J. Cancer Res. Clin. Oncol. 94, 233-248 (1979) Journal of

Cancer Research and

Clinical Oncology @ Springer-Verlag 1979

Neoplastische und Pr~ineoplastische Ver~inderungen bei Ratten nach einmaliger oraler Applikation yon N-Nitrosomorpholin

P. Bannasch, D. Mayer und R. Krech

Abteilung fiir Cytopathologie, Institut ffir Experimentelle Pathologie, Deutscbes Krebsforschungszen- trum, Im Neuenheimer Feld 280, D-6900 Heidelberg, Bundesrepublik Deutschland

Neoplastic and Preneoplastic Lesions in Rats After Oral Administration of a Single Dose of N-Nitrosomorpholine

Summary. The administration of a single oral dose of 320 mg/kg body wt. N-ni- trosomorpholine (NNM) to 62 Sprague-Dawley rats resulted in neoplastic and preneoplastic changes in different organs, especially in liver and kidney. After a lag period of 4 weeks, nearly all experimental animals developed preneoplastic (clear cell, acidophilic, basophilic, mixed cell) foci of the liver parenchyma. Sporadically, small neoplastic nodules were found in the liver as early as 4 weeks after the beginning of the experiment. After a lag period of 1-2 years, 4 of 13 rats showed multiple neoplastic hepatic nodules and one animal a he- patocellular carcinoma. The bile ductules of some animals responded to the carcinogen by forming mucous cholangiofibroses and cystic cholangiomas. After long lag periods, large cholangiofibromas were found in two experimen- tal animals. One or two years after application of the carcinogen, many animals developed epithelial (clear cell, acidophilic, chromophobic, basophilic, oncocy- tic) kidney tumors, often cystic. Pathologically changed (clear cell, chromo- phobic, basophilic, oncocytic) tubules are regarded as precursors of the epithe- lial tumors. The altered tubules appear for the first time at about half a year after application of the carcinogen. Apart from multiple cysts of the liver and kidneys some pancreatic cysts developed in two animals. In addition, two mesenchymal kidney tumors, one malignant neurinoma, two sub- cutaneous fibromas, one fibroadenoma, and one squamous cell carcinoma of the skin were observed.

Key words: N-nitrosomorpholine - Single dose - Hepatocarcinogenesis - Re- nal carcinogenesis - Pancreatic cysts

Zusammenfassung: Die einmalige orale Gabe yon 320 mg/kg K6rpergewicht N- Nitrosomorpholin (NNM) an 62 m~innliche Sprague-Dawley-Ratten fiihrte zu pr/ineoplastischen und neoplastischen Ver~inderungen in verschiedenen Orga-

Sonderdruckanfragen an: Prof. Dr. P. Bannasch (Adresse siehe oben)

0171/5216/79/0094/0233/$3.20

234 P. Bannasch et al.

nen, besonders in Leber und Nieren. Im Leberparenchym bildeten sich nach ei- ner Latenzzeit yon 4 Wochen bei nahezu allen Versuchstieren pr~ineoplastische (klarzellige, acidophile, basophile, gemischtzellige) Herde aus. Vereinzelt wa- ren nach 4 Wochen schon kleine neoplastische Kn6tchen in der Leber zu beob- achten. Nach einer Latenzzeit yon 1-2 Jahren entwickelten 4 yon 13 Ratten mul- tiple neoplastische Knoten, 1 Tier zeigte ein hepatocellul~ires Carcinom. Die Galleng/inge reagierten bei einem Teil der Tiere mit Ausbildung yon verschlei- menden Cholangiofibrosen und cystischen Cholangiomen. Bei 2 Tieren fanden sich nach langen Latenzzeiten ausgedehnte Cholangiofibrome. In den Nieren entwickelten sich 1-2 Jahre nach der Carcinogengabe epitheliale (klarzellige, acidophile, chromophobe, basophile, onkocyt~re) Tumoren, die z.T. cystisch gebaut waren. Als Vorstufe der Nierenepitheliome fassen wir charakteristisch ver~inderte (klarzellige, chromophobe, basophile, onkocytfire) Tubuli auf, de- ren Ausbildung etwa ein halbes Jahr nach Versuchsbeginn einsetzt. Bei 2 Ver- suchstieren traten neben multiplen Leber- und Nierencysten einzelne Pankreas- cysten auf. Augerdem wurden 2 mesencbymale Nierentumoren, 1 malignes Neurinom des N. oculomotorius, 2 subcutane Fibrome, 1 Fibroadenom und 1 Plattenepithelcarcinom der Haut beobachtet.

Schliisselwiirter: N-Nitrosomorpholin - Einmalige Gabe - Hepatocarcinogene- se - Renale Carcinogenese - Pankreascysten

Die carcinogene Wirkung des heterocyclischen Nitrosamins N-Nitrosomor- pholin (NNM) ist in zahlreichen Experimenten an verschiedenen Species, insbe- sondere an Ratten nachgewiesen worden (Druckrey et al., 1967; JARC Mono- graphs, 1978). Dabei wurde die Substanz meist chronisch bis zum Versuchsende oder in Stoppversuchen fiber mehrere Wochen oral oder subcutan verabreicht. Nur bei Hamstern wurde auBerdem der Effekt von einmaligen subcutanen Injektionen des NNM untersucht (Althoff et al., 1974). Als Hauptzielorgan der carcinogenen Wirkung erwies sich bei Ratten und M/iusen die Leber, daneben waren aber auch noch andere Organe, wie z. B. die Nieren, die Ovarien oder die Lungen yon Tumo- ren befallen (Druckrey et al., 1961; Bannasch et al., 1964, 1978; Lijinsky u. Taylor, 1975; Newberne u. Shank, 1973). Bei Hamstern traten die Tumoren nach oraler Applikation in der Leber (Shank u. Newberne, 1976), nach subcutaner Injektion dagegen bevorzugt im Respirations- und im oberen Verdauungstrakt auf (Haas et al., 1973; Mohr et al., 1974; Reznik et al., 1976). Fische entwickelten bei Immersion yon Nitrosomorpholin im Tankwasser verschiedenartige Lebertumoren (Pliss u. Khudoley, 1975).

Durch gleichzeitige orale Gabe yon Morpholin und Nitrit lassen sich bei Rat- ten, M~iusen und Hamstern die gleichen Gesch~a4ilste induzieren wie durch Nitro- somorpholin allein (Sander u. Biirkle, 1969; Greenblatt et al., 1971 ; Newberne u. Shank, 1973; Shank u. Newberne, 1976). Aus diesen Beobachtungen wurde ge- schlossen, dab NNM im Verdauungstrakt der Versuchstiere aus den Vorstufen Ni- trit und Morpholin synthetisiert werden kann. Ein derartiger Entstehungsmeeha- nismus yon NNM ist - worauf Sander u. Bfirkle (1969) schon vor Jahren hingewie- sen haben - auch beim Menschen denkbar. Die eingehende Erforschung der Wir- kungsweise yon NNM ist daher nicht nur yon theoretischem Interesse, sondern auch yon groger praktischer Bedeutung ffir die Abschfitzung des carcinogenen Ri-

Carcinogene Wirknng von N-Nitrosomorpholin 235

sikos, das diese Substanz ffir den Menschen darstellt. In der vorliegenden Arbeit haben wir gepr/ift, welchen Langzeiteffekt die einmalige orale Gabe einer hohen NNM-Dosis bei Ratten hat.

Material und Methoden 62 m/innlichen Sprague-Dawley-Ratten (Zentralinstitut fiir Versuchstierzucht, Hannover) wurde N-Ni- t rosomorpholin einmalig in einer Dosis yon 320 mg/kg K6rpergewicht, gel6st in Leitungswasser, per Schlundsonde verabreicht. Als Kontrollgruppe diente eine gleich groBe Zahl von unbehandelten m/inn- lichen Sprague-Dawley-Ratten. Versuchs- und Kontrolltiere wurden unter standardisierten Bedingun- gen in Makrolonk/ifigen gehalten und erhielten Wasser und Altromin ad libitum.

Gruppen von jeweils 3-6 Versuchs- und Kontrolltieren wurden zwei Tage und 1, 4, 9 und 22 Wo- chert nach Versuchsbeginn get6tet. Die iibrigen Tiere wurden entweder bis zum Spontantod gehalten oder get6tet, wenn sich ihr Allgemeinzustand auffallend verschlechterte. Die letzten Tiere wurden zwei Jahre nach Versuchsbeginn get6tet. Weitere Einzelheiten sind den Tabellen 1-5 zu entnehmen.

Tabelle 1. Anzahl der Ratten mit pr/ineoplastischen Herden, neoplastischen Knoten und hepato- cellul~iren Carcinomen zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach einmaliger oraler Gabe von 320 mg N N M / k g K6rpergewicht

Versuchs- Tierzahl Klar- und Basophile Neo- Hepato- dauer acidophilzellige Herde plastische cellul~ire (Wochen) Glykogen- Knoten Carcinome

speicherherde

0 - 3 12 (29) . . . . 4 5 ( 6 ) " 5 - 2 - 9-22 6 6 1 - -

27-40 8 8 4 - - 55-93 11 (13) a 11 5 4 1

a GesamttierzahI bei Addition yon get6teten und spontan gestorbenen (ira Hinblick auf pr/ineo- plastische Ver~inderungen am Leberparenchym nicht auswertbaren) Versuchstieren

Tabelle 2. Anzahl der unbehandel ten Kontrollrat ten mit Ver~inderungen am Leberparenchym

Versuchs- Tierzahl Klar- und Basophile Neo- dauer acidophilzellige Herde plastische (Wochen) Glykogen- Knoten

speicherherde

Hepato- cellul/ire Carcinome

0 - 3 29 - 4 6 9 5 2 6 -

27-40 8 1 55-93 13 4

Tabeile 3. Anzahl der Ratten mit Verfinderungen der Gallenggnge zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach einmaliger Gabe yon 320 nag N N M / k g K/Srpergewicht

Versuchsdauer Tierzahl Gallengangs- Cholangio- Cystische Cholangio- (Wochen) proliferate fibrosen Cholangiome fibrome

0 - 3 29 20 2 - - 4 6 4 4 - - 9-22 6 3 - - -

27M0 8 5 - 3 - 5 5 4 3 13 6 3 10 2

Tab

elle

4.

Anz

ahl

der

Rat

ten

mit

bes

tim

mte

n T

ub

ulu

sver

~n

der

un

gen

un

d E

pit

hel

iom

en d

er N

iere

zu

unte

rsch

iedl

iche

n Z

eitp

un

kte

n n

ach

ein

mal

iger

ora

ler

Gab

e yo

n 32

0 m

g N

NM

/kg

K/S

rper

gew

icht

Ver

such

s-

Tie

rzah

l K

larz

elli

ge

Kla

r- u

nd

O

nk

o-

On

ko

cyti

ire

Bas

op

hil

e u

nd

C

hro

mo

- C

yst

en

Bas

ophi

le E

pit

hel

iom

e d

auer

(g

lyko

ge-

acid

ophi

l-

cy

t~ir

e

Ep

ith

elio

me

alci

anop

hile

Tu

bu

li

ph

ob

e (W

oche

n)

noti

sche

) ze

llig

e T

ub

uli

T

ub

uli

cy

stis

ch-

tubu

l~ir

/ T

ub

uli

E

pit

hel

iom

e K

lein

zell

ig

Gro

Bze

llig

pa

pill

gr

soli

d

0-

3 12

(29

) ..

..

.

29

- 1

4 5

(6)

..

..

2

2 9-

22

6 -

- 4

- 1

1 -

27-4

0 8

6 -

2 -

6 3

1 2

6 2

55-9

3 11

(1

3)"

7 3

8 3

12

8 4

5 8

1

" G

esam

ttie

rzah

l be

i A

dd

itio

n v

on

get

6tet

en u

nd

sp

on

tan

ges

torb

enen

(im

Hin

blic

k au

f tu

bul~

ire

L~i

sion

en n

ich

t vo

ll a

usw

ertb

aren

) V

ersu

chst

iere

n

Tab

elle

5, A

nza

hl

der

un

beh

and

elte

n K

on

tro

llra

tten

mit

bes

tim

mte

n T

ub

ulu

sver

~in

der

un

gen

un

d E

pit

hel

iom

en d

er N

iere

Ver

such

s-

Tie

rzah

l K

larz

elli

ge

Kla

r- u

nd

O

nk

o-

Onk

ocyt

~ir

e B

aso

ph

ile

un

d

Ch

rom

o-

Cy

sten

B

asop

hile

Ep

ith

elio

me

daue

r (g

lyko

ge-

acid

ophi

l-

cyt~

ire

Ep

ith

elio

me

alci

ano

ph

ile

Tu

bu

li

ph

ob

e (W

oche

n)

noti

sche

) ze

llige

T

ub

uli

T

ub

uli

cy

stis

ch-

tubu

l~ir

/ T

ub

uli

E

pit

hel

iom

e K

lein

zell

ig

Gro

Bze

llig

pa

pill

iir

soli

d

0-3

6

- -

- 6

- -

- 4

3 -

- 3

- 9-

22

6 -

- -

6 -

1 27

~40

8 -

- 1

8 1

1 1

55-9

3 13

-

3 1

11

2 1

2

r

Carcinogene Wirkung von N-Nitrosomorpholin 237

Alle Tiere wurden sorgf/iltig obduziert. Die histologische Untersuchung der Kontrollen wurde in den ersten vier Wochen auf die Leber und auf neun Stichproben der Nieren (vgl. Tab. 5) beschr~inkt. Im fibrigen wurden zu allen Zeitpunkten Leber, Nieren, Milz, Herz und Lungen systematisch histolo- gisch untersucht. Bei makroskopisch erkennbaren Ver/inderungen wurden auch andere Organe aufge- arbeitet. Fixierung: 4% Formaldehydl6sung oder Carnoysches Gemisch. Einbettung: Paraplast. Ffir- bungen: Hfimatoxylin-Eosin; Perjodsfiure-Schiffs Reagenz, Gegenf~irbung mit Orange G und Weigerts H~matoxylin (Tri-PAS); Alcianblau.

Ergebnisse und Diskussion

Von den 62 Versuchstieren starben 17 infolge der akuten toxischen Wirkung des NNM innerhalb der ersten drei Wochen spontan. Die fibrigen Tiere entwickelten in einem hohen Prozentsatz neoplastische und prfineoplastische Ver/inderungen in Leber und Niere. Daneben fanden sich mitunter Pankreascysten und Hauttumo- ren. Bei einem Tier trat ein malignes Neurinom auf.

1. Neoplastische und prdneoplastische Leberveriinderungen

Die neoplastischen und prfineoplastischen Verfinderungen, die sich bei lfingerer Gabe yon NNM am Leberparenchym abspielen, sind bereits eingehend beschrie- ben worden (Bannasch, 1975, 1978a, b). In den ersten Wochen nach einmaliger oraler Applikation von 320 mg/kg NNM entsprach das histologische Bild der Le- ber weitgehend den Ver~nderungen, die nach dreiw6chiger Trfinkung einer 50 mg-%igen NNM-L6sung beobachtet wurden. Beziiglich der unspezifisch-toxi- schen Leberl~sionen verweisen wir auf frfihere Publikationen (Bannasch u. Reiss, 1971; Theodossiou et al., 1971; Romen u. Bannasch, 1972; Romen et al., 1973; Ste- wart et al.; 1975; Taper u. Bannasch, 1976, 1979). Bereits 4 Wochen nach Versuchs- beginn waren bei 5 yon 6 Versuchstieren vereinzelt klarzellige Glykogenspeicher- herde (Abb. la) und bei 2 Tieren sogar kleine neoplastische Kn6tchen im Leberpar- enchym zu finden. Wie aus Tabelle 1 hervorgeht, waren herdf6rmige Parenchym- ver~nderungen in spfiteren Versuchsstadien bei allen auswertbaren Tieren nachzu- weisen. Die Herde nahmen im Verlaufe des Experimentes an Gr6Be zu. In vielen Herden erschierlen neben klaren auffallende acidophile Zellen (Abb. 1 b). Die Kerne der klaren oder acidophilen Zellen waren oft erheblich vergr6Bert.

Die Auffassung, dab die klar- und acidophilzelligen Glykogenspeicherherde ei- ne pr/ineoplastische Parenchymver/inderung anzeigen (Bannasch, 1968), wird heu- te von zahlreichen Autoren geteilt (Bannasch et al., 1979). Scherer und Emmelot (1976) haben die Induktion solcher Herde, die z.T. neben der Glykogenspeiche- rung Aktivit/itsver/inderungen bestimmter Enzyme aufweisen, durch einmalige Gabe verschiedener anderer hepatotroper Carcinogene beschrieben und die Kine- tik der Herdbildung genauer analysiert. Die fr/iher schon im einzelnen dargestell- ten Uberg/inge der pr/ineoplastischen Herde in Areale aus intermedi~ren oder ba- sophilen Zellen (Bannasch, 1975, 1976) waren auch nach einmaliger NNM-Appli- kation hfiufig zu beobachten (Abb. lc). Ein bis zwei Jahre nach der Giftgabe ent- wickelten sich bei 4 yon 13 Tieren multiple neoplastische Knoten. Bei einem Tier trat ein hepatocellulfires Carcinom auf. W/ihrend basophile Parenchymherde, neo: plastische Knoten und Leberzellcarcinome selbst bei den filtesten Kontrolltieren fehlten, zeigten 5 yon 21 Kontrollen, die 1-2 Jahre nach Versuchsbeginn get6tet worden waren, kleine klar- oder acidophilzellige Glykogenspeicherherde (Tabelle

238 P. Bannasch et al.

Abb. la~l. Pr~ineoplastische und neoplastisch e Leberver~inderungen bei Ratten nach einmaliger oraler Gabe yon 320 mg/NNM/kg K~Srpergewicht: a Vorwiegend klarzelliger Glykogenspeicherherd des Leberparenchyms. HE. 500:1. b Vorwiegend acidophilzelliger Gtykogenspeicherherd des Leber- parenchyms. HE. 500:1. c Ausschnitt yon neoplastischem Leberknoten mit Mischpopulation aus klaren Glykogenspeicherzellen und basophilen Zellen. HE. 500:1. d Cholangiofibrom. He. 140:1

Carcinogene Wirkung von N-Nitrosomorpholin 239

Abb. 2. Ausgedehnte, mehrkammerige Cysten in Leber a und Niere b sowie kleinere Pankreascysten c bei derselben Ratte 80 Wochen nach einmaliger oraler Gabe von 320 mg NNM/kg K6rpergewicht. Alle Abb.: HE. a 24:1, b 100:1, c 140:1

240 P. Bannasch et al.

2). Bei der Entstehung solcher Herde ist mit carcinogenen Umwelteinfliissen zu rechnen, wie sie z. B. von Kann et al. (1977) in Form einer Beimischung geringer Mengen yon Dimethylnitrosamin zu der auch flit unsere Tiere verwendeten Stan- darddi/it nachgewiesen wurden. Der wesentlich frfihere Zeitpunkt, zu dem sich die Glykogenspeicherherde bei den Versuchstieren entwickelten, sowie die gr6gere Zahl und Ausdehnung dieser Herde sprechen jedoch daffir, dab die NNM-Appli- kation eine maBgebliche Rolle bei ihrer Entwicklung spielte.

Auch die Ver/inderungen, welche die Gallengdnge der einmalig mit NNM be- handelten Tieren erfuhren, entsprachen weitgehend den L/isionen nach dreiw6chi- ger Tr/inkung einer 50mg-~igen NNM-L6sung (Bannasch u. Reiss, 1971; Ban- nasch u. Massner, 1976). Aus Tabelle 2 ist zu entnehmen, dab schon friihzeitig nach der Giftgabe bei fast allen Tieren ausgepr/igte Gallengangsproliferate auftra- ten, die spfiter tells wieder verschwanden, teils zu verschleimenden Cholangiofibro- sen fortschritten. Abweichend yon unseren frfiheren Beobachtungen konnten wir nicht in allen Versuchsgruppen eine Persistenz der Cholangiofibrose feststellen. Dies erkl/irt sich m6glicherweise mit der relativ kleinen Zahl von Versuchstieren, die in der Zeit von 9--40 Wochen zur Verfiigung standen. Jedenfalls waren nach La- tenzzeiten von 55-93 Wochen wieder bei 3 von 13 Tieren verschleimende Cholan- giofibrosen zu beobachten. Von ihnen ffihrten alle Oberg~inge zu schleimfreien cy- stischen Cholangiomen (Bannasch u. Reiss, 1971), vereinzelt auch zu regelrechten Cystenlebern (Abb. 2a) oder zu ausgedehnten Cholangiofibromen (Abb. ld) (Ban- nasch u. Massner, 1976). Bei den unbehandelten Ratten traten derartige Tumoren nicht auf. Dagegen waren vereinzelt kleine Gallengangsproliferate zu beobachten, die jedoch im Gegensatz zu der Carcinogen-induzierten Cholangiofibrose (Ban- nasch u. Reiss, 1971; Chou u. Gibson, 1972) niemals eine Verschleimung zeigten. Aus dem Verhalten der Galleng/inge mug geschlossen werden, dab bereits eine ein- malige Applikation von NNM ausreicht, um die gesamte mehrstufige Sequenz cel- lul/irer Ver/inderungen, die zur Ausbildung yon cholangiocellul/iren Tumoren fiihrt, in Gang zu setzen.

2. Neoplastische und prgineoplastische Nierenverdnderungen Im Gegensatz zu Experimenten mit niedrigeren NNM-Dosen (vgl. Bannasch et al., 1974, 1978a, b) traten nach einmaliger oraler Applikation von 320 mg/kg NNM schwere unspezifisch-toxische Nierenschdden auf. Innerhalb yon wenigen Tagen entwickelten sich in der Nierenrinde ausgedehnte Tubulusnekrosen, die bis zu vier Wochen nach der Giftgabe bei 23 von 35 Versuchstieren nachzuweisen waren. Be- reits in der ersten Versuchswoche setzte eine Regeneration der Tubulusnekrosen ein, sodaB sich ein buntes histologisches Bild ausbildete. Die erhaltenen Tubulus- epithelien der gesch~idigten Rindenbezirke zeigten neben einer Zunahme der cyto- plasmatischen Basophilie h~iufig Mitosen. In vielen F~illen waren die Mitosen ge- st6rt, sO fanden sich z.B. Chromosomenverklebungen, Chromosomenverspren- gungen oder Briickenbildungen in der Telophase. Aul3erdem waren oft - zum Teil ganz unregelm/iBig geformte - GroBkerne zu beobachten, wie sie als Folge yon Mi- tosest6rungen in der toxisch gesch/idigten Niere schon 1/inger bekannt sind (Peri- stianis et al., 1978; Reichert et al., 1978). Die regenerierten Tubuli waren zun~ichst meist yon einem ungew6hnlich flachen Epithel ausgekleidet. Abweichend yon dem gel/iufigen Bild regeneratorischer Tubulusver/inderungen zeigten die schwer ge-

Carcinogene Wirkung yon N-Nitrosomorpholin 241

Abb. 3. Nierentumoren bei Ratten nach einmaliger oraler Gabe yon 320 mg NNM/kg K6rpergewicht: a Trabekulfires Rindenadenom mit auffallend vakuolisierten Zellen. Tri-PAS. 300:1. b Sklerosierender mesenchymaler Tumor in der Nierenrinde. HE. 140:1. c Polymorphzelliges Sarkom. HE. 140:1

242 P. Bannasch et al.

Abb. 4a-d. Pr/ineoplastische und neoplastische Ver~tnderungen der Nierentubuli bei Ratten nach ein- maliger oraler Gabe von 320 mg NNM/kg K6rpergewicht: a Klarzelliger Glykogenspeichertubulus. HE. 300:1. b Onkocytentubulus. Tri-PAS. 190:1. c Teils hellzelliger ("chromophober"), teils m~iBig basophiler Tubulus mit deutlich vergr61]erten Epithelien. HE. 300:1. d Chromophobes Mikroadenom. HE. 300:1

Carcinogene Wirkung von N-Nitrosomorpholin 243

schfidigten Rindenpartien oft auffallend helle Tubulusepithelien, deren Cytoplas- ma reichlich alcianophile Substanzen (saute Mucopolysaccharide) enthielt. Viele Tubuli waren durch cystenartige Erweiterungen gekennzeichnet.

In der Zeit von 9-22 Wochen nach der NNM-Applikation war eine weitgehen- de Normalisierung der Nierenstruktur festzustellen. Als Uberreste der initialen to- xischen L/~sion waren in einigen Tubulusepithelien noch GroBkerne nachzuweisen. Manche Tubuli waren cystisch dilatiert und von einem flachen basophilen und/ oder alcianophilen Epithel ausgekleidet. Daneben fanden sich in gr6Berer Zahl Gruppen von basophilen und/oder alcianophilen Tubuli, die meist von einer ver- breiterten Basalmembran umgeben waren. Das Interstitium derartiger Tubulus- gruppen war mitunter yon Ansammlungen rundkerniger Endztindungszellen durchsetzt.

Gewebliche Reaktionen, die in einen engeren Zusammenhang mit der Geschwulstbildung gebracht werden k6nnen, entwickelten sich erst zu sp/~teren Ver- suchszeiten, 27-93 Wochen nach der Giftgabe. Sie sind in Tabelle 4 zusarhmenge- fal3t. Tabelle 5 enth/~lt die Befunde, die an den Kontrolltieren erhoben wurden. Bei der tabellarischen Zusammenstellung sind wir unseren friiheren Erfahrungen an der NNM-vergifteten Rattenniere gefolgt (Bannasch et al., 1974). Danach sind im wesentlichen 3 Formen von epithelialen Nierentumoren zu unterscheiden, die je- weils eine eigenst~indige Morphogenese haben: 1. klarzellige (glykogenotische) und/oder acidophilzellige Epitheliome, 2. basophile Epitheliome und 3. Onkocyto- me. Alle diese Tumortypen entwickelten sich auch bei einmaliger Gabe des Carci- nogens. AuBer den in der Tabelle aufgefiihrten Tumoren traten 4 Geschw/ilste auf, die wir in unseren fri_iheren Experimenten mit NNM nicht beobachtet haben: 2 Ade- nome zeigten einen trabekulfiren Bau (Abb. 3). Ihre Zellen waren teils acidophil, teils m/~13ig basophil. Sie wiesen regelmfiBig groBe cytoplasmatische Vakuolen auf, die ein siebartiges Muster bedingten. Die Vakuolen enthielten weder PAS-positive noch alcianophile Substanzen. Ein Nachweis yon Lipiden war an dem Carnoy-fi- xierten Gewebe nicht m6glich. Eine Metastasierung der epithelialen Nierentumo- ren war nicht festzustellen.

Neben epithelialen traten bei zwei Tieren mesenchymale Tumoren auf. Einer dieser Tumoren (Abb. 3b) setzte sich aus einer ziemlich einheitlichen Population yon faserbildenden Spindelzellen zusammen (Hard, 1976). Er breitete sich ohne scharfe Grenze zwischen den Nierentubuli aus und umhiillte diese oft vollst~ndig. Der zweite mesenchymale Tumor war als polymorphzelliges Sarkom (Abb. 3c) zu klassifizieren. Seine Malignit/~t war dutch den Nachweis von Lungenmetastasen einwandfrei zu belegen.

Die Erzeugung von verschiedenartigen Nierentumoren durch einmalige Gabe yon Dimethylnitrosamin an Ratten ist bereits 1962 von Magee u. Barnes beschrie- ben und spfiter yon Murphy et al. (1966) bestfitigt worden.

Die Vorstellung, dab die klar- und acidophilzelligen Nierentumoren aus glyko- genotischen Nierentubuli (Abb. 4a) hervorgehen, haben wir ktirzlich ausfiihrlich begrtindet (Bannasch et al., 1978a). Die Ergebnisse der vorliegenden Untersuchun- gen (Tabelle 4) stimmen mit dieser Interpretation in jeder Hinsicht fiberein. Das gleiche gilt ftir die Ableitung der Onkocytome (Tabelle 4) aus Onkocytentubuli, de- ren Umwandlung in Tumoren auch nach einmaliger Gabe von NNM in allen Stu- fen zu verfolgen ist (Bannasch et al., 1978b).

244 P. Bannasch et al.

Abb. 5. Einfache, von einem flachen Epithel ausgekleidete Cysten a und grol3zelliges basophiles Cyst- adenom b bei Ratten nach einmaliger oraler Gabe von 320 mg NNM/kg K/Srpergewicht. In der Nach- barschaft des Cystadenoms b einige basophile Tubuli. Beide Abbildungen: HE. a 180:1. b 250:1

Carcinogene Wirkung von N-Nitrosomorpholin 245

Die Morphogenese der basophilen Epitheliome ist noch nicht befriedigend ge- klfirt, verschiedene Beobachtungen sprechen jedoch ffir eine Abstammung dieses Tumortyps yon Tubuli, die aus basophilen und/oder alcianophilen (Mucopolysac- charid-speichernden) Epithelien zusammengesetzt sind (Bannasch et al., 1971). Die nach einer einmaliger NNM-Applikation erhobenen Befunde scheinen diese Auf- fassung zu stfitzen (Tabelle 4). Nicht ohne weiteres damit zu vereinbaren ist aller- dings, dab/ihnliche, wenn meist auch nur relativ kleinzellige Tubuli bei Kontroll- tieren (Tabelle 5) mit zunehmendem Alter geh/iuft auftreten (Bannasch et al., 1974). Diese Tubuli erfahren aber bei vielen alten Kontrolltieren (Tabelle 5) cysti- sche Dilatationen, die durchaus einen neoplastischen Charakter haben k6nnten. Bei den einmalig NNM-behandelten Ratten war die Zahl und Ausdehnung der tu- bul/iren L/isionen und cystischen Verfinderungen (Abb. 2b, 5a)in der Regel wesent- lich gr6Ber als bei den Kontrollen. Von den cystischen Erweiterungen war bei den Versuchstieren mitunter auch die Bowmansche Kapsel betroffen. Aul3erdem tra- ten bei den Versuchtstieren oft groBzellige basophile und alcianophile Tubuli auf (Tabelle 4), die bei Kontrollen sehr selten sin& Verfinderungen, die als Ubergangs- stadien zwischen alcianophilen oder basophilen Tubuli und Tumoren gedeutet werden k6nnen, waren bei vielen Versuchstieren zu beobachten (Abb. 5b). In man- chen F/illen zeigten voll ausgebildete basophile Epitheliome noch eine mfiBige A1- cianophilie. Besonders bemerkenswert sind chromophobe Tubuli (Tabelle 4), die sich aus ungew6hnlich groBen, im HE-Pr/iparat hellen Zellen zusammensetzen (Abb. 4b). Diese speichern im Gegensatz zu den klaren Zellen kein Glykogen. Sie haben ein leicht getrfibtes, feinvacuol/ires Cytoplasma und enthalten neben gerin- gen Mengen von alcianophilen Substanzen (Mucopolysacchariden) vermutlich Li- pide (Bannasch, 1974). Der l~lbergang solcher Tubuli in Mikroadenome (Abb. 4d) ist mitunter einwandfrei zu belegen. Zur weiteren Klfirung des Zusammenhangs zwischen alcianophilen, basophilen und chromophoben Tubuli auf der einen und basophilen Tumoren aufder anderen Seite fiihren wir z. Z. vergleichende licht- und elektronenmikroskopische Studien an einem gr6geren Untersuchungsmaterial durch.

Die Glomerula zeigten bei den alten Versuchstieren hfiufig eine Sklerose, wie sie frfiher bei NNM-geschfidigten Ratten schon ausfiihrlich beschrieben wurde (Ro- men et al., 1975; Romen, 1976). In geringerem Ausmage waren fihnliche Ver/inde- rungen bei einigen alten Kontrollratten zu beobachten.

3. Pankreaseysten

Bei zwei Versuchstieren, die 80 bzw. 82 Wochen nach der NNM-Applikation ge- t6tet wurden, fanden sich neben multiplen und z.T. sehr ausgedehnten Leber- und Nierencysten einzelne Pankreascysten (Abb. 2c). Diese Cysten waren mit einem einschichtigen, flachen Epithel ausgekleidet und erschienen optisch gr6Btenteils leer. Ganz vereinzelt enthielten die Lumina yon Gangstrukturen Schleimsubstan- zen, die sich mit Alcianblau anf~rbten und eine positive PAS-Reaktion gaben.

4. Sonstige Tumoren

38 Wochen nach der NNM-Applikation trat bei einer Ratte ein malignes Neuri- nom des N. oculomotorius auf. Nach 39 Wochen fand sich bei einem Tier in der

246 P. Bannasch et al.

rechten Achselbeuge ein Fibroadenom. Bei zwei weiteren Tieren entwickelten sich 55 bzw. 93 Wochen nach der Carcinogengabe subcutane Fibrome. SchlieBlich war 85 Wochen nach Versuchsbeginn bei einer Ratte am Hals ein verhornendes Plat- tenepithelcarcinom der Haut nachzuweisen.

SchluBfolgerungen Aus den geschilderten Befunden geht hervor, dab die einmalige orale Applikation von NNM an m~innliche Ratten in Leber und Niere im Prinzip die gleichen car- cinogenen Effekte hat wie eine 1/ingere Tr~inkung niedrigerer NNM-Dosen. Mes- enchymale Nierentumoren haben wir bisher allerdings nur bei einmaliger Gabe der h6heren NNM-Dosis gesehen. Besonders bemerkenswert erscheint, dab nach der einmaligen Giftgabe neben Leber- und Nierencysten mitunter auch Pankreascy- sten auftreten. Aus der menschlichen Pathologie ist das Zusammentreffen yon Le- ber-, Nieren- und Pankreascysten seit langem bekannt. Es wird als Hinweis auf ei- nen dysontogenetischen Entstehungsmechanismus der Cysten angesehen. Durch die dargestellten Beobachtungen an der Ratte wird diese Deutung in Frage gestellt. Jedenfalls mug auckbeim Menschen mit der M6glichkeit einer Entstehung von Le- ber-, Nieren- und Pankreascysten durch exogene Noxen gerechnet werden.

Das wichtigste Ergebnis der vorliegenden Arbeit sehen wir in dem Nachweis, dab die bislang nur nach chronischer Carcinogengabe beobachtete Stufenfolge cel- lul/irer Ver/inderungen bei der Entstehung von epithelialen Leber- und Nierentu- moren auch nach einmaliger NNM-Applikation ablfiuft. Die z. T. schon lange Zeit vor der Ausbildung yon Tumoren auftretende Speicherung von Glykogen oder Mucopolysacchariden in Leber- und Nierenepithelien oder die Anhgufung yon atypischen Mitochondrien in renalen Onkocyten (vgl. Bannasch et at., 1978b) k6n- nen demnach als Indikatoren yon irreversiblen intracellul~iren Stoffwechselst6run- gen gelten. Ob diese Stoffwechselst6rungen eine notwendige Voraussetzung oder nut eine belanglose Begleiterscheinung der neoplastischen Zelltransformation sind, ist often. Die Gesetzm/igigkeit, mit der sie unter den verschiedensten Ver- suchsbedingungen auftreten, spricht jedoch fiir einen engen Zusammenhang mit dem Transformationsvorgang.

Fiir die Uberlassung des Nitrosomorpholins danken wir Herrn Professor Preussmann, Heidelberg. Ausgezeichnete technische Assistenz leisteten Frau G. Volz, Herr D. Greulich und Herr E. Zang.

Literatur Althoff, J., Wilson, R., Cardesa, A., Pour,P.: Comparative studies of neoplastic response to a single

dose of nitroso compounds. III. The effect of N-nitrosopiperidine and N-nitrosomorpholine in Syrian golden hamsters. Z. Krebsforsch. 81, 251-259 (1974)

Bannasch, P.: The cytoplasm of hepatocytes during carcinogenesis. Electron- and light microscopical investigations of the nitrosomorpholine-intoxicated rat liver. In: Recent Results in Cancer Research, Vol. 19, pp. 1-105. Berlin, Heidelberg, New York: Springer 1968

Bannasch, P.: Carcinogen-induced cellular thesaurismoses and neoplastic cell transformation. Rec. Res. Cancer Res. 44, 115-126 (1974)

Bannasch, P.: Die Cytologic der Hepatocarcinogenese. In: Handbuch der allgemeinen Pathologic. H. W. Altmann et al. (Hrsg.), Vol. VI, Teil 7, pp. 123-276. Berlin, Heidelberg, New York: Springer 1975

Carcinogene Wirkung von N-Nitrosomorpholin 247

Bannasch, P.: Cytology and cytogenesis of neoplastic (hyperplastic) hepatic nodules. Cancer Res. 36, 2555-2562 (I976)

Bannasch, P.: Cellular and subcellular pathology of liver carcinogenesis. In: Primary liver tumors (eds.: H. Returner et al.), pp. 87-111. Lancaster: MTP Press 1978a

Bannasch, P.: Sequential cellular alterations during hepatocarcinogenesis. In: Rat hepatic neoplasia P. Newberne and W. H. Butler (eds.), pp. 58-89. Cambridge, London: MIT Press 1978b

Bannasch, P., Hacker, H.J., Mayer, D.: Early biological markers during liver carcinogenesis. Arch. Toxicol. Suppl. 2, 145-155 (1979)

Bannasch, P., Krech, R., Zerban, H.: Morphogenese und Mikromorphologie epithelialer Nierentumo- ren bei Nitrosomorpholin-vergifteten Ratten. II. Tubul~re Glykogenose und die Genese von klar- oder acidophilzelligen Tumoren. Z. Krebsforsch. 92, 63-86 (1978a)

Bannasch, P., Krech, R., Zerban, H.: Morphogenese und Mikromorphologie epithelialer Nierentumo- ren bei Nitrosomorpholin-vergifteten Ratten. III. Onkocytentubuli und Onkocytome. Z. Krebs- forsch. 92, 87-104 (1978b)

Bannasch, P., Massner, B.: Histogenese und Cytogenese von Cholangiofibromen und Cholangiocarci- nomen bei Nitrosomorpholin-vergifteten Ratten. Z. Krebsforsch. 87, 239-255 (1976)

Bannasch, P., Miiller, H.A.: Lichtmikroskopische Untersuchungen fiber die Wirkung yon N-Nitroso- morpholin auf die Leber von Ratte und Maus. Arzneim. Forsch. (Drug. Res.) 14, 805-814 (1964)

Bannasch, P., Reiss, W.: Histogenese und Cytogenese cholangiocellul/irer Tumoren bei Nitrosomor- pholin-vergifteten Ratten. Zugleich ein Betrag zur Morphogenese der Cystenleber. Z. Krebsforsch. 76, 193-215 (1971)

Bannasch, P., Schacht, U., Storch, E.: Morphogenese und Mikromorphologie epithelialer Nierentumo- ren bei Nitrosomorpholin-vergifteten Ratten. I. Induktion und Histologie der Tumoren. Z. Krebs- forsch. 81, 311-331 (1974)

Bannasch, P., Schacht, U., Weidner, R., Storch, E.: Morphogenese und Mikromorphologie basophiler und onkocyt~irer Nierentumoren bei Nitrosamin-vergifteten Ratten. Verh. Dtsch. Ges. Pathol. 55, 665-670 (1971)

Chou, S.T., Gibson, J.B.: A comparative histochemical study of rat livers in alpha-naphthyl-iso-thio- cyanate (ANIT) and DL-ethionine intoxication. J. Pathol. 108, 73-83 (1972)

Druckrey, H., Preussmann, R., lvankovic, S., Schmfihl, D.: Organotrope carcinogene Wirkung bei 65 verschiedenen N-Nitroso-Verbindungen an BD-Ratten. Z. Krebsforsch. 69, 103-210 (1967)

Druckrey, H., Preussmann, R., Schmfihl, D., Mfiller, M.: Chemische Konstitution und carcinogene Wirkung bei Nitrosaminen. Naturwissenschaften 48, 134~135 (1961)

Greenblatt, M., Mirvish, S., So, B.T.: Nitrosamine studies: Induction of lung adenomas by concurrent administration of sodium nitrite and secondary amines in Swiss mice. J. Nat. Cancer Inst. 46, 1029- 1034 (1971)

Haas, H., Mohr,.U., Krfiger, F.W.: Comparative studies with different doses of N-nitrosomorpho- line, N-nitrosopiperidine, N-nitrosomethylurea, and dimethylnitrosamine in Syrian golden ham- sters. J. Nat. Cancer Inst. 51, 1295-1301 (t973)

Hard, G.-C.: Tumours of the kidney, renal pelvis and ureter. In: Pathology of tumours in laboratory animals, Vol. I, tumours of the rat, part 2, V. S. Turnsov (ed.}, pp. 73-102. Lyon: International Agen- cy for Research on Cancer 1976

IARC Monographs on the evaluation of the carcinogenic risk of chemicals to humans, Vol. 17: Some N-nitroso compounds. Lyon: International=Agency for Research on Cancer 1978

Kann, J., Spiegelhalder, B., Eisenbrand, G., Preussmann, R: Occurence of volatile N-nitrosamines in animal diets. Z. Krebsforsch. 90, 321-323 (1977)

Lijinsky, W., Taylor, H.W.: Increased carcinogenicity of 2,6-dimethyl-nitrosomorpholine compared with nitrosomorpholine in rats. Cancer Res. 35, 2123-2125 (1975)

Magee, P.N., Barnes, J.M.: Induction of kidney tumours in the rat with dimethylnitrosamine (N-ni- trosodimethylamine). J. Pathol. Bacteriol. 84, 19-31 (1962)

Mohr, U., Reznik, G., Reznik-Schfiller, H.: Carcinogenic effects of N-nitrosomorpholine and N-ni- trosopiperidine on European hamster (Cricetus cricetus). J. Nat. Cancer Inst. 53, 231-237 (1974)

Murphy, G.P., Mirand, E.A., Johnsten, G.S., Schmidt, J.D., Scott, W.N.: Renal tumors induced by a single dose of dimethylnitrosamine: morphologic, functional, enzymatic, and hormonal character- ization. Invest. Urol. 4, 39-56 (1966)

Newberne, P.M., Shank, R.C.: Induction of liver and lung tumours in rats by the simultaneous admin- istration of sodium nitrite and morpholine. Fd. Cosmet. Toxicol. 11, 819-825 (1973)

248 P. Bannasch et al.

Peristianis, G.C., Austwick, P.K.C., Carter, R.L.: An ultrastructural investigation of nephrotoxicity in rats induced by feeding cultures of Penicillium verrucosum var. Cyclopium. Virchows Archiv Cell Pathol. 28, 321-337 (1978)

Pliss, G.B., Khudoley, V.V.: Tumor induction by carcinogenic agents in aquarium fish. J. Nat. Cancer Inst. 55, 129-136 (1975)

Reichert, D., Heuschler~ D., Bannasch, P.: Nephrotoxic and hepatotoxic effects of dichloroacetylene. Fd Cosmet. Toxicol. 16, 227-235 (1978)

Reznik, G., Mohr, U., Kmoch, M.: Carcinogenic effects of different N-nitroso-compounds in Chinese hamsters. II. N-nitrosomorpholine and N-nitrosopiperidine. Z. Krebsforsch. 86, 95-102 (1976)

Romen, W.: Zur Pathogenese der Glomerulosklerose. Ver/Sffentlichungen aus der Pathologic, W. Biingeler et al. (Hrsg.), Heft 102. Stuttgart, New York: Fischer 1976

Romen, W., Bannasch, P.: Karyokinese und Kernstruktur w~ihrend der Hepatocarcinogenese. I. Mito- sen und MitosestiSrungen in Hepatozyten und Hepatomzellen der Nitrosomorpholin-vergifteten Rattenleber. Virchows Archiv. Cell Pathol. 11, 24-33 (1972)

Romen, W., Bannasch, P., Aterman, K.: Toxic glomerulosclerosis-morphology and pathogenesis. Vir- chows Archiv Cell Pathol. 19, 205-219 (1975)

Romen, W., Bannasch, P., Aziz, A., Reuss, W.: Karyokinese und Kernstruktur w~hrend der Hepato- carcinogenese. II. Die Feinstruktur des Zellkerns in Hepatozyten und Hepatomzellen der Nitro- somorpholin-vergifteten Rattenleber. Virchows Archiv Cell Pathol. 13, 267-296 (1973)

Sander, J., Biirkle, G.: Induktion maligner Tumoren bei Ratten dutch gleichzeitige Verfiitterung von Nitrit und sekund~iren Aminen. Z. Krebsforsch. 73, 54-66 (1969)

Scherer, E., Emmelot, P.: Kinetics of induction and growth of enzyme-deficient islands involved in he- patocarcinogenesis. Cancer Res. 36, 2544-2554 (1976)

Shank, R.C., Newberne, P.M.: Dose-response study of the carcinogenicity of dietary sodium nitrite and morpholine in rats and hamsters. Fd Cosmet. Toxicol. 14, 1-7 (1976)

Stewart, C.W., Hicks, R.M., Magee, P.N.: Acute biochemical and morphological effects of N-nitro- somorpholine in comparison to dimethyl- and diethylnitrosamine. Chem. Biol. Interact. 11,413-429 (1975)

Taper, H.S., Bannasch, P.: Histochemical correlation between glycogen, nucleic acids and nucleases in pre-neoplastic and neoplastic lesions of rat liver after short-term administration of N-nitrosomor- pholine. Z. Krebsforsch. 87, 53-65 (1976)

Taper, H.S., Bannasch, P.: Histochemical differences between so-called megalocytosis and neoplastic or preneoplastic liver lesions induced by N-nitrosomorpholine. Europ. J. Cancer 15, 189-196 (1979)

Theodossiou, A., Bannasch, P., Reuss, W.: Glykogen und endoplasmatisches Retikulum der Leberzelle nach hohen Dosen des Carcinogens N-Nitrosomorpholin. Virchows Archiv Cell Pathol. 7, 126-146 (1971)

Eingegangen am 3. M~irz 1979/Angenommen am 23. April 1979