Valencia, Martín Zumárraga, Claudia Morsella, María L. Mon, Mariana Viale, Fernando Paolicchi, María I. RomanoEvaluación del antibiograma directo desde el frasco de hemocultivo con el sistema Vitek 2C: su utilidad en la clínicaRolando N. Soloaga, Natalia A. Carrion, Alejandra M. Margari, Marta Giovanakis, Alicia Sujemecki, Ernesto Efron, Juan C. Pidone, Liliana I. Guelfand, Mariela Mendez AranibarBacteriemia fulminante asociada a Capnocytophaga sputigena en un paciente con linfoma no Hodgkin tipo T. Diagnóstico por secuenciación genética del ARNr 16STomás García Lozano, Pablo Lorente Alegre, Mª Dolores Linares Latorre, Eduardo Aznar Oroval* Uso del cultivo para un mejor rendimiento diagnóstico en un hospital de referencia para tuberculosisValéria Martins Soares, Wania Da Silva Carvalho, Silvana Spindola De MirandaEvaluación inmunoenzimática del antígeno recombinante SAPA en perros infectados naturalmente por Trypanosoma cruziRubén O. Cimino, Patricio Diosque, Inés R. López Quiroga, José F. Gil, Julio R. Nasser

AGENTES ANTIMICROBIANOS* β-lactamasas de tipo AmpC de codificación plasmídica (pAmpC) en Enterobacteriaceae:epidemiología de los microorganismos y de los marcadores de resistenciaDaniela Cejas, Liliana Fernández Canigia, Mirta Quinteros, Marta Giovanakis, Carlos Vay, Silvana Lascialandare, Daniel Mutti, Gastón Pagniez, Marisa Almuzara, Gabriel Gutkind, Marcela Radice

MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS* Asociación entre prácticas de ordeño y recuento de organismos psicrótrofos en leche de tanque de fríoAna I. Molineri, Marcelo L. Signorini, Alejandra L. Cuatrín, Vilma R. Canavesio, Verónica E. Neder, Norma B. Russi, Julio C. Bonazza, Luis F. Calvinho* Caracterización de aislamientos de Listeria monocytogenes obtenidos de ganado y de carne molida de vacuno por electroforesis de campo pulsadoClaudia Foerster, Lorena Vidal, Miriam Troncoso, Guillermo Figueroa

ARTÍCULO ESPECIAL* Paratuberculosis bovina: una revisión sobre las ventajas y desventajas de las diferentes pruebas diagnósticasLiliana R. Gilardoni, Fernando A. Paolicchi, Silvia L. MundoAvances en el desarrollo de vacunas contra la neosporosis bovinaYanina P. Hecker, María C. Venturini, Carlos M. Campero, Anselmo C. Odeón, Dadín P. Moore

IMÁGENES MICROBIOLÓGICASTrichosporon asahiiSusana Carnovale, Liliana Guelfand

* FE DE ERRATAS: Biodegradación de fenol en cultivos estáticos por Penicillium chrysogenum ERK 1: habilidades catalíticas y fitotoxicidad residualErika A. Wolski,Viviana Barrera, Claudia Castellari, Jorge F. González


* En Inglés

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Número 4

EDITORIALAcceso abierto: ¿un modelo realmente abierto para investigadores de países en desarrollo?Beatriz Passerini de Rossi

MICROBIOLOGÍA BÁSICA*Frecuencia de genes de virulencia de Escherichia coli en lechones neonatos de un criadero intensivo de ArgentinaFabrisio E. Alustiza, Natalia Y. Picco, Romina V. Bellingeri, Horacio R. Terzolo, Adriana B. Vivas*Identificación molecular del endosimbionte secundario Hamiltonella defensa en el pulgón amarillo de los cereales, Metopolophium dirhodumMarta C. Telesnicki, Claudio M. Ghersa, María A. Martínez-Ghersa, Joel D. Arneodo

MICROBIOLOGÍA CLÍNICA Y ENFERMEDADES INFECCIOSAS*Detección de rinovirus por RT-PCR en tiempo real en muestras respiratorias de niños de Buenos Aires, ArgentinaDébora N. Marcone, Cristina Videla, Carmen Ricarte, Guadalupe Carballal, Santiago Vidaurreta, Marcela EchavarríaCampylobacter spp.: prevalencia y caracterización feno-genotípica de aislamientos de pacientes con diarrea y de sus mascotas en la provincia de La Pampa, ArgentinaAna L. Tamborini, Luis M. Casabona, María R. Viñas, Valeria Asato, Alicia Hoffer, María I. Farace, María C. Lucero, Alejandra Corso, Mariana Pichel*Aislamiento de Serratia rubidaea de una infección mixta posterior a la mordedura de un caballoMirta L. Litterio, Solange Arazi, Claudia Hernández, Horacio LopardoAcanthamoeba sp.: un caso de queratitis no relacionada con el uso de lentes de contactoClaudia Menghi, María C. Caride, Claudia GattaHidatidosis retroperitoneal secundaria a quiste hidatídico de localización hepáticaKatherina A. Vizcaychipi, Sonia Sosa, Federico Camicia, Graciela Santillán, María Casalins, María del Carmen Nigro

AGENTES ANTIMICROBIANOS*Primera evaluación en Argentina de GenoType®MTBDRplus para la detección de Mycobacterium tuberculosis multidrogo-resistente desde aislamientos y especímenes clínicosBelén R. Imperiale, Martín J. Zumárraga, Gabriela Weltman, Roxana Zudiker, Ángel A. Cataldi, Nora S. MorcilloEvaluación de diversos métodos fenotípicos para la detección de carbapenemasas KPC en Klebsiella pneumoniaeFederico G. Nicola, Jimena Nievas, Jorgelina Smayevsky*Caso de transmisión familiar de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina adquirido en la comunidad portador del gen Inu(A) en la ciudad de Santa Fe, ArgentinaEmilce de los A. Méndez, María L. Roldán, María R. Baroni, María A. Mendosa, Sabrina A. Cristóbal, Stella M. Virgolini, Diego FacconeIncidencia y distribución estacional de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina en pacientes adultos ambulatorios en una clínica de la provincia de Buenos Aires: período 2006-2011María T. Verón, María G. Ojeda, Fabián Avino, Anabella Spelzzini, Ana L. Barboza, Yesica Petrozzino

ARTÍCULO ESPECIALEscherichia coli verocitotoxigénico: varias cuestiones y los tambos tambiénDaniel Fernández, Nora L. Padola

IMÁGENES MICROBIOLÓGICAS*Infección de un hospedador natural por un podovirus antártico marinoJosé L. López, Walter P. Mac Cormack

Índice general del volumen 44Índice de temasÍndice de autoresAgradecimiento a los revisoresInstrucciones para los autoresGuía para la preparación de los manuscritosInstructions to authorsManuscript preparation checklist

* En inglés

247

250

255

259

266

272

275

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325329333336337341342346

329

Volumen 44 - 2012

INDICE DE TEMAS

Acanthamoeba castellanii 133 - endosimbiosis 133Acanthamoeba sp. 275 - agua contaminada 275 - queratitis bilateral 275Ácidos nucleicos 144 - eficiencia 144 - extracción 144 - inhibición 144 - PCR en tiempo real 144Agar CAS 150Agregaciones celulares 138AmpC plasmídicas 182Antimicrobianos - Arcobacter butzleri 133 - Bacilos gram negativos 165 - Bacterias psicrótrofas 187 - Campylobacter spp. 266 - Capnocytophaga sputigena 170 - Cefalosporinas 30, 182 - Enterobacterias 30, 182 - Enterococcus faecalis 43 - Escherichia coli 43, 250- Escherichia coli O157:H7 - Escherichia coli enterotoxigénica (ETEC) 84 - Escherichia coli productora de toxina Shiga (STEC) 84, 94, 312- Especies de Penicillium 36- Klebsiella pneumoniae 290- Leptospira interrogans 138- Listeria monocytogenes 195- Micobacterias 3, 155, 173- Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis 155, 201- Mycobacterium tuberculosis 173, 283- Penicillium chrysogenum 113 - Salmonella Infantis 69 - Serratia rubidaea 272 - Staphylococcus aureus 101 - Staphylococcus aureus resistente a la meticilina 303 - Staphylococcus epidermidis 16 - Stenotrophomonas maltophilia 150Aphididae 255 - gamma proteobacteria 255 - PCR 255 - secuenciación 255 - simbionte facultativo 255Arnow 150Bacteriemias 10, 165, 170 - adultos 10 - de origen comunitario 10 - servicio de urgencias 10Biofilm 16, 138Bovinos 312Carbapenemasas KPC 290 Carne molida de vacuno 195Cerdos 85

Chlamydophila pecorum 65 - análisis de secuencias 65 - aves en cautiverio 65 - gen ompA 65CHROMagar KPC 89 - vigilancia KPC 89CMY- 2 182Cobayos 138Criadero intensivo 250 Csáky 150 Cultivo ungueal 21Cultura de la cita 135Dermatofitos 21Detección fenotípica 290D- glucosamina 16Diarrea posdestete 85Echinococcus granulosus 278 - absceso 278 - quiste retroperitoneal 278 Electroforesis de campo pulsado 195Enfermedad de los edemas 85Escobajo 105 - decoloración 105 - enzimas lignocelulósicas 105 - fermentación en estado sólido 105 - hongos de la pudrición blanca 105 Especies reactivas del oxígeno 16Fenol 113Fitotoxicidad 113Genes de virulencia 250Glucosa 16Hodge cuantificado 290Hongos del suelo 113Hongos miceliales no dermatofitos 21Infección del tracto urinario 94Influenza 26 - pandemia 26 - PCR 26Intoxicaciones alimentarias 101Leche de tanque 187Lechones 250 Lesiones vesículo- ampollosas 61 - paciente oncológico inmunodeprimido 61Levaduras 21Linfoma no Hodgkin 170LPV 303 Manipuladores de alimentos 101Mansonella ozzardi 97 - diagnóstico 97 - PCR 97Mascotas 266Mazza, Salvador 1Microbiología clínica 63Microorganismos marinos 49, 122 - aplicaciones biotecnológicas 49 - bioprospección 49, 122


Mordedura de caballo 272Nanotecnología 63Neospora caninum 216 - aborto 216 - bovinos 216 - vacuna 216Onicomicosis 21Pediatría 272Podovirus antártico marino 324Predifusión 290Protozoos 43Querión de Celso 134Rinovirus 259 - infección respiratoria aguda 259 - niños 259 - RT-PCR en tiempo real 259 Salamines 36SARM-AC 303SCCmec IV 303

Sideróforos 150Subtipos genéticos 266Tambos 312Trichosporon asahii 231Trypanosoma cruzi 177 - antigeno SAPA 177 - ELISA 177 - perros 177Tuberculosis 173 - baciloscopía 173 - cultivo de micobacterias 3, 155, 173 - dianóstico 173 - Geno Type® 283 - MTBDRplus 283 - multidrogo-resistente 283Virus canarypox recombinante 75 - glicoproteína G 75 - vacuna antirrábica 75Vitek 2C 165

Volume 44 - 2012

SUBJECT INDEX

Acanthamoeba castellanii 133 - endosymbiosis 133Acanthamoeba sp. 275 - bilateral keratitis 275 - contaminated water 275Antarctic marine podovirus 324Antimicrobials - Arcobacter butzleri 133 - Campylobacter spp. 266 - Capnocytophaga sputigena 170 - Cephalosporins 30, 182 - Enterobacteria 30, 182 - Enterococcus faecalis 43 - Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) 84 - Escherichia coli 43, 250 - Escherichia coli O157:H7 84, 94, 312 - Gram-negative rods 165 - Klebsiella pneumoniae 290 - Leptospira interrogans 138 - Listeria monocytogenes 195 - Methicillin - resistant Staphylococcus aureus 303 - Mycobacteria 3, 155, 173 - Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis 155, 201 - Mycobacterium tuberculosis 173, 283 - Penicillium chrysogenum 113 - Penicillium species 36 - Psychrotrophic bacteria 187 - Salmonella Infantis 69 - Serratia rubidaea 272 - Shiga toxin- producing Escherichia coli (STEC) 85, 94 - Staphylococcus aureus 101 - Staphylococcus epidermidis 16 - Stenotrophomonas maltophilia 150Aphididae 255 - facultative symbiont 255 - gamma- proteobacteria 255 - PCR 255 - sequencing 255Arnow 150Bacteremia 10, 165, 170 - adults 10 - community-acquired 10 - emergency service 10Biofilm 16,138Bulk tank milk 187CA-MRSA 303CAS agar 150Cattle 312 Cattle ground beef 195Cell aggregations 138Chlamydophila pecorum 65 - birds in captivity 65 - ompA gene 65 - sequence analysis 65CHROMagar KPC 89 - screening KPC 89

Citation culture 135Clinical microbiology 63CMY- 2 β - lactamase 182Csáky 150Dairy farms 312Dermatophytes 21D-glucosamine 16Echinococcus granulosus 278 - abscess 278 - retroperitoneal cyst 278Edema disease 85Food handlers 101Food poisoning 101Genetic subtypes 266Glucose 16Grape stalks 105 - dye degradation 105 - lignocellulolytic enzymes 105 - solid state fermentation 105 - white rot fungi 105Guinea pigs 138 Horse bite 272Influenza 26 - pandemic 26 - PCR 26Intensive farm 250KPC carbapenemase detection 290 Kerion celsi 134Mansonella ozzardi 97 - diagnosis 97 - PCR 97Marine microorganisms 49, 122 - bioprospection 49, 122 - biotechnological applications 49Mazza, Salvador 1Modified Hodge test 290Nanotech 63Nail culture 21Neospora caninum 216 - abortion 216 - bovines 216 - vaccine 216 Non - dermatophyte mycelial fungi 21Non - Hodgkin lymphoma 170 Nucleic acids 144 - efficiency 144 - extraction 144 - inhibition 144 - real-time PCR 144 Onychomycoses 21Pediatrics 272Pets 266Phenol 113Phenotypic methods 290 Phytotoxicity 113Piglets 250

331


Pigs 85Plasmid - encoded AmpC 182Postweaning diarrhea 85Pre-diffusion technique 290Protozoans 43Pulsed-field gel electrophoresis 195PVL 303 Recombinant canarypox virus 75 - glycoprotein G 75 - rabies vaccine 75Reactive oxygen species 16Rhinoviruses 259 -acute respiratory infection 259 - children 259 - real-time RT-PCR 259 Salami 36Siderophores 150Soil fungus 113SSCmec IV 303

Trichosporon asahii 231Trypanosoma cruzi 177 - dogs 177 - ELISA 177 - SAPA antigen 177Tuberculosis 173 - bacilloscopy 173 - diagnostic 173 - Geno Type® 283 - MTBDRplus 283 - multidrug - resistant 283 - mycobacterial culture 3, 155, 173Urinary tract infection 94Vesiculobullous lesions 61 - immunocompromised cancer patient 61Virulence genes 250Vitek 2C 165Yeast - like fungi 21

Volumen 44 - 2012

INDICE DE AUTORESAUTHORS INDEX

Aiassa V 16

Albesa I 16

Alcaraz E 150

Almuzara M 182

Alustiza FE 250

Arazi S 272

Arneodo JD 255

Artico MJ 10

Asato V 266

Auteri C 138

Avilés N 10

Avino F 306

Ayala JA 69

Aznar Oroval E 61, 170

Balseiro V 94

Barbás MG 26

Barberis C 30

Barboza AL 306

Barnes AI 16

Baroni MR 303

Barrera V 113

Basombrío MA 144

Baumeister E 26

Bazet C 94

Bellingeri RV 250

Bettucci L 36

Bonazza JC 187

Brihuega B 138

Cabrera MG 97

Caimi K 138

Calamante G 75

Camicia F 278

Calvinho LF 187

Campero CM 216

Canavesio VR 187

Cappuccio J 85

Carballal G 259

Carbonari C 94

Caride MC 275

Carnovale S 231

Carobene M 135

Carrillo S 10

Carrion NA 165

Casabona LM 266

Casalins M 278

Castellari C 113

Castro GM 26

Cataldi AA 3, 283

Cattani E 89

Cejas D 182

Cimino RO 177

Cogut S 89

Conte Grand D 75

Corso A 266

Cristóbal SA 303

Cruz Mojarrieta J 61

Cuatrín AL 187

Cudolá A 26

Cuffini C 65

DÁSTEC B 94

Da Silva Carvalho W 173

Davies C 144

Degese MF 97

Deza N 94

Di Conza JA 69

Di Giulio B 3

Díaz OA 21

Dionisi HM 49, 122

Diorio L 105

Diosque P 177

Domínguez MS 43

Echavarría M 259

Echeverría-Valencia G 155

Efron E 165

Erbin M 89

Errecalde L 89

Escalante AH 43

Faccone D 303

Falabella AM 43

Famiglietti A 30

Farace MI 266

Fernández Canigia L 182

Fernández D 312

Fernández H 133

Figueroa G 195

Foerster C 195

Forchiassin F 105

Franco M 150

Frutos MC 65

Gadea M del P 94

Gallardo Martínez A 134

Gallego SV 26

Galvalisi U 36

García CA 150

García Lozano T 61, 170

García S 30

Gasparotto A 10

Gatta C 275

333


Gerosa PE 21

Ghersa CM 255

Gil JF 177

Gilardoni LR 201

Gioffré A 3, 155

Giovanakis M 165, 182

González JF 113

Grassi E 105

Guarnera EA 97

Guelfand LI 165, 231

Guida AM 101

Gutiérrez Cacciabue D 144

Gutkind GO 69, 182

Hecker YP 216

Hermes R 89

Hernández C 272

Hoffer A 266

Imperiale B 3, 283

Insarralde L 85

Irazu L 97

Jar AM 63

Jordá GB 101

Jordá Vargas L 89

Kademian S 26

Kaufman S 89

Kiguen X 65

Krivokapich SJ 97

Lasciandare S 182

León J de 26

Leotta GA 85

Levin L 105

Linares Latorre MD 170

Litterio ML 272

Livrelli V 94

Lopardo H 272

López JL 324

López Quiroga IR 177

Lorente Alegre P 170

Lozada M 49, 122

Lucero MC 266

Lupo S 36

Luque A 75

Mac Cormack WP 324

Manfredi EA 101

Marcone DN 259

Margari AM 165

Martínez-Ghersa MA 255

Martins Soares V 173

Marucci RS 101

Medina G 133

Méndez Aranibar M 165

Méndez E de los A 303

Mendosa MA 303

Menghi CI 1, 275

Messeguer Badía F 61

Micucci M 75

Molineri AI 187

Mollerach ME 69

Mollo V 10

Mon ML 155

Monterisi A 10

Montoto Piazza L 30

Moore DP 216

Mora MC 144

Morbidoni HR 63

Morcillo N 3

Moredo FA 85

Morsella C 155

Mota MI 94

Mundo SL 201

Mutti D 182

Nasser JR 177

Nastro M 30

Navarro M 10

Nazar JR 21

Neder VE 187

Nicola FG 290

Nievas J 290

Nigro M del C 278

Ocaña Carrizo V 10

Odeón AC 216

Ojeda MG 306

Olivera NL 49, 122

Padola NL 312

Pagniez G 182

Paolicchi F 155, 201

Passerini de Rossi B 150, 247

Pérez O 75

Perfumo CJ 85

Petrozzino Y 306

Piccini J 36

Picco NY 250

Pichel M 266

Pidone JC 165

Pires PS 101

Poma HR 144

Posse T 89

Quinteros M 182

Quiroga MA 85

Radice M 182

Rajal VB 144

Ré V 65

Ricarte C 259

Rivas M 94

Robatto M 94

Rocchi M 10

Rodríguez CH 30

Rodríguez MA 97

Roldán ML 303

Romano MI 155

Romero V 10

Rudak L 75

335índice de Autores

Rügnitz E 94

Russi NB 187

Russo S 75

Saiz M 134

Samartino L 138

Santillán G 278

Saposnik E 30

Schelotto F 94

Signorini ML 187

Smayevsky J 290

Soloaga RN 165

Sonia Sosa FC 278

Spelzzini A 306

Spindola de Miranda S 173

Sujemecki A 165

Taboga O 75

Tamborini AL 266

Telesnicki MC 255

Terzolo HR 250

Troncoso M 195

Tutzer S 89

Uribe LP 134

Varela G 94

Vay C 30, 150, 182

Venezuela F 65

Venturini MM 216

Venzano A 138

Verón MT 306

Viale M 155

Vidal L 195

Vidaurreta S 259

Videla C 259

Villanueva MP 133

Viñas MR 266

Virgolini SM 303

Vivas AB 250

Vizcaychipi KA 278

Weltman G 283

Wolski EA 113

Zamora AS 43

Zanetti F 75

Zudiker R 283

Zumárraga M 3, 155, 283

VOLUMEN 44 - 2012

AGRADECIMIENTO A LOS REVISORES

El Comité Editor de la Revista Argentina de Microbiología agradece a los señores revisores eltiempo, esfuerzo y experiencia dedicados a mejorar la calidad de la revista

Alcaide FAlmirón MAmbroggi MAmoroso A Andresiuk MVAranaz AAraujo FArias LBaumeister EBinsztein NBottasso OBratanich ABrihuega BCalderon ECallejo RCataldi ACerrone GChiocchio VCostamagna RDionisi HEchaide IFamiglietti AFarinati AFernández Canigia LFernández Scavino AAFerreras JFreire MCGentile AGherardi MGiacoboni GGómez NGómez RGonzález Cappa SMGottschalk MGruppi AHozbor MCImperiale BJensen OJure MALaciar ALeotta GLiron JPLopardo HLópez BMartino V

Massa RMatteo MMercado EMira GMollerach MMorcillo N Moredo FMoretton JNicola FOdeon APadola NLPando MPerazzi BPérez GPichel MPower PRadice MRepetto SRivera MRodriguez RRodriguez Giordano SRosenzvit MRosmini MSalvat ASamartino L Santoianni JSauka DScolaro LSignorini M Smayevsky JSobrino FSola CSpinelli STaboga OTakiff HTeixeira KTevez STurco MTurk GVaccari MCVanasco BVay CVázquez SVega AZorreguieta MA

D-glucosamina reduce la formación de biofilm de Staphylococcus epidermidis135

La Revista Argentina de Microbiología (RAM) es una publicación trimestral editada por la Asociación Argentina de Microbiologíay destinada a la difusión de trabajos científicos en las distintas áreas de la Microbiología. La Asociación Argentina de Microbiologíase reserva los derechos de propiedad y reproducción del material aceptado y publicado.

REQUISITOS GENERALES Los manuscritos enviados a esta revista deben constituir informes de investigación original. El envío de un manuscrito implicaque los autores tienen las autorizaciones institucionales para proceder a la publicación de los datos y que el mismo manuscrito (uotro de contenido similar) no ha sido previamente publicado (salvo presentaciones parciales en reuniones científicas) ni se encuentraen consideración por otra revista. Los datos originales deberán ser presentados al Comité Editor en caso de ser necesario. Se debeexplicitar que los resultados que se muestran provienen de proyectos aprobados por los Comités de Bioseguridad y/o Bioética delas instituciones participantes, así como que respetan la Ley de Habeas Data en caso de incluir datos de pacientes.

PRESENTACIÓN DE LOS ORIGINALES Y DERECHOS DE AUTOR Los manuscritos deben dirigirse al Comité Editor de la Revista Argentina de Microbiología acompañados de una nota de acuerdocon el siguiente modelo:

“Sres. Comité Editor de la Revista Argentina de Microbiología: en mi carácter de autor responsable declaro que el resto de losautores han acordado que los represente frente a la RAM con respecto al envío del manuscrito …[Título]… y son responsablesjunto a mí de su contenido. Este trabajo (u otro de contenido similar) no ha sido publicado previamente ni está siendo consideradoen otra revista para su publicación. Asimismo, manifiesto mi conformidad de otorgar los derechos de copia (copyright) a la RevistaArgentina de Microbiología, una vez concretada la publicación”.

Todos los autores de un manuscrito deberán acceder explícitamente a su publicación, serán responsables de la veracidad delos contenidos y deberán explicitar su conformidad para que uno de ellos, que es quien suscribirá la nota arriba citada, actúe comoautor para la correspondencia a los fines del manejo editorial. Asimismo, los autores manifestarán su conformidad con la posiciónde cada uno en la lista de autores, en la que se indicará su filiación académica. Un cambio de autor o de orden de autores sólo seráconsiderado si se solicita mediante una nota firmada por todos los autores a tal efecto. En una carta adjunta, los autores deberánespecificar la existencia de conflictos de interés que puedan afectar la evaluación del manuscrito. Estos serán confidenciales ymantenidos en reserva por el Comité Editor.

Deben especificarse en la sección agradecimientos las fuentes de financiación para la tarea experimental descrita en el manuscrito,ya sean éstas institucionales, oficiales o privadas. También se deberán especificar en esta sección las afiliaciones comerciales o losvínculos tales como consultorías, así como la copropiedad de licencias con fines comerciales por parte de uno o más autores. El material será analizado por el Comité Editor y sometido a la consideración de dos árbitros científicos designados para cadacaso. El Comité Editor se reserva el derecho de rechazar aquellos manuscritos cuyos contenidos se superponen total o parcialmentecon trabajos ya publicados, o cuyas temáticas no se correspondan con las de la RAM. Asimismo, son motivos de rechazo la falta decumplimiento de las reglas editoriales, violaciones éticas, baja calidad científica y un uso pobre del idioma, sea éste inglés o español.El Comité Editor se reserva el derecho de efectuar las modificaciones gramaticales o de estilo que considere necesarias.

ORGANIZACIÓN Y FORMATO La RAM acepta artículos originales, informes breves, artículos especiales, imágenes microbiológicas, editoriales y también editasuplementos. Se solicita leer cuidadosamente las especificaciones de cada formato a los efectos de elegir el más apropiado y deesta manera agilizar el proceso de evaluación. Los manuscritos podrán redactarse indistintamente en español o en inglés, aunque el Comité Editor estimula a los autores aescribir los trabajos en inglés para favorecer su difusión y lectura a nivel internacional. Artículos originales. Son trabajos de investigación completos y deben redactarse respetando las siguientes secciones: Título(en español y en inglés) y Título abreviado, Resumen y Palabras clave (en español y en inglés), Introducción, Materiales y métodos,Resultados, Discusión, Agradecimientos y Bibliografía. El manuscrito no deberá exceder las 8000 palabras incluyendo a todas lassecciones, con hasta 6 tablas o figuras. Informes breves. Son trabajos de menor extensión, entre los que se incluyen casuísticas, casos clínicos y descripciones detécnicas o dispositivos nuevos, avalados por trabajos experimentales concluyentes. Se debe omitir la división del texto en seccionesy todo el manuscrito no podrá exceder las 3000 palabras, con un máximo de quince citas bibliográficas y de tres tablas o figuras. Esnecesario un análisis cuidadoso de la presentación de los datos para evitar su reiteración en el texto, en las tablas y en las figuras,a fin de mantener la característica de brevedad de este tipo de artículos. Artículos especiales. Son actualizaciones o consensos de grupos de trabajo acerca de temas de gran interés en el ámbitoregional o internacional. Sus autores deben ser especialistas en la materia y el texto debe incluir una revisión bibliográfica amplia yactualizada. Los artículos especiales admiten hasta 10 000 palabras, 8 tablas o figuras y no más de 100 citas bibliográficas. Imágenes microbiológicas. Pueden corresponder a fotos de bacterias, hongos, parásitos o virus, tomadas de exámenesen fresco o con coloraciones, y observadas bajo microscopía óptica, electrónica o de fluorescencia. También se admiten otrasimágenes fotográficas, por ejemplo, microorganismos en medios de cultivo, lesiones ilustrativas en pacientes o en animales deexperimentación, imágenes radiográficas y ecográficas, de tomografías computarizadas, de resonancia magnética nuclear, etc.Estas imágenes, de gran valor didáctico y no necesariamente excepcionales, deben estar acompañadas de un texto explicativoy de flechas indicadoras, cuando corresponda. El conjunto no debe exceder una página impresa. Los requisitos de calidad parael envío de las imágenes se describen bajo el ítem “Figuras”.

INSTRUCCIONES PARA LOS AUTORES


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La Revista Argentina de Microbiología (RAM) es una publicación trimestral editada por la Asociación Argentina de Microbiologíay destinada a la difusión de trabajos científicos en las distintas áreas de la Microbiología. La Asociación Argentina de Microbiologíase reserva los derechos de propiedad y reproducción del material aceptado y publicado.

REQUISITOS GENERALES Los manuscritos enviados a esta revista deben constituir informes de investigación original. El envío de un manuscrito implicaque los autores tienen las autorizaciones institucionales para proceder a la publicación de los datos y que el mismo manuscrito (uotro de contenido similar) no ha sido previamente publicado (salvo presentaciones parciales en reuniones científicas) ni se encuentraen consideración por otra revista. Los datos originales deberán ser presentados al Comité Editor en caso de ser necesario. Se debeexplicitar que los resultados que se muestran provienen de proyectos aprobados por los Comités de Bioseguridad y/o Bioética delas instituciones participantes, así como que respetan la Ley de Habeas Data en caso de incluir datos de pacientes.

PRESENTACIÓN DE LOS ORIGINALES Y DERECHOS DE AUTOR Los manuscritos deben dirigirse al Comité Editor de la Revista Argentina de Microbiología acompañados de una nota de acuerdocon el siguiente modelo:

“Sres. Comité Editor de la Revista Argentina de Microbiología: en mi carácter de autor responsable declaro que el resto de losautores han acordado que los represente frente a la RAM con respecto al envío del manuscrito …[Título]… y son responsablesjunto a mí de su contenido. Este trabajo (u otro de contenido similar) no ha sido publicado previamente ni está siendo consideradoen otra revista para su publicación. Asimismo, manifiesto mi conformidad de otorgar los derechos de copia (copyright) a la RevistaArgentina de Microbiología, una vez concretada la publicación”.

Todos los autores de un manuscrito deberán acceder explícitamente a su publicación, serán responsables de la veracidad delos contenidos y deberán explicitar su conformidad para que uno de ellos, que es quien suscribirá la nota arriba citada, actúe comoautor para la correspondencia a los fines del manejo editorial. Asimismo, los autores manifestarán su conformidad con la posiciónde cada uno en la lista de autores, en la que se indicará su filiación académica. Un cambio de autor o de orden de autores sólo seráconsiderado si se solicita mediante una nota firmada por todos los autores a tal efecto. En una carta adjunta, los autores deberánespecificar la existencia de conflictos de interés que puedan afectar la evaluación del manuscrito. Estos serán confidenciales ymantenidos en reserva por el Comité Editor.

Deben especificarse en la sección agradecimientos las fuentes de financiación para la tarea experimental descrita en el manuscrito,ya sean éstas institucionales, oficiales o privadas. También se deberán especificar en esta sección las afiliaciones comerciales o losvínculos tales como consultorías, así como la copropiedad de licencias con fines comerciales por parte de uno o más autores. El material será analizado por el Comité Editor y sometido a la consideración de dos árbitros científicos designados para cadacaso. El Comité Editor se reserva el derecho de rechazar aquellos manuscritos cuyos contenidos se superponen total o parcialmentecon trabajos ya publicados, o cuyas temáticas no se correspondan con las de la RAM. Asimismo, son motivos de rechazo la falta decumplimiento de las reglas editoriales, violaciones éticas, baja calidad científica y un uso pobre del idioma, sea éste inglés o español.El Comité Editor se reserva el derecho de efectuar las modificaciones gramaticales o de estilo que considere necesarias.

ORGANIZACIÓN Y FORMATO La RAM acepta artículos originales, informes breves, artículos especiales, imágenes microbiológicas, editoriales y también editasuplementos. Se solicita leer cuidadosamente las especificaciones de cada formato a los efectos de elegir el más apropiado y deesta manera agilizar el proceso de evaluación. Los manuscritos podrán redactarse indistintamente en español o en inglés, aunque el Comité Editor estimula a los autores aescribir los trabajos en inglés para favorecer su difusión y lectura a nivel internacional. Artículos originales. Son trabajos de investigación completos y deben redactarse respetando las siguientes secciones: Título(en español y en inglés) y Título abreviado, Resumen y Palabras clave (en español y en inglés), Introducción, Materiales y métodos,Resultados, Discusión, Agradecimientos y Bibliografía. El manuscrito no deberá exceder las 8000 palabras incluyendo a todas lassecciones, con hasta 6 tablas o figuras. Informes breves. Son trabajos de menor extensión, entre los que se incluyen casuísticas, casos clínicos y descripciones detécnicas o dispositivos nuevos, avalados por trabajos experimentales concluyentes. Se debe omitir la división del texto en seccionesy todo el manuscrito no podrá exceder las 3000 palabras, con un máximo de quince citas bibliográficas y de tres tablas o figuras. Esnecesario un análisis cuidadoso de la presentación de los datos para evitar su reiteración en el texto, en las tablas y en las figuras,a fin de mantener la característica de brevedad de este tipo de artículos. Artículos especiales. Son actualizaciones o consensos de grupos de trabajo acerca de temas de gran interés en el ámbitoregional o internacional. Sus autores deben ser especialistas en la materia y el texto debe incluir una revisión bibliográfica amplia yactualizada. Los artículos especiales admiten hasta 10 000 palabras, 8 tablas o figuras y no más de 100 citas bibliográficas. Imágenes microbiológicas. Pueden corresponder a fotos de bacterias, hongos, parásitos o virus, tomadas de exámenesen fresco o con coloraciones, y observadas bajo microscopía óptica, electrónica o de fluorescencia. También se admiten otrasimágenes fotográficas, por ejemplo, microorganismos en medios de cultivo, lesiones ilustrativas en pacientes o en animales deexperimentación, imágenes radiográficas y ecográficas, de tomografías computarizadas, de resonancia magnética nuclear, etc.Estas imágenes, de gran valor didáctico y no necesariamente excepcionales, deben estar acompañadas de un texto explicativoy de flechas indicadoras, cuando corresponda. El conjunto no debe exceder una página impresa. Los requisitos de calidad parael envío de las imágenes se describen bajo el ítem “Figuras”.

INSTRUCCIONES PARA LOS AUTORES


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Cartas al Editor. Pueden corresponder a comentarios o nuevos datos. Los primeros consisten en observaciones sobre losartículos publicados en la revista; los segundos están destinados a comunicar hallazgos concisos que no son apropiados para supublicación como trabajo completo o informe breve. Ambas clases de contribuciones no deben exceder las 500 palabras, deben tenertítulo en español e inglés, no deben llevar resumen y pueden contener no más de una figura o tabla. Los autores y sus filiacionesaparecerán al pie de la carta. Se debe proporcionar solo la filiación primaria de cada autor. Los comentarios deben hacer mencióndel volumen y el número en que se publicó el artículo comentado, de su título completo y del apellido del primer autor. Asimismo,deben contener referencias bibliográficas que apoyen el argumento de quien envía la carta. Para considerar la publicación de uncomentario, se solicitará primero una respuesta al autor de correspondencia del artículo publicado; la aprobación final y publicaciónde ambas quedará a criterio del editor. En el caso de una contribución presentada como nuevos datos, ésta se asignará a un editorexperto en la materia, quien junto con revisores externos se encargará de su evaluación. Se debe tener en cuenta que algunos delos servicios de indexación no incluyen las Cartas al Editor en sus bases de datos.

Editoriales. Abordan tópicos científicos de gran actualidad y particular relevancia para la comunidad científica especializada en laMicrobiología, o trabajos de opinión sobre política científica. La oportunidad y autoría de los editoriales, así como sus lineamientosgenerales, quedan exclusivamente a criterio del Comité Editor.

Suplementos. Corresponden a revisiones extensas de un tema específico realizadas por una o varias sociedades científicaso universidades, o a los resúmenes de las contribuciones efectuadas en el marco de eventos científicos organizados por la AsociaciónArgentina de Microbiología o alguna de sus Divisiones o Filiales (comunicaciones orales, paneles, conferencias, mesas redondas,etc.). Los suplementos estarán a cargo de editores invitados; sus propuestas temáticas y lineamientos generales deberán seraceptados por el Comité Editor.

La revisión de los manuscritos correspondientes a los suplementos estará a cargo de revisores elegidos por el Comité Editor(revisiones extensas) y de los editores invitados (resúmenes de eventos). El suplemento deberá ser financiado en su totalidad porla entidad que ha organizado la reunión científica, la que tendrá en cuenta que el suplemento deberá ser accesible a todos losparticipantes del evento o a todos los socios de la Asociación Argentina de Microbiología (por suscripción y on-line). Con respectoa la edición, el suplemento deberá respetar exactamente el formato y el estilo de la Revista Argentina de Microbiología en todossus aspectos (tapa, tipo de papel, impresión, tablas, figuras, fotos, etc.), tal como se describe en este instructivo. Los suplementoscorrespondientes a los resúmenes de los eventos deben incluir en este orden: nómina de los miembros del Comité Editor de laRevista Argentina de Microbiología, datos de presentación del evento (título completo, lugar y fecha), índice en español y en inglés,agradecimientos, nómina de las autoridades del evento y mensaje/s del/de los presidente/s. A continuación se presentarán losresúmenes numerados desde el uno con números arábigos. Al final del suplemento debe incluirse el índice alfabético de autores ylas “Instrucciones para los autores” de la Revista Argentina de Microbiología, en español y en inglés. El programa esquemático delevento sólo se podrá incluir en forma de tríptico, suelto en el interior del suplemento.

ELABORACIÓN DE LOS MANUSCRITOSLos manuscritos se deben escribir en hoja A4 con márgenes de 3 cm de lado. Se deberá utilizar formato de fuente Times New

Roman, estilo regular, tamaño 12 puntos, a doble espacio. Las letras en negrita o itálica se usarán sólo cuando corresponda. A partirdel resumen, se deberán numerar consecutivamente las páginas (en el ángulo inferior derecho) y las líneas del manuscrito. Esto seaplicará tanto para el texto como para las tablas, figuras y leyendas, y también para la bibliografía. Las páginas correspondientesa las tablas, figuras y leyendas se incluirán después de la sección de bibliografía.

Carátula. En la primera página se debe indicar el título del trabajo (sólo la primera letra en mayúscula, el resto en minúscula); losautores (primer nombre completo, iniciales de los nombres restantes y apellidos completos de todos los autores); lugar de trabajo(nombre de la institución y dirección postal) y título abreviado del trabajo, de hasta 50 caracteres, para cabeza de página. Si el trabajoincluye autores con distintos lugares de trabajo, se colocarán superíndices numéricos (no encerrados entre paréntesis) junto a losnombres, de manera de identificar a cada autor con su respectivo lugar de trabajo. El autor responsable de la correspondencia seindicará con un asterisco en posición de superíndice ubicado junto al nombre; se detallará su dirección de correo electrónico. Enaquellos casos en que uno o varios de los autores hayan cambiado de filiación, se debe consignar la filiación donde se realizó eltrabajo y al pie de página, su lugar de trabajo actual.

Resúmenes. Se incluirán sólo en los artículos originales, informes breves y artículos especiales y podrán tener una extensiónmáxima de 250 palabras para los artículos originales y de 150 palabras para los informes breves. El primero de ellos estará redactadoen el idioma empleado en el trabajo; el segundo, en el otro idioma y estará encabezado por el título completo del trabajo. Cada unode ellos estará seguido de una lista de tres a seis palabras clave en el idioma correspondiente. Se debe evitar en los resúmenes eluso de abreviaturas y de citas bibliográficas. Dado que el resumen puede ser publicado separadamente por servicios bibliográficos,se deberá asegurar que resulte comprensible aun en ausencia del texto completo.

Introducción. Debe suministrar suficiente y adecuada información sobre el tema en cuestión, como para permitir su comprensiónal lector no especializado. Asimismo debe incluir la hipótesis o la base científica que guió el diseño experimental y los objetivos deltrabajo definidos con claridad. Las referencias citadas en esta sección deberán ser elegidas muy cuidadosamente y ser las másimportantes del tema.

Materiales y Métodos. Debe contener una adecuada descripción de los métodos, aparatos, reactivos y procedimientos utiliza-dos, con el detalle suficiente como para permitir la reproducción de los experimentos. Los procedimientos o técnicas comunes y deutilización de rutina pueden citarse por medio de una referencia (ej., determinación de la CIM según el CLSI, 2010). Los métodosnuevos o desarrollados especialmente para el trabajo deben ser descritos con detalle, como así también la fuente de drogas pococomunes o materiales biológicos (cepas bacterianas, virales, fúngicas, plásmidos, etc.). La marca y la procedencia de los reactivos,de los medios de cultivo y de los equipos deben consignarse en el texto la primera vez que se los cita identificando marca, ciudad/estado (si correspondiera) y país de origen.

Resultados. Debe incluir el diseño experimental y su base científica, así como los resultados obtenidos presentados en formaconcisa como texto (preferentemente) o como tabla(s) o figura(s). Evite el uso innecesario de tablas y figuras para mencionar datosque podrían ser presentados en el texto. No duplique la misma información incluyéndola en el texto y en las tablas o figuras. Limiteel número de fotografías a las mínimas necesarias para mostrar los resultados experimentales. Numere las tablas y figuras en elorden en el que se citan en el texto. Se deben evitar las repeticiones y destacar sólo los datos importantes. Se debe dejar para lasección Discusión la interpretación más extensa.

Discusión. Debe hacer énfasis sobre los aspectos más importantes y novedosos del estudio, e interpretar los datos experimentalesobtenidos en relación con los ya publicados. Indique las conclusiones a las que se arribó y evite la reiteración de datos y conceptosya vertidos en secciones anteriores. Se admite la presentación de Resultados y Discusión como una sección conjunta.

Agradecimientos. Esta sección se debe presentar en un solo párrafo, en un tamaño de letra menor al usado en el texto del


manuscrito (Times New Roman, tamaño 11 puntos). Se mencionarán en esta sección las fuentes de financiación y los individuoso instituciones que hayan contribuido con reactivos, materiales biológicos o discusión de resultados.

Bibliografía. En todos los manuscritos es conveniente que el 70 % de las citas bibliográficas corresponda a los últimos 10 añosy el 30 % restante se distribuya entre los trabajos clave publicados durante los años anteriores. Las citas bibliográficas se debenescribir en hoja aparte y presentarse en orden alfabético de autores, numeradas correlativamente empleando números arábigos.En el texto, las citas deben aparecer con números entre paréntesis, en correspondencia con el número con que aparecen en labibliografía. Las referencias a comentarios personales y a trabajos inéditos deberán mencionarse en el texto como comunicaciónpersonal, escrito entre paréntesis.

Para las referencias, se deberán citar la totalidad de los autores y seguir los siguientes modelos:a. Publicaciones periódicasHéritier C, Poirel L, Lambert T, Nordmann P. Contribution of acquired carbapenem-hydrolyzing oxacillinases to carbapenem

resistance in Acinetobacter baumannii. Antimicrob Agents Chemother 2005; 49: 3198-202.Los títulos de las revistas serán abreviados según el Index Medicus (el listado puede obtenerse en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

sites/entrez?db=journals).b. Capítulos de libros/módulosMartins Teixeira L, Siqueira Carvalho M da G, Facklam RR. Enterococcus. En: Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Landry ML,

Pfaller MA, editors. Manual of Clinical Microbiology, 9th edition. Washington DC, ASM Press, 2007, p. 430-42.c. Presentaciones en congresos u otros eventos científicosAguilar M, Punschke K, Touati D, Pianzzola MJ. Estudios fisiológicos y genéticos en la bacteria sulfato reductora Desulfoar-

culus baarsii. Terceras Jornadas Rioplatenses de Microbiología, 1997, Resumen J2, p. 102, Ciudad Autónoma de Buenos Aires,Argentina.

d. Presentaciones en congresos u otros eventos científicos reproducidas dentro de un suplemento publicado por unarevista de publicación periódica.

Fellner MD, Correa RM, Durand K, Teyssié AR, Picconi MA. Análisis del ADN circulante de virus Epstein-Barr (EBV) en pacien-tes inmunosuprimidos con y sin linfomas asociados. VIII Congreso Argentino de Virología, Resumen 10416. Rev Argent Microbiol2005; 37 Supl 1: 95.

e. InstitucionalesClinical and Laboratory Standards Institute. Disk diffusion. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; 15th

Informational Supplement, 2005; M100-S15. Wayne, PA, EE.UU.f. TesisBrizzio A. Aplicación de una PCR múltiple para la identificación de cepas de Staphylococcus aureus toxigénicas. Tesis de Maestría

en Microbiología Molecular 2009. ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” y Universidad Nacional de San Martín.g. Referencias on-line1. Para libros on-lineSullivan CJ, editor. 1999-2001. Fungi: an evolving electronic resource for the microbiological community. ASM Press. [On-line]

http://link.asmusa.de/link/service/books/91090. Consultado el 7 de setiembre de 2001.2. Para versiones on-line de revistas disponibles en forma impresa.van der Zeiss L, Danziger VB. History of clinical microbiology. Clin Microbiol 1999; 100: 123-234. [On-line]3. Para revistas únicamente disponibles on-lineZellnitz F, Foley PM. October 1998, posting {or revision} date. History of virology. Am Virol J 1998; 1: 30-50. [Online] http://www.

avj.html.4. Para trabajos publicados on-line como manuscritos de publicación adelantadaZheng Z, Zou J. 5 September 2001. The initial step of the glycerolipid pathway: identifi cation of glycerol-3-phosphate/dihydroxy-

The initial step of the glycerolipid pathway: identification of glycerol-3-phosphate/dihydroxy-acetone phosphate dual substrateacyltransferases in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem 10. 1074/jbc.M104749200.

h. Los ítems, referencias a trabajos o a resúmenes de congresos no publicados, en proceso de publicación o bajo revisión;comunicaciones personales; patentes en aplicación o en trámite; bases de datos y páginas web deben ser citadas en el texto entreparéntesis como se muestra:

… resultados similares (Gómez H, resultados no publicados)… nuevo protocolo de detección empleado (González JL, enviado para su publicación).… concentraciones de droga (López GO, 34th Intersci Conf Antimicrob Agents Chemother; abstr. 114, 1994).… nueva especie de bacteria celulolítica (Márquez W, comunicación personal)… comentados previamente por diversas fuentes (http://fcen.uba.edu.ar)Tablas. Se presentarán en hoja aparte, numeradas consecutivamente con números arábigos, encabezadas con un breve título

explicativo (que en lo posible no reitere los títulos de las filas y las columnas), con las leyendas y/o aclaraciones que correspondanal pie. Las llamadas para las aclaraciones al pie se harán empleando números arábigos entre paréntesis y superíndice. Sólo losbordes externos de la primera y la última fila y la separación entre los títulos de las columnas y los datos se marcarán con líneacontínua. No se marcarán las filas ni los bordes de las columnas.

Figuras. Se presentarán en hoja aparte, con el número de figura en el margen superior izquierdo y en el orden que aparecen enel texto. Los dibujos deberán estar en condiciones que aseguren una adecuada reproducción. Los números, letras y signos tendrándimensiones adecuadas para ser legibles cuando se hagan las reducciones necesarias. Las referencias de los símbolos utilizadosen las figuras deberán incluirse dentro de la misma figura y no en el texto de la leyenda. Las fotografías podrán ser realizadas encolor o en blanco y negro, en el formato JPEG o TIFF. Las resoluciones mínimas requeridas son 300 dpi para las imágenes y foto-grafías en color y escala de grises, 600 dpi para las imágenes de arte de combinación (letras e imágenes) y 1200 dpi para lasimágenes de arte de línea (gráficos y dibujos). Nota: es muy importante que se use una adecuada resolución de archivo. Todaslas imágenes individuales que se importan en un archivo gráfico deben estar en la resolución correcta antes de su carga. Tengaen cuenta, sin embargo, que cuanto mayor sea la resolución más grande será el archivo y más tiempo demandará su envío pormedios electrónicos. Las leyendas de las figuras se presentarán reunidas en una hoja aparte, ordenadas consecutivamente connúmeros arábigos.

Secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos. Las secuencias nuevas comunicadas a través de la publicación en estarevista deberán ser depositadas en una base de datos y sus números de acceso incluidos en el manuscrito, no más tarde de laetapa de revisión. Los números de acceso deberán ser incorporados en un párrafo separado al final de la sección “Materiales ymétodos” en el caso de trabajos originales, o luego del texto en el caso de informes breves. La información sobre bases de datosactualmente disponibles es la siguiente: DDBJ: Center for Information Biology and DNA Data Bank of Japan National Institute ofGenetics; e-mail. [email protected]; URL, http://www.ddbj.nig.ac.jp

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Cartas al Editor. Pueden corresponder a comentarios o nuevos datos. Los primeros consisten en observaciones sobre losartículos publicados en la revista; los segundos están destinados a comunicar hallazgos concisos que no son apropiados para supublicación como trabajo completo o informe breve. Ambas clases de contribuciones no deben exceder las 500 palabras, deben tenertítulo en español e inglés, no deben llevar resumen y pueden contener no más de una figura o tabla. Los autores y sus filiacionesaparecerán al pie de la carta. Se debe proporcionar solo la filiación primaria de cada autor. Los comentarios deben hacer mencióndel volumen y el número en que se publicó el artículo comentado, de su título completo y del apellido del primer autor. Asimismo,deben contener referencias bibliográficas que apoyen el argumento de quien envía la carta. Para considerar la publicación de uncomentario, se solicitará primero una respuesta al autor de correspondencia del artículo publicado; la aprobación final y publicaciónde ambas quedará a criterio del editor. En el caso de una contribución presentada como nuevos datos, ésta se asignará a un editorexperto en la materia, quien junto con revisores externos se encargará de su evaluación. Se debe tener en cuenta que algunos delos servicios de indexación no incluyen las Cartas al Editor en sus bases de datos.

Editoriales. Abordan tópicos científicos de gran actualidad y particular relevancia para la comunidad científica especializada en laMicrobiología, o trabajos de opinión sobre política científica. La oportunidad y autoría de los editoriales, así como sus lineamientosgenerales, quedan exclusivamente a criterio del Comité Editor.

Suplementos. Corresponden a revisiones extensas de un tema específico realizadas por una o varias sociedades científicaso universidades, o a los resúmenes de las contribuciones efectuadas en el marco de eventos científicos organizados por la AsociaciónArgentina de Microbiología o alguna de sus Divisiones o Filiales (comunicaciones orales, paneles, conferencias, mesas redondas,etc.). Los suplementos estarán a cargo de editores invitados; sus propuestas temáticas y lineamientos generales deberán seraceptados por el Comité Editor.

La revisión de los manuscritos correspondientes a los suplementos estará a cargo de revisores elegidos por el Comité Editor(revisiones extensas) y de los editores invitados (resúmenes de eventos). El suplemento deberá ser financiado en su totalidad porla entidad que ha organizado la reunión científica, la que tendrá en cuenta que el suplemento deberá ser accesible a todos losparticipantes del evento o a todos los socios de la Asociación Argentina de Microbiología (por suscripción y on-line). Con respectoa la edición, el suplemento deberá respetar exactamente el formato y el estilo de la Revista Argentina de Microbiología en todossus aspectos (tapa, tipo de papel, impresión, tablas, figuras, fotos, etc.), tal como se describe en este instructivo. Los suplementoscorrespondientes a los resúmenes de los eventos deben incluir en este orden: nómina de los miembros del Comité Editor de laRevista Argentina de Microbiología, datos de presentación del evento (título completo, lugar y fecha), índice en español y en inglés,agradecimientos, nómina de las autoridades del evento y mensaje/s del/de los presidente/s. A continuación se presentarán losresúmenes numerados desde el uno con números arábigos. Al final del suplemento debe incluirse el índice alfabético de autores ylas “Instrucciones para los autores” de la Revista Argentina de Microbiología, en español y en inglés. El programa esquemático delevento sólo se podrá incluir en forma de tríptico, suelto en el interior del suplemento.

ELABORACIÓN DE LOS MANUSCRITOSLos manuscritos se deben escribir en hoja A4 con márgenes de 3 cm de lado. Se deberá utilizar formato de fuente Times New

Roman, estilo regular, tamaño 12 puntos, a doble espacio. Las letras en negrita o itálica se usarán sólo cuando corresponda. A partirdel resumen, se deberán numerar consecutivamente las páginas (en el ángulo inferior derecho) y las líneas del manuscrito. Esto seaplicará tanto para el texto como para las tablas, figuras y leyendas, y también para la bibliografía. Las páginas correspondientesa las tablas, figuras y leyendas se incluirán después de la sección de bibliografía.

Carátula. En la primera página se debe indicar el título del trabajo (sólo la primera letra en mayúscula, el resto en minúscula); losautores (primer nombre completo, iniciales de los nombres restantes y apellidos completos de todos los autores); lugar de trabajo(nombre de la institución y dirección postal) y título abreviado del trabajo, de hasta 50 caracteres, para cabeza de página. Si el trabajoincluye autores con distintos lugares de trabajo, se colocarán superíndices numéricos (no encerrados entre paréntesis) junto a losnombres, de manera de identificar a cada autor con su respectivo lugar de trabajo. El autor responsable de la correspondencia seindicará con un asterisco en posición de superíndice ubicado junto al nombre; se detallará su dirección de correo electrónico. Enaquellos casos en que uno o varios de los autores hayan cambiado de filiación, se debe consignar la filiación donde se realizó eltrabajo y al pie de página, su lugar de trabajo actual.

Resúmenes. Se incluirán sólo en los artículos originales, informes breves y artículos especiales y podrán tener una extensiónmáxima de 250 palabras para los artículos originales y de 150 palabras para los informes breves. El primero de ellos estará redactadoen el idioma empleado en el trabajo; el segundo, en el otro idioma y estará encabezado por el título completo del trabajo. Cada unode ellos estará seguido de una lista de tres a seis palabras clave en el idioma correspondiente. Se debe evitar en los resúmenes eluso de abreviaturas y de citas bibliográficas. Dado que el resumen puede ser publicado separadamente por servicios bibliográficos,se deberá asegurar que resulte comprensible aun en ausencia del texto completo.

Introducción. Debe suministrar suficiente y adecuada información sobre el tema en cuestión, como para permitir su comprensiónal lector no especializado. Asimismo debe incluir la hipótesis o la base científica que guió el diseño experimental y los objetivos deltrabajo definidos con claridad. Las referencias citadas en esta sección deberán ser elegidas muy cuidadosamente y ser las másimportantes del tema.

Materiales y Métodos. Debe contener una adecuada descripción de los métodos, aparatos, reactivos y procedimientos utiliza-dos, con el detalle suficiente como para permitir la reproducción de los experimentos. Los procedimientos o técnicas comunes y deutilización de rutina pueden citarse por medio de una referencia (ej., determinación de la CIM según el CLSI, 2010). Los métodosnuevos o desarrollados especialmente para el trabajo deben ser descritos con detalle, como así también la fuente de drogas pococomunes o materiales biológicos (cepas bacterianas, virales, fúngicas, plásmidos, etc.). La marca y la procedencia de los reactivos,de los medios de cultivo y de los equipos deben consignarse en el texto la primera vez que se los cita identificando marca, ciudad/estado (si correspondiera) y país de origen.

Resultados. Debe incluir el diseño experimental y su base científica, así como los resultados obtenidos presentados en formaconcisa como texto (preferentemente) o como tabla(s) o figura(s). Evite el uso innecesario de tablas y figuras para mencionar datosque podrían ser presentados en el texto. No duplique la misma información incluyéndola en el texto y en las tablas o figuras. Limiteel número de fotografías a las mínimas necesarias para mostrar los resultados experimentales. Numere las tablas y figuras en elorden en el que se citan en el texto. Se deben evitar las repeticiones y destacar sólo los datos importantes. Se debe dejar para lasección Discusión la interpretación más extensa.

Discusión. Debe hacer énfasis sobre los aspectos más importantes y novedosos del estudio, e interpretar los datos experimentalesobtenidos en relación con los ya publicados. Indique las conclusiones a las que se arribó y evite la reiteración de datos y conceptosya vertidos en secciones anteriores. Se admite la presentación de Resultados y Discusión como una sección conjunta.

Agradecimientos. Esta sección se debe presentar en un solo párrafo, en un tamaño de letra menor al usado en el texto del


manuscrito (Times New Roman, tamaño 11 puntos). Se mencionarán en esta sección las fuentes de financiación y los individuoso instituciones que hayan contribuido con reactivos, materiales biológicos o discusión de resultados.

Bibliografía. En todos los manuscritos es conveniente que el 70 % de las citas bibliográficas corresponda a los últimos 10 añosy el 30 % restante se distribuya entre los trabajos clave publicados durante los años anteriores. Las citas bibliográficas se debenescribir en hoja aparte y presentarse en orden alfabético de autores, numeradas correlativamente empleando números arábigos.En el texto, las citas deben aparecer con números entre paréntesis, en correspondencia con el número con que aparecen en labibliografía. Las referencias a comentarios personales y a trabajos inéditos deberán mencionarse en el texto como comunicaciónpersonal, escrito entre paréntesis.

Para las referencias, se deberán citar la totalidad de los autores y seguir los siguientes modelos:a. Publicaciones periódicasHéritier C, Poirel L, Lambert T, Nordmann P. Contribution of acquired carbapenem-hydrolyzing oxacillinases to carbapenem

resistance in Acinetobacter baumannii. Antimicrob Agents Chemother 2005; 49: 3198-202.Los títulos de las revistas serán abreviados según el Index Medicus (el listado puede obtenerse en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

sites/entrez?db=journals).b. Capítulos de libros/módulosMartins Teixeira L, Siqueira Carvalho M da G, Facklam RR. Enterococcus. En: Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Landry ML,

Pfaller MA, editors. Manual of Clinical Microbiology, 9th edition. Washington DC, ASM Press, 2007, p. 430-42.c. Presentaciones en congresos u otros eventos científicosAguilar M, Punschke K, Touati D, Pianzzola MJ. Estudios fisiológicos y genéticos en la bacteria sulfato reductora Desulfoar-

culus baarsii. Terceras Jornadas Rioplatenses de Microbiología, 1997, Resumen J2, p. 102, Ciudad Autónoma de Buenos Aires,Argentina.

d. Presentaciones en congresos u otros eventos científicos reproducidas dentro de un suplemento publicado por unarevista de publicación periódica.

Fellner MD, Correa RM, Durand K, Teyssié AR, Picconi MA. Análisis del ADN circulante de virus Epstein-Barr (EBV) en pacien-tes inmunosuprimidos con y sin linfomas asociados. VIII Congreso Argentino de Virología, Resumen 10416. Rev Argent Microbiol2005; 37 Supl 1: 95.

e. InstitucionalesClinical and Laboratory Standards Institute. Disk diffusion. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; 15th

Informational Supplement, 2005; M100-S15. Wayne, PA, EE.UU.f. TesisBrizzio A. Aplicación de una PCR múltiple para la identificación de cepas de Staphylococcus aureus toxigénicas. Tesis de Maestría

en Microbiología Molecular 2009. ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” y Universidad Nacional de San Martín.g. Referencias on-line1. Para libros on-lineSullivan CJ, editor. 1999-2001. Fungi: an evolving electronic resource for the microbiological community. ASM Press. [On-line]

http://link.asmusa.de/link/service/books/91090. Consultado el 7 de setiembre de 2001.2. Para versiones on-line de revistas disponibles en forma impresa.van der Zeiss L, Danziger VB. History of clinical microbiology. Clin Microbiol 1999; 100: 123-234. [On-line]3. Para revistas únicamente disponibles on-lineZellnitz F, Foley PM. October 1998, posting {or revision} date. History of virology. Am Virol J 1998; 1: 30-50. [Online] http://www.

avj.html.4. Para trabajos publicados on-line como manuscritos de publicación adelantadaZheng Z, Zou J. 5 September 2001. The initial step of the glycerolipid pathway: identifi cation of glycerol-3-phosphate/dihydroxy-

The initial step of the glycerolipid pathway: identification of glycerol-3-phosphate/dihydroxy-acetone phosphate dual substrateacyltransferases in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem 10. 1074/jbc.M104749200.

h. Los ítems, referencias a trabajos o a resúmenes de congresos no publicados, en proceso de publicación o bajo revisión;comunicaciones personales; patentes en aplicación o en trámite; bases de datos y páginas web deben ser citadas en el texto entreparéntesis como se muestra:

… resultados similares (Gómez H, resultados no publicados)… nuevo protocolo de detección empleado (González JL, enviado para su publicación).… concentraciones de droga (López GO, 34th Intersci Conf Antimicrob Agents Chemother; abstr. 114, 1994).… nueva especie de bacteria celulolítica (Márquez W, comunicación personal)… comentados previamente por diversas fuentes (http://fcen.uba.edu.ar)Tablas. Se presentarán en hoja aparte, numeradas consecutivamente con números arábigos, encabezadas con un breve título

explicativo (que en lo posible no reitere los títulos de las filas y las columnas), con las leyendas y/o aclaraciones que correspondanal pie. Las llamadas para las aclaraciones al pie se harán empleando números arábigos entre paréntesis y superíndice. Sólo losbordes externos de la primera y la última fila y la separación entre los títulos de las columnas y los datos se marcarán con líneacontínua. No se marcarán las filas ni los bordes de las columnas.

Figuras. Se presentarán en hoja aparte, con el número de figura en el margen superior izquierdo y en el orden que aparecen enel texto. Los dibujos deberán estar en condiciones que aseguren una adecuada reproducción. Los números, letras y signos tendrándimensiones adecuadas para ser legibles cuando se hagan las reducciones necesarias. Las referencias de los símbolos utilizadosen las figuras deberán incluirse dentro de la misma figura y no en el texto de la leyenda. Las fotografías podrán ser realizadas encolor o en blanco y negro, en el formato JPEG o TIFF. Las resoluciones mínimas requeridas son 300 dpi para las imágenes y foto-grafías en color y escala de grises, 600 dpi para las imágenes de arte de combinación (letras e imágenes) y 1200 dpi para lasimágenes de arte de línea (gráficos y dibujos). Nota: es muy importante que se use una adecuada resolución de archivo. Todaslas imágenes individuales que se importan en un archivo gráfico deben estar en la resolución correcta antes de su carga. Tengaen cuenta, sin embargo, que cuanto mayor sea la resolución más grande será el archivo y más tiempo demandará su envío pormedios electrónicos. Las leyendas de las figuras se presentarán reunidas en una hoja aparte, ordenadas consecutivamente connúmeros arábigos.

Secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos. Las secuencias nuevas comunicadas a través de la publicación en estarevista deberán ser depositadas en una base de datos y sus números de acceso incluidos en el manuscrito, no más tarde de laetapa de revisión. Los números de acceso deberán ser incorporados en un párrafo separado al final de la sección “Materiales ymétodos” en el caso de trabajos originales, o luego del texto en el caso de informes breves. La información sobre bases de datosactualmente disponibles es la siguiente: DDBJ: Center for Information Biology and DNA Data Bank of Japan National Institute ofGenetics; e-mail. [email protected]; URL, http://www.ddbj.nig.ac.jp

339

Xxxx 73ISSN 0325-7541Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 73

Guía para la preparación de los manuscritosLa siguiente lista está destinada a servir de guía para la preparación y revisión de su manuscrito de acuerdo con el estilo y formato de la revista. Para más detalles consultar las Instrucciones a los Autores (http://www.aam.org.ar). Los manuscritos que no cumplan con el formato especificado serán devueltos a los autores, retrasándose el proceso de evaluación y publicación.

Título Sí No No corresponde

Incluye título en español

Incluye título en inglés

Incluye título abreviado

Autores Identifica al autor responsable

Incluye dirección, teléfono y correo electrónico del autor responsable

Incluye a todos los autores

Incluye el lugar de trabajo de cada autorIncluye nota de presentación del manuscrito por el autor responsable

ResúmenesNo supera el máximo de palabras permitidas

Incluye resumen en español

Incluye palabras clave en español

Incluye resumen en inglés

Incluye palabras clave en inglés

TextoNo supera el máximo de palabras permitidas

No supera el máximo de tablas y/o figuras permitidas

Contiene las secciones correspondientes

Hace uso correcto de las abreviaciones

Cita la marca y procedencia de los reactivos, de los medios de cultivo y de los equipos

Cita el número de acceso de las nuevas secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos

Tablas y FigurasIncluye cada una en hoja aparte

Los títulos son claros y concisos

Incluye las leyendas

Las citas en el texto se corresponden con el número de cada tabla y figura

Explica las abreviaciones no convencionales al pie de las tablas

Envía las figuras y fotografías en archivos adjuntos

BibliografíaRespeta estrictamente el formato requerido por la revista

Ordena las citas bibliográficas en forma alfabética

Incluye las referencias en el texto en correspondencia con el número con el que aparecen en esta sección

AgradecimientosCita las fuentes de financiamiento

































EMBL: EMBL Nucleotide Sequence Submissions, European Bioinformatics Institute; e-mail. [email protected]; URL,http://www.ebi.ac.uk

GenBank: National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine; e-mail. [email protected]; URL,http:// www.ncbi.nlm.nih.gov

En lo que respecta a la presentación de nuevas secuencias de ácidos nucleicos, aquellas de hasta 50 nucleótidos pueden serpresentadas en cualquier estilo. Las secuencias de longitud importante deben ser presentadas como Figuras para reducir espacio,indicando 80 a 120 nucleótidos por línea, en un tipo de letra que lo haga fácilmente legible en las condiciones de publicación (16cm, ancho de dos columnas de la RAM). De ser posible, se dividirán las líneas de la secuencia en bloques de 10 o 20 nucleótidosseparados por un espacio o por números indicativos encima de la secuencia. Las líneas deberán estar numeradas, indicando elnúmero correspondiente a la izquierda de la primera base de cada línea. Las anotaciones necesarias se marcarán en negrita,subrayadas o entre paréntesis. Si se requiriere presentar la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia nucleotídica,se indicará mediante el uso de símbolos de una letra aceptados como indicativos de aminoácidos, los que se localizarán debajodel primer nucleótido del codón codificante.

Siglas. Las siglas y demás abreviaciones (cuando esto corresponda) deberán ser explicitadas después de su primera menciónen el texto. Las unidades de medida se expresarán siguiendo las normas del Système International dÚnités.

ENVÍO DE LOS MANUSCRITOSLos manuscritos podrán ser enviados por correo electrónico ([email protected]) o por correo postal (Deán Funes 472, C1214AAD,

Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina), incluyendo una versión electrónica en CD-ROM, el que deberá estar identificadocon una etiqueta o rótulo que indique el nombre del trabajo y los programas (y versiones) usados para confeccionar el texto, lasfiguras y las fotografías, así como el nombre de los archivos que contiene.

Se recomienda incluir todo el texto del artículo en un solo archivo; en caso de haber imágenes, éstas deben enviarse en archivosseparados. Se recomienda además tipear las mayúsculas, los espacios entre palabras, las itálicas y las negritas tal como se desease muestren luego en el impreso; no dejar espacios antes y después de los subtítulos; justificar el texto y usar la tecla de tabulacióny no la barra espaciadora para encolumnar las tablas.

Se recomienda a los autores revisar la lista de chequeo que figura a continuación de estas instrucciones y verificar que se hacumplido con todos los requisitos allí señalados. Antes de enviar un manuscrito, es también recomendable consultar algún ejem-plar reciente de la RAM para verificar si se han seguido las pautas requeridas de formato y estilo y, eventualmente, efectuar lasmodificaciones necesarias.

Se aconseja a los autores eliminar de las propiedades de los archivos que envíen todo tipo de información que identifique suautoría.

PROCESO EDITORIALUna vez que el manuscrito ha cumplido el proceso editorial y se encuentra listo para su publicación, se enviará por correo

electrónico al autor responsable el archivo en formato pdf de la prueba de galera, para que realice las correcciones tipográficasque correspondieran. No podrá cambiar conceptos ni modificar párrafos que alteren el formato de la impresión. Se deberá imprimirel documento, realizar las correcciones sobre el texto y devolverlo por fax o como archivo escaneado por correo electrónico. Lascorrecciones también pueden ser enviadas por correo electrónico, especificando claramente la página, el párrafo y la línea que sedesea corregir. La corrección deberá ser devuelta en un plazo no superior a los siete días corridos de remitida la prueba de galera,caso contrario se considerará como declinada su publicación. En ese momento se le enviará al autor el monto que deberá abonarpara que el artículo pueda ser publicado.

La Revista Argentina de Microbiología apoya las políticas para el registro de ensayos clínicos de la Organización Mundial de laSalud (OMS) y del International Committee of Medical Journal Editors (ICMJE), reconociendo la importancia de estas iniciativas parael registro y la divulgación internacional de información sobre estudios clínicos, en acceso abierto. En consecuencia, solamente seaceptarán para publicación los artículos de investigaciones clínicas que hayan recibido un número de identificación en uno de losRegistros de Ensayos Clínicos validados por los criterios establecidos por la OMS y el ICMJE, cuyas direcciones están disponiblesen el sitio del ICMJE. El número de identificación se deberá registrar al final del resumen.

Costo de la página. Por cada página publicada se cobrarán $ 75 o $ 200 si ésta incluye fotografías en color (Argentina, sociosde la AAM), $ 200 o $ 600 (Argentina, no socios de la AAM) y USD 70 o USD 180 (otros países).

Formas de pagoSi es socio y abona sus cuotas por débito, puede suscribirse abonando con débito con solo solicitarlo por mail a [email protected] copia a [email protected]

Secretaria: Deán Funes 472, (C1214AAD) Ciudad Autónoma de Buenos Aires - Argentina; Tel.: (54-11) 4932-8858 y(54-11) 4932-8948; e-mail. [email protected]; http://www.aam.org.ar

SUSCRIPCIÓN ANUAL (4 números)

Socios AAM $ 120Argentina no socios $ 240América Latina USD 100Otros países USD 200

Por depósito enBanco Galicia, (cualquier sucursal),cta. cte. Nº 10980/6 007/1, CBU 0070007820000010980619, enviándonos la fotocopia de la boletade depósito por fax, aclarando nombre, domicilio y concepto del pago, a los TE/FAX: 011 4 932-8858 y 8948 -CUIT: 30-60746436-3 oescaneada por mail a [email protected] Nación, (cualquier sucursal), cta. cte. Nº 000969700035/74 suc. Bulnes, CBU: 0110697420069700035747, CUIT: 30-60746436-3enviándonos la fotocopia, idem instrucciones para Bco. Galicia.

125100

250200

:

300

200400150300



































































En lo que respecta a la presentación de nuevas secuencias de ácidos nucleicos, aquellas de hasta 50 nucleótidos pueden serpresentadas en cualquier estilo. Las secuencias de longitud importante deben ser presentadas como Figuras para reducir espacio,indicando 80 a 120 nucleótidos por línea, en un tipo de letra que lo haga fácilmente legible en las condiciones de publicación (16cm, ancho de dos columnas de la RAM). De ser posible, se dividirán las líneas de la secuencia en bloques de 10 o 20 nucleótidosseparados por un espacio o por números indicativos encima de la secuencia. Las líneas deberán estar numeradas, indicando elnúmero correspondiente a la izquierda de la primera base de cada línea. Las anotaciones necesarias se marcarán en negrita,subrayadas o entre paréntesis. Si se requiriere presentar la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia nucleotídica,se indicará mediante el uso de símbolos de una letra aceptados como indicativos de aminoácidos, los que se localizarán debajodel primer nucleótido del codón codificante.

Siglas. Las siglas y demás abreviaciones (cuando esto corresponda) deberán ser explicitadas después de su primera menciónen el texto. Las unidades de medida se expresarán siguiendo las normas del Système International dÚnités.

ENVÍO DE LOS MANUSCRITOSLos manuscritos podrán ser enviados por correo electrónico ([email protected]) o por correo postal (Deán Funes 472, C1214AAD,

Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina), incluyendo una versión electrónica en CD-ROM, el que deberá estar identificadocon una etiqueta o rótulo que indique el nombre del trabajo y los programas (y versiones) usados para confeccionar el texto, lasfiguras y las fotografías, así como el nombre de los archivos que contiene.

Se recomienda incluir todo el texto del artículo en un solo archivo; en caso de haber imágenes, éstas deben enviarse en archivosseparados. Se recomienda además tipear las mayúsculas, los espacios entre palabras, las itálicas y las negritas tal como se desease muestren luego en el impreso; no dejar espacios antes y después de los subtítulos; justificar el texto y usar la tecla de tabulacióny no la barra espaciadora para encolumnar las tablas.

Se recomienda a los autores revisar la lista de chequeo que figura a continuación de estas instrucciones y verificar que se hacumplido con todos los requisitos allí señalados. Antes de enviar un manuscrito, es también recomendable consultar algún ejem-plar reciente de la RAM para verificar si se han seguido las pautas requeridas de formato y estilo y, eventualmente, efectuar lasmodificaciones necesarias.

Se aconseja a los autores eliminar de las propiedades de los archivos que envíen todo tipo de información que identifique suautoría.

PROCESO EDITORIALUna vez que el manuscrito ha cumplido el proceso editorial y se encuentra listo para su publicación, se enviará por correo

electrónico al autor responsable el archivo en formato pdf de la prueba de galera, para que realice las correcciones tipográficasque correspondieran. No podrá cambiar conceptos ni modificar párrafos que alteren el formato de la impresión. Se deberá imprimirel documento, realizar las correcciones sobre el texto y devolverlo por fax o como archivo escaneado por correo electrónico. Lascorrecciones también pueden ser enviadas por correo electrónico, especificando claramente la página, el párrafo y la línea que sedesea corregir. La corrección deberá ser devuelta en un plazo no superior a los siete días corridos de remitida la prueba de galera,caso contrario se considerará como declinada su publicación. En ese momento se le enviará al autor el monto que deberá abonarpara que el artículo pueda ser publicado.

La Revista Argentina de Microbiología apoya las políticas para el registro de ensayos clínicos de la Organización Mundial de laSalud (OMS) y del International Committee of Medical Journal Editors (ICMJE), reconociendo la importancia de estas iniciativas parael registro y la divulgación internacional de información sobre estudios clínicos, en acceso abierto. En consecuencia, solamente seaceptarán para publicación los artículos de investigaciones clínicas que hayan recibido un número de identificación en uno de losRegistros de Ensayos Clínicos validados por los criterios establecidos por la OMS y el ICMJE, cuyas direcciones están disponiblesen el sitio del ICMJE. El número de identificación se deberá registrar al final del resumen.

Costo de la página. Por cada página publicada se cobrarán $ 75 o $ 200 si ésta incluye fotografías en color (Argentina, sociosde la AAM), $ 200 o $ 600 (Argentina, no socios de la AAM) y USD 70 o USD 180 (otros países).

Formas de pagoSi es socio y abona sus cuotas por débito, puede suscribirse abonando con débito con solo solicitarlo por mail a [email protected] copia a [email protected]

Secretaria: Deán Funes 472, (C1214AAD) Ciudad Autónoma de Buenos Aires - Argentina; Tel.: (54-11) 4932-8858 y(54-11) 4932-8948; e-mail. [email protected]; http://www.aam.org.ar

SUSCRIPCIÓN ANUAL (4 números)

Socios AAM $ 120Argentina no socios $ 240América Latina USD 100Otros países USD 200

Por depósito enBanco Galicia, (cualquier sucursal),cta. cte. Nº 10980/6 007/1, CBU 0070007820000010980619, enviándonos la fotocopia de la boletade depósito por fax, aclarando nombre, domicilio y concepto del pago, a los TE/FAX: 011 4 932-8858 y 8948 -CUIT: 30-60746436-3 oescaneada por mail a [email protected] Nación, (cualquier sucursal), cta. cte. Nº 000969700035/74 suc. Bulnes, CBU: 0110697420069700035747, CUIT: 30-60746436-3enviándonos la fotocopia, idem instrucciones para Bco. Galicia.

140 Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 00-00REVISTA ARGENTINA DE

INSTRUCTIONS TO AUTHORS

Revista Argentina de Microbiología (RAM) is published by the Asociación Argentina de Microbiología on a quarterly basis. The aimof this journal is to publish current scientific works in the different areas of Microbiology. The Asociación Argentina de Microbiologíareserves the right to use, reproduce and publish the accepted material.

GENERAL REQUIREMENTSManuscripts submitted for publication in RAM should be original research articles. Submitting a manuscript for publication implies

that the authors have been authorized by the corresponding institutions to publish relevant data and that neither the manuscript norone with substantially similar content has been previously published, except in the case of partial presentations at scientific meetings,or is being considered for publication by another journal. If necessary, original data should be submitted to the Editorial Board. Itshould also be made clear that results come from projects approved by the Biosafety and Bioethics Committees of the participatinginstitutions, and that when those results include patient information they conform to the Habeas Data Act.

SUBMISSION OF ORIGINALS AND COPYRIGHTManuscripts should be addressed to the Editorial Board of Revista Argentina de Microbiología accompanied by a cover letter

according to the following model:“Dear Editors of Revista Argentina de Microbiología,As corresponding author (to whom correspondence should be addressed), hereby declare that the coauthors have accepted to be

represented by myself before RAM with regard to the submission of the manuscript “…Title…”, and they are jointly responsible with mefor the contents of this work. Neither this manuscript (nor any other with similar contents) has been previously published or isbeing considered for publication by another journal. I also agree to transfer copyright to Revista Argentina de Microbiología oncepublished”.

All the authors of a manuscript should explicitly authorize its publication and will be responsible for the truthfulness of its contents.They should also express their agreement regarding the choice of one of them to become the corresponding author for editorial pur-poses. Furthermore, they should express their agreement with respect to their position in the list of authors, indicating their academicaffiliation. A change of the corresponding author or in the order of the list of authors shall only be considered by a note signed by allthe authors to that effect. The authors shall also disclose any existing conflict of interests that might affect the manuscript assess-ment on an attached letter. The Editorial Board shall treat all received manuscripts in strict confidence.

Funding sources for research work described in the manuscript, either from public or private institutions, commercial affiliationsor consultancies, as well as co-ownership of patents for business purposes by one or more authors shall be indicated under theAcknowledgements Section.

Contributions will be assessed by the Editorial Board and submitted to the consideration of two scientific referees appointed foreach case. The Editorial Board reserves the right to reject those manuscripts whose contents partially or totally overlap with worksalready published or whose topics are irrelevant to those of RAM. Furthermore, reasons for rejection are non-compliance ofeditorial requirements, ethical violations, low scientific quality and poor use of language, either English or Spanish. The Editorial Boardreserves the right to make all necessary grammatical and style modifications.

ORGANIZATION AND FORMATRAM accepts original articles, brief reports, special articles, microbiological images, editorials and supplements. Careful reading

of the specifications for each special format is recommended in order to choose the most adequate one and therefore, to expeditethe evaluation proceedings.

Manuscripts shall be written in Spanish or English. The Editorial Board encourages authors to use English as their language ofchoice so that their work reaches wider international scope and readership.

Original articles. They are full research papers which must be submitted in accordance to the following sections: Title (in Spanishand English) and Short Title, Abstract and Key words (in Spanish and English), Introduction, Materials and Methods, Results,Discussion, Acknowledgements and References. Manuscripts shall not exceed 8,000 words including all the sections and shallinclude a maximum of 6 tables or figures.

Brief reports. They are less extensive works. They include case reports, descriptions of new tecniques or equipment based onconclusive experimental work. Manuscripts should not be divided into sections and shall not exceed 3,000 words. References shouldbe limited to fifteen citations and tables and figures to a maximum of three. Careful analysis of data presented should be observedso as to avoid their repetition in the text, tables and figures, in order to maintain the typical concision in style that characterizes thistype of articles.

Special articles. They are updates or workshop results on topics of regional and international weight. Their authors must bespecialists in their field of study. Texts must include updated and comprehensive bibliography. Updates may include up to 10,000words, 8 tables or figures. References should be limited to 100 bibliographic citations.

Microbiological images. They may include high-quality pictures of bacteria, fungi, parasites and viruses, from direct observationor staining under optical, electronic or fluorescent microscopy. They may also include other photographic images of microorganisms inculture media, lesions in humans or laboratory animals, x-ray and ultrasound images, computed tomography scans, nuclear magneticresonance, etc. These images having great instructional value though not necessarily ground-breaking, should be accompanied byan explanatory text and indicating arrows when necessary. The set of images should fit one printed page at most. Quality require-ments for images are described under the “Figures” section below.

Letters to the Editor. Letters can include either comments or new data. The comments consist in observations made on the articlespublished in the journal; the latter are aimed at communicating short pieces of work which do not have the appropriate length to bepublished as a complete work or brief report. Both contributions must not exceed 500 words, they should include the title in Spanish


and English, they must not have an abstract, and may contain only one figure or table. The authors’affiliations should be placed at thebottom of the letter. Only the primary affiliation of each author should be indicated. The comments should mention the volume andissue number where the article was published, as well as the complete title and the first author’s last name. Furthermore, the sendershould mention the bibliographical references that support the letter contents. In order to publish a comment, the correspondingauthor of the published article will be first consulted, the final decision and publication will remain at the editor‘s discretion.

Contributions of new facts will be submitted to a specialist editor with knowledge in the subject matter, who along with externalreviewers will assess the information. It should be noted that some journal indexing services do not include Letters to the Editorin their databases.

Editorials. They focus on current scientific topics of special relevance to the scientific community specialized in Microbiology, orare opinion works on scientific policies. This section is the sole domain of the Editoral Board, who will determine editorial policy andauthorship, as well as the general guidelines.

Supplements. They will consist of detailed reviews of a specific subject conducted by one or several scientific organizations oruniversities, as well as abstracts of contributions presented at scientific meetings or universities organized by the Asociación Argentinade Microbiología or any of its divisions or branches (oral communications, boards, lectures, round tables,etc.), and chaired by guesteditors. Topics to be considered in the supplements and general outlines should be approved by the Editorial Board.

Revision of manuscripts under the Supplements section will be in charge of reviewers appointed by the Editorial Board in thecase of extensive reviewing, and of guest editors in the case of abstracts of meetings. Supplements will be wholly financed by thebody organizing the scientific meeting, which will bear in mind that supplements should be distributed among participants to themeetings and all members of the Asociación Argentina de Microbiología either by subscription or on-line. As regards style and for-mat, supplements shall strictly conform to the standards of Revista Argentina de Microbiología in all respects (cover, paper quality,printing, tables and figures, illustrations, etc.), as described in the “Instructions to Authors” section. Supplements correspondingto abstracts of meetings shall include the following information in this order: names of members of the Editorial Board of RevistaArgentina de Microbiología, data about the event (complete title, venue and date), content list of meetings (in Spanish and English),acknowledgements, names of organizing officers and message delivered by the Chair/s. Abstracts consecutively numbered in Arabicnumerals as from 1 (one) should subsequently follow. An alphabetical index of authors and the English and Spanish versions of theinstructions to authors of Revista Argentina de Microbiología should be printed next. The meeting schedule will only be included in theSupplement as a separate leaflet in the form of a triptych.

PREPARATION OF MANUSCRIPTSManuscripts should be written in A4 paper format with 3 cm margins on each side, using Times New Roman font, regular, 12,

and double-spaced. Bold and italics printing types should be used when necessary. Counting from the abstract section of themanuscript onwards, all pages should be consecutively numbered in the lower right margin, as well as the manuscript lines. Thisshall also apply to text, tables, figures, legends and references. Pages including tables, figures and legends shall be included afterthe References section.

Front or title page. The first page shall include the manuscript title using capitals only for the first letter and lowercase for therest, the author’s names (complete first name, initials of other names and surname of all authors); place of work (institution nameand mailing address), and a short title of the work with a maximum of 50 characters as running head. If authors have differentworking places, the institutional affiliation of each autor shall be indicated by numerical superinscriptions added to their names (notbetween parenthesis) to identify each author with his/her affiliation. The name of the corresponding author shall be marked by anasterisk in superscript position next to his/her name. The corresponding author’s e-mail shall also be included. If one or severalauthors have changed his/her/their affiliation, the current affiliation where work was performed should be indicated and thecurrent place of work in a footer.

Abstracts. They will only be included in original articles, brief reports and special articles and shall have a maximum of 250words for original and special articles, and 150 words for brief reports. The first abstract will be written in the language used in thework and the second in the other language. It shall be headed by the complete title of the work. Abstracts shall be followed by a list ofthree to six key words in the corresponding language. Abbreviations and bibliographic citations should be avoided. A clearunderstanding of abstracts should be ensured since they may be separately published by bibliographic services.

Introduction. It should provide sufficient and relevant information on the topic to be analyzed to allow the understanding ofnon-specialized readers. It should also include the hypothesis or scientific background that guided the experimental layout of thework as well as its clearly defined objectives. References mentioned in this section should be the most relevant ones with respectto the topic and must be carefully chosen.

Materials and Methods. This section should include an accurate and detailed description of the methods, equipment, reagentsand procedures used, so that the experiments could be replicated. Frequently used or routine procedures and techniques may bementioned by specific reference (eg., MIC determination by the CLSI methods, 2010). New methods or those especially developedfor the study should be described in detail, as well as infrequent drug sources or biological materials (bacterial, viral, fungal strainsand plasmids, etc.). Trademarks and origin of reagents, culture means and equipment should be indicated in the text the first timethey are mentioned, identifying the commercial brand name, state and country of origin.

Results. It should include the experimental layout and its scientific background as well as the results obtained presented in aconcise way preferably as text, or as table/s or figure/s). Unnecessary use of tables and figures to mention data should be avoidedwhen they could be included in the text. Do not repeat the same information in the text and in the tables or figures. Limit the numberof photographs to the minimum necessary to support experimental results. Number the tables and figures in the order they arementioned in the text. Avoid repetitions and include only most relevant data. In-depth interpretation will be included in the Discus-sion section.

Discussion. Emphasis should be placed on important cutting-edge findings; experimental data should be examined in the lightof previously published works. Conclusions should be presented avoiding unnecessary repetition of data and concepts alreadyincluded in preceding sections. Results and Discussion can be presented as a joint section.

Acknowledgements. This section shall be typed in smaller printing characters than those used in the manuscript (Times NewRoman, 11). Financing sources and names of individuals and/or institutions contributing with reagents, biological material or resultdiscussions should be briefly mentioned.

References. It is convenient that 70 % whenever possible of bibliographic citations in all manuscripts correspond to the last10 years and the remaining 30 % be distributed in key works from previous years. Names of authors cited shall be listed in

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140 Revista Argentina de Microbiología (2012) 44: 00-00REVISTA ARGENTINA DE

INSTRUCTIONS TO AUTHORS

Revista Argentina de Microbiología (RAM) is published by the Asociación Argentina de Microbiología on a quarterly basis. The aimof this journal is to publish current scientific works in the different areas of Microbiology. The Asociación Argentina de Microbiologíareserves the right to use, reproduce and publish the accepted material.

GENERAL REQUIREMENTSManuscripts submitted for publication in RAM should be original research articles. Submitting a manuscript for publication implies

that the authors have been authorized by the corresponding institutions to publish relevant data and that neither the manuscript norone with substantially similar content has been previously published, except in the case of partial presentations at scientific meetings,or is being considered for publication by another journal. If necessary, original data should be submitted to the Editorial Board. Itshould also be made clear that results come from projects approved by the Biosafety and Bioethics Committees of the participatinginstitutions, and that when those results include patient information they conform to the Habeas Data Act.

SUBMISSION OF ORIGINALS AND COPYRIGHTManuscripts should be addressed to the Editorial Board of Revista Argentina de Microbiología accompanied by a cover letter

according to the following model:“Dear Editors of Revista Argentina de Microbiología,As corresponding author (to whom correspondence should be addressed), hereby declare that the coauthors have accepted to be

represented by myself before RAM with regard to the submission of the manuscript “…Title…”, and they are jointly responsible with mefor the contents of this work. Neither this manuscript (nor any other with similar contents) has been previously published or isbeing considered for publication by another journal. I also agree to transfer copyright to Revista Argentina de Microbiología oncepublished”.

All the authors of a manuscript should explicitly authorize its publication and will be responsible for the truthfulness of its contents.They should also express their agreement regarding the choice of one of them to become the corresponding author for editorial pur-poses. Furthermore, they should express their agreement with respect to their position in the list of authors, indicating their academicaffiliation. A change of the corresponding author or in the order of the list of authors shall only be considered by a note signed by allthe authors to that effect. The authors shall also disclose any existing conflict of interests that might affect the manuscript assess-ment on an attached letter. The Editorial Board shall treat all received manuscripts in strict confidence.

Funding sources for research work described in the manuscript, either from public or private institutions, commercial affiliationsor consultancies, as well as co-ownership of patents for business purposes by one or more authors shall be indicated under theAcknowledgements Section.

Contributions will be assessed by the Editorial Board and submitted to the consideration of two scientific referees appointed foreach case. The Editorial Board reserves the right to reject those manuscripts whose contents partially or totally overlap with worksalready published or whose topics are irrelevant to those of RAM. Furthermore, reasons for rejection are non-compliance ofeditorial requirements, ethical violations, low scientific quality and poor use of language, either English or Spanish. The Editorial Boardreserves the right to make all necessary grammatical and style modifications.

ORGANIZATION AND FORMATRAM accepts original articles, brief reports, special articles, microbiological images, editorials and supplements. Careful reading

of the specifications for each special format is recommended in order to choose the most adequate one and therefore, to expeditethe evaluation proceedings.

Manuscripts shall be written in Spanish or English. The Editorial Board encourages authors to use English as their language ofchoice so that their work reaches wider international scope and readership.

Original articles. They are full research papers which must be submitted in accordance to the following sections: Title (in Spanishand English) and Short Title, Abstract and Key words (in Spanish and English), Introduction, Materials and Methods, Results,Discussion, Acknowledgements and References. Manuscripts shall not exceed 8,000 words including all the sections and shallinclude a maximum of 6 tables or figures.

Brief reports. They are less extensive works. They include case reports, descriptions of new tecniques or equipment based onconclusive experimental work. Manuscripts should not be divided into sections and shall not exceed 3,000 words. References shouldbe limited to fifteen citations and tables and figures to a maximum of three. Careful analysis of data presented should be observedso as to avoid their repetition in the text, tables and figures, in order to maintain the typical concision in style that characterizes thistype of articles.

Special articles. They are updates or workshop results on topics of regional and international weight. Their authors must bespecialists in their field of study. Texts must include updated and comprehensive bibliography. Updates may include up to 10,000words, 8 tables or figures. References should be limited to 100 bibliographic citations.

Microbiological images. They may include high-quality pictures of bacteria, fungi, parasites and viruses, from direct observationor staining under optical, electronic or fluorescent microscopy. They may also include other photographic images of microorganisms inculture media, lesions in humans or laboratory animals, x-ray and ultrasound images, computed tomography scans, nuclear magneticresonance, etc. These images having great instructional value though not necessarily ground-breaking, should be accompanied byan explanatory text and indicating arrows when necessary. The set of images should fit one printed page at most. Quality require-ments for images are described under the “Figures” section below.

Letters to the Editor. Letters can include either comments or new data. The comments consist in observations made on the articlespublished in the journal; the latter are aimed at communicating short pieces of work which do not have the appropriate length to bepublished as a complete work or brief report. Both contributions must not exceed 500 words, they should include the title in Spanish


and English, they must not have an abstract, and may contain only one figure or table. The authors’affiliations should be placed at thebottom of the letter. Only the primary affiliation of each author should be indicated. The comments should mention the volume andissue number where the article was published, as well as the complete title and the first author’s last name. Furthermore, the sendershould mention the bibliographical references that support the letter contents. In order to publish a comment, the correspondingauthor of the published article will be first consulted, the final decision and publication will remain at the editor‘s discretion.

Contributions of new facts will be submitted to a specialist editor with knowledge in the subject matter, who along with externalreviewers will assess the information. It should be noted that some journal indexing services do not include Letters to the Editorin their databases.

Editorials. They focus on current scientific topics of special relevance to the scientific community specialized in Microbiology, orare opinion works on scientific policies. This section is the sole domain of the Editoral Board, who will determine editorial policy andauthorship, as well as the general guidelines.

Supplements. They will consist of detailed reviews of a specific subject conducted by one or several scientific organizations oruniversities, as well as abstracts of contributions presented at scientific meetings or universities organized by the Asociación Argentinade Microbiología or any of its divisions or branches (oral communications, boards, lectures, round tables,etc.), and chaired by guesteditors. Topics to be considered in the supplements and general outlines should be approved by the Editorial Board.

Revision of manuscripts under the Supplements section will be in charge of reviewers appointed by the Editorial Board in thecase of extensive reviewing, and of guest editors in the case of abstracts of meetings. Supplements will be wholly financed by thebody organizing the scientific meeting, which will bear in mind that supplements should be distributed among participants to themeetings and all members of the Asociación Argentina de Microbiología either by subscription or on-line. As regards style and for-mat, supplements shall strictly conform to the standards of Revista Argentina de Microbiología in all respects (cover, paper quality,printing, tables and figures, illustrations, etc.), as described in the “Instructions to Authors” section. Supplements correspondingto abstracts of meetings shall include the following information in this order: names of members of the Editorial Board of RevistaArgentina de Microbiología, data about the event (complete title, venue and date), content list of meetings (in Spanish and English),acknowledgements, names of organizing officers and message delivered by the Chair/s. Abstracts consecutively numbered in Arabicnumerals as from 1 (one) should subsequently follow. An alphabetical index of authors and the English and Spanish versions of theinstructions to authors of Revista Argentina de Microbiología should be printed next. The meeting schedule will only be included in theSupplement as a separate leaflet in the form of a triptych.

PREPARATION OF MANUSCRIPTSManuscripts should be written in A4 paper format with 3 cm margins on each side, using Times New Roman font, regular, 12,

and double-spaced. Bold and italics printing types should be used when necessary. Counting from the abstract section of themanuscript onwards, all pages should be consecutively numbered in the lower right margin, as well as the manuscript lines. Thisshall also apply to text, tables, figures, legends and references. Pages including tables, figures and legends shall be included afterthe References section.

Front or title page. The first page shall include the manuscript title using capitals only for the first letter and lowercase for therest, the author’s names (complete first name, initials of other names and surname of all authors); place of work (institution nameand mailing address), and a short title of the work with a maximum of 50 characters as running head. If authors have differentworking places, the institutional affiliation of each autor shall be indicated by numerical superinscriptions added to their names (notbetween parenthesis) to identify each author with his/her affiliation. The name of the corresponding author shall be marked by anasterisk in superscript position next to his/her name. The corresponding author’s e-mail shall also be included. If one or severalauthors have changed his/her/their affiliation, the current affiliation where work was performed should be indicated and thecurrent place of work in a footer.

Abstracts. They will only be included in original articles, brief reports and special articles and shall have a maximum of 250words for original and special articles, and 150 words for brief reports. The first abstract will be written in the language used in thework and the second in the other language. It shall be headed by the complete title of the work. Abstracts shall be followed by a list ofthree to six key words in the corresponding language. Abbreviations and bibliographic citations should be avoided. A clearunderstanding of abstracts should be ensured since they may be separately published by bibliographic services.

Introduction. It should provide sufficient and relevant information on the topic to be analyzed to allow the understanding ofnon-specialized readers. It should also include the hypothesis or scientific background that guided the experimental layout of thework as well as its clearly defined objectives. References mentioned in this section should be the most relevant ones with respectto the topic and must be carefully chosen.

Materials and Methods. This section should include an accurate and detailed description of the methods, equipment, reagentsand procedures used, so that the experiments could be replicated. Frequently used or routine procedures and techniques may bementioned by specific reference (eg., MIC determination by the CLSI methods, 2010). New methods or those especially developedfor the study should be described in detail, as well as infrequent drug sources or biological materials (bacterial, viral, fungal strainsand plasmids, etc.). Trademarks and origin of reagents, culture means and equipment should be indicated in the text the first timethey are mentioned, identifying the commercial brand name, state and country of origin.

Results. It should include the experimental layout and its scientific background as well as the results obtained presented in aconcise way preferably as text, or as table/s or figure/s). Unnecessary use of tables and figures to mention data should be avoidedwhen they could be included in the text. Do not repeat the same information in the text and in the tables or figures. Limit the numberof photographs to the minimum necessary to support experimental results. Number the tables and figures in the order they arementioned in the text. Avoid repetitions and include only most relevant data. In-depth interpretation will be included in the Discus-sion section.

Discussion. Emphasis should be placed on important cutting-edge findings; experimental data should be examined in the lightof previously published works. Conclusions should be presented avoiding unnecessary repetition of data and concepts alreadyincluded in preceding sections. Results and Discussion can be presented as a joint section.

Acknowledgements. This section shall be typed in smaller printing characters than those used in the manuscript (Times NewRoman, 11). Financing sources and names of individuals and/or institutions contributing with reagents, biological material or resultdiscussions should be briefly mentioned.

References. It is convenient that 70 % whenever possible of bibliographic citations in all manuscripts correspond to the last10 years and the remaining 30 % be distributed in key works from previous years. Names of authors cited shall be listed in

343


alphabetical order and numbered in sequence with Arabic numerals on a separate page. Citations in the text should appear innumbers placed between parenthesis, to coincide with the number they have in the References section. Reference to personalcomments and un-published works should be presented as personal communication, written between parenthesis.

References should include the name of all the authors and conform to the following models:a. Periodical publicationsHéritier C, Poirel L, Lambert T, Nordmann P. Contribution of acquired carbapenem-hydrolyzing oxacillinases to carbapenem

resistance in Acinetobacter baumannii. Antimicrob Agents Chemother 2005; 49: 3198-202.Names of journal titles shall be abbreviated according to Index Medicus, a list of which can be obtained at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

sites/entrez?db=journals.b. Chapters of books/modulesMartins Teixeira L, Siqueira Carvalho M da G, Facklam RR. Enterococcus. In: Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Landry ML,

Pfaller MA, editors. Manual of Clinical Microbiology, 9th edition. Washington DC, ASM Press, 2007, p. 430-42.c. Presentations in scientific meetings or other eventsAguilar M, Punschke K, Touati D, Pianzzola MJ. Estudios fisiológicos y genéticos en la bacteria sulfato reductora Desulfoarculus

baarsii. Terceras Jornadas Rioplatenses de Microbiología, 1997, Abstract J2, p. 102, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.d. Presentations in congresses or other scientific meetings in a supplement published by a periodic academic journalFellner MD, Correa RM, Durand K, Teyssié AR, Picconi MA. Análisis del ADN circulante de virus Epstein-Barr (EBV) en pacien-

tes inmunosuprimidos con y sin linfomas asociados. VIII Congreso Argentino de Virología, Abstract 10416. Rev Argent Microbiol2005; 37 Supl 1: 95.

e. Institutional publicationsClinical and Laboratory Standards Institute. Disk diffusion. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; 15th

Informational Supplement, 2005; M100-S15. Wayne, PA, USA.f. ThesesBrizzio A. Aplicación de una PCR múltiple para la identificación de cepas de Staphylococcus aureus toxigénicas. Tesis de Maestría

en Microbiología Molecular 2009. INEI-ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” y Universidad Nacional de San Martín.g. On-line references1. For on-line BooksSullivan CJ, editor. 1999-2001. Fungi: an evolving electronic resource for the microbiological community. ASM Press. (On-line)

http://link.asmusa.de/link/service/books/91090. Accessed 7 September 2001.2. For on line versions of printed journalsvan der Zeiss L, Danziger VB. History of clinical microbiology. Clin Microbiol 1999; 100: 123–234. (On-line)3. For journals only available on-lineZellnitz F, Foley PM. October 1998, posting {or revision} date. History of virology. Am Virol J 1998; 1: 30-50. (On-line) http://

www.avj.html.4. For manuscripts published on line in advance of their publicationZheng Z, Zou J. 5 September 2001. The initial step of the glycerolipid pathway: identification of glycerol-3-phosphate/dihydroxy-

acetone phosphate dual substrate acyltransferases in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 10. 1074/jbc.M104749200.g. Items, references to works or congress abstracts not yet published, about to be published or under revision, personal

communications, existing or pending patents, databases and web pages shall be mentioned in the text between parenthesis asshown:

… similar results (Gómez H, unpublished results)… new detection protocol used (González JL, Submitted for publication).… drug concentrations (López GO, 34th Intersci Conf Antimicrob Agents Chemother, abstr. 114, 1994).… new type of cellulolytic species (Márquez W, personal communication)... previously commented by different sources (http://fcen.uba.edu.ar)Tables. They should be included on separate pages, consecutively numbered with Arabic numerals, preceded by an explanatory

title, with captions and/or the corresponding explanations below. Reference marks for explanations in the form of footnotes shall usesuperscripted Arabic numbers betweeen parenthesis. Lines shall only be used in the external borders of the first and last row, andto separate the headings of the columns from the data. Rows and column borders shall not be inserted.

Figures. They will be included on separate pages with the figure number in the upper left margin and in the order they arementioned in the text. Drawings should be clear enough to ensure suitable reproduction. Numbers, letters and signs shall have theadequate size to be readable once reduced as needed. References to symbols used in the figures shall be included within the samefigure and not in the text legend. Photographs may be in colour or black and white, in JPEG or TIFF formats. Minimum photo resolu-tion requirements are 300 dpi for color and grayscale images and photo prints, 600 dpi for combined art images (letters and images)and 1200 dpi for images composed of lines (graphs and drawings). Note: It is very important to use the adequate file resolution. Allindividual images imported in a graphic file should be in the correct resolution before uploading them. Bear in mind that the higherthe resolution, the larger the file and the longer it will take to send it electronically. Captions to the illustrations should be includedon a separate page, in consecutive order using Arabic numerals.

Aminoacid and nucleic acid sequences. New sequences informed by publication in this journal should be deposited in adatabase and their accession number included in the manuscript, no later than revision stage. The mentioned accession numbersshould be included in a separate paragraph at the end of the Materials and Methods section in the case of original works or at theend of the text in the case of brief reports. The information about currently available databases is the following:

DDBJ: Center for Information Biology and DNA Data Bank of Japan, National Institute of Genetics; e-mail. [email protected];URL, http://www.ddbj.nig.ac.jp



Nucleic acid sequences of up to 50 nucleotides included in the work developed in the manuscript may be presented in any stylewhatsoever. Significantly long sequences should be presented as Figures so as to reduce space, printing those having 80 to 120nucleotides per line in a readable font according to publishing guidelines (16 cm, width of two RAM columns). If possible, the sequence


AAM members $ 120Argentina non members $ 240Latin America USD 100Other countries USD 200

should be divided into blocks of 10 to 20 nucleotides separated by a space or by indicative numbers placed above the sequence.Lines should be numbered, indicating the corresponding number to the left of the first pair on each line. Any necessary commentsshall be bold-typed, underlined or written between parentheses. If it is necessary to include the amino acid sequence encoded bythe nucleotide sequence, it shall be indicated by the use of one-letter symbols accepted as amino acid indicators placed under thefirst nucleotide of the encoding codon.

Abbreviatons. They must be made explicit when mentioned for the first in the text. Units of measurements will be expressedaccording to the standards of Système International dÚnités.

SUBMITTANCE OF MANUSCRIPTSManuscripts may be submitted by e-mail ([email protected]) or ordinary mail to Deán Funes 472, C1214AAD, Ciudad Autónoma

de Buenos Aires, Argentina, including a CD-ROM electronic version, with a label or inscription indicating: title of work, the programand program version used for the text, figures, photographs and the title of all the files it contains.

The complete text of the article should be included in only one file. If there are images, they should be sent on separate files.Besides, it is advisable that capital letters, spaces between words, italics and bold letters are typed in the same way they appear inthe printed version. There should be no spaces before and after subheadings, the text should be justified and tab-setting should beused instead of the spacing bar for columns in tables.

Authors should revise the check list shown after these instructions and see that all the requirements therein have been fulfilled.Before submitting the manuscripts, authors should also examine one of the latest RAM issues in order to verify if all guidelines havebeen followed as regards format and style and to make all necessary modifications if neccessary.

Authors should delete from file properties all kind of information that could identify their authorship.

EDITORIAL PROCESSOnce the manuscript has completed the editorial process and is ready for publication, a file in pdf format with the galley proof shall

be sent by e-mail to the corresponding editor for making the corresponding typing corrections. He/she should not change conceptsnor modify paragraphs which could alter the print format. The document should be printed after making the corrections on the textand sent by fax or as a scanned file by e-mail. Corrections may also be sent by e-mail, clearly specifying the page, paragraph andline to be corrected and should be returned within seven running days of reception, otherwise it shall be assumed that its publicationhas been declined.

At that moment, the amount to be paid for the publication of the article will be sent to the author.Revista Argentina de Microbiología follows the policies for clinical trial registration of the World Health Organization (WHO) and

of the International Committee of Medical Journal Editors (ICMJE), acknowledging the importance of those initiatives for the inter-national dissemination of information on clinical research in open access format. Therefore, only articles referring to trialspreviously registered with an identifying number in one of the Clinical Trial Registers that meet WHO and ICMJE requirements will beaccepted for publication. Their addresses are available in the ICMJE site. The identifying registration number shall be publishedat the end of the abstract.

Publishing charges. Each published page will cost $ 75 or $ 200 (pesos) when the page includes color photographs (AAMmembers in Argentina,), $ 200 o $ 600 (pesos) (AAM non-members in Argentina) and U$S 70 o U$S 180 (in other countries).

The Secretary: Deán Funes 472, (C1214AAD) Ciudad Autónoma de Buenos Aires - Argentina; Tel.: (54-11) 4932-8858 and(54-11) 4932-8948; e-mail. [email protected]; http://www.aam.org.ar

Payment: By check or money order, to the order of Asociación Argentina de Microbiología. Price includes mail postage.

ANNUAL SUBSCRIPTION (4 issues)



































125 250

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alphabetical order and numbered in sequence with Arabic numerals on a separate page. Citations in the text should appear innumbers placed between parenthesis, to coincide with the number they have in the References section. Reference to personalcomments and un-published works should be presented as personal communication, written between parenthesis.

References should include the name of all the authors and conform to the following models:a. Periodical publicationsHéritier C, Poirel L, Lambert T, Nordmann P. Contribution of acquired carbapenem-hydrolyzing oxacillinases to carbapenem

resistance in Acinetobacter baumannii. Antimicrob Agents Chemother 2005; 49: 3198-202.Names of journal titles shall be abbreviated according to Index Medicus, a list of which can be obtained at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

sites/entrez?db=journals.b. Chapters of books/modulesMartins Teixeira L, Siqueira Carvalho M da G, Facklam RR. Enterococcus. In: Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Landry ML,

Pfaller MA, editors. Manual of Clinical Microbiology, 9th edition. Washington DC, ASM Press, 2007, p. 430-42.c. Presentations in scientific meetings or other eventsAguilar M, Punschke K, Touati D, Pianzzola MJ. Estudios fisiológicos y genéticos en la bacteria sulfato reductora Desulfoarculus

baarsii. Terceras Jornadas Rioplatenses de Microbiología, 1997, Abstract J2, p. 102, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.d. Presentations in congresses or other scientific meetings in a supplement published by a periodic academic journalFellner MD, Correa RM, Durand K, Teyssié AR, Picconi MA. Análisis del ADN circulante de virus Epstein-Barr (EBV) en pacien-

tes inmunosuprimidos con y sin linfomas asociados. VIII Congreso Argentino de Virología, Abstract 10416. Rev Argent Microbiol2005; 37 Supl 1: 95.

e. Institutional publicationsClinical and Laboratory Standards Institute. Disk diffusion. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; 15th

Informational Supplement, 2005; M100-S15. Wayne, PA, USA.f. ThesesBrizzio A. Aplicación de una PCR múltiple para la identificación de cepas de Staphylococcus aureus toxigénicas. Tesis de Maestría

en Microbiología Molecular 2009. INEI-ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” y Universidad Nacional de San Martín.g. On-line references1. For on-line BooksSullivan CJ, editor. 1999-2001. Fungi: an evolving electronic resource for the microbiological community. ASM Press. (On-line)

http://link.asmusa.de/link/service/books/91090. Accessed 7 September 2001.2. For on line versions of printed journalsvan der Zeiss L, Danziger VB. History of clinical microbiology. Clin Microbiol 1999; 100: 123–234. (On-line)3. For journals only available on-lineZellnitz F, Foley PM. October 1998, posting {or revision} date. History of virology. Am Virol J 1998; 1: 30-50. (On-line) http://

www.avj.html.4. For manuscripts published on line in advance of their publicationZheng Z, Zou J. 5 September 2001. The initial step of the glycerolipid pathway: identification of glycerol-3-phosphate/dihydroxy-

acetone phosphate dual substrate acyltransferases in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 10. 1074/jbc.M104749200.g. Items, references to works or congress abstracts not yet published, about to be published or under revision, personal

communications, existing or pending patents, databases and web pages shall be mentioned in the text between parenthesis asshown:

… similar results (Gómez H, unpublished results)… new detection protocol used (González JL, Submitted for publication).… drug concentrations (López GO, 34th Intersci Conf Antimicrob Agents Chemother, abstr. 114, 1994).… new type of cellulolytic species (Márquez W, personal communication)... previously commented by different sources (http://fcen.uba.edu.ar)Tables. They should be included on separate pages, consecutively numbered with Arabic numerals, preceded by an explanatory

title, with captions and/or the corresponding explanations below. Reference marks for explanations in the form of footnotes shall usesuperscripted Arabic numbers betweeen parenthesis. Lines shall only be used in the external borders of the first and last row, andto separate the headings of the columns from the data. Rows and column borders shall not be inserted.

Figures. They will be included on separate pages with the figure number in the upper left margin and in the order they arementioned in the text. Drawings should be clear enough to ensure suitable reproduction. Numbers, letters and signs shall have theadequate size to be readable once reduced as needed. References to symbols used in the figures shall be included within the samefigure and not in the text legend. Photographs may be in colour or black and white, in JPEG or TIFF formats. Minimum photo resolu-tion requirements are 300 dpi for color and grayscale images and photo prints, 600 dpi for combined art images (letters and images)and 1200 dpi for images composed of lines (graphs and drawings). Note: It is very important to use the adequate file resolution. Allindividual images imported in a graphic file should be in the correct resolution before uploading them. Bear in mind that the higherthe resolution, the larger the file and the longer it will take to send it electronically. Captions to the illustrations should be includedon a separate page, in consecutive order using Arabic numerals.

Aminoacid and nucleic acid sequences. New sequences informed by publication in this journal should be deposited in adatabase and their accession number included in the manuscript, no later than revision stage. The mentioned accession numbersshould be included in a separate paragraph at the end of the Materials and Methods section in the case of original works or at theend of the text in the case of brief reports. The information about currently available databases is the following:

DDBJ: Center for Information Biology and DNA Data Bank of Japan, National Institute of Genetics; e-mail. [email protected];URL, http://www.ddbj.nig.ac.jp



Nucleic acid sequences of up to 50 nucleotides included in the work developed in the manuscript may be presented in any stylewhatsoever. Significantly long sequences should be presented as Figures so as to reduce space, printing those having 80 to 120nucleotides per line in a readable font according to publishing guidelines (16 cm, width of two RAM columns). If possible, the sequence

Option 1:

With Visa, Mastercard or American Express credit cards, indicating:Card No.Expiry dateCard security codeCardholder’ name, surname and national ID number Amount of authorized payment.

Option 2:

Money transfer to Banco de la Nación ArgentinaSucursal Bulnes (0009)Av. Rivadavia 3726, Buenos Aires, Argentina.Current Account No. 69700035/74Holder: Asociación Argentina de MicrobiologíaSwift Code: NACNARBA

Option 3:

Western UnionTransfer payable to Néstor Luis GarínD.N.I. Nº 11176443Informing: Transaction No. or MTCNto: [email protected]




















































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200400150300

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78 Revista Argentina de Microbiología (2010) 42: ---ISSN 0325-7541Revista Argentina de Microbiología (2010) 42: 78

Manuscript Preparation ChecklistThe following checklist is designed to help you prepare and revise your manuscript according to journal style and format. For additional details, consult the Instructions to Authors (http://www.aam.org.ar). Manuscripts not following the specified format shall be returned to their authors, delaying the evaluation and publication process.

Title Yes No Does not apply

Includes title in Spanish Includes title in English Includes abbreviated title

Authors Identifies corresponding author Includes corresponding author’s address, telephone number and e-mail adress Includes all the authors Includes authors’ affiliations Includes cover letter for manuscript submission signed by corresponding author

AbstractsEach abstract does not exceed the maximum number of words allowed Includes an abstract in Spanish Includes key words in Spanish Includes an abstract in English Includes key words in English

TextDoes not exceed the maximum number of words allowed Does not exceed the maximum number of tables and/or figures allowed Has the corresponding sections Makes correct use of abbreviations Mentions trademarks and origin of reagents, culture media and equipment Mentions accession number of new amino acids and nucleic acids sequences

Tables and FiguresEach of them is included on a separate page Titles are clear and concise Legends are included Citations in the text correspond with the numbers of each table and figure Abbreviations are explained as a table footnote Figures and photographs are sent in attached files

References Strictly adheres to the format required by the journal Items in this section are listed in alphabetical order Citations in the text correspond with the numbers appearing in this section

Acknowledgements Funding sources are mentioned


347

XIII CONGRESO ARGENTINO DE MICROBIOLOGÍA 2013 – CAM 2013II CONGRESO DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA Y AMBIENTAL (DIMAyA)

65° Aniversario de la AAM

23 al 26 de septiembre de 2013

Lugar: Palais Rouge. J. Salguero 1443. Ciudad Autónoma de Buenos Aires

Fecha límite de presentación de trabajos: 31 de mayo de 2013

Comité organizador XIII CAM 2013

Presidente: Rodolfo Campos Vicepresidentes: Marta Rivas, Marta Rocchi Secretaria: María I. G. Fernández Prosecretaria: Lucía Cavallaro Secretaría Científica: Fernando Goldbaum, Jorgelina SmayevskySecretaría Técnica: Alfredo Martínez

Comité Científico

Graciela Davel, Liliana Fernandez Canigia, María J. Gallego, Andrea Mangano, Marcelo O. Masana, Pablo Power, Laura Riera, Diego SaukaComité técnico: Silvia Raffellini, Adriana SucariÁrea FinanzasTesorero: Teresa Bianchi Protesorero: Paula Gagetti Vocales: Patricia Caballero (Cuyo), Laura Decca (Córdoba), Luis A. Merino (NEA), Isabel Borges de Kestelman (NOA), Perla Hermida Lucena (Rosario), Marina Rico (S Fe), Mabel Rizzo (BBlanca)Comité de DifusiónMaría Soledad Ramírez, María Paula Quiroga

Comité organizador II DIMAyA 2013

Presidente: Diego SaukaVicepresidente: Diego LibkindSecretaria: Susana VazquezSecretaría Científica: Fabricio CassánSecretaría Técnica: Mónica BaldiniVocales: Marcelo Berretta, Rosana Massa, Claudio Penna, Inés García de Salamone, Silvia Toresani

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TEMARIO PRELIMINAR CAM 2013

Sesiones principales

Escenario de prevención y tratamiento de enfermedades huérfanas y olvidadas • en ArgentinaCoordinadores: Marcelo Abril – Alejandro Krolewiecki

Estado actual del diagnóstico microbiológico por métodos moleculares• Coordinador: Marisa Farber – Alejandro Schijman

Un enfoque integrador sobre la resistencia a los antibióticos: de la investigación • a la clínicaCoordinador: Alejandro VilaRobert Bonomo. Un renacimiento de los inhibidores de beta lactamasas: del laboratorio a la cabecera del paciente. James Spencer. Resistencia a carbapenemes en patógenos gram negativos oportunistas: el desafío de las metalo beta lactamasas. Shahriar Mobashery. Como Sa se transformó en SAMR. Utilización de herramientas de proteómica y genómica para la identificación • microbiana y análisis taxonómicos de comunidades Coordinadores: Antonio Lagares – Martín Vázquez

Innovación en el desarrollo de vacunas• Coordinador: Juliana Cassataro

Biotecnología en Microbiología• Coordinadores: Diego de Mendoza – Diego Comercio

Sesiones secundarias

Enfermedades transmitidas por alimentos: de la prevención a la clínica• Coordinadores: Marta Rivas – Julián Antman

La ubicuidad de los • biofilms y sus implicanciasCoordinadores: Ángeles Zorreguieta – José Degrossi

Actualización en el diagnóstico microbiológico y tratamiento de las infecciones • del paciente con transplante de órganos sólidosCoordinadores: Iris Agorio – Laura BarcánBeatriz Livellara. Monitoreo de infecciones virales en TOS: CMV, EBV

Alejandro Schijman. Nuevas técnicas para el diagnóstico y seguimiento de Chagas en TOS Silvia Relloso. Infecciones bacterianas y micóticas en TOS Laura Barcán. Visión clínica, importancia del diagnóstico, incidencia de resistencia en evolución clínica

Un nuevo escenario en la infección por HIV• Coordinadores: Pedro Cahn – Horacio SalomónPedro Cahn: Tratamiento como prevención Adriana Durán: Perfil de los nuevos diagnósticos en la Ciudad de Buenos Aires María Belen Bouzas: Nuevos algoritmos diagnósticos en la infección por HIV Una visión integral en la prevención de la infección por HPV y cáncer de cérvix• Coordinadores: María Alejandra Picconi – Peter JF SnijdersPeter JF Snijders. Nuevas estrategias en el tamizaje para detección de lesiones precursoras del cáncer de cérvix Silvina Arrossi. Incorporación de la detección del ADN de HPV Carla Vizzotti. Introducción de la vacuna contra HPV en el calendario de vacunación de Argentina: logros y desafíos Nuevos antifúngicos• Coordinadores: Gustavo Giusiano – Susana CórdobaNora Tiraboschi. Problemáticas de la terapéutica actual: tratamiento con azólicos en el paciente HIV. Interacción entre las drogas actualmente disponibles. Candidiasis con cepas resistentes en pacientes con insuficiencia renal y hepáticaCecilia Dignani. Anfotericina desoxicolato versus nuevas fórmulas para el tratamiento de micosis invasoras por hongos miceliales en pacientes neutropénicosSusana Córdoba. Actividad in vitro de los nuevos antifúngicos en cepas argentinasJorge Finquelievich. Nuevos triazólicos. Es necesario el monitoreo sérico?

Formación en microbiología• Coordinadores: Esteban C. Serra – Juan D. ClausLuis A. Merino. Entornos virtuales en la enseñanza de la microbiología: uso de trabajos prácticos en línea.Sixto R. Costamagna. Enseñanza-aprendizaje de la parasitología: diferentes enfoques considerando el qué, para qué y para quienes, en las carreras de grado y en los post-grados.Diana Vullo. Mejoramiento de la enseñanza de la microbiología en todos los niveles: ¿cuál es el camino que sigue la American Society for Microbiology (ASM) para hacerlo real?

La vacunología como ciencia• Coordinadores: Delia Enría – Daniela HozborCiro A. de Quadros. Vacunas: pasado, presente y futuroCarla Vizzotti. Inmunizaciones: el impacto de una política de estado en la salud públicaChristian Mandl. Creando una línea innovativa de vacunas

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TEMARIO PRELIMINAR CAM 2013

Sesiones principales

Escenario de prevención y tratamiento de enfermedades huérfanas y olvidadas • en ArgentinaCoordinadores: Marcelo Abril – Alejandro Krolewiecki

Estado actual del diagnóstico microbiológico por métodos moleculares• Coordinador: Marisa Farber – Alejandro Schijman

Un enfoque integrador sobre la resistencia a los antibióticos: de la investigación • a la clínicaCoordinador: Alejandro VilaRobert Bonomo. Un renacimiento de los inhibidores de beta lactamasas: del laboratorio a la cabecera del paciente. James Spencer. Resistencia a carbapenemes en patógenos gram negativos oportunistas: el desafío de las metalo beta lactamasas. Shahriar Mobashery. Como Sa se transformó en SAMR. Utilización de herramientas de proteómica y genómica para la identificación • microbiana y análisis taxonómicos de comunidades Coordinadores: Antonio Lagares – Martín Vázquez

Innovación en el desarrollo de vacunas• Coordinador: Juliana Cassataro

Biotecnología en Microbiología• Coordinadores: Diego de Mendoza – Diego Comercio

Sesiones secundarias

Enfermedades transmitidas por alimentos: de la prevención a la clínica• Coordinadores: Marta Rivas – Julián Antman

La ubicuidad de los • biofilms y sus implicanciasCoordinadores: Ángeles Zorreguieta – José Degrossi

Actualización en el diagnóstico microbiológico y tratamiento de las infecciones • del paciente con transplante de órganos sólidosCoordinadores: Iris Agorio – Laura BarcánBeatriz Livellara. Monitoreo de infecciones virales en TOS: CMV, EBV

Alejandro Schijman. Nuevas técnicas para el diagnóstico y seguimiento de Chagas en TOS Silvia Relloso. Infecciones bacterianas y micóticas en TOS Laura Barcán. Visión clínica, importancia del diagnóstico, incidencia de resistencia en evolución clínica

Un nuevo escenario en la infección por HIV• Coordinadores: Pedro Cahn – Horacio SalomónPedro Cahn: Tratamiento como prevención Adriana Durán: Perfil de los nuevos diagnósticos en la Ciudad de Buenos Aires María Belen Bouzas: Nuevos algoritmos diagnósticos en la infección por HIV Una visión integral en la prevención de la infección por HPV y cáncer de cérvix• Coordinadores: María Alejandra Picconi – Peter JF SnijdersPeter JF Snijders. Nuevas estrategias en el tamizaje para detección de lesiones precursoras del cáncer de cérvix Silvina Arrossi. Incorporación de la detección del ADN de HPV Carla Vizzotti. Introducción de la vacuna contra HPV en el calendario de vacunación de Argentina: logros y desafíos Nuevos antifúngicos• Coordinadores: Gustavo Giusiano – Susana CórdobaNora Tiraboschi. Problemáticas de la terapéutica actual: tratamiento con azólicos en el paciente HIV. Interacción entre las drogas actualmente disponibles. Candidiasis con cepas resistentes en pacientes con insuficiencia renal y hepáticaCecilia Dignani. Anfotericina desoxicolato versus nuevas fórmulas para el tratamiento de micosis invasoras por hongos miceliales en pacientes neutropénicosSusana Córdoba. Actividad in vitro de los nuevos antifúngicos en cepas argentinasJorge Finquelievich. Nuevos triazólicos. Es necesario el monitoreo sérico?

Formación en microbiología• Coordinadores: Esteban C. Serra – Juan D. ClausLuis A. Merino. Entornos virtuales en la enseñanza de la microbiología: uso de trabajos prácticos en línea.Sixto R. Costamagna. Enseñanza-aprendizaje de la parasitología: diferentes enfoques considerando el qué, para qué y para quienes, en las carreras de grado y en los post-grados.Diana Vullo. Mejoramiento de la enseñanza de la microbiología en todos los niveles: ¿cuál es el camino que sigue la American Society for Microbiology (ASM) para hacerlo real?

La vacunología como ciencia• Coordinadores: Delia Enría – Daniela HozborCiro A. de Quadros. Vacunas: pasado, presente y futuroCarla Vizzotti. Inmunizaciones: el impacto de una política de estado en la salud públicaChristian Mandl. Creando una línea innovativa de vacunas

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Micobacteriosis: epidemiología, diagnóstico clínico y microbiológico, tratamiento • y prevenciónCoordinadores: Isabel N. de Kantor – Angel CataldiViviana Ritacco. Recientes aportes de la biología molecular a la epidemiología de las micobacterias Martín Zumárraga. Investigaciones cooperativas sobre micobacteriosis zoonóticas en América Latina. Estado actual y perspectivas Ana María Reniero. Complejo Mycobacterium avium y micobacterias ambientales. Virulencia, respuesta inmune, diagnóstico etiológico y drogas activas para el tratamiento.Fernando A. Paolicchi. Paratuberculosis (Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis). Estrategias diagnósticas y control en bovinos. Costo beneficio. ¿Posible rol zoonótico?

Nuevos y viejos antibióticos: un dilema del siglo XXI• Coordinadores: Gabriel Gutkind – Gabriel Levy Hara

Nuevos desafíos en infecciones de transmisión sexual (ITS)• Coordinadores: María B. Bouzas – Patricia Galarza

Mesas redondas

Vigilancia de virosis emergentes y reemergentes y su impacto en el medio • ambiente y la biodiversidad de especiesCoordinadores: Silvana Levis – Juan ArbizaElizabeth Hunsperger: Dengue y otros flavivirus de importancia sanitaria en las Américas Oscar Lencinas. Rabia: situación en Argentina Marta Contigiani. Encefalitis de San Luis Microorganismos • ex – situ: manejo de colecciones, transferencias de material y patentesCoordinadores: Graciela Davel – Raquel TerragnoGladys I. Martos. Buenas prácticas en el gerenciamiento de Colecciones de CultivoRamiro Picasso. Acuerdos de transferencia de material biológico Fernando Ardila. Microorganismos y patentes: normativa nacional y convenios internacionales Cronobacter sakazakii• , un patógeno emergenteCoordinadores: Sergio Epszteyn – Mariana PichelMariana Pichel. Herramientas moleculares para el diagnóstico y subtipificación de Cronobacter

Viviana Vilches. Primeros aislamientos clínicos de Cronobacter spp. en Argentina Sergio Epszteyn. Cronobacter sakazakii en fórmulas lácteas infantiles en Argentina

Modificación en la distribución geográfica de infecciones endémicas en • ArgentinaCoordinadores: Daniel Salomón – Alfredo C. Seijo

Probióticos: efectos clínicos, aplicaciones tecnológicas y aspectos regulatorios• Coordinadores: Jorge Reinheimer – Gabriela PerdigónPablo Renzulli. Óptica industrial sobre el tema quesos probióticos Ana Binetti. EPS de bacterias lácticas y probióticas: aspectos tecnológicos y funcionalesCarolina Maldonado Galdeano. Probióticos en la prevención de infecciones por enterobacterias. Mecanismos inducidos Esteban Carmuega. Probióticos y salud: estudios realizados en humanos Diagnóstico, tratamiento y control de las infecciones intrahospitalarias• Coordinadores: Ángela Famiglietti – Rodolfo QuirosRolando N. Soloaga: Métodos diagnósticos de las infecciones intrahospitalarias (bacteriemias asociadas a accesos vasculares centrales, neumonía asociada al respirador e infección asociada a cáteter urinario)Griselda Almada: Prevención y control de la infecciones intrahospitalaria Ellen Jo Baron: Control de las infecciones intrahospitalarias: vigilancia activa por métodos moleculares

Influenza animal y humana• Coordinadores: Esla Baumeister – Ariel Pereda

Actualización en nomenclatura y taxonomía fúngica• Coordinadores: Cecilia C. Carmarán – Nicolás RefojoAndrea Romero. Cambios en la nomenclatura fúngica Diego Libkind. Nuevos desafíos para la taxonomía y sistemática de levaduras Ruben Abrantes. Impacto de los cambios taxonómicos en la identificación de hongos miceliales asociados a infecciones humanas Evaluación del bioriesgo• Coordinadores: Sandra Pampuro – Edith VallesSandra Pampuro. Conceptos y definicionesEdith Valles. Relación con la biocustodiaLeonora Nusblat. Inportancia y utilidadAna María Nicola. Relación con la bioseguridad

Antibióticos: mecanismos de acción y resistencia• Coordinadores y Disertantes: Faltan confirmar

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Micobacteriosis: epidemiología, diagnóstico clínico y microbiológico, tratamiento • y prevenciónCoordinadores: Isabel N. de Kantor – Angel CataldiViviana Ritacco. Recientes aportes de la biología molecular a la epidemiología de las micobacterias Martín Zumárraga. Investigaciones cooperativas sobre micobacteriosis zoonóticas en América Latina. Estado actual y perspectivas Ana María Reniero. Complejo Mycobacterium avium y micobacterias ambientales. Virulencia, respuesta inmune, diagnóstico etiológico y drogas activas para el tratamiento.Fernando A. Paolicchi. Paratuberculosis (Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis). Estrategias diagnósticas y control en bovinos. Costo beneficio. ¿Posible rol zoonótico?

Nuevos y viejos antibióticos: un dilema del siglo XXI• Coordinadores: Gabriel Gutkind – Gabriel Levy Hara

Nuevos desafíos en infecciones de transmisión sexual (ITS)• Coordinadores: María B. Bouzas – Patricia Galarza

Mesas redondas

Vigilancia de virosis emergentes y reemergentes y su impacto en el medio • ambiente y la biodiversidad de especiesCoordinadores: Silvana Levis – Juan ArbizaElizabeth Hunsperger: Dengue y otros flavivirus de importancia sanitaria en las Américas Oscar Lencinas. Rabia: situación en Argentina Marta Contigiani. Encefalitis de San Luis Microorganismos • ex – situ: manejo de colecciones, transferencias de material y patentesCoordinadores: Graciela Davel – Raquel TerragnoGladys I. Martos. Buenas prácticas en el gerenciamiento de Colecciones de CultivoRamiro Picasso. Acuerdos de transferencia de material biológico Fernando Ardila. Microorganismos y patentes: normativa nacional y convenios internacionales Cronobacter sakazakii• , un patógeno emergenteCoordinadores: Sergio Epszteyn – Mariana PichelMariana Pichel. Herramientas moleculares para el diagnóstico y subtipificación de Cronobacter

Viviana Vilches. Primeros aislamientos clínicos de Cronobacter spp. en Argentina Sergio Epszteyn. Cronobacter sakazakii en fórmulas lácteas infantiles en Argentina

Modificación en la distribución geográfica de infecciones endémicas en • ArgentinaCoordinadores: Daniel Salomón – Alfredo C. Seijo

Probióticos: efectos clínicos, aplicaciones tecnológicas y aspectos regulatorios• Coordinadores: Jorge Reinheimer – Gabriela PerdigónPablo Renzulli. Óptica industrial sobre el tema quesos probióticos Ana Binetti. EPS de bacterias lácticas y probióticas: aspectos tecnológicos y funcionalesCarolina Maldonado Galdeano. Probióticos en la prevención de infecciones por enterobacterias. Mecanismos inducidos Esteban Carmuega. Probióticos y salud: estudios realizados en humanos Diagnóstico, tratamiento y control de las infecciones intrahospitalarias• Coordinadores: Ángela Famiglietti – Rodolfo QuirosRolando N. Soloaga: Métodos diagnósticos de las infecciones intrahospitalarias (bacteriemias asociadas a accesos vasculares centrales, neumonía asociada al respirador e infección asociada a cáteter urinario)Griselda Almada: Prevención y control de la infecciones intrahospitalaria Ellen Jo Baron: Control de las infecciones intrahospitalarias: vigilancia activa por métodos moleculares

Influenza animal y humana• Coordinadores: Esla Baumeister – Ariel Pereda

Actualización en nomenclatura y taxonomía fúngica• Coordinadores: Cecilia C. Carmarán – Nicolás RefojoAndrea Romero. Cambios en la nomenclatura fúngica Diego Libkind. Nuevos desafíos para la taxonomía y sistemática de levaduras Ruben Abrantes. Impacto de los cambios taxonómicos en la identificación de hongos miceliales asociados a infecciones humanas Evaluación del bioriesgo• Coordinadores: Sandra Pampuro – Edith VallesSandra Pampuro. Conceptos y definicionesEdith Valles. Relación con la biocustodiaLeonora Nusblat. Inportancia y utilidadAna María Nicola. Relación con la bioseguridad

Antibióticos: mecanismos de acción y resistencia• Coordinadores y Disertantes: Faltan confirmar

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TEMARIO PRELIMINAR II CONGRESO DIMAyA

Área agrícolaControl microbianos de insectos• Coordinadores: Marcelo Berretta – Nicolás PedriniControl biológico de fitopatógenos de impacto en agricultura• Coordinadores: Viviana Barrera – María Alejandra RodríguezAbordajes metodológicos para el estudio de la interacción microorganismo-• planta-sueloCoordinadores: Jorge Angelini – Fabricio Cassán

Área ambientalMicroorganismos de ambientes extremos• Coordinadores: Silvia Coria – Virginia de GarcíaEl rol de los microorganismos en la producción de bioenergía• Coordinadores: Héctor Alvarez – Marisa GómezLos microorganismos y su relación con la sanidad de cuerpos de agua dulce• Coordinadores: Mónica Baldini – Delia OrianiEstudio funcional de las comunidades microbianas• Coordinadores: Eleonora Campos – Susana VázquezLevaduras indígenas para la producción de bebidas fermentadas• Coordinadores: Christian Lopes – Mariana Combina

Invitados extranjeros confirmados hasta la fecha: Patrick Murray (EEUU) – Ellen Jo Baron (EEUU) - Robert A. Bonomo (EEUU) – James Spencer (Inglaterra) – Shahriar Mobashery (EEUU) – Peter J. F. Snijders (Holanda) – Rafael Cantón (España) – Juan Arbiza (Uruguay) – Elizabeth Hunsperger (CDC/EEUU) – Ciro de Quadros (Instituto Sabin) Aranceles de Inscripción al Congreso. Los aranceles son en pesos argentinos.Hasta el 31 de marzo de 2013: socios $500; no socios $1000; estudiantes socios $250; no socios $500.Hasta el 30 de junio de 2013: socios $650; no socios $1300; estudiantes socios $325; no socios $750Desde el 23 de septiembre de 2013: socios $800; no socios $1600; estudiantes socios $400; no socios $800.

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Documents

Nº4 VOL 44 2012y de sus mascotas en la provincia de La Pampa, Argentina Ana L. Tamborini, Luis M. Casabona, María R. Viñas, Valeria Asato, Alicia Hoffer, María I. Farace, María