UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO MATEMATIČKI FAKULTET, ODSEK ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

Nataša V. Cvetković

FERMENTACIJA SOJINOG MLEKA

PROBIOTSKOM STARTER KULTUROM

MASTER RAD

Niš, 2015.

UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO MATEMATIČKI FAKULTET, ODSEK ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

MASTER RAD

FERMENTACIJA SOJINOG MLEKA

PROBIOTSKOM STARTER KULTUROM

Kandidat: Mentor:

Nataša Cvetković dr. Nataša Joković

Niš, 2015.

UNIVERSITY OF NIS

FACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICS, DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY

MASTER THESIS

SOYBEAN MILK FERMENTATION WITH

PROBIOTIC STARTER CULTURE

Candidate: Mentor:

Nataša Cvetković Nataša Joković, PhD

Niš, 2015.

Biografija

Ime i Prezime: Nataša Cvetković

Datum rodjenja: 19.12.1991.

Mesto rodjenja: Niš

Osnovna Škola: Dositej Obradović, Niš 1998 - 2006

Srednja škola: Gimnazija ”Svetozar Marković” Niš

2006 – 2010.

Osnovne studije: PMF Niš, Odsek za biologiju i ekologiju

2010 – 2013.

Master studije: PMF Niš, Odsek za biologiju

2013 – 2015.

Sažetak

U ovom radu je ispitivana mogućnost rasta probiotske starter kulture ABY-6

sastavljene od bakterija Streptococcus thermophilus (80%), Lactobacillus acidophilus

(13%), Bifdobacterium bifidum (6%) i Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus (1%),

u sojinom mleku. Proces fermentacije je praćen merenjem pH vrednosti

fermentacionih podloga, dok je broj bakterija tokom fermentacije određivan metodom

sukcesivnog razblaživanja na M17 i MRS podlozi. ABY-6 starter kultura smanjuje pH

vrednost sojinog mleka sa 6, 4 na 4, 03 nakon 24 sata fermentacije tako da je sojino

mleko dobar supstrat za rast ove kulture. Ispitivanjem uticaja inokuluma (1% , 3% i

6%) na proces fermentacije, pokazano je da količina inokuluma ne utiče značajno na

pH vrednost sojinog mleka nakon 4,5 sata fermentacije kao ni na broj ćelija određenih

na M17 podlozi. Broj ćelija na MRS podlozi je veći sa povećanjem količine

inokuluma. Broj ćelija streptokoka određivan na M17 podlozi bio je veći nakon 4,5

sata fermentacije u odnosu na broj bakterija na MRS podlozi. U daljem radu, ispitivan

je uticaj dodatka surutke u sojino mleko na proces fermentacije. Rezultati su pokazali

da surutka ne utiče značajno na pH vrednost fermentisanog sojinog mleka, kao ni na

broj bakterijskih ćelija na M17 i MRS podlozi. Fermentisano sojino mleko i sojino

mleko sa dodatkom surutke imaju stabilne vrednosti pH i broja ćelija u periodu od 20

dana čuvanja na 4C.

Ključne reči: sojino mleko, probiotska starter kultura, surutka

Abstrakt

The growth of probiotic starter culture ABY-6 consisting of Streptococcus

thermophilus (80%), Lactobacillus acidophilus (13%), Bifdobacterium bifidum (6%)

and Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus (1%), in the soymilk was studied. The

fermentation process was monitored by measuring the pH value of the fermentation

media, while the number of bacteria during fermentation was determined by the

method of successive dilutions on M17 and MRS media. ABY-6 starter culture

reduced the pH of soymilk from 6, 4 to 4, 03 after 24 hours of fermentation, so that

the soymilk is a good substrate for the growth of this culture. Investigation of the

effect of the inoculum (1%, 3% and 6%) on the fermentation process, showed that the

amount of the inoculum didn’t affect the pH of soymilk significantly after 4.5 hours of

fermentation as well as the number of cells on M17 medium. Number of cells on

MRS medium was greater with increasing amounts of inoculum. The number of

streptococcal cells determined on M17 medium was higher than number of cells on

MRS medium after 4.5 hours of fermentation. In further work, we investigated the

influence of whey addition on fermentation of soymilk. The results showed that the

whey didn’t affect significantly the pH values of the fermented soymilk, as well as the

number of bacterial cells determined on the M17 and MRS media. Fermented soymilk

and soymilk with added whey had a stable pH values and the number of cells over a

period of 20 days of storage at 4C.

Keywords: soymilk, probiotic starter culture, whey

Sadržaj

1. Uvod ........................................................................................................................... 8

1.1. Funkcionalna hrana ............................................................................................. 9

1.1.2. Probiotska hrana ......................................................................................... 10

1.2. Probiotske bakterije .......................................................................................... 14

1.2.1. Bakterije mlečne kiseline ........................................................................... 16

1.2.2. Bifidobakterije ........................................................................................... 19

2. Fermentisana hrana .................................................................................................. 20

2.1. Soja ................................................................................................................... 22

2.1.2. Fermentisani proizvodi od soje .................................................................. 23

2.1.3. Sojino mleko .............................................................................................. 24

3.Ciljevi rada ................................................................................................................ 26

4.Materijali i metode .................................................................................................... 27

4.1.Materijal ............................................................................................................. 27

4.1.1 Fermentacione podloge ............................................................................... 27

4.1.2 Probiotska kultura i podloge ....................................................................... 27

4.2.Metode rada ....................................................................................................... 28

4.2.1 Fermentacija sojinog mleka ........................................................................ 28

4.2.2 Merenje pH vrednosti ................................................................................. 28

4.2.3 Brojanje bakterijskih ćelija ......................................................................... 28

5.Rezultati i diskusija ................................................................................................... 29

5.1. Rast probiotske kulture u sojinom mleku ..................................................... 29

4.2 Uticaj inokuluma na rast probiotske kulture .................................................. 31

4.3 Uticaj dodavanja surutke na rast probiotske culture .......................................... 34

4.4 Stabilnost fermentisanih napitaka tokom skladištenja ....................................... 36

Zaključci: ..................................................................................................................... 38

Literatura ...................................................................................................................... 39

8

1. Uvod

Funkcionalne namirnice, usled svog specifičnog i izmenjenog sastava u

odnosu na klasične namirnice iste vrste, imaju pozitivne efekte na zdravlje ljudi. U

funkcionalnu hranu spada i probiotska hrana ( Huffnagle, 2008.). Probiotik je

proizvod koji sadrži žive organizme koji ingestijom (od strane ljudi i životinja) u

određenom broju pokazuju pozitivne efekte po zdravlje iznad delovanja vezanih za

normalnu ishranu. Probiotici su nam uglavnom dostupni putem kiselo-mlečnih

proizvoda koji imaju veliku ulogu u ishrani zdravih i bolesnih ljudi.

Na području Srbije su zastupljeni fermentisani mlečni napitci sa probiotskim

bakterijama mada u poslednje vreme sve je učestalija upotreba soje i sojinih

proizvoda u ishrani. Soja i njeni proizvodi veoma su cenjeni i traženi u svetu zbog

visokog sadržaja nezasićenih masnih kiselina, lecitina, izoflavona i minerala (gvožde,

magnezujum, kalijum). Od svih proizvoda posebnu pažnju privlači sojino mleko

(Nenadić, 1982.).

9

1.1. Funkcionalna hrana

Funkcionalna hrana je hrana koja ima povoljan uticaj na ljudsko zdravlje

pored svojih uobičajenih nutritivnih funkcija. To je hrana koja sadrži biološki aktivna

jedinjenja koja je čine funkcionalnom jer pozitivno utiču na određene funkcije u

organizmu, što je naučno potvrđeno. Ove namirnice se, najčešće, koriste u očuvanju

optimalnih gastrointestinalnih funkcija, podizanju nivoa aktivnosti antioksidativne

odbrane organizma, smanjenju faktora rizika uključenih u etiologiju

kardiovaskularnih oboljenja i kancera (Martirosyan, 2011.).

Funkcionalnom hranom se može smatrati:

Namirnica kojoj je komponenta sa povoljnim delovanjem dodata (probiotik,

biljni steroli), ili kojoj je komponenta sa nepovoljnim delovanjem oduzeta

(smanjenje sadržaja zasićenih masti, uklanjanje fitata enzimskim putem)

Namirnica u kojoj je priroda jedne ili više komponenti modifikovana

(hidroliza proteina mleka u bebi formulama);

Uobičajena namirnica za koju se pokazalo da ima povoljan efekat po ljudsko

zdravlje (proizvodi od ovsa);

Novi proizvod sa funkcionalnim sastojkom.

Pozitivne efekte funkcionalne namirnice često pokazuju usled prisustva jedne

ili više bioaktivnih komponenti u svom sastavu, za koje je naučnim istraživanjima

utvrdjeno da, u količinama u kojima su prisutne u namirnici, imaju pozitivne efekte na

pojedine fiziološke ili biohemijske procese u organizmu.

Jedinjenja koja čine hranu funkcionalnom prolazana su u tableli 1.

Funkcionalna hrana Efekat po zdravlje

Kalijum Nizak nivo natrijuma

Smanjen rizik od povišenog krvnog pritiska i šloga

Biljni steroli i estri stanola

Proteini soje Voće, povrće i žitarice koje sadrže vlakna

Smanjen rizik od srčanih oboljenja

Kalcijum Smanjen rizik od osteoporoze

Beta karoten slobodne radikale i tako sprečava oštećenje ćelija

Likopen smanjuje rizik od raka prostate

Fitoestrogeni iz soje i proizvoda od soje olakšavaju simptome menopauze, štite od bolesti srca i snižavaju nivo

LDL i ukupnog holesterola

Flavonoidi i druge materije u voću/citrusima i

povrću

Neutrališu slobodne radikale i snižavaju rizik od raka

10

1.1.2. Probiotska hrana

U funkcionalnu hranu spada i probiotska hrana (Miletić et al. 2011.).

Fuler (Fuller) je 1989. godine definisao termin probiotik kao proizvod koji

sadrži žive organizme koji ingestijom (od strane ljudi i životinja) u određenom broju

pokazuju pozitivne efekte po zdravlje iznad delovanja vezanih za normalnu ishranu.

Pod ovom definicijom on obuhvata nekoliko zahteva koja treba da ispunjavaju

mikroorganizmi da bi se smatrali probioticima (na primer, mikrobne ćelije moraju biti

žive i konzumirane u velikom broju, obično 109 ćelija dnevno). Medjutim, Filerova

definicija ne uključuje koji mikroorganizmi (da li samo intestinalni ili neki drugi)

treba da budu konzumirani i koliko dugo (dnevno kao preventiva ili 2 i više nedelja

kao lek). Definicija ne ukazuje da li povoljni efekti po zdravlje moraju biti dokazani

naučnim kliničkim studijama u nezavisnim i renomiranim naučnim istraživačkim

grupama, a rezultati da budu objavljeni u recenziranim časopisima. Definicija takodje

ne obuhvata objašnjenje mehanizma na koji način probiotske bakterije povoljno

deluju na organizam. Iako su neke naučne studije pokazale da se povoljni efekti po

zdravlje mogu postići konzumiranjem proizvoda koji sadrže cele mrtve ćelije ili samo

ćelijske delove (Saad, 2013.). uobičajeno je da se termin probiotici koristi i primenuje

za proizvode koji sadrže žive ćelije mikroorganizama.

Pozitivan efekat probiotika zavisi od njihovog prisustva u velikom broju u

gastrointestinalnom traktu. Ovo se može postići konzumiranjem velikog broja

viabilnih ćelija probiotskih mikroorganizama ili stimulisanjem brzog rasta poželjnih

bakterija snabdevanjem odgovarajućim nutritijentima. Najčešće su to izvori ugljenika

koji ne mogu biti metabolisani od bakterija u debelom i tankom crevu što probiotskim

bakterijama daje prednosti u rastu i dostizanju velike brojnosti.

Ovi nutritijenti se nazivaju prebiotici i definišu se kao nesvarljivi sastojci

hrane koji imaju pozitivne efekte na domaćina stimulisanjem rasta i/ili aktivnosti

jedne ili više vrsta bakterija u debelom crevu.

11

Na slici 1 prikazana je razlika izemdju prebiotika i probiotika.

Slika 1: Razlika izmedju probiotika i prebiotika

Termin simbiotik uključuje oba termina: prebiotik i probiotik. On

podrzumeva da, umesto korišćenja probiotika i prebiotika odvojeno, proizvod sadrži

obe komponente, to jest, korisne mikroorganizme u velikom broju i nutritijente koji

im omogućavaju da se brzo razmnožavaju u gastrointestinalnom traktu i izazivaju

korisne efekte.

Žive ćelije probiotika mogu biti konzumirane na tri načina:

proizvodi fermentisanog mleka (jogurt sa živim ćelijama Lactobacilus

delbrueckii ssp. bulgaricus i Streptoccocus thermophilus, acidofilno mleko sa

Lactobacillus acidophilus),

hrana i piće obogaćena živim ćelijama poželjnih intestinalnih bakterija

(Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus casei i

Bifidobacterium vrste)

farmaceutski proizvodi aktivnih ćelija u obliku tableta, kapsula i granula

(Shantanu, 2011.)

Probiotici su nam uglavnom dostupni putem kiselo mlečnih proizvoda koji

imaju veliku ulogu u ishrani zdravih i bolesnih ljudi. Oni se odlikuju lakom

svarljivošću i odgovarajućim dijetetskim svojstvima. Dobijaju se mlečno kiselinskom

fermentacijom pod dejstvom bakterija mlečne kiseline koje zauzimaju značajno

mesto u mikroflori intestinalnog trakta. Smatra se da svakodnevno unošenje kiselo-

mlečnih proizvoda omogućava funkcionisanje i ponovno uspostavljanje normalnog

12

balansa gastrointenstinalnog trakta. Danas postoji veliki broj fermentisanih mlečnih

napitaka sa probiotskim bakterijama koje potiču iz gastrointestinalnog trakta, a

pripadaju rodovima Bifidobacterium i Lactobacillus. Na području Srbije su

zastupljeni fermentisani mlečni napitci sa probiotskim bakterijama (Versalovic,

Wilsson, 2008.). Jogurt i kefir pripadaju grupi melčno kiselinskih proizvoda koji

mogu da sadrže probiotike.

Jogurt je polutečni mlečni proizvod koji se dobija fermentacijom mleka na

temperaturi od 42-45oC tokom 2-4 sata. Fermentaciju vrše bakterije Lactobacillus

delbrueckii ssp.bulgaricus i Streptococcus thermophilus. Nakon fermentacije jogurt se

hladi čime se usporava kiseljenje i produžava trajnost. Jogurt sadrži oko 0,7% mlečne

kiseline. U jogurt se dodaju probiotske bakterije, najčešće su to to laktobacili i

bifidobakterije (Maćej, Marković, 2009.).

Kefir je mlečno alkoholno- fermentisani probiotski i prebiotski napitak

bogat enzimima, sa mikroorganizmima koji balansiraju ekosistem domaćina i čije

redovno korišćenje poboljšava zdravlje. Kefir se dobija nakon ubcivanja kefirovih

zrna u mleko. Nakon fermentacije, kefirova zrna se odvajaju filtracijom i mogu se

koristiti za novu fermentaciju. Kefirova zrna se sastoje od miliona ćelija različitih

mikroorganizama. U kefirovim zrnima nalaze se bakterije mlečne kiseline iz rodova

Lactobacillus, Leuconostoc i Lactococcus. Neke od njih imaju probiotske

karakteristike (Puđa, 2009.).

Iako neki proizvodjači tvrde da probiotski proizvodi imaju veliki broj

pozitivnih dejstava po ljudsko zdravlje, većina nije dokazana u naučnim studijama

(Sacks, 2006.). Kao što je napomenuto, mnogi proizvodi ne sadrže vrste i sojeve koji

su istraživani za moguće pozitivne efekte i nemaju dovoljan broj viabilnih ćelija

neophodnih za postizanje pozitivnih efekata. Zbog toga, postoje ozbiljne sumnje o

pozitivnom delovanju ovih proizvoda. Ne postoji dilema da pojedini mikroorganizmi

zaista imaju pozitivan efekat na gastrointestinalni trakt i, generalno, ljudsko zdravlje.

Međutim, sve to mora biti određeno i potvrđeno kroz validne naučne studije.

Do sada su potpuno naučno dokazana dva pozitivna efekta probiotske hrane-

ublažavanje simptoma netolerancije laktoze i prevencija i redukcija simptoma diaree.

Poboljšanje digestije laktoze je posledica delovanja živih ćelija bakterija

mlečne kiseline koje se koriste kao starter kulture, a sastoji se u stimulaciji aktivnosti

crevne laktaze, u digestiji laktoze u crevnom lumenu jogurtnom laktazom. Zbog toga

13

laktoza intolerantne osobe tj. osobe alergične na mleko, u većoj meri podnose mlečno

kisele proizvode nego mleko (Schiffin, 2014.).

U prevenciji i terapiji dijareja (akutna diareja, rota virusi, putnička diareja,

profilaksa i terapija dijareje izazvane antibiotskom terapijom, Kronova bolest i

iritabilni kolon). Probiotske bakterije unete u obliku kiselo mlečnih proizvoda

kolonizuju intestinalni trakt i deluju kao prirodna barijera za infektivne bakterije i na

taj način imaju značajnu ulogu u terapiji dijareja tj. u uspostavljanju ravnoteže crevne

mikroflore; Lactobacillus acidofilus je efikasnijija od vrste Lactobacillusa bulgaricus

koja je sposobna da u digestivnom traktu ostane živa 10 dana pa i duže. Laktobacili

stvaraju nepovoljne uslove za opstanak raznih uzročnika bolesti, na primer,

mikrokoka, klostridija i raznih kolibakterija (Otles, 2013.).

Pored dokazanih pozitivnih efekata probiotskih bakterija na ljudsko zdravlje,

ispitivanje potencijlnih pozitivnih efekata je u eksperimentalnoj fazi.

Smatra se da probiotske bakerije mogu biti korišćene u lečenju alergija, koje

po jednoj od hipoteza nastaju zbog smanjenog izlaganja dece bakterijskim i viralnim

patogenima što dovodi do promena u imunom sistemu. Kasnija kolonizacija

gastrointestinalnog trakta dece sa vrstama laktobacila i bifidobakterija, takođe, može

biti jedan od razloga pojave alergija. Pored toga i sastav mikroflore može dovesti do

pojave alergijskih reakcija. Kod dece čija je mikrofloru slična mikroflori odraslih

osoba češće su alergije nego kod dece u čijem je gastrointestinalnom traktu

Bifidobactericum bifidum dominantna bakterija. Delovanje probiotika na smanjenje

alergijskih reakcija je preko regulacije imunog odgovora (Cho, Finocchiaro, 2009.).

Antikancerogena aktivnost bakterije mlečne kiseline moguća je inhibicijom

delovanja enzima koje sintetišu fekalni mikroorganizmi u kolonu, a koji redukuju -azo

i aromatična jedinjenja u kancerogene supstance. Pored prevencije karcinoma

gastrointestinalnog trakta, posebno debelog creva takođe smanjuju rizik od drugih

karcinoma. Mehanizam dejstva se ogleda u tome što smanju produkciju kancerogena-

nitrozamina i smanjuju resorpciju aflatoksina (Pessione, 2014.).

Jedna od mogućih primena probiotika je u smanjenju koncentracije

holesterola koji je osnovni faktor rizika za koronarne srčane bolesti. Probiotske

bakterije smanjuju koncentraciju holesterola asimilacijom holesterola ili vezivanjem

holesterola za površinu bakterijske ćelije čime direktno smanjuju njegovu

14

koncentraciju u organizmu. Drugi mehanizam podrazumeva da probiotske bakterije

mogu da inhibiraju enzime koji učestvuju u sintezi holesterola (Makinen, 2012.).

1.2. Probiotske bakterije

Najveći broj probiotskih mikroorganizma pripada rodu Lactobacillus i

Bifidobacteria ali je za neke sojevi enterokoka, laktokoka, streptokoka, leukonostoka i

sporolaktobacila pokazano da mogu da imaju probiotski efekat. Takođe, određeni

sojevi bakterija iz roda Bacilus (B. subtilis i B. cereus), vrsta Clostridium butyricum,

Propionibacterium freuderneichii i Esherichia coli kao i kvasci roda Saccharomyces

pokazuju pozitivan efekat na zdravlje ljudi (Vidhyalakshmi, 2009.).

Da bi se neki mikroorganizam mogao koristiti u probiotičke svrhe mora da

ispunjava sledeće uslove:

Da je poreklom iz digestivnog trakta čoveka;

Da nije patogen ni toksičan za ljude;

Da preživljava uslove koji vladaju u digestivnom traktu, u prvom redu veliku

kiselost želudačnog soka, a i da je otporan prema žučnim kiselinama u tankom

crevu;

Da proizvodi antimikrobne supstance aktivne prema nepoželjnim

mikroorganizmima u digestivnom traktu;

Da tokom tehnoloških postupaka proizvodnje i čuvanja ima visok stepen

preživljavanja (Silva, Freitas 2014.).

Pošto genetičke karakteristike probiotskih sojeva eventualno mogu da dovedu do

patogenosti ili infektivnosti soja potrebno je znati tačno poreklo soja kao i genetičke

karakteristike. Takodje je bitno utvrditi i prisustvo virulentnih faktora koji mogu da

dovedo do toksičnosti soja, njihove rezistencije na antibiotike ili sintezu metabolita

koji mogu da izazovu nepoželjne reakcije u ljudskom organizmu.

Probiotski mikroorganizmi ostvaruju svoje dejstvo prolaskom kroz

gastrointestinalni trakt čoveka i vezivanje za epitelne ćelije gastrointestinalnog trakta.

Funkcionalna svojstva probiotskih bakterija odnose se na mogućnost njihovog

prolaska kroz gastrointestinalni trakt i vezivanje za ćelije gastrointestinalnog trakta.

Najznačajnije karakteristike probiotskih sojeva su poželjna fiziološka svojstva ovih

sojeva koja utiču pozitivno na ljudsko zdravlje (Makinen, 2012.).

Poželjna fiziološka svojstva su sledeća:

15

delovanje na imuni sistem (imunomodulacija),

inhibitorno delovanje na gastrointestinalne patogene bakterije,

delovanje na metabolizam holesterola i laktoze

antimutagena

antikancerogena svojstva.

16

1.2.1. Bakterije mlečne kiseline

Bakterije mlečne kiseline su opisane tek krajem XIX veka, iako postoje dokazi

da je fermentisana hrana bila prisutna u ljudskoj ishrani i pre 5000 godina. Prema

nekim fosilim ostacima, utrvdjeno je da su postojale na zemlji pre oko tri milijardi

godina, pre nego što je kiseonik bio prisutan u atmosferi (Stojiljković, 2010.).

Bakterije mlečne kiseline rastu uglavnom u nutritivno bogatim sredinama.

Mogu se naći na istrulelom bilju i voću, u mlečnim proizvodima, fermentisanom mesu

i ribi, na repi, krompiru, kiselom kupusu, ukiseljenom povrću, piću, biljkama, vodi,

sokovima, mulju kao i telesnim dupljama (usta, genitalije, intestinalni i respiratorni

trakt) ljudi i životinja. Oni predstavjaju deo zdrave mikroflore ljudskih creva

(Marković, Maćej, 2008.).

Tipične bakterije mlečne kiseline koje rastu pod standardnim uslovima

(nelimitirajuće koncentracije glukoze, limitacija faktora rasta i kiseonika) su Gram-

pozitivne, nesporogene, katalaza negativne u odsustvu porforinoida, aerotolerantne,

acidotolerantne, organotrofne i striktno fermentativne štapićaste ili kokoidne bakterije

koje produkuju mlečnu kiselinu kao glavni krajnji proizvod. Nemaju citohrome i ne

mogu da sintetišu porfirine. Ove karakteristike mogu da variraju pod određenim

uslovima. U prisustvu hema moguća je katalaza i proizvodnja citohroma, tako da se

mlečna kiselina može dalje metabolisati, što rezultuje nižim koncentracijama mlečne

kiseline kao krajnjeg proizvoda (Lahtinen et al, 2011). Deoba ćelija se dešava u jednoj

ravni, osim kod pediokoka. Ćelije su uglavnom nepokretne. Imaju potrebu za

kompleksnim faktorima rasta kao što su vitamini i aminokiseline (Lahtinen et al,

2011.).

Na osnovu katabolizma glukoze koji je glavni izvor energije za bakterije

mlečne kiseline, bakterije mlečne kiseline mogu biti podeljene u dve grupe -

homofermentativne i heterofermentativne. Homofermentativne vrste bakterija mlečne

kiseline produkuju < 85% mlečne kiseline kao jedini krajnji produkt, dok

heterofermentativne vrste proizvode mlečnu kiselinu, CO2 i etanol/acetat. Najmanje

polovina ugljenika u krajnjem proizvodu je u vidu laktata. Homofermentativne

bakterije mlečne kiseline vrše glikolizu i mlečnu fermentaciju. Heterofermentativne

bakterije mlečne kiseline koriste pentoza fosfatni put, koji se alternativno naziva još i

put fosfoketolaze ili fosfoglukonata (Glišić, 2006.).

17

Streptococcus

Streptococcus je rod Gram-pozitivnih bakterija iz familije Streptococcaceae

koje su široko rasprostranje u prirodi. Deo su normalne bakterijske flore

gastrointestinalnog trakta čoveka, a neke vrste su i uzročnici različitih bolesti.

Streptokoke su okruglog oblika, povezane u parove (slika 3), obično nepokretne, ne

stvaraju spore te su najčešći fakultativni anaerobi (Prudja, 2009.).

U okviru roda Streptococcus, jedina vrsta koja je važna u industriji mleka i

fermentisanih mlečnih proizvoda je Streptococcus thermophilus. Ova bakterija je

izolovana iz mnogih sireva i fermentisanih mlečnih proizvoda, ali i sa biljnog

materijala. S. thermophilus je termofilna bakterija mlečne kiseline, koja raste na 45oC,

čak i preko 50oC, dok na temperaturi od 10oC ne raste. Ćelije su okruglog oblika i

javljaju se u paru i u dugim lancima. Pripada grupi homofermentativnih bakterija

mlečne kiseline i sintetiše L oblik mlečne kiseline. Ulazi u sastav starter kultura za

proizvodnju jogurta i sireva (Harrington, 2012.).

Pored S.thermophillus se veoma često u mlečnoj industriji. Tipična mlečna

bakterija, termofilna, opstaje do temperature od 43oC. Zajedno sa L.bulgarigus je

starter kultura za proizvodnju jogurta u odnosu 1:1. Nalaze se u simbiozi gde je

L.bulgarigus jači proteolit i stvara jedinjenja manje molekulske mase koja

S.thermophilus koristi (Duraković, 2002.).

Slika 3: Streptococcus sp.

18

Lactobacillus

Najbrojni rod BMK je rod Lactobacillus sa 135 vrsta i preko 25 podvrsta.

Lakotobacili su štapićaste bakterije duge ili kokoidne (slika 4). Većina laktobacila

raste na temperaturi od 2-53oC i na pH=3,0-7,0. Ove bakterije mogu biti

mikroaerofilne ili fakultativno anaerobne, dok starije kulture rastu u aerobnim

uslovima. Metabolizam laktobacila je respiratorni ili fermentativni. Laktobacili se

mogu naći u različitim vrstama namirnica (sveže voće, voćni sokovi, sveže povrće,

konzervisano povrće, mlečni proizvodi, vino, pivo, meso i proizvodi od mesa.),

zemljištu, vodi, u crevima ljudi i domaćih životinja.

Koriste se kao starter kulture za proizvodnju kobasica (Lb. plantaruni, Lb.

brevis), kao i mlečno fermentisanih proizvoda (Lb. acidophilus, Lb. lactis, Lb. casei,

Lb. debrueckii) (Božanić, 2000.).

Slika 4: Lactobacillus sp.

19

1.2.2. Bifidobakterije

Bifidobakterije su Gram pozitivne bakterije štapićastog oblika. Rod

Bifidobacterium obuhvata više od 28 vrsta koje su normalna komponenta crevne flore

donjeg dela gastrointestinalnog trakta. Pored gastrointestinalnog trekta mogu se naći i

kao deo mikroflore vagine i usne duplje sisara i drugih životinja. To su anaerobne

bakterije koje nemaju katalaze, ne formiraju spore i nemaju flagele. Bifidobakterije su

po morfologiji granati štapići karakterističnog oblika (u obliku slova V, X ili Y) (slika

5) ali oblik bifidobakterija varira u zavisnosti od podloga na kojima se gaje i

spoljašnjih uslova gajenja. Rastu na podlogama koje su bogate nutritijentima i

faktorima rasta.

Produkti metabolozima bifidobakterija inhibitorno deluju na rast pathogenih

vrsta. Bifidobakterije u debelom crevu razlažu ugljene hidrate i tako stvaraju umereno

kiselu sredinu koja suprimira rast bakterija i drugih patogenih mikroorganizama.

Imaju uticaj na metabolizam masnih kiselina, žučnih kiselina, holesterola i steroidnih

hormona u crevnom traktu. Bifidobakterije produkuju veliki broj vitamina,

uključujući vitamine B grupe kao i vitamin K, koji se apsorbuju i ulaze u cirkulaciju.

Pored toga masne kiseline kratkih lanaca koje sintetišu bifidobakterije iz ugljenih

hidrata su primarni izvor energije za epitelne ćelije debelog creva. Ne učestvuju u

fermentacijama pri proizvodnji fermentisane hrane već se dodaju mlečnim

fermentisanim proizvodima kao probiotici. Najznačajniji predstavnici roda

Bifidobacterium su: B. bifidum, B. longum, B. breve, B. adolescensis i B. infantis.

Ove vrste mogu se izolovati iz debelog creva u različitom broju u zavisnosti od

starosnog perioda života. B. longum je bakterija koja se može izolovati iz gastro

intestinalnog trakta ljudi svih starosnih grupa (Marković, 2013.).

Slika 5: Biffidobacterium sp.

20

2. Fermentisana hrana

Fermentisana hrana predstavlja tip hrane u kojoj rastom mikroorganizama i

njihovim metabolizmom dolazi do konverzije organskih jedinjenja iz supstrata u

produkte metabolizma mikroorganizama. Fermentisana hrana se najčešće dobija

fermentacijom sirovina koju vrše mikroorganizmi. Konzumiranjem fermentisane

hrane u organizam unosimo žive i mrtve mikroorganizme koji su rasli u hrani, njihove

produkte metabolizma kao i ostatak supstrata koji nije iskorišćen od strane

mikroorganizama. Osnovne karakteristike fermentisane hrane su:

konzervacija,

povećanje nutritivnih vrednosti,

organoleptička svojstva.

Mikroorganizmi koji vrše konzervaciju hrane produkuju različita jedinjinja

koja inhibitorno deluju na rast drugih mikroorganizama. Najčešće su to organske

kiseline, ali mogu da sintetišu i H2O2, O2, etanol, diacetil i mnoge druge organske

molekule sa antimikrobnim dejstvom. Konzervancija hrane omogućava produženje

roka trajanja hrane kao i veću bezbednost hrane (Martinoć et al, 2006).

Mikroorganizmi vrše konverziju supstrata u organske molekule koji imaju

veću nutritivnu vrednost, te tako povećavaju nutritivnu vrednost fermentisane hrane.

Npr. bakterije koje se nalaze u jogurtu vrše konverziju laktoze u mlečnu kiselinu,

tako da ljudi koji su intolerantni na laktozu mogu da usvajaju sve hranljive supstance

iz mleka preko jogurta (Obradović, 2001.).

Organoleptička svojstva prehrambenih proizvoda se određuju ljudskim čulima,

a ne mogu se odrediti instrumentalnim analitičkim tehnikama i egzaktnim merenjima.

Kvalitet prehrambenih proizvoda određen je njihovim fizičko-hemijskim

karakteristikama, nutritivnom i energetskom vrednošću i drugim karakteristikama kao

što su izgled, boja, miris i ukus. Ove karakteristike kao i viskoznost, čvrstoća, tvrdoća,

rastegjivost, plastičnost, hrskavost proiyvoda predstavljaju organoleptička svojstva

proizvoda. Danas se primenjuju različiti proizvodni procesi za istu početnu sirovinu

što je omogućilo postojanje oko 3500 različitih fermentisanih proizvoda (Zaid et al,

2007.).

21

Mikroorganizmi koji učestvuju u proizvodnji hrane mogu se podeliti u 3

grupe:

bakterije (bakterije mlečne kiseline, bakterije sirćetne kiseine, bakterije iz

rodova Bifidobactericum, Propinobacterium i Brevibacterium) najčešće se

koristi prilikom proizvodnje fermentisanih proizvoda od mesa, mleka i

proizvoda biljnog porekla,

kvasci ( rod Saccaharomyces) učestvuju u fermentaciji žitarica i koriste se u

pekarskoj industriji,

plesni (rodovi Aspergillus i Penicillium)-koriste se za proizvodnju različitih

sireva kao i fermentisane hrane biljnog porekla.

22

2.1. Soja

Soja sadrži 37-50 % proteina (meso ima 12 - 22 %), nezasićene masne kiseline,

lecitin, izoflavon (izuzetno efikasan u prevenciji raka i osteoporoze) i veoma korisne

minerale (gvožde, magnezujum, kalijum) (Nenadić, 1995.). Soja ne sadrži holesterol i

laktozu. Pedeset grama soje namiriće skoro u potpunosti dnevnu potrebu za

vitaminom E, B1, folnom kiselinom i vitaminom B6, polovinu dnevne potrebe za

kalijumom i trećinu potrebe za magnezijumom. Od ugljenih hidrata soja sadrži

polisaharid dekstrin koji ima važnu ulogu u ishrani dijabetičara jer onemogućava

naglo povećanje sadržaja glukoze u krvi. Soja je izvor lecitina i vitamina E. Ovi

prirodni antioskidansi sprečavaju oksidaciju LDL holesterola (Djordjević, 1980.). Sve

ove karakteristike kao i niska cena proizvodnje i prerade čine soju i njene proizvode

sve popularnijim namirnicama.

Soja ima višestruku upotrebu u ishrani ljudi i životinja, ali i u različitim

granama industrije (slika 6).

Slika 6: Različiti proizvodi od soje (Riaz, 2005.)

23

2.1.2. Fermentisani proizvodi od soje

Fermentisani proizvodi od soje ranije su uglavnom bili popularni na azijskom

tržištu, medjutim danas se sve više koriste i kod nas.

Cheonggukjang je fermentisani proizvodi koji se pravi od zrna soje. To je

pasta koja se koristi u korejskoj kuhinji. Sadrži cela, ali i samlevena zrna

soje.Fermentaciju vrši Bacillus subtilus na 40oC tokom 48-72h bez dodatka soli

(Shurtleff, 2011.).

Doubanjiang je ljuti, slani fermentisani proizvod koji se pravi od boba,

pirinča i soje. Fermentacija je spontana i vrše je uglavnom BMK (Hosking, 1995.).

Tempeh je tradicionalni proizvod od soje, poreklom iz Indonezija. Dobija se

prirodnom fermentacija zrna soje. Fermentaciju vrše gljive Rhizopus oligosporus ili

Rhizopus oryzae (McCloud, 1992.).

Miso je tradicionalni japanski proizvod koji se dodaje prilikom pravljenja

različitih supa ili soseva. Fermentaciju vrši Aspergillus oryzae i Tetragenococcus

halophilus. Ovaj proizvod ima visok sadržaj vitamina i proteina (Katz, 2012.).

Nato je tradicionalna japanska hrana poreklom iz Kine koje nastaje

fermentacijom soje koju vrši Bacillus subtilis. Ima visok sadržaj proteina, jak miris i

ukus, i “klizavu” tekstura (Buerk, 2010.).

Soja sos nastaje fermentacijom koju vrše Aspergillus oryzae i Aspergillus

sojae. Ranije se koristio pre svega u kuhinji Istočne Azije mada je danas veoma

popularan proizvod na svim kontinentima. Sadrži 10 puta više antioksidanasa od vina

(Schueller, 1997.).

Tempeh je fermentisani proizvod poreklom iz Indonezije gde je starter

Rhizopus oligosporus, bogat je vitaminom B12 i polisaharidima (Tan, 2006.).

Sufu nosi još i naziv “Kineski sir”, po ukusu je sličan plavom siru i veoma je

bogat proteinima. Fermentaiju vrše plesni Actinomucor elegans, Mucor sufu, Mucor

rouxanus, Mucor wutuongkiao, Mucor racemosus, Rhizopus spp. (Tan, 2006.).

Poslednjih godina ispituje se mogućnost proizvodnje novih fermentisanih

proizvoda od soje. Tako se fermentisano sojino mleko proizvodi dodavanjem bakterija

mlečne kiseline u sirovinu kako bi se izvela mlečno kiselinska fermentacija. U sojino

mleko, takođe, se dodaju probiotski mikroorganizmi kako bi se dobio napitak sa

funkcionalnim karakteristikama.

24

2.1.3. Sojino mleko

Soja i njeni proizvodi veoma su cenjeni i traženi u svetu zbog visokog sadržaja

nezasićenih masnih kiselina, lecitina, izoflavona i minerala (gvožde, magnezujum,

kalijum). Od svih proizvoda posebnu pažnju privlači sojino mleko (Nenadić, 1995.).

Prvi podaci o sojinom mleku pojavljuju se u Kini 82. godine p.n.e. dok se u

Evropi prvi put spominje 1793 godine.

Sojino mleko je mutna beličasta tečnost prijatnog ukusa koja se proizvodi od

celog zrna soje (slika 7). Suva zrna se potapaju preko noći u vodu, zatim se melju i

dodaje im se još vode. Odnos vode i zrna je 10:1. Dobijena mešavina se potom kuva

kako bi povišena temperatura aktivirala inhibitobor tripsina, poboljšala ukus i da bi

proizvod bio pasterizovan. Zagrevanje se vrši 15-20 minita na temperaturi od oko

100oC. Potom se vrši uklanjanje nerastvornih ostataka (okara) filtracijom. Tokom

proizvodnje dodaje se inulin i morska so. U 100 g proizvoda ima oko 3,3 g proteina, 1

gr ugljenih hidrata, 1,3 g masti i 2,2 gr inulina. Energetska vrednost sojinog mleka je

32 Kcal (134 KJ).

Sojino mleko je zdrav i hranljiv napitak koji može da zamenjuje kravlje mleko.

Lako je svarljivo, ne sadrži holesterol niti mlečni šećer, koji je uzrok raznih

alergijskih smetnji. Pošto ne sadrži sirovine animalnog porekla, proizvod je pogodan

za dane posta kao i za vegetarijance i vegane.

Sva mleka od soje nisu ista, već se razlikuju u zavisnosti od sorte i kvaliteta

zrna soje. Starost semena i načini njegovog skladištenja, kao i kvalitet zemljišta gde je

biljka gajena, znatno utiču n kvalitet sojinog mleka. Pojedini enzimi u soji proizvode

isparljive sastojke, koji mogu da imaju neprijatan miris, što umanjuje kvalitet

proizvoda. Ukupna količina isparljivih materija je u direktnoj vezi sa aktivnošću

enzima lipokigenaze. Duže skladištenje izaziva promenu boje.

Slika 7: Proizvodnja sojinog mleka

25

Sojino i kravlje mleko se razlikuju po svom hemijskom sastavu (tabela 2).

Sojino i kravlje mleko su bogat izvor proteina ali kravlje mleko ih sadrži nešto više (6

gr/ 250ml) -u odnosu na sojino mleko (4 gr/ 250ml). Biološka vrednost sojinih

proteina je za oko 20 odsto niža od proteina kravljeg mleka. Sojino mleko ne sadrži

laktozu, mlečni šećer koga ima u kravljem mleku, dok je procenat masti dva put manji

u sojinom mleku u odnosu na kravlje. Kalcijum se u sojinom mleku nalazi u maloj

količini i vezan je za nerastvorno vlakno iz pulpe mahunarke tako da je njegova

apsorpcija 75 % u odnosu na kalcijum iz kravljeg mleka.

Visok nivo fitinske kiseline u soji smanjuje apsorpciju kalcijuma,

magnezijuma, bakra, gvožđa i cinka.

Kravlje mleko Sojino mleko

Informacije o proizvodu 2% mast Vanila

Zapremina 240 ml 240 ml

Kalorije 120 100

Kalorije iz masti 45 30

Ukupno masti 5 g 3,5 g

Trans masti ? 0 g

Zasićene masti 3 g 0,5 g

Holestorel 20 mg 0 mg

Natrijum 125 mg 95 mg

Kalijum 0 mg 300 mg

Ukupno ugljenih hidrata 12 g 10 g

Dijetalna vlakna 0g 1 g

Šećeri 11 g 7 g

Proteini 8 g 6 g

Vitamin A 10% 10%

Vitamin C 4 % 0%

Kalcijum 30% 30%

Gvoždje 0% 6%

Vitamin D 25% 30%

Riboflavin 0% 30%

Folna kiselina 0% 6%

Vitamin B12 0% 50%

Cink 0% 4%

Fosfor 20% 0%

Tabela 2: Hemijski sastav sojinog i kravljeg mleka (Brandon, 2004.)

26

3.Ciljevi rada

Imajući u vidu, eksperimentalno i naučno, dokazane činjenice o zdravstvenom

značaju i hranljivim svojstvima sojinog mleka, ciljevi ovog rada su:

ispitivanje mogućnosti rasta probiotske ABY-6 kulture u sojinom mleku,

ispitivanje uticaja količine inokuluma na rast probiotske starter kulture,

ispitivanje uticaja surutke na rast probiotske starter kulture,

određivanje stabilnosti fermentisanog sojinog mleka u toku čuvanja na 4C.

27

4.Materijali i metode

4.1.Materijal

4.1.1 Fermentacione podloge

Za ispitivanje procesa fermentacije u toku ovog istraživanja korišćeno je sojino mleko

proizvođača Delhaize (Belgija). Nutritivne vrednosti ovog sojinog napitka, u 100 ml

proizvoda, su:

Proteini 3,3g

Ugljeni hidrati 1g

Lipidi 1,3g

Inulin 2,2g

Energetska vrednost 32 Kcal

Za obogaćivanje sojinog mleka korišćena je komercijalna surutka u prahu (Lučar,

Srbija). Sastav surutke je bio sledeći: proteini min. 11%, laktoza min. 61%, mast maks.

2%, suva meterija min. 95% i pepeo maks. 9.5%.

Inokulum kojim je zasejavano sojino mleko pripremljen je od kravljeg mleka sa 0,5%

mlečne masti (Imlek, Srbija). Kravlje mleko, sojino mleko i sojino mleko obogaćeno

surutkom su pasterizovani kuvanjem na 80C 30 minuta.

4.1.2 Probiotska kultura i podloge

Probiotska kultura Laktoferm ABY-6 (Biochem, Italija) dobijena u obliku

liofiliziranog praha korišćena je za fermentaciju sojinog mleka. Ova starter kultura je

mešavina bakterijskih vrsta Streptococcus thermophilus (80%), Lactobacillus

acidophilus (13%), Bifdobacterium bifidum (6%) i Lactobacillus delbrueckii ssp.

bulgaricus (1%). Starter kultura je aktivirana rastvaranjem 0.1 gr praha u 10 ml

sterilnog kravljeg mleka, nakon čega je mleko inkubirano 5 sati na 42C. Inokulum za

fermentaciju sojinog mleka dobijen je dvostrukim sukcesivnim zasejavanjem

pasterizovanog kravljeg mleka (1,5% v/v) aktiviranom starter kulturom ABY-6.

Početni inokulum dobijen je zasejavanjem sterilnog kravljeg mleka aktiviranom

starter kulturom dok je radni inokulum dobijen zasejavanjem početnog inokuluma u

kravlje mleko. Kravlje mleko zasejano ABY-6 kulturom inkubirano je 24 sata na

42C i nakon inkubacije, merena je pH vrednost. U radu je za inokulaciju

fermentacionih podloga uvek korišćen inokulum čija je pH vrednost bila 4,20.

Brojanje bakterijskih ćelija tokom fermentacije rađeno je na selektivnim podlogama

za BMK. Korišćena je MRS čvrsta podloga (Torlak, Srbija) koja favorizuje rast

laktobacila i M17 čvrsta podloga (Merck, Nemačka) obogaćena 5% glukozom (Zorka,

Srbija) za rast streptokoke.

28

4.2.Metode rada

4.2.1 Fermentacija sojinog mleka

Čisto sojino mleko i sojino mleko sa dodatkom surutke (1%, 2%, 4% w/v) su

korišćeni za fermentaciju sojinog mleka. Prekonoćnim inokulumom probiotske

kulture zasejavane su fermentacione podloge. Za ispitivanje uticaja količine

inokuluma na fermentaciju sojinog mleka ABY-6 starter kulturom korišćen je 1%, 3%

i 6% (v/v) radni inokulum probiotske kulture. 3% inokulum je korišćen za ispitivanje

uticaja surutke na rast probiotske kulture. Nezasejano sojino mleko je korišćeno kao

kontrola tokom svih eksperimenata. Fermentisane podloge koje su zasejane i

nezasejane kontrolne podloge su inkubirane tokom 24 sata na 42C.

Tok fermentacije je praćen merenjem pH vrednosti fermentacionih podloga i

određivanjem broja ćelija u određenim vremenskim periodima. Uzorci su uzimani

prvih 5 sati od početka fermentacije u vremenskim intervalima od 1,5 sati i nakon 24

sata. Dobijeni fermentisani napici su čuvani u frižideru na 4C i njihova stabilnost je

određivana merenjem pH vrednosti i brojanjem ćelija na svaka 4 dana u periodu od 20

dana.

4.2.2 Merenje pH vrednosti

Zbog gustine uzorka, uzorci su prvo razblaživani sa 10 ml destilovane vode, a

pH vrednosti fermentacionih podloga i kontrola merene su pH metrom (Eutech

Instrument, Singapur).

4.2.3 Brojanje bakterijskih ćelija

Indirektnom metodom brojanja odredjivan je broj bakterijskih ćelija u uzorcima iz

fermentacionih podloga. Početni uzorak je razblaživan u fiziološkom rastvoru (0,85%

NaCl) zbog velikog broja ćelija. Iz uzorka sa većim razblaženjem je radjeno

zasejavanje MRS i M17 podloga da bi na svakoj Petri ploči bilo izmedju 30 i 300

kolonija. Zasejane Petri ploče inkubirane su 48 sati na 37C, nakon čega su brojane

kolonije. Množenjem broja kolonija sa korišćenim razblaženjem je dobijen broj ćelija

u uzorku i prikazan je kao logN u 1 ml uzorka (logN/ml) gde je N broj kolonija na

podlozi.

29

5.Rezultati i diskusija

5.1. Rast probiotske kulture u sojinom mleku

Soja je namirnica sa visokim sadržajem proteina, esencijalnih amino kiselina,

nezasićenih masnih kiselina i izoflavona, dok ne sadrži holesterol i laktozu (Lin et al.,

2004.). Sa druge strane, soja i proizvodi od soje imaju specifičane organoleptičke

karakteristike koje potiču od n-heksanala i pentanala kao i nesvarljive oligosaharide

kao što su rafinoza i stahioza što ograničava upotrebu soje i njenih proizvoda u ishrani

mnogih ljudi (Božanić et al., 2011., Chengcheng et al., 2014). Jedan od načina

prevazilaženja ovih ograničenja i poboljšanja organoleptičkih karakteristika proizvoda

od soje jeste proizvodnja fermentisanih napitaka od soje. Karakteristična aroma i

miris fermentisanih proizvoda od soje, najčešće, se postižu korišćenjem BMK u

fermentaciji (Chengcheng et al., 2014).

Sojino mleko je vodeni ekstrak sojinih zrna i predstavlja dobru podlogu za rast

različitih vrsta BMK pri čemu su bakterijske vrste iz roda Lactobacillus najčešće

korišćene za fermentaciju sojinog mleka (Chengcheng et al., 2014). Probiotske BMK,

takođe, su korišćene za dobijanje fermentisanog sojinog mleka (Chiang i Pan, 2012).

Komercijalna probiotska starter kultura Laktoferm ABY-6 sastoji se od

bakterijskih vrsta St. thermophilus (80%), Lb. acidophilus (13%), B. bifidum (6%) i

Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus (1%). Vrste St. thermophilus i Lb. delbrueckii ssp.

bulgaricus ulaze u sastav starter kulture za proizvodnju jogurta, dok vrste Lb.

acidophilus i B. bifidum se dodaju kao probiotici u fermentisane napitke. Starter

kultura Laktoferm koristi se komercijalno za proizvodnju mlečnih fermentisanih

napitaka, kao i fermentisanih napitaka na bazi mleka i surutke (Rakin et al., 2015). U

pregledanoj literature nisu pronađeni podaci o fermentaciji sojinog mleka sa

probiotskom starter kulturom ABY-6.

Na početku eksperimenta, ispitivana je mogućnost rasta probiotske starter

kulture ABY-6 u čistom sojinom mleku i sojinom mleku sa dodatkom surutke (1%,

2%, 4% w/v). S obzirom da BMK koriste laktozu kao osnovni izvor energije za rast i

kazein kao izvor amino kiselina, u sojino mleko je dodata surutka kao izvor ovih

hranljivih materija. Fermentacione podloge su zasejana 3% aktiviranom ABY-6

starter kulturom i inkubirane su 24 sata na 42C. Nakon inkubacije merena je PH

vrednost fermentacionih podloga i određivan je broj ćelija u njima.

30

pH vrednost sojinog mleka zasejanog ABY- 6 kulturom nakon 24 sata

inkubacije bila je 4,03 (Tabela 1). Kako je pH vrednost nezasejanog sojinog mleka

6,56, smanjenje pH vrednosti zasejanog sojinog mleka ABY-6 kulturom ukazuje da

bakterije u korišćenoj starter kulturi sintetišu organske kiseline. BMK sintetišu

mlečnu kiselinu kao glavni produkt energetskog metabolizma tokom svog rasta što

dovodi do smanjivanja pH vrednosti supstrata u kome rastu (Axelsson, 1998). U

frementacionim podlogama gde je dodata surutka pH vrednost je bila nešto niža u

odnosu na sojino mleko. Najniža pH vrednost izmeren je u sojinom mleku sa

dodatkom 2% surutke (Tabela 1).

Tabela 1. pH vrednosti i broj ćelija sojinog i obogaćenog sojinog mleka nakon

fermentacije sa probioskom kulturom

Uzorak pH vrednost Broj ćelija (logN/ml)

M17 MRS

Sojino mleko 4,03 4,5 4,85

Sojino mleko + 1% surutka 3,95 5,6 5,7

Sojino mleko + 2% surutka 3,86 5,5 5,7

Sojino mleko + 4% surutka 3,94 5,7 5,7

Broj bakterijskih ćelija određivan na M17 i MRS podlozi bio je veći u svim

fermentacionim podlogama u kojima je dodata surutka u odnosu na neobogaćeno

sojino mleko gde je broj ćelija na obe korišćene podloge bio oko 1 logN/ml manji

(Tabela 1). Najveći broj ćelija na M17 podlozi koja je selektivna za rast streptokoka

bio je u sojinom mleku sa 4% surutke. Na MRS podlozi, broj ćelija bio je isti u svim

fermentacionim podlogama sa surutkom (5,7 log N/ml). MRS podloga je selektivna za

rast laktobacila ali na njoj mogu da rastu i bifidobakterije. S obzirom da je veći broj

bakterijskih ćelija na MRS podlozi u odnosu na broj ćelija na M17 podlozi, hemijski

sastav sojinog mleka favorizuje rast laktobacila i bifidobakterija. Ovi rezultati su u

suprotnosti sa rezultatima drugih istraživanja koj su pokazali da je sojino mleko

pogodniji supstrat za rast streptokoka u odnosu na laktobacile (Božanić et al., 2011.

2008.). U sojinom mleku kao izvori ugljenika nalaze se saharoza, rafinoza i stahioza

koje mogu da koriste laktobacili i bifidobakterije kao izvore energije ali ne i vrsta St.

thermophilus što objašnjava njihov bolji rast u odnosu na streptokoke. Osim toga, u

31

radu je korišćeno sojino mleko sa inulinom koji, takođe, pospešuje rast laktobacila i

bifidobakterija (Arzu i Bakirci, 2014, Stijepić et al., 2013). Na osnovu dobijenih

rezultata pokazano je da je sojino mleko pogodan supstrat za rast probiotske starter

kulture ABY-6 tako da je u daljem radu korišćeno čisto sojino mleko.

4.2 Uticaj inokuluma na rast probiotske kulture

Prilikom optimizacije fermentacije sirovina bakterijskim starter kulturama

potrebno je ispitati kako određeni parametri utiču na tok fermentacije i kvalitet

finalnog proizvoda. Jedan od parametara koji značajno može da utiče na proces

fermentacija i broj ćelija tokom fermentacije je količina inokuluma, pre svega zato što

od količine inokuluma zavisi početni broj ćelija unešen u određenu fermentacionu

podlogu. Zato je u daljem radu ispitivan uticaj inokuluma (1%, 3%, 6% ) na proces

fermentacije sojnog mleka. Fermentacija je praćena 4,5 sata jer je to dovoljno vreme

za snižavanje pH vrednosti sojinog mleka na 4,6 što predstavlja izoelektričnu tačku

proteina soje (Vissesanguan et al., 2005).

Na slici 1 prikazana je promena pH vrednosti sojinog mleka tokom 4 sata

fermentacije sa različitom količinom inokuluma ABY-6 starter kulture. pH vrednosti

fermentacionih podloga su nakon 4 sata fermentacije bile približno iste, pri čemi je

najmanja pH vrednost dostignuta sa 6 % inokulumom (6%). U radu Bulatović i

saradnika (2014) koji su koristili ABY-6 kulturu za fermentaciju surutke, postignuta

je pH vrednost 4,5 za 4,5 sata fermentacije sa 6% inokulumom. Sojino mleko sadrži

veliku količinu proteine ali su oni drugačije strukture u odnosu na kazein iz surutke.

BMK iz starter kulture sporije razlažu proteine soje što usporava rast bakterija i

sintezu kiselina. Osim toga, laktoza koja je prisutna u surutki a nema je u sojinom

mleku, predstavlja bolji supstrat za bržu sintezu mlečne kiseline u odnosu na ugljene

hidrate iz sojinog mleka.

32

Slika 1. Promena pH vrednosti sojinog mleka tokom fermentacije

u zavisnosti od količine inokuluma

Određivanje broja ćelija tokom fermentacije rađeno je na M17 i MRS podlozi (Slika 2

i 3). Broj ćelija vrste St. thermophilus određen na M17 podlozi nakon 4, 5 sata

fermentacije najveći je sa 6% inokulumom (6,2 logN/ml), nešto manji sa 3%

inokulumom (6,1 logN/ml), dok je sa 1% inokulumom 5,8 logN/ml najmanji. Na

početku fermentacije broj ćelija streptokoka je za oko 1 logN/ml manji u odnosu na

broj unetih ćelija sa 3% i 6% inokulumom zbog čega je na kraju praćenog perioda

fermentacije njihov broj manji.

Slika 2. Promena broja ćelija na M17 podlozi tokom fermentacije sojinog

mleka u zavisnosti od količine inokuluma

33

Broj ćelija laktobacila i bifidobakterija određivan na MRS podlozi je različit nakon

4,5 sata fermentacije sojinog mleka iako je njihov broj približno isti na početku

fermentacije (Slika 3). Na kraju praćenog perioda fermentacije, broj ćelija na MRS

podlozi gde je korišćen 6% inokulum iznosi 5 logN/ml, dok je sa 1% inokulumom 3,9

logN/ml. sa 6% inokulumom 5 logN/ml.

Slika 3. Promena broja ćelija na MRS podlozi tokom fermentacije sojinog

mleka u zavisnosti od količine inokuluma

Broj ćelija streptokoka je za oko 1,5 logN/ml veći u odnosu na broj ćelija

određen na MRS podlozi nakon 4,5 sata fermentacije sojinog mleka. Probiotska

starter kultura ABY-6 sastoji se od 80% ćelija vrste St. thermophilus, dok laktobacili i

bifidobakterije čine preostalih 20%. Osim toga, radni inokulum korišćen u ovom radu

dobijen je u kravljem mleku, u kome streptokoke mnogo bolje rastu u odnosu na vrste

Lb. acidophilus i B. bifidum tako da je njihov početni broj u sojinom mleku veći

(Slika 2 i 3). Broj streptokoka konstantno raste od početka fermentacije sa

eksponencijalnim rastom nakon 1,5 sata od početka fermentacije. Kod laktobacila i

bifidobakterija, logaritamska faza rasta počinje tek nakon tri sata. Sve ovo dovodi do

manjeg broja laktobacila i bifidobakterija nakon praćenog perioda fermentacije.

Fermentacijom surutke obogaćene mlekom sa ABY-6 starter kulturom, dobijen je veći

broj ćelija u fermentacionim podlogama (Bulatović et al, 2014; Rakin et al., 2015). U

jednom prethodnom istraživanju sa jogurtnom starter kulturom pokazano je da

streptokoke brže rastu u odnosu na laktobacile nakon 4 sata fermentacije sojinog

mleka (Božanić et al, 2011).

34

4.3 Uticaj dodavanja surutke na rast probiotske culture

Surutka sadrži proteine surutke (20% od ukupnih proteina), laktozu, vitamine

rastvorljive u vodi i minerale. Proteini i peptide surutke imaju važna biološka svojstva

u organizmu, tj. imaju uticaj na imuni,kardiovaskularni, nervni i gastrointestinalni

sistem, kao i osećaj sitosti (Rakin et al., 2015). Zbog toga se surutka dodaje mnogim

fermentisanim napicima kako bi se povećale njihove funkcionalne karakteristike.

Kako bi se ispitao uticaj dodavanja surutke na fermentaciju sojinog mleka, rađena je

fermentacija obogaćenog sojinog mleka sa 1 % surutkom. U ovim fermentacijama

korišćen je 3% inokulim probiotske starter kulture ABY-6. Proces fermentacije praćen

Na slici 4 prikazane su dobijene pH vrednosti fermentisanog sojinog mleka (SM) i

sojinog mleka sa dodatkom surutke (SMS) nakon 6 sati fermentacije. Dodavanje

surutke u sojino mleko ne utiče mnogo na pH vrednosti fermentacionih podloga jer su

dobijene vrednosti slične ( 4,5 za sojino mleko sa surutkom i 4,6 za sojino mleko). U

sojinom mleku sa surutkom je pH vrednost bila manja u prvih četiri sata fermentacije

u odnosu na sojino mleko bez surutke.

Slika 4. Promena pH vrednosti sojinog mleka (SM) i sojinog mleka obogaćenog

surutkom (SMS) tokom fermentacije K-kontrola

35

Dodavanje surutke u sojino mleko nema veliki uticaj na broj ćelija određivan

na M17 i MRS podlozi (Slika 5). Broj ćelija streptokoka je na kraju praćenog perioda

fermentacije u sojinom mleku 7,1 logN/ml, dok je u sojinom mleku sa surutkom 7,3

log N/ml. Slična razlika u broju ćelija dobijena je i na MRS podlozi gde je broj ćelija

laktobacila i bifidobakterija za 0,3 logN/ml veći u fermentacionoj podlozi sa surutkom.

Ovakav rezultat je malo neočekivan za streptokoke koje koriste laktozu kao osnovni

izvor energije za rast. Laktobacili i bifidobakterije mogu da koriste rafinozu i stahiozu

iz sojinog mleka za rast (Božanić et al, 2011) čime se može objasniti njihov sličan

broj na korišćenim podlogama za fermentaciju.

Slika 5. Promena broja ćelija tokom fermentacije sojinog mleka (SM) i sojinog mleka

obogaćenog surutkom (SMS) određivana na M17 I MRS podlozi

36

4.4 Stabilnost fermentisanih napitaka tokom skladištenja

Da bi neki proizvod mogao da se smatra probiotskim mora da sadrži 8

logN/ml ćelija. S obzirom da se fermentisani napici čuvaju u određenom vremenskom

period pre konzumiranja, potrebno je da broj ćelija probiotika ostane stabilan. Osim

toga, fermentisani poizvodi moraju da zadrže fizičkohemijske karakteristike i

organoleptička svojstva u period skladištenja. Fizičkohemijski parametri kao što su

pH vrednost, viskoznost i kapacitet zadržavanja vode su osnovni pokazatelji

stabilnosti proizvoda tokom čuvanja u dužem vremenskom periodu (Stijepić et al.,

2013).

Fermentisano sojino mleko i sojino mleko obogaćeno surutkom su odmah

nakon 6 sati fermentacije prebečeni u frižider. Na slici 6 prikazana je pH vrednost

fermentisanih napitaka od soje tokom skladištenja na 4C u period od 20 dana. Nakon

manjeg početnog pada pH vrednosti fermentisanih napitaka, njihova pH vrednost

ostaje stabilna do 20. dana. S obzirom da su u probiotskoj starter kulturi ABY-6

termofilne bakterije, one ne mogu da rastu na niskoj temperraturi od 4C u frižideru.

Takođe, stabilnost pH vrednosti dobijenih napitaka ukazuje da nije došlo do kvarenja

proizvoda tokom skladištenja.

Slika 6. pH vrednosti fermentisanog sojinog mleka (SM) i sojinog mleka sa dodatkom

surutke (SMS) tokom čuvanja na 4C

37

Na slici 7 prikazan je broj ćelija probiotskih bakterija određivan na MRS

podlozi u sojinom mleku i sojinom mleku obogaćenom surutkom u period od 20 dana

čuvanja na temperature od 4C. Broj ćelija malo varira u ispitivanom period. S

obzirom da su varijacije u broju ćelija od 0,02 do 0,06 logN/ml mogu se smatrati

eksperimentalnom greškom.

Slika 7. Broj bakterijskih ćelija u sojinom mleku (SM) i sojinom mleku obogaćenom

surutkom (SMS) na MRS podlozi u toku perioda čuvanja

38

Zaključci:

Na osnovu rezultata predstavljenih u ovom radu mogu se doneti sledeći zaključci:

Sojino mleko je dobar supstrat za rast probiotske starter kulture ABY-6.

Količina inokuluma ne utiče značajno na pH vrednost sojinog mleka nakon 4,5

sata fermentacije kao ni na broj ćelija određenih na M17 podlozi. Broj ćelija

na MRS podlozi je veći sa povećanjem količine inokuluma.

Broj ćelija streptokoka je veći nakon 4,5 sata fermentacije u odnosu na broj

dobijenih bakterijskih ćelija na MRS podlozi.

Dodavanje surutke u sojino mleko ne utiče značajno na pH vrednost

fermentisanog sojinog mleka, kao ni na broj bakterijskih ćelija na M17 i MRS

podlozi.

Fermentisano sojino mleko i sojino mleko sa dodatkom surutke imaju stabilne

vrednosti pH i broja ćelija u periodu od 20 dana čuvanja na 4C.

39

Literatura

Axelsson, L., 1998: Lactic Acid Bacteria: Classification and Physiology. In

Lactic Acid Bacteria - Microbiology and Functional Aspecta. - Marcel Dekker,

USA: 1 - 72.

Arzu K., Ihsan Z., 2014: Influence of inulin and demineralised whey powder

addition on the organic acid profiles of probiotic yoghurts. - International

Journal of Dairy Technology, 67.

Božanić R. et al., 2000: Senzorska svojstva i prihvatljivost jogurta i

aromatiziranog jogurta proizvedenog od kozjeg i kravljeg mlijeka. -

Mljekarstvo 50: 199-208.

Božanić R. et al., 2011: Optimising Fermentation of Soymilk with Probiotic

Bacteria Czech J. - Food Sci., 29: 51–56.

Božanić R. et al., 2008: Influence of temperature and glucose addition on

growth and survival of BCT culture in soymilk. - Mljekarstvo, 58: 171–179.

Brandon U. Hansen, 2004: Health Benefits of a Soy Milk Switch. – OmniNerd

http://www.omninerd.com/articles/Health_Benefits_of_a_Soy_Milk_Switch

Bulatović M. Lj. et al., 2014: Quality attributes of a fermented whey-based

beverage enriched with milk and a probiotic strain. - RSC Adv., 4: 55503–

55510.

Chengcheng L. et al., 2014: Microbiological, physicochemical and

rheological properties of fermented soymilk produced with exopolysaccharide

(EPS) producing lactic acid bacteria strains. - LWT - Food Science and

Technology, 57: 477 – 485.

Chiang, S. Pan, T., 2012: Beneficial effects of Lactobacillus paracasei subsp.

paracasei NTU 101 and its fermented products. - Applied Microbiology and

Biotechnology, 93: 903 - 916.

Cho, S.S., Finocchiaro, T., 2009: Handbook of Prebiotics and Probiotics

Ingredients: Health Benefits and Food Applications. - CRC press, USA.

Chou, C., Hou, J., 2000: Growth of bifidobacteria in soymilk and their

survival in the fermented soymilk drink during storage. - International Journal

of Food Microbiology, 56: 113 - 121.

Duraković, K., 2009: Primena kombuhe u tehnologiji funkcionalnih

fermentisanih mlečnih proizvoda. - Časopis saveza hemičara i tehnologa 20:

65-70.

Enders, J. G., 2001: Soy Protein Products: Characteristics, Nutritional Aspects,

and Utilization. - CRC press, USA.

Glišić, Z., 2006: Proizvodnja sira na tradicionalan način. - Kairos, Sremski

Karlovci.

Harrington. D.J., Chanter, N., 2002:The molecular basis of Streptococcus equi

infection and disease. - Microbes and Infection 4: 501-510.

Huffnagle, G.B., 2008: The Probiotics Revolution: The Definitive Guide to

Safe, Natural Health Solutions Using Probiotic and Prebiotic Foods and

Supplements. - Batman Dell, New York.

Katz. S.E., 2012: The Art of Fermentation: An In - Depth Exploration of

Essential Concepts and Processes from Around the World. - Foreword,

London.

Lahtinen, S. et al, 2011: Lactic Acid Bacteria: Microbiological and Functional

Aspects. - CRS press, USA.

40

Lin, F. et al, 2004: Fermentation of a milkesoymilk and Lycium chinense

Miller mixture using a new isolate of Lactobacillus paracasei subsp.

paracasei NTU101 and Bifidobacterium longum. - Journal of Industrial

Microbiology & Biotechnology, 31: 559 - 564.

Maćej, O., Marković D., 2008: Tehničko - tehnološki priručnik za mlekarstvo.

- Poljoprivredni fakultet, Zemun.

Makinen, K., 2012: Science and technology for the mastership of probiotic

applications.- Journal of biotechnology 162: 356-365.

Marković, D., 2003: Priručnik za mlekarstvo. - AD „Imlek“, Beograd.

Martinović, A. et al, 2006: Biotechnology in Animal Husbandry. - Institute for

Animal Husbandry, Belgrade.

Martirosyan, M.D., 2011: Functional Foods and Chronic Diseases: Science

and Practice. - Food Science Publisher, Texas, USA.

McCloud, T., 1992: Natto: A Breakfast Dish That's An Acquired Taste. -

Daily press.

http://articles.dailypress.com/1992-12-07/news/9212070016_1_natto-soybeans-

vinegar-flavored

Miletić, I. et al., 2009: Specijalne formulacije mleka za osobe sa posebnim

nutritivnim potrebama. - Farmaceutski fakultet, Institut za bromatologiju,

Beograd

Nenadić, N., 1982: Soja- Gajenje i upotreba. - Mala poljoprivredna biblioteka,

Beograd.

Otles, S., 2013: Probiotics and Prebiotics in Food, Nutrition and Health. -

CRC press, USA.

Pessione, E., 2014: Interactive Probiotics.- CRC press, USA.

Puđa, P., 2009: Tehnologija mleka i sirarstvo - Opšti deo. - Graph Style, Novi

Sad.

Rakin M. B., et al., 2015: Kvalitet fermentisanog napitka od surutke i mleka. -

Hemijska industrija

Riaz, M.N., 2005: Soy Applications in Food. - CRC press, USA.

Saad, N. et al, 2013: An overview of the last advances in probiotic and

prebiotic field. - LWT - Food Science and Technology 50: 1-16.

Silva, J.P.S., Freitas, A. C., 2014: Probiotic Bacteria: Fundamentals, Therapy,

and Technological Aspects. - CRC press, USA.

Schiffin, E.J., 2014: Intestinal Microbiota in Health and Disease: Modern

Concepts. - CRC press, USA.

Shurtleff, W., Aoyagi,A., 2011: History of Fermented Black Soybeans (165

B.C. to 2011). - Lafayette, California.

Stijepić M. et al., 2013: Physicochemical characteristics of soy probiotic

yoghurt with inulin additon during the refrigerated storage. - Romanian

Biotechnological Letters, 18.

Stojiljković, J., 2009: Prehrambena industrija- mleko i mlečni proizvodi. -

Časopis saveza hemičara i tehnologa 20: 130-133.

Versalovic, J., Wilson M., 2008: Therapeutic Microbiology: Probiotics and

Related Strategies. - CRC press, USA.

Vidhyalakshmi, R. et al, 2009: The Future of Probiotics. - Advances in

Biological Research 3: 96-103.

41

`Vissesanguan W. et al., 2005: Accelerated proteolysis of soy proteins during

fermentation of Thua - Nao innoculated with Bacillus subtilis. - Journal of

Food Biochemistry, 29: 349–366.

Xiaomi, T., 2006: Stand back! Stinky tofu chain stores arrive in Shenzhen. -

Shenzhen Daily.

http://paper.sznews.com/szdaily/20060602/ca2324508.htm

Zaid, A. et al, 2007: Biotehnološki rečnik za hranu i poljoprivredu. – Partenon,

Beograd