Embed Size (px)
Citation preview
Marko Močibob
NEKATALITIČKE PROTEINSKE DOMENE
EUKARIOTSKIH SERIL-tRNA-SINTETAZA
Doktorska disertacija
predložena Kemijskom odsjeku Prirodoslovno-matematičkog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu
radi stjecanja akademskog stupnja doktora prirodnih znanosti (kemija)
Zagreb 2010.
Marko Močibob
NON-CATALYTIC PROTEIN DOMAINS OF
EUKARYOTIC SERYL-tRNA SYNTHETASES
Doctoral Thesis
submitted to the Department of Chemistry, Faculty of Science, University of Zagreb,
for the academic degree of Doctor of Natural Sciences (Chemistry)
Zagreb 2010.
V
Ova doktorska disertacija izrađena je na Zavodu za biokemiju Kemijskog odsjeka Prirodoslovno-matematičkog fakulteta, Sveučilišta u Zagrebu, pod vodstvom dr. sc. Ivane Weygand-Đurašević, red. prof.
VII
Puno hvala
Mentorici, na pruženom povjerenju i podršci u izradi doktorske disertacije.
Kolegama i prijateljima - sadašnjim i bivšim, na Zavodu za biokemiju, na
ugodnoj radnoj atmosferi, razgovorima, savjetima, podršci i pomoći u
svakodnevnom radu.
Mojim diplomandima koji su aktivno sudjelovali u eksperimentalnom radu.
Ruđerovcima u petom krilu na gostoprimstvu i prijateljskoj okolini.
Prijateljima i obitelji posebno koji su me pratili i podržavali na životnom putu.
IX
SADRŽAJ
1. UVOD .....................................................................................................1 2. LITERATURNI PREGLED ........................................................................3
2.1. Seril-tRNA-sintetaze ........................................................................................3 2.1.1. Struktura bakterijskih SerRS..................................................................3 2.1.2. Struktura arhealnih SerRS......................................................................5 2.1.3. Obilježja eukariotskih SerRS.................................................................8 2.1.4. Polipeptidni produžetak SerRS iz kvasca Saccharomyces cerevisiae .11 2.1.5. Struktura mitohondrijske SerRS sisavaca............................................12
2.2. Dodatne domene eukariotskih aminoacil-tRNA-sintetaza: raznolikost strukture i funkcije ........................................................................................14 2.2.1. Pomoćne domene za vezanje tRNA.....................................................14 2.2.2. Multienzimski kompleks aminoacil-tRNA-sintetaza...........................17 2.2.3. Interakcije aminoacil-tRNA-sintetaza s elongacijskim faktorima.......18 2.2.4. Interakcije kvaščevih aminoacil-tRNA-sintetaza s proteinom Arc1p .20 2.2.5. Ostale uloge produžetaka eukariotskih aminoacil-tRNA-sintetaza .....22 2.2.6. Usporedba s polipeptidnim produžetkom eukariotskih seril-tRNA-
sintetaza................................................................................................25
3. MATERIJALI I METODE .......................................................................27 3.1. Materijali ........................................................................................................27
3.1.1. Standardne kemikalije..........................................................................27 3.1.2. Aminokiseline, baze i nukleotidi .........................................................27 3.1.3. Boje ......................................................................................................28 3.1.4. Enzimi, proteini i nukleinske kiseline..................................................28 3.1.5. Sastojci mikrobioloških hranjivih podloga i medija ............................28 3.1.6. Kromatografske kolone i punila...........................................................28 3.1.7. Komercijalni kompleti ("kitovi") za pročišćavanje DNA....................29 3.1.8. Sojevi i plazmidi E. coli.......................................................................29 3.1.9. Sojevi i plazmidi kvasca Saccharomyces cerevisiae ...........................30 3.1.10. Mikrobiološki mediji i podloge ...........................................................32
3.2. Određivanje koncentracije proteina po Bradfordu....................................33 3.3. Elektroforetske metode .................................................................................34
3.3.1. Elektroforeza proteina na poliakrilamidnom gelu u prisutnosti SDS-a (SDS-PAGE)........................................................................................34
3.3.2. Western-analiza....................................................................................34 3.3.3. Nativna elektorforeza kompleksa proteina i nukleinskih kiselina .......35 3.3.4. Elektroforeza DNA u agaroznom gelu ................................................37
3.4. Metode rekombinantne DNA........................................................................37 3.4.1. Lančana reakcija polimeraze (PCR) ....................................................37 3.4.2. Lančana reakcija polimeraze (PCR) na bakterijskim kolonijama........38 3.4.3. Kloniranje i ciljana mutageneza gena za SerRS kukuruza ..................38 3.4.4. Kloniranje gena za krnji oblik SerRS kvasca ......................................41 3.4.5. Kloniranje gena za kimerne proteine kvaščeve i kukuruzne SerRS ....42 3.4.6. Određivanje nukleotidnog slijeda DNA - sekvenciranje .....................43 3.4.7. Transformacija kvasaca metodom s litijevim acetatom.......................43 3.4.8. Izolacija DNA iz kvasca ......................................................................44
X
3.5. Metode pročišćavanja proteina ....................................................................45 3.5.1. Izolacija i pročišćavanje kukuruzne SerRS, njezinih krnjih i mutiranih
oblika afinitetnom kromatografijom na Ni-NTA agarozi ....................45 3.5.2. Izolacija i pročišćavanje kvaščeve SerRS i njezinog krnjeg oblika
SerRS∆C13 ..........................................................................................46 3.5.3. Izolacija i pročišćavanje kimernih proteina Zm18Sc13 i Zm26Sc20..48
3.6. Izolacija i pročišćavanje tRNA iz kukuruza................................................49 3.6.1. Ekstrakcija nukleinskih kiselina kukuruza...........................................49 3.6.2. Izdvajanje tRNA iz taloga nukleinskih kiselina i deacilacija tRNA....50 3.6.3. Kromatografija tRNA na DEAE-celulozi ............................................50
3.7. Određivanje aminoacilacijske aktivnosti enzima .......................................51 3.7.1. Standardna reakcija aminoaciliranja ....................................................51 3.7.2. Određivanje udjela tRNASer u ukupnoj tRNA .....................................52 3.7.3. Određivanje kinetičkih parametara za tRNA i serin ............................52 3.7.4. Termička inaktivacija enzima ..............................................................53
3.8. Komplementacija soja kvasca s inaktiviranim genom za SerRS...............53 3.8.1. Konstrukcija plazmida korištenih u pokusima komplementacije ........53 3.8.2. Komplementacija S. cerevisiae BR2727∆SES1 metodom izmjene
plazmida...............................................................................................54 3.8.3. Provjera uspješnosti komplementacije.................................................55
3.9. Metode detekcije proteinskih interakcija ....................................................56 3.9.1. Vezanje SerRS na Ni-NTA agarozu s imobiliziranim Pex21p............56 3.9.2. Sustav dvaju hibrida.............................................................................57
4. REZULTATI ..........................................................................................59 4.1. Konstrukcija krnjih i mutiranih oblika kvaščeve i kukuruzne seril-tRNA-
sintetaze...........................................................................................................59 4.1.1. Preliminarni rezultati i potraga za prikladnim ekspresijskim sustavom ..
............................................................................................................59 4.1.2. Mutanti i deletanti seril-tRNA-sintetaza iz kvasca i kukuruza korišteni
u ovom radu .........................................................................................61 4.1.3. Proksimalna regija produžetka na C-kraju presudna je za stabilnost
eukariotskih SerRS...............................................................................63 4.2. Utjecaj produžetaka na katalitička svojstva ZmcSerRS i ScSerRS i
vezanje tRNA..................................................................................................66 4.2.1. Odabir supstrata za određivanje kinetičkih parametara ZmcSerRS i
njezinih varijanti ..................................................................................66 4.2.2. Priprava i pročišćavanje ukupne tRNA iz kukuruza............................67 4.2.3. Utjecaj produžetaka na kinetičke parametre za tRNA.........................69 4.2.4. Utjecaj produžetaka na vezanje tRNA u elektroforezi pri nativnim
uvjetima................................................................................................70 4.2.5. Određivanje kinetičkih parametara za serin.........................................72
4.3. Komplementacija kvaščevog soja BR2727∆SES1 krnjim oblicima ScSerRS i ZmcSerRS.....................................................................................73 4.3.1. Metoda izmjene plazmida ....................................................................73 4.3.2. Komplementacije rekombinantnim centromernim plazmidom pUN100
............................................................................................................74 4.3.3. Komplementacija sa ZmcSerRS konstruktima u plazmidu pVT103-L77
4.4. Uloga produžetka kvaščeve SerRS u interakciji s peroksinom Pex21p....78 4.4.1. Kimerni proteini kvaščeve i kukuruzne SerRS....................................78
XI
4.4.2. Interakcija kimernih proteina s Pex21p imobiliziranim na Ni-NTA agarozi..................................................................................................79
4.4.3. Interakcija kimernih proteina s Pex21p u sustavu dvaju hibrida .........80
5. RASPRAVA ...........................................................................................85 5.1. Utjecaj proksimalne regije produžetaka na C-kraju eukariotskih SerRS
na njihovu strukturu......................................................................................85 5.1.1. Proksimalna regija produžetaka na C-kraju eukariotskih seril-tRNA-
sintetaza neophodna je za njihovu stabilnost .......................................85 5.1.2. Smještaj C-terminalnog produžetka u prostornoj strukturi SerRS ......86 5.1.3. Utjecaj histidinskog privjeska na svojstva rekombinantnih SerRS .....87 5.1.4. Utjecaj C-terminalnog produžetka na kinetička svojstva SerRS .........88
5.2. Uloga produžetka kvaščeve SerRS u vezanju peroksina Pex21p ..............89 5.2.1. Kompleks SerRS i Pex21p je osobitost kvasca S. cerevisiae?.............90
5.3. Smjernice za buduća istraživanja.................................................................91
6. ZAKLJUČCI ..........................................................................................93 7. LITERATURA........................................................................................95 8. POPIS KRATICA .................................................................................107 9. ŽIVOTOPIS .........................................................................................109
XIII
SAŽETAK Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Doktorska disertacija Kemijski odsjek
Nekatalitičke proteinske domene eukariotskih seril-tRNA-sintetaza
Marko Močibob
Kemijski odsjek, Prirodoslovno-matematički fakultet
Horvatovac 102a, 10 000 Zagreb Seril-tRNA-sintetaze (SerRS) su enzimi koji kataliziraju sintezu seril-tRNASer za potrebe biosinteze proteina na ribosomu. Zbog svoje nezamjenjive uloge u biosintezi proteina, prisutni su u svim živim stanicama, u organizmima iz sve tri domene života i evolucijski su dobro očuvani. Osobitost seril-tRNA-sintetaza eukariota jest bazični polipeptidni produžetak na C-kraju katalitičke domene, kojeg bakterijski homolozi ne posjeduju. Priređen je niz mutiranih oblika (deletanata i mutanata) seril-tRNA-sintetaze kukuruza i kvasca u području produžetka na C-kraju svojstvenog eukariotskim SerRS, u svrhu istraživanja njegove uloge. Istražena su svojstva krnjih i mutiranih enzima kombinacijom metoda in vitro i in vivo. Uklanjanje cjelokupnog polipeptidnog produžetka narušava stabilnost SerRS kvasca i kukuruza. Mutagenezom i mjerenjem termalne stabilnosti krnjih i kimernih proteina mapirana je proksimalna regija produžetka, koja spaja produžetak s katalitičkom domenom, kao neophodna za stabilnost eukariotskih SerRS. Određivanje kinetičkih parametara krnjih enzima pokazalo je da produžeci ne utječu na katalitička svojstva krnjih enzima, te da produžeci ne predstavljaju pomoćne vezne domene za tRNA. Krnji proteini kvaščeve i kukuruzne SerRS potpuno su funkcionalni in vivo i komplementiraju soj kvasca inaktiviranog gena za SerRS. Produžetak kvaščeve SerRS neophodan je za nastajanje kompleksa s peroksinom Pex21p. Stoga su dizajnirani kimerni proteini SerRS kukuruza s produžetkom kvaščeve SerRS. Kimerni proteini nisu se vezali na imobilizirani Pex21p in vitro, niti je sustavom dvaju hibrida u kvascu detektirana interakcija in vivo, što sugerira da su ostale regije kvaščeve SerRS uključene u interakciju s Pex21p. Proksimalni dio produžetka neophodan je za stabilnost enzima, dok je ostatak slobodan za ostale uloge, kao ostvarivanje proteinskih interakcija. 111 + XV stranica, 32 slike, 12 tablica, 112 literaturnih navoda, jezik izvornika: hrvatski Rad je pohranjen u Nacionalnoj i sveučilišnoj knjižnici u Zagrebu, ulica Hrvatske bratske zajednice 4, i Središnjoj kemijskoj knjižnici u Zagrebu, Horvatovac 102A Ključne riječi: peroksin / produžeci aminoacil-tRNA-sintetaza / seril-tRNA-sintetaza, stabilnost seril-tRNA-sintetaza / tRNA Mentor: Dr. sc. Ivana Weygand-Đurašević, red. prof. Ocjenitelji: Dr. sc. Đurđica Ugarković, zn. savj. IRB i nasl. red. prof. PMF Dr. sc. Ivana Weygand-Đurašević, red. prof. Dr. sc. Vladimir Mrša, red. prof. Rad prihvaćen 11. siječnja 2010.
XV
ABSTRACT University of Zagreb Faculty of Science Doctoral Thesis Department of Chemistry
Non-catalytic protein domains of eukaryotic seryl-tRNA synthetases
Marko Močibob
Department of Chemistry, Faculty of Science
Horvatovac 102a, 10 000 Zagreb Seryl-tRNA synthetases (SerRS) are enzymes catalyzing synthesis of seryl-tRNASer, required in protein biosynthesis. These enzymes are essential for every living cell, they are present in organisms from three kingdoms of life, and evolutionary are well preserved. Eukaryotic cytosolic (SerRS) have idiosyncratic C-terminal extensions not present in prokaryotic counterparts. In order to explore the function of idiosyncratic extension of eukaryotic SerRS, a series of truncations and mutations were introduced to extensions of the yeast and maize SerRS. The properties of truncated or mutated enzymes were assessed both in vitro and in vivo. Complete removal of polypeptide extension deleteriously affects stability of truncated maize and yeast SerRS. Mutagenesis and thermal inactivation studies of truncated and chimeric proteins pinpointed proximal region, adjacent to the catalytic core, as indispensable for protein stability. Determination of kinetic parameters revealed that extensions do not affect the catalytic properties of truncated enzymes, nor they represent the auxiliary tRNA-binding domains. Truncated variants of yeast and maize SerRS were fully functional in vivo, as demonstrated by their ability to complement Saccharomyces cerevisiae strain with disrupted SerRS gene. Although the yeast C-terminal SerRS extension is required for Pex21p binding, the chimeric proteins of maize SerRS with appended yeast SerRS extension remained incapable of Pex21p binding, both in vitro as shown by pull-down assay, and in vivo, in yeast two-hybrid assay. This implies that additional regions of yeast SerRS may also contribute to the interaction with the peroxin. The proximal region of the eukaryotic SerRS C-terminal extension is indispensable for protein stability, while the remaining part of the extension remains available for other functions, such as species-specific protein:protein interactions. 111 + XV pages, 32 figures, 12 tables, 112 references, original in Croatian language Thesis deposited in National and University Library in Zagreb, ulica Hrvatske bratske zajednice 4, and Central Chemical Library in Zagreb, Horvatovac 102A Keywords: aaRS extensions / peroxin /seryl-tRNA synthetase / SerRS stability / tRNA Mentor: Dr. Ivana Weygand-Đurašević, Professor Reviewers: Dr. Đurđica Ugarković, Senior researcher Dr. Ivana Weygand-Đurašević, Professor Dr. Vladimir Mrša, Professor Thesis accepted: January 11th, 2010
1
1. UVOD Aminoacil-tRNA-sintetaze (aaRS) [1] su evolucijski stari i dobro očuvani
enzimi koji sudjeluju u biosintezi proteina. Oni kataliziraju sintezu aminoacil-tRNA
(aa-tRNA) potrebnih u translaciji mRNA na ribosomu. Reakcija se odvija u dva
koraka: aminokiselina (aa) aktivira se ATP-om pri čemu nastaje aminoacil-adenilat
(aa-AMP), i zatim se prenosi na odgovarajuću tRNA:
aa + ATP aa-AMP + PPi
aa-AMP + tRNA aa-tRNA + AMP
aa + ATP + tRNA aa-tRNA + AMP + PPi
U pravilu, za svaku pojedinu aminokiselinu postoji odgovarajuća aminoacil-tRNA-
sintetaza, pa se pojedine aaRS označavaju troslovnom (ili jednoslovnom) kraticom
aminokiseline za koju su specifične; tako npr. SerRS (ili SRS) označava seril-tRNA-
sintetazu, LysRS (ili KRS) predstavlja lizil-tRNA-sintetazu, itd. Aminoacil-tRNA-
sintetaze su vrlo specifični enzimi koji pripadne supstrate (aminokiselinu i tRNA)
prepoznaju s visokom točnošću, što je neophodno za točnost biosinteze proteina u
cjelini. S obzirom da sudjeluju u osnovnom staničnom procesu - biosintezi proteina,
prisutni su u svakoj stanici, u sve tri domene života, i vjerojatno su bili među prvim
proteinima koji su nastali u evoluciji živog svijeta [2].
Aminoacil-tRNA-sintetaze modularne su građe i sastoje se od katalitičke
domene koja katalizira aktivaciju aminokiseline i esterifikaciju tRNA, te vezne
domene za tRNA koja omogućuje prepoznavanje pripadne tRNA. Iako je njihov
mehanizam aminoacilacije temeljno jednak, aminoacil-tRNA-sintetaze dijele se u dva
nepovezana razreda (razred I i II), na temelju međusobno isključivih motiva u
primarnoj strukturi katalitičke domene [3], a koji odražavaju razlike u topologiji
aktivnog mjesta [4]. Razlike u arhitekturi aktivnog mjesta odražavaju se i na različit
način vezanja zajedničkih supstrata, ATP-a i tRNA. I dok je struktura katalitičkih
domena unutar pojedinog razreda relativno očuvana, uz jasno prepoznatljive
strukturne motive, vezne domene za tRNA pokazuju iznenađujuću strukturnu
varijabilnost i divergentnost. Vezne domene za tRNA nisu očuvane unutar pojedinog
razreda, i pojedine vrste aaRS posjeduju strukturno različite vezne domene za tRNA.
Uvod
2
Uz katalitičku i veznu domenu za tRNA, pojedine aaRS mogu posjedovati
dodatne domene ili peptidne sljedove; npr. domene za hidrolizu nepravilno
aminoaciliranih tRNA ili aa-AMP (eng. proofreading ili editing domains), signalne
sljedove za unos u organele i sl. Osobitost eukariotskih aminoacil-tRNA-sintetaza* je
da često posjeduju dodatne domene ili polipeptidne produžetke na svojem N- ili C-
kraju, koje nisu prisutne kod njihovih bakterijskih homologa. Struktura i uloga tih
produžetaka i dodatnih domena vrlo je raznolika (vidi literaturni pregled). Takav je
slučaj i s eukariotskim seril-tRNA-sintetazama (SerRS), koje posjeduju kratak
polipeptidni produžetak (tipično 17-46 aminokiselina) na C-kraju kojeg ne nalazimo
kod njihovih bakterijskih homologa. Delecija polipeptidnog produžetka kvaščeve
SerRS narušava stabilnost proteina in vivo i in vitro te uzrokuje promjene u afinitetu
za supstrate [5, 6]. Novija istraživanja pokazala su da kvaščeva seril-tRNA-sintetaza
stvara interakcije s Pex21p [7], proteinom uključenim u biogenezu peroksisoma.
Zanimljivo, delecijom produžetka na C-kraju kvaščeve SerRS ta se interakcija gubi
[8], što upućuje na sudjelovanje produžetka u ostvarivanju interakcije s Pex21p.
Cilj istraživanja je pobliže upoznati i definirati ulogu produžetaka eukariotskih
citosolnih seril-tRNA-sintetaza, kombinacijom in vitro metoda proteinske biokemije i
genetičkih in vivo metoda u kvascu. Istraživanja su proširena na kukuruznu seril-
tRNA-sintetazu, koja također posjeduje produžetak na C-kraju od 26 aminokiselina.
Generiran je niz mutanata i deletanata kvaščeve i kukuruzne seril-tRNA-sintetaze, s
ciljem da se raščlane strukturno i funkcionalno značajne regije produžetaka. Ispitana
su katalička svojstva i stabilnost mutiranih i krnjih proteina te utjecaj na afinitet prema
tRNA i serinu. Biološki značaj produžetaka i moguća nekatalitička uloga testirane su
in vivo, u pokusima komplementacije stanica kvasca s inaktiviranim genom za SerRS.
Metodama rekombinantne DNA priređeni su kimerni proteini kukuruzne SerRS s
produžetkom kvaščeve SerRS da bi se ispitalo je li produžetak glavna i dominantna
regija interakcije peroksina Pex21p s kvaščevom SerRS. Korištene su
komplementarne in vivo i in vitro metode, kvaščev sustav dvaju hibrida (eng. yeast
two-hybrid) i vezanje na kolonu s imobiliziranim Pex21p (eng. pull-down assay).
* U ovoj radnji pod "eukariotskim aminoacil-tRNA-sintetazama" najčešće se podrazumijevaju citosolne eukariotske aminoacil-tRNA-sintetaze. Naime, u eukariotskim stanicama osim u citoplazmi translacija se odvija i u drugim staničnim odjeljcima (mitohondriji, kloroplasti i srodni organeli) gdje aminoacilaciju tRNA često (ne uvijek!) kataliziraju drukčije forme aaRS nego u citoplazmi.
3
2. LITERATURNI PREGLED
2.1. Seril-tRNA-sintetaze
2.1.1. Struktura bakterijskih SerRS
Seril-tRNA-sintetaze iz svih dosad istraživanih organizama su homodimerni
enzimi relativne molekulske mase 100 000 - 120 000 [9]. Njihova biološka uloga je
vezanje serina na pripadne tRNASer. Poput većine aaRS, modularne su građe, i
podjedinice se sastoje od N-terminalne vezne domene za tRNA i globularne, C-
terminalne katalitičke domene (slika 1).
Slika 1: Struktura seril-tRNA-sintetaze iz Thermus thermophilus. Lijevo: pogled niz molekulsku os simetrije II. reda. Desno: pogled na vezne domene za tRNA izložene otapalu. U jednoj podjedinici žutonarančastom bojom označena je N-terminalna vezna domena za tRNA, a purpurnom bojom globularna katalitička domena. Druga podjedinica obojana je sivo, a naglašeni su motiv 1 (plavo), motiv 2 (zeleno) i motiv 3 (žuto). Prema koordinatama PDB ID 1sry, M. Fujinaga et al., J. Mol. Biol. 234 (1993) 222-233.
Seril-tRNA-sintetaza (SerRS) iz bakterije Escherichia coli prva je sintetaza
razreda II kojoj je 1990. godine određena trodimenzionalna struktura [10]. Ona je
nedvojbeno pokazala da se topologija katalitičke domene aaRS razreda II u potpunosti
razlikuje od one razreda I i potvrdila da su dva razreda aaRS nastala neovisno tijekom
evolucije. Katalitička domena sastoji se od sedmeročlane antiparalelne β-ploče i dvije
α-zavojnice koje ih povezuju, i takva je topologija jedinstvena za aaRS razreda II.
Katalitičke domene aaRS razreda I građene su oko tzv. Rossmann-ove strukture (eng.
Rossmann fold ili Rossmann dinucleotide-binding domain) koja se pojavljuje i kod
drugih porodica enzima (dehidrogenaze, kinaze i sl.) kao vezna domena za nukleotide.
Literaturni pregled
4
C-terminalna katalitička domena globularne je građe i zadužena je za
aktivaciju i prijenos serina na tRNASer. Seril-tRNA-sintetazi iz bakterije Thermus
thermophilus određena je kristalna struktura u različitim kompleksima sa supstratima
(ATP, analozi Ser-AMP-a, tRNASer) [11 , 12]. U katalitičkoj domeni očuvani su
strukturni motivi 1, 2 i 3, karakteristični za aaRS razreda II (slika 1). Motiv 1 dio je
dodirne površine podjedinica, pa je većina aaRS razreda II dimerne prirode. Motiv 2 i
3 dio su aktivnog mjesta enzima. Motiv 2 u strukturi SerRS obuhvaća dva
antiparalelna lanca β-ploče povezana fleksibilnom petljom. Bočni ogranci motiva 2
stvaraju vezno mjesto za ATP, a zanimljivo je da pri vezanju tRNASer nakon
aktivacije serina, petlja motiva 2 mijenja konformaciju i, umjesto s ATP ili Ser-AMP,
stupa u interakciju s akceptorskom peteljkom tRNA [12]. Motiv 3 obuhvaća α-
zavojnicu i jedan lanac β-ploče, i zajedno s motivom 2 formira vezno mjesto za serin i
ATP. Visoka selektivnost prema vezanju serina osigurana je malom veličinom veznog
mjesta za bočni ogranak supstrata i vodikovim vezama između hidroksilne skupine
serina i aminokiselina aktivnog mjesta [11].
Vezna domena za tRNA ima karakterističnu strukturu dvije međusobno
svijene antiparalelne α-zavojnice (eng. coiled coil), duljine oko 60 Å, koje su izložene
otapalu (slika 1). Njezina struktura stabilizirana je pravilnim ponavljanjem
hidrofobnih bočnih ogranaka (većinom leucina i izoleucina) na međupovršni između
dvije α-zavojnice. Presudna uloga N-terminalne domene u prepoznavanju i vezanju
tRNASer potvrđena je eksperimentalno. Delecija te regije uzrokuje značajan pad
aminoacilacijske aktivnosti, dok vezanje serina i ATP-a ostaje nepromijenjeno [13].
Zbog gubitka specifičnosti za tRNASer, ovakav krnji enzim katalizira serilaciju
nepripadnih tRNA u E. coli. Kristalne strukture kompleksa SerRS iz T. termophilus s
tRNASer [12, 14] pokazale su da se N-terminalna domena SerRS postavlja okomito na
peteljku varijabilne regije tRNASer, i ostvaruje niz interakcija prvenstveno s
okosnicom varijabilne regije tRNASer te D- i T-petljama tRNASer. Pri tome je
akceptorska peteljka tRNA usmjerena u aktivno mjesto katalitičke domene druge
podjedinice. Prema tome, tRNA se veže preko obje podjedinice (slika 2).
Literaturni pregled
5
Slika 2: Kompleks seril-tRNA-sintetaze, tRNASer i Ser-AMS (analog Ser-AMP-a). Podjedinice su označene žutom i plavom bojom. Okosnica tRNA istaknuta je crvenom bojom, a baze zelenom. Analog Ser-AMP-a u aktivnom mjestu prikazan je kalotno. Model je orijentiran tako da se vidi akceptorska (sredina) i varijabilna regija tRNA koja završava u donjem lijevom kutu slike. Preuzeto iz S. Cusack et al, EMBO J. 15 (1996), 2834-2842.
Tzv. "varijabilna ruka" - dodatna peteljka i omča u varijabilnoj regiji tRNA, osobitost
je tRNA izoakceptora za serin, leucin i tirozin kod bakterija, odnosno serin i leucin
kod eukariota i arheja, i važan je element prepoznavanja tRNA za SerRS. Zanimljivo
je da je antikodon tRNASer pri vezanju na SerRS izložen otapalu i nije identitetni
element za SerRS.
2.1.2. Struktura arhealnih SerRS
Primarne strukture seril-tRNA-sintetaza evolucijski su umjereno dobro
očuvane, pogotovo u području C-terminalne katalitičke domene [2], stoga se vjeruje
da su opisane strukture bakterijskih SerRS reprezentativne, te da opažena strukturna i
mehanistička obilježja vrijede općenito. Nedavno riješena kristalna struktura seril-
tRNA-sintetaze iz termofilne arheje Pyrococcus horikoshii to je direktno potvrdila [15]
(slika 3, lijevo). Na slici 3 (lijevo) vidi se da SerRS iz P. horikoshii rekapitulira
glavna obilježja prethodno opisanih bakterijskih SerRS (slika 1): N-terminalna
domena posjeduje karakterističnu strukturu antiparalelne α-zavojnice, a globularna
domena jednake je arhitekture kao kod bakterijskih SerRS. Od 7 bočnih ogranaka koji
kod SerRS iz T. termophilus ostvaruju interakcije s varijabilnom rukom tRNASer, 6
bočnih ogranka je očuvano u strukturi SerRS iz P. horikoshii. Računalnim
modeliranjem prema bakterijskim SerRS izgrađen je model vezanja tRNA na arhealnu
Literaturni pregled
6
SerRS, a ciljanom mutagenezom okarakterizirani su dodatni bočni ogranci N-domene
koji su očuvani kod arhealnih i eukariotskih SerRS i sudjeluju u vezanju tRNA.
Arhealna SerRS iz P. horikoshii serilira bakterijske tRNASer iz T. termophilus i E. coli
s jednakom učinkovitošću kao svoju pripadnu tRNASer. Globularna, C-terminalna
katalitička domena posjeduje dodatnu inserciju svojstvenu arhealnim SerRS, koja
formira kratku dvolančanu paralelnu β-ploču i α-zavojnicu (slika 3, lijevo). Zajedno s
antiparalelnom β-pločom svojstvenoj aaRS razreda II i petljom motiva 2, insercija
stvara pozitivno nabijeni kanal koji vodi prema aktivnom mjestu i možda potpomaže
vezanje 3' kraja tRNA. Kristalna struktura kompleksa SerRS iz P. horikoshii s
analogom seril-adenilata pokazala je da su interakcije sa seril-adenilatom u aktivnom
mjestu istovjetne kao kod bakterijskih SerRS.
Slika 3: Usporedba arhealnih SerRS bakterijskog (lijevo) i metanogenog tipa (desno). Lijevo: SerRS iz Pyrococcus horikoshii (PDB ID: 2dq0, Y. Itoh et al., RNA Biol. 5 (2008) 54-62). Desno: atipična SerRS iz Methanosarcina barkeri (PDB ID: 2cja, S. Bilokapić et al., EMBO J. 25 (2006) 2498-509). Žutonarančastom bojom označena je vezna domena za tRNA, a purpurnom bojom katalitička domena. Druga podjedinica prikazana je sivo. Plave kuglice predstavljaju ione cinka u aktivnom mjestu atipične SerRS iz M. barkeri. Insercija karakteristična za arhealne SerRS bakterijskog tipa i motiv HTH atipičnih SerRS označeni su plavom bojom.
Zanimljivu iznimku od univerzalne evolucijske očuvanosti strukture SerRS
predstavljaju SerRS malog broja metanogenih arheja. Dok većina arheja posjeduje
seril-tRNA-sintetaze homologne SerRS bakterija, za koje je kristalna struktura SerRS
iz P. horikoshii zorno pokazala i strukturnu sličnost, manji broj metanogenih arheja
posjeduje SerRS izrazito divergentne primarne strukture [16]. Sličnost s bakterijskim
SerRS je minimalna, i uočljiva uglavnom unutar očuvanih motiva razreda II.
Eksperimentalno je pokazano [16] da ti divergentni enzimi doista imaju sposobnost
seriliranja tRNASer. Ipak, tek je kristalna struktura SerRS iz metanogene arheje
Methanosarcina barkeri [ 17 ] otkrila iznenađujuće strukturne razlike naprama
Literaturni pregled
7
opisanim SerRS, kako u katalitičkoj domeni, tako i u veznoj domeni za tRNA (slika
3). Stoga se dosad opisane SerRS prisutne u sve tri domene života (bakterije, eukarioti,
većina arheja) nazivaju bakterijskim tipom ili kanonskim SerRS, dok potonje
nazivamo metanogenim tipom ili atipičnim SerRS [18].
Uočljivo je da N-terminalna domena atipične SerRS iz M. barkeri ima
potpuno drukčiju strukturu od SerRS bakterijskog tipa. Umjesto dugačkih
antiparalelnih α-zavojnica, N-terminalna domena SerRS iz M. barkeri građena je od
šesterolančane β-ploče okružene kratkim α-zavojnicama (slika 3, desno). Računalno
modeliranje [17] kao i eksperimentalna istraživanja [19] potvrdila su da N-terminalna
domena neobične strukture ima ulogu vezne domene za tRNA, te da se tRNA veže
preko obje podjedinice [20], kao kod SerRS bakterijskog tipa (slika 2).
Katalitička domena metanogenih SerRS također pokazuje značajne razlike u
usporedbi s katalitičkom domenom bakterijskih SerRS. Najzanimljivija razlika jest da
su atipične SerRS metaloenzimi, s ionom cinka u aktivnom mjestu. Ion cinka
sudjeluje u vezanju serina, koordinirajući α-amino-skupinu aminokiseline [17].
Nadalje, prilikom vezanja serina dolazi do konformacijske promjene dotad fleksibilne
petlje (eng. serine ordering loop) [17] koja poprima konformaciju α-zavojnice i stupa
u interakciju sa serinom ili seril-adenilatom vezanom u aktivnom mjestu.
Odgovarajuća regija kod bakterijskog tipa SerRS je kraća, i ne mijenja konformaciju u
α-zavojnicu. Prema tome, vezno mjesto za serin kod atipičnih SerRS bitno se razlikuje
od veznog mjesta za serin kod kanonskih SerRS. Funkcionalne i mehanističke razlike
u prepoznavanju serina očituju se i u različitoj osjetljivosti dva tipa SerRS prema
kompetitivnim inhibitorima [21]. Vezno mjesto za ATP je slično kao kod SerRS
bakterijskog tipa, i ATP se veže u svinutoj konformaciji karakterističnoj za aaRS
razreda II. Treća osobitost katalitičke domene atipičnih SerRS jest insercija koja u
prostornoj strukturi poprima konformaciju dvije α-zavojnice povezane kratkom
omčom, tzv. HTH-motiv (eng. helix-turn-helix). HTH-motiv pozicionira se iznad
katalitičke domene suprotne podjedinice i povećava dodirnu površinu dimera [17]. Na
HTH-motiv oslanja se i N-terminalna domena suprotne podjedinice, pa je HTH-motiv
kritičan za ispravno pozicioniranje N-terminalne domene [20] (slika 3, desno) koja je
s katalitičkom domenom povezana fleksibilnim polipeptidnim lancem. Delecija HTH-
motiva dovodi do inaktivacije enzima, jer katalitička domena gubi sposobnost vezanja
Literaturni pregled
8
cinka i aktivacije serina, vjerojatno uslijed propagacije strukturnih promjena
uzrokovanih delecijom sve do aktivnog mjesta, što dodatno potvrđuje važnost motiva
HTH u sveukupnoj arhitekturi atipičnih SerRS.
Zanimljivo je spomenuti da su kod nekih bakterija koje posjeduju kanonski tip
SerRS pronađeni homolozi SerRS metanogenog tipa, kojima nedostaje N-terminalna
vezna domena za tRNA. Unatoč relativno niskoj sličnosti na razini primarne strukture,
njihova prostorna struktura pokazuje zapanjujuću sličnost s katalitičkom domenom
metanogenog tipa SerRS, s cinkom u aktivnom mjestu i motivom HTH. (N. Ivić,
neobjavljeno). Prisutnost kanonskih SerRS u tim organizmima, i nedostatak vezne
domene za tRNA sugeriralo je da njihova uloga nije aminoaciliranje tRNA. To je i
potvrđeno, te se ispostavilo da ti krnji homolozi atipičnih SerRS aminoaciliraju
određene proteine s fosfopanteteinskom prostetičkom skupinom (M. Močibob,
neobjavljeno). Osim proteina MshC iz Mycobacterium smegmatis [22, 23], homologa
CysRS, to je do sada jedini poznati primjer homologa aaRS koji je izašao iz okvira
biosinteze proteina ili aminokiselina i predstavlja uzbudljivu poveznicu između
sinteze proteina i neribosomske sinteze peptida.
2.1.3. Obilježja eukariotskih SerRS
Eukariotske SerRS pokazuju umjerenu sličnost s bakterijskim i arhealnim
SerRS na razini primarne strukture, i pripadaju tzv. bakterijskom ili kanonskom tipu
SerRS. Funkcionalno su slični s bakterijskim enzimima, te ih često mogu zamijeniti in
vivo. Tako npr. kvaščeva seril-tRNA-sintetaza može funkcionalno komplementirati
bakterijsku SerRS in vivo, u soju E. coli s termosenzitivnom SerRS [24]. Isto tako, i
organelna i citosolna SerRS iz evolucijski udaljenog kukuruza komplementiraju soj E.
coli s termosenzitivnom SerRS [25; S. Lesjak, neobjavljeno]. Također i organelna i
citosolne SerRS kukuruza mogu komplementirati in vivo mitohondrijsku [ 26 ],
odnosno citosolnu SerRS kvasca [ovaj rad]. Nadalje, mutagenezom petlje motiva 2
kod kvaščeve SerRS [27] pokazano je da su bočni ogranci na analognim položajima
funkcionalno slični, te da aktivno mjesto kvaščeve SerRS strukturno i funkcionalno
nalikuje bakterijskim homolozima. Riješene strukture bakterijskih SerRS omogućile
su dobru interpretaciju rezultata u strukturnom kontekstu.
Ono po čemu se eukariotske i arhealne SerRS razlikuju od bakterijskih
homologa je mehanizam prepoznavanja tRNASer, što vjerojatno odražava evolucijske
Literaturni pregled
9
promjene u strukturi tRNA [28]. Kod bakterija postoje tri skupine izoakceptora tRNA
duge (tj. dodatne) varijabilne ruke: tRNASer, tRNALeu i tRNATyr. Dodatna varijabilna
ruka helikalne strukture glavni je identitetni element za sve seril-tRNA-sintetaze.
Izoakceptori za tRNASer, tRNALeu i tRNATyr kod bakterija razlikuju se po broju
nesparenih baza (0 za tRNASer, 1 za tRNALeu i 2 kod tRNATyr) na početku helikalne
peteljke varijabilne ruke, što zajedno s insercijama u D-petlji diktira orijentaciju
helikalne ruke. Bakterijske SerRS strogo diskriminiraju tRNALeu i tRNATyr od
pripadne tRNASer, prema orijentaciji varijabilne ruke. Kod eukariota i arheja tRNATyr
je izgubila varijabilnu ruku, te samo tRNASer i tRNALeu posjeduju dugu varijabilnu
ruku i jednu nesparenu bazu u peteljci varijabilne ruke. Stoga su eukariotske i
arhealne SerRS relaksiranije u prepoznavanju pripadne tRNASer dugačke varijabilne
ruke (i njene orijentacije) od bakterijskih homologa, i više se oslanjaju na specifične
nukleotidne sljedove u tRNASer. Nadalje, helikalna peteljka varijabilne ruke je dulja
kod bakterijskih tRNASer (5 do 7 parova baza), nego kod eukariotskih i arhealnih
tRNASer (tipično 4 para baza). Prema tome, ne čudi da je prepoznavanje heterolognih
tRNASer često jednosmjerno, tj. iako kvaščeva [29] i kukuruzna SerRS, te SeRS iz
metanogenih arheja [30] aminoaciliraju tRNASer iz E. coli, a SerRS iz P. horikoshii
[15] aminoacilira tRNASer iz T. termophilus, obrat ne vrijedi - bakterijska SerRS iz T.
termophlius ne aminoacilira tRNASer iz arheje P. horikoshii, a SerRS iz E. coli neće
aminoacilirati tRNASer iz kvasca i metanogenih arheja [31].
Zanimljivu osobitost u vezanju serina pokazuje kvaščeva seril-tRNA-sintetaza.
U reakciji izmjene pirofosfata, koja omogućuje praćenje prvog stupnja reakcije
aminoaciliranja - aktivaciju serina, prisutnost pripadne tRNASer povećava afinitet
kvaščeve SerRS prema serinu [32]. Enzim u prisutnosti tRNASer je gotovo za red
veličine učinkovitiji u aktivaciji serina. Ujedno se u prisutnosti tRNA smanjuje razina
misaktivacije nepripadnog treonina. Ti podaci sugeriraju da do optimalne i učinkovite
aktivacije pripadne aminokiseline dolazi u prisutnosti tRNA, a mehanizam je prozvan
tRNA-ovisno prepoznavanje aminokiseline. Postoje indicije da organelna SerRS iz
kukuruza [26] također pokazuje tRNA-ovisno prepoznavanje serina. Je li taj
mehanizam svojstven ostalim eukariotskim SerRS, i SerRS općenito, za sada ostaje
nepoznanica.
Literaturni pregled
10
Eukariotske SerRS u usporedbi s bakterijskim homolozima posjeduju kratak
polipeptidni produžetak na C-kraju, u produžetku katalitičke domene (slika 4),
dugačak 17 (Schizosaccharomyces pombe) do 46 aminokiselina (sisavci). Ti
produžeci sličnog su karaktera - bogati su bazičnim i hidrofilnim aminokiselinama;
teorijski pI izoliranih peptida kreće se od 9,2 (sisavci) do 10,3 (Dictyostelium
discoideum; Arabidopsis thaliana), ali aminokiselinski slijed polipeptidnih
produžetaka eukariotskih SerRS nije očuvan.
motiv 2 T. termophilus : GEILPY--EALPLRYAGYAPAFRSEAGSFGKDVRGLMRVHQFHKVEQYVLTEASLEASDRAFQELLENAEEILRLLEL : 311E. coli : GEIIDE--DDLPIKMTAHTPCFRSEAGSYGRDTRGLIRMHQFDKVEMVQIVRP--EDSMAALEEMTGHAEKVLQLLGL : 321B. subtilis : DEILSG--DSLPINYAAFSACFRSEAGSAGRDTRGLIRQHQFNKVELVKFVKP--EDSYEELEKLTNQAERVLQLLEL : 315D. radiodurans : GEQLSA--DELPLTFAGFSAAFRREAGSAGRDVRGLIRVHEFRKVEQYVLCRADQEEGLKWFERLLSNAEGLLQALEL : 313 P. horikoshii : NEILDG--KDLPLLYVGVSPCFRKEAGTAGKDTKGIFRVHQFHKVEQFVYSRPE--ESWEWHEKIIRNAEELFQELEI : 336P. furiosus : NEILDG--KDLPLLYVAFSPCFRKEAGTAGKDTKGIFRVHQFHKVEQFVYSRPE--ESWEWHERLVRNAEELFQELEI : 336S. tokodaii : KEEIPK--EKLPLKYVGISPAFRKEAGAANKDLKGIFRVHQFHKVEQFIFSSPE--DSWKLHEELIRNAEEIFQGLGL : 336T. acidophilum : NQFLEE--KDLPLRVAGISACFRREAGAHGKDTKGIFRVHQFNKIEQFVFCKPE--DSWDFLEEILGNAEAIYRSLGI : 334 S. cerevisiae : GEWFEKPQEQLPIHYVGYSSCFRREAGSHGKDAWGVFRVHAFEKIEQFVITEPE--KSWEEFEKMISYSEEFYKSLKL : 332Z. mays : GDRIYP--AELPIKYAGYSTCFRKEAGSHGRDTAGIFRVHQFEKIEQFCITSPNGNDSWEIHEEMLKNSEDFYKEIGL : 323C. elegans : NEWIKE--TELPIKYAGVSTCFRQEVGSHGRDTRGIFRVHQFEKIEQFVLCSPNDNESWTLFDEMIGNAESYYQELQI : 357M. musculus : DEWLRP--EDLPIKYAGLSTCFRQEVGSHGRDTRGIFRVHQFEKIEQFVYSSPHDNKSWEMFDEMIATAEEFYQSLGI : 357 T. termophilus : PYRLVEVATGDMGPGKWRQVDIEVYLPSEGRYRETHSCSALLDWQARRANLRYR-DPE--GRVRYAYTLNNTALATPR : 386E. coli : PYRKIILCTGDMGFGACKTYDLEVWIPAQNTYREISSCSNVWDFQARRMQARCRSKSD--KKTRLVHTLNGSGLAVGR : 397B. subtilis : PYRVMSMCTGDLGFTAAKKYDIEVWIPSQDTYREISSCSNFEAFQARRANIRFRREAK--GKPEHVHTLNGSGLAVGR : 391D. radiodurans : PYRVIQNCTGDMGAGKVLMYDIETWVPSEQKYRETHSCSYLGDWQARRTGLRYR-DEH--GKLLYAHTLNNTGIASPR : 388 P. horikoshii : PYRVVNICTGDLGYVAAKKYDIEAWMPGQGKFREVVSASNCTDWQARRLNIRFRDRT--DEKPRYVHTLNSTAIATSR : 412P. furiosus : PYRVVNICTGDLGYVAAKKYDIEAWMPGQGRFREVVSASNCTDWQARRLNIRFRDRT--DEKPRYVHTLNSTAIATSR : 412S. tokodaii : PYRVINIATGDLGACAAKKYDLEVWMPAQAKFREMVSCSNCLDWQAYRMRIRYVEKG--GKK-GYVHTLNSTAIASTR : 411T. acidophilum : PYRVVNVCSGELGRLAAKKYDIEAWFPAQGKFREIVSASNDTDYQARSLNIKYRTSE----GNRFVHTLNSTAIATTR : 408 S. cerevisiae : PYRIVGIVSGELNNAAAKKYDLEAWFPYQKEYKELVSCSNCTDYQSRNLEIRCGIKKMGDREKKYVHCLNSTLAATQR : 410Z. mays : PYQVVSIVSGALNDAAAKKYDLEAWFPASKTFRELVSCSNCTDFQSRRLGIGYGQKKNDEQSKQFVHMLNSTLTATER : 401C. elegans : PYQVVNIVSGELNNAAAKKFDLEAWFPGSGAYRELVSCSNCLDYQSRRLKVRYGQTKKLSGEVPFVHMLNATMCATTR : 435M. musculus : PYHIVNIVSGSLNHAASKKLDLEAWFPGSGAFRELVSCSNCTDYQARRLRIRYGQTKKMMDKVEFVHMLNATMCATTR : 435
motiv 3 T. termophilus : ILAMLLENHQLQDGRVRVPQALIPYMGKEVLEPCG------------------------------------------- : 421E. coli : TLVAVMENYQQADGRIEVPEVLRPYMNGLEYIG--------------------------------------------- : 430B. subtilis : TVAAILENYQQEDGSVVIPKVLRPYMGNREVMKP-------------------------------------------- : 425D. radiodurans : ILVPLLENHQQADGTVRVPAALRPYLGGREVLGQPVR----------------------------------------- : 425 P. horikoshii : AIVAILENHQEEDGTVRIPKVLWKYTGFKEIVPVEKKERCCAT----------------------------------- : 455P. furiosus : AIVAILENHQQEDGTVKIPRALWKYTGFKEIVPVEKKEGCCKA----------------------------------- : 455S. tokodaii : TITAILENYQREDGVVEIPKVLKKYLEPFSRAPKDYIYPRKE------------------------------------ : 453T. acidophilum : ILVAIMENFQEGDR-IRIPDVLVPYTGFQYIEKG-------------------------------------------- : 441 S. cerevisiae : ALCCILENYQTEDG-LVVPEVLRKYIPGE-PEFLPFVNELPK----NSTSSKDKKKKN-------------------- : 462Z. mays : TLCCILENFQKEDG-VEVPKALQPYMGG--IEFLPFKQPLDAKQAADSKSNKSKSKGNAA------------------ : 458C. elegans : VICAILENNQTEEG-INVPTAIQQWMPENYRTFIPFVKPAPIDEDAKKATGKK------------------------- : 487M. musculus : TICAILENYQAEKG-IAVPEKLREFMPPGLQELIPFVKPAPIDQEPSKKQKKQHEGSKKKAKEVPLENQLQSMEVTEA : 512 Slika 4: Poravnavanje (eng. alignment) C-terminalnog dijela reprezentativnih seril-tRNA-sintetaza iz bakterija (T. termophilus - D. radiodurans), arheja (P. horikoshii - T. acidophilum) i eukariota (S. cerevisiae - M. musculus). U poravnanju je prikazan dio katalitičke domene s motivima 2 i 3. Sivom pozadinom istaknuti su produžeci eukariotskih SerRS koji nisu prisutni kod bakterijskih homologa. Uočljiva je očuvanost katalitičke domene i divergentnost duljine i slijeda produžetaka eukariotskih SerRS. U poravnavanju su korištene sekvence (Swiss-prot / Uniprot acc. no.) iz: Termus thermophilus (P34945), Escherichia coli (P0A8L1), Bacillus subtilis (P37464), Deinococcus radiodurans (Q9RUV5), Pyrococcus horikoshii (O58441), Pyrococcus furiosus (Q8U1K2), Sulfolobus tokodaii (Q970Y4), Thermoplasma acidophilum (Q9HKX5), pivski kvasac - Saccharomyces cerevisiae (P07284), kukuruz - Zea mays (NCBI nucleotide acc. no. AY103609.1), Caenorhabditis elegans (Q18678), miš - Mus musculus (P26638).
Literaturni pregled
11
2.1.4. Polipeptidni produžetak SerRS iz kvasca Saccharomyces cerevisiae
Do sada je istraživana samo uloga polipeptidnog produžetka kvaščeve SerRS, i
pokazalo se da delecija C-terminalnog produžetka ima dramatičan utjecaj na svojstva
kvaščevog enzima. Delecija polipeptidnog produžetka kvaščeve SerRS (zadnjih 20
aminokiselina na C-kraju) negativno utječe na stabilnost proteina in vivo i in vitro te
uzrokuje promjene u afinitetu za supstrate [5, 6]. Npr. ekspresijom gena SES1 za
kvaščevu SerRS s plazmida pCJ11 pod kontrolom jakog inducibilnog GAL-promotora,
razina SerRS u stanicama kvasca raste za 150 puta. Ekspresijom gena za krnju SerRS
bez polipeptidnog produžetka od 20 aminokiselina (SerRS∆C20) pri istim uvjetima,
nastaje drastično manje rekombinantnog proteina, svega 1-10 puta više od endogenog
SerRS kodiranog genomom kvasca. To jako otežava pročišćavanje krnjeg
rekombinantnog enzima. Budući da je razina mRNA nastale ekspresijom gena za
cjelovitu i krnju SerRS jednaka [5], razlike u količini nastalih enzima očito su
posljedica njihove različite stabilnosti in vivo, odnosno sklonosti degradaciji krnjeg
enzima [6]. Krnja kvaščeva SerRS bez polipeptidnog produžetka (SerRS∆C20)
sposobna je komplementirati soj kvasca s inaktiviranim genom za SerRS, ali samo
ako je eksprimirana s višekopijskog plazmida pod kontrolom jakog promotora ADH
[5], dok cjelovita SerRS komplementira isti soj kvasca kada je eksprimirana s
centromernog plazmida pod kontrolom vlastitog promotora. Pokusi komplementacije
pokazuju da produžetak nije esencijalan, ali jest važan budući da je vijabilnost stanica
komplementiranih sa SerRS∆C20 smanjena. Stabilnost krnjeg SerRS∆C20 narušena
je i in vitro, pročišćeni SerRS∆C20 je podložniji termičkoj inaktivaciji od cjelovitog
SerRS [5, 6].
Delecija produžetka katalitičke domene utječe i na katalitičke parametre
enzima, odnosno na afinitet prema supstratima. Afinitet SerRS∆C20 prema serinu je
smanjen, tj. KM SerRS∆C20 za serin (252 µmol dm-3) je oko četiri puta veći nego za
cjeloviti SerRS (62,5 µmol dm-3) [5] u ukupnoj reakciji aminoaciliranja, dok je kcat
približno jednak. U reakciji aktivacije serina, mjerenoj metodom izmjene pirofosfata u
odsutnosti tRNA, afinitet krnjeg (KM = 500 µmol dm-3) i cjelovitog (KM = 480 µmol
dm-3) enzima prema serinu približno je jednak, što znači da je kod krnjeg enzima
narušeno tRNA-ovisno prepoznavanje serina [6].
Literaturni pregled
12
Utjecaj delecije na vezanje tRNA je složeniji. U reakciji aminoaciliranja s
ukupnom, nefrakcioniranom kvaščevom tRNA, krnji enzim pokazuje 2 do 4 puta veći
afinitet prema tRNA od cjelovite SerRS [5, 6]. Afinitet krnjeg enzima prema
pročišćenoj, nativnoj tRNASer također je za dva puta veći od cjelovitog enzima. S
druge strane, "sirova" tRNASer, bez posttranskripcijskih modifikacija dobivena
transkripcijom in vitro, je 7 puta lošiji supstrat za SerRS∆C20 nego za cjeloviti SerRS,
iako cjeloviti enzim sa sličnom učinkovitošću prepoznaje nativnu tRNASer i "sirovi"
transkript tRNASer dobiven in vitro [6].
Prekomjerna ekspresija krnje kvaščeve SerRS toksična je za stanice kvasca [6],
vjerojatno uslijed opisanih promjena u mehanizmu prepoznavanja supstrata. Ti
rezultati upućuju da je produžetak neophodan za ispravno strukturiranje kvaščeve
SerRS, optimalno vezanje supstrata i katalizu. Je li utjecaj produžetka katalitičke
domene na katalitičke parametre direktan, i posljedica promjena u katalitičkom
mehanizmu, ili je utjecaj delecije posredan, kroz narušavanje ukupne strukture enzima,
ostaje nejasno. Budući da nije poznata kristalna struktura eukariotskih SerRS, smještaj
i struktura polipeptidnih produžetaka eukariotskih SerRS ostaje nepoznanica.
Novija istraživanja pokazala su da kvaščeva seril-tRNA-sintetaza stvara
interakcije s Pex21p [7], proteinom uključenim u biogenezu peroksisoma. Peroksini
Pex21p i Pex18p funkcionalno su redudantni i zajedno s peroksinom Pex7p sudjeluju
u unosu proteina sa signalnim slijedom tipa 2 (eng. peroxisome targeting signal 2) u
matriks peroksisoma [ 33 ]. Interakcija kvaščeve SerRS s Pex21p otkrivena je
kvaščevim sustavom dvaju hibrida (eng. yeast two-hybrid) i potvrđena na koloni s
imobiliziranim Pex21p (eng. pull-down assay). Zanimljivo, delecijom produžetka na
C-kraju kvaščeve SerRS gubi se interakcija s Pex21p [8] što upućuje na sudjelovanje
produžetka u ostvarivanju interakcije s Pex21p.
2.1.5. Struktura mitohondrijske SerRS sisavaca
Pregled strukture seril-tRNA-sintetaza i produžetaka eukariotskih SerRS
svakako ne bi bio potpun bez spomena strukture mitohondrijske SerRS goveda [34].
Mitohondrijske SerRS sisavaca dugo zaokupljaju pažnju istraživača, jer su dva
izoakceptora tRNASer sisavaca neobične, bizarne, strukture - nedostaje im dodatna
varijabilna ruka koja je glavni element prepoznavanja tRNASer za SerRS u svim
domenama života, a jednom od mitohondrijskih izoakceptora nedostaje i D-ruka,
Literaturni pregled
13
univerzalno očuvani strukturni element gotovo svih tRNA [9, 28, 34]. Uzevši u obzir
da je sličnost na razini primarne strukture N-domene mitohondrijske SerRS i njezinih
eukariotskih i bakterijskih homologa niska, bilo je upitno kako se ostvaruje interakcija
mitohondrijske SerRS i tRNASer i da li mitohondrijske SerRS sisavaca uopće
posjeduju karakterističnu strukturu antiparalelnih α-zavojnica N-terminalne domene
za vezanje tRNA. Ono što je također zanimljivo je da mitohondrijske SerRS sisavaca
posjeduju dodatne produžetke na N- i C-kraju.
Kristalna struktura mitohondrijske SerRS goveda (slika 5) spregnuta s in vitro
mutagenezom razjasnila je mehanizme prepoznavanja tih neobičnih tRNA i
divergentnih SerRS. Mitohondrijska SerRS goveda ipak posjeduje N-terminalnu
veznu domenu za tRNA helikalne strukture, pri čemu su antiparalelne α-zavojnice
nešto dulje (65 Å) i malo drukčije orijentacije nego kod bakterijskih SerRS.
Produžetak na N-kraju stvara dodatnu α-zavojnicu, a C-terminalni produžetak
dugačak 24 aminokiseline proteže se preko katalitičke domene suprotne podjedinice,
značajno povećavajući dodirnu površinu dimera. Prema modelu temeljenom na
rezultatima in vitro mutageneze, obje dodatne domene uključene su u prepoznavanje
neobičnih mitohondrijskih tRNA, mehanizmom svojstvenom mitohondrijskom
sustavu: kod bakterijskih SerRS varijabilna ruka i T-petlja tRNASer okružuju
antiparalelne zavojnice N-domene SerRS, pa se protein nalazi "u sendviču" tRNA,
dok kod mitohondrijske SerRS dodatne domene i N-domena okružuju akceptorsku
peteljku i T-petlju tRNA, pa se mitohondrijska tRNA nalazi "u sendviču" proteina.
Važno je naglasiti da se produžeci eukariotskih citosolnih SerRS razlikuju od
produžetka mitohondrijske SerRS goveda na razini primarne strukture i da uzevši u
obzir osobitosti mitohondrijskog sustava sigurno nemaju istu ulogu.
Literaturni pregled
14
Slika 5: Struktura mitohondrijske SerRS iz goveda. Žutonarančastom bojom označena je N-terminalna vezna domena za tRNA. Katalitička domena prikazana je purpurno. Druga podjedinica prikazana je sivo. Produžetci na C- i N-kraju svojstveni mitohondrijskim SerRS sisavaca prikazani su plavom bojom. Produžetak na C-kraju proteže se preko katalitičke domene susjedne podjedinice i zajedno s N-krajem susjedne podjedinice smješta se u podnožju vezne domene za tRNA. Prema koordinatama PDB ID 1wle, S. Chimnaronk et al., EMBO J. 24 (2005) 3369-3379.
2.2. Dodatne domene eukariotskih aminoacil-tRNA-sintetaza: raznolikost strukture i funkcije
Poput eukariotskih seril-tRNA-sintetaza, mnoge eukariotske aaRS uz
posjeduju dodatne domene ili polipeptidne produžetke na N- ili C-kraju koje ne
nalazimo kod njihovih bakterijskih homologa. Općenito govoreći, budući da svaka
aaRS mora posjedovati katalitičku i tRNA-veznu domenu, bakterijski homolozi
obično predstavljaju aaRS "minimalne" ili "osnovne arhitekture" na koje su pridodane
pomoćne, dodatne domene svojstvene eukariotskim sustavima, a koje eukariotskim
aaRS daju nova svojstva.
Dodatni sljedovi na N-kraju organelnih eukariotskih aaRS imaju ulogu
signalnih sljedova za unos u mitohondrije, kloroplaste ili srodne organele. Oni se u
pravilu nakon unosa u organele proteolitički uklanjaju i nisu funkcionalno relevantni.
Stoga signalni sljedovi organelnih eukariotskih aaRS neće biti dalje razmatrani.
2.2.1. Pomoćne domene za vezanje tRNA
Dodatne domene eukariotskih aaRS često predstavljaju pomoćne ili
nespecifične vezne domene za (t)RNA. Primjeri takvih pomoćnih domena su brojni.
Literaturni pregled
15
Tako npr. LysRS sisavaca posjeduje produžetak duljine oko 60 aminokiselina na N-
kraju proteina [35], koji prethodi domeni za vezanje antikodona (tj. "glavnoj" veznoj
domeni za tRNA). Taj produžetak ima izražen bazičan karakter i posjeduje 14
bazičnih aminokiselina u svojoj primarnoj strukturi, što upućuje da bi mogla
doprinositi sposobnosti LysRS hrčka da nespecifično veže tRNA. Naime, LysRS
hrčka veže pripadnu tRNALys s približno jednakom konstantom disocijacije (30 nmol
dm-3) kao nepripadnu kvaščevu tRNAAsp ili tRNAPhe (40 nmol dm-3). Delecijom N-
terminalnog produžetka LysRS konstanta disocijacije raste gotovo 100 puta za
tRNALys (3 µmol dm-3), a za kvaščevu tRNAAsp čak i više (Kd ≥ 30 µmol dm-3).
Izolirani peptid koji odgovara produžetku ima slabi afinitet prema tRNALys (Kd ≈ 20
µmol dm-3). Prema tome, dodatna N-terminalna domena predstavlja pomoćnu,
nespecifičnu domenu za vezanje tRNA koja sinergistički omogućuje LysRS
učinkovito vezanje tRNA. Delecija pomoćne domene ne utječe na kinetičke parametre
za lizin i ATP, ali smanjuje afinitet za tRNALys 4 puta u reakciji aminoaciliranja.
Uočljivo je da je utjecaj na kinetičke parametre manje izražen nego na konstantu
disocijacije kompleksa LysRS:tRNA. Budući da je u citosolu stanica sisavaca više od
95 % tRNA aminoacilirano [36] i u kompleksu s elongacijskim faktorom EF1A,
koncentracija slobodne deacilirane tRNA je vrlo niska i daleko ispod KM LysRS za
tRNA, pa se spekulira da tRNA ne difundira slobodno u citoplazmi, već da se unutar
ciklusa usmjereno prenosi na enzim(e) (eng. channeling), pri čemu bi nespecifična
vezna domena za tRNA mogla pomoći, sprječavajući otpuštanje slobodne tRNA.
Pomoćnu veznu domenu za vezanje tRNA ima i kvaščeva glutaminil-tRNA-
sintetaza [37]. Pomoćna domena obuhvaća 228 aminokiselina na N-kraju, sadrži dva
klastera bazičnih aminokiselina i nespecifično veže RNA jednolančane ili dvolančane
strukture približno jednakim afinitetom [ 38 ]. GlnRS iz E. coli ne aminoacilira
kvaščevu tRNAGln, ali ako se bakterijskoj GlnRS pripoji pomoćna domena kvaščeve
GlnRS, kimerni enzim nadilazi barijeru između vrsta i aminoacilira kvaščevu tRNA in
vitro te komplementira soj kvasca s inaktiviranim genom za GlnRS [ 39 ]. Iako
pomoćna domena pripojena bakterijskoj GlnRS omogućuje učinkovito
aminoaciliranje kvaščeve tRNAGln, ostaje nejasan njezin značaj za kvaščevu GlnRS,
budući da njeno uklanjanje ne utječe na kinetičke parametre GlnRS za tRNAGln [40],
niti narušava funkcionalnost kvaščeve GlnRS in vivo [41], ali umjereno povećava KM
za ostale supstrate (7 puta za ATP, 4 puta KM za Gln).
Literaturni pregled
16
Kvaščeva valil-tRNA-sintetaza također ima pomoćnu veznu domenu za tRNA
na N-kraju, duljine 97 aminokiselina, koju ne nalazimo kod bakterijskih ValRS.
Pomoćna domena kvaščeve ValRS također sadrži klaster bazičnih aminokiselina i
nespecifično veže tRNA [42]. Za razliku od kvaščeve GlnRS i LysRS hrčka, delecija
te domene uzrokuje gotovo potpun gubitak aminoacilacijske aktivnosti kvaščeve
ValRS, te drastično smanjuje sposobnost vezanja tRNA. Očekivano, krnji enzim nije
funkcionalan in vivo, ali fuzija odgovarajuće regije ValRS sisavaca vraća mu biološku
aktivnost. Zanimljivo, fuzija pomoćne domene ValRS također omogućuje GlnRS iz E.
coli da komplementira stanice kvasca inaktiviranog gena za GlnRS, a fuzija pomoćne
domene kvaščeve GlnRS ili ValRS na ValRS iz E. coli omogućuje joj da preuzme
funkciju kvaščeve ValRS [43] što zorno pokazuje značaj takvih nespecifičnih tRNA-
veznih domena za aaRS. Valja naglasiti da unatoč nespecifičnoj prirodi tih domena
koje olakšavaju vezanje svih (t)RNA, one "pomažu" aaRS i u vezanju odgovarajuće
tRNA. Specifičnost aminoaciliranja osigurana je katalitičkom "jezgrom" enzima koja
zatim prepoznaje odgovarajuću tRNA među vezanim tRNA. Kada bi nespecifične
pomoćne vezne domene za tRNA kompromitirale selektivnost enzima za pripadnu
tRNA, njihove fuzije s bakterijskim aaRS bile bi letalne za stanice kvasca uslijed
narušavanja točnosti translacije.
Pomoćnu domenu za vezanje tRNA karakteristične strukture helix-turn-helix
nalazimo kod nekoliko eukariotskih aaRS, npr. kod humane MetRS [ 44 ],
bifunkcionalne GluProRS viših eukariota [45, 46], te GlyRS, HisRS i TrpRS sisavaca.
Motiv je građen od ~50 aminokiselina. Kod bifunkcionalne GluProRS povezuje
zasebne domene GluRS i ProRS istog polipeptida, u obliku tri uzastopno ponavljajuća
slijeda (eng. tandem repeats) kod GluProRS sisavaca, odnosno šest ponavljajućih
sljedova kod GluProRS vinske mušice [ 47 ]. Ponavljajući motivi GluProRS
nespecifično vežu RNA [46]. Struktura jednog motiva određena je NMR-
spektroskopijom [45, 46] i pokazala je da evolucijski očuvani bazični bočni ogranci
stvaraju plohu pozitivnog naboja na jednoj strani strukture, što predstavlja
potencijalno vezno mjesto za (t)RNA. Njihov učinak je sinergistički, i tri ponavljajuća
motiva imaju znatno veći afinitet prema tRNA od jednog izoliranog motiva. MetRS
čovjeka posjeduje samo jedan motiv opisane strukture na C-kraju, na koji se nastavlja
dodatni slijed aminokiselina bogat lizinom. Taj dvodijelni produžetak povećava
afinitet enzima za tRNA i ima dvojnu ulogu: motiv helix-turn-helix sprječava
Literaturni pregled
17
slobodnu disocijaciju aminoacilirane tRNA s enzima i omogućava njezin usmjereni
prijenos (eng. channeling) na elongacijski faktor EF1A (vidi poglavlje 2.2.3), a
dodatni slijed bogat lizinom nespecifično "privlači" neaciliranu tRNA [44] .
2.2.2. Multienzimski kompleks aminoacil-tRNA-sintetaza
Kod viših eukariota, od člankonožaca (kukci, paučnjaci, rakovi) do sisavaca,
devet aminoacil-tRNA-sintetaza (GluProRS, IleRS, LeuRS, MetRS, GlnRS, LysRS,
ArgRS i AspRS) i tri pomoćna, nekatalitička proteina (p18, p38 i p43) udruženo je u
makromolekulski kompleks (slika 6) [47, 48]. Multienzimski kompleks aminoacil-
tRNA-sintetaza (skraćeno: multisintetazni kompleks) ima relativnu molekulsku masu
oko 1,0 - 1,5 · 106. Krioelektronska mikroskopija pokazala je da ima oblik izduženog
slova U, s dva režnja i šupljinom između njih [49]. Imunoelektroskopijom je mapiran
položaj pojedinih komponenti unutar kompleksa.
Slika 6: Shematski dvodimenzionalni prikaz multienzimskog kompleksa aminoacil-tRNA-sintetaza sisavaca. Naznačene su neke od interakcija utvrđene sustavom dvaju hibrida ili kemijskim metodama (eng. crosslinking). Raspored u dvodimenzionalnom prikazu ne odgovara nužno njihovom relativnom položaju u prostornoj strukturi kompleksa. Preuzeto iz: S. W. Lee et al., J. Cell Sci. 117 (2004) 3725-3734.
Važnu ulogu za asocijaciju pojedinih aaRS u multisintetazni kompleks imaju
upravo dodatne domene eukariotskih aaRS. Humana MetRS pored nespecifične vezne
domene za tRNA na C-kraju, posjeduje i dodatnu domenu na N-kraju duljine 214
aminokiselina, čije proteolitičko uklanjanje uzrokuje disocijaciju MetRS iz
multisintetaznog kompleksa. Katalitička aktivnost slobodne, krnje forme MetRS i
MetRS u multisintetaznom kompleksu je usporediva [44], pa je očito primarna uloga
N-terminalne domene ostvarivanje proteinskih interakcija unutar kompleksa. Delecija
N-terminalne domene ArgRS duljine 73 aminokiselina dovodi do njezinog
oslobađanja iz multisintetaznog kompleksa, i kao u slučaju MetRS, ne utječe značajno
Literaturni pregled
18
na kinetičke parametre [50]. N-terminalna domena kod ArgRS potrebna je za njegovu
interakciju s proteinom p43 multisintetaznog kompleksa.
Proteinske interakcije unutar multisintetaznog kompleksa sustavno su
istraživane pomoću biosenzora (eng. surface plasmon resonance) [51] i sustavom
dvaju hibrida u kvascu (yeast two-hybrid) [52]. Ponavljajući motivi unutar GluProRS,
osim što imaju ulogu nespecifične RNA vezne domene, ostvaruju interakciju s
dodatnim domenama na C-kraju IleRS i N-kraju ArgRS [52]. Prema tome, dodatna
domena GluProRS je višefunkcionalna. Ipak, valja naglasiti da interakcije unutar
multisintetaznog kompleksa nisu ovisne isključivo o produžecima [51]. Interakcijama
AspRS unutar multisintetaznog kompleksa također doprinosi dodatna N-terminalna
domena, ali njenom delecijom ne dolazi do disocijacije AspRS iz kompleksa, iako je
afinitet AspRS za kompleks smanjen, što znači da velik doprinos imaju interakcije s
"katalitičkim tijelom" AspRS. LysRS ostvaruje interakcije s p38 preko "katalitičkog
tijela" enzima, neovisno o svojoj nespecifičnoj veznoj domeni za tRNA na N-kraju
opisanoj u prethodnom poglavlju, a isto vrijedi i za GlnRS.
Razlog udruživanja aaRS kod viših eukariota u multienzimski kompleks ostaje
nedovoljno razjašnjen i postoji nekoliko hipoteza (koje se međusobno ne isključuju!)
o njegovoj svrsi. Multisintetazni kompleks je netipičan po tome što katalizira devet
neovisnih aminoacilacijskih aktivnosti, dok multienzimske komplekse obično stvaraju
enzimi koji kataliziraju nekoliko uzastopnih reakcija na zajedničkom metaboličkom
putu. Jedna od svrha mogla bi biti "dijeljenje" pomoćnih domena za vezanje tRNA
koje su okarakterizirane kod 5 proteina u kompleksu (AspRS, LysRS, GluProRS,
MetRS i p43) [47]. Ostale hipoteze spekuliraju da je multisintetazni kompleks važan
za usmjereni prijenos (eng. channeling) tRNA u stanicama eukariota, regulaciju
aktivnosti aaRS tijekom staničnog ciklusa ili kao "spremište" komponenti s
aktivnošću nevezanom uz aminoaciliranje tRNA - npr. p43 je procitokin koji se
oslobađa u apoptozi raspadom multisintetaznog kompleksa, a mnoge eukariotske
aaRS posjeduju alternativne funkcije uz svoju osnovnu ulogu u translaciji [48, 53].
2.2.3. Interakcije aminoacil-tRNA-sintetaza s elongacijskim faktorima
Mnoge eukariotske aaRS stvaraju interakcije s elongacijskim faktorima [54]
što se smatra biološki relevantnim za usmjereni prijenos tRNA (eng. channeling)
tijekom kruženja tRNA između makromolekulskih partnera. Naime, prema modelu
Literaturni pregled
19
usmjerenog prijenosa (eng. channeling), tRNA se usmjereno prenosi na elongacijski
faktor EF1A, zatim na ribosom i natrag na aaRS, bez otpuštanja tRNA i slobodne
difuzije u staničnom mediju. Prema tom modelu, dostupnost tRNA za aminoaciliranje
određena je učinkovitošću kruženja tRNA u tom ciklusu, a ne o staničnoj
koncentraciji tRNA [47]. Brojna eksperimentalna opažanja govore u prilog modelu
usmjerenog prijenosa, pogotovo u stanicama sisavaca: aminokiseline dodane "izvana"
u obliku aminoacil-tRNA ne sudjeluju u translaciji u permeabiliziranim stanicama
sisavaca [55]. Arginil-tRNAArg nastala pomoću ArgRS u multisintetaznom kompleksu
je bolji supstrat za biosintezu proteina od Arg-tRNAArg nastale pomoću slobodne
forme ArgRS, što ukazuje na važnost multisintetaznog kompleksa za usmjereni
prijenos tRNA [56].
U nekoliko slučajeva dokumentirana je i detaljno istražena uloga eukariotskih
produžetaka u interakciji s elongacijskim faktorom. Već je spomenuto da humana
MetRS, koja je dio multisintetaznog kompleksa, posjeduje C-terminalnu domenu koja
sprječava otpuštanje aminoacilirane tRNA [44], pa cjeloviti enzim ima značajno manji
obrtni broj od krnje MetRS. Dodatak EF1A povećava procesivnost i stimulira
cjelovitu MetRS, ali nema utjecaja na krnji enzim, što zorno pokazuje značaj
interakcije s elongacijskim faktorom i ulogu dodatne domene.
Valil-tRNA-sintetaza viših eukariota pročišćena je iz raznih organizama u
stabilnom kompleksu s elongacijskim faktorom EF-1H. EF-1H se sastoji od EF1A
koji prenosi aminoaciliranu tRNA na ribosom, i EF1B - faktora koji potiče izmjenu
gvanin-nukleotida u EF1A (eng. guanine nucleotide exchange factor). Interakcija
ValRS s EF1B omogućuje interakciju s EF1A, što stimulira katalitičku aktivnost
ValRS [ 57 ]. N-terminalna domena ValRS kunića znatno je dulja (oko 300
aminokiselina) od pomoćne vezna domene za tRNA kvaščeve ValRS (oko 100
aminokiselina) opisane u poglavlju 2.2.1, pri čemu je upravo prvih 200 aminokiselina
potrebno za interakciju s EF-1H [58]. Preostalih 100 aminokiselina homologno je
produžetku kvaščeve ValRS. To navodi na zaključak da ValRS sisavaca na N-kraju
zapravo ima dvije (funkcionalno različite) domene: dodatnu domenu za vezanje EF-
1H koju kvaščev homolog nema, i bazičnu nespecifičnu veznu domenu za tRNA
kakvu posjeduje i kvaščeva ValRS.
Literaturni pregled
20
U katalitičkom ciklusu humane AspRS, disocijacija produkta (acilirane
tRNAAsp) je korak koji ograničava brzinu reakcije [ 59 ]. Vrijeme poluraspada
kompleksa AspRS i Asp-tRNAAsp procijenjeno je na čak 90 minuta. Elongacijski
faktor EF1A stvara kompleks s AspRS:tRNAAsp, stimulira otpuštanje Asp-tRNAAsp i
samu katalitičku aktivnost AspRS. Slično kao kod humane MetRS, delecija dodatnog
N-terminalnog produžetka (32 aminokiseline) povećava obrtni broj (kcat) krnje AspRS,
ujedno smanjuje afinitet (povećava KM) za tRNA, a EF1A više nema utjecaja na
kinetičke parametre i ne veže se na krnji enzim [60]. Autori istraživanja zaključuju da
produžetak humane AspRS usporava otpuštanje acilirane tRNA, stupa u interakciju s
EF1A i omogućuje prijenos Asp-tRNAAsp na elongacijski faktor. Podsjetimo da
produžetak na N-kraju AspRS utječe na asocijaciju u multisintetazni kompleks
(poglavlje 2.2.2), još jednom ilustrirajući višestruku ulogu dodatnih produžetaka.
2.2.4. Interakcije kvaščevih aminoacil-tRNA-sintetaza s proteinom
Arc1p
U stanicama kvasaca, GluRS i MetRS stvaraju kompleks s proteinom Arc1p
[61]. Arc1p povećava katalitičku efikasnost enzima i utječe na njihovu staničnu
lokalizaciju. Domena na C-kraju Arc1p posjeduje tzv. OB-strukturu (eng.
oligonucleotide-binding fold; OB fold) koja je česti strukturni motiv kod mnogih
proteina koji vežu RNA; veznu domenu za antikodon OB-strukture posjeduju aaRS
podrazreda IIb (AspRS, AsnRS i LysRS). Takva domena pojavljuje se kao samostojni
dimerni protein od 111 aminokiselina koji veže tRNA (tRNA-binding protein; Trbp
111) u termofilnoj bakteriji Aquifex aeolicus. Trbp 111 specifično prepoznaje tRNA i
prepoznaje njezim karakteristični prostorni "L"-oblik, vežući se s vanjske strane
pregiba [62]; Trbp 111 ne veže jednolančanu RNA, ni ribosomsku 5S RNA. Poput
Trpb 111, Arc1p također ima široku specifičnost prema različitim izoakceptorima
tRNA [63].
Za oba enzima pokazano je da asociraju s Arc1p preko svojih dodatnih N-
terminalnih domena svojstvenim eukariotskim enzimima [ 64 ]. Vezna mjesta za
MetRS i GluRS locirana su u N-terminalnoj domeni Arc1p i međusobno se ne
preklapaju [65], pa se obje aaRS istodobno mogu vezati na Arc1p, a trojni kompleks
MetRS:Arc1p:GluRS (s ili bez tRNA) moguće je izolirati gel-filtracijskom
kromatografijom [63]. Model kompleksa MetRS:Arc1p:GluRS prikazan je na slici 7,
Literaturni pregled
21
a biokemijska i strukturna istraživanja potvrđuju da GluRS i MetRS nisu u direktnoj
interakciji unutar kompleksa.
Slika 7: Model kompleksa MetRS:Arc1p:GluRS. Lijevo: shematski prikaz kompleksa u kompleksu s tRNA. Kompleks je stabiliziran interakcijama između domena na N-kraju MetRS, GluRS i Arc1p. Desno: trodimenzionalni model interakcija između N-domena MetRS (plavo), GluRS (crveno) i Arc1p (žuto i zeleno) dobiven superpozicijom kristalnih struktura binarnih kompleksa N-domene MetRS i N-domene Arc1p, te N-domene GluRS i N-domene Arc1p. Prilagođeno iz: K. Galani et al., EMBO J. 20 (2001) 6889-6898 i H. Simader et al., Nucleic Acids Res. 34 (2006) 3968-3979.
MetRS u kompleksu s Arc1p 500 puta učinkovitije aminoacilira pripadnu
tRNA nego slobodna kvaščeva MetRS [61], prvenstveno uslijed povećanja afiniteta za
tRNA. Stimulacija katalitičke aktivnosti GluRS je puno skromnija, svega dva do deset
puta, a kompleks kvaščeve GluRS i tRNAGlu dovoljno je čvrst da ga se može izolirati
gel-filtracijskom kromatografijom [ 66 ], iako je konstanta disocijacije kompleksa
Arc1p i GluRS za tRNA 120 puta manja od konstante disocijacije slobodne GluRS za
tRNA. Dakle, Arc1p predstavlja pomoćnu nespecifičnu veznu domenu za tRNA za
MetRS i GluRS in trans, u obliku zasebne podjedinice, za čije vezanje GluRS i
MetRS kvasca posjeduju posebne, dodatne module. Osim što utječe na katalitička
svojstva GluRS i MetRS, Arc1p utječe i unutarstanični smještaj enzima, jer GluRS i
MetRS u kompleksu s Arc1p lokalizirani isključivo u citoplazmi i ne ulaze u staničnu
jezgru [64, 67].
Metionil-tRNA-sintetaza iz riže [68] na C-kraju posjeduje dodatnu domenu
(210 aminokiselina), a koja je homologna Trbp 111 i tRNA-veznoj domeni Arc1p
(slika 8). Dakle, dodatna domena koja je potreba kvaščevoj MetRS i koja se veže
preko specijalizirane domene za vezanje Arc1p, kod biljne MetRS je prisutna kao dio
istog polipeptidnog lanca. Poput prethodno opisanih pomoćnih veznih domena za
tRNA, delecija pomoćne vezne domene za tRNA drastično povećava konstantu
disocijacije za pripadne i nepripadne tRNA s MetRS iz riže. Pomoćna domena
Literaturni pregled
22
povećava katalitičku učinkovitost enzima, jer krnja MetRS ima 2 puta manji afinitet
prema ukupnoj kvaščevoj tRNA i 10 puta manji afinitet za pripadnu tRNAiMet u
reakciji aminoaciliranja. Važno je naglasiti da se dodatna domena na C-kraju MetRS
iz riže strukturno i funkcionalno razlikuje od C-terminalne domene humane MetRS
izgrađene oko motiva helix-turn-helix s bazičnim produžetkom [48] opisane u
prethodnom poglavlju. Zanimljivo je da dodatnu domenu homolognu Trbp 111 imaju
i neke (ne sve!) arhealne i bakterijske MetRS, npr. iz E. coli, T. termophilus i P.
horikoshii [ 69 ] (slika 8) što je iznimka od pravila da su produžeci svojstveni
isključivo eukariotskim aaRS. Dodatna C-terminalna domena kod tih enzima zaslužna
je za njihovu dimerizaciju, budući da je i sam Trbp 111 dimer. I na kraju, spomenimo
da domenu homolognu Trbp 111 posjeduje i p43, pomoćni protein multisintetaznog
kompleksa (poglavlje 2.2.2) koji također ima afinitet za tRNA i služi kao pomoćna
vezna domena za tRNA, ali nakon proteolitičkog cijepanja poprima ulogu citokina [47,
48]. Strukturna raznolikost eukariotskih MetRS i homologa Trbp 111 sažeta je na slici
8.
Slika 8: Strukturna raznolikost produžetaka metionil-tRNA-sintetaza (MRS; lijevo) i usporedba s homolognim proteinima (desno). Različita ispuna označava različite tipove domena. Bijeli pravokutnik označava "minimalnu" MetRS, kakvu posjeduje A. aeolicus i neke bakterije. MetRS iz riže (O. sativa) posjeduje domenu na C-kraju homolognu veznoj domeni za tRNA u proteinima Arc1p i p43. Prvi dio te domene homologan proteinu Trbp 111 (crna ispuna) iz A. aeolicus posjeduje i MetRS iz E. coli. Humana i kvaščeva MetRS posjeduju domene na N-kraju potrebne za asocijaciju u multisintetazni kompleks ili s Arc1p. Humana MetRS ima na C-kraju dodatnu domenu koja se razlikuje od Trbp 111 ili MetRS riže, a homologna je ponavljajućim motivima u bifunkcionalnoj GluProRS sisavaca. Naznačeni su karakteristični motivi aaRS razreda I. Numeracija označava broj aminokiselina. Preuzeto iz M. Kaminska et al. EMBO J. 19 (2000) 6908-6917.
2.2.5. Ostale uloge produžetaka eukariotskih aminoacil-tRNA-sintetaza
Sa stajališta funkcionalne raznolikosti eukariotskih produžetaka, zanimljiv je
N-terminalni produžetak kvaščeve AspRS. Taj produžetak od 70 aminokiselina na N-
Literaturni pregled
23
kraju kvaščeve AspRS različit je od produžetka na N-kraju humane AspRS koji je
važan za interakciju humane AspRS s EF1A i asocijaciju u multisintetazni kompleks
(poglavlja 2.2.2 i 2.2.3). Kvaščeva AspRS u području N-terminalnog produžetka
posjeduje regiju bogatu lizinom [70], pa ne iznenađuje da produžetak predstavlja
pomoćnu veznu domenu za tRNA (slika 9), a slična konsenzus-sekvenca pronađena je
i kod ostalih eukariotskih aaRS podrazreda IIb (LysRS i AsnRS). Delecija ekstenzije
povećava konstantu disocijacije krnje AspRS i tRNA za dva reda veličine i smanjuje
afinitet krnjeg enzima prema tRNA za 100 puta u reakciji aminoaciliranja. Izolirana
dodatna N-terminalna domena također pokazuje slabi afinitet prema tRNA. Prema
tome, dodatna domena kvaščeve AspRS predstavlja tipičnu pomoćnu veznu domenu
za tRNA, koja doprinosi efikasnosti eukariotske aaRS.
Slika 9: Model interakcije pomoćne tRNA-vezne domene kvaščeve AspRS s tRNAAsp. Struktura katalitičke i glavne vezne domene za tRNA (žuto) u kompleksu s tRNA određena je rengenskom kristalografijom, a produžetak na N-kraju (plavo) modeliran je na temelju protekcije molekule tRNA od kemijskog i enzimatskog cijepanja (eng. footprinting). Purpurnom bojom označena je konzervirani bazični motiv (29-LSKKxLKKxxK-39) za koji je eksperimentalno potvrđeno da je presudan za vezanje tRNA. Preuzeto iz M. Frugier et al. EMBO J. 19 (2000) 2371-2380.
Istraživanja koja su uslijedila otkrila su da kvaščeva AspRS specifično veže
vlastitu mRNA [71]. U vezanju Asp za mRNA sudjeluju dodatna domena i "glavna"
domena za vezanje antikodona, a područje mRNA na koje se AspRS veže odgovara
netranslatiranoj regiji mRNA na 5'-kraju i dijelu koji kodira upravo N-terminalnu
domenu (od -87 do 210 nukleotida; relativno prema početku translacije). In vivo je
prekomjerna ekspresija AspRS utišavala ekspresiju gena-reportera koji je kodirao tu
regiju, što je upućuje na (auto)regulaciju ekspresije kvaščeve AspRS vezanjem
vlastite mRNA (slika 10). Na temelju protekcije RNA od kemijske i enzimatske
razgradnje (eng. footprinting) izrađen je model regulatorne regije mRNA i vezanja
AspRS [ 72 ]. Regulatorna regija mRNA ima složenu sekundarnu strukturu koja
Literaturni pregled
24
oponaša dijelove tRNAAsp i veže se preko obje podjedinice dimerne AspRS.
Mehanizam regulacije ekspresije AspRS povratnom spregom (slika 10) ovisan je o
tRNA [73]: višak AspRS koji nije u kompleksu s pripadnom tRNAAsp veže se na
regulatornu regiju vlastite mRNA i utišava njenu ekspresiju, pa je translacija mRNA
za AspRS usklađena s razinom pripadne tRNAAsp u stanici. U oba procesa (vezanje
tRNAAsp, vezanje na regulatornu regiju mRNA) N-terminalni produžetak ima
nezamjenjivu ulogu.
Slika 10: Model regulacije ekspresije kvaščeve AspRS povratnom spregom, ovisan o koncentraciji tRNA. Višak slobodne AspRS iz citoplazme odlazi u jezgru gdje se veže na vlastitu mRNA i utišava njenu ekspresiju. Preuzeto iz M. Frugier et al., EMBO Rep. 6 (2005) 860-865.
Mnoge eukariotske aaRS su tijekom svojeg dugog evolucijskog razdoblja
poprimile dodatne funkcije neovisne o ulozi u biosintezi proteina [53]. Dobro istražen
i radikalan primjer su humana triptofanil- i tirozil-tRNA-sintetaza koje sudjeluju u
signalnim putovima angiogeneze (rast novih krvnih žila). Cjeloviti enzimi ne
sudjeluju u staničnoj signalizaciji, ali proteolitičkim cijepanjem ili alternativnim
prekrajanjem mRNA (eng. alternative splicing) nastaju fragmenti koji imaju
antagonistički utjecaj na angiogenezu. Humana TyrRS ima na C-kraju domenu koja je
homologna Arc1p i citokinu EMAP II, koji se oslobađa razgradnjom p43. Taj
fragment oslobođen iz TyrRS ima također citokinu aktivnost [74]. Iznenađujuće,
Literaturni pregled
25
ostatak "minimalne" TyrRS bez dodatne C-terminalne domene također ima citokinu i
angiogenu aktivnost. Humana TrpRS pak na N-kraju ima domenu homolognu
uzastopno ponavljajućim motivima humane GluProRS. Krnja TrpRS nastala
proteolizom ili alternativnim prekrajanjem mRNA, kojoj većim dijelom ili u
potpunosti nedostaje dodatna domena, inhibira angiogenezu, dok cjelovita TrpRS ne
utječe na angiogenezu. Dakle, antiangiogena aktivnost katalitičkog tijela TrpRS
regulirana je prisutnošću dodatne domene. U oba slučaja dodatne domene TyrRS i
TrpRS nisu neophodne za njihovu katalitičku aktivnost [75]. Zanimljivo, nedavna
istraživanja impliciraju sudjelovanje SerRS u razvoju krvnih žila [76, 77], ali nema
indicija o ulozi produžetka.
2.2.6. Usporedba s polipeptidnim produžetkom eukariotskih seril-tRNA-
sintetaza
Iz dosada navedenog vidljivo je da je struktura i funkcija dodatnih domena
eukariotskih aaRS vrlo raznolika. Smještaj, obilježja i uloga dodatnih domena sažeta
je u tablici 1. Dodatne domene često predstavljaju pomoćne domene za vezanje tRNA,
sudjeluju u interakcijama između proteina, često su presudne su za stabilnost
proteinskih kompleksa, a pripisuje im se uloga u unutarstaničnom smještaju enzima,
mehanizmu usmjerenog prijenosa tRNA, staničnoj signalizaciji i alternativnim
funkcijama aaRS. Vrlo su divergentne, ponekad čak i unutar iste porodice enzima
(primjer eukariotskih MetRS; kvaščeve i humane AspRS), a mogu imati višestruke
uloge (pr. GluProRS, kvaščeva AspRS, humana AspRS).
Literaturni pregled
26
Tablica 1: Pregled smještaja, duljine i uloge produžetaka i dodatnih domena eukariotskih aminoacil-tRNA-sintetaza.
aaRS Organizam Smještaj, duljina Uloga
MetRS Oryza sativa C / 200 nespecifična vezna domena za tRNA
C / 76 nespecifična vezna domena za tRNA, interakcija s EF-1A MetRS Homo sapiens
N / 214 interakcije unutar multi-aaRS kompleksa
MetRS S. cerevisiae N / 193 interakcija s Arc1p
GluRS S. cerevisiae N / 210 interakcija s Arc1p
GlnRS S. cerevisiae N / 228 nespecifična vezna domena za tRNA
AspRS S. cerevisiae N / 71 interakcija s vlastitom mRNA - regulacija ekspresije; nespecifična vezna domena za tRNA
AspRS Homo sapiens N / 32 nespecifična vezna domena za tRNA; otpuštanje Asp-tRNAAsp; interakcija s EF1A
ValRS S. cerevisiae N / 97 nespecifična vezna domena za tRNA
ValRS O. cuniculus N / ∼300 nespecifična vezna domena za tRNA; interakcija s EF-1H
GluProRS Homo sapiens linker / 207
vezna domena za RNA; interakcije unutar multi-aaRS kompleksa
LeuRS Homo sapiens C / 89 interakcije unutar multi-aaRS kompleksa
ArgRS Homo sapiens N / 72 interakcije unutar multi-aaRS kompleksa
LysRS Homo sapiens N / ~60 nespecifična vezna domena za tRNA
TyrRS Homo sapiens C / 170 citokin; regulacija citokine i angiogene aktivnosti TyrRS
TrpRS Homo sapiens N / 47 regulacija antiangiogene aktivnosti TrpRS
U usporedbi s ostalim aaRS, produžeci eukariotskih SerRS su relativno kratki
(∼ 20 do 50 aminokiselina) i ne pokazuju sličnost na razini primarne strukture s
opisanim produžecima. Njihov bazičan karakter sugerira da bi mogle predstavljati
pomoćnu domenu za vezanje tRNA. S druge strane, gubitak interakcije kvaščeve
SerRS s Pex21p uslijed delecije produžetka upućuje na njegovu važnost u proteinskim
interakcijama. Uzevši u obzir raznolikost uloga dodatnih domena eukariotskih aaRS i
njihove višestruke uloge, ne mogu se isključiti nove, dodatne uloge polipeptidnih
produžetaka SerRS.
27
3. MATERIJALI I METODE
3.1. Materijali
3.1.1. Standardne kemikalije
Agaroza (Sigma), akrilamid (Sigma), amonijev acetat (Kemika), amonijev
klorid (Kemika), amonijev persulfat (APS) (Serva), N,N-dimetilformamid (DMF)
(Sigma), ditiotreitol (DTT) (Sigma), etilendiamintetraoctena kiselina (EDTA) (Sigma),
etanol (Kemika), fenilmetilsulfonil-fluorid (PMSF) (Sigma), fenol (Kemika),
formaldehid (Kemika), fosfatna kiselina (Kemika), glicerol (Kemika), glicin (USB
Corporation), N-(2-hidroksietil)piperazin-N'-2-(etansulfonska kiselina) (HEPES)
(USB Corporation), imidazol (Sigma), kalcijev klorid (Kemika), kalijev acetat
(Kemika), kalijev bikromat (Kemika), kalijev dihidrogenfosfat (Kemika), kalijev
hidroksid (Kemika) kalijev klorid (Kemika), kloroform (Kemika), kloridna kiselina
(Kemika), litijev acetat (Sigma), magnezijev acetat (Sigma), magnezijev klorid
(Fluka), magnezijev sulfat (Sigma), β-merkaptoetanol (Serva), metanol (Kemika),
N,N’-metilenbisakrilamid (Merck), 2-(N-morfolino)etansulfonska kiselina (MES)
(Sigma), natrijev acetat (Kemika), natrijev dodecilsulfat (SDS) (Merck), natrijev
hidrogenfosfat (Kemika), natrijev hidroksid (Kemika), natrijev klorid (Kemika),
natrijev karbonat (Sigma), nitratna kiselina (Kemika), Nonident P-40 (NP-40) (USB
Corporation), octena kiselina (Kemika), polietilenglikol 4000 (PEG 4000) (Sigma),
1,4-bis(2-(4-metil-5-fenil)oksazolil)benzen (POPOP) (Kemika), 2,5-difeniloksazol
(PPO) (Kemika), srebrov nitrat (Kemika), N,N,N’,N’-tetrametiletilendiamin (TEMED)
(Serva), Tris(hidroksimetil)-aminometan (Tris) (Kemika), trikloroctena kiselina (TCA)
(Kemika), Triton X-100 (Sigma).
3.1.2. Aminokiseline, baze i nukleotidi
adenin sulfat (Sigma), adenozin-trifosfat (ATP) (Sigma), arginin hidroklorid
(Sigma), asparagin (Sigma), dNTP (smjesa dATP, dGTP, dCTP, dTTP) (Sigma),
fenilalanin (Sigma), glicin (Sigma), glutaminska kiselina (Sigma), histidin hidroklorid
(Sigma), izoleucin (Sigma), leucin (Sigma), lizin hidroklorid (Sigma), metionin
(Sigma), prolin (Sigma), serin (Sigma), [U-14C]-serin (PerkinElmer), tirozin (Sigma),
treonin (Sigma), triptofan (Sigma), uracil (Sigma)
Materijali i metode
28
3.1.3. Boje
Bromfenol plavo (Serva), Coomassie Brillliant Blue R-250 (Merck),
Coomassie Brilliant Blue G-250 (Serva), etidij-bromid (Boehringer Mannheim),
ksilencijanol fluorofosfat (Serva), otopina boje Ponceau S (Sigma).
3.1.4. Enzimi, proteini i nukleinske kiseline
Albumin iz goveđeg seruma (eng. bovine serum albumin; BSA) (NEB),
alkalna fosfataza iz škampa (eng. shrimp alkaline phosphatase; SAP) (GE
Healthcare), jednolančana DNA iz sperme lososa (Sigma), High Fidelity PCR
Enzyme Mix (Fermentas), Pfu DNA-polimeraza (Fermentas), poliklonska antitijela
kunića na kvaščevu SerRS (laboratorijski pripravak), poliklonska antitijela kunića na
LexA (Invitrogen), restrikcijske endonukleaze s pripadnim puferima (NEB),
ribonukleaza A iz goveđe gušterače (USB Corporation), T4 DNA-ligaza (Fermentas),
sekundarna antitijela na antitijela kunića konjugirana s peroksidazom iz hrena (Sigma),
Taq DNA-polimeraza (Fermentas), ukupna tRNA iz E. coli (Roche), ukupna tRNA iz
pivskog kvasca (Roche).
Transkript kvaščevog tRNASer izoakceptrora 1 priređenog in vitro [ 78 ]
ljubazno je ustupila Jelena Jarić.
Oligonukleotidi (Invitrogen) korišteni kao početnice u lančanoj reakciji
polimeraze sintetizirani su prema potrebi.
3.1.5. Sastojci mikrobioloških hranjivih podloga i medija
Agar (Sigma), 3-amino-1,2,4-triazol (3-AT) (Sigma), ampicilin, natrijeva sol
(Sigma), 5-brom-4-klor-3-hidroksiindolil-β-galaktopiranozid (X-gal) (Sigma), ekstrakt
kvasca (Difco), 5-fluoroorotat (5-FOA) (Fermentas), galaktoza (Sigma), glukoza
(Kemika), izopropil-β-D-tiogalaktopiranozid (IPTG) (Fermentas), kanamicin sulfat
(Sigma), pepton (Sigma), tripton (Sigma), Yeast Nitrogen Base without amino acids
(YNB) (Difco).
3.1.6. Kromatografske kolone i punila
DEAE-celuloza DE-52 (Whatman), MonoQ HR 10/10 (Pharmacia), MonoS
HR 5/5 (Pharmacia), Ni-NTA agaroza (Qiagen), PD-10 (GE Healthcare)
Materijali i metode
29
3.1.7. Komercijalni kompleti ("kitovi") za pročišćavanje DNA
QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) za izolaciju plazmidne DNA iz E. coli,
QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) za pročišćavanje DNA iz reakcijskih smjesa
ulančane reakcije polimeraze (PCR-a), QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) za
izolaciju fragmenata DNA iz agaroznih gelova.
3.1.8. Sojevi i plazmidi E. coli
Sojevi E. coli
DH5α (supE44 ∆lacU169 (φ80 lacZ ∆M15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-
1 relA1): laboratorijski soj za rutinsku amplifikaciju plazmidne DNA i kloniranje,
deficijentan za rekombinaciju. Mogućnost α-komplementacije s plazmidima iz pUC
serije [79].
BL21(DE3) (F- ompT hsdSB(rB– mB
–) gal dcm (DE3); Novagen): laboratorijski
soj za prekomjernu ekspresiju gena kloniranih u vektore iz pET serije. Deficijentan za
proteaze lon i ompT. Posjeduje gen za T7 RNA-polimerazu integriran u genomsku
DNA pod kontrolom inducibilnog promotora lacUV5 [80].
Plazmidi za ekspresiju proteina u E. coli
pET28b - plazmid za prekomjernu ekspresiju proteina pod kontrolom
inducibilnog promotora T7lac. Omogućuje dobivanje rekombinantnog proteina sa ili
bez histidinskog privjeska (skraćeno: His-tag) na N- ili C-kraju, radi pročišćavanja
rekombinantnog proteina afinitetnom kromatografijom na Ni-NTA agarozi. Plazmid
malog broja kopija u stanici koji nosi kanamicinsku rezistenciju [81].
pET15bPEX21 - derivat plazmida pET15b, s kloniranim genom za Pex21p u
restrikcijska mjesta NdeI i BamHI [8]. Kodira Pex21sa histidinskim privjeskom na N-
kraju. Ostala svojstva slična kao pET28b, osim što nosi rezistenciju na ampicilin.
Materijali i metode
30
3.1.9. Sojevi i plazmidi kvasca Saccharomyces cerevisiae
Sojevi kvasca Saccharomyces cerevisiae
S2088α (MATα ura3-52 trp1 lys2-801 leu2∆1 his3-∆200 pep4::HIS3 prb-
∆1.6R can1 GAL) - haploidni soj kvasca korišten za prekomjernu ekspresiju
rekombinantnih proteina, s inaktiviranim genima za proteaze prA i prB [82].
L40 (MATa trp1 leu2 his3 LYS2::lexA-HIS3 URA3:lexA-lacZ) [ 83 ] - soj
kvasca za sustav dvaju hibrida (eng. yeast two-hybrid), posjeduje gene-pokazatelje
HIS3 i lacZ pod kontrolom sintetskih promotora ovisnih o LexA.
BR2727∆SES1 (MATa ura3-1 leu2-3,112 his4 trp1 lys2 arg4-9 ade2-1
SES1::LYS2) - haploidni soj kvasca s inaktiviranom genomskom kopijom gena za
SerRS (SES1) insercijom biljega LYS2. Posjeduje centromerni plazmid pUN70SES1, s
URA3 biljegom, koji kodira SerRS neophodan za preživljavanje soja.
Plazmidi za kvasac Saccharomyces cerevisiae
Svi korišteni vektori pripadaju tzv. shuttle-vektorima, koji osim ishodišta
replikacije u kvascu, posjeduju i nukleotidne sljedove za njihovo umnožavanje i
održavanje u E. coli.
pCJ11 visokokopijski plazmid za prekomjernu ekspresiju proteina pod
kontrolom inducibilnog jakog promotora GAL1 [ 84 ]. Visoka razina ekspresije
rekombinantnih proteina osigurana je kombinacijom jakog promotora i biljega
Materijali i metode
31
LEU2-d kojem nedostaju esencijalni dijelovi promotora pa je slabo eksprimiran [82],
što stanice kvasca prisiljava na održavanjem velikog broja kopija plazmida u stanici.
pCJ11SES1 i pCJ11SES1∆C20 - derivati pCJ11 s genima za cjelovitu SerRS
i krnju SerRS∆C20 kloniranim u restrikcijsko mjesto BamHI, pod kontrolom
promotora GAL1 [5].
pUN100 - centomerni niskokopijski plazmid s biljegom LEU2 i regijom
višestrukih restrikcijskih mjesta (MCS) iz plazmida pUC18 [85]. Korišten u pokusima
komplementacije.
pVT103-L6,3 kb
HindIIIPvuIIPstIXhoISstIXbaIBamHI
SphI
SphI
BglI
PvuIScaI
EcoRI
NruI
EcoRIEcoRV
BstEIIClaIKpnI
PvuI
HpaI
NsiI
leu2-d
f1 ori
Ampr
ori
2µ oriADH3'
ADHp
pVT103-L6,3 kb
HindIIIPvuIIPstIXhoISstIXbaIBamHI
SphI
SphI
BglI
PvuIScaI
EcoRI
NruI
EcoRIEcoRV
BstEIIClaIKpnI
PvuI
HpaI
NsiI
leu2-d
f1 ori
Ampr
ori
2µ oriADH3'
ADHp
pUN1006,4 kb
LEU2
Ampr
ori CEN4
ARS1
lacZ'
NarI
PstIBglII
NaeI
XhoI
NaeIHpaI
ClaIKpnIEcoRIEcoRV
PvuIIPvuII
Eco
RI
Sac
IK
pnI
SmaI
Bam
HI
XbaI
Sal
IP
stI
Sph
IH
indI
II
pUN1006,4 kb
LEU2
Ampr
ori CEN4
ARS1
lacZ'
NarI
PstIBglII
NaeI
XhoI
NaeIHpaI
ClaIKpnIEcoRIEcoRV
PvuIIPvuII
Eco
RI
Sac
IK
pnI
SmaI
Bam
HI
XbaI
Sal
IP
stI
Sph
IH
indI
II
pVT103-L - visokokopijski episomalni plazmid s biljegom LEU2-d i jakim
krnjim konstitutivnim promotorom gena ADH1 [86]. Ekspresijski vektor, korišten u
pokusima komplementacije.
Materijali i metode
32
pACTpex21 - derivat vektora pACT s kloniranim genom za Pex21p [7].
Plazmid kodira kimerni protein Pex21p s aktivacijskom domenom proteina GAL4 na
N-kraju ("prey-vektor"). Hibridni protein se u kvascu eksprimira s pojačanog krnjeg
promotora ADH1. Ekspresija je konstitutivna, srednje razine. Za usmjeravanje
proteina u jezgru se koristi signalni slijed velikog T-antigena iz SV40. Kao biljeg
koristi se gen LEU2. Korišten u sustavu dvaju hibrida.
EcoRIXbaI
2uHpaI
ClaI
LEU2
EcoRIEcoRVNotI
loxPNotI
AHD1t
MCS
GAL4ad
ADH1p
ColEI
Amp
AatII
pACT7.7 kb
SphI
ADH1p
HindIII
LexA
EcoRVHA-epitop
MCS
ADH1t SphI
HindII
EcoRVTRP1
XbaI
PvuIIColE1
BglII
PvuI
Amp
AatII
2u
pAB1515.7 kb
6.0 kb
pAB151 - višekopijski plazmid koji u sustavu dvaju hibrida kodira fuzijske
proteine s veznom domenom za DNA iz LexA ("bait-vektor") [7]. Ekspresija
fuzijskog protein je pod kontrolom konstitutivnog promotora ADH1 i terminatora
ADH.
3.1.10. Mikrobiološki mediji i podloge
LB (Luria-Bertani) medij - kompletni medij za uzgoj E. coli. Sastav: tripton
10 g dm-3, kvaščev ekstrakt 5 g dm-3, NaCl 10 g dm-3. Steriliziran autoklaviranjem 20
min pri 120 °C. U medij za hranjive podloge dodaje se 20 g dm-3 agara prije
sterilizacije autoklaviranjem. Nakon autoklaviranja u sterilni medij po potrebi su
dodani ampicilin (natrijeva sol, 100 mg dm-3) ili kanamicin sulfat (30 mg dm-3) .
YPD, YPAD - kompletni mediji za uzgoj kvasaca. Sastav: pepton 20 g dm-3,
glukoza 20 g dm-3, kvaščev ekstrakt 10 g dm-3. U YPAD medij dodan je još i adenin,
do 50 mg dm-3. Steriliziran autoklaviranjem 20 min pri 120 °C. U medij za hranjive
podloge dodaje se 20 g dm-3 agara prije sterilizacije autoklaviranjem.
Materijali i metode
33
Minimalni medij za kvasce s glukozom (YNB medij s glukozom). Sastav:
YNB 6,7 g dm-3, glukoza 20 g dm-3. Steriliziran autoklaviranjem 20 min pri 120 °C. U
medij za hranjive podloge dodaje se 20 g dm-3 agara prije sterilizacije autoklaviranjem.
Ako nije drukčije naglašeno, pod minimalnim medijem podrazumijeva se minimalni
medij s dodatkom glukoze kao izvorom ugljikohidrata.
Minimalni medij za kvasce s galaktozom (YNB medij s galaktozom).
Sastav: YNB 6,7 g dm-3, galaktoza 20 g dm-3. Steriliziran autoklaviranjem 20 min pri
120 °C. Galaktoza sterilizirana filtracijom na filteru pora 0,22 µm dodaje se naknadno,
nakon autoklaviranja.
Minimalni mediji za kvasce suplementirani su sa sljedećim dodacima, prije
autoklaviranja: adenin sulfat 20 mg dm-3, arginin hidroklorid 20 mg dm-3, lizin
hidroklorid 30 mg dm-3, histidin hidroklorid monohidrat 20 mg dm-3, triptofan 20 mg
dm-3, leucin 60 mg dm-3, izoleucin 30 mg dm-3, valin 50 mg dm-3, metionin 20 mg
dm-3, fenilalanin 50 mg dm-3, treonin 50 mg dm-3, uracil 20 mg dm-3. Izostavljen je
jedan ili više sastojaka, ovisno o selekciji koja se želi postići.
3.2. Određivanje koncentracije proteina po Bradfordu
Metoda se temelji se na svojstvu da se apsorpcijski maksimum anionske boje
Coomassie Brilliant Blue G-250 pomiče s 465 nm na 595 nm uslijed vezanja na
proteine u kiseloj otopini [87].
Za konstrukciju baždarnog pravca pripremi se nekoliko koncentracija
proteinskog standarda (BSA) u rasponu od 2-16 µg u 0,1 ml vode. Svim uzorcima,
standardima i slijepoj probi doda se 1 ml Bradfordovog reagensa (vodena otopina
sastava: Coomassie Brilliant Blue G-250 0,1 g dm-3, volumni udio etanola 5 % i
fosforne kiseline 8,5 %). Sadržaj se promiješa nekoliko puta i inkubira 5 min do 1 h.
Izmjeri se apsorbancija uzoraka pri λ = 595 nm, u istom vremenskom intervalu.
Materijali i metode
34
3.3. Elektroforetske metode
3.3.1. Elektroforeza proteina na poliakrilamidnom gelu u prisutnosti
SDS-a (SDS-PAGE)
Cijeli postupak izveden je u uređaju za vertikalnu elektroforezu Mini Protean
II (Bio-Rad). Između dviju staklenih ploča u uspravnom položaju do 3/4 volumena
izliven je gel za razdvajanje priređen dodatkom APS-a do konačne koncentracije 0,7
µg ml-1 i TEMED-a do konačnog volumnog udjela 0,05% u otopinu sastava: maseni
udio akrilamida i bisakrilamida (u masenom omjeru 29:1) 9 %, SDS 1 g dm-3, Tris
0,375 mol dm-3 titriran kloridnom kiselinom do pH 8,8. Gel je nadsvođen destiliranom
vodom radi sprečavanja pristupa atmosferskom kisiku koji inhibira polimerizaciju,
čime je istovremeno poravnan gornji rub gela. Nakon 30 min voda je odlivena te je
izliven gel za sabijanje dodavanjem APS-a do konačne koncentracije 0,7 µg ml-1 i
TEMED do konačnog udjela 0,05% u otopinu sastava: maseni udio akrilamida i
bisakrilamida (u masenom omjeru 29:1) 4%, SDS 1 g dm-3, Tris 0,125 mol dm-3
titriran HCl-om do pH 6,8. Prije polimerizacije gela za sabijanje, umetnut je teflonski
češalj za formiranje jažica.
Uzorak proteina nanesen je na gel pomiješan u volumnom omjeru 3:1 s
puferom za nanošenje uzoraka (SDS 50 g dm-3, glicerol φ = 30 %, β-merkaptoetanol φ
= 8 %, bromfenol plavo 0,1 g dm-3, Tris 0,25 mol dm-3 titriran HCl-om do pH 6,8).
Prije nanošenja na gel, proteini su denaturirani zagrijavanjem u kipućoj vodi u trajanju
od 5 min. Elektroforeza je vođena u puferu sastava: 14,4 g dm-3 glicina, 3 g dm-3 Tris-
a, 1 g dm-3 SDS-a. Uzorak je sabijan u gelu za sabijanje pri konstantnom naponu od
130 V, a razdvajan u drugom dijelu gela pri 200 V.
Proteini su detektirani bojanjem pomoću Coomassie Brillinat Blue R-250.
Nakon elektroforeze gel je inkubiran 20-30 minuta u otopini boje Coomassie Brilliant
Blue R-250 (Coomassie Brilliant Blue R-250 2,5 g dm-3, octena kiselina φ = 10 %,
metanol φ = 45 %) uz potresanje na rotacijskoj platformi. Gel je zatim prokuhavan u
većoj količini kipuće vode (1 - 1,5 litara) radi uklanjanja nevezane boje.
3.3.2. Western-analiza
Nakon razdvajanja proteina pomoću SDS-PAGE, gel se oslobađa aparature i
inkubira 5 min u puferu za prijenos (14,4 g dm-3 glicina, 3 g dm-3 Tris-a, volumni udio
Materijali i metode
35
etanola 20 %). Za prijenos proteina na nitroceluloznu membranu korištena je
aparatura za polusuhi prijenos (Pharmacia LKB). Na anodnu ploču položeno je šest
listova filter-papira (Whatman 3MM) veličine gela, namočenih puferom za prijenos.
Na filter-papir položena je nitrocelulozna membrana (Hybond-C Extra; Amersham
Biosciences), a na nju gel i sljedećih 6 listova filter-papira namočenih puferom za
prijenos. Po istiskivanju mjehurića zraka i suvišnog pufera, na vrh je položena
katodna ploča. Prijenos je trajao 90 minuta uz konstantnu jakost el. struje od 0,8 mA
cm-2 gela. Učinkovitost prijenosa proteina na membranu provjerena je reverzibilnim
bojanjem membrane pomoću otopine Ponceau S.
Nakon ispiranja, membrana je blokirana inkubacijom 2 sata u otopini
nemasnog mlijeka u prahu (50 g dm-3) u puferu TBS/NP-40 (25 mmol dm-3 Tris-a
titriranog HCl-om do pH 7,5, 150 mmol dm-3 NaCl, NP-40 φ = 0,1 %), radi
sprječavanja nespecifične adsorpcije antitijela na membranu. Membrana je zatim
inkubirana s primarnim antitijelima na kvaščevu SerRS ili LexA u puferu TBS/NP-40
u trajanju od 1 sata, isprana je 2 puta kratko i 3 puta po 5 minuta istim puferom, a
zatim 1 sat s otopinom sekundarnih antitijela u puferu TBS/NP-40, konjugiranih s
peroksidazom iz hrena. Nakon ispiranja membrane s puferom TBS/NP-40 (2 puta
kratko, 3 puta po 10 min), položaj sekundarnih antitijela detektiran je
kemiluminiscencijom. Korišten je komplet LumiGLO (KPL), koji se temelji na
oksidaciji luminola vodikovim peroksidom kataliziranoj peroksidazom konjugiranoj
za sekundarna antitijela. Kemiluminiscencija je zabilježena na fotografskom filmu
BioMax Light (Kodak).
3.3.3. Nativna elektorforeza kompleksa proteina i nukleinskih kiselina
Neposredno prije priprave kompleksa proteina i tRNA, transkript kvaščeve
tRNA pažljivo je renaturiran: uzorak tRNA zagrijavan je u vodenoj kupelji 5 min na
80 °C. Nakon što se vodena kupelj polako ohladila do 70 °C, dodan je magnezijev
klorid do konačne koncentracije 10 mmol dm-3. Uzorak tRNA izvađen je iz vodene
kupelji i ostavljen 15-20 minuta na sobnoj temperaturi da se ohladi, te je čuvan na
ledu do upotrebe.
Jedan mikrogram (približno 10 pmol) kvaščeve ili kukuruzne SerRS, te
njihovih varijanti, inkubiran je s 0,54 µg (20 pmol) svježe renaturiranog transkripta
kvaščeve tRNASer (izoakceptor 1) u otopini sastava: HEPES 50 mmol dm-3, titriran
Materijali i metode
36
NaOH do pH 7,0, MgCl2 5 mmol dm-3. Inkubacija enzima i renaturirane tRNA trajala
je 15 minuta pri sobnoj temperaturi u ukupnom volumenu 10 µl. Uzorku je dodan
glicerol do volumnog udjela 5 % i ksilencijanol fluorofosfat (konačna koncentracija
0,1 mg ml-1) radi lakšeg praćenja tijeka elektroforeze. Uzorci su naneseni na
poliakrilamidni gel masenog udjela 7,5 %, priređen polimerizacijom smjese
akrilamida i bisakrilamida masenog omjera 39:1. Poliakrilamidni gel priređen je u
elektroforetskom puferu sastava istovjetnog sastavu pufera u kojem su pripravljeni
kompleksi. Elektroforeza je trajala oko 100 minuta pri 4 °C uz konstantan napon od
150 V u aparaturi za vertikalnu elektroforezu Mini Protean II (Bio-Rad).
Po završetku elektroforeze gelovi su bojani srebrom [88]. Gel je fiksiran
inkubacijom 20-30 minuta u otopini volumnog udjela etanola 50 % i octene kiseline
12 % na rotacijskoj platformi. Zatim je gel inkubiran tijekom 20-30 minuta u otopini
volumnog udjela etanola 10 % i octene kiseline 5 %. Gel je kratko ispran
redestiliranom vodom, a zatim je namakan u otopini kalijevog bikromata
koncentracije 1 g dm-3 zakiseljene dodatkom 0,27 µl koncentrirane nitratne kiseline
(w = 65 %) po mililitru otopine. Gel je ispran redestiliranom vodom, približno 3 puta
po 10 minuta, do potpunog obezbojenja gela i okolne otopine. Gel je zatim inkubiran
30 minuta na rotacijskoj platformi u otopini srebrovog nitrata koncentracije 2 g dm-3.
Gel je kratko ispran otopinom natrijevog karbonata (γ = 35 g dm-3) kojoj je dodano
0,10 µl otopine formaldehida (w = 37 %) po mililitru otopine. Razvijanje se provodi u
otopini natrijevog karbonata (γ = 35 g dm-3) uz dodatak 0,50 µl otopine formaldehida
(w = 37 %) po mililitru otopine, dok se ne pojave pruge željenog intenziteta.
Razvijanje se zaustavlja uranjanjem gela u otopinu octene kiseline volumnog udjela
1 %.
Kompleksi kvaščeve ili kukuruzne SerRS, te njihovih varijanti s ukupnom
nefrakcioniranom kvaščevom ili kukuruznom tRNA priređeni su na sličan način kao
kompleksi s transkriptom kvaščeve tRNASer, inkubacijom 35 pmol enzima i ukupnom
tRNA koja je sadržavala 70 pmol tRNASer. Elektroforeza je trajala oko 135 minuta, a
gelovi su bojani pomoću Coomassie Brilliant Blue R-250, po jednakom postupku kao
u SDS-PAGE.
Materijali i metode
37
3.3.4. Elektroforeza DNA u agaroznom gelu
Za restrikcijsku analizu DNA, određivanje veličine DNA-fragmenata i
plazmida, te za izolaciju fragmenata DNA za potrebe kloniranja koristi se
horizontalna elektroforeza u gelu agaroze. Korišteni su gelovi s masenim udjelom
agaroze 1%, pripravljeni otapanjem agaroze na temperaturi vrenja u puferu TAE (Tris
40 mmol dm-3, 1 mmol dm-3 EDTA, titrirano octenom kiselinom do pH 8,0) u kojeg je
prethodno dodan etidij-bromid do koncentracije od 0,5 mg dm-3. Elektroforeza je
provedena u istom puferu u električnom polju jakosti 8-10 V/cm. Prije nanošenja na
gel, uzorcima je dodana smjesa glicerola i organskih boja (glicerol φ = 50 %,
bromfenol plavo w = 0,4 %, ksilencijanol fluorofosfat w = 0,4 %) do 1/10 konačnog
volumena, radi lakšeg nanošenja uzorka u jažice gela i praćenja napretka
elektroforeze.
Vizualizacija DNA vrpci, uslijed interkaliranja etidij-bromida u DNA, obavlja
se promatranjem gela na transiluminatoru, pod UV-svjetlošću valne duljine 312 nm.
3.4. Metode rekombinantne DNA
Rutinske metode rekombinantne DNA kao što su cijepanje DNA
restrikcijskim endonukleazama, restrikcijska analiza, defosforilacija DNA, ligacija
DNA pomoću T4 DNA-ligaze, izolacija plazmidne DNA metodom alkalne lize,
pročišćavanje fragmenata DNA, izolacija DNA iz agaroznog gela, uzgoj i
transformacija bakterija elektroporacijom i sl. izvedene su prema postupcima
opisanim u laboratorijskom priručniku J. Sambrook i D. Russell-a: Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, 3. izdanje, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001), ili
prema uputama proizvođača korištenih enzima i kompleta.
3.4.1. Lančana reakcija polimeraze (PCR)
Lančana reakcija polimeraze (eng. polymerase chain reaction; skraćeno PCR)
korištena je rutinski za umnažanje gena za kloniranje, ciljanu mutagenezu i za
detekciju (provjeru) ciljnih nukleotidnih sljedova u postupcima kloniranja, genetičkih
manipulacija kvasaca, i sl.
Rutinski, PCR se odvijao u 20 µl reakcijske smjese sastava: 200 µmol dm -3
dATP, dGTP, dCTP i dTTP, 2 µmol dm-3 početnica komplementarnih 5' i 3'-kraju
gena, 2,5 mmol dm-3 magnezijevog klorida, 75 mmol dm-3 Tris-a titriranog HCl-om
Materijali i metode
38
do pH 8,8, 20 mmol dm-3 amonijevog sulfata, Tween volumnog udjela 0,1 %, 0,4-0,6
jedinica Taq DNA-polimeraze, odgovarajući kalup. Reakcijski uvjeti navedeni su u
tablici 2. Sastav reakcijske smjese i reakcijski uvjeti mijenjani su i optimirani ovisno o
konkretnom slučaju i namjeni. Ulančana reakcija se odvijala u uređaju Primus (MWG-
Biotech).
Tablica 2: Standardni uvjeti PCR-a
Korak Temperatura / °C Trajanje koraka / min
početna denaturacija 94 3
denaturacija 94 0,5
vezanje početnica na kalup 50 0,5
produljenje lanaca 72 2
30 ciklusa
završno produljenje lanaca 72 5
3.4.2. Lančana reakcija polimeraze (PCR) na bakterijskim kolonijama
PCR na bakterijskim kolonijama (eng. colony-PCR) korišten je prilikom
pretrage bakterijskih kolonija za klonovima koji sadrže plazmid s ugrađenim genom.
Izvedbom (sastav reakcijske smjese i reakcijski uvjeti) je vrlo sličan rutinskom PCR-u,
osim što je izostavljen kalup u reakcijskoj smjesi.
Bakterijska kolonija nježno je dodirnuta sterilnim nastavkom, i prenijeta na
zasebnu ploču s hranjivom podlogom. Isti je nastavak uronjen u reakcijsku smjesu za
PCR, uz žustro miješanje. Na nastavku zaostaje dovoljno bakterijskih stanica da
njihova DNA posluži kao kalup prilikom umnažanja u PCR-u. Reakcijski uvjeti isti su
kao kod rutinskog PCR-a, osim što je početni korak denaturacije produljen na 10
minuta radi lize bakterijskih stanica.
3.4.3. Kloniranje i ciljana mutageneza gena za SerRS kukuruza
Cjeloviti gen za citosolnu SerRS iz kukuruza (ZmcSerRS) i njezine krnje
varijante umnožene su PCR-om koristeći plazmid pSKSerZMc [89]. U PCR-u je
korištena Pfu DNA-polimeraza ili smjesa DNA-polimeraza (High Fidelity PCR
Enzyme Mix, Fermentas) s pripadnim puferima, da bi se smanjila vjerojatnost
uvođenja slučajnih (neželjenih) mutacija prilikom umnažanja DNA PCR-om. Za
Materijali i metode
39
umnažanje gena za ZmcSerRS i njenih krnjih varijanti, korištene su početnice
navedene u tablici 3.
Tablica 3: Početnice korištene u kloniranju gena za ZmcSerRS, njezinih krnjih i mutiranih varijanti. Podcrtana su restrikcijska mjesta za BamHI (GGATCC), NcoI (CCATGG) i XbaI (TCTAGA) korištena prilikom kloniranja fragmenata DNA dobivenih PCR-om. Sivom bojom označeni su sljedovi koji nisu komplementarni kalupu, a dodani su radi lakšeg cijepanja krajeva DNA restrikcijskim endonukleazama. Podebljano su označeni početni i stop-kodoni.
Oligonukleotid (5' → 3') Opis
1 CCACTCGGATCCTTAAAATGCATCACCATCATCACCATGCTGGTATGCTCGACATCAACTTGTTC
Početnica komplementarna 5' kraju gena za ZmcSerRS. Slijed koji kodira histidinski privjesak prikazan je kurzivom.
2 AAGCGACCATGGTCGACATCAACTTGTTCC Početnica komplementarna 5' kraju ZmcSerRS
3 TCGCAATCTAGAATGCTCGACATCAACTTG Početnica komplementarna 5' kraju ZmcSerRS
4 CCACTCGGATCCAACTCAAGCAGCATTTCC Početnica komplementarna 3' kraju ZmcSerRS
5 CCACTCGGATCCTTAGGAGTCAGCAGCTTGTTTGG Početnica za umnažanje 3' kraja ZmcSerRS∆C12
6 GTCAGCGGATCCTTAGGCATCCAAAGGTTGCTTG Početnica za umnažanje 3' kraja ZmcSerRS∆C18
7 CGCGGATCCTCAAAGAAACTCTATTCCACC Početnica za umnažanje 3' kraja ZmcSerRS∆C26
8 CCACTCGGATCCTCAAGCAGCATTTCCCTGTTGATTTGCACTTGTTTGATTGGAGTCAGCAGCTTGTTTGG Početnica za dobivanje ZmcSerRSmut1 mutanta
9 CCTTTCAAGCAACCTTTGAATGCCCAATCAGCTGCTAACGCCAAATCAAACAAGTCC
Početnica korištena u prvom krugu megaprimer PCR-a (zajedno s početnicom 4) za dobivanje ZmcSerRSmut2
10 GGTGGAATAGAGTTCCTTGCCTGTCAAGCAACCTTTGGTGCCAAACAAGCTGCTGAC
Početnica korištena u prvom krugu megaprimer PCR-a (zajedno s početnicom 4) za dobivanje ZmcSerRSmut3
Umnoženi fragmenti DNA pročišćeni su iz reakcijske smjese za PCR, cijepani
odgovarajućim restrikcijskim endonukleazama, i klonirani u restrikcijska mjesta NcoI
i BamHI plazmida pET28 (ZmcSerRS bez histidinskog privjeska), NdeI i BamHI
plazmida pET28 (ZmcSerRS s histidinskim privjeskom) i BamHI mjesto pCJ11.
Prilikom umnožavanja DNA fragmenata za kloniranje u kvaščev vektor pCJ11,
konstruktima je pridodan nukleotidni slijed koji kodira histidinski privjesak
(MHHHHHHAG-) na N-kraju proteina, pomoću početnice 1. Geni za krnje varijante
ZmcSerRS (ZmcSerRS∆C12, ZmcSerRS∆C18 i ZmcSerRS∆C26) dobiveni su
umnažanjem DNA s početnicama koje daju skraćene fragmente i uvode stop kodon na
njihov 3'-kraj.
ZmcSerRSmut1 ima mutiran C-kraj produžetka. ZmcSerRSmut1 dobiven je
pomoću početnice 1 i 8, koja nije u potpunosti komplementarna 3'-kraju kodirajućeg
slijeda ZmcSerRS, već posjeduje deleciju kojom mijenja okvir čitanja blizu C-kraja
Materijali i metode
40
produžetka i inserciju kojom se na samom kraju produžetka vraća originalni okvir
čitanja.
ZmcSerRSmut2 i mut3 s izmijenjenom početnom i središnjom regijom C-
terminalnog produžetka, dobiveni su ciljanom mutagenezom, metodom megaprimer
PCR-a [ 90 ] (slika 11). U prvom krugu PCR-a korištena je početnica 4
komplementarna 3'-kraju kodirajućeg slijeda za ZmcSerRS i početnica 9 ili 10 koje
unose željene mutacije u području C-terminalnog produžetka kukuruzne SerRS. Klice
9 i 10 komplementarne su 5'-kraju fragmenta koji kodira C-kraj ZmcSerRS.
Fragmenti ("megaprimeri") koji kodiraju mutirani oblik C-kraja ZmcSerRS pročišćeni
su elektroforezom na agaroznom gelu (maseni udio agaroze 2 %) i u drugom krugu
PCR-a produljeni su koristeći početnicu 1 koja kodira histidinski privjesak i
pSKSerRSZMc kao kalup. Reakcijski uvjeti za prvi krug megaprimer PCR-a dani su
u tablici 4, a drugi krug PCR-a odvijao se pri standardnim uvjetima navedenim u
tablici 2.
kalup DNA
mutagena početnicaPCR I
megaprimer
kalup DNA
megaprimer
PCR II
mutirana DNA
His-tag
kalup DNA
mutagena početnicaPCR I
megaprimer
kalup DNA
megaprimer
PCR II
mutirana DNA
His-tag
Slika 11: Shematski prikaz ciljane mutageneze metodom megaprimer PCR-a korištene za dobivanje ZmcSerRSmut2 i mut3. U prvom krugu PCR-a umnožen je fragment DNA koji nosi željene mutacije. U drugom krugu PCR-a mutirani fragment produlji se na kalupu DNA, pri čemu je pomoću odgovarajuće početnice nadodan kodirajući slijed za histidinski privjesak (His-tag) na N-kraju proteina.
Materijali i metode
41
Tablica 4: Reakcijski uvjeti prvog kruga megaprimer PCR-a, za sintezu mutiranog fragmenta C-kraja ZmcSerRS
Korak Temperatura / °C Trajanje koraka
početna denaturacija 94 2,5 min
denaturacija 94 30 s
vezanje početnica na kalup 50 30 s
produljenje lanaca 72 40 s
30 ciklusa
završno produljenje lanaca 72 2,5 min
Fragmenti DNA koji kodiraju ZmcSerRS, njezine krnje i mutirane varijante s
His-tagom na N-kraju cijepani su s BamHI i ugrađeni u vektor pCJ11. Prije ligacije
T4 DNA-ligazom vektor je defosforiliran alkalnom fosfatazom iz škampa da se
spriječi njegova spontana recirkularizacija. Nakon elektroporacije ligacijskih smjesa,
potencijalni pozitivi pretraženi su PCR-om na bakterijskim kolonijama, a orijentacija
inserta provjerena je restrikcijskom analizom. Određivanjem nukleotidnog slijeda
(sekvenciranjem) potvrđena je prisutnost željenih mutacija.
3.4.4. Kloniranje gena za krnji oblik SerRS kvasca
Konstrukcija ekspresijskih plazmida pCJ11SES1 i pCJ11SES1∆C20 za
cjelovitu SerRS i krnju SerRS kvasca bez produžetka na C-kraju (ScSerRS∆C20)
opisana je u referenci 5 (poglavlje 3.1.9).
Skraćeni fragment DNA koji kodira krnji SerRS∆C13 umnožen je PCR-om
koristeći pCJ11SES1 kao kalup pomoću klica navedenih u tablici 5. Korištena je
smjesa DNA polimeraza (High Fidelity PCR Enzyme Mix, Fermentas) i reakcijski
uvjeti navedeni u tablici 2. Fragment DNA pročišćen je iz reakcijske smjese za PCR,
obrađen restrikcijskom endonukleazom BamHI i ugrađen u plazmid pCJ11 sličnim
postupkom kao konstrukti kukuruzne SerRS. Kvaščeva SerRS i njezini krnji oblici
klonirani su bez kodirajućeg slijeda za histidinski privjesak na N-kraju.
Materijali i metode
42
Tablica 5: Početnice korištene pri umnažanju gena za kvaščevu SerRS i njezinog krnjeg oblika SerRS∆C13. Restrikcijsko mjesto za BamHI je podcrtano, a sivom bojom označeni su nukleotidni sljedovi koji nisu komplementarni kalupu, a dodani su radi lakšeg cijepanja krajeva DNA s BamHI. Početni i stop-kodon je podebljan.
Oligonukleotid (5' → 3') Opis
1 CCCCGGGATCCATGTTGGACATCAACCAAT Početnica komplementarna 5' kraju gena za ScSerRS
2 GGTGAGGGATCCTTATGGTAATTCATTAACGAATGG Početnica za stvaranje 3' kraja ScSerRS∆C13
3.4.5. Kloniranje gena za kimerne proteine kvaščeve i kukuruzne SerRS
Fragment DNA koji kodira kukuruznu SerRS kojoj je produžetak djelomično
zamijenjen produžetkom kvaščeve SerRS (Zm18Sc13) dobiven je pomoću PCR-a,
umnažanjem gena ZmcSerRS s početnicom 2 koja je komplementarna 3'-kraju gena
za ZmcSerRS, a posjeduje nukleotidni slijed koji kodira dio produžetka kvaščeve
SerRS (tablica 6).
Tablica 6: Početnice korištene pri dobivanju fragmenata DNA koji kodiraju kimerne proteine kukuruzne SerRS s produžetkom kvaščeve SerRS.
Oligonukleotid (5' → 3') Opis
1 AAGCGACCATGGTCGACATCAACTTGTTCC Početnica komplementarna 5' kraju ZmcSerRS
2 CCACTCGGATCCTTAATTCTTCTTTTTCTTGTCTTTACTAGAGGTGGAATTCTTGGCATCCAAAGGTTGCTTG
Početnica za zamjenu dijela kukuruznog produžetka kvaščevim produžetkom (kurziv) u Zm18Sc13 (zajedno s početnicom 1)
3 GGTGGAATAGAGTTCCTTCCATTCGTTAATGAATTACC Početnica komplementarna 3' kraju kat. domene ZmcSerRS i 5' kraju produžetka (kurziv) ScSerRS, za dobivanje Zm26Sc20
4 GGCGCGGATCCTTAATTCTTCTTTTTCTTGTC Početnica komplementarna 3' kraju ScSerRS
Kod potpune zamjene produžetka kukuruzne SerRS kvaščevim produžetkom
primijenjena je prilagođena varijanta preklapajućeg PCR-a (eng. overlap PCR; slika
12) [90]. Pomoću klica 3 i 4 s pCJ11SES1 umnožen je fragment DNA koji kodira
produžetak kvaščeve SerRS, a na 5' kraju komplementaran je s genom kukuruzne
SerRS. U drugom krugu PCR-a kao kalup je poslužila smjesa tog fragmenta i
pSKSerZMc, te početnice 1 i 4, komplementarne 5'-kraju gena za ZmcSerRS i 3'-
kraju gena za ScSerRS. Takva kombinacija klica može umnožiti jedino kimernu
molekulu DNA koja kodira kukuruznu SerRS s kvaščevim produžetkom (Zm26Sc20),
nastalu u prvim ciklusima drugog kruga PCR-a (slika 12).
Materijali i metode
43
kalup DNA (gen za ScSerRS)
kimerna početnicaPCR I
PCR II
gen za ZmcSerRS
produžetak ScSerRS
kimerna DNA(Zm26Sc20)
Slika 12: Shematski prikaz preklapajućeg (eng. overlap) PCR-a, korištenog pri dobivanju kimernog Zm26Sc20. U prvom krugu PCR-a umnožen je fragment koji kodira C-terminalni produžetak kvaščeve SerRS (ScSerRS) i posjeduje regiju komplementarnu genu za kukuruznu SerRS (ZmcSerRS). U drugom krugu PCR-a umnožen je fragment DNA koji kodira kukuruznu SerRS s kvaščevim produžetkom (Zm26Sc20), upotrebom klica koje mogu umnožiti samo kimernu DNA.
DNA fragmenti pročišćeni su iz reakcijskih smjesa za PCR, obrađeni su
restrikcijskim endonukleazama NcoI i BamHI i ugrađeni u plazmid pET28, za
ekspresiju konstrukata u E. coli (bez histidinskog privjeska). Potencijalni pozitivi
detektirani su PCR-om na bakterijskim kolonijama i provjereni restrikcijskom
analizom. Sekvenciranjem su potvrđene izmjene u nukleotidnom slijedu.
3.4.6. Određivanje nukleotidnog slijeda DNA - sekvenciranje
U 13 µl otopine koja je sadržavala 300 do 500 ng plazmida u redestiliranoj
vodi ili puferu niske ionske jakosti, dodan je 1 µl početnice (3,2 µmol dm-3) za
sekvenciranje. Sekvenciranje je provedeno na četverokapilarnom sekvenatoru ABI
PRISM® 3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems) u DNA-servisu Instituta
Ruđer Bošković pod vodstvom dr. sc. Helene Četković.
3.4.7. Transformacija kvasaca metodom s litijevim acetatom
Ova metoda temelji se na tehnikama autora Schiestla i Gietza [ 91 ].
Pojedinačnom kolonijom s krute podloge inokulirano je 10 ml tekućeg medija YPD i
inkubirano preko noći na 30°C na rotacijskoj platformi. Pri OD600 ~ 1 (optička gustoća
mjerena pri λ = 600 nm) stanice su skupljene centrifugiranjem na 2000 g, 3 min te
Materijali i metode
44
isprane s 40 ml sterilne redestilirane vode i ponovo centrifugirane. Stanični talog
resuspendiran je u 0,8 ml redestilirane vode i podijeljen na alikvote od 100 µl i
smješteni na led. Na taloge je dodano, ovim redoslijedom: 240 µl PEG 4000 (0,5 g
ml-1), 36 µl litijevog acetata (1 mol dm-3), 5 µl jednolančane DNA (10 mg ml-1), te 1-
10 µg plazmida kojim transformiramo (u volumenu od ~10 µl, odnosno 10 µl tipične
preparacije). Sadržaj je dobro promiješan na vortex-miješalici te su transformacijske
smjese inkubirane na 30°C tijekom 30 min uz lagano miješanje na rotacijskoj
platformi. Transformacijske smjese su prebačene na prethodno zagrijani termo-blok
na 42°C 15 minuta, nakon čega su stanice skupljene centrifugiranjem na 3000 g, 15 s.
Supernatant je uklonjen pipetom, a stanični talozi su resuspendirani u 50-100 µl
redestilirane vode te su transformanti nasađeni na odgovarajuću krutu selektivnu
podlogu.
3.4.8. Izolacija DNA iz kvasca
Protokol služi jednostavnoj izolaciji manje količine ukupne DNA kvasca -
smjese genomske i plazmidne DNA, koja može poslužiti kao kalup u PCR-u ili za
transformaciju bakterijskih stanica plazmidnom DNA.
Talog stanica kvasca iz 7,5 ml zasićene tekuće kulture prikupljen je
centrifugiranjem (5000 g, 5 min). Talog stanica ispran je s 1 ml vode. Na talog stanica
dodano je 200 µl pufera za lizu (10 mmol dm-3 Tris titriran HCl-om do pH 8, 1 mmol
dm-3 EDTA, 100 mmol dm-3 NaCl, Triton X-100 2 %, SDS 1 %), 200 µl smjese
fenola i kloroforma, te 200 µl staklenih kuglica (promjer 0,5 mm, Sigma). Smjesa je
snažno potresana 2 min na vortex-miješalici. Suspenziji je dodano 200 µl pufera TE
(10 mmol dm-3 Tris, 1 mmol dm-3 EDTA, titrirano HCl-om do pH 8) te je vodena faza
odijeljena centrifugiranjem (15 000 g, 5 min). Vodena faza ekstrahirana je jednakim
volumenom fenol-kloroforma, a zatim su nukleinske kiseline istaložene dodatkom
natrijevog acetata (pH 5,2 podešen octenom kiselinom, konačna koncentracija 0,3 mol
dm-3) i jednakog volumena izopropanola. Talog je ispran otopinom etanola volumnog
udjela 70 %, posušen pod vakuumom i otopljen u puferu TE uz dodatak ribonukleaze
A (40 µg ml-1).
Materijali i metode
45
3.5. Metode pročišćavanja proteina
3.5.1. Izolacija i pročišćavanje kukuruzne SerRS, njezinih krnjih i
mutiranih oblika afinitetnom kromatografijom na Ni-NTA agarozi
Prilikom kloniranja i mutageneze konstruktima kukuruzne SerRS pridodan je
histidinski privjesak (His-tag). Proteini s histidinskim privjeskom se specifično vežu
za stacionarnu fazu s imobiliziranim niklovim ionima (slika 13), što omogućuje
njihovu jednostavnu izolaciju afinitetnom kromatografijom.
Slika 13: Shematski prikaz strukture Ni-NTA agaroze i vezanja histidinskog privjeska na stacionarnu fazu.
ZmcSerRS, njezine krnje i mutirane varijante, prekomjerno su eksprimirane u
kvascu soja S2088α transformiranog odgovarajućim derivatima plazmida pCJ11.
Predkulture u minimalnom mediju s glukozom inokulirane su pojedinačnom
kolonijom transformiranih kvasaca. Predkulture su uzgajane na 30 °C u
termostatiranoj tresilici do rane stacionarne faze (OD600 = 1,8 - 2,0). Predkulturama je
inokuliran minimalni medij s galaktozom, dodatkom stacionarne predkulture u omjeru
1:25 prema volumenu minimalnog medija s galaktozom. Stanice su uzgajane u
inducirajućem mediju s galaktozom na 30 °C do kasne eksponencijalne faze rasta
(OD600 ≤ 1), sakupljene su centrifugiranjem pri 5000 g, 10 min na 4 °C. Svi daljnji
postupci odvijali su se u ledenici na 4 °C ili na ledu.
Proteinski ekstrakt priređen je mehaničkim razaranjem stanica kvasca pomoću
staklenih kuglica. Na talog stanica kvasca dodan je 1 do 2 volumena pufera za
afinitetnu kromatografiju s 10 mmol dm-3 imidazola, te staklene kuglice promjera 0,5
mm (Sigma) do meniskusa suspenzije. Smjesa je žustro potresana u ledenici na 4 °C
na vortex-miješalici. Suspenzija je izdvojena pipetiranjem između staklenih kuglica,
Materijali i metode
46
koje su dodatno isprane malom količinom pufera. Suspenzija je zatim centrifugirana
15 min pri 15 000 g i 4 °C radi uklanjanja staničnih ostataka.
Sastav pufera za afinitetnu kromatografiju na Ni-NTA agarozi:
Tris 25 mmol dm-3
NaCl 500 mmol dm-3
glicerol volumnog udjela 10 %
β-merkaptoetanol 5 mmol dm-3
PMSF 1 mmol dm-3
imidazol 10 - 250 mmol dm-3
titrirano HCl-om do pH 8,0 (pri 4 °C).
Proteinski ekstrakt nanesen je na prethodno uravnoteženu kolonu Ni-NTA
agaroze. Kolona je isprana s deset volumena pufera s 40 mmol dm-3 imidazola, a
zatim su proteini vezani na kolonu eluirani puferom s 250 mmol dm-3 imidazola.
Čistoća frakcija i konačnih pripravaka proteina provjerena je pomoću SDS-PAGE.
Pročišćeni proteini odsoljeni su prema puferu sastava: 30 mmol dm-3 HEPES titriran
KOH do pH 7,0, KCl 150 mmol dm-3, 4 mmol dm-3, volumni udio glicerola 25 %.
Enzimi su ugušćeni ultrafiltracijom, te čuvani na -80 °C.
3.5.2. Izolacija i pročišćavanje kvaščeve SerRS i njezinog krnjeg oblika
SerRS∆C13
Kvaščeva SerRS i njezin krnji oblik SerRS∆C13 pročišćeni kromatografijom
na ionskim izmjenjivačima, koristeći sustav FPLC (eng. Fast Protein Liquid
Chromatography, proizvođač Pharmacia) za automatiziranu visokotlačnu tekućinsku
kromatografiju (slika 14).
Materijali i metode
47
Slika 14: Sustav FPLC. a i b - visokotlačne pumpe, c - centralna upravljačka jedinica, d - UV-detektor, e - sakupljač frakcija, f - spremnik za nanošenje uzorka (superloop), g - pisač, h - kromatografske kolone (izmjenjive; trenutno odspojene s instrumenta).
ScSerRS i ScSerRS∆C13 prekomjerno su eksprimirani u stanicama kvasca
soja S2088α transformiranim plazmidima pCJ11SES1 ili pCJ11SES1∆C13. Ekspresija
je inducirana uzgojem u minimalnom mediju s galaktozom, sličnim postupkom kao u
slučaju cjelovite ZmcSerRS i njezinih varijanti.
Proteinski ekstrakt priređen je razaranjem stanica kvasaca pomoću staklenih
kuglica (vidi prethodno poglavlje) u puferu sastava: 100 mmol dm-3 Tris-a titriranog
HCl-om do pH 7,5, 250 mmol dm-3 KCl-a, 1 mmol dm-3 EDTA, 5 mmol dm-3 β-
merkaptoetanola, 1 mmol dm-3 PMSF-a. Proteinski ekstrakt zatim je ultracentrifugiran
1 sat pri 100 000 g i 4 °C. Supernatant je propušten preko DEAE-celuloze (anionski
izmjenjivač) uravnotežene u istom puferu radi adsorpcije nukleinskih kiselina i
komponenti koje se ireverzibilno vežu na anionske izmjenjivače. Većina staničnih
proteina izlazi u nevezanoj frakciji.
Pufer za kromatografiju na koloni za anionsku izmjenu MonoQ HR 10/10:
Tris 25 mmol dm-3
KCl 20 - 300 mmol dm-3
EDTA 0,2 mmol dm-3
glicerol volumnog udjela 10 %
β-merkaptoetanol 5 mmol dm-3
titriran HCl-om do pH 7,9 pri 4 °C
Materijali i metode
48
Kolona MonoQ HR 10/10 uravnotežena je u puferu s 20 mmol dm-3 KCl-a.
Proteinski ekstrakti odsoljeni su gel-filtracijom na koloni PD-10 prema istom puferu i
aplicirani na kolonu MonoQ. Kolona je isprana s 5 volumena pufera s 20 mmol dm-3
KCl-a da se uklone nevezani proteini, a zatim je eluirana linearnim gradijentom KCl-a,
od 20 do 300 mmol dm-3 u 7,5 volumena kolone. Frakcije obogaćene sa ScSerRS ili
ScSerRS∆C13 su prikupljene i odsoljene prema puferu za kromatografiju na koloni
MonoS HR 10/10.
U kromatografiji na koloni za kationsku izmjenu MonoS HR 10/10 korišteni
su različiti puferi za ScSerRS i ScSerRS∆C13:
ScSerRS ScSerRS∆C13
HEPES 50 mmol dm-3 MES 30 mmol dm-3
KCl 20 - 300 mmol dm-3 KCl 15 - 250 mmol dm-3
glicerol 10 % volumnog udjela glicerol 10 % volumnog udjela
β-merkaptoetanol 5 mmol dm-3 β-merkaptoetanol 5 mmol dm-3
titrirano KOH do pH 7,0 pri 4 °C titrirano KOH do pH 6,0 pri 4 °C
Kao i u kromatografiji na MonoQ, nevezani proteini isprani su s puferom niske ionske
jakosti, a zatim je kolona MonoS HR 5/5 eluirana linearnim gradijentom KCl-a, (20 -
300 mmol dm-3 za ScSerRS, odnosno 15 - 250 mmol dm-3 za ScSerRS∆C13) u 12
volumena kolone.
Pročišćeni proteini odsoljeni su prema puferu sastava: 30 mmol dm-3 HEPES
titriran KOH do pH 7,0, KCl 150 mmol dm-3, 4 mmol dm-3, volumni udio glicerola 25
% i ugušćeni ultrafiltracijom, te čuvani na -80 °C.
3.5.3. Izolacija i pročišćavanje kimernih proteina Zm18Sc13 i Zm26Sc20
Konstrukti plazmida pET28 za kimerne proteine kukuruzne SerRS s
produžetkom kvaščeve SerRS (Zm18Sc13 i Zm26Sc20) i za cjelovitu ZmcSerRS nisu
posjedovali histidinski privjesak. Eksprimirani su u E. coli soja BL21(DE3) i
pročišćeni kromatografijom na koloni za ionsku izmjenu MonoQ HR 10/10, pomoću
sustava FPLC .
Predkulture bakterije E. coli BL21(DE3) transformirane pET28 konstruktima
uzgajane su preko noći u LB-mediju s kanamicinom na 37 °C uz potresanje.
Materijali i metode
49
Zasićenim predkulturama, u omjeru 1:100, inokuliran je svježi LB-medij s
kanamicinom. Kulture su uzgajane na 30 °C i u eksponencijalnoj fazi rasta (OD600 =
0,5-0,8) dodan je IPTG do konačne koncentracije 1 mmol dm-3 radi indukcije
ekspresije pET28 konstrukata. Kulture su potresane još 2,5 sata na 30 °C, a zatim su
stanice oborene centrifugiranjem u trajanju 10 min pri 4 000 g i 4 °C.
Talog bakterijskih stanica resuspendiran je u 4 volumena pufera sastava: 100
mmol dm-3 Tris-a titriranog HCl-om do pH 7,5, 250 mmol dm-3 KCl-a, 1 mmol dm-3
EDTA, 10 mmol dm-3 β-merkaptoetanola, 1 mmol dm-3 PMSF-a. Stanice su razorene
soniciranjem. Suspenzija je centrifugirana 10 minuta pri 15 000 g i 4 °C, a supernatant
je dodatno razbistren ultracentrifugiranjem u trajanju od 1 sata pri 100 000 g i 4 °C.
Proteinski ekstrakt propušten je preko DEAE-celuloze uravnotežene u istom puferu, i
odsoljen na kolonama PD-10 prema puferu za kromatografiju na MonoQ.
Sastav pufera za kromatografiju na koloni za anionsku izmjenu MonoQ HR
10/10 istovjetan je sastavu pufera za kromatografiju ScSerRS i ScSerRS∆C13 na
koloni MonoQ, navedenom u prethodnom poglavlju. Kolona je eluirana linearnim
gradijentom KCl-a, od 20 do 300 mmol dm-3.
Zahvaljujući visokoj razini ekspresije ZmcSerRS i kimernih proteina u E. coli,
čistoća proteina nakon jednog koraka pročišćavanja bila je zadovoljavajuća za
planirane biokemijske pokuse. Proteini su odsoljeni i ugušćeni ultrafiltracijom, u
puferu sastava: 30 mmol dm-3 HEPES titriran KOH do pH 7,0, KCl 150 mmol dm-3,
DTT 4 mmol dm-3, volumni udio glicerola 25 %, te su pohranjeni na -80 °C do
upotrebe.
3.6. Izolacija i pročišćavanje tRNA iz kukuruza
Postupak izolacije tRNA iz kukuruza razvijen je prema protokolima izolacije
tRNA iz E. coli [92, 93] i kvasca [94]. Postupak izolacije i pročišćavanja analiziran je
elektroforezom na agaroznom gelu masenog udjela 1,5 %, a koncentracija tRNA
određena je spektrofotometrijski, mjerenjem apsorbancije pri 260 nm.
3.6.1. Ekstrakcija nukleinskih kiselina kukuruza
Sjemenke kukuruza nabubrene su u vodi i ostavljene da klijaju na vlažnoj
podlozi 7 do 10 dana u mraku. Svježi izdanci kukuruza, prije pojave listova,
Materijali i metode
50
sakupljeni su i smrznuti na -80 °C. Izdanci u smrznutom obliku mehanički su usitnjeni
u prah. Na 100 g usitnjenog tkiva dodano je 200 ml fenola zasićenog vodom i 200 ml
otopine natrijevog acetata (0,3 mol dm-3, titriran octenom kiselinom do pH 5,2).
Suspenzija je snažno miješana 1 sat na magnetskoj miješalici. Ostaci tkiva, vodena i
organska faza razdvojeni su centrifugiranjem 10 min pri 4000 g. Vodena faza
prebačena je u čistu posudu, a organskoj fazi s ostacima tkiva dodano je novih 100 ml
otopine natrijevog acetata, te je smjesa promućkana i ponovno centrifugirana. Vodena
faza je spojena s prethodnom i ekstrahirana jednakim volumenom fenola zasićenog
vodom, a zatim s pola volumena kloroforma.
Nukleinske kiseline istaložene su dodatkom 2,5 volumena 96 %-tnog etanola
ohlađenog na -20 °C, smjesa je ostavljena 2-3 sata na -20 °C. Talog nukleinskih
kiselina je prikupljen centrifugiranjem (30 min, 8000 g, 4 °C), ispran s etanolom
volumnog udjela 80 % ohlađenog na -20 °C i osušen pod vakuumom.
3.6.2. Izdvajanje tRNA iz taloga nukleinskih kiselina i deacilacija tRNA
Talogu nukleinskih kiselina iz 100 g tkiva dodano je 100 ml otopine NaCl-a (1
mol dm-3). Smjesa je snažno miješana na magnetskoj miješalici pri 4 °C. Talog je
prikupljen centrifugiranjem i ekstrakcija taloga ponovljena je s 50 ml otopine NaCl-a.
Supernatantu iz prethodna dva koraka dodana je trećina volumena Tris-a (1 mol dm-3),
titriranog octenom kiselinom do pH 8,8 i otopina je inkubirana 1 sat pri 37 °C.
Otopina je neutralizirana dodatkom 1,5 ml koncentrirane octene kiseline na svakih
100 ml otopine.
Ekstrahirana tRNA istaložena je iz otopine dodatkom 2,5 volumena etanola
(96 %, ohlađen na -20 °C), nakon 2-3 sata stajanja na -20 °C. Talog sirove tRNA
prikupljen je centrifugiranjem, ispran hladnom otopinom etanola (vol. udio 80 %),
osušen pod vakuumom i otopljen u minimalnoj količini redestilirane vode.
3.6.3. Kromatografija tRNA na DEAE-celulozi
Budući da je sirova preparacija tRNA bila loš supstrat u aminoaciliranju,
ukupna tRNA kukuruza dodatno je pročišćena kromatografijom na DEAE-celulozi
[95].
Materijali i metode
51
Pufer za kromatografiju na DEAE-celulozi: natrijev acetat 10 mmol dm-3,
magnezijev klorid 10 mmol dm-3, natrijev klorid 0,2 ili 1 mol dm-3.
Uzorak djelomično pročišćene tRNA otopljene u sterilnoj redestiliranoj vodi
ekstrahiran je dva puta sa smjesom fenola i kloroforma. Uzorak je nanesen na kolonu
s DEAE-celulozom prethodno uravnoteženoj u puferu s 0,2 mol dm-3 NaCl-a. Kolona
je isprana s 8 do 10 volumena istog pufera, a tRNA je eluirana puferom s 1 mol dm-3
NaCl-a. Prikupljene su frakcije koje su pokazivale visoku apsorbanciju pri 260 nm, i
tRNA je istaložena dodatkom 1,5 volumena izopropanola pri sobnoj temperaturi.
Talog je ispran hladnom otopinom etanola (vol. udio 80 %), posušen, i otopljen u
minimalnoj količini redestilirane vode. Uzorak je dijaliziran preko noći prema puferu
sastava: Tris 5 mmol dm-3 titriran HCl-om do pH 7,5, MgCl2 1 mmol dm-3.
3.7. Određivanje aminoacilacijske aktivnosti enzima
3.7.1. Standardna reakcija aminoaciliranja
Mjerenje aminoacilacijske aktivnosti SerRS temelji se na praćenju nastajanja
radioaktivne Ser-tRNASer u prisutnosti radioaktivnog [14C]-serina [96]:
[14C]-Ser + ATP + tRNASer → [14C]-Ser-tRNASer + AMP + PPi
Reakcija se zaustavlja nanošenjem alikvota reakcijske smjese u pravilnim
vremenskim razmacima na komadiće filter-papira (Whatman 3MM) koji se odmah
uranjaju u hladnu otopinu trikloroctene kiseline (TCA; 100 g dm-3). Pri tome dolazi
do taloženja proteina i nukleinskih kiselina. Suvišni radioaktivitet (neizreagirani
[14C]-Ser) uklanja se ispiranjem: 10 min u hladnoj otopini TCA koncentracije 100 g
dm-3, 2 puta po 5 min u hladnoj otopini TCA koncentracije 50 g dm-3, i 3 min u
hladnom etanolu. Komadići filter-papira osuše se u sušioniku na 75 °C, urone se u
scintilacijsku otopinu (5 g dm-3 PPO i 0,3 g dm-3 POPOP u toluenu) i količina
radioaktiviteta (proporcionalna količini [14C]-Ser-tRNASer) izmjeri se u
scintilacijskom brojaču. Količina nastale Ser-tRNASer određuje se usporedbom
izmjerene aktivnosti s aktivnošću poznate količine radioaktiviteta izmjerene u
scintilacijskom brojaču.
Tipična reakcijska smjesa korištena za rutinsko praćenje katalitičke aktivnosti
sadržavala je: Tris 50 mmol dm-3, titriran HCl-om do pH 7,5 (ScSerRS i
Materijali i metode
52
ScSerRS∆C13) ili pH 7,9 (ZmcSerRS i njezine varijante), BSA 0,4 mg ml-1, DTT 4
mmol dm-3, MgCl2 15 mmol dm-3, ATP 5 mmol dm-3, ukupna kvaščeva tRNA 6 mg
ml-1, [U-14C]-Ser 20-125 µmol dm-3 (40 Ci mol-1). Reakcija se odvijala pri 30 °C. U
mjerenju katalitičke aktivnosti ZmcSerRS i njezinih varijanti korištena je
komercijalno dostupna ukupna tRNA kvasca, ako nije drukčije naglašeno. Reakcija je
započeta dodatkom enzima ili jednog od supstrata u reakcijsku smjesu, ovisno o
praktičnosti izvedbe u svakom pojedinom slučaju.
3.7.2. Određivanje udjela tRNASer u ukupnoj tRNA
Zahvaljujući visokoj selektivnosti aaRS prema pripadnoj tRNA, koncentracija
i udio izoakceptora tRNASer u ukupnoj tRNA kvasca ili kukuruza određen je
aminoaciliranjem pomoću ScSerRS i ZmcSerRS. U reakcijsku smjesu dodana je
povećana koncentracija enzima, a udio tRNASer izračunat je nakon što se količina
produkta u vremenu ustalila (tj. nakon što je reakcija dosegnula "plato").
Komercijalna ukupna tRNA kvasca sadržavala je 3,2 % specija sposobnih
primiti serin u reakciji aminoaciliranja, ukupna tRNA iz E. coli 3,8 %, a ukupna
tRNA kukuruza sadržavala je 8,9 % tRNASer.
3.7.3. Određivanje kinetičkih parametara za tRNA i serin
Kinetički parametri za serin određeni su uz dodatak 4,3 mg ml-1 ukupne
kvaščeve tRNA, što odgovara koncentraciji tRNASer od 5 µmol dm-3, a koncentracija
serina je varirana.
Kinetički parametri za tRNA određeni su uz konstantnu koncentraciju serina
(100 µmol dm-3) i različite koncentracije homologne ukupne tRNA - ukupne tRNA
kvasca za ScSerRS i ScSerRS∆C13, odnosno ukupne tRNA kukuruza za ZmcSerRS,
ZmcSerRS∆C12 i ZmcSerRS∆C18.
Pri određivanju kinetičkih parametara za pojedini supstrat (Ser ili tRNASer)
koncentracija za taj supstrat varirana je u rasponu od 0,2 do 5 KM. Koncentracija
enzima odabrana je tako da bi porast količine produkta u vremenu bio linearan, a
kretala se od rasponu od 2 do 8 nmol dm-3. Kinetički parametri određeni su
nelinearnom regresijom, prema modelu Michaelis-Menten ovisnosti početne brzine
Materijali i metode
53
enzimski katalizirane reakcije (v0) o koncentraciji supstrata. Sva određivanja
kinetičkih parametara ponovljena su barem tri puta.
3.7.4. Termička inaktivacija enzima
Uzorci su inkubirani istodobno pri različitim temperaturama (18-52 °C), u
uređaju za gradijent-PCR Mastercycler gradient (Eppendorf). Inkubacija je trajala 40
minuta. Uzorci su sadržavali 120 nmol dm-3 enzima u puferu sastava: 50 mmol dm-3
Tris titriran HCl-om do pH 7,5 (ScSerRS i ScSerRS∆C13) ili pH 7,9 (ZmcSerRS i
njezine varijante), 0,4 mg ml-1 BSA i 4 mmol dm-3 DTT. Nakon inkubacije pri
različitim temperaturama uzorci su ohlađeni na 4 °C, a preostala enzimska aktivnost
mjerena je pri 30 °C standardnim aminoacilacijskim testom. Pretpostavljen je
jednostavan model ireverzibilne denaturacije enzima i empirijska sigmoidalna
ovisnost preostale aktivnosti o temperaturi inkubacije [97]. Nelinearnom regresijom
određene su sigmoidalne krivulje koje najmanje odstupaju od eksperimentalnih
podataka i izračunata je temperatura koja odgovara gubitku 50 % katalitičke
aktivnosti (t50) pri danim uvjetima. Termička inaktivacija ponovljena je najmanje tri
puta za svaki uzorak.
3.8. Komplementacija soja kvasca s inaktiviranim genom za SerRS
3.8.1. Konstrukcija plazmida korištenih u pokusima komplementacije
Komplementacija soja kvasca BR2727∆SES1 s inaktiviranim genom za SerRS
(SES1) provedena je metodom izmjene plazmida (eng. plasmid shuffling) [98]. Za
potrebe komplementacije konstruiran je derivat niskokopijskog centromernog vektora
pUN100 s promotorom i terminatorom gena SES1, u koji su zatim klonirani fragmenti
DNA koji kodiraju razne varijante kvaščeve i kukuruzne SerRS (slika 15).
Fragment kvaščeve genomske DNA (3 kb) koji sadrži SES1 (gen za ScSerRS;
1,4 kb) i odgovarajuće promotorske i terminatorske elemente izrezan je iz plazmida
pVTserS [24] pomoću PvuII i EcoRV koji ostavljaju tupe krajeve. Fragment je
ugrađen u prethodno defosforiliran vektor pUN100 cijepan enzimom PvuII, dajući
plazmid nazvan pUN100ScSerRS. Fragment izrezan iz pVTserS sadržavao je
restrikcijska mjesta za BamHI na 5' i 3' kraju otvorenog okvira čitanja za ScSerRS
Materijali i metode
54
koja su uvedena ciljanom mutagenezom. Cijepanjem plazmida pUN100ScSerRS
pomoću BamHI uklonjen je otvoreni okvir čitanja za ScSerRS, a cirkularizacijom
vektora s T4 DNA-ligazom dobiven je pUN100∆ScSerRS, plazmid koji sadrži
restrikcijsko mjesto za BamHI između promotora i terminatora gena SES1. U mjesto
BamHI vektora pUN100∆ScSerRS pod kontrolu promotora gena SES1 preklonirani su
inserti iz pCJ11 koji kodiraju ScSerRS∆C13, ScSerRS∆C20, ZmcSerRS,
ZmcSerRS∆C12, ZmcSerRS∆C18 i ZmcSerRS∆C26 (slika 15). Restrikcijskom
analizom praćena je ugradnja željenih inserata u plazmide i potvrđena pravilna
orijentacija otvorenih okvira čitanja prema promotoru SES1.
pVTSerS9,9 kb
BamHIBamHI SES1
pUN1006,2 kb
EcoRVPvuII
MCS
PvuIIPvuII
leu2 Ampr
3. PvuII, EcoRV
1. PvuII2. SAP
4. T4 DNA-lig
leu2 Ampr
pUN100ScSerRS
8,8 kb
BamHIBamHI SES1
PvuII(PvuII)
(EcoRV)5. BamHI6. T4 DNA-lig
pUN100∆ScSerRS
7,4 kbleu2 Ampr
BamHI
PvuII
leu2 Ampr
pUN100xxx
8,8 kb
BamHIBamHI xxx
PvuII
pCJ11xxx8,6 kb
BamHI BamHIxxx
7. BamHI8. SAP10. T4 DNA lig.
9. BamHI
pVTSerS9,9 kb
BamHIBamHI SES1
pUN1006,2 kb
EcoRVPvuII
MCS
PvuIIPvuII
leu2 Ampr
3. PvuII, EcoRV
1. PvuII2. SAP
4. T4 DNA-lig
leu2 Ampr
pUN100ScSerRS
8,8 kb
BamHIBamHI SES1
PvuII(PvuII)
(EcoRV)5. BamHI6. T4 DNA-lig
pUN100∆ScSerRS
7,4 kbleu2 Ampr
BamHI
PvuII
leu2 Ampr
pUN100xxx
8,8 kb
BamHIBamHI xxx
PvuII
pCJ11xxx8,6 kb
BamHI BamHIxxx
7. BamHI8. SAP10. T4 DNA lig.
9. BamHI
Slika 15: Shematski prikaz konstrukcije plazmida za komplementaciju kvasca soja BR2727∆SES1. Svjetlom nijansom plave boje označeni su fragmenti genomske DNA kvasca s promotorskim i terminatorskim elementima gena SES1. U zagradama su naznačena restrikcijska mjesta uništena tijekom kloniranja. Oznake: SAP - defosforilacija alkalnom fosfatazom iz škampa, T4 DNA-lig - ligacija DNA pomoću T4 DNA-ligaze. Žutom bojom i oznakom xxx označeni su inserti koji kodiraju razne varijante ScSerRS i ZmcSerRS. Pojedini elementi plazmida nisu prikazani u stvarnom omjeru veličina.
Fragmenti DNA koji kodiraju ScSerRS i ZmcSerRS te njezine krnje oblike
preklonirani su iz pCJ11 i u vektor pVT103-L visokog broja kopija u stanici, pod
kontrolu promotora ADH1.
3.8.2. Komplementacija S. cerevisiae BR2727∆SES1 metodom izmjene
plazmida
Soj kvasca BR2727∆SES1/pUN70SES1 transformiran je derivatima plazmida
pUN100 ili pVT103-L koji su kodirali različite oblike ScSerRS i ZmcSerRS, uz
odgovarajuće kontrolne plazmide (pUN100SES1, pUN100∆SES1, pVT103-L i
Materijali i metode
55
pVT103-LSES1). Transformanti su selektirani na krutoj podlozi s minimalnim
medijem YNB Leu- Lys- Ura-*. Transformanti su uzgajani u tekućem minimalnom
mediju YNB Leu- Lys- (uz dodatak uracila), da bi se omogućio spontan gubitak
"spasiteljskog" plazmida pUN70SES1 s biljegom URA3 koji kodira ScSerRS
neophodan za vijabilnost soja BR2727∆SES1. Kulture u tekućem mediju YNB Leu-
Lys- razrijeđene su još dva puta u omjeru 1:100 sa svježim medijem, kako bi se
produljio rast pri neselektivnim uvjetima za pUN70SES1. Protuselekcija stanica s
pUN70SES1 napravljena razrjeđivanjem u mediju YNB Leu- Lys- uz dodatak 5-
fluoroorotata (5-FOA, 1 g dm-3), koji je toksičan za stanice s funkcionalnim biljegom
URA3 [99]. Na krutoj podlozi YNB Leu- Lys- s 5-FOA izolirane su pojedinačne
kolonije nakon komplementacije, te je nekoliko desetaka klonova za svaki konstrukt
prenijeto na krutu podlogu s medijem YPAD.
3.8.3. Provjera uspješnosti komplementacije
Kvaščevim kolonijama dobivenim nakon protuselekcije s 5-FOA najprije su
provjereni biljezi (prototrofija za Leu i Lys, auksotrofija za Ura i otpornost na 5-FOA)
uzgojem na odgovarajućim krutim podlogama s minimalnim medijem.
Budući da kvasci mogu izbjeći protuselekciju s 5-FOA i drugim mehanizmima
osim gubitkom plazmida pUN70SES1, PCR-om na izoliranoj DNA kvasca provjerena
je eliminacija gena SES1 za cjelovitu SerRS. Kombinacijom klica za 3' i 5'-kraj SES1
kod pravih pozitiva dobiven je fragment DNA duljine 5,4 kb, koji odgovara
genomskoj kopiji gena SES1 (1,4 kb) inaktiviranoj insercijom biljega LYS2 (4,5 kb).
Kod lažnih pozitiva u PCR-u je dobiven fragment od 1,4 kb, koji je nastao
umnožavanjem cjelovitog SES1 gena, bez obzira da li je ostao očuvan na plazmidu ili
se (nasumično) integrirao u genomsku DNA. PCR je napravljen sa smjesom Taq i Pfu
DNA-polimeraza (omjer 10:1), prema uvjetima opisanim u poglavlju 3.4.1, osim što
je korak produljenja lanaca pri 72 °C trajao 8 minuta.
* Leu-, Lys-, Ura- i sl. označava sastojak izostavljenu iz minimalnog medija, odnosno selekciju na
temelju prototrofije za dotičnu komponentu.
Materijali i metode
56
U komplementaciji s kvaščevim konstruktima, prisutnost cjelovitih ili krnjih
oblika ScSerRS u pojedinim koracima komplementacije provjeravana je Western-
analizom s poliklonskim antitijelima na kvaščevu SerRS.
3.9. Metode detekcije proteinskih interakcija
3.9.1. Vezanje SerRS na Ni-NTA agarozu s imobiliziranim Pex21p
E. coli soj BL21(DE3) transformiran plazmidom pET15bPEX21 uzgajan je u
tekućoj kulturi u LB-mediju uz dodatak ampicilina i induciran je dodatkom IPTG-a do
konačne koncentracije 1 mmol dm-3 pri 30 °C. Nakon dodatka IPTG-a, kultura je
potresana daljnja 3 sata na 30 °C, a zatim su stanice prikupljene centrifugiranjem.
Proteinski ekstrakt priređen je sonikacijom, u puferu sastava: Tris 25 mmol dm-3,
NaCl 500 mmol dm-3, glicerol volumnog udjela 10 %, imidazol 10 mmol dm-3, β-
merkaptoetanol 5 mmol dm-3, PMSF 1 mmol dm-3, pH podešen na 8 dodatkom HCl-a.
Proteinski ekstrakt koji je sadržavao eksprimirani Pex21p s histidinskim
privjeskom na N-kraju propušten je kroz kolonu Ni-NTA agaroze, prethodno
ekvilibriranoj u puferu za lizu. Nevezani i nespecifično vezani proteini isprani su istim
puferom koji je sadržavao 40 mmol dm-3 imidazola, a zatim je kolona ekvilibrirana u
puferu sastava: imidazol 40 mmol dm-3, MgCl2 5 mmol dm-3, β-merkaptoetanol 5
mmol dm-3, titriran HCl-om do pH 7,5. Smola s vezanim Pex21p resuspendirana je u
dva volumena pufera i razdijeljena u alikvote po 45 µl suspenzije, ekvivalentnima 15
µl slegnute smole. U alikvote resuspendirane smole dodano je po 30 µg ScSerRS,
ZmcSerRS ili njihovih kimernih varijanti (bez histidinskog privjeska) i smjesa je
inkubirana 10 minuta pri sobnoj temperaturi uz povremeno potresanje.
Smola je isprana 3 x 180 µl pufera u kojem se odvijalo vezanje SerRS
(imidazol 40 mmol dm-3, MgCl2 5 mmol dm-3, β-merkaptoetanol 5 mmol dm-3, titriran
HCl-om do pH 7,5), a zatim su vezani proteini eluirani otopinom imidazola (300
mmol dm-3, pH podešen HCl-om na 7,5) s volumnim udjelom glicerola 15 %. Eluat je
analiziran pomoću SDS-PAGE.
Nespecifično vezanje SerRS za Ni-NTA agarozu i prisutne nečistoće
provjereno je na kromatografskom mediju koji je bio zasićen proteinskim ekstraktom
soja BL21(DE3) u kojem nisu eksprimirani rekombinantni proteini.
Materijali i metode
57
3.9.2. Sustav dvaju hibrida
Fragmenti DNA koji kodiraju kimerne proteine Zm18Sc13 i Zm26Sc20
preklonirani su iz vektora pET28 (poglavlje 3.4.5) cijepanjem pomoću NcoI i BamHI
u plazmid pAB151 koji kodira "mamac" u sustavu dvaju hibrida. Ostale korištene
vektore (pACTpex21, pAB151SES1 [7], pAB151ScSerRS∆C13 i pAB151ZmcSerRS
[8]) ljubazno je ustupila Vlatka Godinić-Mikulčić. Soj L40 simultano je transformiran
s pACTpex21 i derivatima vektora pAB151, transformanti su selektirani na
minimalnoj podlozi YNB Leu- Trp-. Western-analizom s antitijelima na LexA
potvrđena je ekspresija fuzijskih proteina "mamaca".
U soju L40 praćena je aktivacija dvaju gena-pokazatelja: HIS3 čija aktivacija
omogućuje soju L40 rast na minimalnoj podlozi bez dodatka histidina (YNB Leu- Trp-
His-), i lacZ koji kodira β-galaktozidazu čiju je katalitičku aktivnost jednostavno
detektirati kromogenim supstratima kao što su 5-brom-4-klor-3-hidroksiindolil-β-
galaktopiranozid (X-gal) ili o-nitrofenil-β-galaktopiranozid (ONPG). Provjera
aktivacije oba gena pokazatelja napravljena je u duplikatu, s dva neovisna klona
dobivena transformacijom L40.
Provjera histidinske prototrofije (His+) - aktivacije gena HIS3
Aktivacija gena HIS3 omogućuje soju rast na podlozi bez histidina, tj.
prototrofiju za histidin. Kolonije soja L40 transformirane plazmidom pACTpex21 i
konstruktima plazmida pAB151 razmazane su s krutog minimalnog medija YNB Leu-
Trp- na podlogu s minimalnim medijem YNB Leu- Trp- His- s 5 mmol dm-3 3-AT (3-
amino-1,2,4-triazola). Podloge su inkubirane nekoliko dana na 30 °C. 3-AT je
kompetitivni inhibitor produkta gena HIS3 koji potiskuje slabi rast soja L40 uslijed
"curenja" promotora gena HIS3.
Filter-test aktivnosti β-galaktozidaze
Z-pufer (pufer za provjeru aktivnosti β-galaktozidaze):
natrijev hidrogenfosfat 60 mmol dm-3
natrijev dihidrogenfosfat 40 mmol dm-3
KCl 10 mmol dm-3
magnezijev sulfat 1 mmol dm-3
Materijali i metode
58
Na podlogu s minimalnim medijem YNB Leu- Trp- razmazane su kolonije
kvasca koje se žele provjeriti na aktivnost β-galaktozidaze. Nakon nekoliko dana
inkubacije na 30 °C, nakon što na podlozi naraste debeli sloj stanica, na ploču se
prisloni filter-papir i jednolično pritisne na podlogu, tako da se sloj stanica kvasca
zalijepi i prenese s podloge na filter-papir. Filter-papir se uroni u tekući dušik, s licem
(prenešenim stanicama) okrenutim prema gore. Naglim smrzavanjem u tekućem
dušiku permeabiliziraju se stanice kvasca. U Z-puferu otopi se uz zagrijavanje
agaroza do masenog udjela 0,7 %, a nakon što se otopina dovoljno ohladi doda se
otopina X-gal (20 mg ml-1 u N,N-dimetilformamidu) do konačne koncentracije 0,334
mg ml-1 i β-merkaptoetanol (konačna koncentracija 40 mmol dm-3). Nakon što se
filter-papir sa stanicama kvasca odmrzne, prelije se tankim slojem agaroze i X-gal
otopljene u Z-puferu. Smjesa hlađenjem očvrsne, a ploča s filter-papirom inkubira se
30 min do nekoliko sati na sobnoj temperaturi ili 30 °C, do pojave plave boje željenog
intenziteta, nastale oksidacijom produkata hidrolitičke razgradnje X-gal β-
galaktozidazom.
59
4. REZULTATI
4.1. Konstrukcija krnjih i mutiranih oblika kvaščeve i kukuruzne seril-tRNA-sintetaze
4.1.1. Preliminarni rezultati i potraga za prikladnim ekspresijskim
sustavom
Velika prepreka u proučavanju uloge produžetka kvaščeve SerRS bila je
nestabilnost i niska razina ekspresije krnjeg proteina ScSerRS∆C20 [5, 6], što znatno
otežava preparaciju i pročišćavanje takvog enzima. Postupak se temeljio na ekspresiji
krnjeg proteina u kvascu i pročišćavanju konvencionalnim kromatografskim
tehnikama u nekoliko koraka. Purifikaciju je komplicirala činjenica da krnji
rekombinantni protein treba odvojiti od endogene cjelovite SerRS. Prinos je bio nizak
i nedovoljan za istraživanja različitim biofizičkim metodama.
Problemu sam pokušao doskočiti ekspresijom rekombinantnog krnjeg proteina
ScSerRS∆C20 u stanicama E. coli, koje su već prije korištene za efikasnu
prekomjernu ekspresiju rekombinantne cjelovite ScSerRS. Razina ekspresije
ScSerRS∆C20 u E. coli bila je visoka, ali protein je u potpunosti taložio u
inkluzijskim tijelima. Brojni pokušaji optimizacije uzgoja i ekspresije
rekombinantnog ScSerRS∆C20 nisu dali rezultata. Nadalje, zanemariva frakcija
ScSerRS∆C20 koji je bio topiv i prisutan u staničnom ekstraktu E. coli bio je potpuno
katalitički neaktivan i vjerojatno je predstavljao topivu frakciju nestrukturiranog
oblika istovjetnog obliku istaloženom u inkluzijskim tijelima. Zaključeno je da je
ScSerRS∆C20 inherentno nestabilan, i dok se stanice kvasca "bore" protiv takvog
proteina degradacijom [6], u E. coli protein iz istog razloga završava u inkluzijskim
tijelima. Pokušaji učinkovitije ekspresije ScSerRS∆C20 u stanicama kvasca, raznim
kombinacijama ekspresijskih vektora i afinitetnih privjesaka također su rezultirali
neuspjehom. Cjelovita ScSerRS s histidinskim privjeskom (skraćeno: His-tag) na N-
kraju eksprimirana u E. coli ili kvascu ima nižu katalitičku aktivnost u usporedbi s
konstruktima bez dodataka na N-kraju, pa je zaključeno da je kvasac optimalan
ekspresijski sustav za kvaščev enzim te da dodavanje afinitetnih privjesaka
kompromitira njegova katalitička svojstva.
Rezultati
60
Pokušaji dobivanja krnje SerRS kukuruza bez eukariotske ekstenzije
(ZmcSerRS∆C26) dali su slične rezultate - dok se cjelovita ZmcSerRS učinkovito
eksprimirala u različitim ekspresijskim sustavima, njezin krnji oblik ZmcSerRS∆C26
nije bilo moguće dobiti. ZmcSerRS∆C26 u kvascu nije se eksprimirao, a u E. coli
dolazilo je do potpune agregacije u inkluzijska tijela. Prema tome, nestabilnost
ScSerRS∆C20 nije bila osobitost kvaščevog enzima, već općenito svojstvo
eukariotskih SerRS. Stoga je promijenjena strategija u istraživanju ekstenzija
eukariotskih SerRS: umjesto potpune delecije produžetka, odlučio sam napraviti niz
djelomičnih delecija i mutacija u području C-terminalne regije, u nadi da će biti
moguće razlučiti regije presudne za stabilnost enzima od funkcionalno relevantnih
regija. Izbor za početnu konstrukciju mutanata i deletanata pao je na ZmcSerRS s His-
tagom proizvedenom u kvascu (slika 16), jer se pokazalo da ZmcSerRS za razliku od
ScSerRS tolerira dodatak His-taga u kvascu, a u kasnijim fazama istraživanja
korištena je i E. coli kao ekspresijski sustav za varijante ZmcSerRS bez His-taga,
budući da je razina ekspresije viša nego u kvascu (slika 18; A i C).
Slika 16: Analiza stabilnosti različitih konstrukata ZmcSerRS eksprimiranih u kvascu ili E. coli. Uzorci su ostavljeni na 0 °C od 0 do 36 sati, a zatim im je izmjerena rezidualna katalitička aktivnost na 30 °C. "His6-" označava prisutnost histidinskog privjeska (His-taga) na N-kraju ZmcSerRS; "ekstrakt" označava da je mjerena aktivnost enzima u proteinskom ekstraktu E. coli. Pročišćeni ZmcSerRS s His-tagom na N-kraju proizveden u kvascu i ZmcSerRS iz E. coli bez His-taga pokazuju zanemariv pad aktivnosti stajanjem na 0 °C, dok ZmcSerRS s His-tagom dobiven u E. coli gotovo potpuno gubi aktivnost unutar 24 h, bez obzira da li se aktivnost mjeri u proteinskom ekstraktu E. coli ili pročišćenom enzimu. Pomoću SDS-PAGE potvrđeno je da tijekom inkubacije ne dolazi do proteolitičke degradacije enzima u proteinskom ekstraktu ili pročišćenih enzima (nije prikazano).
Rezultati
61
4.1.2. Mutanti i deletanti seril-tRNA-sintetaza iz kvasca i kukuruza
korišteni u ovom radu
Skraćenica ScSerRS označava SerRS iz citosola kvasca Saccharomyces
cerevisiae, a skraćenica ZmcSerRS odnosi se na citosolnu SerRS iz kukuruza (Zea
mays).
Produžeci na C-kraju kvaščeve i kukuruzne SerRS ne pokazuju homologiju na
razini aminokiselinskog slijeda (slika 4 i 17), ali ipak imaju sličnu organizaciju i
aminokiselinski sastav. Bazične aminokiseline smještene su pretežito na samom kraju
produžetka, dok središnjim dijelom produžetaka dominiraju hidrofilne, ali neutralne
aminokiseline (slika 17). Na početku produžetaka, tj. u regiji koja je spojena na
katalitičku domenu (proksimalna regija) uočljiva je zastupljenost prolina i nepolarnih
aminokiselina.
A proksimalna bazična regija regija IEFLPFKQPLDAKQAADSKSNKSKSKGNAA ZmcSerRS hidrofilno područje
IEFLPFKQPLDAKQAADSNQTSANQQGNAA ZmcSerRSmut1 IEFLPFKQPLNAQSAANAKSNKSKSKGNAA ZmcSerRSmut2 IEFLACQATFGAKQAADSKSNKSKSKGNAA ZmcSerRSmut3
IEFLPFKQPLDAKQAADS ZmcSerRS∆C12IEFLPFKQPLDA ZmcSerRS∆C18IEFL ZmcSerRS∆C26 B proksimalna bazična regija regija PEFLPFVNELPKNSTSSKDKKKKN ScSerRS hidrofilno područje PEFLPFVNELP ScSerRS∆C13 PEFL ScSerRS∆C20 C IEFLPFKQPLDAKQAADSKSNKSKSKGNAA ZmcSerRS IEFLPFKQPLDAKNSTSSKDKKKKN Zm18Sc13 IEFLPFVNELP KNSTSSKDKKKKN Zm26Sc20
Slika 17: Krnji i mutirani oblici kvaščeve (ScSerRS) i kukuruzne (ZmcSerRS) seril-tRNA-sintetaze. Sivim slovima označene su aminokiseline koje pripadaju katalitičkoj domeni SerRS, obična (crna) slova odgovaraju produžecima svojstvenim eukariotskim SerRS. (A) SerRS kukuruza i njezine varijante. Istaknute su aminokiseline mutirane u pojedinom konstruktu. (B) Kvaščeva SerRS i njezini krnji oblici. (C) Kimerni proteini kukuruzne SerRS s kvaščevim produžetkom. Aminokiselinski sljedovi koji potječu iz kvaščevog enzima istaknuti su sivom podlogom.
Budući da dodatak histidinskog privjeska na N-kraju kvaščevoj SerRS
onemogućuje ekspresiju funkcionalnog proteina i u E. coli i u kvascu, ZmcSerRS je
Rezultati
62
odabrana za konstrukciju početne serije mutanata i deletanata koji su eksprimirani s
His-tagom u kvascu. His-tag je omogućio paralelno pročišćavanje niza konstrukata,
što konvencionalnim kromatografskim tehnikama na sustavu FPLC ne bi bilo
izvedivo. Za razliku od ZmcSerRS∆C26 čiju ekspresiju nije moguće detektirati u
kvascu, krnje ZmcSerRS∆C12 i ZmcSerRS∆C18 učinkovito su se eksprimirale i u
potpunosti su zadržale aminoacilacijsku aktivnost. Kod ZmcSerRS∆C18 uklonjen je
gotovo cijeli produžetak, njegov hidrofilni i bazični dio, osim proksimalnog dijela koji
se nastavlja na katalitičku domenu. Priređeni su i mutanti ZmcSerRSmut1,
ZmcSerRSmut2 i ZmcSerRSmut3 (slika 17A). Mutacije su bile slučajne, uvedene
pomicanjem okvira čitanja unutar regije od interesa, ali pazeći da se zadrži hidrofilan
ili hidrofoban karakter regije. Pročišćeni ZmcSerRSmut1 i ZmcSerRSmut2 bili su
potpuno aktivni, dok se ZmcSerRSmut3 s mutiranom proksimalnom regijom ponašao
slično kao ZmcSerRS∆C26 i nije se dao eksprimirati. Vjerojatno je u oba slučaja
delecija ili mutacija proksimalne regije (vidi sliku 17) zaslužna za destabilizaciju i
brzu degradaciju proteina, što onemogućuje njihovu izolaciju. Uzrok slabe ekspresije
ScSerRS∆C20 je također brza degradacija in vivo [6].
Ta je pretpostavka provjerena dizajnom stabilnog krnjeg oblika kvaščeve
SerRS, ScSerRS∆C13 (slika 17B). ScSerRS∆C13 analogan je ZmcSerRS∆C18. Za
razliku od nestabilnog i problematičnog ScSerRS∆C20, ScSerRS∆C13 nije se
razlikovao od ScSerRS po pitanju razine ekspresije, stabilnosti i katalitičke aktivnosti,
što je potvrdilo pretpostavku da je uklanjanje proksimalne regije uzrok nestabilnosti
krnjih ScSerRS∆C20 i ZmcSerRS∆C26. U oba sustava, zadiranje u proksimalnu
regiju rezultiralo je "sve-ili-ništa" efektom.
Nadalje, dizajnirana su još i dva kimerna proteina (slika 17C): kod Zm26Sc20
cijeli produžetak SerRS kukuruza zamijenjen je produžetkom kvaščeve SerRS, dok je
u kimeri Zm18Sc13 zadnjih 18 polarnih i nabijenih aminokiselina kukuruzne SerRS
zamijenjeno s 13 aminokiselina kvaščeve SerRS istih svojstava, bez zadiranja u
područje proksimalne regije. Oba kimerna proteina bila su katalitički aktivna.
Budući da je za potrebe disertacije uspješno proizvedeno i pročišćeno 11
konstrukata, različitim strategijama i ekspresijskim sustavima, rezultati njihove
ekspresije i pročišćavanja nisu detaljno izloženi, već su na slici 18 prikazani tipični
Rezultati
63
rezultati ekspresije i čistoće za neke od njih. Svi korišteni proteini bili su
zadovoljavajuće čistoće (> 90 % prema SDS-PAGE) i priređeni u dovoljnoj količini
(nekoliko mg ili više) za planirane biokemijske pokuse.
A B C
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
A B C
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Slika 18: Primjeri ekspresije i pročišćavanja različitih konstrukata ScSerRS i ZmcSerRS. (A) Proteinski ekstrakti kvasca s eksprimiranim ZmcSerRS (1), ZmcSerRS∆C12 (2) i ZmcSerRS∆C18 (3). Pročišćeni ZmcSerRS (4), ZmcSerRS∆C12 (5) i ZmcSerRS∆C18 (6) izolirani afinitetnom kromatografijom na Ni-NTA agarozi iz proteinskog ekstrakta kvasca. Analogno za ZmcSerRSmut1 i ZmcSerRSmut2 (nije prikazano). (B) Proteinski ekstrakt kvasca (7) te proteinski ekstrakti kvasca s eksprimiranim ScSerRS (8) i ScSerRS∆C13 (9); ScSerRS (10) i ScSerRS∆C13 (11) pročišćeni u dva koraka kromatografijom na ionskim izmjenjivačima pomoću sustava FPLC. (C) Ekspresija Zm18Sc13 (12) i Zm26Sc20 (13) u E. coli, analogno za ZmcSerRS (nije prikazano); ZmcSerRS (14), Zm18Sc13 (15) i Zm26Sc20 (16) pročišćeni kromatografijom na ionskom izmjenjivaču pomoću sustava FPLC. Razina ekspresije konstrukata ZmcSerRS (1-3) u kvascu je znatno niža od razine ekspresije u E. coli (12, 13) ili razine ekspresije ScSerRS i ScSerRS∆C13 (7-9) u kvascu, ali još uvijek je dovoljno visoka za učinkovitu izolaciju afinitetnom kromatografijom u jednom koraku na Ni-NTA agarozi.
4.1.3. Proksimalna regija produžetka na C-kraju presudna je za
stabilnost eukariotskih SerRS
Da bi se pažljivije istražio utjecaj produžetaka na stabilnost enzima, krnji i
kimerni oblici kvaščeve i kukuruzne SerRS podvrgnuti su termalnoj inaktivaciji (slika
19). Nakon ireverzibilne denaturacije pri različitim temperaturama u trajanju od 40
min, uzorci su ohlađeni na 4 °C, a zatim je preostala katalitička aktivnost izmjerena na
30 °C. Iz krivulja su izračunate temperature pri kojoj uzorci gube 50 % katalitičke
aktivnosti (t50), prikazane u tablici 7.
Rezultati
64
A B C
25 30 35 400
20
40
60
80
100 ZmcSerRSZm18Sc13Zm26Sc20
t / °C
Are
l / %
20 25 30 350
20
40
60
80
100
ZmcSerRSZmcSerRS∆C18
t / °C
Are
l / %
35 40 45 500
20
40
60
80
100
ScSerRSScSerRS∆C13
t / °C
Are
l / %
A B C
25 30 35 400
20
40
60
80
100 ZmcSerRSZm18Sc13Zm26Sc20
t / °C
Are
l / %
20 25 30 350
20
40
60
80
100
ZmcSerRSZmcSerRS∆C18
t / °C
Are
l / %
35 40 45 500
20
40
60
80
100
ScSerRSScSerRS∆C13
t / °C
Are
l / %
Slika 19: Termalna inaktivacija krnjih i kimernih oblika SerRS. Uzorci su inkubirani 40 minuta pri različitim temperaturama, a zatim im je izmjerena preostala katalitička aktivnost.
Tablica 7: Temperatura pri kojoj u 40 minuta dolazi do 50 % denaturacije (t50) ScSerRS i ZmcSerRS, njihovih krnjih ili kimernih oblika. Mjerenja su ponovljena tri puta, vrijednosti su izražene kao aritmetička sredina ± standardna pogreška. Dvije različite vrijednosti za ZmcSerRS odnose se na ZmcSerRS s histidinskim privjeskom pročišćen iz kvasca, i ZmcSerRS bez histidinskog privjeska pročišćenoj iz E. coli.
Enzim t / °C
ScSerRS 43,00 ± 0,04
ScSerRS∆C13 44,5 ± 0,2
ZmcSerRS 31,0 ± 0,3
ZmcSerRS∆C18 31,5 ± 0,3
ZmcSerRS 34,8 ± 0,2
Zm18Sc13 33,4 ± 0,2
Zm26Sc20 30,7 ± 0,2
Iz slike 19A i B i vrijednosti iz tablice 7, vidljivo je da su krnji enzimi
ScSerRS∆C13 i ZmcSerRS∆C18 jednako otporni na ireverzibilnu termičku
denaturaciju kao cjeloviti ScSerRS i ZmcSerRS. Prema tome, delecija velikog dijela
produžetka koja obuhvaća polarne i bazične aminokiseline nema nikakvog utjecaja na
strukturu i stabilnost enzima. Nameće se zaključak da do destabilizacije dolazi pri
uklanjanju proksimalnog dijela produžetaka, koji sadrži prolin i hidrofobne
aminokiseline, budući da ScSerRS∆C20 ima bitno smanjenu termičku stabilnost u
usporedbi sa ScSerRS [5, 6].
Kimerni proteini SerRS kukuruza s transplantiranim produžetkom kvaščeve
SerRS bili su također prilično stabilni u usporedbi s cjelovitom ZmcSerRS (slika 19C;
tablica 7). To je u skladu s očekivanjima za Zm18Sc13 koji pokazuje marginalno
smanjenu stabilnost (za 1,4 °C) u usporedbi sa ZmcSerRS, budući da taj konstrukt
Rezultati
65
ima sačuvanu pripadnu proksimalnu regiju produžetka presudnu za cjelokupnu
stabilnost enzima. Zanimljiva je stabilnost kimere Zm26Sc20. Nju možemo
promatrati kao krnji ZmcSerRS∆C26 na koji je pridodan cijeli produžetak kvaščeve
SerRS. Interesantno je da u tom slučaju produžetak kvaščeve SerRS uspijeva spasiti
inače nestabilan protein i povratiti njegov strukturni integritet. Za razliku od
ZmcSerRS∆C26, takav kimerni protein lako se eksprimira, pročišćava i pokazuje
normalnu aminoacilacijsku aktivnost. Ipak, njegova stabilnost jest niža u usporedbi sa
ZmcSerRS za 4,1 °C, odnosno u usporedbi sa Zm18Sc13 za 2,7 °C, što je
signifikantno budući da se na slici 19 vidi da unutar intervala od ∼5 °C dolazi do
gotovo potpunog gubitka aktivnosti. Uzrok smanjenoj stabilnosti Zm26Sc20 u
usporedbi sa ZmcSerRS i Zm18Sc13 su razlike na razini primarne strukture
proksimalne regije produžetka kvaščeve i kukuruzne SerRS, iako sadrže
aminokiseline sličnih svojstava, što dodatno podupire zaključak da je proksimalni dio
produžetka važan za stabilnost SerRS. Valja naglasiti da razlike između stabilnosti
kimera i ZmcSerRS nisu posljedica kraćenja produžetka. Zm18Sc13 (26 - 18 + 13 =
21 aminokiselina) ima kraći produžetak od ZmcSerRS (26 aminokiselina), i približnoj
jednako dugi produžetak kao Zm26Sc20 (20 aminokiselina), pa ipak je Zm18Sc13
bitno stabilniji od Zm26Sc20. Tj. razlika između Zm18Sc13 i Zm26Sc20 nije u
duljini produžetka, nego u proksimalnoj regiji (slika 17C).
U pokusima termičke inaktivacije uočena je i umjerena razlika u stabilnosti
ZmcSerRS s His-tagom pročišćene iz kvasca i ZmcSerRS bez His-taga pročišćene iz
E. coli (tablica 7), što nije ništa neobično za enzime dobivene iz različitih
ekspresijskih sustava. I dok ZmcSerRS tolerira His-tag na N-kraju pod cijenu nešto
smanjene stabilnosti, kod ScSerRS His-tag narušava strukturu i katalitičku aktivnost
do mjere pri kojoj postaje neprimjenjiv. U ekspresijskom sustavu u E. coli negativan
utjecaj His-taga na ZmcSerRS postaje još izraženiji i ozbiljno kompromitira svojstva
enzima (slika 16). Valja naglasiti da se His-tag na ZmcSerRS eksprimiranoj u kvascu,
nadodan PCR-om (MHHHHHHAG-), razlikuje od His-taga kodiranog vektorom
pET28 (MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMAR-) u E. coli.
U daljnjem eksperimentalnom radu istraživanja su bila fokusirana na krnje
oblike enzima (ZmcSerRS∆C12, ZmcSerRS∆C18 i ScSerRS∆C13). Iako su mutanti
ZmcSerRS s promjenama u slijedu C-terminalnog produžetka (ZmcSerRSmut1, mut2
Rezultati
66
i mut3) pružili dragocjene smjernice o utjecaju pojedinih dijelova produžetka na
stabilnost i aktivnost enzima, procijenjeno je da odsutnost neprirodnih
aminokiselinskih sljedova kod krnjih enzima pojednostavljuje buduću interpretaciju
rezultata.
4.2. Utjecaj produžetaka na katalitička svojstva ZmcSerRS i ScSerRS i vezanje tRNA
4.2.1. Odabir supstrata za određivanje kinetičkih parametara
ZmcSerRS i njezinih varijanti
Iako se već u ranim fazama istraživanja pokazalo da ZmcSerRS učinkovito
serilira heterolognu ukupnu tRNA kvasca, nametalo se pitanje je li to dovoljno dobar
supstrat za kinetičku analizu ZmcSerRS i njezinih krnjih varijanti. Kukuruz i kvasac
ipak su evolucijski udaljeni organizmi, mada je za mnoge aaRS i SerRS [31]
pokazano da su sposobne aminoacilirati heterolognu tRNA iz različitih domena života.
Nadalje, u ovoj fazi istraživanja bilo je jasno da su krnji oblici ZmcSerRS katalitički
aktivni i da mogući utjecaj delecija na kinetičke parametre neće biti jako izraženi. U
više slučajeva je pokazano da je utjecaj pomoćnih veznih domena za tRNA manje
izražen pri aminoaciliranju heterologne tRNA [35, 68]. Uostalom, prije upotrebe
"zamjenskog", tj. heterolognog supstrata, neophodno ga je usporediti s pripadnim,
odnosno prirodnim supstratom. Stoga sam se odlučio za pripravu tRNA iz kukuruza.
Kao supstrati za aminoaciliranje često se koriste transkripti sintetskih gena za
tRNA priređeni in vitro, transkripcijom kalupa DNA pomoću T7 RNA-polimeraze [96,
100]. To je jednostavna metoda priprave pojedinog izoakceptora tRNA, a glavna
prednost joj je mogućnost dobivanja mutiranih molekula tRNA kakve ne postoje u
prirodnim izvorima. Takva tRNA ne posjeduje posttranskripcijske modifikacije, ali
one obično nisu presudne za prepoznavanje aaRS i tRNA (tj. nisu identitetni element),
ali mogu utjecati na stabilnost molekule tRNA. Nedostatak metode je da transkripti
tRNA mogu biti heterogene dužine zbog svojstva T7-RNA polimeraze da ponekad
nasumično dodaje jedan ili dva nukleotida na 3'-kraj, te heterogenost konformacije
nastalih molekula. Stoga udio specija koje se mogu aminoacilirati u pripravku
transkripta in vitro može varirati od 25 do 90 %. Alternativa ekspresiji in vitro je
prekomjerna ekspresija gena za tRNA in vivo [96], također pomoću T7 RNA-
Rezultati
67
polimeraze pri čemu će stanični aparat procesirati tRNA 3'- i 5'-krajeve tRNA i
(djelomično) uvesti posttranskripcijske modifikacije svojstvene prirodnoj tRNA.
Druga mogućnost je izolacija tRNA iz prirodnog izvora, pri čemu se dobije
smjesa svih izoakceptora različitih aminokiselina prisutnih u tkivu ili stanici. Daljnja
izolacija pojedinih izoakceptora je mukotrpna i oslanja se na kromatografiju HPLC-
om na reverznim fazama i druge vrlo raznorodne i zahtjevne kromatografske tehnike
[ 101 ]. U novije vrijeme koristi se i afinitetna kromatografija na koloni s
imobiliziranim EF-Tu [102], ali i ta metoda ima ozbiljnih nedostataka.
Uzevši u obzir sve navedeno, odlučio sam kao supstrat prirediti i koristiti
ukupnu tRNA kukuruza, jer je procijenjeno da je to materijal čija priprema predstavlja
dobar kompromis svojstava, zahtjevnosti pripreme i tehničkih ograničenja u
laboratoriju. Nadalje, ukupna tRNA je biološki najrelevantniji supstrat, s obzirom da
se u živoj stanica serilacija tRNASer odvija u smjesi s izoakceptorima za ostale
aminokiseline.
4.2.2. Priprava i pročišćavanje ukupne tRNA iz kukuruza
Zrelo biljno tkivo je zahtjevan polazni materijal za izolaciju makromolekula
zbog tvrde celulozne stanične stijenke, a velik dio stanice zauzima vakuola pa
stanična jezgra, citoplazma i organele u kojima se odvija glavnina biokemijskih
procesa zauzimaju mali dio volumena stanice. Stoga su kao polazni materijal odabrani
mladi izdanci kukuruza, tj. mlado tkivo prije formiranja listova, čvrste stabljike i tvrde
stanične stijenke.
Postupak izolacije tRNA iz biljnog tkiva osmišljen je na temelju protokola za
izolaciju ukupne tRNA kvasca i E. coli. Postupak se sastojao od ekstrakcije
nukleinskih kiselina iz usitnjenog tkiva kiselina pomoću fenola (slika 20, uzorak 3) iz
čijeg je taloga otopinom NaCl-a ekstrahirana tRNA (slika 20, uzorak 4 i 5), pri čemu
su u talogu zaostale genomska DNA, mRNA i ribosomske RNA (slika 20, uzorak 6).
Ukupna tRNA deacilirana je inkubacijom u puferu visokog pH (pH 8,8, 1 h, 37 °C).
Rezultati
68
Slika 20: Analiza izolacije ukupne tRNA iz kukuruza na 1,5 %-tnom agaroznom gelu: 1 - komercijalna ukupna kvaščeva tRNA, 1 µg; 2 - λ / HindIII, 1 µg; 3 - nukleinske kiseline kukuruza ekstrahirane fenolom, približno 2 µg; 4 - tRNA ekstrahirana NaCl-om iz taloga nukleinskih kiselina, približno 1-1,5 µg; 5 - isto kao pod 4., samo 5 puta više uzorka; približno 7 µg; 6 - visokomolekulskih nukleinskih kiselina preostalih u talogu nakon ekstrakcije NaCl-om.
U sirovom pripravku ukupne tRNA (uzorci 4 i 5) vidljivi su ostaci rRNA i
DNA, a udio tRNA procijenjen je na 80-90 % nukleinskih kiselina. To je
zadovoljavajuće, budući da nije dokumentirano da rRNA ili DNA smetaju katalitičkoj
aktivnosti aaRS. Udio ribosomskih rRNA u tipičnoj stanici je oko 85 %, 5 % otpada
na mRNA (zato su na gelu slabo vidljive u obliku difuznog razmaza u pozadini rRNA;
uzorak 6), a udio tRNA je samo 10 %. Stoga ekstrakcija NaCl-om značajno obogaćuje
uzorak s obzirom na tRNA (konačni udio > 80%), a iz uzorka 6 vidljivo je da je
ekstrakcija tRNA bila potpuna. Dvije jasne i oštre pruge ribosomske RNA (uzorak 3 i
6) indikator su da je tijekom preparacije izbjegnuta degradacija uzorka
ribonukleazama jer bi u tom slučaju pruge rRNA bile slabe i difuzne.
Tako priređena sirova ukupna tRNA bila je lošiji supstrat od ukupne kvaščeve
tRNA, pa je dodatno pročišćena kromatografijom na DEAE-celulozi [95]. Pročišćena
ukupna tRNA bila je znatno bolji supstrat, što je potvrdilo da su uzrok smanjene
aktivnosti bile prisutne nečistoće.
Konačni prinos nakon pročišćavanja na DEAE-celulozi bio je 6-8 mg ukupne
tRNA kukuruza na 100 g polaznog materijala (izdanaka kukuruza). Udio tRNASer u
pripravku iznosio je 8,9 %, što je izvrstan rezultat budući da se udio tRNASer u
komercijalnoj ukupnoj tRNA kvasca prema iskustvima Laboratorija kreće 3-6 %.
1 2 3 4 5 6
genomska DNA rRNA tRNA
Rezultati
69
Postupak izolacije i pročišćavanja ukupne tRNA kukuruza objavljen je i
detaljno opisan u prvom hrvatskom metodološkom priručniku iz molekularne
biologije [103].
4.2.3. Utjecaj produžetaka na kinetičke parametre za tRNA
Produžeci eukariotskih SerRS sadrže značajan udio bazičnih aminokiselina
(slika 4 i 17), što je sugeriralo da bi mogli imati važnu ulogu u vezanju tRNA. Bazični
karakter ili motivi koji sadržavaju bazične bočne ogranke svojstveni su pomoćnim
veznim domenama za tRNA eukariotskih aaRS. Stoga su određeni kinetički parametri
za tRNA u reakciji aminoaciliranja, za ScSerRS, ZmcSerRS i njihove krnje oblike.
0 1 2 3 4 50.0
0.5
1.0
1.5
ZmcSeRS∆C12ZmcSerRS∆C18
ZmcSerRS
c(tRNASer) / µmol dm-3
k / s
-1
0 1 2 3 40.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
ScSerRS∆C13ScSerRS
c(tRNASer) / µmol dm-3
k / s
-1
Slika 21: Ovisnost početne brzine enzimski katalizirane reakcije o koncentraciji tRNASer, za reakcije aminoaciliranja katalizirane ScSerRS, ZmcSerRS i njihovim krnjim oblicima. Početne brzine izražene su po količini enzima: k / s-1 = v0 / c (enzima), po analogiji s kcat, tj. kao broj molekula supstrata prevedenih u produkt po molekuli enzima u jedinici vremena.
Tablica 8: Kinetički parametri za ScSerRS, ZmcSerRS i njihove krnje oblike za tRNASer, određene u reakciji aminoaciliranja. Kao supstrat korištena je ukupna tRNA kukuruza za ZmcSerRS, ZmcSerRS∆C12 i ZmcSerRS∆C18, odnosno ukupna tRNA kvasca za ScSerRS i ScSerRS∆C13. Koncentracija serina bila je 100 µmol dm-3. Određivanja su ponovljena najmanje tri puta, dobivene vrijednosti izražene su kao aritmetička sredina ± standardna pogreška.
Enzim KM / µmol dm-3 kcat / s-1
ZmcSerRS 0,58 ± 0,06 1,48 ± 0,05
ZmcSerRS∆C12 0,65 ± 0,02 1,28 ± 0,02
ZmcSerRS∆C18 0,66 ± 0,1 1,43 ± 0,07
ScSerRS 0,71 ± 0,11 0,58 ± 0,03
ScSerRS∆C13 0,65 ± 0,07 0,54 ± 0,02
Unatoč izraženom bazičnom karakteru, uklanjanje produžetka ne pokazuje
nikakav utjecaj na kinetičke parametre za tRNASer (tablica 8), krnji oblici ZmcSerRS i
Rezultati
70
ScSerRS jednako dobro aminoaciliraju ukupnu tRNA kukuruza, odnosno kvasca
(slika 21). To posebno iznenađuje za ZmcSerRS∆C18 i ScSerRS∆C13, kojima je
uklonjeno gotovo 70 % produžetka, zajedno s cjelokupnom hidrofilnom i bazičnom
regijom (vidi sliku 17).
Budući da je komercijalno dostupna ukupna tRNA kvasca često korištena kao
zamjenski supstrat za ZmcSerRS i njezine varijante, određeni su kinetički parametri
za ukupnu tRNA kvasca, te za ukupnu tRNA E. coli (tablica 9). Laboratorijska
preparacija ukupne tRNA iz kukuruza je najbolji supstrat. Vidljivo je da su kinetički
parametri ZmcSerRS za ukupnu tRNA iz evolucijski udaljenog kvasca vrlo slični kao
za pripadnu tRNA, što opravdava korištenje ukupne kvaščeve tRNA kao zamjenskog
supstrata u daljnjim kinetičkim eksperimentima. Iznenađuje pak da ZmcSerRS vrlo
učinkovito serilira bakterijsku tRNA iz E. coli, razlika između kcat / KM za tRNA iz E.
coli (1,29 µmol-1 dm3 s-1) i kukuruza (2,55 µmol-1 dm3 s-1) je svega 2 puta. Usporedbe
radi, ScSerRS 4,2 puta slabije aminoacilira transkript E. coli tRNASer dobiven in vitro
od transkripta vlastite tRNASer [29].
Tablica 9: Usporedba kinetičkih parametara ZmcSerRS za heterologne ukupne tRNA različitog porijekla. Koncentracija serina bila je 100 µmol dm-3. Određivanja su ponovljena najmanje tri puta, dobivene vrijednosti izražene su kao aritmetička sredina ± standardna pogreška.
Ukupna tRNA KM / µmol dm-3 kcat / s-1
kukuruz (Z. mays) 0,58 ± 0,06 1,48 ± 0,05
kvasac (S. cerevisiae) 0,77 ± 0,1 1,1 ± 0,1
E. coli 0,86 ± 0,04 1,11 ± 0,02
4.2.4. Utjecaj produžetaka na vezanje tRNA u elektroforezi pri nativnim
uvjetima
Katalitičke konstante (KM i kcat) za tRNA ostale su potpuno nepromijenjene pri
deleciji C-terminalnih produžetaka ScSerRS i ZmcSerRS. Stoga je malo vjerojatno da
produžetak djeluje kao pomoćna vezna domena za tRNA unatoč svojim bazičnim
svojstvima. Radi provjere tog zaključka, stvaranje kompleksa između ZmcSerRS i
ScSerRS s tRNA istraživano je elektroforezom pri nativnim uvjetima, metodom
pomaka u gelu (eng. EMSA; electrophoretic mobility shift assay; slika 22).
Rezultati
71
protein
kompleksSerRS i tRNA
tRNA
ScS
erR
S
ScS
erR
S∆C
13
ScS
erR
S
ScS
erR
S∆C
13
+ tRNASer
bez
prot
eina
ZmcS
erR
S
ZmcS
erR
S∆C
12
ZmcS
erR
S∆C
18
ZmcS
erR
S
ZmcS
erR
S∆C
12
ZmcS
erR
S∆C
18
bez
prot
eina
+ tRNASer
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
protein
kompleksSerRS i tRNA
tRNA
ScS
erR
S
ScS
erR
S∆C
13
ScS
erR
S
ScS
erR
S∆C
13
+ tRNASer
bez
prot
eina
ZmcS
erR
S
ZmcS
erR
S∆C
12
ZmcS
erR
S∆C
18
ZmcS
erR
S
ZmcS
erR
S∆C
12
ZmcS
erR
S∆C
18
bez
prot
eina
+ tRNASer
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
AB
protein
kompleksSerRS i tRNA
ScS
erR
S
ScS
erR
S∆C
13
ScS
erR
S
ScS
erR
S∆C
13
+ ukupnatRNA kvasca
ZmcS
erR
S
ZmcS
erR
S∆C
12
ZmcS
erR
S∆C
18
ZmcS
erR
S
ZmcS
erR
S∆C
12
ZmcS
erR
S∆C
18
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
+ ukupna tRNA kukuruza
B
protein
kompleksSerRS i tRNA
ScS
erR
S
ScS
erR
S∆C
13
ScS
erR
S
ScS
erR
S∆C
13
+ ukupnatRNA kvasca
ZmcS
erR
S
ZmcS
erR
S∆C
12
ZmcS
erR
S∆C
18
ZmcS
erR
S
ZmcS
erR
S∆C
12
ZmcS
erR
S∆C
18
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
+ ukupna tRNA kukuruza
Slika 22: Kompleksi kvaščeve i kukuruzne SerRS i tRNA. Proteini i tRNA su inkubirani pri sobnoj temperaturi, a nastali kompleksi odijeljeni su elektroforezom na poliakrilamidnim gelovima. (A) Kompleksi ScSerRS, ZmcSerRS i njihovih krnjih oblika s transkriptom kvaščeve tRNASer priređenog in vitro. 1, 2, 6, 7, 8 - kontrole; enzimi bez dodatka tRNA. 5, 12 - slobodna tRNASer (kontrola). Gel je bojan srebrom. (B) Kompleksi SerRS i njihovih krnjih oblika s ukupnom kvaščevom ili kukuruznom tRNA. 1, 2, 5, 6, 7 - kontrole; enzimi bez dodatka tRNA. Gel je bojan pomoću Coomassie Brilliant Blue R-250.
Na slici 22A, na gelu bojanom srebrom koje detektira proteine, nukleinske
kiseline i njihove komplekse, vidi se pojava dodatne pruge u uzorcima koji su
sadržavali enzim i tRNA (3, 4, 9, 10, 11), a kojih u kontrolnim uzorcima (1, 2, 5-8, 12)
nema. Te dodatne pruge odgovaraju kompleksu između enzima i transkripta kvaščeve
tRNASer priređenog in vitro. Vidi se da krnji enzimi ScSerRS∆C13 (4),
ZmcSerRS∆C12 (10) i ZmcSerRS∆C18 (11) stvaraju jednako dobro komplekse kao
cjelovite ScSerRS (3) i ZmcSerRS (9). Nastajanje kompleksa nedvojbeno je pokazano
i s ukupnom kvaščevom ili kukuruznom tRNA (slika 22B). Na slici 22B gel je bojan
pomoću Coomassie Brilliant Blue R-250 koji specifično boja proteine. Nastajanje
kompleksa s tRNA očituje se kao pomak proteina (uzorci 3, 4, 8, 9, 10) u usporedbi s
kontrolnim uzorcima (1, 2, 5, 6, 7) jer tRNA donosi kompleksu visok negativan naboj.
Na oba gela uočljiva je veća pokretljivost krnjih proteina (i njihovih kompleksa) u
odnosu na cjelovite ScSerRS i ZmcSerRS, jer je krnjim proteinima uklonjen pozitivno
nabijeni dio produžetka.
Rezultati elektroforeze pri nativnim uvjetima, metodom pomaka u gelu,
podupiru zaključak da produžeci ScSerRS i ZmcSerRS ne utječu u značajnoj mjeri na
vezanje tRNA.
Rezultati
72
4.2.5. Određivanje kinetičkih parametara za serin
ScSerRS pokazuje tRNA-ovisno prepoznavanje serina (vidi poglavlje 2.1.3),
gdje vezanje tRNA povećava afinitet i točnost prepoznavanja enzima za serin. Kod
ScSerRS∆C20 taj je mehanizam narušen i ScSerRS∆C20 ima povećani KM za serin
(KM = 252 µmol dm-3) u usporedbi sa ScSerRS (KM = 62,5 µmol dm-3) [5].
Pretpostavlja se da je narušen mehanizam tRNA-ovisnog prepoznavanja serina jedan
od uzroka toksičnosti ScSerRS∆C20 in vivo [6]. Stoga je bilo interesantno odrediti i
usporediti kinetičke parametre za serin za cjelovite i krnje enzime (tablica 10).
0 100 200 300 400 500 600 7000
1
2
3
ZmcSerRS∆C12ZmcSerRS∆C18
ZmcSerRS
c (Ser) / µmol dm-3
k / s
-1
0 100 200 3000.0
0.1
0.2
0.3
0.4
ScSerRS∆C13ScSerRS
c(Ser) / µmol dm-3
k/ s
-1
Slika 23: Ovisnost početne brzine enzimski katalizirane reakcije o koncentraciji serina za ScSerRS, ZmcSerRS i njihove krnje oblike. Početne brzine izražene su po količini enzima: k / s-1 = v0 / c (enzima), po analogiji s kcat, tj. kao broj molekula supstrata prevedenih u produkt po molekuli enzima u jedinici vremena.
Tablica 10: Kinetički parametri za ScSerRS, ZmcSerRS i njihove krnje oblike za serin, određene u reakciji aminoaciliranja. Parametri su određeni u prisutnosti ukupne tRNA kvasca, u koncentraciji koja odgovara 5 µmol dm-3 tRNASer. Određivanja su ponovljena najmanje tri puta, dobivene vrijednosti izražene su kao aritmetička sredina ± standardna pogreška.
Enzim KM / µmol dm-3 kcat / s-1
ZmcSerRS 149 ± 13 2,8 ± 0,1
ZmcSerRS∆C12 108 ± 14 3,2 ± 0,1
ZmcSerRS∆C18 145 ± 17 3,7 ± 0,2
ScSerRS 47 ± 5 0,46 ± 0,02
ScSerRS∆C13 51 ± 6 0,47 ± 0,02
Kao što se iz slike 23 vidi, delecija produžetka ne utječe na kinetičke
parametre krnjih oblika ZmcSerRS i ScSerRS za serin. Kinetički parametri za sva tri
krnja enzima jednaka su kinetičkim parametrima cjelovitih enzima (tablica 10), što je
neočekivano, budući da ScSerRS∆C20 ima četiri puta veći KM za serin od ScSerRS.
Rezultati
73
4.3. Komplementacija kvaščevog soja BR2727∆SES1 krnjim
oblicima ScSerRS i ZmcSerRS
4.3.1. Metoda izmjene plazmida
Metoda izmjene plazmida (eng. plasmid shuffling; slika 24) temelji se na
zamjeni tzv. "spasiteljskog" plazmida (eng. rescue plasmid; u ovom slučaju
pUN70SES1 s biljegom URA3) plazmidom koji nosi gen za koji se želi ispitati može li
nadomjestiti (tj. komplementirati) funkciju inaktiviranog gena u genomu kvasca. Ako
je gen esencijalan za stanicu, soj s inaktiviranim genom ne bi bio vijabilan, pa je
preživljavanje soja osigurano "spasiteljskim" plazmidom koji nosi taj esencijalni gen.
Dakle, komplementacija se odvija postupno, zamjenom "spasiteljskog" plazmida s
plazmidom koji nosi željeni konstrukt (mutirani oblik gena, homologni gen iz drugog
organizma i sl.), ukoliko ispitivani konstrukt može nadomjestiti (komplementirati)
funkciju eliminiranog gena [104].
Derivati plazmida pUN100 ili pVT103-L transformirani su u soj kvasca
BR2727∆SES1/pUN70SES1 (slika 24). U soju BR2727∆SES1 gen za ScSerRS (SES1)
inaktiviran je insercijom biljega lys2. Uzgojem u mediju uz dodatak uracila omogućen
je spontani gubitak "spasiteljskog" plazmida pUN70SES1 s biljegom URA3.
Auksotrofi za uracil koji su (potencijalno) izgubili "spasiteljski" plazmid izolirani su
protuselekcijom u mediju s 5-fluoroorotatom (5-FOA) koji je toksičan za stanice s
funkcionalnim genom URA3.
Rezultati
74
1. transformacija2. selekcija na mediju
Ura- Leu- Lys-
lys2
SES1
SES1
URA3xxx
leu2Lys+ Ura+ Leu-
pUN70SES1
lys2
SES1
SES1
URA3
xxx
leu2
Lys+ Ura+ Leu+
pUN70SES1
3. uzgoj u mediju Leu- Lys-
4. protuselekcija sa 5-FOA
lys2
SES1
xxx
leu2
Lys+ Ura- Leu+
Slika 24: Shema komplementacije soja BR2727∆SES1 s rekombinantnim plazmidima pUN100 ili pVT103-L. Naznačen je fenotip (tj. auksotrofija / prototrofija) soja u pojedinim koracima komplementacije. Opis postupka u tekstu.
4.3.2. Komplementacije rekombinantnim centromernim plazmidom
pUN100
Krnji enzimi kvaščeve i kukuruzne SerRs kreirani u ovom radu bili su potpuno
stabilni, a uklanjanje C-terminalnog produžetka nije utjecalo na njihove katalitičke
parametre. Budući da su krnji enzimi potpuno funkcionalni in vitro, produžeci očito
nemaju katalitičku ulogu, točnije ne potpomažu vezanje i aminoaciliranje tRNA.
Stoga je odlučeno ispitati njihovu funkcionalnost in vivo, u pokusima
komplementacije. Izostanak komplementacije katalitički potpuno kompetentnim
enzimima bila bi indikacija da produžetak ima neku drugu, nekatalitičku, ali važnu
ulogu in vivo. Npr. produžeci bi mogli utjecati na lokalizaciju proteina u stanici,
budući da produžetak ScSerRS nalikuje signalu za upućivanje u jezgru [105] (eng.
nuclear localization signal). Smatra se da bi aminoaciliranje tRNA u jezgri moglo
imati ulogu provjere zrele molekule tRNA je li ispravno procesirana, modificirana i
prepoznata prije eksporta u citoplazmu. Budući da mnoge eukariotske aaRS posjeduju
dodatne domene za interakciju s drugim proteinima, i budući da su dodatne domene
često višefunkcionalne (vidi poglavlje 2.2.6 i tablicu 1), moguće je zamisliti niz
nekatalitičkih uloga produžetaka koje bi bile presudne za vijabilnost stanica. Budući
da ZmcSerRS učinkovito serilira kvaščevu tRNA (čak 2 puta bolje od ScSerRS!),
Rezultati
75
provjerena je komplementacija soja BR2727∆SES1 cjelovitom ZmcSerRS i njenim
krnjim oblicima.
Za ScSerRS∆C20 već je pokazano da komplementira soj BR2727∆SES1 [5],
ali vijabilnost stanica bila je smanjena (vrijeme diobe povećano za 70 %), iako je bio
eksprimiran s plazmida YEp351 visokog broja kopija u stanici i pod kontrolom jakog
promotora ADH1. Uzrok lošoj komplementaciji vjerojatno je niska stanična razina
ScSerRS∆C20 uslijed njegove nestabilnosti i brze degradacije in vivo. Budući da su
krnji enzimi kreirani u ovom radu bili stabilni, primijenjena je drugačija strategija
komplementacije: krnji proteini eksprimirani su s centromernog plazmida pUN100
malog broja kopija (1 do 2 plazmida po stanici), pod kontrolom pripadnog promotora
gena SES1. Time se pokušalo što vjernije oponašati prirodnu razinu ekspresije
ScSerRS, da možebitni biološki učinci delecija produžetaka ne budu prikriveni (tj.
kompenzirani) povišenom razinom ekspresije pod kontrolom nepripadnog promotora,
kao što je promotor ADH1. Komplementacija je pokušana s derivatima plazmida
pUN100 koji kodiraju ScSerRS∆C13, ScSerRS∆C20, ZmcSerRS, ZmcSerRS∆C12,
ZmcSerRS∆18 i ZmcSerRS∆C26. Kao pozitivna kontrola korišten je pUN100SES1
koji kodira ScSerRS i pUN100∆SES1 kao negativna kontrola.
Rezultati komplementacije i protuselekcije s 5-FOA analizirani su na dva
načina: PCR-om (slika 25) na ukupnoj DNA nastalih auksotrofa za uracil rezistentnih
na 5-FOA, i Western-analizom. ZmcSerRS i njeni krnji oblici nisu komplementirali
BR2727∆SES1, vjerojatno zbog (pre)niske razine ekspresije. Heterologni
rekombinantni proteini se u pravilu lošije eksprimiraju u domaćinu od homolognih
gena (usporedi na slici 18 ZmcSerRS, uzorci 1-3, i ScSerRS uzorci 8 i 9), uslijed
preferentnog korištenja različitih sinonimnih kodona (eng. codon usage bias) i drugih
razloga. S druge strane, ScSerRS∆C13 komplementirao je stanice kvasca, te nije
primijećen sporiji rast ili neki drugi nepovoljan fenotip takvih stanica. ScSerRS∆C20
nije komplementirao soj BR2727∆SES1, a Western-analizom nije detektirana njegova
ekspresija (slika 26). Nedovoljna razina ekspresije ScSerRS∆C20 u pokusima
komplementacije dodatni je pokazatelj nestabilnosti ScSerRS∆C20 in vivo, budući da
je od prije poznato da delecija ne utječe na razinu njegove mRNA u stanici [5].
Rezultati
76
6,64,4
2,3 i 2,0
6,64,4
2,3 i 2,0
5,4 5,4
1,4
lys2
SES1
xxx
leu2
Lys+ Ura- Leu+
A
B C
Slika 25: Provjera komplementacije soja BR2727∆SES1 PCR-om. (A) Insercijom biljega lys2 inaktivirana je genomska kopija gena SES1 (1,4 kb). Umnažanjem tog lokusa pomoću početnica komplementarnih 5' i 3'-kraju gena SES1 nastaje fragment DNA duljine 5,4 kb. (B) Kod pravih pozitiva ta kombinacija početnica umnožava samo fragment duljine 5,4 kb; korištene klice nisu komplementarne ZmcSerRS ili 3'-kraju gena za krnje oblike ScSerRS. (C) Lažni pozitivi: prisutnost dodatnog fragmenta duljine 1,4 kb otkriva prisutnost cjelovitog gena SES1. Na slici (B) i (C) prva jažica sadrži DNA faga λ cijepanog s HindIII (marker molekulskih masa; naznačene lijevo od gela).
Slika 26: Western-analiza proteinskih ekstrakata BR2727∆SES1 prije i poslije izbacivanja "rescue"-plazmida pUN70SES1 u komplementaciji s pUN100ScSerRS∆C13 i pUN100ScSerRS∆C20. Korištena su primarna antitijela na ScSerRS.
Prije komplementacije: 1 - pročišćeni ScSerRS (marker); 2 - pročišćeni ScSerRS∆C13 (marker); 3, 4 - soj transformiran praznim plazmidom; 5, 6 - pUN100ScSerRS (pozitivna kontrola); 7, 8 - pUN100ScSerRS∆C13; 9, 10 - pUN100ScSerRS∆ C20. U uzorcima 7 i 8 vidljiva je dodatna pruga krnje ScSerRS∆C13, dok dodatne pruge u uzorcima 9 i 10 koja bi odgovarala ScSerRS∆C20 nema.
Nakon komplementacije: 1 - pročišćeni ScSerRS (marker); 2 - pročišćeni ScSerRS∆C13 (marker); 3, 4 - pUN100ScSerRS (pozitivna kontrola); 5, 6 - pUN100ScSerRS∆C13; 7, 8 - pUN100ScSerRS∆ C20. U uzorcima 5 i 6 vidljiva je samo krnja ScSerRS∆C13, što potvrđuje da je došlo do
komplementacije. Uzorci 7 i 8 sadrže cjelovitu ScSerRS (lažni pozitivi).
Rezultati
77
4.3.3. Komplementacija sa ZmcSerRS konstruktima u plazmidu
pVT103-L
Budući da ZmcSerRS i njezini derivati učinkovito aminoaciliraju kvaščevu
tRNA, a produžetak ScSerRS ne čini se neophodan za komplementaciju, za očekivati
je da ZmcSerRS i njezini krnji derivati također komplementiraju soj BR2727∆SES1.
Nemogućnost komplementacije konstruktima ZmcSerRS u plazmidu pUN100
vjerojatno je posljedica njihove slabe ekspresije, pa su ZmcSerRS i njezini krnji oblici
klonirani u vektor pVT103-L visokog broja kopija, pod kontrolu promotora ADH1.
Ekspresija konstrukata provjerena je mjerenjem aminoacilacijske aktivnosti u
proteinskim ekstraktima prije komplementacije (tablica 11).
Tablica 11: Aminoacilacijska aktivnost proteinskih ekstrakata soja BR2727∆SES1/pUN70SES1 transformiranog derivatima plazmida pVT103-L koji kodiraju različite oblike ZmcSerRS. Specifična aktivnost je izražena u relativnim jedinicama, normirana masenom koncentracijom proteinskog ekstrakta.
pVT103-L v0 / cpm min-1 γ / µg ml-1 spec. akt. (v0 / γ)
prazan plazmid 148 150 1,0
prazan plazmid 75 50 1,5
ZmcSerRS 372 20 18,6
ZmcSerRS∆C12 322 20 16,1
ZmcSerRS∆C18 686 20 34,3
ZmcSerRS∆C26 125 150 0,8
ZmcSerRS∆C26 66 50 1,3
Aminoacilacijska aktivnost s eksprimiranim konstruktima ZmcSerRS bila je
13-27 puta veća od aminoacilacijske aktivnosti endogenog ScSerRS kodiranog
plazmidom pUN70SES1, osim u slučaju ZmcSerRS∆C26, koja je bila na razini
negativne kontrole. Opet, ZmcSerRS∆C26 se ponaša potpuno analogno
ScSerRS∆C20 za koji je pokazana nedostatna razina ekspresije s plazmida
pUN100ScSerRS∆C20 za komplementaciju.
Očekivano, komplementacija ZmcSerRS i njegovim krnjim oblicima
kloniranim u pVT103-L vektor bila je uspješna (tablica 12), osim u slučaju
ZmcSerRS∆C26 čija razina ekspresije vjerojatno nije bila dovoljna za
komplementaciju (tablica 11). Rezultati komplementacije sa ZmcSerRS i njenim
Rezultati
78
krnjim oblicima, sasvim su u skladu s rezultatima dobivenim s varijantama ScSerRS
kloniranih u vektor pUN100 (tablica 12).
Tablica 12: Usporedba komplementacije kvaščevog soja BR2727∆SES1 različitim konstruktima plazmida pUN100 i pVT103-L.
pUN100 pVT103-L
ScSerRS + ZmcSerRS +
ZmcSerRS∆C12 +
ScSerRS∆C13 + ZmcSerRS∆C18 +
ScSerRS∆C20 - ZmcSerRS∆C26 -
Mogućnost ZmcSerRS da komplementira soj s inaktiviranim genom za
ScSerRS bila je očekivana. Krnji mutanti ScSerRS i ZmcSerRS s netaknutom
proksimalnom regijom također su sposobni preuzeti funkciju endogene ScSerRS in
vivo, ponovno dokazujući da velik dio produžetka ScSerRS i ZmcSerRS nije
neophodan za funkciju eukariotskih SerRS. To je iznenađujući rezultat, budući da su
produžeci kod eukariotskih SerRS evolucijski očuvani. Ostaje otvorena mogućnost da
uloga produžetaka eukariotskih SerRS dolazi do izražaja samo pod posebnim
uvjetima (oksidativni ili drugi tipovi stresa, u nepovoljnim uvjetima, tijekom
sporulacije ili sl.) ili samo u određenim fazama razvoja ili staničnog ciklusa.
4.4. Uloga produžetka kvaščeve SerRS u interakciji s peroksinom Pex21p
4.4.1. Kimerni proteini kvaščeve i kukuruzne SerRS
Nedavno je pokazano u sustavu dvaju hibrida [8] da se interakcija ScSerRS i
Pex21p (poglavlje 2.1.4) gubi ako se ukloni C-terminalni produžetak, što upućuje na
zaključak da bi produžetak mogao predstavljati vezno mjesto za Pex21p, odnosno
domenu za interakciju s peroksinom. Iako ZmcSerRS također posjeduje sličan
produžetak na C-kraju, u sustavu dvaju hibrida nema naznake interakcije s Pex21p.
Ali kao što je već naglašeno, produžeci kvaščeve i kukuruzne SerRS su slični su po
svojoj hidrofilnoj i bazičnoj prirodi, ali razlikuju se na razini primarne strukture.
Hipotetske determinante za vezanje proteina unutar produžetka na C-kraju mogle su
tijekom evolucije divergirati.
Rezultati
79
Radi provjere je li produžetak kvaščeve SerRS dovoljan i samodostatan za
vezanje Pex21p, tj. predstavlja li domenu za vezanje proteina, dizajnirani su kimerni
proteini kukuruzne SerRS, kojoj je produžetak zamijenjen produžetkom kvaščeve
SerRS. Iako se interakcija s Pex21p u sustavu dvaju hibrida gubi već pri uklanjanju
zadnjih 13 aminokiselina s C-kraja ScSerRS, ne može se isključiti da se područje
interakcije proteže nešto dalje od te regije. Stoga su dizajnirana dva kimerna proteina
(slika 17C): Zm18Sc13, kod kojeg je 18 hidrofilnih i bazičnih aminokiselina
produžetka ZmcSerRS zamijenjeno s analognim dijelom produžetka ScSerRS, te
Zm26Sc20 kod kojeg je cijeli produžetak ZmcSerRS zamijenjen produžetkom
ScSerRS. Budući da ZmcSerRS i ScSerRS pokazuju značajnu sličnost na razini
primarne strukture (51 % jednakih i 67 % sličnih aminokiselina) zasigurno posjeduju
vrlo sličnu prostornu strukturu pa bi okosnica ZmcSerRS trebala osigurati optimalni
strukturni kontekst za interakciju Pex21p s produžetkom ScSerRS u kimernim
proteinima.
4.4.2. Interakcija kimernih proteina s Pex21p imobiliziranim na Ni-NTA
agarozi
Za potrebe provjere interakcije Pex21p s izvedenicama ScSerRS i ZmcSerRS,
osmišljen je sustav za in vitro detekciju interakcije, tzv. pull-down assay. Pex21p
pomoću histidinskog privjeska na N-kraju imobiliziran je na Ni-NTA agarozu, a zatim
je suspenzija inkubirana s pročišćenim ScSerRS, ZmcSerRS i njihovim različitim
oblicima (slika 27A). Vezani proteini eluirani su puferom koji je sadržavao 300 mmol
dm-3 imidazola, te analizirani pomoću SDS-PAGE. Enzimi bez histidinskog privjeska
se ne vežu na Ni-NTA agarozu, osim ako ne stvaraju kompleks s vezanim Pex21p.
Rezultati
80
Ni2+
His-tag Pex21p
........
....
?
SerRS
elucijaimidazolomSDS-PAGE
- +
Pex21p
SerRS
SDS-PAGE
Ni-NTAagaroza
ScS
erR
S
ZmcS
erR
S
Zm18
Sc1
3
Zm26
Sc2
0
ZmcS
erR
S
/
+ Pex21p
SerRS
Pex21p
1 2 3 4 5 6
10075
50
35
25
Mr / 103
ScS
erR
S
ZmcS
erR
S
- Pex21p
ScS
erR
S
ZmcS
erR
S
+ Pex21p
ScS
erR
S
ScS
erR
S∆
C13
ZmcS
erR
S
/
SerRS
Pex21p
1 2 3 4 5 6 7 8
B C
A
Slika 27: Detekcija interakcije Pex21p i raznih varijanti SerRS (bez His-taga) na Ni-NTA agarozi s imobiliziranim Pex21p. (A) Ako dolazi do interakcije, SerRS se zadržava na smoli i eluira zajedno s vezanim Pex21p. (B) Vezanje ScSerRS, ScSerRS∆C13 i ZmcSerRS na Ni-NTA agarozu zasićenu proteinskim ekstraktom E. coli s eksprimiranim Pex21p (5-8) i bez Pex21p (3, 4). 1, 2 - pročišćeni proteini (markeri). Lijevo su naznačeni položaji markera molekulskih masa. (C) Vezanje kimernih proteina na Ni-NTA agarozu zasićenu proteinskim ekstraktom s Pex21p.
Kao što se na slici 27B vidi, rezultati sustava dvaju hibrida potvrđeni su in
vitro: ScSerRS specifično se veže na Pex21p (uzorak 6), dok se delecijom zadnjih 13
aminokiselina interakcija gubi (uzorak 7). ZmcSerRS nije se vezao na smolu s
imobiliziranom Pex21p (uzorak 8). Međutim, kimerni proteini (slika 27C, 5 i 6)
također nisu stvarali dovoljno stabilne interakcije s Pex21p da bi se vezali na Ni-NTA
agarozu. Iako je produžetak kvaščeve SerRS neophodan za interakciju s Pex21p, jer
se njegovim uklanjanjem interakcija gubi, on nije dovoljan za stvaranje stabilnog
kompleksa SerRS i Pex21p. Nastajanje kompleksa ScSerRS i Pex21p ovisno je o
interakcijama s drugim, dodatnim regijama ScSerRS, i te su interakcije specifične, jer
kompleks ne nastaje sa ZmcSerRS kojoj je pripojen produžetak ScSerRS.
4.4.3. Interakcija kimernih proteina s Pex21p u sustavu dvaju hibrida
Iznenađujući rezultati sustava za in vitro detekciju interakcija - izostanak
nastajanja kompleksa s kimernim proteinima, dodatno su provjereni
Rezultati
81
komplementarnom metodom sustava dvaju hibrida. To je genetička metoda za
detekciju interakcija in vivo (slika 28, gore), u stanicama kvasca. Jedan od partnera
fuzionira se s veznom domenom za DNA, koja prepoznaje promotorske sljedove
gena-pokazatelja (tzv. bait; "mamac"). Drugi protein fuzionira se za aktivacijsku
domenu transkripcijskog faktora, koja može aktivirati transkripciju gena (tzv. prey;
"plijen") ako je vezana na promotor. Ako dva partnera stvaraju kompleks, to će
dovesti do aktivacije transkripcije gena pokazatelja (slika 28, gore) u odgovarajućem
soju kvasca. Smatra se da sustav dvaju hibrida omogućuje detekciju slabijih, tj.
labilnih kompleksa koje nisu dovoljno stabilni za izolaciju in vitro.
U našem slučaju kimerni proteini Zm18Sc13 i Zm26Sc20 bili su pripojeni
DNA-veznoj domeni LexA, a Pex21p je bio vezan za aktivacijsku domenu
transkripcijskog faktora GAL4. Soj L40 ima dva gena-pokazatelja: HIS3, koji
aktivacijom omogućuje rast na podlozi minimalnog medija bez histidina (tj.
prototrofiju za histidin) i lacZ koji kodira β-galaktozidazu.
Rezultati
82
plazmid saDNA-veznom
domenomLexA
BDSerRS
plazmid saDNA-veznom
domenomLexA
BDSerRS
plazmid saaktivacijskom
domenomGAL4
ADPex21p
plazmid saaktivacijskom
domenomGAL4
ADPex21p
ko-transformacija u S. cerevisiae L40
LexA
SerRS Pex21p
Gal4ad
RNA-polimeraza II
gen pokazatelj (HIS3 ili lacZ)
ekspresija
filter-test na aktivnostβ-galaktozidaze aktivacija biljega HIS3
Ø
ScSerRS ScSerRS∆C13
ZmcSerRS
Zm18Sc13
Zm18Sc13Zm26Sc20
Zm26Sc20
Ø
ScSerRS ScSerRS∆C13
ZmcSerRS
Zm18Sc13
Zm18Sc13Zm26Sc20
Zm26Sc20
pAB151 pACTpex21
Slika 28: Provjera interakcije kimernih proteina Zm18Sc13 i Zm26Sc20 sustavom dvaju hibrida u soju kvasca L40. Gore: Ako protein ostvaruje interakciju s Pex21p, to dovodi do aktivacije gena-pokazatelja lacZ ili HIS3 Dolje lijevo: Aktivnost β-galaktozidaze - plavo obojenje detektirana je filter-testom samo s cjelovitim ScSerRS (pozitivna kontrola). Dolje desno: Na podlozi minimalnog medija bez histidina raste samo pozitivna kontrola (ScSerRS) uslijed aktivacije biljega HIS3. Kao negativna kontrola (Ø) korištene su stanice kvasca transformirane s pACTpex21 i praznim vektorom pAB151 (tj. prazan mamac). U oba slučaja testirana su dva neovisna klona za Zm18Sc13 i Zm26Sc20 nakon ko-transformacije vektorima pACTpex21 konstruktima u pAB151.
Rezultati su jednaki kao u sustavu in vitro: u sustavu dvaju hibrida aktivacija
oba gena pokazatelja zabilježena je samo s cjelovitim ScSerRS, dok krnji
ScSerRS∆C13 ili ZmcSerRS ne pokazuju interakciju s Pex21p (slika 28, dolje).
Western-analizom potvrđeno je da su svi fuzijski proteini s LexA bili eksprimirani
(slika 29) u soju korištenom u sustavu dvaju hibrida. Začudo, transplantacija
produžetka s C-kraja kvaščeve SerRS u kukuruznu SerRS nije omogućila vezanje
Pex21p na kimerne proteine, što znači da produžetak ScSerRS nije samodostatna,
Rezultati
83
odnosno samostalna vezna regija za Pex21p, već da u vezanju Pex21p na ScSerRS
sudjeluju dodatne regije katalitičke ili N-terminalne domene.
Slika 29: Western-analiza proteinskih ekstrakata kvaščevog soja L40, transformiranog derivatima plazmida pAB151. Korištena su primarna antitijela na LexA. 1 - pAB151 (LexA; prazan plazmid), 2 - ScSerRS, 3 - ScSerRS∆C13, 4 - ZmcSerRS, 5, 6 - Zm18Sc13, 7, 8 - Zm26Sc20.
85
5. RASPRAVA
5.1. Utjecaj proksimalne regije produžetaka na C-kraju eukariotskih SerRS na njihovu strukturu
5.1.1. Proksimalna regija produžetaka na C-kraju eukariotskih seril-
tRNA-sintetaza neophodna je za njihovu stabilnost
Prethodna istraživanja [5, 6] pokazala su da uklanjanje produžetka kvaščeve
SerRS drastično utječe na stabilnost krnje ScSerRS∆C20 in vivo i in vitro, katalitička
svojstva i funkcionalnost in vivo. Stabilnost krnjih deletanata i mutanata ScSerRS i
ZmcSerRS korištenih u ovom radu jasno pokazuju da je destabilizacija ScSerRS∆C20
i ZmcSerRS∆C26 posljedica uklanjanja (ili zadiranja) u proksimalne regije, kojima su
produžeci vezani na katalitičku domenu. Uklanjanje ili mutiranje proksimalne regije
rezultira niskom ekspresijom i nemogućnošću dobivanja rekombinantnih proteina u
sustavima za prekomjernu ekspresiju, a in vivo onemogućuje komplementaciju
kvaščevog soja inaktiviranog gena za ScSerRS. S druge strane, deletanti kojima je
uklonjen gotovo cijeli produžetak (70 %), osim proksimalne regije, ne razlikuju se po
katalitičkim svojstvima ili termalnoj stabilnosti od cjelovitih enzima, a funkcionalni
su i in vivo. Zamjena proksimalne regije kukuruzne SerRS proksimalnim dijelom
produžetka kvaščeve SerRS u kimeri Zm26Sc20 daje funkcionalan protein, ali
smanjene termalne stabilnosti zbog razlika na razini primarne strukture produžetaka i
proksimalne regije.
Nažalost, drastičan utjecaj proksimalne regije na stabilnost ScSerRS i
ZmcSerRS onemogućava detaljnije istraživanje njezine uloge zbog učinka "sve-ili-
ništa", odnosno nemogućnosti pripreme enzima izmijenjene proksimalne regije. U
ovom radu mapirana je proksimalna regija kao regija odgovorna za destabilizaciju
eukariotskih SerRS po uklanjanju produžetaka. U svrhu daljnjih istraživanja utjecaja
proksimalne regije na stabilnost eukariotskih SerRS trebalo bi pristupiti
konzervativnije, odnosno kroz manje izmjene proksimalnih regija, kao što su
postupne delecije pojedinačnih aminokiselina ili točkaste mutacije unutar proksimalne
regije, te primijeniti egzaktnije biofizičke metode (cirkularni dikroizam, pretražnu
diferencijalnu kalorimetriju - DSC i sl.).
Rasprava
86
5.1.2. Smještaj C-terminalnog produžetka u prostornoj strukturi SerRS
U kristalnim strukturama SerRS bakterijskog tipa iz T. termophilus, A.
aeolicus i P. horikoshii, C-krajevi polipeptidnih lanaca završavaju blizu dodirne
površine podjedinica (slika 30). Budući da prostorna struktura eukariotskih SerRS nije
poznata, ne zna se kako su C-terminalni produžeci smješteni unutar strukture
eukariotskih SerRS. Budući da proksimalni dio produžetaka sadrži hidrofobne
aminokiseline, pretpostavljam da su tijekom evolucije eukariotskih SerRS
proksimalne regije umetnute u unutrašnjost proteina, možda upravo uvlačenjem
proksimalnog dijela na dodirnoj površini između podjedinica, te da su postale sastavni
i neophodan dio strukturne okosnice enzima, čije uklanjanje onda ima posljedicu
narušavanja globalne arhitekture enzima. Ostatak produžetaka, koji obuhvaća
hidrofilne i bazične aminokiseline, vjerojatno je izložen otapalu i dostupan za
interakciju s drugim makromolekulama, kao što je Pex21p. Slično je primijećeno kod
MetRS kvasca: delecija 185 od 193 aminokiselina dugačke dodatne domene na N-
kraju kvaščeve MetRS nije imalo nikakvog utjecaja na aktivnost ili stabilnost enzima,
dok nije uklonjeno zadnjih 8 aminokiselina dodatne N-terminale domene, što je
destabiliziralo enzim [106]. Kasnije se ispostavilo da ta domena predstavlja domenu
za vezanje Arc1p (poglavlje 2.2.4).
Slika 30: Smještaj C- i N-krajeva polipeptidnih lanaca kod bakterijskog tipa SerRS. Preklopljene su strukture SerRS iz bakterija T. termophilus (PDB zapis 1sry) i Aquifex aeolicus (2dq3), te arheje P. horikoshii (2dq0). Vezne domene za tRNA na N-kraju obojane su žutonarančasto, a katalitičke domene purpurnom i sivom bojom. Plavom bojom istaknuto je zadnjih 16 aminokiselina na C-kraju jednog od polipeptidnih lanca, a ružičastom bojom označeno je prvih 9 aminokiselina na N-kraju. Lijevo: Pogled na katalitičke domene duž osi simetrije drugog reda. Desno: Pogled na katalitičke domene i smještaj C- i N-kraja u odnosu na veznu domenu za tRNA i aktivno mjesto (istaknuto štapićastim prikazom analoga Ser-AMP-a u strukturi 2dq0 i 2dq3).
Da evolucijski (ne)očuvane dodatne ekstenzije ili insercije mogu biti presudne
za stabilnost enzima pokazuje i primjer metanogenog tipa SerRS. Motiv HTH
Rasprava
87
(poglavlje 2.1.2) predstavlja inserciju na razini primarne strukture svojstvenu
atipičnim SerRS, koju ne posjeduju SerRS bakterijskog tipa. Delecija karakterističnog
HTH-motiva ne narušava samo aminoacilacijsku aktivnost - budući da je motiv HTH
važan za pozicioniranje vezne domene za tRNA, već i vezanje cinka u aktivnom
mjestu i prvi korak aktivacije aminokiseline, jer u odsutnosti motiva HTH dolazi do
urušavanja globalne strukture katalitičke podjedinice [20].
O konformaciji hidrofilnog i bazičnog ostatka produžetka moguće je samo
nagađati. Kod mitohondrijske SerRS sisavaca (vidi poglavlje 2.1.5) produžetak na C-
kraju jedne podjedinice proteže se preko katalitičke domene susjedne podjedinice do
podnožja vezne domene za tRNA i značajno povećava dodirnu površinu između
podjedinica. Produžetak na C-kraju mitohondrijskih SerRS sisavaca slične je duljine
kao produžetak ScSerRS ili ZmcSerRS, ali potpuno je različit na razini primarne
strukture, te ima vrlo specijaliziranu ulogu u vezanju neobičnih mitohondrijskih
izoakceptora tRNASer netipične strukture. Računalna modeliranja [107] sugeriraju da
je produžetak na C-kraju ScSerRS dovoljno dugačak da se svija natrag prema
aktivnom mjestu iste podjedinice i da dolazi u blizinu petlje motiva 2, što bi objasnilo
njegov utjecaj, tj. promjene u katalitičkim svojstvima ScSerRS∆C20. Međutim,
modeliranje nekonzerviranih dijelova proteinskih struktura vrlo je nepouzdano, a
najnoviji kinetički podaci za ScSerRS, ZmcSerRS i njihove krnje oblike prezentirani
u ovom radu ne podupiru direktan utjecaj produžetaka na katalitička svojstva
eukariotskih SerRS.
5.1.3. Utjecaj histidinskog privjeska na svojstva rekombinantnih SerRS
Razmatranjem struktura bakterijskih SerRS i mogućeg smještaja C-
terminalnih produžetaka eukariotskih SerRS, primijećeno je da N-kraj polipeptidnih
lanaca SerRS smješten između vezne domene za tRNA i katalitičke domene (slika 30,
desno). To bi moglo objasniti zašto SerRS često ne toleriraju histidinski privjesak na
N-kraju - histidinski privjesak ukliješten je između dviju domena i vjerojatno
interferira s njihovim strukturiranjem. Hoće li doći do narušavanja strukture ovisi o
pojedinom slučaju: kvaščeva SerRS uopće ne tolerira dodavanje histidinskog
privjeska na N-kraj, dok su SerRS iz E. coli [21] ili bakterijski tip SerRS iz
Methanosarcine barkeri [ 108 ] s histidinskim privjeskom katalitički aktivne.
Kukuruzna SerRS može akomodirati histidinski privjesak koji joj je pridodan PCR-
Rasprava
88
om (MHHHHHHAG-) kod konstrukata priređenih u kvascu, ali ne i histidinski
privjesak kodiran vektorom pET28 (MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMAR-) kod
konstrukata eksprimiranih u E. coli. Ta dva histidinska privjeska imaju različite
poveznice (eng. linker) kojima su vezani na N-kraj ZmcSerRS, pa je to isto mogući
uzrok razlikama između ZmcSerRS s histidinskim privjeskom proizvedenih u kvascu
i E. coli (slika 16).
Čini se da bi za SerRS prikladnije bilo smjestiti histidinski privjesak na C-kraj,
ali razvidno je zašto to nije bila opcija u ovom radu.
5.1.4. Utjecaj C-terminalnog produžetka na kinetička svojstva SerRS
Unatoč bazičnom karakteru produžetaka eukariotskih SerRS, uklanjanje
bazičnog dijela produžetka nije utjecalo na kinetičke parametre krnjih oblika ScSerRS
i ZmcSerRS prema tRNA, koji imaju jednaka katalitička svojstva kao cjeloviti enzimi
(tablica 8). Stoga se uloga produžetaka kao pomoćnih veznih domena za tRNA
(poglavlje 2.2.1) ne čini vjerojatna. Iako je utjecaj na kinetičke parametre (tj. kcat i KM)
pomoćnih veznih domena za tRNA ponekad manji nego na vezanje tRNA, tj.
konstante disocijacije kompleksa aaRS i tRNA, on u pravilu postoji. Utjecaj na
nastajanje kompleksa s tRNA krnjih varijanti ScSerRS i ZmcSerRS nije primijećen ni
u elektroforezi pri nativnim uvjetima (slika 22), što također isključuje mogućnost da
produžeci značajnije doprinose vezanju eukariotskih SerRS i tRNASer.
Prijašnja istraživanja [5, 6] pokazala su da ScSerRS∆C20 ima četiri puta veći
KM za serin od cjelovitog ScSerRS, te izmijenjene katalitičke parametre u
aminoaciliranju tRNA. Pretpostavljeno je da izmijenjeni kinetički parametri i narušen
mehanizam prepoznavanja serina doprinose toksičnom utjecaju ScSerRS∆C20 in vivo.
Kod ScSerRS∆C13, ZmcSerRS∆C12 i ZmcSerRS∆C18 nije primijećen nikakav
utjecaj na kinetičke parametre (KM i kcat) za serin (tablica 10), iako je uklonjeno
gotovo 70 % produžetka i svi sljedovi za koje se smatralo da su funkcionalno
relevantni. To neslaganje moguće je jednostavno objasniti predloženim utjecajem
proksimalne regije na globalnu strukturu enzima: uklanjanje proksimalne regije u
slučaju ScSerRS∆C20 narušava strukturni integritet enzima i vjerojatno utječe na
njegovu sveukupnu konformaciju. Kod takvog enzima narušene strukture suptilne
konformacijske promjene pretpostavljene u tRNA-ovisnom prepoznavanju serina su
Rasprava
89
onemogućene, kroz posredan utjecaj proksimalne regije na globalnu strukturu enzima,
a ne direktnim sudjelovanjem produžetka u vezanju ili prepoznavanju supstrata i/ili
tRNA. Toksični utjecaji na rast stanica prilikom pokušaja pretjerane ekspresije
ScSerRS∆C20 također su možda posredni, jer biosinteza nestabilnog enzima praćena
njegovom brzom degradacijom predstavljaju velik teret za stanični aparat sinteze i
razgradnje proteina.
5.2. Uloga produžetka kvaščeve SerRS u vezanju peroksina Pex21p
Interakcija kvaščeve SerRS s peroksinom Pex21p uključenim u biogenezu
peroksisoma [109] otkrivena je pretragom kvaščeve biblioteke sustavom dvaju hibrida
sa ScSerRS kao mamcem [7], što je zanimljivo budući da se radi o proteinima
uključenim u nepovezane stanične procese. Pa ipak, interakcija je potvrđena u
različitim izvedenicama specifičnog vezanja ScSerRS na kromatografske smole s
imobiliziranim Pex21p [7, 8] i kompleks je dovoljno stabilan da bude izoliran in vitro
(slika 27). Izostanak interakcije Pex21p sa strukturno sličnim ZmcSerRS [8] (slika 27
i 28) dodatna je potvrda specifičnosti vezanja Pex21p i SerRS.
Poboljšava li Pex21p na neki način svojstva ScSerRS ili je interakcija sa
ScSerRS važna za funkcionalnost Pex21p ostaje nepoznanica. Pex21p ne veže tRNA
[8], prema tome ne predstavlja nespecifičnu veznu domenu za tRNA in trans poput
Arc1p ili p43 u multisintetaznom kompleksu. Trojni kompleks Pex21p, ScSerRS i
tRNASer detektiran je elektroforetski [8], i postoje naznake da bi vezanje tRNASer na
ScSerRS u trojnom kompleksu moglo biti olakšano, vjerojatno kroz konformacijske
promjene koje vezanje Pex21p inducira u ScSerRS, a ne direktnim sudjelovanjem
Pex21p u vezanju tRNA. Postoje naznake da Pex21p poboljšava katalitička svojstva
ScSerRS [7, 110]. U svakom slučaju, učinci Pex21p na katalitička svojstva ScSerRS
ili vezanje tRNA nisu veliki, a rigoroznu kinetičku i biokemijsku analizu Pex21p kao
modulatora aktivnosti ScSerRS koče teškoće u dobivanju rekombinantnog Pex21p. S
druge strane, detekcija trojnog kompleksa Pex21p, ScSerRS i tRNASer, te skroman (ili
nikakav) utjecaj na katalitička svojstva ScSerRS pokazuje da se vezna mjesta za
tRNASer i Pex21p na ScSerRS ne preklapaju. Stoga je interakcija između Pex21p i
ScSerRS možda značajna u biogenezi peroksisoma, npr. kao mehanizam regulacije
aktivnosti Pex21p, njegove stanične lokalizacije ili sl. U tom slučaju kompleksiranje
Rasprava
90
sa ScSerRS moglo bi za Pex21p sličnu ulogu kao maskiranje citokine aktivnosti p43
ugradnjom u multisintetazni kompleks [48, 49, 53], ili supresija angiogene i
antiangiogene aktivnosti humane TyrRS, odnosno TrpRS dodatnim domenama [74,
75]. Prema tom modelu, Pex21p bio bi "uskladišten" u kompleks sa ScSerRS, pri
čemu ne bi smetao ScSerRS u njezinom primarnoj ulozi, tj. serilaciji tRNASer.
U kontekstu biološke važnosti interakcije ScSerRS i Pex21p, zanimljivi su
rezultati komplementacija. Nedvojbeno je ustanovljeno da je produžetak kvaščeve
ScSerRS neophodan za interakciju s Pex21p [8] (slika 27 i 28). Međutim, narušavanje
interakcije s Pex21p delecijom C-terminalnog produžetka ne sprječava
komplementaciju krnjim ScSerRS∆C13. Isto tako, iako ZmcSerRS ne pokazuje
interakciju s Pex21p, također komplementira kvaščev soj inaktiviranog gena za SerRS.
Soj kvasca s inaktiviranim genom za Pex21p, stoga bez mogućnosti stvaranja
kompleksa ScSerRS i Pex21p, također je vijabilan [33], pa je očito da interakcija
ScSerRS i Pex21p nije esencijalna in vivo, barem pod uobičajenim uvjetima rasta.
Pex21p dakle nije esencijalni kofaktor ScSerRS in vivo. Zanimljivo je da
transplantacija produžetka kvaščeve SerRS u ZmcSerRS nije omogućila interakciju
kimernih proteina s Pex21p ni in vitro, s imobiliziranim Pex21p, ni in vivo u sustavu
dvaju hibrida. Produžetak ScSerRS očito nije autonomno i samodostatno vezno
mjesto za Pex21p, što znači da u vezanju Pex21p značajnu ulogu imaju ostale regije
ScSerRS.
5.2.1. Kompleks SerRS i Pex21p je osobitost kvasca S. cerevisiae?
Pex21p i funkcionalno redudantni Pex18p nisu evolucijski očuvani. Pretragom
anotiranih baza sekvenci (UniProt) i pretragom ostalih baza na temelju homologije
(NCBI Blast), Pex21p je pronađen u samo nekoliko srodnih vrsta kvasaca, porodice
Saccharomycetaceae (slika 31). Sličnost na razini primarne strukture je neočekivano
niska (18-23 % jednakih, 31-43 % sličnih aminokiselina) za proteine iz evolucijski
tako bliskih organizama. Očuvanost Pex18p još je i manja, što ne čudi ako je
funkcionalno redudantan s Pex21p. Pex21p i Pex18p su ko-receptori za Pex7p pri
unosu proteina sa signalnim slijedom tipa 2 (eng. peroxisome targeting signal 2;
skraćeno PTS2) u matriks peroksisoma [111]. Ulogu ko-receptora za Pex7p u srodnim
vrstama kvasaca Yarrowia lipolytica, Pichia pastoris, Hansenula polymorpha i
plijesni Neurospora crassa [ 112 ] preuzeo je Pex20p, a kod sisavaca Pex5pL.
Rasprava
91
Taksonomska ograničenost Pex21p i njegova slaba evolucijska očuvanost sugerira da
bi kompleks SerRS i Pex21p mogao biti ograničen na kvasac S. cerevisiae ili nekoliko
srodnih vrsta.
S.cerevisiae : MPSVCHTSPIEKIIQQ-----GHRIQNDSLIPSKRTKLAHTELTAHYATEDSHVEKHFLHNGSNFDGIDN--VRYQNQPSPLTFI : 78 C.glabrata : MSQYCAADPIQRMVSR-----KGPYLDTQQQRVYKHRSGTGHGTNIRQPTTGIVEATFLQNNSGMNAVHPTTLNVQTHNAHATGR : 80 K.lactis : -MSVCQTNPLNTLVSKSGYRFGQPNQHQQSIAQQQSRPRNNALDHQFSQFTGASGPSFAHPQHQQLPMAA--VVANATTAASTTS : 82 A.gossypii : -MSLCQGSAMQKLIAKT----EGPMAGVGRVGGFNRPSGGLGQSSAEQQLQARAGERASQNR---------FMAVLEPQRELGGR : 71 * 100 * 120 * 140 * 160 * S.cerevisiae : TPNNTVDSSDWVPQFSSMKIDDSLEFSSEYKRLYSNYESQQRLNSSRQHLPFKNCMIRKTSCTYPPQKTLRQQRQGNRDNPTDAF : 163 C.glabrata : TIAKSVDTNSWVNDFSSMKVQDPLEFADSYKNLYKQYEQKQFHNTVPAQCPRN----LYIPTVTRPQTTLNIVDHHEDKSSAVDQ : 161 K.lactis : NTATASDHHVWIDQFANMQVHDKTEFPTDYKQMYSQYEARGASYSMGAPVMVS-----HSQMFPRHQQSLMVNQLESQAYASSSA : 162 A.gossypii : MARGDGLQADWVRQFSSMQVEDPLAFSAEYQRAYAGYEQRQAARPAARVLGYGG--SMFMPTMPQQQLQQQVAPQQTAQAALQEA : 154 180 * 200 * 220 * 240 * S.cerevisiae : QFD----AEFQVLEREIQKERYEPITRRDEKWFDQDQSELQRIATDIVKCCTPPPSSASSSSTLSSSVESKLSESKFIQLMRNIS : 244 C.glabrata : LID----DEFEKIEEEVKDQ--------------NQKLEFQESAQSFIEICE------------RSQMKEKLQRSKFFQVMQKVS : 216 K.lactis : KLD----EQFAELERQVQDDEKEQQQDKDDDFHLKETSPLDEDQRQLKEAAQSIYTTLSDK---SSTTSSKFSNSKFLGLMRNIS : 240 A.gossypii : ELERYLEREFDVLEGELAPP--EVPEALSAPLLDHEQLGFQESAKAIYATLS------------APIHKDKFGASKFMGLMRQVS : 225 260 * 280 * 300 * 320 * S.cerevisiae : SGDVTLKKNADGNSASELFSSNNGELVGNRHIFVKDEIHKDILD---------------------------------------- : 288 C.glabrata : DGEATIRQDGENYVIR-------------------------------------------------------------------- : 232 K.lactis : DGVITLKKNPDEDKYTELYSPSTGETFGEEYFPVQDSVLGDPLDSIGDLSNMSSSEAAAKVYHNSV------------------ : 306 A.gossypii : TGDVTLSKSESG--YTGLHMTAGGEAVGAEYRAVTDEVVQVPEVAAALPLAGEERSLASQMEDLLNKVDIAGLSSNEAAMRILS : 307
Slika 31: Višestruko poravnavanje sekvenci Pex21p iz različitih vrsta kvasaca: Saccharomyces cerevisiae (P50091), Ashbya gossypii (Q75AS1), Candida glabrata (Q6FTX7), Kluyveromyces lactis (Q6CN41). Svi navedeni organizmi pripadaju porodici kvasaca Saccharomycetaceae. U zagradama su navedeni jedinstveni identifikatori sekvenci iz baze UniProt.
5.3. Smjernice za buduća istraživanja
Budući da su uloge dodatnih domena eukariotskih SerRS često višestruke,
moguće su nove, zasad neotkrivene uloge produžetaka eukariotskih SerRS, pored
sudjelovanja produžetka kvaščeve ScSerRS u vezanju Pex21p, tim više što Pex21p
nije evolucijski očuvan. Takve uloge lako je zamisliti, ali teško ih je sa sigurnošću
predvidjeti. Npr. iako produžeci ScSerRS i ZmcSerRS nisu uključene u vezanje tRNA,
možda su ipak važni za usmjereni prijenos tRNA ili interakciju s translacijskim
aparatom. Produžetak humane AspRS (poglavlje 2.2.4) usporava otpuštanje
aminoaciliranog produkta, sudjeluje u interakciji AspRS s elongacijskim faktorom
EF1A i omogućuje prijenos aminoacilirane tRNA na EF1A. Slično produžecima
eukariotskih SerRS, taj produžetak je kratak, obuhvaća samo 32 aminokiseline, i
također je hidrofilan. Sistematično su istraživane interakcije između aaRS sisavaca i
komponenata elongacijskih faktora [54] sustavom dvaju hibrida, ali SerRS je ostala
izvan mreže interakcija. Pretraga kvaščeve biblioteke sustavom dvaju hibrida sa
ScSerRS kao mamcem u kojoj je identificiran Pex21p [7] također nije uhvatila
elongacijske faktore kao potencijalne partnere, ali negativni rezultati u sustavu dvaju
hibrida nisu dokaz nepostojanja interakcije.
Rasprava
92
Moguće je da druge eukariotske SerRS stupaju u interakciju s nekim drugim
funkcionalnim analozima Pex21p, stoga je u sklopu tekućeg projekta na Zavodu za
biokemiju u planu pretraživanje biljne biblioteke cDNA iz uročnjaka (Arabidopsis
thaliana) sustavom dvaju hibrida, u potrazi za potencijalnim partnerom biljnih SerRS.
Potencijala za nove, dodatne uloge ili funkcije imaju posebno produžeci SerRS
kralješnjaka, koje su znatno dulje od produžetaka SerRS ostalih eukariota (slika 32).
H.sapiens : TEKGITVPEKLKEFMPPGLQELIPFVKPAPIEQEPSKKQKKQHEGS-KKKAAARDVTLENRLQNMEVTDA : 514M.musculus : AEKGIAVPEKLREFMPPGLQELIPFVKPAPIDQEPSKKQKKQHEGS-KKK--AKEVPLENQLQSMEVTEA : 512D.rerio : TEEGIIVPEPLKAFMPPGLTEIIKFVKPAPIDQETTKKQKKQQEGGKKKKHQGGDADLENKVENMSVNDS : 515D.melanogaster : TETGIKVPEPLKKYMPAKFQDEIPFVKPAPIDLELAAAEKQKGKKEKTKKDPAAG--------------- : 501C.elegans : TEEGINVPTAIQQWMPENYRTFIPFVKPAPIDEDAKKATGKK---------------------------- : 487Z.mays : KEDGVEVPKALQPYMG-GIE-FLPFKQPLDAKQAADSKSNKSKSKGNAA--------------------- : 458A.thaliana : REDGVDIPEVLQPFMG-GET-FLPFKAKP---VVADTKGKKSKA-------------------------- : 451S.cerevisiae : TEDGLVVPEVLRKYIP-GEPEFLPFVNELP-KNSTSSKDKKKKN-------------------------- : 462S.pombe : TPDGVNVPKVLQPYMG-GKT-FLPFTKELP-KNSTS---KKGKN-------------------------- : 450D.discoideum : TEGGITVPVPLRPYL--GKD-FIPFVKAAP-KQKAIPKQKTTTPEQK----------------------- : 451 Slika 32: Prikaz C-kraja eukariotskih SerRS. Produžetak svojstven eukariotskim SerRS označen je masnijim slovima i crnom strelicom. U poravnavanju su korištene sekvence SerRS kralješnjaka (Homo sapiens - P49591, Mus musculus - P26638, Danio rerio - Q6DRC0), beskralješnjaka (Drosophila melanogaster - NCBI Protein NP_608743, Caenorhabditis elegans - Q18678), biljaka (Zea mays - NCBI Nucleotide AY103609, Arabidopsis thaliana - Q39230), gljiva (Saccharomyces cerevisiae - P07284, Schizosaccharomyces pombe - O14018) i praživotinja (Dictyostelium discoideum - Q7KWQ2). Ako nije drukčije naznačeno, navedeni su identifikatori iz baze podataka UniProt.
Iako istraživanja opisana u ovoj disertaciji nisu pružila nedvosmislen odgovor
o ulozi eukariotskih SerRS, razjasnila su mnoge nejasnoće i pripremila teren za
daljnja istraživanja. Mapirana je regija produžetka presudna za stabilnost eukariotskih
SerRS i konstruirane su stabilne varijante krnjih enzima. Uhodane su metode
pročišćavanja rekombinantnih enzima. Usporedba dvije evolucijski udaljene SerRS
omogućila je provjeru i uopćavanje mnogih zaključaka; rezultati dobiveni sa ScSerRS,
ZmcSerRS i njihovim varijantama potpuno su konzistentni.
Sojevi kvasca u kojima je interakcija s Pex21p dokinuta komplementacijom s
krnjim ScSerRS∆C13 ili heterolognom ZmcSerRS mogli bi biti vrlo korisni u
daljnjem istraživanju značaja interakcije s Pex21p in vivo. Sojevi kvasca
komplementirani sa ScSerRS∆C13 i ZmcSerRS imaju potpuno funkcionalni Pex21p i
ti sojevi su na neki način komplementarni soju u kojem je interakcija onemogućena
inaktivacijom gena za Pex21p. Soj kvasca s inaktiviranim genom PEX21 dostupan je
u javnim kolekcijama sojeva.
93
6. ZAKLJUČCI Produžeci svojstveni eukariotskim SerRS su hidrofilnog i bazičnog karaktera, ali
divergentne primarne strukture.
Uklanjanje produžetka narušava strukturu eukariotskih SerRS jer je dio
produžetka do katalitičke domene (proksimalna regija) neophodan za stabilnost
enzima.
SerRS često ne toleriraju dodatak histidinskog privjeska na N-kraj, jer je N-kraj
uglavljen između vezne domene za tRNA i katalitičke domene.
Dizajnirani su stabilni krnji oblici SerRS kvasca i kukuruza deletiranog
produžetka.
Osmišljen je postupak za preparativnu izolaciju ukupne biljne tRNA.
SerRS kukuruza učinkovito aminoacilira heterologne tRNA kvasca i E. coli.
Delecija produžetka ne utječe na katalitička svojstva krnjih enzima.
Unatoč bazičnom karakteru, produžetak eukariotskih SerRS nije pomoćna vezna
domena za tRNA.
Produžetak eukariotskih SerRS nije esencijalan in vivo za stanice kvasca pod
uobičajenim uvjetima rasta. ScSerRS∆C20 i ZmcSerRS∆C26 ne
komplementiraju stanice kvasca s inaktiviranim genom za ScSerRS jer nisu
stabilni in vivo, što vjerojatno uzrokuje njihovu brzu degradaciju.
Produžetak kvaščeve SerRS je neophodan za interakciju s Pex21p, ali ne
predstavlja samostalno vezno mjesto za Pex21p.
95
7. LITERATURA
1. M. Ibba, D. Söll: Aminoacyl-tRNA synthesis. Annu. Rev. Biochem. 69 (2000)
617-50
2. C. R. Woese, G. J. Olsen, M. Ibba, D. Söll: Aminoacyl-tRNA Synthetases, the
Genetic Code, and the Evolutionary Process. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64
(2000) 202-236
3. G. Eriani, M. Delarue, O. Poch, J. Gangloff, D. Moras: Partition of tRNA
synthetases into two classes based on mutually exclusive sets of sequence
motifs. Nature 347 (1990), 203-206
4. S. Cusack: Eleven down and nine to go. Nat. Struct. Biol. 2 (1995) 824-831
5. I. Weygand-Đurašević, B. Lenhard, S. Filipić, D. Söll: The C-terminal
extension of yeast seryl-tRNA synthetase affects stability of the enzyme and
its substrate affinity. J. Biol. Chem. 271 (1996) 2455-2461
6. B. Lenhard, M. Praetorius-Ibba, S. Filipić, D. Söll, I. Weygand-Đurašević: C-
terminal truncation of yeast SerRS is toxic for Saccharomyces cerevisiae due
to altered mechanism of substrate recognition. FEBS Lett. 439 (1998) 235-240
7. S. Ročak, I. Landeka, I. Weygand-Đurašević: Identifying Pex21p as a protein
that specifically interacts with yeast seryl-tRNA synthetase. FEMS Microbiol.
Lett. 214 (2002) 101-106
8. V. Godinić, M. Močibob, S. Ročak, M. Ibba, I. Weygand-Đurašević: Peroxin
Pex21p interacts with the C-terminal noncatalytic domain of yeast seryl-tRNA
synthetase and forms a specific ternary complex with tRNASer. FEBS J. 274
(2007) 2788–2799
9. I. Weygand-Đurašević, S. Cusack: Seryl-tRNA Synthetases; u M. Ibba, C.
Francklyn, S. Cusack (ur.): The Aminoacyl-tRNA Synthetases. Landes
Biosciences, Georgetown (SAD), 2005., str. 177-192
10. S. Cusack, C. Berthet-Colominas, M. Härtlein, N. Nassar, R. Leberman: A
second class of synthetase structure revealed by X-ray analysis of Escherichia
coli seryl-tRNA synthetase at 2.5 Å. Nature 347 (1990) 249-255
Literatura
96
11. H. Belrhali, A. Yaremchuk, M. Tukalo, K. Larsen, C. Berthet-Colominas, R.
Leberman, B. Beijer, B.Sproat, J. Als-Nielsen, G. Grübel, J.-F. Legrand,
M.Lehmann, S. Cusack: Crystal Structures at 2.5 Angstrom Resolution of
Seryl-tRNA Synthetase complexed with Two Analogs of Seryl Adenylate,
Science 263 (1994) 1432-1436
12. S. Cusack, A. Yaremchuk, M. Tukalo: The crystal structure of the ternary
complex of T. thermophilus seryl-tRNA synthetase with tRNASer and a seryl-
adenylate analogue reveals a conformational switch in the active site, EMBO J.
15 (1996) 2834-2842
13. F. Borel, C. Vincent, R. Leberman, M. Härtlein: Seryl-tRNA synthetase from
Escherichia coli: implication of its N-terminal domain in aminoacylation
activity and specificity. Nucleic Acids Res. 22 (1994), 2963-2969
14. V. Biou, A. Yaremchuk, M. Tukalo, S. Cusack: The 2.9 Å crystal structure of
T. thermophilus seryl-tRNA synthetase complexed with tRNASer. Science 263
(1994) 1404-1410
15. Y. Itoh, S. Sekine, C. Kuroishi, T. Terada, M. Shirouzu, S. Kuramitsu, S.
Yokoyama: Crystallographic and mutational studies of seryl-tRNA synthetase
from the archaeon Pyrococcus horikoshii. RNA Biol. 5 (2008) 169-177
16. H. S. Kim, U. C. Vothknecht, R. Hedderich, I. Celic, D. Söll: Sequence
divergence of seryl-tRNA synthetases in archaea. J. Bacteriol. 180 (1998)
6446-6449
17. S. Bilokapić, T. Maier, D. Ahel, I. Gruić-Sovulj, D. Söll, I. Weygand-
Đurašević, N. Ban: Structure of the unusual seryl-tRNA synthetase reveals a
distinct zinc-dependent mode of substrate recognition. EMBO J. 25 (2006)
2498-2509.
18. S. Bilokapić, N. Ban, I. Weygand-Đurašević: Seryl-tRNA Synthetases:
Enzymes with Multiple Personalities. Croat. Chem. Acta 82 (2009) 493-501
19. J. Jarić, S. Bilokapić, S. Lesjak, A. Crnković, N. Ban, I. Weygand-Đurašević:
Identification of amino acids in the N-terminal domain of atypical
Literatura
97
methanogenic-type Seryl-tRNA synthetase critical for tRNA recognition. J.
Biol. Chem. 284 (2009) 30643-30651
20. S. Bilokapić, N. Ivić, V. Godinić-Mikulčić, I. Piantanida, N. Ban, I. Weygand-
Đurašević: Idiosyncratic helix-turn-helix motif in Methanosarcina barkeri
seryl-tRNA synthetase has a critical architectural role. J. Biol. Chem. 284
(2009) 10706-10713
21. D. Ahel, D. Slade, M. Močibob, D. Söll, I. Weygand-Đurašević: Selective
inhibition of divergent seryl-tRNA synthetases by serine analogues. FEBS.
Lett. 579 (2005) 4344-4348
22. D. Sareen, M. Steffek, G. L. Newton, R. C. Fahey: ATP-dependent L-
cysteine:1D-myo-inosityl 2-amino-2-deoxy-alpha-D-glucopyranoside ligase,
mycothiol biosynthesis enzyme MshC, is related to class I cysteinyl-tRNA
synthetases. Biochemistry 41 (2002) 6885-6890
23. F. Fan, M. W. Vetting, P. A. Frantom, J. S. Blanchard: Structures and
mechanisms of the mycothiol biosynthetic enzymes. Curr. Opin. Chem. Biol.
13 (2009) 444-452
24. I. Weygand-Đurašević, N. Ban, D. Jahn, D. Söll: Yeast seryl-tRNA synthetase
expressed in Escherichia coli recognizes bacterial serine-specific tRNA in vivo.
Eur. J. Biochem. 214 (1993) 869-877
25. J. Rokov, D. Söll, I. Weygand-Đurašević: Maize mitochondrial seryl-tRNA
synthetase recognizes Escherichia coli tRNASer in vivo and in vitro. Plant Mol.
Biol. 38 (1998) 497-502
26. J. Rokov-Plavec, S. Lesjak, I. Landeka, I. Mijaković, I. Weygand-Đurašević:
Maize Seryl-tRNA Synthetase: Specificity of Substrate Recognition by the
Organellar Enzyme. Arch. Biochem. Biophys. 397 (2002) 40-50
27. B. Lenhard, S. Filipić, I. Landeka, I. Škrtić, D. Söll, I. Weygand-Đurašević:
Defining the Active Site of Yeast Seryl-tRNA Synthetase. J. Biol. Chem. 272
(1997) 1136-1141
Literatura
98
28. B. Lenhard, O. Orellana, M. Ibba, I. Weygand-Đurašević: tRNA recognition
and evolution of determinants in seryl-tRNA synthesis. Nucleic Acids Res. 27
(1999) 721-729
29. A. Soma, H. Himeno: Cross-species aminoacylation of tRNA with a long
variabile arm between Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae.
Nucleic Acids Res.26 (1998) 4374-4381
30. S. Bilokapić, D. Korenčić, D. Söll, I. Weygand-Đurašević: The unusual
methanogenic seryl-tRNA synthetase recognizes tRNASer species from all
three kingdoms of life. Eur. J. Biochem. 271 (2004) 694-702
31. J. Rokov-Plavec, S. Bilokapić, I. Gruić-Sovulj, M. Močibob, F. Glavan, M.
Brgles, I. Weygand-Đurašević: Unilateral flexibility in tRNASer recognition by
heterologous seryl-tRNA synthetases. Period. Biol. 106 (2004) 147-154
32. I. Gruic-Sovulj, I. Landeka, D. Söll, I. Weygand-Đurašević: tRNA-dependent
amino acid discrimination by yeast seryl-tRNA synthetase. Eur. J. Biochem.
269 (2002) 5271-529
33. P. E. Purdue, X. Yang, P. B. Lazarow: Pex18p and Pex21p, a novel pair of
related peroxins essential for peroxisomal targeting by the PTS2 pathway. J.
Cell Biol. 143 (1998) 1859-1869.
34. S. Chimnaronk, M. Gravers Jeppesen, T. Suzuki, J. Nyborg, K. Watanabe:
Dual-mode recognition of noncanonical tRNAs(Ser) by seryl-tRNA synthetase
in mammalian mitochondria. EMBO J. 24 (2005) 3369-3379
35. M. Francin, M. Kaminska, P. Kerjan, M. Mirande: The N-terminal domain of
mammalian lysyl-tRNA synthetase is a functional tRNA-binding domain. J.
Biol. Chem. 277 (2002) 1762-1769
36. M. Lazard, M Mirande, JP Waller: Expression of the aminoacyl-tRNA
synthetase complex in cultured Chinese hamster ovary cells. Specific
derepression of the methionyl-tRNA synthetase component upon methionine
restriction. J. Biol. Chem. 262 (1987) 3928-3987
Literatura
99
37. C.-C. Wang, A.J. Morales, P. Schimmel: Functional redundancy in the
nonspecific RNA binding domain of a class I tRNA synthetase. J. Biol. Chem.
275 (2000) 17180-17186
38. C.-C. Wang, P. Schimmel: Species Barrier to RNA recognition Overcome
with Nonspecific RNA binding domains. J. Biol. Chem. 274 (1999) 16508-
16512
39. E. F. Whelihan, P. Schimmel: Rescuing an essential enzyme–RNA complex
with a non-essential appended domain. EMBO J. 16 (1997) 2968-2974
40. S.W. Ludmerer, D. J.Wright, P. Schimmel: Purification of glutamine tRNA
synthetase from Saccharomyces cerevisiae. A monomeric aminoacyl-tRNA
synthetase with a large and dispensable NH2-terminal domain. J. Biol. Chem.
268 (1993) 5519-5523
41. S.W. Ludmerer, P. Schimmel: Construction and analysis of deletions in the
amino terminal extension of glutamine tRNA synthetase of Saccharomyces
cerevisiae. J. Biol. Chem. 262 (1987) 10807-10813
42. C.-P. Chang, G. Lin, S.-J. Chen, W.-C. Chiu, W.-H. Chen, C.-C. Wang:
Promoting the Formation of an Active Synthetase/tRNA Complex by a
Nonspecific tRNA-binding Domain. J. Biol. Chem. 283 (2008) 30699-30706
43. W. C. Chiu , C. P. Chang, C. C. Wang: Evolutionary basis of converting a
bacterial tRNA synthetase into a yeast cytoplasmic or mitochondrial enzyme. J.
Biol. Chem. 284 (2009) 23954-23960
44. M. Kaminska, V. Shalak, M. Mirande: The appended C-domain of human
methionyl-tRNA synthetase has a tRNA-sequestering function. Biochemistry
40 (2001) 14309-14316
45. E.-J. Jeong, G.-S. Hwang, K.-H. Kim, M.-J. Kim, S. Kim, K.-S. Kim:
Structural analysis of multifunctional peptide motifs in human bifunctional
tRNA synthetase: identification of RNA-binding residues and functional
implications for tandem repeats. Biochemistry 39 (2000) 15775-15782
Literatura
100
46. B. Cahuzac, E. Berthonneau, N. Birlirakis, E. Guittet, M. Mirande: A recurrent
RNA-binding domain is appended to eukaryotic aminoacyl-tRNA synthetases.
EMBO J. 19 (2000) 445-452
47. M. Mirande: Multi-Aminoacyl-tRNA Synthetase Complexes; u M. Ibba, C.
Francklyn, S. Cusack (ur.): The Aminoacyl-tRNA Synthetases. Landes
Biosciences, Georgetown (SAD), 2005., str. 298-308
48. S. W. Lee, B. H. Cho, S. G. Park, S. Kim: Aminoacyl-tRNA synthetase
complexes: beyond translation. J Cell Sci. 117 (2004) 3725-3734
49. J. M. Han, J. Y. Kim, S. Kim: Molecular network and functional implications
of macromolecular tRNA synthetase complex. Biochem. Biophys. Res.
Commun. 303 (2003) 985-993
50. L. Guigou, V. Shalak, M. Mirande: The tRNA-Interacting Factor p43
Associates with Mammalian Arginyl-tRNA Synthetase but Does Not Modify
Its tRNA Aminoacylation Properties. Biochemistry 43 (2004) 4592-4600
51. J.-C. Robinson, P. Kerjan, M. Mirande: Macromolecular Assemblage of
Aminoacyl-tRNA Synthetases: Quantitative Analysis of Protein-Protein
Interactions and Mechanism of Complex Assembly. J. Mol. Biol. 304 (2000)
983-994
52. S. B. Rho, M. J. Kim, J. S. Lee, W. Seol, H. Motegi, S. Kim, K. Shiba:
Genetic dissection of protein-protein interactions in multi-tRNA synthetase
complex. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (1999) 4488-4493
53. S. G. Park, K. L. Ewalt, S. Kim: Functional expansion of aminoacyl-tRNA
synthetases and their interacting factors: new perspectives on housekeepers.
Trends Biochem. Sci. 30 (2005) 569–574
54. J. S. Lee, S. G. Park, H. Park, W. Seol, S. Lee, S. Kim: Interaction Network of
Human Aminoacyl-tRNA Synthetases and Subunits of Elongation Factor 1
Complex. Biochem. Biophys. Res. Commun. 291 (2002) 158-164
55. R. Stapulionis, M. P. Deutscher: A channeled tRNA cycle during mammalian
protein synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (1995) 7158-7161
Literatura
101
56. S. V. Kyriacou, M. P. Deutscher: An important role for the multienzyme
aminoacyl-tRNA synthetase complex in mammalian translation and cell
growth. Mol. Cell 29 (2008) 419-27
57. B. S. Negrutskii, V. F. Shalak, P. Kerjan, A. V. El’skaya, M. Mirande:
Functional Interaction of Mammalian Valyl-tRNA Synthetase with Elongation
Factor EF-1α in the Complex with EF-1H J. Biol. Chem. 274 (1999) 4545-
4550
58. G. Bec, P. Kerjan, J. P. Waller: Reconstitution in vitro of the valyl-tRNA
synthetase-elongation factor (EF) 1 beta gamma delta complex. Essential roles
of the NH2-terminal extension of valyl-tRNA synthetase and of the EF-1 delta
subunit in complex formation. J. Biol. Chem. 269 (1994) 2086-2092
59. V. S. Reed, M. E. Wastney, D. C. Yang: Mechanisms of the transfer of
aminoacyl-tRNA from aminoacyl-tRNA synthetase to the elongation factor 1
alpha. J. Biol. Chem. 269 (1994) 32932-32936
60. V. S. Reed, D. C. Yang: Characterization of a novel N-terminal peptide in
human aspartyl-tRNA synthetase. Roles in the transfer of aminoacyl-tRNA
from aminoacyl-tRNA synthetase to the elongation factor 1 alpha. J. Biol.
Chem. 269 (1994) 32937-32941
61. G. Simos, A. Segref, F. Fasiolo, K. Hellmuth, A. Shevchenko, M. Mann, E. C.
Hurt: The yeast protein Arc1p binds to tRNA and functions as a cofactor for
the methionyl- and glutamyl-tRNA synthetases. EMBO J. 15 (1996) 5437-
5448
62. M. A. Swairjo, A. J. Morales, C. C. Wang, A. R. Ortiz, P. Schimmel: Crystal
structure of trbp111: a structure-specific tRNA-binding protein. EMBO J. 19
(2000) 6287-6298
63. K. Deinert, F. Fasiolo, E. C. Hurt, G. Simos: Arc1p Organizes the Yeast
Aminoacyl-tRNA Synthetase Complex and Stabilizes Its Interaction with the
Cognate tRNAs. J. Biol. Chem. 276 (2001) 6000-6008
Literatura
102
64. K. Galani, H. Großhans, K. Deinert, E. C. Hurt, G. Simos: The intracellular
location of two aminoacyl-tRNA synthetases depends on complex formation
with Arc1p. EMBO J. 20 (2001) 6889-6898
65. H. Simader, M. Hothorn, C. Köhler, J. Basquin, G. Simos, D. Suck: Structural
basis of yeast aminoacyl-tRNA synthetase complex formation revealed by
crystal structures of two binary sub-complexes. Nucleic Acids Res. 34 (2006)
3968-3979
66. J.-S. Graindorge, B. Senger, D. Tritch, G. Simos, F. Fasiolo: Role of Arc1p in
the modulation of yeast glutamyl-tRNA synthetase activity. Biochemistry 44
(2005) 1344-1352
67. M.-P. Golinelli-Cohen, M. Mirande: Arc1p is required for cytoplasmic
confinement of synthetases and tRNA. Mol. Cell Biochem. 300 (2007) 47–59
68. M. Kaminska, M. Deniziak, P. Kerjan, J. Barciszewski, M. Mirande: A
recurrent general RNA binding domain appended to plant methionyl-tRNA
synthetase acts as a cis-acting cofactor for aminoacylation. EMBO J. 19 (2000)
6908–6917
69. S. Blanquet, T. Crépin, Y. Mechulam, E. Schmitt: Methionyl-tRNA
Synthetases; u M. Ibba, C. Francklyn, S. Cusack (ur.): The Aminoacyl-tRNA
Synthetases. Landes Biosciences, Georgetown (SAD), 2005., str. 47-58
70. M. Frugier, L. Moulinier, R. Giegé: A domain in the N-terminal extension of
class IIb eukaryotic aminoacyl-tRNA synthetases is important for tRNA
binding. EMBO J. 19 (2000) 2371-2380
71. M. Frugier, R. Giegé: Yeast aspartyl-tRNA synthetase binds specifically its
own mRNA. J. Mol. Biol. 331 (2003) 375-383
72. M. Ryckelynck, B. Masquida, R. Giegé, M. J. Frugier: An intricate RNA
structure with two tRNA-derived motifs directs complex formation between
yeast aspartyl-tRNA synthetase and its mRNA. J. Mol. Biol. 354 (2005) 614-
629
Literatura
103
73. M. Frugier, M. Ryckelynck, R. Giegé: tRNA-balanced expression of a
eukaryal aminoacyl-tRNA synthetase by an mRNA-mediated pathway. EMBO
Rep. 6 (2005) 860-865
74. X. L. Yang, P. Schimmel, K. L. Ewalt: Relationship of two human tRNA
synthetases used in cell signaling.Trends Biochem. Sci. 29 (2004) 250-256.
75. K. L. Ewalt, P. Schimmel: Activation of angiogenic signaling pathways by
two human tRNA synthetases. Biochemistry 41 (2002) 13344-13349
76. H. Fukui, R. Hanaoka, A. Kawahara: Noncanonical activity of seryl-tRNA
synthetase is involved in vascular development. Circ. Res. 104 (2009) 1253-
1259
77. W. Herzog, K. Müller, J. Huisken, D. Y. Stainier: Genetic evidence for a
noncanonical function of seryl-tRNA synthetase in vascular development.,
Circ. Res. 104 (2009) 1260-1266
78. I. Gruić-Sovulj, J. Jarić, M. Dulić, M. Cindrić, I. Weygand-Đurašević:
Shuffling of Discrete tRNASer Regions Reveals Differently Utilized Identity
Elements in Yeast and Methanogenic Archaea. J. Mol. Biol. 361 (2006) 128-
139
79. J. Sambrook, D. Russell: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3. izdanje,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001., str. A3.7
80. pET System manual, 11th ed (2006), Novagen
81. pET-28a-c(+) Vector Map, Novagen Technical Bulletin TB074 12/98
82. G. Loison: Production of foreign protein at high level; u J. R. Johnston (ur.):
molecular Genetics of Yeast, A Practical Approach. IRL Press, Oxford (GB),
1994, str. 161-180
83. A. B. Vojtek, S. M. Hollenberg, J. A. Cooper: Mammalian Ras interacts with
the serine/threonine kinase Raf. Cell 74 (1993) 205-214
84. C. Hadfield: Construction of cloning and expression vectors; u J. R. Johnston
(ur.): Molecular Genetics of Yeast, A Practical Approach. IRL Press, Oxford
(GB), 1994, str. 17-48
Literatura
104
85. S. J. Elledge, R. W. Davis: A family of versatile centromeric vectors designed
for use in the sectoring-shuffle mutagenesis assay in Saccharomyces
cerevisiae. Gene 70 (1988) 303-312
86. T. Vernet, D. Dignard, D. Y. Thomas: A family of yeast expression vectors
containing the phage f1 intergenic region. Gene 52 (1987) 225-233.
87. M. Bradford: A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilising principle of protein-dye binding. Analyt.
Biochem. 72 (1976) 248-254
88. J. Heukeshoven, R. Dernick: Simplified method for silver stainig of proteins in
polyacrylamide gels and the mechanism of silver staining. Electrophoresis 6
(1985) 103-112
89. J. Rokov, I. Weygand-Đurašević: Seryl-tRNA synthesis in maize. Period. Biol.
101 (1999) 137-142
90. J. Sambrook, D. W. Russel: Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd ed.,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001, str. 13.1-13.62.
91. R. H. Schiestl , R. D. Gietz: High efficiency transformation of intact cells
using single stranded nucleic acids as a carrier. Curr. Genet. 16 (1989) 339-
346
92. G. von Ehrenstein: Isolation of sRNA from intact Escherichia coli cells. Meth.
Enzymol. 12 (1967) 588-596
93. A. D. Kelmers, C. W. Hancher, E. F. Phares, G. David Novelli: Large-scale
fermentation of Escherichia coli and recovery of transfer ribonucleic acids.
Meth. Enzymol. 20C (1971) 3-9.
94. R. W. Holley: Isolation of sRNA from intact yeast cells. Meth. Enzymol. 12A
(1967), 596-598.
95. H. Raczniak, H. D. Becker, B. Min, D. Söll: A Single Amidotransferase Forms
Asparaginyl-tRNA and Glutaminyl-tRNA in Chlamydia trachomatis. J. Biol.
Chem. 276 (2001) 45862-45867.
Literatura
105
96. C. S. Francklyn, E. A. First, J. J. Perona, Y.-M. Hou: Methods for kinetic and
thermodynamic analysis of aminoacyl-tRNA synthetases. Methods 44 (2008)
100-118
97. R. K. Scopes: Protein purification, principles and practice. Springer-Verlag
New York Inc., 1982, str. 61-63
98. J. D. Boeke, J. Trueheart, G. Natsoulis, G. R. Fink: 5-Fluoroorotic acid as a
selective agent in yeast molecular genetics. Meth. Enzymol., 154 (1987) 164-
175
99. J. D. Boeke, F. LaCroute, G. R. Fink: A positive selection for mutants lacking
orotidine-5'-phosphate decarboxylase activity in yeast: 5-fluoro-orotic acid
resistance. Mol. Gen. Genet. 197 (1987) 345-346
100. J. F. Milligan, O. C. Uhlenbeck: Synthesis of small RNAs using T7 RNA
polymerase. Meth. Enzymol. 180 (1989) 51-62
101. E. Cayama, A. Yépez, F. Rotondo, E. Bandeira, A. C. Ferreras, F. J. Triana-
Alonso: New chromatographic and biochemical strategies for quick
preparative isolation of tRNA. Nucleic Acids Res. 28 (2000) e64
102. S. Riberio, S. Nock, M. Sprinzl: Purification of aminoacyl-tRNA by affinity
chromatography on immobilized Thermus thermophilus EF-Tu·GTP Anal.
Biochem. 228 (1995) 330-335
103. M. Močibob, J. Rokov-Plavec: Izdvajanje ukupne tRNA, u A. Ambiović-
Ristov (ur.): Metode u molekularnoj biologiji, Institut Ruđer Bošković, Zagreb,
2007, str. 265-271.
104. R. S. Sikorski, J. D. Boeke: In vitro mutagenesis and plasmid shuffling: From
cloned gene to mutant yeast. Meth. Enzymol. 194 (1991) 302-318
105. P. Schimmel, C.-C. Wang: Getting tRNA synthetases into the nucleus. 24
(1999) 127-128
106. P. Walter, I. Weygand-Đurašević, A. Sanni, J.-P. Ebel, F. Fasiolo: Deletion
analysis in the amino-terminal extension of methionyl-tRNA synthetase from
Literatura
106
Saccharomyces cerevisiae shows that a small region is important for the
activity and stability of the enzyme. J. Biol. Chem. 264 (1989) 17126-17130
107. B. Lenhard: Seril-tRNA-sintetaza iz kvasca Saccharomyces cerevisiae:
evolucijske prilagodbe i mehanizam djelovanja. Doktorska disertacija,
Sveučilište u Zagrebu 1999.
108. D. Korenčić, C. Polycarpo, I. Weygand-Đurašević D. Söll: Differential modes
of transfer RNASer recognition in Methanosarcina barkeri. J. Biol. Chem. 279
(2004) 48780-48786
109. J. J. Smith, J. D. Aitchison: Regulation of peroxisome dynamics. Curr. Opin.
Cell Biol. 21 (2009) 119-126
110. I. Weygand-Đurašević, I. Gruić-Sovulj, S. Ročak, I. Landeka: The accuracy of
seryl-tRNA synthesis. Food Technol. Biotechnol. 40 (2002) 247-253
111. L.-A. Brown, A. Baker: Shuttles and cycles: transport of proteins into the
peroxisome matrix (Review). Mol. Membr. Biol. 25 (2008) 363-375
112. M. Sichting, A. Schell-Steven, H. Prokisch, R. Erdmann, H. Rottensteiner:
Pex7p and Pex20p of Neurospora crassa function together in PTS2-dependent
protein import into peroxisomes. Mol. Biol. Cell 14 (2003) 810-821
107
8. POPIS KRATICA
(d)ATP (deoksi)adenozin-5'-trifosfat 3-AT 3-amino-1,2,4-triazol 5-FOA 5-fluoroorotat aa aminokiselina; aminoacil- aa-AMP aminoacil-adenilat aaRS aminoacil-tRNA-sintetaza APS amonijev peroksodisulfat BSA serumski albumin goveda cpm counts per minute; broj otkucaja u minuti pri scintilacijskom mjerenju
radioaktivnosti DEAE-celuloza dietilaminoetil-celuloza DTT ditiotreitol EDTA etilendiamintetraoctena kiselina EF1A eukariotski elongacijski faktor 1A eng. engleski FPLC Fast Protein Liquid Chromatography HEPES N-(2-hidroksietil)piperazin-N'-2-(etansulfonska kiselina) His-tag histidinski privjesak (MHHHHHHAG- ili MGSSHHHHHHSSGLVPR
GSHMAR-) IPTG izopropil-β-D-tiogalaktopiranozid kcat obrtni broj Kd konstanta disocijacije KM konstanta Michaelis-Menten LB Luria-Bertani medij; kompletni medij za uzgoj E. coli MES 2-(N-morfolino)etansulfonska kiselina Ni-NTA nikal(II)-nitrilotrioctena kiselina NP-40 Nonident P-40 OD600 gustoća mikrobioloških kultura, mjerena spektrofotometrijski pri
valnoj duljini 600 nm PCR lančana reakcija polimeraze PEG 4000 polietilenglikol 4000 PMSF fenilmetilsulfonil-fluorid POPOP 1,4-bis(2-(4-metil-5-fenil)oksazolil)benzen PPi pirofosfat, P2O7
4- PPO 2,5-difeniloksazol PTS-2 signalni slijed za unos proteina u peroksisome, tipa 2 (eng. peroxisome
targeting signal 2) SAP alkalna fosfataza iz škampa ScSerRS citosolna seril-tRNA-sintetaza kvasca Saccharomyces cerevisiae (za
krnje inačice vidi sliku 17) SDS natrijev dodecilsulfat SDS-PAGE elektroforeza na poliakrilamidnom gelu u prisutnost natrijevog
dodecilsulfata SerRS seril-tRNA-sintetaza SES1 gen za citosolnu seril-tRNA-sintetazu kvasca S. cerevisiae
Popis kratica
108
t50 temperatura pri kojoj se gubi 50 % enzimske aktivnosti TCA trikloroctena kiselina TEMED N,N,N’,N’-tetrametiletilendiamin Tris tris(hidroksimetil)-aminometan tRNAaa transfer RNA za određenu aminokiselinu tRNASer transfer RNA za serin X-gal 5-brom-4-klor-3-hidroksiindolil-β-galaktopiranozid YNB Yeast Nitrogen Base without amino acids; dodatak minimalnim
medijima za kvasac; izvor dušika, vitamina i elemenata u tragovima YPD, YPAD kompletni medij za uzgoj kvasca Saccharomyces cerevisiae ZmcSerRS citosolna seril-tRNA-sintetaza kukuruza Zea mays (za krnje i mutirane
inačice vidi sliku 17) Aminokiseline Ala A alanin Arg R arginin Asn N asparagin Asp D aspartat Cys C cistein Gln Q glutamin Glu E glutamat Gly G glicin His H histidin Ile I izoleucin Leu L leucin Lys K lizin Met M metionin Phe F fenilalanin Pro P prolin Ser S serin Thr T treonin Trp W triprofan Tyr Y tirozin Val V valin
109
9. ŽIVOTOPIS Rođen sam 27. kolovoza 1979. godine u Puli, Republika Hrvatska. Nakon
srednjoškolskog obrazovanja (Srednja škola i opća gimnazija Jurja Dobrile u Pazinu;
program opće gimnazije), 1997. godine upisao sam studij kemije na Prirodoslovno-
matematičkom fakultetu u Zagrebu. Diplomirao sam 2002. godine s radnjom
"Elektroforeza u istraživanju kompleksa seril-tRNA-sintetaza s tRNASer".
Od rujna 2002. godine zaposlen sam kao znanstveni novak na radnom mjestu
asistenta na Zavodu za biokemiju Kemijskog odsjeka Prirodoslovno-matematičkog
fakulteta. Kao asistent sudjelovao sam u nastavi brojnih kolegija i laboratorijskih
praktikuma. Neposredni sam voditelj 4 diplomska rada.
U okviru međunarodne suradnje, od 14. travnja do 31. lipnja 2009. godine
boravio sam na institutu ETH (Eidgenössiche Technische Hochschule) u Zürichu,
Švicarska, u laboratoriju prof. Nenada Bana.
Znanstvene publikacije
1. M. Močibob, I. Weygand-Đurašević: The proximal region of a noncatalytic
eukaryotic seryl-tRNA synthetase extension is required for protein stability in
vitro and in vivo. Arch. Biochem. Biophys. 470 (2008) 129–138
2. V. Godinić, M. Močibob, S. Ročak, M. Ibba, I. Weygand-Đurašević: Peroxin
Pex21p interacts with the C-terminal noncatalytic domain of yeast seryl-tRNA
synthetase and forms a specific ternary complex with tRNASer. FEBS J. 274
(2007) 2788–2799
3. D. Ahel, D. Slade, M. Močibob, D. Söll, I. Weygand-Đurašević: Selective
inhibition of divergent seryl-tRNA synthetases by serine analogues. FEBS Lett.
579 (2005) 4344–4348
4. I. Gruić-Sovulj, J. Rokov-Plavec, M. Močibob, T. Kamenski, I. Weygand-
Đurašević: Stability of the complex between yeast seryl-tRNA synthetase and
tRNASer under different electrophoretic conditions. Croat. Chem. Acta 77
(2004) 599–604
5. J. Rokov-Plavec, S. Bilokapić, I. Gruić-Sovulj, M. Močibob, F. Glavan, M.
Brgles, I. Weygand-Đurašević: Unilateral flexibility in tRNASer recognition by
heterologous seryl-tRNA synthetases. Period. Biol. 106 (2004) 147–154
Životopis
110
Ostale publikacije
1. M. Močibob, J. Rokov-Plavec: Izolacija ukupne tRNA, poglavlje u knjizi
Metode u molekularnoj biologiji (ur. A. Ambriović-Ristov i drugi), Zagreb,
Institut Ruđer Bošković (2007) str. 265-271
Sudjelovanje na konferencijama i tečajevima:
1. 50 godina molekularne biologije u Hrvatskoj, Zagreb 20. i 21. studeni 2008.
M. Močibob, N. Ivić, M. Luić, I. Weygand-Đurašević: Seril-tRNA-sintetaze iz
metanogenih arheja i njihovi eubakterijski homolozi (usmeno priopćenje)
2. Congress of the Croatian Society of Biochemistry and Molecular Biology,
Osijek 17. - 20. rujan 2008.
M. Močibob, I. Weygand-Đurašević: Unusual homologs of atypical enzymes
(postersko priopćenje)
3. MedILS Summer School '08: Hottest Topics in Protein Research, Split 19. - 26.
srpanj 2008.
M. Močibob, I. Weygand-Đurašević: Homologs of unusual methanogenic-type
seryl-tRNA synthetases (postersko priopćenje; nagrada organizatora za
najbolje usmeno izlaganje)
4. 22nd tRNA Workshop, Uppsala, 1.-6. 11. 2007.
M. Močibob, V. Godinić, I. Weygand-Đurašević: C-terminal extensions of
eukaryotic seryl-tRNA synthetases: impact on protein function and stability
(postersko priopćenje)
5. Kongres Hrvatskog društva za biokemiju i molekularnu biologiju, Bjelolasica,
30. rujan - 2. listopad 2004.
S. Ročak, V. Godinić, I. Landeka, M. Močibob, I. Weygand-Đurašević: C-
terminal extension of yeast SerRS has important role in tRNA binding and
protein-protein interactions (postersko priopćenje; koautor)
Životopis
111
6. Eighth International Summer School on Biophysics, Supramolecular Structure
and Function, Rovinj, 14.-26. rujan 2003.; 45 Years of molecular biology in
Croatia, 50 years of double helix, Zagreb, 20 i 21. studeni 2003.
M. Močibob, I. Gruić-Sovulj, I. Weygand-Đurašević: Macromolecular
complexes of seryl-tRNA synthetases and tRNASer explored by native
electrophoresis (postersko priopćenje)
7. 8. Hrvatski biološki kongres, Zagreb, 27. rujan - 2. listopad 2003.
J. Rokov-Plavec, S. Ročak, I. Gruić-Sovulj, I. Landeka, S. Lesjak, J. Jarić, M.
Močibob, S. Bilokapić, I. Weygand-Đurašević: Seryl-tRNA synthetases:
structure, function and evolution across all three domains of life (usmeno
priopćenje; koautor)
8. XVIII. hrvatski skup kemičara i kemijskih inženjera, Zagreb, 16.-19. veljače
2003.
M. Močibob, I. Gruić-Sovulj, I. Weygand-Đurašević: Stabilnost i stehiometrija
kompleksa seril-tRNA sintetaza i tRNASer (postersko priopćenje)
9. 1st Croatian Congress on Molecular Life Sciences, Opatija, 9.-13. lipanj 2002.
I. Gruić-Sovulj, I. Landeka, M. Močibob, T. Kamenski, I. Weygand-Đurašević:
Yeast seryl-tRNA synthetase: tRNA-dependent amino acid discrimination and
anticooperative binding of tRNASer (postersko priopćenje; koautor)
