ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

----------------------

Bùi Thị Khánh

NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƢỢNG MỘT SỐ ĐỘT

BIẾN CỦA HỘI CHỨNG ĐỘNG KINH, GIẬT CƠ VỚI SỢI CƠ

KHÔNG ĐỀU – MERRF Ở NGƢỜI VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2015

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

------------------------

Bùi Thị Khánh

NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƢỢNG MỘT SỐ ĐỘT

BIẾN CỦA HỘI CHỨNG ĐỘNG KINH, GIẬT CƠ VỚI SỢI CƠ

KHÔNG ĐỀU – MERRF Ở NGƢỜI VIỆT NAM

Mã số: 60420114

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:

GS.TS. Phan Tuấn Nghĩa

Hà Nội – 2015

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến GS.TS.

Phan Tuấn Nghĩa, thầy luôn tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện cho tôi

trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Tôi xin trân trọng cảm ơn TS. Nguyễn Thị Hồng Loan, ThS. Nguyễn Văn

Minh và Cn. Phùng Bảo Khánh và các anh chị em làm việc tại phòng Protein tái tổ

hợp thuộc Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trƣờng

Đại học Khoa học Tự Nhiên đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực nghiệm.

Tôi xin chân thành cám ơn Ban giám hiệu Trƣờng Cao đẳng Y tế Thái Bình,

Trƣởng khoa Y học cơ sở và các anh em trong bộ môn Y học cơ sở đã tạo điều kiện

thuận lợi cho tôi đƣợc đi học nâng cao trình độ của mình.

Tôi xin chân thành cảm ơn đến toàn thể quý thầy, cô trong Bộ môn Sinh lý

thực vật và Hóa sinh, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên đã truyền

đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu.

Tôi xin g i lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu, Phòng Sau Đại học, Ban Chủ

nhiệm Khoa Sinh học và các Phòng chức năng của Trƣờng Đại học Khoa học Tự

nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi học tập, hoàn thành

chƣơng trình học Cao học.

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên,

khích lệ tôi hoàn thành khóa học.

Hà Nội, tháng 12 năm 2015

HVCH: Bùi Thị Khánh

iii

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN …..…………………………………………………………... ii

MỤC LỤC …..…………………………………………………………………….. iii

DANH MỤC C C K HI U VÀ CHỮ VIẾT TẮT….……………….…….vi

DANH MỤC C C BẢNG............................................................................... viii

DANH MỤC C C HÌNH……………………………………………….........ix

MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LI U ............................................................. 3

1.1. CẤU TRÚC VÀ CHỨC NĂNG CỦA TY THỂ NGƢỜI ....................... 3

1.1.1. Cấu trúc của ty thể ............................................................................. 3

1.1.2. Chức năng của ty thể ......................................................................... 6

1.1.2.1. Ty thể hoạt động như một nhà máy năng lượng của tế bào ....... 6

1.1.2.2. Ty thể và quá trình lão hóa ......................................................... 7

1.1.2.3. Ty thể và quá trình tự chết của tế bào ........................................ 9

1.1.3. Hệ gen ty thể và đặc điểm di truyền của hệ gen ty thể .................... 10

1.1.3.1. Hệ gen ty thể ............................................................................. 10

1.1.3.2. Đặc điểm di truyền của hệ gen ty thể ........................................ 12

1.1.3.3. Tính chất dị tế bào chất và tốc độ đột biến của ty thể .............. 12

1.2. ĐỘT BIẾN GEN TY THỂ VÀ C C B NH LIÊN QUAN .................. 13

1.2.1. Các loại đột biến gen ty thể ............................................................. 13

1.2.1.1. Đột biến điểm ............................................................................ 14

1.2.1.2. Đột biến cấu trúc mtDNA ......................................................... 15

1.2.2. Các bệnh do đột biến gen ty thể ...................................................... 15

1.2.2.1. Hội chứng gây ra bởi các đột biến điểm phổ biến trên gen mã

hóa tRNA ................................................................................................ 17

1.2.2.2. Các hội chứng liên quan đến các đột biến điểm phổ biến trên

gen mã hóa protein ................................................................................ 19

1.2.2.3. Các bệnh liên quan đến các đột biến trên gen mã hóa rRNA ... 21

1.2.2.4. Bệnh gây nên bởi các đột biến khác trên mtDNA ..................... 22

1.3. HỘI CHỨNG ĐỘNG KINH, GIẬT CƠ VỚI SỢI CƠ KHÔNG ĐỀU

(MERRF) ....................................................................................................... 24

1.3.1. Các đột biến của hội chứng MERRF ............................................... 25

iv

1.3.1.1. Đột biến A8344G ...................................................................... 25

1.3.1.2. Đột biến T8356C ....................................................................... 26

1.3.1.3. Đột biến G8363A ...................................................................... 26

1.3.2. Những tác động của hội chứng MERRF trên ngƣời

bệnh..........................................................................................................27

1.3.3. Các phƣơng pháp phát hiện đột biến MERRF............................... 30

1.3.3.1. Phát hiện đột biến thuộc hội chứng MERRF bằng PCR kết hợp

với RFLP ........... ………………………………………………………………30

1.3.3.2. Phân tích đột biến thuộc hội chứng MERRF bằng xác định

trình tự gen …...……………………………............................................31

1.3.3.3. Kỹ thuật đa dạng cấu hình sợi đơn SSCP (single-stranded

conformational polymorphism)..………………………………………....31

1.3.3.4. Định lượng đột biến gen ty thể bằng phương pháp real-time

PCR ………………..…………………………………………………………32

1.3.3.5. Phát hiện đột biến DNA ty thể bằng hệ thống cảm biến sinh

học .......................................................................................................... 32

CHƢƠNG 2: NGUYÊN LI U VÀ PHƢƠNG PH P NGHIÊN CỨU ........... 34

2.1. NGUYÊN LI U ..................................................................................... 34

2.1.1. Mẫu bệnh phẩm ............................................................................... 34

2.1.2. Các hóa chất, nguyên liệu khác ....................................................... 34

2.2. M Y MÓC VÀ TRANG THIẾT BỊ ..................................................... 34

2.3. PHƢƠNG PH P NGHIÊN CỨU .......................................................... 35

2.3.1. Tách chiết DNA tổng số .................................................................. 35

2.3.2. Kiểm tra và định lƣợng DNA tách chiết .......................................... 35

2.3.3. Nhân bản đoạn gen ty thể bằng kỹ thuật PCR ................................. 36

2.3.4. Kỹ thuật PCR kết hợp với kỹ thuật đa hình chiều dài các đoạn phân

cắt giới hạn (PCR-RFLP) .......................................................................... 37

2.2.5. Điện di trên gel agarose ................................................................... 37

2.2.6. Điện di trên gel polyacrylamide ...................................................... 38

2.2.7. Kỹ thuật real-time PCR s dụng mẫu dò huỳnh quang dạng khóa

cầu axit nucleic (LNA-locked nucleic acid) .............................................. 39

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................... 43

3.1. THU THẬP MẪU M U B NH NHÂN VÀ T CH CHIẾT DNA

TỔNG SỐ ...................................................................................................... 43

v

3.1. Một số đặc điểm của mẫu phân tích ................................................... 43

3.2. Tách chiết DNA tổng số của các mẫu ................................................ 43

3.2. SÀNG LỌC C C ĐỘT BIẾN GEN THUỘC HỘI CHỨNG MERRF Ở

NGƢỜI VI T NAM BẰNG PHƢƠNG PH P PCR-RFLP ........................ 44

3.2.1. Sàng lọc đột biến A8344G ............................................................... 44

3.2.1.1. Nhân bản đoạn gen từ 8155 - 8366 bằng PCR ......................... 44

3.2.1.2. Phân tích sự có mặt của đột biến A8344G bằng PCR-RFLP ... 45

3.2.2. Sàng lọc đột biến T8356C ............................................................... 47

3.2.1.1. Nhân bản đoạn gen từ 8166 - 8358 bằng PCR ......................... 47

3.2.2.2. Phân tích sự có mặt của đột biến T8356C bằng PCR-RFLP ... 48

3.2.3. Sàng lọc đột biến G8363A ............................................................... 49

3.2.1.1. Nhân bản đoạn gen từ 8342 - 8582 .......................................... 49

3.2.2.2. Phân tích sự có mặt của đột biến G8363A bằng PCR-RFLP ... 51

3.3. XÂY DỰNG ĐƢỜNG CHUẨN ĐỂ ĐỊNH LƢỢNG ĐỘT BIẾN

A8344G BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR ........................................ 53

3.3.1. Thiết kế mẫu dò huỳnh quang Taqman LNA .................................. 53

3.3.1.1. Thiết kế mẫu dò huỳnh quang Taqman LNA ............................. 53

3.3.1.2. Đánh giá tính đặc hiệu của mẫu dò đột biến A8344G .............. 55

3.3.2. Xây dựng đƣờng chuẩn và đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp

real-time PCR để định lƣợng đột biến A8344G ........................................ 57

3.3.2.1. Định lượng số bản sao của plasmid mang đoạn gen đột biến và

không đột biến A8344G.......................................................................... 57

3.3.2. 2. Kết quả xây dựng đường chuẩn đột biến A8344G ................... 57

3.2.4. Th nghiệm khả năng phát hiện và định lƣợng đột biến A8344G .. 61

3.4. SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN GEN THUỘC HỘI CHỨNG MERRF BẰNG

PHƢƠNG PH P GIẢI TRÌNH TỰ TRỰC TIẾP ........................................ 62

3.4.1. Kết quả giải trình tự vùng gen mang đột biến MERRF 8155-9292

trên hệ gen ty thể. ....................................................................................... 62

KẾT LUẬN ....................................................................................................... 64

TÀI LI U THAM KHẢO ................................................................................. 65

PHỤ LỤC …………………………………………………………………………..79

vi

DANH MỤC CÁC K HIỆU VÀ CH VIẾT TẮT

APS Ammonium persulfate

ANT Adenine nucleotide translocase

ADP Adenine diphosphat

ATP Adenine triphosphate

bp Base pair (cặp bazơ)

BFQ Black fluorescence quencher (chất hấp phụ huỳnh quang)

CoQ Coenzyme Q

CPEO Chronic progressive external ophthalmoplegia

(Bệnh liệt mắt cơ ngoài tiến triển kinh niên)

Cyt c Cytochrome c

Cyt b Cytochrome b

D-loop Vòng chuyển vị

dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate

ddH2O Deionized distilled H2O (nƣớc cất loại ion, kh trùng)

EtBr Ethidium bromide

FAD+

Flavin adenine dinucleotide (dạng oxi hóa)

FADH2 Flavin adenine dinucleotide (dạng kh )

IPTG Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranoside

kb Kilobase

KSS Kearns-Sayre syndrome (Hội chứng KSS)

LB Luria Bertani

LHON Leber’s hereditary optic neuropathy

(Bệnh liệt thần kinh thị giác di truyền theo Leber)

LNA Locked nucleic acid (nucleotide dạng khóa)

MELAS Mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis, stroke-like

Episodes (Hội chứng não giật cơ, tăng acid lactic máu và giả

tai biến mạch)

MERRF Myoclonic epilepsy with ragged-red fibres

(Hội chứng động kinh, giật cơ với sợi cơ không đều)

MIDD Maternally inherited diabetes and deafness

vii

(Bệnh tiểu đƣờng và câm điếc di truyền theo mẹ)

MRI Magnetic resonance image (Hình ảnh chụp cộng hƣởng từ)

mtDNA Mitochondrial DNA (DNA ty thể)

nDNA Nuclear DNA (DNA nhân)

NAD+

Nicotinamide adenine dinucleotide (dạng oxi hóa)

NADH Nicotinamide adenine dinucleotide (dạng kh )

NARP Neuropathy, ataxia and retinitis pigmentos

(Hội chứng gây liệt, mất sự điều hòa và viêm võng mạc

OD Optical density (Mật độ quang học)

PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi polymerase)

PEO Progressive external ophthalmoplegia

(Bệnh liệt cơ mắt ngoài tiến triển)

RFLP Restriction fragment length polymorphism

(Sự đa hình các đoạn phân cắt giới hạn)

ROS Reactive oxygen species (dạng oxy phản ứng)

SDS Sodium dodecylsulphate

TAE Tris -Acetate-EDTA

TBE Tris -Borate-EDTA

TEMED N, N, N’, N’- Tetramethyl-Ethylenediamine

Tm Melting temperature (Nhiệt độ tách chuỗi)

viii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Các biểu hiện và triệu chứng lâm sàng của 62 bệnh nhân MERRF . 29

Bảng 2.1: Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR các đoạn gen mang đột biến

MERRF ............................................................................................................. 36

Bảng 2.2: Thành phần bản gel polyacrylamide 12% ........................................ 38

Bảng 2.3: Trình tự của mồi và mẫu dò dùng cho real-time PCR ...................... 41

Bảng 3.1: Trình tự mồi nhân đoạn gen 8155 - 8366 ......................................... 44

Bảng 3.2: Trình tự và sản phẩm cắt của enzyme BanII .................................... 46

Bảng 3.3: Trình tự mồi cho phản ứng PCR đoạn gen 8166 - 8358 .................. 47

Bảng 3.4: Trình tự mồi cho PCR đoạn gen 8342 - 8582 .................................. 50

Bảng 3.5: Trình tự của mẫu dò dùng cho real-time PCR .................................. 54

Bảng 3.6: Tƣơng quan giữa nồng độ DNA plasmid mang đột biến và không

đột biến A8344G ban đầu và số chu kỳ ngƣỡng đƣợc xác định bằng real-time

PCR ................................................................................................................... 58

Bảng 3.7: Tỷ lệ phần trăm plasmid đột biến 8344G pha sẵn ............................ 59

Bảng 3.8: Kết quả thực nghiệm tỷ lệ phần trăm đột biến của mẫu chuẩn. ....... 60

ix

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc ty thể ..................................................................................... 3

Hình 1.2. Cấu tạo màng ty thể ............................................................................ 4

Hình 1.3. Hệ gen ty thể ..................................................................................... 10

Hình 2.1. Cấu trúc của nucleotide cải biến dạng LNA ..................................... 39

Hình 2.2. Nguyên lý hoạt động của mẫu dò Taqman ....................................... 40

Hình 3.1. Điện di sản phẩm DNA tổng số từ mẫu máu của các bệnh nhân ...... 43

Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen 8155 - 8366 ..................... 45

Hình 3.3. Điện di sản phẩm PCR-RFLP đoạn gen 8155 - 8366 của bệnh nhân 46

Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen 8166 - 8385 ..................... 48

Hình 3.5. Điện di sản phẩm PCR-RFLP đoạn gen 8166 - 8385 của bệnh nhân 49

Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen 8342 - 8582 ..................... 50

Hình 3.7. Điện di sản phẩm PCR-RFLP đoạn gen 8166 - 8385 của bệnh nhân 51

Hình 3.8. Kết quả kiểm tra mẫu dò ……………………………………….....60

Hình 3.9. Biểu đồ khuếch đại đoạn gen mang đột biến và không mang đột

biến A8344G bằng real-time PCR .................................................................... 58

Hình 3.10. Sự tƣơng quan giữa tỷ lệ đột biến thực tế và tỷ lệ đột biến lý thuyết 60

Hình 3.11. Th nghiệm định lƣợng 5 mẫu bệnh phẩm không mang đột biến

A8344G bằng real-time PCR ............................................................................ 61

Hình 3.12. Kết quả blast của trình tự 29 mẫu bệnh với trình tự chuẩn J01415.2...63

1

MỞ ĐẦU

Trong hầu hết các tế bào, ty thể là bào quan quan trọng đảm nhiệm chức năng

cung cấp năng lƣợng dƣới dạng ATP cho các hoạt động của tế bào. Ty thể sản xuất

năng lƣợng bằng cách oxy hóa hoàn toàn các hợp chất trung gian của quá trình

chuyển hóa thức ăn của cơ thể tạo thành sản phẩm cuối cùng là H2O, CO2, và năng

lƣợng dƣới dạng ATP.

Ty thể có hệ gen riêng, nhân bản độc lập với hệ gen nhân. DNA ty thể ngƣời

tồn tại ở dạng mạch vòng kép, có kích thƣớc 16.569 bp, với 37 gen, mã hóa cho 2

RNA ribosome, 22 RNA vận chuyển và 13 protein là thành phần cần thiết trong các

phức hợp của chuỗi hô hấp. DNA ty thể dễ bị tổn thƣơng do ty thể là môi trƣờng

giàu dạng oxy phản ứng và thiếu cơ chế s a chữa hiệu quả dẫn đến nhiều đột biến

xuất hiện trong hệ gen ty thể. Hầu hết các hoạt động của tế bào đều dựa vào nguồn

năng lƣợng ổn định do ty thể cung cấp, do đó những sai hỏng trong DNA ty thể có

thể gây ra sự rối loạn đa hệ thống ảnh hƣởng đến nhiều tế bào, mô và các tổ chức

khác nhau.

Năm 1988, Wallace và tập thể đã công bố đột biến điểm đầu tiên trên hệ gen ty

thể ngƣời gây bệnh liên quan đến thần kinh thị giác di truyền theo Leber (Leber’s

hereditary optic neuropathy - LHON). Cho đến nay, hơn 300 đột biến khác nhau

trong hệ gen ty thể ngƣời đã đƣợc xác định, trong đó có hơn 250 đột biến có khả

năng gây bệnh và kèm theo nhiều hội chứng khác nhau.

MERRF (myoclonic epilepsy with ragged-red fibres) là hội chứng động kinh

giật cơ với sợi cơ không đều, ảnh hƣởng đến hệ thần kinh và cơ xƣơng cũng nhƣ

các hệ thống khác của cơ thể, gây nên bởi những đột biến trên gen MT-TK của

DNA ty thể. Ngoài ra, ngƣời mang hội chứng MERRF có thể kèm theo động kinh,

mất điều hòa vận động, suy nhƣợc và mất trí nhớ. Triệu chứng thƣờng khởi phát ở

trẻ em sau một giai đoạn phát triển bình thƣờng, kết quả hay gặp là điếc, thấp bé,

thoái hóa thần kinh thị giác, đôi khi quan sát đƣợc các u mỡ khu trú dƣới da. Tế bào

2

cơ bất thƣờng và xuất hiện sợi cơ màu đỏ bị xé rách nham nhở khi nhuộm với

Gomori trichrome và quan sát dƣới kính hiển vi.

Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về hội chứng

MERRF để xác định nguyên nhân, cơ chế biểu hiện bệnh cũng nhƣ tính di truyền

của bệnh. Tuy nhiên, do tính phức tạp trong tác động lâm sàng, mô bệnh học, cơ

chế phát sinh và biểu hiện bệnh nên việc chẩn đoán bằng phƣơng pháp thăm khám

lâm sàng hay bằng các xét nghiệm thƣờng quy là rất khó khăn, vì thế nhiều bệnh

nhân MERRF vẫn chƣa đƣợc phát hiện và không có phƣơng pháp điều trị hiệu quả.

Ở Việt Nam, gần nhƣ chƣa có công trình nào đi sâu nghiên cứu phát hiện và

định lƣợng đột biến MERRF ở ngƣời Việt Nam.

Nhằm góp phần vào công tác chẩn đoán, điều trị và tƣ vấn di truyền đối với

các bệnh nhân, gia đình bệnh nhân mang hội chứng MERRF chúng tôi tiến hành đề

tài: “Nghiên cứu phát hiện và định lượng một số đột biến của hội chứng động

kinh, giật cơ với sợi cơ không đều - MERRF ở người Việt Nam“.

3

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. CẤU TRÚC VÀ CHỨC NĂNG CỦA TY THỂ NGƢỜI

1.1.1. Cấu trúc của ty thể

Ty thể là bào quan phổ biến đƣợc tìm thấy trong hầu hết các tế bào nhân

chuẩn. Chức năng chính của ty thể là cung cấp năng lƣợng hóa học cần thiết cho các

hoạt động sinh tổng hợp và vận động của tế bào. Ty thể đƣợc lần đầu tiên tìm thấy

trong tế bào cơ năm 1857 bởi nhà giải phẫu học ngƣời Thụy Sĩ, Kollier. Đến năm

1890, nhà mô học ngƣời Đức, Richard Altmann, bằng phƣơng pháp nhuộm fuchsine

đã quan sát đƣợc ty thể ở nhiều tế bào khác nhau dƣới kính hiển vi quang học [27].

Ty thể có đƣờng kính khoảng 0,5-2 µm và chiều dài 7-10 µm. Hình dạng và

số lƣợng ty thể tùy thuộc vào nhu cầu năng lƣợng của mỗi loại tế bào khác nhau,

các tế bào mô cơ xƣơng hoặc thận cần một lƣợng ty thể lớn hơn các tế bào khác

trong cơ thể. Ty thể có thể hình cầu, hình que hay hình sợi nhƣng đều có cấu trúc

chung giống nhau. Ty thể có khả năng thay đổi hình dạng, kích thƣớc, có thể liên

kết với nhau tạo ra những cấu trúc dài hơn hoặc phân ra thành những cấu trúc nhỏ

hơn. Ngoài ra, ty thể có khả năng di chuyển để phản ứng với những thay đổi sinh lý

bên trong tế bào [35].

Hình 1.1. Cấu trúc ty thể [68]

4

Về cấu trúc, ty thể có cấu tạo dạng màng kép, gồm màng trong và màng

ngoài, bao lấy khối chất nền bên trong, khoảng cách giữa hai màng đƣợc gọi là

xoang gian màng. Cả hai màng đều có bản chất là lipoprotein tƣơng tự nhƣ màng

sinh chất, nhƣng có sự khác biệt về hình dạng và các tính chất lý hóa chuyên trách

cho việc thực hiện các chức năng sinh hóa của chúng [35].

Màng ngoài của ty thể có độ dày 6 nm, có tỷ lệ protein (P)/ lipid (L) lớn hơn

hoặc bằng 1. Màng ngoài ty thể chứa tỷ lệ cholesterol thấp (bằng 1/6 so với màng tế

bào hồng cầu), tỷ lệ phosphatidyl choline cao gấp hai lần so với màng tế bào. Màng

ngoài có nhiệm vụ tiếp thu phần lớn protein sản xuất từ tế bào chất để xây dựng ty

thể và kiến tạo màng. Đặc biệt, màng ngoài của ty thể có tính bán thấm rộng hơn

với các ion và các phân t lớn cho phép các ion di chuyển tự do từ ngoài nguyên

sinh chất vào xoang gian màng và ngƣợc lại. Màng ngoài ty thể còn chứa nhiều

enzyme quan trọng nhƣ các transferase, các kinase, cytochrome-reductase, acyl

CoA synthetase [35].

Hình 1.2. Cấu tạo màng ty thể [67]

Màng trong của ty thể có độ dày 6 nm, protein chiếm 80%, lipid chiếm 20%,

và một lƣợng nhỏ cholesterol. Tỷ lệ giữa cholesterol/phospholipid là 1/53. Màng

trong ăn sâu vào chất nền tạo nên các mào răng lƣợc. Cấu trúc “mào” làm tăng diện

tích bề mặt của màng trong gấp ba lần so với màng ngoài và điều này liên quan đến

chức năng của nó là tăng cƣờng vận chuyển điện t và tổng hợp ATP. Màng trong

5

chứa nhiều protein vận chuyển chủ động ATP, ADP, acid béo và các protein

kênh vận chuyển các ion Na+, K

+, Ca

2+ và H

+. Màng trong là nơi bám của 5 phức

hợp thuộc chuỗi hô hấp bao gồm chuỗi vận chuyển điện t (phức hợp I-IV), ATP

synthase (phức hợp V, còn gọi là F1F0-ATPase) và adenine nucleotide

translocase (ANT) [9].

Xoang gian màng (khoảng xen kẽ giữa hai màng) là nơi trung chuyển các

chất giữa hai màng, môi trƣờng cũng tƣơng tự và cân bằng với bào tƣơng của tế

bào. Xoang gian màng chứa nhiều ion H+ từ chất nền đi ra do hoạt động của chuỗi

vận chuyển điện t , chứa cytochrome c (Cyt c) là chất mang điện t cơ động cho

chuỗi hô hấp, giải phóng Cyt c vào bào tƣơng sẽ hoạt hóa enzyme caspase có vai trò

trong quá trình chết theo chƣơng trình của tế bào [32].

Chất nền (matrix) là một vùng vật chất không định hình chứa nhiều cấu trúc

đặc biệt. Chất nền này là một phức hệ protein tan trong nƣớc, tƣơng đối đậm đặc và

chứa các enzyme của chu trình Krebs, các enzyme của quá trình oxy hóa acid béo,

acid amin và bộ máy di truyền riêng của ty thể. Nhƣ vậy, ở tế bào động vật, thực vật

và ngƣời ngoài hệ gen nhân, còn có hệ gen tế bào chất nằm trong ty thể. Ty thể có

vật chất di truyền và bộ máy của riêng nó để tổng hợp nên các RNA cũng nhƣ

protein của chúng. Các DNA ngoài nhiễm sắc thể này mã hóa một số các peptide

của ty thể (ở ngƣời là 13 loại peptide). Các peptide này gắn vào lớp màng trong

cùng với các protein khác đƣợc mã hóa trong nhân tế bào [32].

Ty thể nhân lên theo phƣơng thức rất giống với tế bào vi khuẩn. Khi chúng

trở nên quá lớn, chúng bắt đầu chia đôi. Quá trình này xảy ra sau khi bộ DNA của

ty thể đƣợc nhân đôi hoàn toàn, đƣợc thực hiện bằng sự tạo thành rãnh bên trong và

sau đó màng ngoài thắt lại hình thành hai ty thể con. Đôi khi các ty thể mới đƣợc

tổng hợp ở các trung tâm giàu protein và polyribosome cần thiết. Tuy nhiên, nhiều

ty thể không phân đôi và bị phân hủy trong lyzosome theo cơ chế tự tiêu

(autophagy). Cơ chế này giúp duy trì số lƣợng ty thể đặc trƣng trong một tế bào [9].

6

1.1.2. Chức năng của ty thể

1.1.2.1. Ty thể hoạt động như một nhà máy năng lượng của tế bào

Ty thể đóng vai trò trung tâm trong quá trình chuyển hóa năng lƣợng của tế

bào. Quá trình hô hấp biến đổi hóa học và trao đổi chất tại ty thể đã giúp chúng

chuyển đổi năng lƣợng hóa học tiềm tàng trong các hợp chất hữu cơ tạo ra CO2,

H2O và giải phóng năng lƣợng vào phân t cao năng ATP (adenosine triphosphate).

ATP đƣợc tạo thành từ quá trình phosphoryl hóa oxy hóa dựa trên các phức hệ hô

hấp (gọi là chuỗi vận chuyển điện t ) nằm trên màng trong của ty thể. Quá trình oxy

hóa của tế bào s dụng nguồn các đƣơng lƣợng kh NADH và FADH2 nhƣ nguồn

điện t chính trong chuỗi vận chuyển điện t . Các thành phần của chuỗi vận chuyển

điện t nằm ở màng trong của ty thể bao gồm bốn phức hợp I, II, III và IV và một

số chất mang điện t . Các điện t đƣợc vận chuyển dọc theo chuỗi, ba trong bốn

phức hợp hoạt động nhƣ máy bơm proton, đẩy proton từ chất nền tạo thành dòng

chuyển proton. Nhờ gradient proton và sự chênh lệch điện thế qua màng, mà ATP

đƣợc tổng hợp từ ADP và Pi bởi phức hệ F0F1 synthase, do đó cho phép các proton

trở lại chất nền. Sự kết hợp vận chuyển điện t và tổng hợp ATP hoạt động theo cơ

chế hóa thẩm. Có hai giai đoạn tạo ra ATP ở ty thể, đó là chu trình Krebs diễn ra

trong chất nền và quá trình phosphoryl hóa oxy hóa ở chuỗi vận chuyển điện t nằm

ở màng trong ty thể với sự xúc tác của các phức hệ enzyme [23].

Nguồn tạo ra năng lƣợng trong ty thể là carbohydrate, chất béo và protein

đƣợc lấy từ thức ăn, trong đó chủ yếu là carbohydrate. Các hợp chất carbohydrate,

chủ yếu là glucose thông qua quá trình đƣờng phân (glycolysis) đƣợc phân cắt và

biến đổi cuối cùng tạo thành pyruvate, chất kh NADH và một lƣợng ATP.

Pyruvate đƣợc đƣa vào ty thể và bị oxy hóa, decarboxyl hóa để tạo thành acetyl-

CoA (acetyl-CoA có thể tạo ra từ quá trình oxy hóa acid béo) và tiếp tục đƣợc oxy

hóa hoàn toàn qua chu trình Krebs để tạo thành CO2, H2O và năng lƣợng chủ yếu

đƣợc tích trữ dƣới dạng ATP. Trong chu trình Krebs, điện t và proton H+ đƣợc

tách ra và chuyển đến các phân t nhận điện t là NAD+ và FAD

+ trong chuỗi vận

7

chuyển điện t để tạo thành NADH và FADH2. Chuỗi vận chuyển điện t bao gồm

bốn phức hợp: nicotinamide adenine dinucleotide coenzyme Q reductase (NADH-

CoQ reductase/ phức hệ I), succinate CoQ reductase (phức hệ II), ubiquinol

cytochrome b reductase (phức hệ III), cytochrome c oxidase (phức hệ IV) và hai

phân t vận chuyển điện t giữa các phức hệ là coenzyme ubiquinone (CoQ) và Cyt

c. Phức hệ I và II có vai trò xúc tác cho sự nhận điện t của CoQ từ NADH và

succinate. Sau đó phức hệ III xúc tác cho quá trình chuyển điện t từ CoQ đến Cyt

c. Cuối cùng phức hệ IV xúc tác cho sự vận chuyển điện t từ Cyt c tới chất nhận

cuối cùng là oxy phân t . Ở mỗi giai đoạn, điện t đi qua các phức hệ, năng lƣợng

đƣợc giải phóng ra kèm theo việc bơm các proton (H+) từ chất nền qua màng trong

ra xoang gian màng và làm xuất hiện điện thế màng. Do đó, hệ thống F0F1 synthase

hoạt động và tổng hợp ATP từ ADP và phosphate vô cơ [35].

ATP là nguồn năng lƣợng lớn đƣợc s dụng cho tất cả các quá trình trao đổi

chất cần thiết bên trong tế bào. Vì vậy, khi ty thể bị tổn thƣơng, quá trình sản sinh

ra năng lƣợng bị chậm lại, thậm chí là ngừng lại hoàn toàn. Pyruvate không đƣợc

chuyển hóa tiếp, nên bị biến đổi thành lactate, vì vậy các bệnh nhân bị bệnh ty thể

thƣờng có hàm lƣợng lactate trong máu và trong dịch não tủy cao. Do gần nhƣ tất

cả các tế bào đều dựa vào nguồn năng lƣợng ổn định do ty thể cung cấp nên khi ty

thể bị tổn thƣơng có thể gây ra sự rối loạn đa hệ thống, ảnh hƣởng đến nhiều loại tế

bào cũng nhƣ mô và các cơ quan [35].

1.1.2.2. Ty thể và quá trình lão hóa

Lão hóa là một quá trình sinh học phức tạp, là yếu tố nguy cơ lớn cho sự phát

triển của ung thƣ, thoái hóa thần kinh và các bệnh tim mạch. Cơ chế phân t của sự

lão hóa là vấn đề phức tạp, tuy nhiên quá trình oxy hóa và nitrat hóa protein trong tế

bào đã đƣợc đề xuất là cơ sở cho việc suy giảm chức năng của tế bào và làm giảm

khả năng chống chịu của cơ thể [60].

Các gốc tự do, chủ yếu là các dạng oxy phản ứng (ROS – Reactive oxygen

species) đƣợc xem là những phân t tín hiệu của nhiều hoạt động sinh lý. Những

8

năm 1990, hydrogen peroxide đƣợc làm sáng tỏ là có liên quan đến cytokine,

insulin, yếu tố tăng trƣởng, AP-1 và tín hiệu NF-кB [48]. Sau đó, nhiều báo cáo chỉ

ra rằng H2O2 có thể thúc đẩy sự bất hoạt phosphatase bằng sự oxy hóa cysteine làm

ảnh hƣởng đến con đƣờng truyền tín hiệu [58].

Hệ quả của các phản ứng hô hấp trong ty thể là các điện t chƣa ghép cặp, sự

tƣơng tác của các điện t này với oxy tạo thành các gốc superoxide rất hoạt động,

các gốc tự do có hoạt tính cao. Có tám điểm trong ty thể có khả năng sản xuất O2-

,

superoxide đƣợc chuyển hóa thành hydrogen peroxide (H2O2) bởi superoxide

dismutase (SODs) khi có sự tham gia của một điện t và 2 proton H+ [48].

Ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy rằng ROS có thể gây ra những thay

đổi trong quá trình dịch mã protein. Cụ thể, H2O2 có thể oxy hóa nhóm thiol (-SH)

trong cysteine để tạo thành axit sulphenic (-SOH), tiếp theo phản ứng với GSH sinh

ra glutathionylate (-SSG) mang liên kết disulfide (-S-S-) hoặc amide sulfenyl (-SN).

Mỗi sự thay đổi này có thể ảnh hƣởng đến hoạt động của một protein nhất định.

Phosphorylase bị tác động khá nặng bởi ROS, làm ức chế hoạt động tách gốc

phosphate [48].

Hơn nữa, các gốc tự do khác nhƣ các gốc hydroxyl (OH-) và hydrogen

peoxyde (H2O2) cũng có thể tồn tại ở nồng độ tƣơng đối cao, gây nên nguy cơ oxy

hóa lipid làm tổn thƣơng màng tế bào và ảnh hƣởng đến cấu trúc DNA. Đáng chú ý

rằng sự tác động của các gốc tự do này tới DNA ty thể sẽ lớn hơn DNA trong nhân

do DNA ty thể không liên kết với Histone và không có cơ chế tự s a chữa. Khả

năng tạo năng lƣợng ATP của ty thể giảm và tăng quá trình oxy hoá làm hƣ hại cấu

trúc tế bào. Gốc tự do có thể phá rách màng tế bào khiến chất dinh dƣỡng thất thoát,

tế bào không tăng trƣởng, không đƣợc s a chữa và chết. ROS phá hủy hoặc ngăn

cản sự tổng hợp protein, lipid, đƣờng, tinh bột, enzyme trong tế bào, làm cho

collagen, elastin mất tính đàn hồi khiến da nhăn nheo, cơ khớp cứng nhắc [22].

ROS đƣợc cho là tác nhân chính gây ra những tổn thƣơng sinh lý của tế bào.

Sự tích lũy ROS và các tác nhân oxy hóa có liên quan đến nhiều bệnh lý, bao gồm

9

các bệnh thoái hóa thần kinh, tiểu đƣờng, ung thƣ và lão hóa sớm. ROS và các gốc

tự do gây ra các đột biến gen, tăng sự hình thành và tích lũy các đột biến DNA ty

thể ở các mô trong quá trình lão hóa [48]. Theo thuyết ty thể về lão hoá, việc tích

luỹ những tổn thƣơng ở các thành phần bên trong ty thể bao gồm mtDNA, protein,

lipid làm ảnh hƣởng đến chức năng của ty thể. Nói chung, những tổn thƣơng của

mtDNA trong phạm vi rộng với thời gian dài dẫn đến ty thể bị rối loạn, thậm chí

ngừng hoạt động là nguyên nhân làm cho tế bào chết và cơ thể bị lão hoá [21].

1.1.2.3. Ty thể và quá trình tự chết theo chương trình của tế bào

“Chết theo chƣơng trình” (apoptosis) là một quá trình quan trọng giúp các sinh

vật đa bào duy trì sự toàn vẹn và chức năng của mô và để loại bỏ những hƣ hại hoặc

các tế bào không mong muốn. Ty thể đóng vai trò cốt lõi trong việc điều tiết sự chết

của tế bào bằng cách cung cấp nhiều yếu tố quan trọng bao gồm cả sự hoạt hóa

caspase và phân mảnh nhiễm sắc thể. Ty thể có vai trò quan trọng trong cơ chế tích

tụ Ca2+

và rối loạn quá trình oxy hóa, sự tích lũy lƣợng Ca2+

đủ lớn trong ty thể dẫn

đến sự chết tế bào theo chƣơng trình. Nồng độ và khả năng hoạt động của Ca2+

trong ty thể đƣợc điều khiển bởi họ protein Bcl-2, yếu tố quan trọng tham gia vào

quá trình chết theo chƣơng trình của tế bào [34].

Tín hiệu gây chết nội bào phụ thuộc vào sự phóng thích Cyt c. Tác động của

Cyt c là liên kết với thụ thể protein hoạt hóa procaspase (Apaf-1), tổ hợp lại với

nhau tạo thành heptamer gọi là apoptosome. Apaf-1 trong apoptosome hoạt hóa

procaspase mở đầu (procaspase-9), từ đó hoạt hóa dòng caspase sát thủ để điều dẫn

sự chết tế bào. Bcl-2 điều hòa con đƣờng apoptosis nội bào bằng cách kiểm soát sự

phóng thích Cyt c và các protein khác từ khoảng gian màng của ty thể vào tế bào

chất. Bcl-2 có hai loại: pro-apoptosis Bcl-2 gia tăng sự giải phóng Cyt c và kích

thích sự chết của tế bào; anti-apoptosis Bcl-2 có tác dụng ngƣợc lại, ức chế sự giải

phóng Cyt c từ đó kìm hãm sự chết của tế bào [32, 60].

Nồng độ Ca2+

trong ty thể cũng quyết định đến sự sống còn của tế bào. Sự kích

hoạt nhóm protein pro-apoptosis Bcl-2 đòi hỏi nồng độ ion Ca2+

trong ty thể phải đủ

10

lớn, từ đó dẫn đến các rối loạn về chức năng của ty thể, kích thích giải phóng Cyt c

và hoạt hóa caspase. Mặt khác, khi một lƣợng lớn Ca2+

tích tụ trong ty thể, sẽ tƣơng

tác với cyclophilin D để kích thích mở lỗ bán thấm trên màng trong của ty thể làm

chất nền bị trƣơng lên làm vỡ màng ty thể và phát tán Cyt c. Hơn nữa, Ca2+

còn

kích thích sự tổng hợp các gốc tự do có hoạt tính cao (ROS). Sự dƣ thừa ROS trong

ty thể hoạt động nhƣ chất trung gian của các con đƣờng truyền tín hiệu chết theo

chƣơng trình [34].

Những rối loạn chức năng của ty thể gây ra bởi sự sai hỏng DNA và các yếu tố

gây độc cho gen dẫn đến một kết quả chắc chắn là sự chết tế bào theo chƣơng trình.

1.1.3. Hệ gen ty thể và đặc điểm di truyền của hệ gen ty thể

1.1.3.1. Hệ gen ty thể

Ty thể là bào quan có hệ gen riêng, nhân bản độc lập với gen nhân. DNA ty

thể ngƣời tồn tại ở dạng mạch vòng kép, có kích thƣớc 16.569 bp, gồm 37 gen mã

hóa cho 2 phân t ARN ribosome, 22 phân t ARN vận chuyển và 13 phân t

protein là thành phần cần thiết trong các phức hợp của chuỗi hô hấp.

Hình 1. 3. Hệ gen ty thể [11]

11

ND1-ND6 và ND4L mã hóa 7 tiểu đơn vị của phức hợp (NADH-ubiquinone

oxidoreductase), Cyt b là tiểu đơn vị phức hợp III chỉ đƣợc mã hóa bởi mtDNA

(ubiquinol cytochrome c oxidase reductase), COX 1-3 mã hóa cho 3 tiểu đơn vị của

phức hợp V (ATP synthase). Các phân t protein còn lại của chuỗi hô hấp đƣợc mã

hóa bởi gen nhân, đƣợc dịch mã trong tế bào chất, sau đó đƣợc vận chuyển vào bên

trong ty thể [59].

Đặc biệt, so với hệ gen nhân, hệ gen ty thể chứa rất ít trình tự không mã hóa

xen kẽ với vùng mã hóa. D-loop nằm giữa gen tRNAPhe

(gen MT-TK) và tRNAPro

(gen MT-TP) là vùng không mã hóa lớn nhất và có vai trò quan trọng trong điều

hòa quá trình sao chép và phiên mã của hệ gen ty thể, chứa promoter cho sự phiên

mã chuỗi nặng (H) và chuỗi nhẹ (L), chứa điểm khởi đầu của quá trình tái bản. Hai

gen mã hóa cho rRNA (12S và 16S rRNA) và 22 gen mã hóa cho 22 tRNA đƣợc

nằm giữa các gen mã hóa cho protein. Các gen này cung cấp các RNA cần thiết cho

sự tổng hợp protein bên trong ty thể [11].

Hệ gen ty thể sao chép độc lập với hệ gen nhân bằng một hệ thống riêng trong

ty thể nhƣng các enzyme cho quá trình tái bản lại do hệ gen nhân mã hóa. Quá trình

phiên mã và dịch mã của DNA ty thể lại đƣợc điều khiển bởi gen nhân. Hệ gen ty

thể đƣợc phiên mã từ một điểm khởi đầu nằm trên vùng D-loop, bản phiên mã sau

đó đƣợc endonuclease phân cắt để hình thành nên phân t rRNA 12S và 16S, tRNA

và mRNA tiền thân. Phân t mRNA hoàn thiện của ty thể không đƣợc gắn mũ

nhƣng có đuôi polyA. Mô hình phiên mã trên có nhiều điểm giống với một operon

của vi khuẩn [11, 59].

Các tế bào ngƣời có thể chứa tới hàng ngàn bản sao mtDNA trong một tế bào và

có số lƣợng dao động tùy thuộc vào nhu cầu s dụng năng lƣợng của từng loại tế bào.

Số bản sao mtDNA giảm nhiều lần trong quá trình tạo tinh trùng nhƣng dƣờng nhƣ

tăng đột ngột trong quá trình tạo trứng. Số lƣợng bản sao mtDNA thay đổi rất lớn ở

các mô khác nhau và đƣợc kiểm soát nghiêm ngặt trong thời kỳ đầu của quá trình

phát triển của động vật. Số bản sao mtDNA tăng khi quá trình trao đổi chất tăng [46].

12

1.1.3.2. Đặc điểm di truyền của hệ gen ty thể

Sự di truyền của các gen trên mtDNA là sự di truyền qua tế bào chất. Giống

nhƣ các DNA ngoài nhân, DNA ty thể đƣợc di truyền theo dòng mẹ, ngƣời mẹ

truyền gen ty thể cho các con, nhƣng chỉ con gái của bà mới có thể truyền các kiểu

gen này cho thế hệ tiếp theo. Cơ chế di truyền này đƣợc lý giải bởi tế bào trứng của

ngƣời phụ nữ trung bình chứa khoảng 100.000 phân t DNA ty thể, trong đó một

tinh trùng khỏe mạnh chỉ chứa trung bình 100 - 1500 phân t , mặt khác sự suy thoái

của mtDNA trong đƣờng sinh dục nam và sự phá hủy mtDNA của tinh trùng khi

vào tế bào trứng là rất rõ ràng nên mtDNA trong tế bào hợp t thƣờng chỉ đƣợc

thừa hƣởng từ trứng [29, 61].

Đối với các gen nằm trong nhân của tế bào sinh vật nhân chuẩn, chúng tuân

theo các quy luật hoạt động của nhiễm sắc thể trong các cơ chế phân bào. Nhƣng

hệ gen ty thể lại không tuân theo những quy luật đó mà các tính trạng do chúng

xác định có những kiểu di truyền riêng đặc trƣng cho chúng. Đột biến mtDNA

đƣợc truyền từ mẹ sang con nhƣng tỷ lệ số bản sao mang đột biến ở mẹ và con

khác nhau, các cá thể mang đột biến trong một phả hệ gia đình cũng có sự thay

đổi về tần suất đột biến vì vậy mức độ biểu hiện bệnh ở mẹ và các con có thể rất

khác nhau [29, 46].

Một đặc điểm khác biệt nổi bật về tính di truyền gen ty thể là tần số xuất hiện

của gen đột biến giữa mẹ và con cái. Ví dụ, một ngƣời mẹ khỏe mạnh mang đột

biến mtDNA có thể sinh ra hai ngƣời con với tần suất mang gen đột biến hoàn toàn

khác nhau, một ngƣời con khỏe mạnh và một ngƣời con có biểu hiện bệnh trầm

trọng ngay từ khi còn nhỏ. Kiểu di truyền này đƣợc gọi là “nút cổ chai”, theo đó tần

suất mang mtDNA đột biến của các thế hệ con cháu khác nhau đáng kể và cũng

khác với mẹ [14, 46, 50].

1.1.3.3. Tính chất không đồng nhất và tốc độ đột biến của ty thể

Mỗi tế bào có thể chứa hàng ngàn bản sao DNA. Vì vậy, khi xuất hiện đột biến

thì trong cùng một mô có thể có cả mtDNA bình thƣờng và mtDNA đột biến, hiện

13

tƣợng này đƣợc gọi là tính không đồng nhất (Heteroplasmy). Nếu các bản sao của

mtDNA đều giống nhau thì đƣợc gọi là đồng nhất giữa các bản sao ty thể

(Homoplasmy).

Số bản sao mtDNA đột biến so với tổng lƣợng mtDNA của tế bào sẽ xác định

mức độ heteroplasmy, là một nhân tố quyết định mức độ nghiêm trọng của bệnh. Đa

số các đột biến mtDNA gây bệnh đều tồn tại ở dạng heteroplasmy. Những hiểu biết

về mức độ dị plasmid của ngƣời mang đột biến là thông số quan trọng để có thể tiên

lƣợng đƣợc tình trạng bệnh lý và sự di truyền của đột biến gen ty thể [14].

mtDNA có tốc độ đột biến cao gấp 10 - 20 lần so với DNA trong nhân, do hệ

gen ty thể ở dạng trần (không liên kết với các protein bảo vệ kiểu histone nhƣ hệ gen

nhân), không chứa trình tự intron, hệ gen ty thể dễ tiếp xúc với các gốc tự do [54].

Ngoài ra, ty thể không có cơ chế s a chữa DNA hiệu quả nhƣ với DNA trong nhân.

Hiện nay, đã có nhiều đột biến gen ty thể gây bệnh đƣợc phát hiện và nghiên cứu.

Các đột biến gen ty thể này thƣờng gây ra các triệu chứng khác nhau, tuy nhiên chủ

yếu tập trung vào cơ, thần kinh và các chuyển hóa của cơ thể.

1.2. ĐỘT BIẾN GEN TY THỂ VÀ CÁC BỆNH LIÊN QUAN

1.2.1. Các loại đột biến gen ty thể

Bộ gen ty thể có tỷ lệ đột biến rất cao, cao hơn từ 10 đến 20 lần so với đột biến

DNA trong nhân.

Hầu hết những thay đổi trên DNA ty thể là đa hình và có vai trò quan trọng

trong việc theo dõi sự di cƣ của con ngƣời. Những đột biến mtDNA gây bệnh

đầu tiên đã đƣợc xác định vào năm 1988. Kể từ đó, hơn 250 đột biến mtDNA

gây bệnh đã đƣợc phát hiện và nghiên cứu, bao gồm hai loại đột biến chính là

đột biến điểm và đột biến cấu trúc. Các đột biến mtDNA có tính không đồng

nhất về biểu hiện lâm sàng và tuổi khởi phát bệnh, do đó việc xác định tỷ lệ của

bệnh đột biến gen ty thể là rất khó khăn. Ƣớc tính ở phía Đông Bắc nƣớc Anh có

tỷ lệ 1/10.000 ngƣời đã có biểu hiện lâm sàng bệnh ty thể và 1/6000 ngƣời có

nguy cơ mắc bệnh. Nghiên cứu tỷ lệ sinh gần đây đã báo cáo tần số đột biến là

14

0,14% đối với đột biến A3243G và 0,2% đối với đột biến A1555G liên quan đến

MT-RNR1 aminoglycoside gây ra mất thính giác, điều này chứng tỏ rằng những

hiểu biết về đột biến gen ty thể còn nhiều hạn chế [31, 56].

1.2.1.1. Đột biến điểm

Đột biến điểm là đột biến thay thế, mất hoặc thêm một nucleotide xảy ra trong

cấu trúc của gen tại một điểm trên phân t DNA. Hơn 250 đột biến điểm gây bệnh

đã đƣợc xác định trên gen ty thể qua các bệnh nhân với hàng loạt các rối loạn khác

nhau (http://mitomap.org/MITOMAP), thƣờng di truyền từ mẹ sang con và liên

quan đến nhiều hệ thống cơ quan. Đột biến điểm trên mtDNA có thể xảy ra trên gen

mã hóa tRNA, rRNA hay protein, tuy nhiên hơn một n a trong số các đột biến điểm

đƣợc báo cáo liên quan đến gen tRNA của ty thể [31].

tRNA ty thể có cấu trúc ngắn hơn và khác biệt với tRNA trong tế bào chất

(mã hóa bởi gen nhân) nên sự sai khác về 1 nucleotide dẫn đến thay đổi dạng

hình L của tRNA, ảnh hƣởng đến cấu trúc bậc ba của chúng. Một số đột biến

trên tRNA ty thể dẫn đến những khiếm khuyết trên phức hợp OXPHOS. Tùy

thuộc vào điểm đột biến trên gen tRNA ty thể sẽ ảnh hƣởng đến các kênh vận

chuyển điện t khác nhau trong chuỗi hô hấp tế bào. Các nguyên nhân gây ra

khiếm khuyết trong quá trình tổng hợp các tRNA ty thể là rất nhiều bao gồm: kết

thúc phiên mã, biến đổi tRNA trƣởng thành, thay đổi bộ ba đối mã, ảnh hƣởng

đến cấu trúc và chức năng của tRNA do đó giảm khả năng gắn acid amin, giảm

liên kết với các yếu tố dịch mã mtEFT hoặc các ribosome ty thể. Đột biến điểm ở

gen mã hóa protein ty thể đặc biệt ảnh hƣởng đến các chức năng của phức hợp

chuỗi hô hấp tế bào mà nó đảm nhiệm [56].

Đột biến điểm trên mtDNA chủ yếu ở dạng không đồng nhất (heteroplasmy),

tỷ lệ đột biến giữa các mô trong cùng một cá thể cũng rất khác nhau. Một số đột

biến gen ty thể ở dạng đồng nhất (homoplasmy) đang đƣợc nghiên cứu nhiều hơn,

đột biến này thƣờng ảnh hƣởng đến các mô xác định và có biểu hiện lâm sàng đặc

15

trƣng. Tuy nhiên, đột biến điểm gen ty thể rất đa hình nên việc xác định tỷ lệ đột

biến gen gây bệnh ty thể là vấn đề cần đƣợc nghiên cứu nhiều hơn nữa [31].

1.2.1.2. Đột biến cấu trúc mtDNA

Đột biến cấu trúc gen ty thể bao gồm mất đoạn, lặp đoạn và một số sự sắp xếp

cấu trúc phức tạp khác đã nghiên cứu đƣợc trong các tình trạng bệnh lý. Phần lớn

đột biến cấu trúc mtDNA đƣợc phát hiện liên quan đến mất đoạn, thay đổi kích

thƣớc khoảng 1,3 - 8 kb hay một vài gen. Đột biến mất đoạn mtDNA thƣờng xảy ra

ở giai đoạn sớm trong quá trình phát triển của hợp t dẫn đến tần số xuất hiện và

biểu hiện bệnh ở các mô là tƣơng tự nhau. Kích thƣớc đoạn mtDNA bị mất có thể

do đột biến gen nhân quy định việc duy trì, sao chép và trao đổi nucleotide trong

mtDNA (ví dụ, POLG và PEO1 mã hóa Twinkle) [56].

Ở cấp độ phân t , khoảng 60% đột biến mất đoạn mtDNA xảy ra trong khu

vực mtDNA mà hai bên là trình tự lặp ngắn, kiểu mất đoạn này đƣợc gọi là đột biến

mất đoạn type I. Khoảng 30% đột biến mất đoạn mtDNA xảy ra tại những vùng có

trình tự lặp không tuyệt đối, đƣợc gọi là mất đoạn type II. Còn lại khoảng 10% đột

biến mất đoạn xảy ra ở vùng không có trình tự lặp. Mất đoạn mtDNA phổ biến nhất,

gặp ở khoảng 1/3 số bệnh nhân, là đột biến mất đoạn 5 kb (8470 - 13447) đƣợc giới

hạn bởi trình tự lặp 13 bp (type I) [24].

Mặc dù có nguồn gốc khác nhau, hầu hết đột biến mất đoạn mtDNA đều có

đặc điểm chung, chủ yếu xảy ra từ quá trình phiên mã. Cơ chế xảy ra đột biến cũng

giống nhau, Krishnan và cộng sự [24] đã đề xuất rằng mất đoạn mtDNA phát sinh

trong quá trình s a chữa các sai hỏng trong phân t mtDNA tái bản. Số lƣợng

nucleotide bị mất và tần suất xuất hiện của đột biến trong các mô là cơ sở quan

trọng cho việc xác định triệu chứng lâm sàng của bệnh, nhƣng có thể không tỷ lệ

thuận với nhau.

1.2.2. Các bệnh do đột biến gen ty thể

Ty thể là bào quan sản xuất năng lƣợng quan trọng trong các tế bào nhân

chuẩn. Bệnh ty thể là bệnh lý trong đó khả năng sản xuất năng lƣợng và đảm

16

nhiệm vai trò bình thƣờng trong tế bào của ty thể bị tổn hại. Nhiều nghiên cứu

cho thấy đột biến mtDNA là một trong các nguyên nhân chủ yếu gây bệnh ở

ngƣời, ngoài ra một số đột biến gen nhân cũng có thể làm mất chức năng của ty

thể gây nên bệnh ty thể [56]. Bệnh ty thể có ảnh hƣởng đến nhiều cơ quan với tập

hợp các triệu chứng liên quan đến cơ, hệ thần kinh và các cơ quan thiết yếu cho sự

sống cần năng lƣợng cao. Biểu hiện lâm sàng của bệnh ty thể rất đa dạng, có những

triệu chứng đan xen vào nhau, thƣờng đƣợc xác định bởi tình trạng thiếu năng

lƣợng tế bào do khiếm khuyết quá trình phosphoryl hóa oxy hóa.

Sự khởi phát các triệu chứng lâm sàng, sự biến đổi kiểu hình và mức biểu

hiện của bệnh ty thể chịu sự chi phối của một số yếu tố bao gồm hiệu ứng

ngƣỡng, sự phân chia tế bào chất trong phân bào, số lƣợng bản sao DNA đƣợc

nhân lên trong ty thể, và sự di truyền “nút cổ chai”. Nhiều đột biến gen gây bệnh

ty thể ở trạng thái không đồng nhất, trong trƣờng hợp này thì tỷ lệ gen đột biến

có liên quan đến mức độ biểu hiện của bệnh. Tỷ lệ gen đột biến nhỏ nhất cần

thiết có thể gây nên những biến đổi sinh hóa và chức năng của tế bào dẫn đến

biểu hiện lâm sàng của bệnh đƣợc gọi là ngƣỡng biểu hiện của đột biến. Giá trị

ngƣỡng này khác nhau đối với từng loại đột biến và giữa các mô, cơ quan trong

cơ thể; sự hô hấp của tế bào theo con đƣờng hiếu khí sẽ bị ảnh hƣởng sớm hơn

so với con đƣờng kị khí. Thông thƣờng các giá trị ngƣỡng trong khoảng 60 -

90% gen đột biến mtDNA [14]. Trong quá trình phân bào, ty thể đƣợc tách ngẫu

nhiên và trong tế bào con sẽ không có sự đồng nhất về tỷ lệ đột biến mtDNA, sự

thay đổi này đôi khi thấp hơn hoặc cao hơn ngƣỡng biểu hiện của bệnh. Mặt

khác, mỗi ty thể của tế bào có hàng ngàn bản sao DNA dẫn đến sự thay đổi tỷ lệ

mtDNA đột biến trong tế bào và mô. Cơ chế di truyền “nút cổ chai” cũng quyết

định sự biểu hiện bệnh ty thể ở các con sinh ra từ trứng của ngƣời mẹ mang đột

biến gen ty thể ở dạng không đồng nhất, bởi sự di truyền ngẫu nhiên lƣợng

mtDNA đột biến vào tế bào trứng của mẹ tạo nên tỷ lệ không đồng nhất ở tế bào

hợp t cao hơn hay thấp hơn ngƣỡng biểu hiện của bệnh [46].

17

Từ việc xác định đƣợc các đột biến mtDNA đầu tiên vào năm 1988, sau đó đã

có nhiều nghiên cứu quan trọng đi sâu tìm hiểu những rối loạn di truyền mtDNA

dẫn đến tình trạng bệnh lý. Hiện nay, đã có hơn 250 đột biến mtDNA gây bệnh

đƣợc xác định. Ngoài ra còn có nhiều báo cáo về các đột biến gen nhân làm thay đổi

protein trong chuỗi hô hấp của ty thể gây nên bệnh ty thể. Những nghiên cứu này

làm sáng tỏ cơ chế phân t của bệnh ty thể, đặc biệt tập trung vào các khuyết tật di

truyền mtDNA, hệ quả chức năng đặc trƣng của đột biến mtDNA nhằm mang lại sự

tiến bộ về phƣơng pháp chẩn đoán và điều trị bệnh ty thể.

1.2.2.1. Hội chứng gây ra bởi các đột biến điểm phổ biến trên gen mã hóa tRNA

Hội chứng MELAS (mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis and

stroke-like episodes) là hội chứng não giật cơ, tăng acid lactic máu và giả tai

biến mạch, đƣợc di truyền từ mẹ sang con. Bệnh có ảnh hƣởng đến nhiều hệ

thống của cơ thể, đặc biệt là não bộ, hệ thần kinh và cơ bắp. Các dấu hiệu và

triệu chứng của rối loạn này thƣờng xuất hiện ở trẻ em sau một thời gian phát

triển bình thƣờng, có thể khởi phát ở mọi lứa tuổi. Triệu chứng của bệnh bao

gồm yếu cơ, đau cơ, đau đầu, nôn, và co giật, một số cá nhân có thể bị đột quỵ

trƣớc tuổi 40. Bệnh tiến triển có thể là liệt n a ngƣời, bất thƣờng về thị giác, co

giật và nhức đầu nghiêm trọng, những lần đột quỵ lặp lại làm tổn thƣơng não dẫn

đến mất thị lực, mất chức năng trí tuệ [6, 56].

Hầu hết bệnh nhân MELAS đều bị tích tụ acid lactic trong cơ thể dẫn đến

nhiễm toan làm nôn m a, đau bụng, rất mệt mỏi, yếu cơ và khó thở. Một số trƣờng

hợp MELAS co thắt cơ không tự chủ, giảm thính lực, bệnh tim và thận, tiểu đƣờng,

mất cân bằng nội tiết tố [40].

Nguyên nhân là do một trong các loại đột biến A3243G, A3251G, T3271C,

T3291C, A3252G, A3260G, C3256T trên gen MT-TL1 mã hóa cho tRNALeu

; đột

biến G13513A, A12770G và A13514G trên gen MT-ND5 mã hóa cho ND5

ubiquinone oxidoreductase của phức hợp I, G583A trên gen MT-TF mã hóa cho

tRNAPhe, G1642A trên gen MT-TV mã hóa cho tRNA

Val, A5814G trên gen MT-TC

18

mã hóa cho tRNACys. Trong đó, đột biến A3243G chiếm 80% số ca mang hội chứng

MELAS, tiếp theo là đột biến T3271C xảy ra khoảng 7,5% [16]. MELAS có thể gây

ra bởi các đột biến điểm mtDNA ở các gen khác nhƣ COXIII, ND1, ND5 hoặc gen

mã hóa tRNAPhe

, tRNAVal

, tRNACys

, rRNA hoặc mất đoạn với kích thƣớc ngắn. Tuy

nhiên, đột biến trên tRNALeu

vẫn là đột biến phổ biến nhất liên quan đến kiểu hình

MELAS. Trong số đó, đột biến A3243G đƣợc báo cáo đầu tiên trên gen mã hóa cho

tRNALeu

và là đột biến phổ biến nhất ở tất cả chủng tộc [1]. Nhƣ vậy, đột biến

A3243G là một chỉ tiêu quan trọng để chẩn đoán hội chứng MELAS ngoài các kiểm

tra lâm sàng.

Hội chứng CPEO (chronic progressive external ophthalmoplegia) là hội

chứng liệt cơ mắt ngoài tiến triển do rối loạn chức năng ty thể, thƣờng gặp ở ngƣời

lớn. Triệu chứng điển hình của bệnh là liệt cơ mắt, sa mí mắt, rối loạn tâm thần và

đột t .

CPEO là một bệnh tiến triển chậm, có thể bắt đầu ở mọi lứa tuổi và tiến triển

trong khoảng thời gian 5 đến 15 năm. Các triệu chứng đầu tiên xuất hiện thƣờng là

mí mắt sụp xuống làm giảm giới hạn vận động của mắt, hạn chế tầm nhìn của mắt,

và tổn thƣơng giác mạc. Bệnh nhân thƣờng s dụng cơ trán để giúp nâng mí mắt

nên có thể xảy ra teo các nhóm cơ trên mặt, khó khăn trong việc nhai, một số bệnh

nhân đục thủy tinh thể, suy giảm thính giác, đau thần kinh sợi trục, mất điều hòa co

cơ, Parkinson [56].

CPEO là tình trạng bệnh gây nên bởi những khuyết tật trong ty thể làm ảnh

hƣởng đến quá trình phosphoryl oxy hóa trên chuỗi hô hấp tế bào. Trong một số

trƣờng hợp, đột biến ở gen MT-TL1 trên mtDNA gây nên CPEO. Nguyên nhân của

bệnh là do đột biến A3243G nằm trên gen mã hóa tRNALeu(UUR)

và đột biến T4274C

nằm trên gen mã hóa tRNAIle. Mất đoạn mtDNA là nguyên nhân quan trọng gây

nên hội chứng CPEO, những mất đoạn có kích thƣớc 3,4 đến 6,9 kb với mức độ

không đồng nhất dao động trong khoảng 18,8 đến 85,5% cho thấy các biểu hiện lâm

sàng khác nhau. Một nghiên cứu trên những bệnh nhân nghi mắc bệnh ty thể ở

19

Malaysia cho thấy rằng độ dài, vị trí mất đoạn và mức độ không đồng nhất đóng vai

trò quan trọng trong việc xác định kiểu hình lâm sàng của bệnh nhân CPEO, hai

bệnh nhân nặng đƣợc tìm thấy mất đoạn mtDNA có kích thƣớc 4320 bp và 4717 bp.

Bệnh nhân CPEO có thể mang đột biến điểm, bao gồm các đột biến trên tRNALeu

,

tRNAIle và tRNA

Asp. Mặt khác, các đột biến gen POLG, SLC25A4 và C10orf2 trên

DNA nhân cũng là nguyên nhân gây bệnh, những gen này rất quan trọng để bảo vệ

mtDNA. Mặc dù cơ chế chƣa rõ ràng, nhƣng đột biến bất kỳ trong 3 gen này đều

dẫn đến mất đoạn lớn trên mtDNA, dao động từ 2-10 kb [17].

1.2.2.2. Các hội chứng liên quan đến các đột biến điểm phổ biến trên gen mã

hóa protein

Hội chứng Leigh (bệnh viêm não tủy cấp di truyền theo Leigh)/NARP

(neuropathy, ataxia and retinitis pigmentos)

Hội chứng Leigh và NARP (yếu cơ do thần kinh, mất điều hòa và viêm sắc tố

võng mạc) là một phần của chuỗi các rối loạn thoái hóa thần kinh tiến triển gây ra

bởi sự bất thƣờng của chuỗi hô hấp tế bào trong ty thể [53].

Hội chứng Leigh đặc trƣng bởi tình trạng thoái hóa thần kinh tiến triển,

trong đó đặc biệt ảnh hƣởng đến não, não trung gian và hạch thần kinh, thƣờng

dẫn đến t vong do suy hô hấp. Các dấu hiệu đầu tiên ở trẻ mắc hội chứng Leigh

là nôn m a, tiêu chảy, khó nuốt dẫn đến ăn uống kém, không phát triển, giảm

trƣơng lực cơ, co cơ không kiểm soát, mất cảm giác và yếu ở các chi, triệu

chứng phổ biến là c động khó khăn. Một số cá nhân liệt cơ mắt, teo dây thần

kinh thị giác, phì đại cơ tim. Ngoài ra, khó thở thƣờng gặp ở những ngƣời mắc

hội chứng Leigh dẫn đến suy hô hấp, hoặc sự tích tụ lactate trong cơ thể đo đƣợc

ở máu, dịch não tủy và nƣớc tiểu [56].

NARP đƣợc đặc trƣng bởi yếu cơ do thần kinh gây mất cảm giác thần kinh,

mất điều hòa và bệnh võng mạc sắc tố. Triệu chứng khởi phát là mất điều hòa vận

động và trí tuệ chậm phát triển, thƣờng xuất hiện ở trẻ em. Một số bệnh nhân NARP

20

có thể tƣơng đối ổn định trong nhiều năm, nhƣng có thể bị xuống cấp từng đợt,

thƣờng có biểu hiện rõ ràng khi kết hợp với các bệnh do virus [66].

Hầu hết các đột biến gen ty thể gây ra hội chứng Leigh đƣợc báo cáo là trên

các gen MT-ATP6, MT-ND3 và MT-ND5, một vài đột biến đƣợc xác định trên các

gen MT-ND2, MT-ND6 và MT-ND4. Ngoài ra, còn có trƣờng hợp trên gen liên

quan đến quá trình tổng hợp protein, đó là gen MT-TV mã hóa cho tRNAVal

, gen

MT-TL1 mã hóa cho tRNALeu

, gen MT-TW mã hóa cho tRNATrp

và gen MT-TK

mã hóa cho tRNALys

. MT-ATP6 là gen duy nhất bị đột biến gây NARP [66].

Trong các trƣờng hợp của hội chứng Leigh, đa số các đột biến nằm trên gen

MT-ATP6, đặc biệt tại vị trí T8993G hoặc T9176C. Sự biến đổi T thành G tại 8993

trong mtDNA ngƣời là một trong các đột biến ty thể kèm theo hội chứng Leigh

đƣợc mô tả nhiều nhất. Đột biến này thay thế leucine thành arginine tại vị trí 156

trên ATPase 6 của ty thể, một trong hai tiểu đơn vị của tiểu phần Fo của phức hệ

ATPase (phức hệ V), làm cho quá trình tổng hợp ATP bị lỗi, tạo ra nhiều gốc oxy tự

do, gây nên các triệu chứng lâm sàng khác nhau [53].

Hội chứng Leigh còn liên quan đến sự biến đổi T12706C của gen ND5, dẫn

đến thay thế phenylalanine bằng leucine ở vị trí 124. ND5 là gen chức năng gồm

1812 bp (từ vị trí 12337 tới 14148) đƣợc mã hóa bởi chuỗi nặng của mtDNA. Sản

phẩm của gen ND5 là một thành phần của phức hệ NADH-ubiquinon

oxidoreductase. Sản phẩm của gen ND5 nằm ở phần kỵ nƣớc của phức hệ I. Protein

này là một trong 7 tiểu phần đƣợc mã hóa bởi mtDNA trong số 42 tiểu phần của

phức hệ I của chuỗi hô hấp. Đột biến trên gen ND5 có liên quan tới nhiều bệnh

trong đó có LHON, Leigh và MELAS [61].

Hội chứng LHON (Leber herteditary optic neuropathy) là hội chứng liệt thần

kinh thị giác di truyền theo Leber, tác động chủ yếu đến võng mạc, gây hội chứng

teo dây thần kinh thị giác, làm mất khả năng nhìn thấy ở cả hai mắt. Bệnh thƣờng

phát triển ở tuổi trƣởng thành, tỷ lệ ảnh hƣởng của nam giới cao hơn 4 đến 5 lần so

với nữ giới. Ngƣời mang bệnh ban đầu hoàn toàn không có biểu hiện cho đến giai

21

đoạn phát triển thị giác làm mờ một mắt, mắt còn lại biểu hiện tƣơng tự sau 2 - 3

tháng, khoảng 25% bệnh nhân khởi phát bệnh với 2 mắt ở cùng thời điểm. Thị lực

giảm nghiêm trọng đến mức không thể đếm đƣợc ngón tay hoặc kém hơn nữa. Sau

giai đoạn cấp tính, đĩa quang trở nên teo. Bất thƣờng về thần kinh nhƣ run chân tay,

bệnh thần kinh ngoại biên, bệnh cơ và rối loạn vận động đƣợc báo cáo là thƣờng

gặp ở bệnh nhân LHON, ở nữ giới có thể phát triển triệu chứng đa xơ cứng [69].

Khoảng 95% trƣờng hợp LHON gây ra bởi các đột biến liên quan đến các tiểu

đơn vị của phức hệ I, bao gồm đột biến G11778A trên gen ND4 (50-70% trƣờng hợp),

đột biến G3460A trên gen ND1 (15% trƣờng hợp) và đột biến T14484C trên gen ND6

(10% trƣờng hợp). Đột biến G11778A là nguyên nhân phổ biến nhất của LHON.

Ngoài ra, còn có các đột biến hiếm khác liên quan đến gen ND5 và ND6 [3].

Các đột biến trên gen ND6 bao gồm T14484C, T14459C, các đột biến này

không những gây ra các triệu chứng của hội chứng LHON mà còn gây ra hội chứng

Leigh. Đột biến G14453A cũng trên gen này, tác động lâm sàng phức tạp hơn, kèm

theo các triệu chứng của LHON còn có các biểu hiện của MELAS.

LHON thƣờng là do một đột biến mtDNA homoplasmy và các con sẽ kế thừa

các đột biến từ mẹ. Tuy nhiên khoảng 50% nam giới sẽ biểu hiện bệnh, trong khi

chỉ có 10% nữ giới bị mất thị giác. Sự tiến triển của bệnh phụ thuộc vào gen đột

biến, 71% bệnh nhân đột biến T14484C có dấu hiệu phục hồi, trong khi đó ở bệnh

nhân A11778G chỉ là 25%. Phần lớn các bệnh nhân mang đột biến A11778G sớm

khởi phát triệu chứng LHON, đã có một vài báo cáo về kiểu hình suy thoái thần

kinh thị giác [69].

1.2.2.3. Các bệnh liên quan đến các đột biến trên gen mã hóa rRNA

Bệnh do đột biến trên gen mã hóa rRNA chiếm tỷ lệ rất nhỏ. Đột biến A1555G

và C1494T đƣợc phát hiện trên gen mã hóa cho rRNA 12S, các đột biến này gây

mất khả năng nghe do kích thích bởi aminoglycoside và mất khả năng nghe không

có hội chứng. Trong đó, đột biến A1555G phổ biến hơn C1494T.

22

Đột biến A1555G là đột biến điểm mtDNA nằm trên gen MT-RNR1, quy dịnh

sự tổng hợp 12S rRNA. Đột biến này nằm trên vị trí mã hóa tiểu đơn vị rRNA và

đƣợc dự đoán gây ra một sự thay đổi trong cơ cấu thứ cấp của rRNA. Sự thay đổi

này làm suy yếu tổng hợp protein và tăng cƣờng tƣơng tác với kháng sinh

aminoglycoside, tiếp tục làm trầm trọng hơn tình trạng bệnh [2]. Đột biến đơn

thuần thƣờng không dẫn đến tình trạng bệnh lý, nhƣng khi kết hợp với các yếu tố

môi trƣờng nhƣ kháng sinh nhóm aminoglycoside sẽ biểu hiện triệu chứng bệnh

điển hình, thƣờng quan sát đƣợc là mất thính lực ở các mức độ khác nhau. Đột

biến A1555G thƣờng ở dạng đồng nhất nhƣng biểu hiện triệu chứng bệnh của

các thành viên trong gia đình là rất khác nhau. Trong một nghiên cứu cũng chỉ ra

rằng biểu hiện của bệnh chịu ảnh hƣởng của việc s dụng kháng sinh

amimoglycoside với 96,5% ở nhóm tuổi 30 điều trị kháng sinh và 39,9% với

nhóm không điều trị kháng sinh [7].

Đột biến khác trên gen rRNA 12S là T1095C, gây nên sự thay đổi base bảo thủ

ở vòng xoắn 25 của rRNA 12S. Nucleotide này nằm ở vị trí P của ribosome, có vai

trò quan trọng trong giai đoạn khởi đầu của quá trình tổng hợp protein của ty thể.

Sự thay đổi cấu trúc bậc ba của rRNA 12S làm ảnh hƣởng đến quá trình tổng hợp

protein, vì vậy dẫn đến mất chức năng của ty thể và gây ra mất khả năng nghe.

1.2.2.4. Bệnh gây nên bởi các đột biến khác trên mtDNA

Hội chứng Kearns-Sayre (KSS) là bệnh liên quan đến sự phát triển sắc tố

võng mạc và liệt cơ mắt ngoài tiến triển, thƣờng khởi phát trƣớc tuổi 20. Nguyên

nhân là do mất đoạn mtDNA khoảng 2-4 kb, thƣờng là 4997 bp từ vị trí 8488-

13460, tại điểm đứt gãy thƣờng có một đoạn 13 bp lặp lại. Ngoài những triệu chứng

nhƣợc cơ, sa mí mắt, yếu cơ mặt, thoái hóa sắc tố võng mạc, bệnh nhân thƣờng có

các biến chứng bao gồm thất điều tiểu não, suy giảm nhận thức và điếc, tắc nghẽn

cơ tim, dáng ngƣời thấp bé, nuốt khó [56].

Hội chứng Pearson là một rối loạn hiếm gặp, thƣờng khởi phát trong những

năm đầu đời, đặc trƣng bởi thiếu máu hồng cầu, tủy xƣơng và suy tụy ngoại tiết.

23

Diễn biến lâm sàng ở trẻ em có thể nặng dẫn đến t vong sớm, những trƣờng hợp

sống sót thƣờng có biểu hiện thiếu máu sau đó phát triển các đặc điểm lâm sàng của

KSS. Bệnh thƣờng đƣợc xác định là do mất đoạn mtDNA quy mô lớn, có mặt ở tất

cả các mô [65].

Bệnh liệt cơ mắt ngoài tiến triển (progressive external ophthalmoplegia-

PEO) đƣợc đặc trƣng bởi sự suy yếu của các cơ mắt, thƣờng xuất hiện ở độ tuổi 18 -

40. Dấu hiệu phổ biến và khác so với bệnh liệt mắt tiến triển kinh niên (CPEO) nhƣ

nhƣợc cơ, sa mí mắt, yếu cơ mặt, rách cơ. Nguyên nhân gây bệnh là những khuyết

tật trong ty thể, hay gặp ở các rối loạn mất đoạn mtDNA quy mô lớn, trong một số

trƣờng hợp là đột biến gen MT-TL1. Mặt khác, các đột biến gen nhân POLG,

SLC25A4 và C10orf2 cũng là nguyên nhân gây nên bệnh này. Các nghiên cứu gần

đây chƣa chứng minh đƣợc sự tƣơng quan giữa kích thƣớc và vị trí đoạn mtDNA bị

mất với mức độ biểu hiện của bệnh [54].

Bệnh Parkinson/hội chứng MELAS gối nhau do đột biến mất đoạn TTAA

bắt đầu ở vị trí 14787 của gen CYTB. Bệnh nhân biểu hiện rối loạn tiến triển nặng,

bắt đầu từ 6 tuổi với biểu hiện khó phối hợp và tập trung vận động. Sau này, bệnh

nhân thể hiện hội chứng Parkinson, rung giật cơ và nhồi máu não [24].

Mất đoạn 9 bp CCCCCTCTA xảy ra ở vùng không mã hóa nằm giữa gen mã

cho cytochrome oxidase II (COII) và tRNALys

trong hệ gen ty thể. Vùng không mã

hóa gồm hai trình tự lặp lại nối tiếp nhau dài 18 bp từ vị trí 8272-8289 trên hệ gen

ty thể. Hiện tƣợng mất đoạn 9 bp đƣợc xem là một dạng đột biến của hệ gen ty thể

và có tỷ lệ cao ở các quần thể ngƣời châu bao gồm Trung Quốc (15%), Việt Nam

(20%), Thái Lan (29%) và Nhật Bản (20%) [62].

Đột biến mất đoạn xuất hiện do những sai hỏng trong quá trình tái bản không

đƣợc s a chữa hoặc do quá trình sao chép bị lỗi. Vì vậy, mất đoạn 9 bp có lẽ xuất

hiện nhƣ kết quả của một lỗi không đƣợc s a chữa trong quá trình sao chép của

mtDNA. Hiện tƣợng mất đoạn 9 bp đƣợc xem xét trên hai phƣơng diện đó là nguồn

gốc tiến hóa và mối liên quan giữa mất đoạn 9 bp với bệnh tật đặc biệt là các rối

loạn ty thể.

24

Ngoài ra, một số bệnh ty thể còn liên quan đến sự đảo đoạn. Nghiên cứu đầu

tiên về một đột biến đảo đoạn trong mtDNA gây bệnh cơ đƣợc phát hiện bởi

Musumeci và tập thể vào năm 2000 [41]. Bệnh nhân đƣợc phát hiện mang đột biến

đảo đoạn 7 nucleotide (ACCTTGC thành GCAAGGT) ở vùng 3902-3908 thuộc

gen mã hóa cho ND1 của NADH ubiquinone oxidoreductase. Đột biến đảo đoạn

này dẫn đến thay thế 3 acid amin (D199G, L200K, và A201V) có tính bảo thủ cao

trong chuỗi polypeptide, là đột biến ở dạng không đồng nhất 80% và đƣợc phát hiện

trong cơ nhƣng không có trong máu bệnh nhân. Sự thay đổi 3 acid amin liên tiếp từ

Asp-Leu-Ala thành Gly-Lys-Val, liên quan đến một vùng bảo thủ cao của gen ND1 có

vai trò quan trọng trong việc gắn ubiquinone.

1.3. HỘI CHỨNG ĐỘNG KINH, GIẬT CƠ VỚI SỢI CƠ KHÔNG ĐỀU

(MERRF)

Năm 1973, một nhóm bệnh nhân mắc bệnh ty thể có triệu chứng lâm sàng liên

quan đến động kinh, giật cơ lần đầu tiên đƣợc mô tả. Sau đó các trƣờng hợp khác

tiếp tục đƣợc mô tả, Fukuhara và cộng sự [28] đã đƣa ra các tính năng cơ bản của

bệnh bao gồm: giật cơ, động kinh kết hợp với sợi cơ không đều đƣợc gọi là hội

chứng MERRF. Bệnh nhân MERRF đƣợc chẩn đoán bởi các tiêu chí: rung giật cơ,

động kinh, thất điều tiểu não, sinh thiết cơ cho thấy sợi cơ đỏ bị rách. Mặc dù đó là

những biểu hiện chính nhƣng thực tế lâm sàng tìm thấy nhiều bệnh nhân MERRF

có triệu chứng không đồng nhất, có thể gặp bệnh nhân điếc, không chịu đƣợc vận

động, mất trí nhớ, u mỡ đối xứng, bệnh sắc tố võng mạc [15, 37].

Hội chứng lần đầu tiên đƣợc mô tả là do đột biến A8344G trên gen mã hóa cho

tRNALys

của ty thể [13, 20, 42]. Nguyên nhân phổ biến của hội chứng MERRF là do

đột biến A8344G, T8356C và G8363A nằm trên gen MT-TK mã hóa cho tRNALys

gây

ra, tất cả đột biến đều tồn tại ở dạng không đồng nhất. Đột biến A8344G là phổ biến

nhất, chiếm 80-90% số ca mang hội chứng MERRF [9, 42]. MERRF cũng đƣợc mô tả

ở bệnh nhân bị mất đoạn mtDNA. Các hội chứng gối nhau với đặc điểm

MELAS/MERRF đã đƣợc báo cáo ở đột biến T7572C và T8356C trên tRNASer

[18].

25

1.3.1. Các đột biến của hội chứng MERRF

1.3.1.1. Đột biến A8344G

Đột biến A8344G là phổ biến nhất, chiếm 80 - 90% số ca mang hội chứng

MERRF. Sự thay đổi nucleotide A thành G tại vị trí 8344 trên gen MT-TK của ty thể

làm thay đổi bộ ba mã hóa trên tRNAlys, do đó giảm khả năng tƣơng tác với bề mặt

ribosome. Đột biến tại vùng này ảnh hƣởng đến sự hợp nhất của dƣ lƣợng lysine vào

protein ty thể, làm suy yếu tổng hợp protein và gây ra các rối loạn chức năng của chuỗi

hô hấp trong ty thể. Từ đó, ty thể giảm hệ thống phosphoryl hóa oxy hóa, đặc biệt là

các phức hợp I (NADH dehydrogenase) và IV (cytochrome c oxidase) [10, 20, 33].

Đột biến A8344G đƣợc di truyền độc lập từ mẹ sang con và thƣờng tồn tại ở

dạng không đồng nhất, nhƣng mức độ phân bố của thể đột biến rất khác nhau giữa

các cá thể và các mô trong cùng một cá thể [10]. Một nghiên cứu cho thấy rằng ở

một phụ nữ lƣợng gen đột biến A8344G trong cơ xƣơng là 94%, trong máu là 38%,

trong nƣớc tiểu là 18%, cũng định lƣợng đột biến tƣơng tự trên mẹ và em gái cho

thấy, ở mẹ có 16% gen đột biến trong máu và 18% trong nƣớc tiểu, kết quả của em

gái là 3% gen đột biến trong máu và 4% trong nƣớc tiểu. Định lƣợng đƣợc tỷ lệ gen

đột biến nhằm xác định mức độ ảnh hƣởng của bệnh đến cá thể mang đột biến. Tỷ

lệ đột biến A8344G có tƣơng quan với sự giảm tổng hợp protein, giảm tiêu thụ oxy

và thiếu cytochrome c oxidase, cũng nhƣ các polypeptid lớn và giàu lysine bị ảnh

hƣởng nặng nề gợi ý rằng các đột biến MERRF trực tiếp hạn chế quá trình tổng hợp

protein của ty thể. Hơn thế nữa, stress oxy hóa và oxy hóa trên các mô bị ảnh hƣởng

bởi thiếu chuỗi hô hấp dẫn đến sự tiến triển các triệu chứng của bệnh ty thể [30].

Mặc dù đƣợc mô tả với các triệu chứng lâm sàng cơ bản của hội chứng

MERRF bao gồm rung giật cơ, mất điều hoà, động kinh và sợi cơ màu đỏ rách

nham nhở nhƣng đột biến A8344G có những biểu hiện kiểu hình không đồng nhất.

Một nghiên cứu ở ngƣời phụ nữ 42 tuổi, ngoài các tính năng chính của hội chứng

MERRF còn có nhiều triệu chứng khác nhƣ suy hô hấp và loạn dƣỡng cơ. Một số

trƣờng hợp biểu hiện tầm vóc ngắn, mất thính lực, bệnh thần kinh ngoại biên, bệnh

26

cơ tim hoặc rối loạn chức năng ống thận. Kết quả nghiên cứu mối tƣơng quan giữa

kiểu gen đột biến A8344G với kiểu hình MERRF cho thấy rằng đột biến này có thể

biểu hiện kiểu hình khác, bao gồm cả triệu chứng lâm sàng của hội chứng Leigh,

rung giật cơ kết hợp với u mỡ đối xứng và các bệnh đầu múi cơ [30].

1.3.1.2. Đột biến T8356C

Hội chứng MERRF thƣờng đƣợc biết đến với đột biến A8344G, nhƣng không

quan sát thấy trong khoảng 10 - 20% số bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng tiêu

biểu của hội chứng MERRF. Một nghiên cứu giải trình tự gen tRNAlys

của năm

bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng đƣợc xác định là rung giật cơ (hoặc động kinh),

mất điều hòa và sợi cơ đỏ bị rách nham nhở, tiền s gia đình tƣơng thích với sự kế

thừa bệnh từ mẹ, nghiên cứu tiền lâm sàng thấy nhiễm toan acid lactic, sinh thiết cơ

cho thấy nhiều sợi cơ đỏ bị xé rách. Kết quả cho thấy có sự thay đổi nucleotide tại

vị trí 8356 từ T chuyển thành C, làm gián đoạn một cặp base đƣợc bảo tồn trong

phân t mtDNA gốc [51].

Mở rộng nghiên cứu về mức độ biểu hiện của bệnh cho thấy đột biến T8356C

cũng tồn tại ở dạng không đồng nhất nhƣng sự phân bố của gen đột biến cũng rất

khác nhau, kết quả phân tích trên 1 bệnh nhân mang đột biến trong cơ là 100% còn

trong máu là 47%. Triệu chứng lâm sàng của bệnh nhân mang đột biến này cũng

khá phức tạp, có bệnh nhân xuất hiện triệu chứng rung giật cơ, động kinh, điếc và

đột quỵ giả tai biến giống nhƣ hội chứng MELAS [6].

1.3.1.3. Đột biến G8363A

Năm 1996, nhóm nghiên cứu Filippo M. Santorelli và cộng sự [45] đã s

dụng phƣơng pháp phân tích đa dạng cấu hình DNA sợi đơn (SSCP) và giải trình

tự trực tiếp của tất cả 22 gen tRNA mã hóa mtDNA để phát hiện tình trạng đột

biến trong 9 bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng tƣơng tự nhƣ hội chứng MERRF

bao gồm tăng acid lactic và pyruvic trong máu, rối loạn thần kinh ngoại biên,

thất điều não, giảm thính lực, sinh thiết cơ cho thấy các sợi cơ đỏ bị xé rách. Kết

quả cho thấy cả 9 bệnh nhân trong 2 gia đình đều mang đột biến thay đổi

27

nucleotide A bằng G tại vị trí 8363 trên mtDNA. Phân tích RFLP cho thấy rằng

đột biến tồn tại ở dạng không đồng nhất và có mức độ phân bố ở các mô khác

nhau nhƣ ở cơ là 95%, ở máu là 59 - 94% [49].

Sự khiếm khuyết một hay nhiều phần của chuỗi phản ứng phosphoryl hóa

(OXPHOS) trong quá trình trao đổi chất ở tế bào cơ của bệnh nhân mang đột biến

G8363A gây ra sự suy giảm tổng hợp protein của ty thể, do đột biến nằm trên gen

tRNAlys. Sự thiếu hụt lysine sẽ ảnh hƣởng đến các tiểu đơn vị trong chuỗi hô hấp

của tế bào, ảnh hƣởng trực tiếp đến phức hợp I và phức hợp IV của chuỗi hô hấp.

Nghiên cứu sâu hơn cho thấy sự hiện diện của các peptid bất thƣờng trong nguyên

bào sợi da của một bệnh nhân mang đột biến G8363A [45, 49, 57].

Những biểu hiện lâm sàng của bệnh nhân mang đột biến A8363G cũng không

đồng nhất, ở một số bệnh nhân có triệu chứng tâm thần chậm phát triển, mất thính

giác, nhiều u mỡ,... đƣợc chẩn đoán giống hội chứng Leigh.

1.3.2. Những tác động của hội chứng MERRF trên ngƣời bệnh

Ty thể là bào quan s dụng oxy để chuyển hóa các sản phẩm trung gian của

thức ăn thành năng lƣợng thông qua một quá trình phosphoryl oxy hóa. Những đột

biến gây MERRF làm suy giảm khả năng của ty thể trong việc tạo ra các protein, s

dụng oxy và sản xuất năng lƣợng. Những đột biến này ảnh hƣởng đến các cơ quan

và các mô với nhu cầu năng lƣợng cao nhƣ não và cơ. Bệnh thƣờng biểu hiện trong

các mô và dễ dàng phát hiện trong mtDNA từ bạch cầu trong máu [37]. Tuy nhiên,

sự xuất hiện của dạng không đồng nhất có thể làm thay đổi mức độ biểu hiện ở các

mô mang đột biến. Do đó những ngƣời có triệu chứng ít phù hợp với MERRF có

thể không đƣợc phát hiện từ bạch cầu mà chỉ phát hiện ở các mô khác nhƣ nguyên

bào sợi da nuôi cấy, niêm mạc miệng,... nhƣng đáng tin cậy nhất là phát hiện từ các

tế bào cơ xƣơng [38].

Hội chứng MERRF thƣờng đƣợc chẩn đoán lâm sàng dựa trên các triệu chứng

bao gồm: tăng nồng độ lactate, pyruvate trong máu và trong dịch não tủy. Protein

dịch não tủy có thể tăng lên trong hội chứng MERRF. Kỹ thuật chụp ảnh não nhƣ

28

hình ảnh cộng hƣởng từ có thể tìm thấy các tổn thƣơng nhƣ đột quỵ. Điện tâm đồ có

thể đƣợc s dụng để chẩn đoán bất thƣờng về tim. Bảng 1.1 liệt kê các triệu chứng

và dấu hiệu thấy đƣợc trong 62 bệnh nhân mang đột biến MERRF [70]. Các đặc

điểm lâm sàng thƣờng gặp nhất có tỷ lệ tƣơng ứng là: giật cơ, yếu cơ, mất điều hòa

(35 - 45%); động kinh tổng quát, mất thính lực (25,0 - 34,9%); suy giảm nhận thức,

nhiều u mỡ, bệnh thần kinh, không dung nạp tập thể dục (15,0 - 24,9%); tăng CK,

teo dây thần kinh thị giác, teo cơ, suy hô hấp, tiểu đƣờng, đau cơ, run, và chứng đau

n a đầu (5,0 - 14,9%) [70].

29

Bảng 1.1: Các biểu hiện và triệu chứng lâm sàng của 62 bệnh nhân

MERRF [70]

Biểu hiện lâm sàng Tần số xuất hiện Tỷ lệ %

Giật cơ 62/62 100%

Động kinh 62/62 100%

Phát triển ban đầu bình

thƣờng 17/17 100%

Sợi cơ đỏ rách nham nhở 47/51 92%

Giảm thính lực 41/45 91%

Tăng acid lactic máu 24/29 83%

Tính kế thừa theo dòng mẹ 34/42 81%

Không dung nạp tập thể dục 8/10 80%

Mất trí 39/52 75%

Bệnh thần kinh 17/27 63%

Ngƣời thấp bé 4/7 57%

Giảm cảm giác 9/18 50%

Liệt dây thần kinh thị giác 14/36 39%

Bệnh cơ tim 2/6 33%

Hội chứng Wolff-

Parkinson-White 2/9 22%

Bệnh võng mạc sắc tố 4/26 15%

U mỡ 2/60 3%

Những tác động của hội chứng MERRF lên bệnh nhân là khá đa dạng, phức

tạp và không đồng nhất. Các rối loạn của hội chứng MERRF ảnh hƣởng đến nhiều

30

bộ phận của cơ thể, đặc biệt cơ bắp và hệ thần kinh, triệu chứng xuất hiện từ thời

thơ ấu hay tuổi vị thành niên. Vì vậy việc phân tích mtDNA là quan trọng ở nhiều

trƣờng hợp có sự rối loạn hệ thống không rõ ràng.

1.3.3. Các phƣơng pháp phát hiện đột biến MERRF

1.3.3.1. Phát hiện đột biến thuộc hội chứng MERRF bằng PCR kết hợp với

RFLP [25, 30, 45]

Kỹ thuật RFLP (restriction fragment length polymorphism) là kỹ thuật phân

tích tính đa hình chiều dài của các phân đoạn DNA đƣợc phân cắt giới hạn. Phƣơng

pháp này dựa trên độ đặc hiệu của các enzyme giới hạn (restriction enzyme) phân

cắt đối với vị trí nhận biết của chúng trên DNA. Sự thay đổi về trình tự nucleotide

của DNA dẫn đến sự thêm hay bớt các điểm phân cắt của enzyme giới hạn, làm cho

các đoạn DNA bị phân cắt có kích thƣớc khác nhau, có thể nhận biết đƣợc dựa trên

phổ băng khi điện di. Theo đó, khi đột biến xuất hiện trong trình tự của DNA tại

những vị trí giới hạn đặc hiệu sẽ dẫn đến tính đa hình trong chiều dài của các đoạn

DNA khi đƣợc cắt bởi cùng một loại enzyme giới hạn đặc hiệu. Hiện tƣợng này đã

tạo ra sự khác biệt trong chiều dài của các đoạn DNA mà khi điện di chúng trên gel

thì có thể phát hiện đƣợc các đột biến.

Kỹ thuật RFLP đã trở nên đơn giản hơn nhờ có sự phát triển của kỹ thuật PCR

(polymerase chain reation). PCR là kỹ thuật phối hợp khả năng lai đặc hiệu của

DNA và khả năng kéo dài chuỗi của DNA polymerase để nhân bản các đoạn DNA

khác nhau lên gấp nhiều lần so với ban đầu. DNA polymerase hoạt động theo

nguyên tắc cần phức hợp khuôn - mồi, trong môi trƣờng thích hợp có các dNTP thì

sẽ kéo dài mồi thành sợi bổ sung với sợi khuôn. Vì vậy, để nhân bản đƣợc đoạn

DNA đích, ngƣời ta cần thiết kế các cặp mồi (primers) đặc hiệu. Đây là một kỹ

thuật rất nhạy, chỉ cần một lƣợng nhỏ DNA khuôn (ng hoặc thấp hơn) phản ứng

cũng có thể diễn ra.

Việc kết hợp PCR-RFLP sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho phát hiện các đột biến

di truyền, trong đó có đột biến điểm trên gen ty thể. PCR-RFLP là công cụ chẩn

đoán sớm đƣợc s dụng phổ biến nhất để phát hiện các đột biến điểm trong

31

mtDNA. Phƣơng pháp này bao gồm các bƣớc chính sau: (1) đoạn mtDNA chứa vị

trí đột biến đƣợc khuếch đại nhờ các đoạn mồi đƣợc thiết kế đặc hiệu; (2) sản phẩm

PCR đƣợc phân cắt bằng enzyme giới hạn thích hợp; (3) các đoạn DNA cắt đƣợc

điện di trên gel agarose hay gel polyacrylamide không biến tính, nhuộm ethidium

bromide (EtBr) và đƣợc phát hiện dƣới ánh sáng t ngoại. Việc lựa chọn enzyme

giới hạn có ý nghĩa quyết định trong việc phát hiện đột biến điểm trong mtDNA.

Dựa trên trình tự nhận biết của enzyme có sẵn trên đoạn DNA chứa đột biến hoặc

đƣợc chủ động tạo ra do cách thiết kế mồi trong PCR mà có thể xác định đƣợc đột

biến và không đột biến sau phản ứng cắt với enzyme.

Trong hầu hết các phòng thí nghiệm lâm sàng, PCR-RFLP là phƣơng pháp phổ

biến nhất đƣợc s dụng để phát hiện nhanh các đột biến điểm gen ty thể. Đây là

phƣơng pháp đơn giản và hiệu quả để phát hiện đột biến mtDNA khi sàng lọc với số

lƣợng mẫu lớn. Tuy nhiên, phƣơng pháp này có độ nhạy tƣơng đối, đôi khi đột biến

khó đƣợc phát hiện vì sự có mặt của các băng DNA mờ nhạt trên gel nếu tỷ lệ

mtDNA đột biến trong mẫu thấp [26]. Giới hạn phát hiện của phân tích PCR-RFLP

nhuộm ethidium bromide là 5-10% [8].

1.3.3.2. Phân tích đột biến thuộc hội chứng MERRF bằng xác định trình tự

gen [10]

Kỹ thuật giải trình tự đƣợc s dụng để phát hiện, tìm kiếm đột biến trong hệ

gen ty thể. Xác định trình tự nucleotide có thể phát hiện và khẳng định chắc chắn

loại đột biến trên DNA ty thể. Tuy vậy kỹ thuật này tốn nhiều thời gian và chi phí

cao, vì vậy nó thƣờng đƣợc s dụng để khẳng định chắc chắn sự có mặt của các đột

biến trong đó có đột biến điểm mtDNA.

1.3.3.3. Kỹ thuật đa dạng cấu hình sợi đơn SSCP (single-stranded

conformational polymorphism)[12]

Phƣơng pháp này dựa trên nguyên tắc là trong điều kiện điện di không biến

tính, các mạch đơn DNA sẽ có cấu trúc nhất định tùy theo trình tự của nó. Các cấu

hình khác nhau ngay cả khi chỉ khác biệt một nucleotide. Sự khác biệt này dẫn đến

sự khác biệt về khả năng di chuyển trong gel polyacrylamide. Vì vậy, khi xuất hiện

32

đột biến trong phân t mtDNA sẽ làm thay đổi cấu trúc bậc hai, cho phép phân tách

sợi DNA đột biến và không đột biến. Phƣơng pháp này có thể áp dụng để sàng lọc

đột biến điểm chƣa biết ở bệnh nhân nghi ngờ rối loạn mtDNA.

1.3.3.4. Định lượng đột biến MERRF bằng phương pháp real-time PCR [19, 52]

Kỹ thuật real-time PCR cho phép phát hiện và định lƣợng sản phẩm khuếch

đại khi tiến trình phản ứng đang diễn ra dựa trên cơ sở đo tín hiệu huỳnh quang,

trong đó sự tăng lên về số lƣợng DNA tƣơng ứng với sự tăng lên của tín hiệu huỳnh

quang. Tín hiệu huỳnh quang đo đƣợc phản ánh số lƣợng sản phẩm đƣợc khuếch

đại trong mỗi chu kỳ. Tùy thuộc vào số lƣợng bản DNA đích ban đầu có trong ống

phản ứng mà giá trị Ct (chu kỳ ngƣỡng) của các mẫu là khác nhau. Dựa vào đặc

điểm này có thể xác định số bản sao DNA đích có trong mẫu nghiên cứu dựa trên

mối quan hệ của mẫu chuẩn đã biết rõ số lƣợng DNA đích ban đầu và mẫu nghiên

cứu với giá trị chu kỳ ngƣỡng [5, 8].

Ƣu điểm chính của real-time PCR là cho phép xác định số bản sao ban đầu của

mẫu DNA ở tỷ lệ thấp với độ chính xác và độ nhạy cao. Kết quả real-time PCR có

thể tính sự có mặt hay vắng mặt của alen hoặc định lƣợng số bản sao. Ngoài ra,

lƣợng sản phẩm DNA đích có thể theo dõi đƣợc sau mỗi chu kỳ mà không cần kiểm

tra bằng phƣơng pháp điện đi [5, 8].

1.3.3.5. Phát hiện đột biến DNA ty thể bằng hệ thống cảm biến sinh học [71]

Biochip là một kỹ thuật mới, đƣợc s dụng trong sàng lọc phát hiện các đột

biến mtDNA, với tốc độ rất nhanh, chính xác dựa trên cơ sở phân tích đột biến bằng

vi tính.

Để sản xuất các chip DNA, các cặp mẫu dò đƣợc thiết kế đặc hiệu cho từng

loại đột biến, bao gồm mẫu dò cho trình tự bình thƣờng và mẫu dò cho trình tự đột

biến. Mẫu dò đƣợc cài trên phiến kính một cách tự động, mỗi phiến kính với diện

tích khoảng 1 cm2 có thể chứa hàng trăm đến hàng ngàn mẫu dò khác nhau. DNA

khuôn đƣợc đánh dấu và lai với các mẫu dò. Các phƣơng pháp đánh dấu bao gồm

33

gắn trực tiếp chất đánh dấu vào DNA khuôn, PCR với mồi đánh dấu hoặc dùng

enzyme biến đổi trực tiếp trình tự đích.

Ở Việt Nam, một bệnh nhân MELAS mang đột biến A3243G đã đƣợc phát

hiện lần đầu tiên bởi Lê Thị Bích Thảo và tập thể [4] bằng phƣơng pháp PCR-RFLP

và giải trình tự nucleotide. Năm 2014, Trƣơng và tập thể [55] đã s dụng phƣơng

pháp PCR-RFLP sàng lọc 106 bệnh nhân cơ não tuy nhiên các tác giả không phát

hiện đƣợc trƣờng hợp nào mang đột biến thuộc hội chứng MERRF. Nhƣ vậy đột

biến MERRF ở bệnh nhân Việt Nam đã đƣợc nghiên cứu tuy nhiên các thông tin có

đƣợc còn hạn chế. Vì thế, việc mở rộng nghiên cứu phát hiện đột biến này ở ngƣời

Việt Nam, đặc biệt là việc định lƣợng mức độ không đồng nhất về kiểu gen đột biến

để đƣa ra mối tƣơng quan giữa tỷ lệ đột biến và biểu hiện lâm sàng của bệnh là cần

thiết và có ý nghĩa thực tiễn cao.

34

CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. NGUYÊN LIỆU

2.1.1. Mẫu bệnh phẩm

Mẫu máu ngoại vi của 312 bệnh nhân ngƣời Việt Nam nghi bị bệnh ty thể

(Phụ lục 1) đƣợc lấy từ Bệnh viện Nhi Trung ƣơng. Các mẫu máu đƣợc bảo quản ở

-80oC. Trong nghiên cứu này, các bệnh nhân đƣợc nghi ngờ mắc hội chứng

MERRF dựa trên sự có mặt của ít nhất hai trong ba đặc điểm sau:

- Tác động lâm sàng liên quan đến các cơ quan: hệ thần kinh trung ƣơng, cơ

xƣơng và cơ tim, tuyến nội tiết, mắt và hệ tiêu hóa.

- Tăng acid lactic trong máu hoặc dịch não tủy.

- Hình ảnh chụp cộng hƣởng từ não không bình thƣờng.

2.1.2. Các hóa chất, nguyên liệu khác

Plasmid chèn đoạn gen 8155 - 8366 có và không mang đột biến A8344G là sản

phẩm của đề tài KC.04.10/11-15

Các kit tách chiết DNA tổng số đƣợc mua từ hãng Qiagen; các cặp mồi và mẫu

dò đƣợc mua từ hãng Integrated DNA Technologies; thang chuẩn DNA, hỗn hợp

dNTP; (Enzynomics, Hàn Quốc); enzyme giới hạn đƣợc mua từ hãng

Thermoscientifics, Kapa probe fast qPCR, Master Mix đƣợc mua của hãng

Kapabiosystems.

Các hóa chất còn lại đều đƣợc mua từ các hãng tin cậy (Sigma, Merk) và đạt

độ tinh khiết cần thiết cho nghiên cứu sinh học phân t .

2.2. MÁY MÓC VÀ TRANG THIẾT BỊ

Các máy móc chính dùng trong nghiên cứu bao gồm: máy NanoDropTM

8000,

máy PCR gradient (Eppendorff), máy real-time PCR iQTM 5 cycler (Biorad), máy

ly tâm lạnh 5417 R (Eppendorf), thiết bị điện di ngang, điện di đứng (Biorad) và hệ

thống chụp ảnh điện di Geldoc (Biorad).

35

2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1. Tách chiết DNA tổng số

DNA tổng số đƣợc tách và tinh sạch từ máu ngoại vi của các bệnh nhân theo

QIAamp DNA Mini Kit của Qiagen. Quy trình thực hiện nhƣ sau:

Hỗn hợp tách DNA chứa 20 µl protease Qiagen, 200 µl mẫu máu, 200 µl đệm

AL và 4 µl RNase 10 mg/ml. Hỗn hợp đƣợc trộn đều bằng máy vortex trong 15

giây để thu đƣợc một dung dịch đồng nhất và đƣợc ủ ở 56oC trong 10 phút. Sau đó

hỗn hợp đƣợc ly tâm nhẹ 3.000 vòng/phút. Tiếp theo, hỗn hợp đƣợc bổ sung 200 µl

ethanol 100%, trộn đều và ly tâm nhẹ 3.000 vòng/phút. Dung dịch trong ống đƣợc

chuyển vào cột Qiagen, ly tâm ở 8000 vòng/phút trong 1 phút và dịch đi qua cột

đƣợc loại bỏ. Cột đƣợc bổ sung 500 µl AW1 và ly tâm ở 8.000 vòng/phút trong 1

phút, sau đó dịch đi qua cột đƣợc loại bỏ. Cột tiếp tục đƣợc cho thêm 500 µl AW2,

ly tâm 14.000 vòng/phút trong 2 phút và dịch đi qua cột đƣợc loại bỏ. Cột đƣợc

chuyển sang một ống 1,5 ml sạch khác và đƣợc bổ sung 150 µl nƣớc cất vô trùng và để

yên trong 1 phút, sau đó đƣợc ly tâm ở 8.000 vòng/phút trong 1 phút. Dịch đi qua cột là

DNA tổng số. Mẫu đƣợc bảo quản ở -20oC cho đến khi s dụng.

2.3.2. Kiểm tra và định lƣợng DNA tách chiết

Sự có mặt của DNA đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. 5 µl

DNA đƣợc trộn với 1 µl đệm tra mẫu chứa ethidium bromide (50 µg/ml), tra lên

giếng gel agarose 1% trong đệm TAE 1X. Điện di đƣợc thực hiện với hiệu điện thế

ổn định 10 volt/cm gel, các băng DNA đƣợc phát hiện dƣới ánh sáng t ngoại.

Nồng độ của DNA tách chiết đƣợc định lƣợng bằng cách đo mật độ hấp thụ

ánh sáng t ngoại của các acid nucleic ở bƣớc sóng 260 nm (A260) trên máy Nano-

Drop. Nguyên tắc của phƣơng pháp là dựa vào khả năng hấp thụ ánh sáng t ngoại

ở bƣớc sóng 260 nm (A260) của các phân t DNA. Từ giá trị mật độ quang ở bƣớc

sóng 260 nm của các phân t DNA, với hệ số A260 = 1 tƣơng đƣơng với hàm lƣợng

DNA sợi đôi là 50 μg/ml, s dụng công thức C = A260 x 50 x n (trong đó n là số lần

pha loãng) để định lƣợng DNA có trong mẫu tách chiết.

36

Phƣơng pháp này đơn giản, nhanh, nhƣng có hạn chế là giá trị đọc đƣợc về độ

hấp thụ có thể bị ảnh hƣởng khi trong mẫu chứa RNA và protein. Vì vậy, trong thực

tế phƣơng pháp này thƣờng đƣợc dùng để định lƣợng các mẫu DNA tinh khiết, tỉ số

A260/A280 đƣợc s dụng để đánh giá độ sạch DNA của chế phẩm. DNA đƣợc cho là

sạch khi giá trị A260/A280 nằm trong khoảng 1,8 - 2,0.

2.3.3. Nhân bản đoạn gen ty thể bằng kỹ thuật PCR

Đoạn gen ty thể mang đột biến MERRF đƣợc khuếch đại bằng phản ứng chuỗi

polymerase (PCR) với các cặp mồi đặc hiệu đã đƣợc thiết kế và chế độ nhiệt thích

hợp. Khuôn cho phản ứng PCR là DNA tổng số đƣợc tách chiết từ mẫu máu bệnh

nhân. Theo tính toán lý thuyết, các đoạn gen chứa đột biến sẽ đƣợc nhân lên bằng kĩ

thuật PCR với kích thƣớc 212 bp (đột biến A8344G), 220 bp (đột biến T8356C),

241 bp (đột biến G8363A).

Thành phần của phản ứng PCR bao gồm: 2,5 µl đệm Taq DNA polymerase

10X; 1 µl Taq DNA polymerase (5 đơn vị/ µl); 2,5 µl dNTPs 2 mM; 1 µl mồi xuôi

10 pmol; 1 µl mồi ngƣợc 10 pmol; 2 µl DNA khuôn (40 - 45 ng/µl) và 15 µl ddH2O

cho tổng thể tích 25 µl. Hỗn hợp phản ứng đƣợc trộn đều, đặt vào máy PCR và tiến

hành chạy với 3 bƣớc chính: biến tính DNA, gắn mồi và kéo dài chuỗi. Chu trình

nhiệt đƣợc thiết lập nhƣ bảng 2.1.

Bảng 2.1: Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR các đoạn gen mang đột biến

MERRF

Chu trình nhiệt oC Thời gian

Biến tính khởi động 95 4 phút

35 chu kỳ

Biến tính 94 30 giây

Gắn mồi * 30 giây

Kéo dài 72 30 giây

Kéo dài hoàn tất 72 5 phút

Bảo quản mẫu 4 + ∞

(* là nhiệt độ gắn mồi, MRAG là 58oC, MRTC là 60

oC, MRGA là 53

oC)

37

Mẫu đối chứng âm tính (không chứa DNA) đƣợc đặt cùng thí nghiệm để kiểm

tra khả năng nhân bản không đặc hiệu.

Sản phẩm phản ứng sau đó đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 2%.

Sau khi PCR kết thúc, 5 µl sản phẩm đƣợc trộn đều với 1 µl dung dịch đệm tra mẫu

có chứa ethidium bromide ở nồng độ 50 µg/ml, tra lên giếng gel đã chuẩn bị trong

đệm TAE 1X. Thang chuẩn DNA 100 bp đƣợc điện di song song cùng với mẫu.

Điện di đƣợc thực hiện với hiệu điện thế ổn định 10 volt/cm gel cho đến khi vạch

màu cách mép bản gel khoảng 2 cm. Bản gel chứa các băng DNA đƣợc quan sát

trên máy soi và chụp ảnh bằng hệ thống Geldoc (Biorad).

2.3.4. Kỹ thuật PCR kết hợp với kỹ thuật đa hình chiều dài các đoạn phân cắt

giới hạn (PCR-RFLP)

Đoạn gen chứa đột biến đƣợc nhân bản bằng kỹ thuật PCR, sản phẩm PCR

sau khi đã kiểm tra trên gel agarose 2% đƣợc cắt trực tiếp bằng enzyme giới hạn

trong đệm tƣơng ứng (reaction buffer). Phản ứng cắt đƣợc thực hiện với thành phần

nhƣ sau: 1 µl đệm enzyme giới hạn 10X; 0,5 µl enzyme giới hạn (50 đơn vị/µl); 7,5

µl sản phẩm PCR và 6,25 µl ddH2O cho tổng thể tích 15 µl, hỗn hợp phản ứng đƣợc

giữ ở 37ºC, từ 12-16 giờ. Sau đó, sản phẩm cắt đƣợc điện di trên gel polyacrylamide

12% và đột biến đƣợc phát hiện dựa vào tính đa hình của các đoạn cắt khi quan sát

dƣới ánh sáng t ngoại.

2.2.5. Điện di trên gel agarose

Kỹ thuật điện di hoạt động nhờ vào lực kéo của điện trƣờng tác động vào các

phân t tích điện và kích thƣớc lỗ của thể nền (gel). Gel cấu tạo bởi các chuỗi cao

phân t (polymer) đƣợc liên kết chéo với nhau tạo thành một hệ thống mạng lƣới

với kích thƣớc các mắt lƣới tùy thuộc vào nồng độ chất cao phân t (agarose,

polyacrylamide) và phản ứng tạo liên kết chéo. Các phân t đƣợc phân tách khi di

chuyển trong gel với vận tốc khác nhau nhờ vào sự khác nhau của lực của điện

trƣờng tác động lên chúng, kích thƣớc của phân t so với kích thƣớc lỗ của gel và

hình dạng, độ cồng kềnh của phân t .

38

Gel agarose 2% đƣợc chuẩn bị trong đệm TAE với nồng độ EDTA 1-2 mM

để tránh sự phân cắt DNA bởi nuclease. Sản phẩm PCR DNA đƣợc trộn với đệm

mẫu có chứa glycerol 20%, chất chỉ thị màu bromophenol xanh, xylene cyanol và

tra vào các giếng trên gel. Quá trình điện di đƣợc thực hiện với hiệu điện thế ổn

định là 10 volt/cm gel đến khi vạch màu bromophenol xanh cách mép gel khoảng 2

cm thì dừng lại (kích thƣớc bản gel agarose 2% chiều dài và chiều rộng là 5x6 cm)

Sau khi kết thúc điện di, bản gel đƣợc lấy ra ngâm dƣới ethidium bromide ở nồng

độ 50 μg/µl 5-7 phút và soi dƣới ánh sáng t ngoại của máy soi chụp ảnh Geldoc

(Biorad). Để phƣơng pháp quan sát DNA trong gel agarose thuận lợi nhất, dùng

thuốc nhuộm huỳnh quang EtBr để nhuộm gel. Sau khi nhuộm, EtBr sẽ xen vào

giữa các base của acid nucleic và phát huỳnh quang dƣới tia UV, cho phép phát

hiện dễ dàng chúng ở trong gel. Mặc dù tính linh động điện di của DNA sợi đôi

mạch thẳng giảm khi có mặt thuốc nhuộm (khoảng 15%), nhƣng khả năng xác định

gel trực tiếp dƣới ánh sáng UV trong suốt quá trình điện di hoặc ở giai đoạn cuối có

ƣu thế rõ rệt.

2.2.6. Điện di trên gel polyacrylamide

Trong nghiên cứu này, gel polyacrylamide 12% đƣợc s dụng với các thành

phần nhƣ trong bảng 2.2.

Bảng 2.2: Thành phần bản gel polyacrylamide 12%

STT Thành phần Thể tích

1 Dung dịch acrylamide 30% 2 ml

2 TAE 5X 1 ml

3 APS 10% 35 μl

4 TEMED 3,5 µl

5 Nƣớc cất kh trùng 1.965 µl

Tổng thể tích 5 ml

Sản phẩm nhân bản gen bằng PCR sau khi đƣợc cắt bằng enzyme giới hạn

đƣợc trộn với đệm mẫu và tra vào đƣờng chạy điện di trong đệm TAE 0,5X với

39

hiệu điện thế ổn định 10 volt/cm gel cho tới khi vạch chỉ thị màu cách đáy bản gel 3

cm thì dừng lại (kích thƣớc bản gel polyacrylamide chiều dài và chiều rộng là 10x8

cm). Gel đƣợc nhuộm bằng EtBr hòa trong nƣớc, sau khoảng 5 phút, bản gel đƣợc

lấy ra, r a dƣới vòi nƣớc và soi dƣới ánh sáng t ngoại của máy soi chụp gel IQ5

(Biorad), các băng gắn với EtBr xuất hiện dƣới dạng các băng màu sáng trên nền

gel màu đen.

2.2.7. Kỹ thuật real-time PCR sử dụng mẫu dò huỳnh quang dạng khóa cầu

acid nucleic (LNA - locked nucleic acid)

Trong thí nghiệm này, đột biến A8344G đƣợc định lƣợng bằng phƣơng pháp

real-time PCR s dụng mẫu dò huỳnh quang có trình tự bổ sung với trình tự đặc

hiệu trên DNA đích, đầu 5’ của mẫu dò có gắn chất phát huỳnh quang (reporter)

FAM (495/520 nm) cho mẫu dò đặc hiệu với trình tự không đột biến và HEX

(535/556 nm) cho mẫu dò đặc hiệu với trình tự đột biến, còn đầu 3’của mẫu dò có

gắn chất hấp phụ tƣơng ứng (quencher) là IBFQ (Iowa black fluorescence

quencher).

Ngoài ra, để tăng nhiệt độ tách chuỗi (Tm) và tính đặc hiệu của mẫu dò, trong

trình tự của mẫu dò còn có cải biến bằng nucleotide dạng khóa (locked nucleic acid)

(Hình 2.1).

Hình 2.1. Cấu trúc của nucleotide cải biến dạng LNA

Nguyên tắc của phƣơng pháp: Mẫu dò huỳnh quang bao gồm một đoạn

nucleotide bắt cặp đặc hiệu với trình tự đích. Khi chƣa có sự xuất hiện của sản

phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích thì mẫu dò Taqman vẫn còn nguyên vẹn,

40

huỳnh quang phát ra từ reporter sẽ bị quencher hấp phụ do nguyên lý cộng

hƣởng năng lƣợng huỳnh quang (nguyên lý FRET), ống phản ứng sẽ không phát

đƣợc huỳnh quang khi nhận đƣợc nguồn sáng kích thích. Khi bắt đầu có sự xuất

hiện sản phẩm khuếch đại đặc hiệu thì mẫu dò huỳnh quang sẽ bắt cặp với khuôn

và bị hoạt tính 5’-exonuclease của enzyme Taq DNA polymerase cắt bỏ để kéo

dài mồi tổng hợp sợi bổ sung, do vậy reporter sẽ rời xa quencher và phát huỳnh

quang khi nhận nguồn sáng kích thích (Hình 2.2). Sự phân cắt của mẫu dò trong

quá trình PCR đã giải phóng reporter làm tăng mật độ huỳnh quang. Sản phẩm

khuếch đại càng nhiều thì số lƣợng reporter tự do càng nhiều và cƣờng độ huỳnh

quang phát ra càng lớn và máy sẽ ghi nhận đƣợc.

Hình 2.2. Nguyên lý hoạt động của mẫu dò Taqman

41

Bảng 2.3: Trình tự của mồi và mẫu dò dùng cho real time PCR

Mẫu dò/Mồi Trình tự Vị trí trên DNA

ty thể

RT8344-Fw 5’ AGC CCA CTG TAA AGC TAA C 3’ 8291 - 8309

RT8344-Rv 5’ GGC ATT TCA CTG TAA AGA GGT 3’ 8370 - 8350

Wt-8344A-

FAM

6FAM-AGA T+TA +A+GA +GA+A +CC-

IBFQ 8332 - 8346

Mt-8344G-

HEX

HEX-GAT +TA+A +GAG +A+GC C-

IBFQ 8333 - 8346

Ghi chú: dấu + chỉ nucleotide LNA

Đoạn DNA chứa đột biến A8344G dài 80 bp từ vị trí 8291 - 8370 đƣợc nhân

bản với cặp mồi RT8344-Fw và RT8344-Rv và nucleotide đột biến đƣợc phát hiện

bằng mẫu dò đặc hiệu Wt-8344A-FAM và Mt-8344G-HEX.

Thành phần của phản ứng real-time PCR gồm qPCR master mix (2X), 1

µmol/L mỗi loại mồi, 0,125 µmol/L mỗi loại mẫu dò (Wt-8344A-FAM/Mt-8344G-

HEX) và 10 ng DNA khuôn cho tổng thể tích 25 l. Real-time PCR đƣợc thực hiện

với chế độ nhiệt 95°C, 10 phút tiếp nối 40 chu kỳ với 95°C, 15 giây để biến tính và

60°C, 60 giây để bắt cặp và kéo dài chuỗi.

Cƣờng độ tín hiệu huỳnh quang đƣợc ghi nhận và phân tích bởi hệ thống iQ5

cycler (Biorad). Sau khi hoàn tất các chu kỳ nhiệt, các mẫu chuẩn và mẫu phân tích

có các đƣờng biểu diễn khuếch đại tƣơng ứng. Từ giá trị chu kỳ ngƣỡng (Ct) của

mẫu nghiên cứu, dựa vào đƣờng chuẩn đƣợc thiết lập bằng cách trộn mẫu DNA

plasmid mang đột biến và không mang đột biến với các tỷ lệ khác nhau từ đó tính ra

phần trăm đột biến của mẫu phân tích.

42

Dãy DNA plasmid từ 5.102-5.10

7 bản sao/µl (hệ số pha loãng 10) chứa trình tự

đột biến và không đột biến đƣợc trộn theo tỷ lệ 1:1 ở cùng nồng độ chạy cùng với

mẫu trong mỗi phản ứng. Lƣợng đột biến trong mỗi mẫu đƣợc đo 3 lần (n = 3) và số

liệu đƣợc x lý theo phƣơng pháp thống kê.

2.2.8. Giải trình tự đoạn gen chứa đột biến

Trình tự đoạn gen đƣợc xác định dựa theo phƣơng pháp Sanger (kết thúc bằng

đầu tận cùng chứa dideoxynucleotide - ddNTP) thông qua dịch vụ phân tích bởi

Công ty 1st base (Singapore). Do ddNTP chỉ chứa đầu 3’-H thay cho 3’-OH nên khi

các nucleotide này đƣợc gắn vào chuỗi DNA đang đƣợc tổng hợp thì chúng sẽ làm

cho quá trình kéo dài chuỗi bị ngừng lại. Theo đó, từ một đoạn DNA khuôn ban đầu

sẽ tổng hợp nên nhiều đoạn sợi đơn mới đƣợc đánh dấu ở một đầu tận cùng là

ddNTP và các đoạn này có độ dài hơn kém nhau một nucleotide. Các đoạn sợi đơn

đó đƣợc phân tách trên gel acrylamide dạng mao quản và máy đọc trình tự sẽ tự

động phân tích kết quả để đƣa ra trình tự đoạn DNA gốc.

43

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. THU THẬP MẪU MÁU BỆNH NHÂN VÀ TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ

3.1.1. Một số đặc điểm của mẫu phân tích

Mẫu máu từ các bệnh nhi có độ tuổi từ 1 tháng đến 15 tuổi, trẻ dƣới 5 tuổi (từ

1 tháng tuổi đến 5 tuổi) đƣợc nghiên cứu chiếm tỷ lệ 87,5%, từ 6 đến 15 tuổi chiếm

tỷ lệ 12,5%. Trong đó, tỷ lệ nam là 57,1%, nữ là 43,9%.

Theo các dẫn liệu chẩn đoán lâm sàng bởi các bác sĩ Bệnh viện Nhi Trung

ƣơng, các bệnh nhi lấy mẫu nghiên cứu đều xuất hiện các triệu chứng của bệnh thần

kinh cơ (encephalomyopathy) nhƣ động kinh co giật, rối loạn chuyển hóa, chậm

phát triển tinh thần vận động, tăng acid lactic máu.

3.1.2. Tách chiết DNA tổng số của các mẫu

DNA tổng số từ 200µl mẫu máu của bệnh nhân đƣợc tách theo Kit của Qiagen

(Mục 2.3.1.), chế phẩm DNA tổng số đƣợc điện di trên gel agarose 1%. Kết quả

điện di sản phẩm DNA tổng số từ mẫu máu của các bệnh nhân (Hình 3.1) cho thấy

các chế phẩm DNA tổng số từ mẫu máu của các bệnh nhân đều có một băng DNA

rõ nét, với độ di động điện thấp (gần vạch xuất phát), chứng tỏ DNA tổng số tách

đƣợc đều nguyên vẹn.

Hình 3.1. Điện di sản phẩm DNA tổng số từ mẫu máu của các bệnh nhân

44

M: Thang chuẩn DNA 1 kb

(-): Đối chứng âm

1-5: DNA tổng số từ mẫu máu của các bệnh nhân

Kết quả đo mật độ hấp thụ ánh sáng t ngoại ở 260 nm của chế phẩm DNA

tổng số (Phụ lục 1) cho thấy các mẫu DNA đều có tỷ số A260/A280 nằm trong khoảng

1,8-2,0; chứng tỏ chế phẩm DNA ít lẫn protein hay RNA. Hàm lƣợng DNA trung

bình đạt 44,5 ng/µl. Nhƣ vậy, chúng tôi đã thu đƣợc các sản phẩm DNA tổng số đạt

yêu cầu để tiến hành các bƣớc thí nghiệm tiếp theo.

3.2. SÀNG LỌC CÁC ĐỘT BIẾN GEN THUỘC HỘI CHỨNG MERRF Ở

NGƢỜI VIỆT NAM BẰNG PHƢƠNG PHÁP PCR-RFLP

3.2.1. Sàng lọc đột biến A8344G

3.2.1.1. Nhân bản đoạn gen từ 8155 - 8366 bằng PCR

Để xác định sự thay đổi nucleotide G thành A tại vị trí 8344 trên mtDNA chúng

tôi đã tiến hành nhân bản đoạn gen có kích thƣớc 212 bp bằng kỹ thuật PCR với cặp

mồi đặc hiệu đƣợc thiết kế bởi Trƣơng Thị Huệ và tập thể [56], nhƣ bảng 3.1.

Bảng 3.1: Trình tự mồi nhân đoạn gen 8155 - 8366

Tên mồi Vị trí gắn Trình tự mồi Chu trình

nhiệt

Sản

phẩm

PCR

Những cải tiến

MRAGFw 8155 – 8175

5’GGT ATA

CTA CGG

TCA ATG

CTC 3’

94ºC: 30 giây

58ºC: 30 giây

72ºC: 30 giây

212 bp

Mồi Rv chứa một

nucleotide không

ghép cặp (T đƣợc

thay thế bằng G

tại vị trí 8347) để

tạo điểm cắt cho

BanII khi có đột

biến

MRAGRv 8366 – 8345

5’ TTT CAC

TGT AAA

GAG GTG

TGG G 3’

45

Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 2% (Hình 3.2) cho

thấy sản phẩm DNA khuếch đại của đoạn gen có kích thƣớc nhƣ tính toán lý thuyết

(212 bp), điều này chứng tỏ chúng tôi đã nhân bản thành công đoạn gen 8155 -

8366 từ mẫu DNA tổng số của các bệnh nhân.

Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen 8155 - 8366

M: Thang chuẩn DNA 100 bp

(-): Đối chứng âm (không chứa DNA khuôn)

(+): Sản phẩm PCR từ plasmid mang đột biến A8344G

1-7: Sản phẩm PCR từ mẫu DNA tổng số của bệnh nhân

3.2.1.2. Phân tích sự có mặt của đột biến A8344G bằng PCR-RFLP

Đoạn gen chứa đột biến sau khi đƣợc khuếch đại bằng PCR và kiểm tra sản

phẩm trên gel agarose 2% đƣợc cắt trực tiếp bằng enzyme giới hạn BanII.

Theo tính toán lý thuyết, đoạn gen 8155 - 8366 không chứa đột biến sẽ bị cắt

thành ba đoạn có kích thƣớc tƣơng ứng là 99 bp, 72 bp và 41 bp; trong khi đó đoạn

gen có đột biến sẽ cắt thành bốn băng với kích thƣớc lần lƣợt là 99 bp, 50 bp, 41 bp

và 22 bp, đột biến làm xuất hiện điểm cắt của enzyme BanII khiến băng 72 bp bị cắt

thành hai băng 50 bp và 22 bp (Bảng 3.2).

46

Bảng 3.2: Trình tự và sản phẩm cắt của enzyme BanII

Trình tự cắt Đệm dùng cho

enzyme

Sản phẩm cắt

DNA đột biến DNA không đột biến

GGGCC/C

GAGCC/C

GGGCC/C

R

99 bp, 41 bp, 50 bp

và 22 bp

99, 41 bp và 72 bp

Sản phẩm cắt đƣợc điện di trên gel polyacrylamide 12% và phát hiện đột biến

dựa vào sự khác nhau về kích thƣớc của phổ băng DNA dƣới ánh sáng t ngoại

(Mục 2.2.6).

Hình 3.3. Điện di sản phẩm PCR-RFLP đoạn gen 8155 - 8366 của bệnh nhân

M: Thang chuẩn DNA

(-): Sản phẩm PCR-RFLP plasmid 8344A

(+):Sản phẩm PCR-RFLP plasmid 8344G

1-7: Sản phẩm PCR-RFLP của bệnh nhân

Kết quả điện di sản phẩm PCR-RFLP (hình 3.3) cho thấy các mẫu DNA nhân

bản của bệnh nhân (đƣờng chạy 4 - 10) đều xuất hiện 3 băng có kích thƣớc tƣơng

ứng là 99 bp, 72 bp và 41 bp, giống với sản phẩm cắt của plasmid không mang đột

biến, trong khi đó đối chứng dƣơng là plasmid mang đột biến bị cắt thành 4 băng có

kích thƣớc tƣơng ứng là 99 bp, 50 bp, 41 bp và 22 bp (đƣờng chạy thứ 3). Chứng tỏ,

47

kết quả PCR-RFLP của chúng tôi là đáng tin cậy, các mẫu bệnh nhân (nêu ở đây là

7 bệnh nhân) đƣợc sàng lọc không mang đột biến A8344G. Thực tế, chúng tôi đã

sàng lọc đột biến A8344G ở 312 bệnh nhân và không phát hiện thấy bệnh nhân nào

mang đột biến A8344G.

3.2.2. Sàng lọc đột biến T8356C

Tiếp tục sàng lọc các đột biến thuộc hội chứng MERRF, chúng tôi tiến hành

điều tra đột biến T8356C trên 182 bệnh nhân nghi mắc bệnh cơ não ty thể (Phụ lục

1) bằng phƣơng pháp PCR-RFLP theo các bƣớc tƣơng tự nhƣ trên.

3.2.1.1. Nhân bản đoạn gen từ 8166 - 8358 bằng PCR

Đoạn gen chứa đột biến T8356C phải đƣợc khuếch đại bằng kỹ thuật PCR với

cặp mồi đƣợc thiết kế bởi Trƣơng Thị Huệ và tập thể [56], nhƣ bảng 3.3, chúng tôi

nhân bản đƣợc đoạn DNA từ vị trí 8166 đến 8358, với kích thƣớc 220 bp.

Bảng 3.3: Trình tự mồi cho phản ứng PCR đoạn gen 8166 - 8358

Tên mồi Vị trí gắn Trình tự

mồi

Chu trình

nhiệt

Sản

phẩm

PCR

Những cải tiến

MRTCFw 8166 – 8189

5’GTCAAT

GCTCTGA

AATCTGT

GGAG 3’

94ºC: 30 giây

60ºC: 30 giây

72ºC: 30 giây

220 bp

Mồi Rv chứa

một nucleotide

không ghép cặp

(G đƣợc thay thế

bằng T tại vị trí

8359) để tạo

điểm cắt cho

DraI khi không

đột biến

MRTCRv 8385 – 8257

5’GTAGTA

TTTAGTT

GGGGCAT

TTCACTT

TA 3’

Kiểm tra sản phẩm PCR bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 2%, cho

kết quả (Hình 3.4) là một băng DNA duy nhất có kích thƣớc 220 bp đƣợc nhân lên.

48

Ở thí nghiệm đối chứng âm không xuất hiện băng DNA nào, chứng tỏ kết quả PCR

là đúng so với những tính toán lý thuyết.

Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen 8166 - 8385

M: Thang chuẩn DNA 100 bp

(-): Đối chứng âm

(+): Sản phẩm PCR plasmid mang đột biến T8356C

1-7: Sản phẩm PCR từ mẫu DNA tổng số của bệnh nhân

3.2.2.2. Phân tích sự có mặt của đột biến T8356C bằng PCR-RFLP

Sản phẩm PCR ở trên đƣợc cắt trực tiếp bằng enzyme giới hạn DraI. Enzym

này sẽ nhận điểm cắt có trình tự TTT/AAA trên đoạn gen 8166 - 8385 không chứa

đột biến và cắt đoạn DNA 220 bp thành hai đoạn có kích thƣớc tƣơng ứng là 192 bp

và 28 bp, trong khi đó đoạn gen có đột biến không có trình tự này nên không bị cắt.

Kiểm tra sản phẩm cắt bằng phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide 12%

và phát hiện đột biến dựa vào sự khác nhau về kích thƣớc của phổ băng DNA dƣới

ánh sáng t ngoại.

49

Hình 3.5. Điện di sản phẩm PCR-RFLP đoạn gen 8166 - 8385 của bệnh nhân

M: Thang chuẩn DNA

(+): Sản phẩm PCR-RFLP của plasmid 8356C

(-): Sản phẩm PCR-RFLP của plasmid 8356T

1-7: Sản phẩm PCR-RFLP của bệnh nhân

Phổ băng điện di cho thấy kết quả tất cả sản phẩm PCR của các mẫu bệnh

nhân (đƣờng chạy 2-8) đều bị cắt thành 2 đoạn DNA có kích thƣớc 192 bp và 28 bp

(hình 3.5) giống nhƣ tính toán lý thuyết, chứng tỏ các mẫu bệnh nhân nghiên cứu

không mang đột biến T8356C. Thực tế, chúng tôi đã điều tra 182 bệnh nhân và

không phát hiện thấy trƣờng hợp nào mang đột biến T8356C.

3.2.3. Sàng lọc đột biến G8363A

Nhằm xác định nguyên nhân gây ra triệu chứng lâm sàng trên những bệnh

nhân đã đƣợc lấy mẫu nghiên cứu, chúng tôi tiếp tục sàng lọc đột biến G8363A trên

182 bệnh nhân có biểu hiện mắc hội chứng MERRF nói trên (Phụ lục 1).

3.2.1.1. Nhân bản đoạn gen từ 8342 - 8582

Chúng tôi dùng kỹ thuật PCR với cặp mồi bắt cặp đặc hiệu với sợi xuôi và sợi

ngƣợc của đoạn mtDNA nghiên cứu, đƣợc thiết kế dựa trên trình tự gen ty thể, nhƣ

bảng 3.4, để nhân lên đoạn DNA có kích thƣớc 241 bp (8342 - 8582) s dụng

khuôn là mẫu DNA tổng số đƣợc tách từ mẫu máu ngoại vi của bệnh nhân.

50

Bảng 3.4: Trình tự mồi cho PCR đoạn gen 8342 - 8582

Tên mồi Vị trí gắn Trình tự mồi Chu trình

nhiệt

Sản phẩm

PCR

MRGAFw 8342 – 8361 5’GAACCAACACCT

CTTTACAG 3’

94ºC: 30 giây

53ºC: 30 giây

72ºC: 30 giây

241 bp

MRGARv 8582 – 8561 5’GCGGGTAGGCCT

AGGATTGTGG 3’

Kiểm tra sản phẩm PCR bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 2% cho

kết quả (Hình 3.6) là một băng DNA duy nhất có kích thƣớc 220 bp đƣợc nhân lên.

Ở thí nghiệm đối chứng âm không xuất hiện băng DNA nào, chứng tỏ kết quả PCR

là đáng tin cậy so với những tính toán lý thuyết.

Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen 8342 - 8582

M: Thang chuẩn DNA 100 bp

(-): Đối chứng âm

(+): Sản phẩm PCR plasmid mang đột biến G8363A

1-7: Sản phẩm PCR từ mẫu DNA tổng số của bệnh nhân

51

3.2.2.2. Phân tích sự có mặt của đột biến G8363A bằng PCR-RFLP

Sản phẩm PCR ở trên đƣợc cắt trực tiếp bằng enzyme giới hạn NlaIII. Theo

tính toán lý thuyết, enzyme NlaIII sẽ nhận biết điểm cắt GTAC đoạn gen 8166 -

8385 không chứa đột biến sẽ bị cắt thành hai đoạn có kích thƣớc tƣơng ứng là 220

bp và 21 bp, trong khi đó đoạn gen có đột biến sẽ không bị cắt.

Sản phẩm cắt đƣợc điện di trên gel polyacrylamide 12% và phát hiện đột biến

dựa vào sự khác nhau về kích thƣớc của phổ băng DNA dƣới ánh sáng t ngoại.

Hình 3.7. Điện di sản phẩm PCR-RFLP đoạn gen 8166 - 8385 của bệnh nhân

M: Thang chuẩn DNA

(+): Sản phẩm PCR-RFLP của plasmid 8363A

(-): Sản phẩm PCR-RFLP của plasmid 8363G

1-7: Sản phẩm PCR-RFLP của bệnh nhân

Phổ băng điện di trên đƣờng chạy 2-8, cho thấy kết quả tất cả các mẫu sản

phẩm PCR của bệnh nhân đều bị cắt thành 2 đoạn DNA 220 bp và 21 bp, chứng tỏ

các mẫu bệnh nhân nghiên cứu không mang đột biến G8363A. Thực tế, chúng tôi

đã điều tra 182 bệnh nhân và không phát hiện thấy trƣờng hợp nào mang đột biến

G8363A.

Hiện nay có rất nhiều phƣơng pháp có thể áp dụng để phát hiện ra sự có mặt

của đột biến A8344G trên gen ty thể nhƣ PCR-RFLP, SSCP, xác định trình tự gen,

52

DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis), real-time PCR. Tuy nhiên, PCR-

RFLP vẫn là một kỹ thuật phân t đơn giản, hiệu quả, phù hợp cho việc sàng lọc

thông dụng một lƣợng mẫu lớn. Cao và tập thể đã s dụng PCR-RFLP để sàng lọc

1.559 mẫu bệnh nhân và phát hiện 158 trƣờng hợp mang đột biến mtDNA gây

bệnh, tất cả các trƣờng hợp đƣợc khẳng định lại bằng xác định trình tự gen đều phù

hợp với kết quả phân tích PCR-RFLP [16]. Bốn bệnh nhân Trung Quốc mang đột

biến A8344G trong nghiên cứu của Yu Qi và cộng sự, đã đƣợc giải trình tự cho kết

quả tƣơng tự nhƣ kết quả PCR-RFLP [44].

Trƣơng Thị Huệ và tập thể [55] đã nghiên cứu sàng lọc đột biến gen ty thể

bằng phƣơng pháp PCR-RFLP trên 106 bệnh nhân Việt Nam, nhƣng cũng không

phát hiện đƣợc bệnh nhân nào mang đột biến A8344G và T8356C. Trong các đột

biến gây nên hội chứng MERRF thì hơn 80% là A8344G, còn đột biến T8356C và

G8363A chỉ khoảng 10-20%. Trên thế giới đã có nhiều công bố về sàng lọc đột biến

A8344G trên bệnh nhân cơ não ty thể với kết quả đáng chú ý nhƣ nghiên cứu của

Qi và cộng sự [44] điều tra đột biến gen ty thể trên 552 bệnh nhân nghi mắc bệnh ty

thể, ở miền Bắc Trung Quốc, bằng phƣơng pháp PCR-RFLP, phát hiện 4 bệnh nhân

mang đột biến A8344G (chiếm 0,72%); Cũng một nghiên cứu khác trên 124 bệnh

nhân Trung Quốc nghi mắc hội chứng Leigh, Zhang và cộng sự đã phát hiện ra 2

bệnh nhân mang đột biến A8344G (1,61%) [63]; Seon-joo Kwon và tập thể [36],

khi nghiên cứu đột biến gen ty thể trên 65 bệnh nhân Hàn Quốc, đã phát hiện đƣợc

3 trƣờng hợp mang đột biến A8344G (4,6%). Nhƣ vậy, có thể thấy tần suất phát

hiện đột biến A8344G trong các nghiên cứu là rất khác nhau. Theo chúng tôi, sự

khác nhau này có thể liên quan nhiều đến cách khu trú lấy mẫu điều tra ban đầu và

có thể còn những nguyên nhân khác nữa cần đƣợc làm rõ.

53

3.3. XÂY DỰNG ĐƢỜNG CHUẨN ĐỂ ĐỊNH LƢỢNG ĐỘT BIẾN A8344G

BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR

3.3.1. Thiết kế mẫu dò huỳnh quang Taqman LNA

3.3.1.1. Thiết kế mẫu dò huỳnh quang Taqman LNA

Việc thiết kế mồi cho real-time PCR dùng Taqman probe về cơ bản đƣợc thực

hiện theo các nguyên tắc thiết kế mồi chung cho PCR.

Đột biến điểm A8344G (MERRF) đƣợc chúng tôi nghiên cứu định lƣợng bằng

kỹ thuật real-time PCR s dụng mẫu dò Taqman khóa cầu methyl.

Kỹ thuật này đƣợc phát triển dựa vào enzyme Taq DNA polymerase có hoạt

tính 5’-exonuclease khi mẫu dò đƣợc gắn vào cùng sợi khuôn với mồi và phản ứng

cắt này chỉ xảy ra khi gen đích đƣợc khuếch đại. Mẫu dò huỳnh quang bao gồm một

đoạn nucleotide bắt cặp đặc hiệu với trình tự đích, đƣợc đánh dấu reporter và

quencher. Khi mẫu dò nguyên vẹn, quencher làm hấp thu tín hiệu huỳnh quang từ

reporter do sự cộng hƣởng năng lƣợng huỳnh quang (nguyên lý FRET) do khoảng

cách giữa reporter và quencher khá gần nhau. Sự phân cắt của mẫu dò trong khi

PCR đã giải phóng reporter làm tăng mật độ huỳnh quang và máy đo tín hiệu huỳnh

quang sẽ ghi nhận đƣợc tín hiệu. Đây là phƣơng pháp phát hiện và định lƣợng đột

biến nhanh, nhạy và chính xác, có giá trị khi xác định tỷ lệ đột biến mtDNA thấp.

Đột biến A8344G là đột biến không đồng nhất, s dụng real-time PCR với

mẫu dò Taqman thông thƣờng đã cho tín hiệu nền cao do việc gắn không đặc hiệu

của mẫu dò vào trình tự đích vì vậy không có giá trị để xác định tỷ lệ đột biến thấp.

Vì vậy để xác định chính xác tỷ lệ đột biến A8344G thì một trong những thách thức

cơ bản là thiết kế mẫu dò Taqman phải có khả năng phân biệt đƣợc các gen đích chỉ

khác nhau một nucleotide. Điều này đạt đƣợc khi khoảng cách ΔTm giữa Tm của

mẫu dò bắt cặp hoàn toàn (mẫu dò match) và Tm của mẫu dò bắt cặp không hoàn

toàn (mẫu dò mismatch) càng lớn. Khoảng ΔTm càng lớn thì việc lựa chọn nhiệt độ

bắt cặp/kéo dài trong phản ứng PCR bên trong khoảng ΔTm càng thuận lợi, mẫu dò

sẽ bắt cặp chính xác hơn.

54

Trong thí nghiệm này, mẫu dò huỳnh quang Taqman có trình tự bổ sung với

trình tự đặc hiệu trên DNA đích, đầu 5’ của mẫu dò có gắn chất phát huỳnh quang

(reporter) FAM (495/520 nm) cho mẫu dò đặc hiệu với trình tự đột biến và HEX

(535/556) cho mẫu dò đặc hiệu với trình tự không đột biến, còn đầu 3’ của mẫu dò

có gắn chất hấp phụ tƣơng ứng (quencher) là BFQ (Black Fluorescence Quencher).

Với mục đích tăng nhiệt độ tách chuỗi (Tm) và tính đặc hiệu của mẫu dò, mẫu

dò bắt cặp đúng và bắt cặp sai cần có nhiệt độ tách chuỗi (Tm) cao hơn (Tm) của mồi

khoảng 10oC và mẫu dò phải ngắn thì tác động của sự thay đổi một nucleotide càng

lớn nên mẫu dò bắt cặp đặc hiệu hơn. Vì vậy, chúng tôi đã cải tiến mẫu dò Taqman

dƣới dạng Taqman LNA. LNA là dạng acid nucleic có chứa nucleotide cải biến với

cầu methyl giữa vị trí oxy 2’ và carbon 4’ của gốc đƣờng. Liên kết này đã hạn chế

tính linh động của nucleotide bị khóa nên làm tăng độ bền nhiệt và độ đặc hiệu của

mẫu dò trong quá trình lai. Điều này làm cho mẫu dò Taqman LNA hấp dẫn hơn khi

s dụng để phát hiện đột biến điểm trên hệ gen ty thể.

Dựa trên nguyên tắc đã phân tích, chúng tôi đã thiết kế mẫu dò Taqman LNA

đặc hiệu để phát hiện đột biến A8344G bằng real-time PCR (Bảng 3.5).

Bảng 3.5: Trình tự của mẫu dò dùng cho real-time PCR

Mẫu dò/Mồi Trình tự Vị trí trên

DNA ty thể

RT8344-Fw 5’ AGC CCA CTG TAA AGC TAA C 3’ 8291 - 8309

RT8344-Rv 5’ GGC ATT TCA CTG TAA AGA GGT 3’ 8370 - 8350

Wt-8344A-FAM 6FAM-AGA T+TA +A+GA +GA+A +CC-

IBFQ 8332 - 8346

Mt-8344G-HEX HEX-GAT +TA+A +GAG +A+GC C-IBFQ 8333 - 8346

Ghi chú: dấu + chỉ nucleotide LNA

55

3.3.1.2. Đánh giá tính đặc hiệu của mẫu dò đột biến A8344G

Đoạn DNA chứa đột biến A8344G dài 80 bp từ vị trí 8291-8370 đƣợc nhân

bản với cặp mồi RT8344-Fw và RT8344-Rv và nucleotide đột biến đƣợc phát hiện

bằng mẫu dò đặc hiệu Wt-8344A-FAM và Mt-8344G-HEX. Các th nghiệm kiểm

tra mẫu dò đƣợc thực hiện s dụng DNA khuôn là plasmid đột biến và không đột

biến đƣợc pha loãng 5.106

bản sao/µl. Qua nhiều lần thăm dò, chúng tôi đã xác định

đƣợc nồng độ mẫu dò thích hợp cho phản ứng real-time PCR là 0,02 µmol/L mỗi

loại mẫu dò cho 25l thể tích phản ứng; với hàm lƣợng mẫu dò này thì cƣờng độ

huỳnh quang đƣợc ghi nhận là cao nhất. Nhiệt độ bắt cặp của mồi và mẫu dò là

60oC, đây là nhiệt độ bắt cặp tối ƣu của mẫu dò Taqman, với nhiệt độ bắt cặp này

mẫu dò sẽ bắt cặp vào sợi đích trƣớc khi mồi bắt cặp, nhờ đó enzyme Taq DNA

polymerase dễ dàng thủy phân mẫu dò, giúp cho việc phát huỳnh quang của

reporter.

Đoạn DNA ty thể chứa đột biến A8344G dài 80 bp từ vị trí 8291-8370 đƣợc

khuếch đại bằng PCR s dụng cặp mồi RT8344-Fw và RT8344-Rv và nucleotide

đột biến đƣợc phát hiện bằng mẫu dò đặc hiệu Mt-8344G-HEX và Wt-8344A-FAM

với các plasmid mang đột biến và không mang đột biến ở nồng độ 5x106 bản sao để

kiểm tra sự hoạt động của mẫu dò và tính đặc hiệu của probe.

56

A: Mẫu dò với plasmid mang đột biến 8344G

B: Mẫu dò với plasmid không mang đột biến 8344A

Hình 3.8. Kết quả kiểm tra mẫu dò (probe)

Kết quả phân tích real-time PCR (hình 3.8) cho thấy khi chạy real-time PCR

với plasmid mang đột biến 8344G thì tín hiệu huỳnh quang chỉ lên với kênh HEX

57

trong khi phản ứng chứa đồng thời cả 2 mẫu dò Mt-8344G-HEX và Wt-8344A-

FAM. Tƣơng tự, với plasmid không mang đột biến (tức chỉ là A8344), thì chỉ có tín

hiệu FAM. Kết quả này khẳng định mẫu dò mà chúng tôi thiết kế có khả năng phân

biệt đặc hiệu mẫu đột biến và mẫu không đột biến.

3.3.2. Xây dựng đƣờng chuẩn và đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp real-

time PCR để định lƣợng đột biến A8344G

3.3.2.1. Xác định số bản sao của plasmid mang đoạn gen đột biến và không đột

biến A8344G

Để xây dựng đƣờng chuẩn của đoạn gen mang đột biến A8344G thuộc hội

chứng MERRF bằng real-time PCR, plasmid mang DNA có đột biến và không đột

biến A8344G đƣợc chuẩn bị ở các nồng độ bản sao khác nhau, dựa trên kích thƣớc

hay trọng lƣợng phân t và nồng độ của DNA plasmid thu nhận đƣợc.

Cụ thể, chúng tôi đã tính đƣợc số bản sao của Plasmid 8344A = 2,1 x 1010

bản

sao, Plasmid 8344G = 1,7 x 1010

bản sao

Số bản sao của 2 plasmid đƣợc pha loãng về cùng một nồng độ là 1 x 1010

bản

sao/µl và đƣợc pha loãng theo hệ số 10 dùng cho các thí nghiệm tiếp theo.

3.3.2. 2. Xây dựng đường chuẩn của đột biến A8344G

S dụng khuôn là hỗn hợp plasmid đột biến và không đột biến theo tỷ lệ 1:1

có nồng độ 5x107

- 5x102 bản

sao /l. Sau khi hoàn tất các chu kỳ nhiệt, các mẫu

chuẩn có số chu kỳ ngƣỡng khác nhau tƣơng quan với số lƣợng DNA đích ban

đầu (Bảng 3.6).

58

Bảng 3.6: Tƣơng quan giữa nồng độ DNA plasmid mang đột biến và không đột

biến A8344G ban đầu và số chu kỳ ngƣỡng đƣợc xác định bằng real-time PCR

Mẫu dò HEX (cho đột biến) Mẫu dò FAM (cho không đột biến)

Số chu kỳ ngƣỡng Số bản copy Số chu kỳ ngƣỡng Số bản copy

16,03 5.107 17,37 5.10

7

19,58 5.106 21,1 5.10

6

22,88 5.105 24,5 5.10

5

26,52 5.104 27,65 5.10

4

29,65 5.103 31,66 5.10

3

32,49 5.102 34,61 5.10

2

Hình 3.9. Biểu đồ khuếch đại đoạn gen mang đột biến và không mang đột biến

A8344G bằng real-time PCR

A: Các đường cong biểu thị mức độ nhân bản của các đoạn gen đích,

B: Đồ thị thể hiện tương quan gi a logarit số bản sao gen mang đột biến

A8344G (đỏ) và không mang đột biến (xanh) với giá trị chu kỳ ngư ng.

59

Kết quả phân tích real-time PCR (Hình 3.9) cho thấy đƣờng chuẩn màu xanh

là của DNA không mang đột biến và màu đỏ là dạng DNA mang đột biến, tạo ra

bằng việc s dụng các tỷ lệ nồng độ khác nhau giữa plasmid chứa đoạn gen ty thể

mang đột biến A8344G và không mang đột biến có độ tuyến tính cao, giá trị của hệ

số tƣơng quan R2 giữa số bản sao DNA ty thể và số chu kỳ ngƣỡng với mẫu dò Wt-

8344A-FAM (không mang đột biến) là 0,999 và Mt-8344G-HEX (mang đột biến) là

0,999, hiệu quả PCR nằm trong khoảng 94-100%. Slope của probe Wt-8344A-FAM

là -3,458, probe Mt-8344G-HEX là -3,317.

Nhằm kiểm tra độ nhạy và độ tin cậy của phƣơng pháp chúng tôi đã tiến hành

xây dựng đƣờng chuẩn tỷ lệ đột biến bằng cách pha mẫu chuẩn có tỷ lệ đột biến là

0,01% - 100% đột biến bằng cách trộn plasmid mang đột biến và không đột biến với

các thể tích nồng độ tƣơng ứng (Bảng 3.7).

Sau đó chúng tôi tiến hành định lƣợng mẫu chuẩn và xây dựng đồ thị sự tƣơng

quan tuyến tính giữa phần trăm tỷ lệ độ biến thực tế và lí thuyết. Đánh giá độ nhạy

và độ tin cậy của phƣơng pháp (Hình 3.10).

Bảng 3.7: Tỷ lệ phần trăm plasmid đột biến 8344G pha sẵn

Tỷ lệ đột biến (%) Plasmid đột biến (µl) Plasmid không đột biến (µl)

0,01 1 x 104 99,99 x 10

6

0,1 1 x 105 99,9 x 10

6

1 1 x 106

99 x 106

10 10 x 106 90 x 10

6

30 30 x 106 70 x 10

6

50 50 x 106 50 x 10

6

70 70 x 106 30x 10

6

100 100 x 106 0 x 10

6

60

Bảng 3.8: Kết quả thực nghiệm tỷ lệ phần trăm đột biến của mẫu chuẩn.

% đột biến lý thuyết % đột biến thực tế

0,01 0,0

0,1 0,3

1 1,4

10 8,0

30 34,0

50 51,5

70 74,2

100 100,0

Hình 3.10. Sự tƣơng quan giữa tỷ lệ đột biến thực tế và tỷ lệ đột biến lý thuyết

Kết quả thu đƣợc ở hình 3.10 cho thấy giới hạn phát hiện đột biến của

phƣơng pháp thiết lập đƣợc là 0,1%, sự tƣơng quan tuyến tính giữa tỷ lệ đột biến

thực tế và lý thuyết có độ tin cậy cao (R2

= 0,997). Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần

cho kết quả giống nhau. Nhƣ vậy đƣờng chuẩn chúng tôi thiết lập đƣợc có độ tin

cậy và độ nhạy tƣơng đƣơng với nghiên cứu của Trƣơng Thị Huệ và tập thể

(2012) trong việc xây dựng đƣờng chuẩn định lƣợng đột biến A3243G bằng

61

phƣơng pháp real-time PCR s dụng mẫu dò Taq man LNA (độ nhạy đạt 0,1%,

R2=0,999) [1].

3.2.4. Thử nghiệm khả năng phát hiện và định lƣợng đột biến A8344G

Trong 312 mẫu bệnh phẩm đã sàng lọc bằng phƣơng pháp PCR-RFLP, chúng

tôi không phát hiện đƣợc trƣờng hợp nào mang đột biến A8344G. Để khẳng định

thêm về kết quả này chúng tôi lựa chọn ngẫu nhiên 5 mẫu bệnh phẩm (kí hiệu

BN1, BN2, BN3, BN4, BN5) và th nghiệm bằng phƣơng pháp real-time PCR đã

đƣợc thiết lập ở trên.

Kết quả định lƣợng ở hình 3.11 cho thấy cả 5 mẫu bệnh phẩm đƣợc th

nghiệm chỉ thu đƣợc tín hiệu FAM, là tín hiệu không đột biến trong khi đó tín

hiệu HEX là tín hiệu đột biến đều không phát hiện đƣợc. Đƣờng chuẩn đƣợc xây

dựng có độ tuyến tính cao (R2 > 0,99). Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần cho kết quả

giống nhau. Vì vậy chúng tôi một lần nữa khẳng định 5 mẫu bệnh phẩm này đều

không mang đột biến A8344G, sự phù hợp về kết quả của hai phƣơng pháp PCR-

RFLP và real-time PCR s dụng mẫu dò huỳnh quang LNA.

Hình 3.11. Thử nghiệm định lƣợng 5 mẫu bệnh phẩm không mang đột biến

A8344G bằng real-time PCR

62

3.3. SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN GEN THUỘC HỘI CHỨNG MERRF BẰNG

PHƢƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ TRỰC TIẾP

Nhƣ đã nêu ở trên, qua sàng lọc bằng PCR-RFLP, chúng tôi đã không phát

hiện đƣợc trƣờng hợp nào mang các đột biến A8344G, T8356C và G8363A thuộc

hội chứng MERRF. Để một lần nữa khẳng định kết quả nghiên cứu bằng PCR-

RFLP là chính xác chúng tôi đã lựa chọn 29 mẫu bệnh nhân nghi ngờ (Phụ lục 1) bị

hội chứng MERRF với triệu chứng rõ nhất để giải trình tự đoạn gen 8155 - 9292

thuộc vùng các đột biến này.

3.3.1. Phân tích trình tự vùng gen mang đột biến MERRF 8155 - 9292 trên hệ

gen ty thể.

Đoạn gen ty thể 8155 - 9292 dài 1137 bp của 29 bệnh nhân nghi bị MERRF

đƣợc chúng tôi nhân gen từ phản ứng PCR với khuôn là mẫu DNA bệnh phẩm đƣợc

nhân lên bằng PCR và giải trình tự nucleotide s dụng mồi theo cả hai chiều. Kết

quả phân tích trình tự thu đƣợc cho thấy không có trƣờng hợp nào mang đột biến

A8344G, T8356C và G8363A của hội chứng MERRF (Hình 3.12). Nhƣ vậy, kết

quả xác định trình tự một lần nữa khẳng định kết quả phân tích bằng PCR-RFLP là

chính xác và đáng tin cậy.

63

Hình 3.12. Kết quả blast của trình tự đoạn gen ty thể 8155 - 9292 của 29

mẫu bệnh với trình tự chuẩn J01415.2

64

KẾT LUẬN

1. Đã sàng lọc 3 đột biến thuộc hội chứng MERRF, trên bệnh nhân nghi mắc

bệnh ty thể (312 bệnh nhân đối với đột biến A8344G và 182 bệnh nhân đối với đột

biến T8356C và G8363A) bằng phƣơng pháp PCR-RFLP nhƣng không phát hiện

đƣợc trƣờng hợp nào mang đột biến.

2. Đã thiết kế thành công mẫu dò Taqman mang nucleotide dạng khóa cầu

methyl và thiết lập đƣợc điều kiện để phân tích định lƣợng đột biến A8344G của

hội chứng MERRF bằng real-time PCR với giới hạn phát hiện đến 0,1% với độ tin

cậy cao (hệ số R2 = 0,997)

3. Đã giải trình tự trực tiếp đoạn gen ty thể 8155 - 9292 (1137 bp) của 29 mẫu

bệnh nhân trong số các bệnh nhân có biểu hiện bệnh thần kinh cơ và cho kết quả âm

tính về đột biến A8344G, T8356C, G8363A bằng PCR-RFLP và tái khẳng định tất

cả các bệnh nhân này đều không mang 1 trong 3 các đột biến vừa nêu.

KIẾN NGHỊ

1. Tiếp tục sàng lọc để phát hiện các đột biến MERRF trên bệnh nhân nghi mắc

bệnh thần kinh, cơ não ở Việt Nam.

2. Xây dựng phƣơng pháp phát hiện, định lƣợng các đột biến gen ty thể khác

nhằm hỗ trợ việc chẩn đoán lâm sàng và nghiên cứu mối liên quan giữa mức độ

biểu hiện bệnh với tỷ lệ đột biến.

65

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Trƣơng Thị Huệ, Nguyễn Văn Liệu, Phạm Vân Anh, Nguyễn Thị Vân Anh,

Phan Tuấn Nghĩa (2012), “Phát hiện và định lƣợng đột biến A3243G trong

hệ gen ty thể ở hội chứng MELAS”, Tạp chí công nghệ sinh học, 10(3), tr.

423-429.

2. Phùng Bảo Khánh, Nguyễn Văn Minh, Trần Đức Hiệp, Trần Kiều Anh, Trƣơng

Thị Huệ, Phạm Vân Anh, Lê Ngọc Anh, Cao Vũ Hùng, Phan Tuấn Nghĩa

(2015), “Phát hiện đột biến gen ty thể A1555G gây bệnh điếc cảm ứng bởi

Aminoglycoside ở một số bệnh nhân ngƣời Việt Nam”, Tạp chí Khoa học

ĐHQGHN – Khoa học Tự Nhiên và Công nghệ , 31(3), tr. 1-7.

3. Nguyễn Văn Minh, Phùng Bảo Khánh, Trƣơng Thị Huệ, Cao Vũ Hùng, Phạm

Vân Anh, Nguyễn Thị Hồng Loan, Phan Tuấn Nghĩa (2015), “Sàng lọc đột

biến G3460A, G11778A và phát hiện đột biến mất đoạn 6 bp mới trên hệ

gen ty thể bệnh nhân thần kinh cơ Việt Nam”, Tạp chí Công nghệ Sinh học,

13(2), tr. 1-7.

4. Trịnh Lê Phƣơng, Chu Văn Mẫn, Phan Tuấn Nghĩa (2009), “Phát hiện đột biến

gen A3243G của hội chứng MELAS bằng phƣơng pháp PCR-RFLP cải

tiến”, Tạp chí Di truyền và ứng dụng, 4, tr. 6-9.

5. Phạm Hùng Vân (2009), PCR và real-time PCR – Các vấn đề cơ bản và các áp

dụng thường gặp, Nhà xuất bản y học, Hà Nội.

Tiếng Anh

6. Abbott J. A., Francklyn C. S., Robey-Bond S. M. (2014), “Transfer RNA and

human disease”, Frontiers in Genetics, 5(158), pp. 1-18.

7. Abreu-Silva R. S., Lezirovitz K., Braga M. C. C., Spinelli M., Pirana S., Della-

Rosa V. A., Otto P. A., Mingroni-Netto R. C. (2006), “Prevalence of the

A1555G (12S rRNA) and tRNASer

(UCN) mitochondrial mutations in

66

hearing-impaired Brazilian patients”, Brazilian Journal of Medical and

Biological Research, 39, pp. 219-226.

8. Bai R. K., Wong L. J. C. (2004), “Detection and quantification of heteroplasmic

mutant mitochondrial DNA by real-time amplification refractory mutation

system quantitative PCR analysis: A single-step approach”, Clinical

Chemistry, 50, pp. 996-1001.

9. Berdanier C. D. (2005), Mitochondria in healthy and disease, CRC Press.

10. Blakely L. E., Alston L. C., Lecky B., Chakrabart B., Falkous G., Turnbull M.

D., Taylor W. R., Gorman S. G. (2014), “Distal weakness with respiratory

insufficiency caused by the m.8344A > G “MERRF” mutation”, Science

Direct, 24, pp. 533–536.

11. Blasiak J., Glowacki S., Kauppinen A., Kaarniranta K. (2013), “Mitochondrial

and Nuclear DNA Damage and Repair in Age-Related Macular

Degeneration”, International Journal of Molecular Sciences, 14(2), pp.

2996-3010.

12. Bornsttein B., Mas J. A., Patrono. C., Fernández-Moreno M. A., González-

Vioque E., Campos. Y., Carrozzo. R., Martín. M. A., Del Hoyo .

P., Santorelli. F. M., Arenas J., Garesse R. (2005), “Comparative analysis of

the pathogenic mechanisms associated with the G8363A and A8296G

mutations in the mitochondrial tRNA Lys

gene”, Biochemical Journal, 387,

pp. 773–77.

13. Boulet L., Karpati G., Shoubridge E. A. (1992) “Distribution and threshold

expression of the tRNA-lys mutation in skeletal muscle of patients with

myoclonic epilepsy and ragged-red fibers (MERRF)”, The American

Journal of Human Genetics, 51(6), pp. 1187 - 1200.

14. Burgstaller J. P., Johnston I. G., Poulton J. (2015), “Mitochondrial DNA disease

and developmental implications for reproductive strategies”, Molecular

Human Reproduction, 21(1), pp.11-22.

67

15. Calabresi P. A., Silvestri G., Dimauro S., Grigga R. C. (1994), “Ekbom’s

syndrome: Lipomas, ataxia, and neuropathy with MERRF”, Muscle and

Nerve, 17, pp. 943-945.

16. Cao Y., Ma Y., Zhang Y., Li Y., Fang F., Wang S., Bu D., Xu Y., Pei P., Li L.,

Xiao Y., Wua H, Yang Y., Zou L., Qi Y. (2010), “Detection of eight

frequently encountered point mutations in mitochondria in Chinese patients

suggestive of mitochondrial encephalomyopathies”, Mitochondrion, 10, pp.

330-334.

17. Chong J. W., Annuar A. A, Wong W. T., Thong M. K., Goh K. J. (2014),

“Single mitochondrial DNA deletions in chronic progressive external

ophthalmoplegia (CPEO) and Kearns-Sayre syndrome (KSS) patients from

a multiethnic Asian population”, Neurology Asia, 19(1), pp. 27-36.

18. Cohen H. B. (2013), “Neuromuscular and Systemic Presentations in Adults:

diagnoses beyond MERRF and MELAS”, Neurotherapeutics, 10, pp. 227–

242.

19. Craven L., Tuppen H. A., Greggains G. D., Harbottle S. J., Julie L., Murphy,

Cree L. M., Murdoch A. P., Chinnery P. F., Taylor R. W., Lightowlers R.

N., Herbert M., Turnbull D. M. (2010), “Pronuclear transfer in human

embryos to prevent transmission of mitochondrial DNA disease”, Nature,

465(7294), pp. 82-85.

20. De la Mata M., Garrido-Maraver J., Cotán D., Cordero M. D., Oropesa- vila

M., Izquierdo L. G., De Miguel M., Lorite J. B., Infante E. R., Ybot

P., Jackson S., Sánchez-Alcázar J. A. (2012), “Recovery of MERRF

Fibroblasts and Cybrids Pathophysiology by Coenzyme Q10”,

Neurotherapeutics, 9, pp. 446-463.

21. Detmer S. A., Chan D. C. (2007), “Functions and dysfunctions of mitochondrial

dynamics”, Nature Publishing Group, 8, pp. 870-879.

22. Duchen M. R. (2004), “Roles of Mitochondria in Health and Disease”,

Diabetes, 53, pp. 96-102.

68

23. Duchen M. R., Szabadkai G. (2010), “Role of mitochondria in human disease”,

Essay in Biochemistry, 47, pp. 118-136.

24. El-Hattab A. W., Scaglia F. (2013), “Mitochondrial DNA Depletion

Syndromes: Review and Updates of Genetic Basis, Manifestations, and

Therapeutic Options”, Neurotherapeutics, 10, pp. 186-198.

25. Emmanuele V., Silvers D. S., Sotiriou E., Tanji K., DiMauro S., Hirano M.

(2011), “MERRF and Kearns-Sayre overlap syndrome due to the mtDNA

m.3291T>C mutation”, Muscle Nerve., 44(3), pp. 448–451.

26. Fan H., Civalier C., Booker J. K., Gulley M. L., Prior T. W., Farber R. A.

(2006), “Detection of common disease-causing mutations in mitochondrial

DNA (Mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis with stroke-like

episodes MTTL1 A3243G and myoclonic epilepsy associated with ragged-

red fibers MTTK A8344G) by real-time polymerase chain reaction”, Journal

of Molecular Diagnostics, 8, pp. 277-281.

27. Fawcett D. W. (1981), The Cell, W. B. Saunders Company, NewYork.

28. Fukuhara N., Tokiguchi S., Shirakawa K., Tsubaki T. (1980), “Myoclonus

epilepsy associated with ragged-red fibers (mitochondrial abnormalities)

disease entity or a syndrome”, Journal Neurol Science, 4791, pp. 117-133.

29. Giles R. E. (1980), “Maternal inheritance of human mitochondria DNA”,

Genetics, 77, pp. 6715-6719.

30. Graf W.D., Sumi S. M., Copass M. K., Ojemann L. M., Longstreth W. T.,

Shanske S., Lombes A., DiMauro S. (1993), “Phenotypic Heterogeneity in

families with the Myoclonic Epilepsy and Ragged-Red Fiber Disease Point

Mutation in Mitochondrial DNA”, American Neurological Association, 33,

pp. 640-645.

31. Greaves L. C., Reeve A. K., Taylor R. W., Turnbull D. M. (2012)

“Mitochondrial DNA and disease”, The Journal of Pathology, 226, pp. 274-

286

69

32. Green R. D., Reed C. J. (1998), “Mitochondria and apoptosis”, Science, 281,

pp. 1309 – 1311.

33. Hammans S. R., Sweeney M. G., Brockington M., Lennox G. G., Lawton N. F.,

Kennedy C. R., Morgan-Hughes J. A., Harding A. E. (1993), “The

mitochondrial DNA transfer RNALys

AG(8344)

mutation and the syndrome

of myoclonic epilepsy with ragged red fibres (MERRF): Relationship of

clinical phenotype to proportion of mutant mitochondrial DNA”, Brain,116,

pp. 617-632.

34. Jeong S. Y., Seol D. W. (2007), “The role of mitochondria in apoptosis”, B. M.

B. reports, pp. 11-22.

35. Krauss S. (2001), “Mitochondria: Structure and Role in Respiration”,

Encyclopedia of Life Sciences, pp. 1- 6.

36. Kwon S. J., Park S. S., Kim J. M., Ahn T. B., Kim S. H., Kim J., Lee S. H., Ha

C. K., Ahn M. Y., Jeon B. S. (2004), “Investigation of common

mitochondrial point mutations in Korea”, Genes and apoptosis to aging and

disease, 1011, pp. 339-344.

37. Lorenzoni P. J., Scola R. H., Kay C. S. K., Silvado C. E. S., Werneck L. C.

(2014), “When should MERRF (myoclonus epilepsy associated with

ragged-red fibers) be the diagnosis?”, Arquivos Neuro-psiquiatria (tên đầy

đủ), 72(10), pp. 803-881.

38. Masucci J. P., Davidson M., Koga Y., Schon E. A., King A. P. (1995), “In Vitro

Analysis of Mutations Causing Myoclonus Epilepsy with Ragged-Red

Fibers in the Mitochondrial tRNA Lys

Gene: Two Genotypes Produce

Similar Phenotypes”, Molecular Cellular Biology, 15(5), pp. 2872-2881.

39. Mfinschef C., Rieger T., Miiller-Huckerb J., Kadenbach B. (1993), “The point

mutation of mitochondrial DNA characteristic for MERRF disease is

found also in healthy people of different ages”, Federation of

European Biochemical Societies letters, 317(1), pp. 27-30.

70

40. Mimaki M., Hatakeyama H., Ichiyama T., Isumi H., Furukawa S., Akasaka M.,

Kamei A., Komaki H., Nishino I., Nonaka I., Goto Y. (2009), “Different

effects of novel mtDNA G3242A and G3244A base changes adjacent to a

common A3243G mutation in patients with mitochondrial disorders”,

Mitochondrion, 9(2), pp. 115-122.

41. Musumeci O., Andreu A. L., Shanske S., Bresolin N., Comi G. P., Rothstein

R., Schon E. A., DiMauro S. (2000), “Intragenic inversion of mtDNA: A

new type of pathogenic mutation in a patient with mitochondrial

myopathy”, The American Journal of Human Genetics, 66, pp. 1900-1904.

42. Noer A. S., Sudoyo H., Lertrit P., Thyagarajan D., Utthanaphol P., Kapsa R.,

Byrnet E., Marzuki S. (1991), “A tRNALys

Mutation in the mtDNA is the

Causal Genetic Lesion Underlying Myoclonic Epilepsy and Ragged-Red

Fiber (MERRF) Syndrome”, The American Society of Human Genetics, 49,

pp. 715-722.

43. Pulkes T., Hanna M. G. (2001), “Human mitochondrial DNA diseases”,

Advanced Drug Delivery Reviews, 49, pp. 27-43.

44. Qi Y., Zhang Y., Wang Z., Yang Y., Yuan Y., Niu S., Pei P., Wang S., Ma

Y., Bu D., Zou L., Fang F., Xiao J., Sun F., Zhang Y., Wu Y., Wang

S., Xiong H., Wu X. (2006), “Screening of common mitochondrial

mutations in Chinese patients with mitochondrial encephalomyopathies”,

Mitochondrion, 7, pp. 147-150.

45. Santorelli F. M., Mak S. C., El-Schahawi M., Casali C., Shanske S., Baram T.

Z., Madrid R. E., DiMauro S. (1996), “ Maternally Inherited

Cardiomyopathy and Hearing Loss Associated with a Novel Mutation in the

Mitochondrial tRNA1LY Gene (G8363A)”, The American Journal of

Human Genetics, 58, pp. 933-939.

46. Sato M., Sato K. (2013), “Maternal inheritance of mitochondrial DNA by

diverse mechanisms to eliminate paternal mitochondrial DNA”, Biochimica

et Biophysica Acta, 1833, pp. 1979-1984.

71

47. Seibel P., Degoul F., Bonne G., Romero N., Frangois D., Paturneau-Jouas M.,

Ziegler F., Eymard B., Fardeau M., Marsac C., Kadenbach B. (1991),

“Genetic biochemical and pathophysiological characterization of a familial

mitochondrial encephalomyopathy (MERRF)”, Journal of the Neurological

Sciences, 105, pp. 217-224.

48. Sena L. A., Chandel N. S. (2012), “Physiological roles of mitochondrial

reactive oxygen species”, Molecular Cell, 48(2), pp. 158-167.

49. Shanske S., Goodman S., Sue C. M., Bruno C., Johnson T. L., Lava N.

S., Waheed N., DiMauro S. (2000), “G8363A mutation in the mitochondrial

DNA transfer ribonucleic acid Lys gene: another cause of Leigh syndrome”,

Journal of Child Neurology, 15(11), pp. 759-761.

50. Shoffner J. M., Wallace D. C. (1992), “Mitochondrial Genetics: Principles and

Practice”, The American Journal of Human Genetics, 51, pp. 179-1186.

51. Silvestri G., Moraes C. T. , Shanske S., Oh S. J., DiMauro S. (1992), “A New

mtDNA Mutation in the tRNA Lys

Gene Associated with Myoclonic

Epilepsy and Ragged-Red Fibers (MERRF)”, The American Journal of

Human Genetics, 51, pp. 1213-1217.

52. Szuhai K., Ouweland J. M., Dirks R. W., Lemaître M., Truffert J. C., Janssen J.

M., Tanke H. J., Holme E., Maassen J. A., Raap A. K. (2001),

“Simultaneous A8344G heteroplasmy and mitochondrial DNA copy

number quantification in Myoclonus Epilepsy and Ragged-Red Fibers

(MERRF) syndrome by a multiplex Molecular Beacon based real-time

fluorescence PCR”, Nucleic Acids Research, 29(3), pp. 1-6.

53. Taylor R. W., Morris A. A. M., Hutchinson M., Turnbull D. M. (2002), “Leigh

disease associated with a novel mitochondrial DNA ND5 mutation”,

European Journal of Human Genetics, 10, pp. 141-144.

54. Taylor R. W., Turnbull D. M. (2007), “Mitochondrial DNA mutations in human

disease”, Nature Review Genetics, 6(5), pp. 389-402.

72

55. Truong T. H., Nguyen T. V. A., Nguyen V. L., Pham V. A., Phan T. N. (2014),

“Screening of common point-mutations and discovery of new T14727C

change in mitochondrial genome of Vietnamese encephalomyopathy

patients”, Mitochondrial DNA, Early Online, pp. 1-8.

56. Tuppen H. A., Blakely E. L., Turnbull D. M., Taylor R. W. (2010),

“Mitochondrial DNA mutations and human disease”, Biochimica et

Biophysica Acta, 1797, pp. 113–128.

57. Virgilio R., Ronchi D., Bordoni A., Fassone E., Bonato S., Donadoni

C., Torgano G., Moggio M., Corti S., Bresolin N., Comi G. P. (2009),

“Mitochondrial DNA G8363A mutation in the tRNA Lys gene: clinical,

biochemical and pathological study”, Journal Neurol Science, 281(1-2), pp.

85-92.

58. Wallace C. D. (2012), “Mitochondria and cancer”, Nature Reviews Cancer,

12(10), pp. 685–698.

59. Wallace C. D., Chalkia D. (2013), “Mitochondrial DNA Genetics and the

Heteroplasmy Conundrum in Evolution and Disease”, Cold Spring Harbor

Perspectives in Biology, 5, pp. 1-47.

60. Wang Z., Cai F., Chen X., Luo M., Hu L., Lu Y. (2013), “The Role of

Mitochondria-Derived Reactive Oxygen Species in Hyperthermia-Induced

Platelet Apoptosis”, Plos one, 8(9), pp. 1-14.

61. Wong L. J. C. (2012), “Mitochondrial Disorders Biochemical and Molecular

Analysis”, Human Express, Part 1, pp. 3-46.

62. Yao Y. G., Watkins W. S., Zhang Y. P. (2000), “Evolutionary history of the

mtDNA 9-bp deletion in Chinese populations and its relevance to the

peopling of east and southeast Asia”, Human Genetics, 107, pp. 504-512.

63. Zhang Y., Yang Y. L., Sun F., Cai X., Qian N., Yuan Y., Wang Z. X., Qi

Y., Xiao J. X., Wang X. Y., Zhang Y. H., Jiang Y. W., Qin J., Wu X. R.

(2007), “Clinical and molecular survey in 124 Chinese patients with Leigh

73

or Leigh-like syndrome”, Journal of Inherited Metabolic Disease, 30(2), pp.

265-267.

Tài liệu trang web

64. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed

65. http://ghr.nlm.nih.gov/condition/pearson-marrow-pancreas-syndrome

66. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1173/

67. http://www.pnas.org/content/105/11/4441/F1.expansion.html

68. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK9896/

69. https://www.orpha.net/data/patho/GB/uk-LHON

70. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1520/

71. http://www.ngrl.org.uk/Wessex

74

PHỤ LỤC 1: DANH SÁCH BỆNH NHÂN - LẤY MẪU PHÂN TÍCH SỰ CÓ MẶT CỦA ĐỘT BIẾN

A8344G, T8365C VÀ G8363A

STT HỌ TÊN TUỔI

GIỚI

TÍNH

TRIỆU CHỨNG LÂM SÀNG MÃ SỐ

NỒNG

ĐỘ

DNA

TỔNG

SỐ

TỶ LỆ

280/

260

SÀNG

LỌC ĐB

A8344G

SÀNG

LỌC ĐB

T8356C

SÀNG

LỌC ĐB

G8363A

1 Vũ Hoàng H 2 t Nam Viêm não BN001 13,1 1,97 x

2 Trần Minh Q 13 th Nam Thoái hóa cơ tủy BN002 12,16 2,03 x

3 Nguyễn Minh D 14 th Nam Bệnh RICH, tiên đoán hội

chứng Leigh BN003 17,51 2,06 x

4 Nguyễn Đức K 1 th Nam Bệnh ty thể, đẻ non BN004 16,77 1,9 x

5 Đỗ Thị L 13 th Nữ Co giật BN005 33,29 2,04 x

6 Vũ Hƣơng G 3 t Nữ Co giật, chậm phát triển BN006 28,92 1,95 x

7 Phạm Minh H 4 t Nam Bệnh RICH BN007 24,84 1,99 x

8 Nguyễn Hoàng Chí T 3 t Nam Co giật, chậm phát triển trí tuệ BN008 53,95 1,91 x

9 Đinh Thị Mai T 2 t Nữ Viêm chất trắng não BN009 42,49 1,9 x

10 Lý A C 5 th Nam Đau đầu BN010 43,86 2,05 x

11 Trƣơng Thị Thu H 4 th Nữ Viêm chất trắng não BN011 42,49 1,92 x

12 Nguyễn Hoàng Thu T 2 t Nữ Động kinh BN012 59,78 1,95 x

75

13 Trịnh Ngọc S 20 th Nam Liệt n a ngƣời BN013 11,34 1,94 x

14 Hoàng Mạnh H 4 t Nam Thiếu máu, thiếu sắt BN014 12,86 1,94 x

15 Nguyễn Văn T 6 t Nam Teo cơ BN015 88,42 1,91 x

16 Trịnh Mai L 3 t Nữ Co giật không đặc hiệu BN016 10,31 1,95 x

17 Lê Minh H 4 t Nam Động kinh BN017 83,8 1,91 x

18 Đỗ Thị T 2 t Nữ Động kinh BN018 66,84 1,92 x

19 Nguyễn Thảo A 8 th Nữ Co giật BN019 20,42 1,94 x

20 Phan Thị H 25 th Nữ Động kinh BN020 13,72 1,94 x

21 Hoàng Đức P 3 t Nam Động kinh BN021 83,89 1,96 x

22 Hà Duy M 4 th Nam Nhồi máu não BN022 59,78 1,86 x

23 Bùi Nhật A 6 th Nam Cơn co giật BN023 16,21 1,92 x

24 Nguyễn Thị P 6 t Nữ Bệnh RICH BN024 30,57 1,92 x

25 Nguyễn Khắc T 3 th Nam VFQF/ Bại não BN025 28,63 1,85 x

26 Nguyễn Hoàng V 7 t Nam Đau đầu BN026 23,81 1,9 x

27 Nguyễn Minh N 3 t Nam Động kinh BN027 27,99 1,73 x

28 Nông văn T 4 t Nam Động kinh BN028 20,15 1,77 x

29 Đỗ Duy T 5 t Nam Loạn dƣỡng cơ BN029 62,64 1,85 x

30 Ninh Gia H 4 t Nam Động kinh BN030 98,85 1,77 x

31 Nguyễn Bảo A 20 th Nam Giật cơ, chậm phát triển tinh

thần vận động BN031 125,89 1,89 x

32 Nguyễn Thị D 14 th Nữ Co giật từng cơn, không sốt, BN032 10,31 1,91 x

76

chậm phát triển

33 Vũ Thủy T 4 t Nữ Bệnh RICH chất khoáng BN033 87,25 1,77 x

34 Lê Thị H 3 th Nữ Co giật BN034 122,53 1,79 x

35 Dƣơng Thị Yến N 3 t Nữ Chậm phát triển BN035 43,86 1,45 x

36 Việt N 15 th Nam Bại não BN036 101,61 1,73 x

37 Nguyễn Phƣơng A 3 t Nữ Động kinh BN037 48,92 1,85 x

38 Vũ Thảo V 11 t Nữ Động kinh BN038 54,2 1,9 x

39 Lại Thanh H 8 t Nữ Chậm phát triển BN039 68,7 1,86 x

40 Hoàng Kim C 6 t Nữ Động kinh BN040 86,58 1,85 x

41 Phí Thu T 4 th Nữ Co giật BN041 71,02 1,9 x

42 Nguyễn Thảo N 6 th Nữ Co giật BN042 108,62 1,73 x

43 Nguyễn Tấn D 4 t Nam Động kinh BN043 67,27 1,77 x

44 Trần Tuấn H 6 t Nam Động kinh BN044 27,88 1,85 x

45 Đỗ Hà L 4 t Nữ Chậm phát triển BN045 29,01 1,77 x

46 Phạm Thị Anh T 7 t Nữ Động kinh BN046 12,34 1,89 x

47 Lƣơng Quang Đ 8 t Nam Nôn nhiều, đau đầu, đau cơ BN047 43,86 2,03 x

48 Lê Phú T 2 t Nam Tật đầu nhỏ BN048 88,42 2,05 x

49 Trần Công H 12 th Nam Co giật BN049 27,86 1,93 x

50 Nguyễn Phƣơng A 6 t Nữ Bệnh RICH chất khoảng BN050 42,49 1,91 x

51 Trần Xuân A 5 t Nam Chậm phát triển BN051 21,44 1,93 x

52 Trần Văn S 3 th Nam Co giật BN052 29,63 1,9 x

77

53 Lê nh D 4 th Nữ Co giật BN053 83,88 1,93 x

54 Nguyễn Hoàng S 12 th Nam Co giật BN054 59,78 1,92 x

55 Phí Thu T 4 t Nữ Chậm phát triển BN055 20,18 1,97 x

56 Quách Thị Kim O 5 th Nữ Co giật BN056 30,44 1,88 x

57 Nguyễn Quốc C 6 t Nam Động kinh BN057 87,25 1,93 x

58 Hoàng Thị Quỳnh A 4 t Nữ Động kinh BN058 20,53 1,97 x

59 Đặng Vy Hà A 8 t Nữ Bệnh RICH Tyroxin BN059 37,42 1,93 x

60 Nguyễn Trần Đăng N 9 t Nam Động kinh toàn thể BN060 19,72 1,95 x

61 Lê Nhật L 13 th Nữ Co giật BN061 34,73 1,94 x

62 Nguyễn Thị Dƣơng Q 6 th Nữ Co giật BN062 25,64 1,95 x

63 Phạm Ngọc S 1 th Nam Ống sọ hầu BN063 57,53 1,9 x

64 Nguyễn Đình T 4 t Nam Động kinh BN064 27,85 1,92 x

65 Lƣơng Đình Q 5 t Nam Chậm phát triển BN065 88,42 1,9 x

66 Hoàng Minh N 7 t Nam Bệnh RICH chất khoáng BN066 32,56 1,92 x

67 Nguyễn Hoàng K 3 t Nam Động kinh BN067 13,62 1,93 x

68 Vũ Văn P 4 t Nam Động kinh BN068 45,93 1,89 x

69 Lê Minh P 5 t Nữ Chậm phát triển BN069 20,44 1,91 x

70 Nguyễn Thị Phƣơng N 3 t Nữ Động kinh BN070 23,53 1,94 x

71 Nguyễn Đan K 4 t Nam Chậm phát triển tinh thần vận

động BN071 60,07 1,95 x

72 Trần Hoàng A 3 t Nam Động kinh BN072 59,1 1,94 x

78

73 Trần Xuân H 6 t Nam Bệnh RICH axit amin BN073 77,48 1,98 x

74 Đặng Minh H 6 t Nam Bệnh RICH BN074 57,79 1,93 x

75 Nguyễn Hoàng Chí T 4 t Nam Bệnh RICH BN075 42,82 1,93 x

76 Trƣơng Anh T 4 t Nữ Chậm phát triển thần kinh BN076 87,25 1,98 x

77 Nguyễn Duy K 8 t Nam Bệnh Rich BN077 78,22 1,97 x

78 Đỗ nh L 6 t Nữ Chậm phát triển thần kinh vận

động BN078 85,12 1,93 x

79 Phạm Thị Minh C 5 th Nữ Bại não BN079 106.00 1,97 x

80 Lƣơng Đình Q 5 t Nam Động kinh BN080 120,84 1,97 x

81 Phạm Trần Phƣơng L 3 t Nữ Nhƣợc cơ chƣa rõ nguyên nhân BN081 74,3 1,93 x

82 Phạm Văn K 13 th Nam Co giật không rõ nguyên nhân BN082 94,1 1,96 x

83 Xa Thị Hồng H 4 t Nữ Động kinh BN083 89,17 1,94 x

84 Nguyễn Kim O 8 t Nữ Chậm phát triển BN084 89,43 1,96 x

85 Nguyễn Thị N 3 th Nữ Co giật BN085 73,45 1,94 x

86 Nguyễn Quang Đ 5 th Nam Tăng áp lực sọ BN086 134,66 1,85 x

87 Phạm Thị Vân A 10 t Nữ Động kinh BN087 112,97 1,75 x

88 Nguyễn Ninh Kh 5 t Nam Bệnh Rich BN088 38,12 1,69 x

89 Đỗ Mỹ A 6 t Nữ Động kinh BN089 83,49 1,72 x

90 Lê Văn T 4 t Nam Động kinh BN090 42,98 1,84 x

91 Nguyễn Thị Thảo V 3 t Nữ Chậm phát triển, co giật BN091 46,3 1,82 x

92 Hoàng Trọng N 4 t Nam Chậm phát triển, co giật BN092 39,38 1,91 x

79

93 Nguyễn Thị Thùy L 5 t Nữ Chậm phát triển thế chất BN093 21,34 1,86 x

94 Nguyễn Bích N 8 t Nữ Chậm phát triển thế chất BN094 19,99 1,9 x

95 Phùng Ngọc T 4 t Nam Chậm phát triển BN095 37,36 1,86 x

96 Hà Việt Anh T 4 t Nữ Động kinh BN096 33,93 1,8 x

97 Đoàn Nông Thảo M 3 th Nữ Co giật BN097 33,29 1,64 x

98 Trần Thị Bích L 5 th Nữ Co giật BN098 28,92 1,75 x

99 Lƣu Quang T 2 t Nam Sốt, giảm vận động BN099 24,84 1,69 x

100 Nguyễn Thu N 7 th Nữ Co giật BN100 53,95 1,67 x

101 Trần Quang M 6 th Nam Viêm phế quản phải BN101 32,23 1,98 x

102 Bùi Đức T 4 t Nam Chậm phát triển BN102 12,86 1,65 x

103 Đỗ Đức Anh Q 9 t Nam Bại não BN103 20,42 1,63 x

104 Trần Lê Cát L 8 th Nữ Co giật BN104 13,72 1,68 x

105 Đoàn Việt B 2 t Nam Sốt, giảm vận động BN105 90,66 1,64 x

106 Tạ Thị An B 4 t Nữ Wilson BN106 25,77 1,84 x

107 Phan Đình T 5 t Nam Động kinh BN107 16,21 1,72 x

108 Phạm Việt C 6 t Nam Bệnh RICH BN108 28,63 1,76 x

109 Nguyễn Quỳnh N 5 th Nữ Co giật BN109 23,81 1,76 x

110 Kim Văn T 6 t Nam Chậm phát triển thần kinh BN110 17,51 1,6 x

111 Lý Thị Huyền T 18 th Nữ Động kinh BN111 30,57 2,73 x

112 Nông Thị Kiều O 8 th Nữ Co giật BN112 20,1 1,62 x

113 Đào Nguyên S 8 t Nam Chậm phát triển thần kinh BN113 10,31 1,68 x

80

114 Phạm Minh L 4 t Nam Động kinh BN114 88,42 1,63 x

115 Nguyễn Minh K 4 t Nam Động kinh BN115 66,84 1,98 x

116 Phạm Việt Y 5 th Nam Co giật BN116 57,32 1,61 x

117 Tạ Thị Minh H 5 t Nữ Chậm phát triển thần kinh BN117 20,42 1,71 x

118 Đỗ Minh K 6 t Nam Đau đầu BN118 34,51 1,64 x

119 Cao Bảo M 4 t Nam Chậm phát triển BN119 56,84 1,44 x

120 Trần Khánh L 4 t Nữ Viêm màng não do Listeria BN120 40,71 1,93 x

121 Phan Minh H 5 th Nam Viêm tiểu phế quản BN121 11,34 1,75 x

122 Phàng Thị A 4 t Nữ Chấn động não BN122 25,42 1,97 x

123 Bùi Minh Đ 4 t Nam Co giật/ RICH BN123 30,51 1,93 x

124 Triệu Bảo L 5 t Nam Chậm phát triển BN124 30,45 1,97 x

125 Lê Văn T 3 t Nam Động kinh BN125 20,46 1,97 x

126 Phạm Quỳnh C 4 th Nữ Co giật BN126 43,33 1,93 x

127 Lý Thị Huyền T 3 t Nữ Động kinh BN127 23,56 1,96 x

128 Nguyễn Thị Thu U 4 t Nữ Động kinh BN128 17,42 1,94 x

129 Lê Nhân A 5 t Nam Bệnh RICH BN129 12,37 1,96 x

130 Trần Minh H 4 t Nam Bệnh RICH/Nhồi máu não BN130 14,77 1,94 x

131 Thân Minh Q 3 t Nam Viêm màng não BN131 30,63 1,85 x x x

132 Nguyễn Huệ H 5 t Nữ Chậm phát triển BN132 47,82 1,75 x x x

133 Mai Thị Thu H 4 t Nữ Động kinh BN133 34,87 1,69 x x x

134 Vũ Thành L 3 t Nam Bệnh cơ, co giật BN134 47,2 1,72 x x x

81

135 Vũ Khánh L 6 t Nữ Chậm phát triển BN135 32,64 1,84 x x x

136 Đoàn Đức D 3 t Nam Chậm phát triển tiểu não BN136 31,75 1,82 x x x

137 Cao Đình H 8 th Nam Co giật BN137 27,88 1,91 x x x

138 Trần Đức Q 15 th Nam Động kinh BN138 21,45 1,86 x x x

139 Phạm Thiên H 3 t Nữ Động kinh kháng trị BN139 29,63 1,9 x x x

140 Nguyễn Hà T 9 th Nữ Co giật BN140 30,47 1,93 x x x

141 Phí Thu T 21 th Nữ Động kinh BN141 13,69 1,98 x x x

142 Hoàng Ngọc L 3 t Nam Tật đầu nhỏ BN142 45,96 1,97 x x x

143 Đỗ Đức Anh Q 18 th Nam Động kinh BN143 23,94 1,93 x x x

144 Ngô Thị Thanh D 6 th Nữ Não úng thủy BN144 26,91 1,97 x x x

145 Nguyễn Thị Kim N 7 th Nữ Co giật BN145 22,53 1,97 x x x

146 Chu Hải P 13 th Nam Loạn dƣỡng não chất trắng BN146 31,72 1,93 x x x

147 Nguyễn Đình P 4 t Nam RICH axit amin thơm BN147 27,84 1,96 x x x

148 Nguyễn Thành V 6 t Nam Động kinh, điếc BN148 20,58 1,94 x x x

149 Lê Trọng Đăng K 8 t Nam Chậm phát triển tâm thần trung

ƣơng BN149 37,49 1,96 x x x

150 Lê Trƣờng Duy K 7 th Nam Não úng thủy bẩm sinh BN150 19,74 1,94 x x x

151 Nguyễn Vinh G 6 th Nam Não úng thủy bẩm sinh BN151 32,55 1,85 x x x

152 Trần Văn K 8 t Nam Chậm phát triển tâm thần BN152 34,73 1,75 x x x

153 Phạm Ngọc Linh A 9 th Nữ Động kinh BN153 25,65 1,69 x x x

154 Lê Tuấn Đ 8 t Nam Chậm phát triển tâm thần BN154 27,88 1,72 x x x

82

155 Nguyễn Thị Quỳnh A 22 th Nữ Xuất huyết não BN155 31,99 1,84 x x x

156 Nguyễn Anh T 11 th Nam Co giật BN156 24,9 1,82 x x x

157 Đoàn Bảo N 14 th Nữ Co giật BN157 46,9 1,93 x x x

158 Trần Trọng N 20 th Nam Động kinh BN158 33,23 1,98 x x x

159 Vũ Văn T 4 t Nam Động kinh BN159 18,55 1,97 x x x

160 Trần Mộc S 7 t Nam Chậm phát triển BN160 33,07 1,93 x x x

161 Bùi Thị T 15 th Nữ Động kinh BN161 29,03 1,97 x x x

162 Nguyễn Sỹ P 19 th Nam Động kinh BN162 44,22 1,97 x x x

163 Phan Thị Quỳnh N 3 t Nữ Động kinh BN163 27,14 1,93 x x x

164 Phạm Thị Lâm C 9 t Nữ Teo cơ, không phì đại bắp cơ BN164 33,8 1,96 x x x

165 Nguyễn Mạnh T 4 t Nam Tật đầu nhỏ BN165 15,23 1,94 x x x

166 Nguyễn Thị T 26 th Nữ Động kinh BN166 16,6 1,96 x x x

167 Đặng Thanh T 2 th Nam Não úng thủy BN167 27 1,94 x x x

168 Hồ Diên P 4 th Nữ Co giật BN168 28,4 1,85 x x x

169 Trần Ngọc T 6 t Nam Loạn dƣỡng não chất trắng BN169 30,6 1,75 x x x

170 Hồ Văn H 8 t Nam RICH axit amin thơm BN170 22,2 1,93 x x x

171 Lê Quang M 7 t Nam Động kinh, điếc BN171 29,3 1,98 x x x

172 Lê Văn Ngọc B 5 t Nam Chậm phát triển tâm thần trung

ƣơng BN172 21,2 1,97 x x x

173 Trần Khánh L 8 th Nữ Não úng thủy bẩm sinh BN173 26,33 1,93 x x x

174 Phạm Đức A 6 th Nam Não úng thủy bẩm sinh BN174 30,63 1,97 x x x

83

175 Nguyễn Thị L 3 t Nữ Chậm phát triển tâm thần BN175 16,67 1,97 x x x

176 Nguyễn Hà Việt D 14 th Nam Động kinh BN176 24,36 1,93 x x x

177 Lƣơng Thu H 8 t Nữ Chậm phát triển tâm thần trung

ƣơng BN177 19,65 1,96 x x x

178 Nguyễn Khoa Thủy T 5 t Nữ Chậm phát triển BN178 41,9 1,94 x x x

179 Loan Thanh Duy K 4 t Nam Chậm phát triển tiểu não BN179 21,8 1,96 x x x

180 Trần Duy M 9 th Nam Co giật BN180 22,91 1,94 x x x

181 Phạm Duy A 25 th Nam Động kinh BN181 38,45 1,85 x x x

182 Lê Thị V 4 t Nữ Động kinh kháng trị BN182 44,3 1,75 x x x

183 Trần Thị Tố U 5 th Nữ Co giật BN183 28,1 1,69 x x x

184 Vằng Thị Q 17 th Nữ Co giật BN184 18,94 1,72 x x x

185 Lê Đức M 2 th Nam Co giật BN185 30,4 1,84 x x x

186 Ngô Khánh V 20 th Nam Động kinh BN186 33,6 1,82 x x x

187 Nguyễn Văn C 3 t Nam Chậm phát triển tâm thần vận

động BN187 20,34 1,91 x x x

188 Phạm Văn T 12 t Nam Co giật BN188 32,57 1,86 x x x

189 Đỗ Thị Hồng N 15 th Nữ Động kinh BN189 49,04 1,93 x x x

190 Trần Thị Bảo N 3 t Nữ Động kinh BN190 30,8 1,98 x x x

191 Trần Phƣơng M 4 t Nữ Chậm phát triển BN191 14,1 1,97 x x x

192 Nguyễn Hải N 15 th Nam Co giật BN192 40,2 1,93 x x x

193 Diền Thị S 4 t Nữ Chậm phát triển tâm thần vận BN193 39,85 1,97 x x x

84

động

194 Trịnh Thị Lan P 12 th Nữ Co giật BN194 44,76 1,97 x x x

195 Lê Thị P 20 th Nữ Động kinh BN195 28,54 1,93 x x x

196 Lê Văn Q 4 t Nam Chậm phát triển tâm thần vận

động BN196 26,6 1,96 x x x

197 Hà Anh V 1 th Nam Cơn tím tái của trẻ sơ sinh BN197 15,6 1,94 x x x

198 Phạm Thị Kiều T 3 t Nữ Chậm phát triển tâm thần vận

động BN198 17,71 1,96 x x x

199 Hoàng Khánh V 8 th Nữ Động kinh BN199 32 1,94 x x x

200 Hồ Diên T 16 th Nữ Động kinh BN200 103,62 1,85 x x x

201 Đỗ Hải P 3 t Nam Chậm phát triển BN201 16,39 1,75 x x x

202 Trần Văn T 3 t Nam Động kinh BN202 24,99 1,93 x x x

203 Hoàng Khánh G 4 t Nam Chậm phát triển tâm thần vận

động BN203 30,73 1,98 x x x

204 Nguyễn Thị H 15 th Nữ Động kinh BN204 26,2 1,97 x x x

205 Phạm Khánh L 3 t Nữ Hội chứng cơ não BN205 39,97 1,93 x x x

206 Lê Thanh T 17 th Nam Động kinh BN206 36,39 1,97 x x x

207 Nguyễn Thanh T 3 t Nam Chậm phát triển tâm thần vận

động, gan to BN207 33,05 1,97 x x x

208 Mầu Anh T 3 th Nữ Sốt cao, co giật BN208 36,1 1,93 x x x

209 Phạm Thành T 2 t Nam Viêm não Nhật Bản BN209 25,36 1,96 x x x

85

210 Nguyễn Văn Thái B 13 th Nam Co giật BN210 22,3 1,94 x x x

211 Phạm Thu H 16 th Nữ Động kinh BN211 29,54 1,96 x x x

212 Phạm Thị Huyền T 3 t Nữ Co giật toàn thân, nhồi máu

não, nghe kém BN212 46,8 1,94 x x x

213 Nguyễn Văn Đ 18 th Nam Co giật các chi nhiều cơn trong

ngày BN213 55,9 1,85 x x x

214 Nguyễn Minh K 2 t Nam Động kinh BN214 24,3 1,75 x x x

215 Nguyễn Thanh B 4 t Nam Chậm phát triển, phát triển

trƣơng lực cơ BN215 27,62 1,69 x x x

216 Đỗ Văn Q 19 th Nam Động kinh BN216 24,6 1,72 x x x

217 Nguyễn Văn Đ 20 th Nam Liệt n a ngƣời BN217 22,29 1,84 x x x

218 Hoàng Lê Vũ L 5 th Nam Viêm phế quản BN218 19,6 1,82 x x x

219 Phạm Cao S 20 th Nam Bại não loại vận động BN219 37,8 1,91 x x x

220 Nguyễn nh D 20 th Nam Động kinh giật cơ BN220 69,03 1,93 x x x

221 Trần Gia B 8 th Nam Co giật BN221 62,9 1,98 x x x

222 Lê Phúc T 26 th Nam Chậm phát triển BN222 25,68 1,97 x x x

223 Trần Duy B 3 th Nam Suy hô hấp, phát triển trƣơng

lực cơ BN223 21,7 1,93 x x x

224 Trần Thị Thu H 4 th Nữ Co giật BN224 45,3 1,97 x x x

225 Lê Thúy T 15 th Nữ Động kinh BN225 34,3 1,97 x x x

226 Vũ Xuân P 3 th Nam Sốt cao co giật BN226 42,9 1,93 x x x

86

227 Nguyễn Đức V 3 t Nam Viêm não BN227 33,25 1,96 x x x

228 Phan Văn M 2 t Nam Tổn thƣơng não, bệnh cơ, co

giật BN228 49,8 1,94 x x x

229 Hoàng Huy H 13 th Nam Suy hô hấp cấp BN229 40,47 1,96 x x x

230 Hoàng Ngọc H 3 t Nam Nhƣợc cơ chƣa rõ nguyên nhân BN230 45,5 1,94 x x x

231 Hoàng Tuấn M 2 th Nam Các dị tật bẩm sinh BN231 23,9 1,85 x x x

232 Lê Lan A 2 th Nữ Động kinh, não phẳng BN232 38,3 1,75 x x x

233 Đỗ Thị H 14 th Nữ Động kinh BN233 37,9 1,69 x x x

234 Nguyễn Văn K 18 th Nam Bệnh RICH chất trắng BN234 34,8 1,72 x x x

235 Cao Thị Lê N 2 t Nữ Tổn thƣơng não, bệnh cơ, co

giật BN235 33,3 1,84 x x x

236 Nguyễn Minh N 17 th Nam Động kinh BN236 28,18 1,93 x x x

237 Nguyễn Ngọc Tƣờng

V 6 th Nữ Co giật BN237 25,7 1,98 x x x

238 Lý Thị Ngọc V 7 th Nữ Động kinh, chậm phát triển tinh

thần vận động BN238 36,5 1,97 x x x

239 Đồng Thị Ngọc A 3 t Nữ Động kinh BN239 18,3 1,93 x x x

240 Hoàng Đỗ Kim A 17 th Nữ Động kinh BN240 22,39 1,97 x x x

241 Giàng Anh D 4 t Nam Động kinh BN241 21,44 1,97 x x x

242 Lý Hà V 8 t Nữ Bệnh RICH BN242 17 1,93 x x x

243 Trần Quốc K 6 t Nam Bệnh RICH BN243 35,5 1,96 x x x

87

244 Nguyễn Vũ Hoàng A 3 t Nam Động kinh BN244 35,8 1,94 x x x

245 Phan Thị L 4 th Nữ Co giật BN245 42,5 1,96 x x x

246 Giáp Văn T 5 th Nam Viêm phế quản BN246 30 1,94 x x x

247 Nguyễn Tuệ L 7 th Nam Co giật BN247 27,9 1,85 x x x

248 Lê Kim Bảo N 4 th Nữ Bại não, rối loạn chuyển hóa BN248 37,5 1,75 x x x

249 Cao Thị Kim O 1 th Nữ Động kinh BN249 16,3 1,69 x x x

250 Ngô Ngọc K 3 t Nam Teo cơ BN250 33,6 1,72 x x x

251 Nguyễn Đức V 5 t Nam Chậm phát triển BN251 15,9 1,84 x x x

252 Hồ Thị X 4 t Nữ RICH BN252 15,2 1,82 x x x

253 Trần Minh T 15 th Nam Co giật BN253 15,5 1,93 x x x

254 Nguyễn Mạnh H 1 th Nam Hội chứng não, màng não, co

giật BN254 44,2 1,98 x x x

255 Lê Tất Anh K 4 t Nam Bệnh RICH BN255 24,8 1,97 x x x

256 Ngô Trƣờng T 5 th Nam Teo cơ tủy BN256 13 1,93 x x x

257 Đặng Ngọc A 1 th Nữ Não úng thủy BN257 24,1 1,97 x x x

258 Bùi Thị Thùy D 6 th Nữ Xuất huyết não BN258 33,9 1,97 x x x

259 Trần Mộc S 4 th Nam Co giật BN259 2,6 1,93 x x x

260 Ngô gia H 3 th Nam Bệnh RICH bẩm sinh BN260 16,26 1,96 x x x

261 Cao Nhật M 3 th Nam Bại não BN261 19 1,94 x x x

262 Tạ Thị T 15 th Nữ Động kinh BN262 25,9 1,96 x x x

263 Nguyễn Anh T 2 t Nữ Động kinh BN263 47,82 1,94 x x x

88

264 Trần Thị Thùy D 3 th Nữ Viêm phế quản phải BN264 34,87 1,85 x x x

265 Viên Đức T 5 th Nam Co giật BN265 25,68 1,75 x x x

266 Nguyễn Thị Hà G 3 t Nữ Chấn thƣơng sọ não BN266 32,64 1,69 x x x

267 Phạm Mai L 9 t Nữ Đau đầu BN267 31,75 1,72 x x x

268 Đoàn Trung H 5 t Nam Hội chứng thận hƣ BN268 29,63 1,84 x x x

269 Nguyễn Trọng Q 4 t Nam Vận động không tự chủ BN269 35,2 1,82 x x x

270 Vũ Diệu L 4 t Nữ Chậm phát triển tâm thần vận

động BN270 13,69 1,93 x x x

271 Mùa A S 20 th Nam Co giật BN271 45,96 1,98 x x x

272 Đặng Tuệ K 8 th Nam Viêm phổi BN272 23,94 1,97 x x x

273 Trần Văn Quốc D 13 th Nam Viêm phế quản phải BN273 26,91 1,93 x x x

274 Nguyền Thùy C 16 th Nữ Tiêu chảy kéo dài BN274 22,53 1,97 x x x

275 Thân Văn H 25 th Nam Bệnh RICH BN275 31,72 1,97 x x x

276 Hà Phạm An N 25 th Nữ Run các chi BN276 27,84 1,93 x x x

277 Vũ Diệp C 2 th Nữ Phù bào thai BN277 93,1 1,96 x x x

278 Hoàng Yến N 2 th Nữ Co giật sơ sinh, rối loạn chuyển

hóa BN278 132,2 1,94 x x x

279 Nguyễn Ngọc B 3 th Nữ Xuất huyết não, tiểu đƣờng typ

1 BN279 20,5 1,96 x x x

280 Hoàng Hữu H 8 th Nam Đái nhạt, chậm phát triển tinh

thần vận động BN280 32,5 1,94 x x x

89

281 Đinh Nho Việt H 6 th Nam Teo não BN281 40,1 1,85 x x x

282 Nguyễn Thị Thúy C 3 th Nữ Viêm phế quản BN282 37,9 1,75 x x x

283 Nguyễn Quang K 14 th Nam Rối loạn chuyển hóa BN283 71,2 1,69 x x x

284 Đinh Ngọc M 5 th Nam Rối loạn chuyển hóa BN284 16,1 1,72 x x x

285 Nguyễn Thị T 2 th Nữ Rối loạn chuyển hóa BN285 16,5 1,84 x x x

286 Triệu Thu N 8 th Nữ Động kinh, bại não BN286 31,9 1,82 x x x

287 Lăng Thị L 9 t Nữ Cơn ngừng thở chƣa rõ nguyên

nhân BN287 105,3 1,93 x x x

288 Lê Minh An P 3 t Nam Co giật chƣa phân loại BN288 47,82 1,98 x x x

289 Hoàng Anh Đ 3 th Nam Co giật BN289 34,87 1,97 x x x

290 Đỗ Quỳnh T 1 th Nữ Co giật sơ sinh BN290 25,68 1,93 x x x

291 Nguyễn Đức M 6 th Nam Co giật không đặc hiệu BN291 32,64 1,97 x x x

292 Nguyễn Anh D 16 th Nam Động kinh BN292 31,75 1,97 x x x

293 Đinh Quốc V 6 th Nam Bại não, liệt co cứng BN293 29,63 1,93 x x x

294 Lê Ứng Trang A 12 th Nữ Co giật chƣa phân loại BN294 30,47 1,96 x x x

295 Đinh Xuân N 18 th Nam Động kinh BN295 13,69 1,94 x x x

296 Chỉn Minh Q 6 t Nam Di chứng do bại liệt BN296 45,96 1,93 x x x

297 Ngô Bảo N 1 th Nữ Não úng thủy bẩm sinh BN297 47,82 1,98 x x x

298 Ngô Quang L 3 t Nam Chậm phát triển tâm thần vận

động BN298 34,87 1,97 x x x

299 Phùng Thị H 23 th Nữ Động kinh BN299 25,68 1,93 x x x

90

300 Đặng Nhật A 8 th Nam Động kinh BN300 32,64 1,97 x x x

301 Phạm Thế A 3 t Nam Động kinh BN301 31,75 1,97 x x x

302 Lê Anh V 5 t Nam Xuất huyết trong não BN302 29,63 1,93 x x x

303 Lê Đức T 2 t Nam Động kinh, bại não BN303 47,82 1,96 x x x

304 Đỗ Thái Huyền A 8 t Nữ Chậm phát triển tinh thần vận

động BN304 34,87 1,94 x x x

305 Hà Minh P 6 t Nữ Chậm phát triển tinh thần vận

động. Điếc, Ngọng BN305 25,68 1,96 x x x

306 Tản văn T 15 th Nam Động kinh, bại não BN306 32,64 1,94 x x x

307 Đặng Gia B 18 th Nam Động kinh, bại não BN307 31,75 1,85 x x x

308 Hà Văn H 2 t Nam Yếu tứ chi, chƣa rõ nguyên

nhân BN308 29,63 1,75 x x x

309 Nguyễn Đại D 5 th Nam Rối loạn chuyển hóa BN309 30,47 1,69 x x x

310 Lê Kim L 2 th Nữ Viêm phế quản BN310 13,69 1,72 x x x

311 Trịnh Hồng T 3 th Nam Động kinh theo dõi bệnh ty thể BN311 45,96 1,84 x x x

312 Lê Tài Đ 2 t Nam Động kinh, theo dõi rối loạn

chuyển hóa BN312 45,2 1,82 x x x