CHẨN ĐOÁN XOẮN KHUẨN

GÂY BỆNH

MỤC TIÊU

1. Giới thiệu sơ đồ chẩn đoán xoắn khuẩn

leptospira.

2. Nguyên lý, cách làm, đọc kết quả, tên và ứng

dụng thực tế phản ứng huyết thanh chẩn đoán

xoắn khuẩn leptospira.

3. Nắm đƣợc kỹ thuật nhuộm và xác định hình

thể lepto khi nhuộm bằng phƣơng pháp violet

de gentian.

2

BỆNH PHẨM

• Máu: 3-5ml bn đang sốt tuần 1

• DNT: 3ml tuần 1

• Nƣớc tiểu: tuần 2

• Chuột cống

• Chuột lang.

3

NUÔI CẤY PHÂN LẬP

• Máu, DNT, nƣớc tiểu

– 2,5 – 3ml màng bụng chuột lang (200 -250g)

– 0,5mlMT Terskich x2: huyết thanh thỏ tƣơi

• N/c dịch tễ học: máu

– Đv lớn -máu pƣ huyết thanh

• (+) hiệu giá ≥1:1600: nƣớc tiểu chuột lang

– Đv nhỏ:

• Máu tim pƣ huyết thanh

• Thận cắt nhỏ:

MT Terskich 28-30ᴼC

nghiền cối vô trùng NMSL ly tâm nhẹ 3ml màng bụng chuột lang

4

• Theo dõi chuột hàng ngày:

– NĐ>39ᴼC: máuMT Terskich (0,5ml) 28-30ᴼC

10 ngày: 1 giọt MT Soi tƣơi KHV tụ quang

nền đen XK pƣ huyết thanh với KHT mẫu.

• Theo dõi chuột lang / 2 tuần: máu pƣ huyết

thanh chủng Leptospira mẫu ngƣng kết HG

≥ 1:800 mổ thận, nƣớc tiểuMT

Terskich chuột lang khác.

• Ống Terskich (BP) tiêu bản giọt ép soi

tƣơi/KHV tụ quang nền đen. Sau 2 tháng

không thấy bỏ.

5

• SOI TƢƠI XOẮN KHUẨN TRÊN KHV TỤ

QUANG NỀN ĐEN:

– Phiến kính sạch, mỏng, không vết xƣớc

– 1 giọt MT Terskich XK tiêu bản giọt ép soi tƣơi

• XK di động mạnh

• Không thấy vòng XK

• Hình lƣợn những điểm sáng lấp lánh 6-9 um

• 2 đầu cong nhƣ cái móc chữ C hay S.

6

• Phản ứng huyết thanh: phản ứng ngƣng kết của

Martin và Pettit:

- KHV nền đen

- KT ít: XK kết cụm hình sao NK sao

- KT nhiều: XK tan, đứt từng mảnh ngƣng kết

tan.

7

1 giọtchủngXK/MT Terskich

1 giọtkhánghuyếtthanh

Máu Dịch não tủy Nước tiểuBệnh phẩmLy tâm

MôitrườngTERSKICH

Phản ứng Martin-Pettit

Chuột cống

Cạo sạch vùnglông gây sướtda, ngâm vàonguồn nước60’

Điều tra dịch tễ

Nghiền gan, thận, lách

Soi di động KHV nền đen

Chuột còn non

8

XOẮN KHUẨN GIANG MAI

• Chẩn đoán chủ yếu là soi tƣơi và chẩn đoán

huyết thanh STS (Serologic test for syphilis)

9

BỆNH PHẨM

• Vết loét:

– BPSD: rửa NMSL/cồn khô kim nạo nhẹ bờ

vết loét nặn dịch rỉ lấy dịch.

• Hạch:

– Hạch sƣng to gần vết loét: khử trùng hạch và

vùng lân cận kim chọc hạch ngoáy bơm vài

giọt NMSL rút dịch XN

• Máu: vết loét đã lành, 3ml.

10

CHẨN ĐOÁN VI SINH

XOẮN KHUẨN GIANG MAI• Xem trực tiếp:

– XK 2 đầu thẳng nhọn

– Chuyển động xoắn ốc, đu đƣa, làn sóng.

• Nhuộm phƣơng pháp Fontana-Tribondeau,

mực tàu

• Nhuộm phƣơng pháp violet de gentian:

• Huyết thanh chẩn đoán bệnh GM

11

Huyết thanh chẩn đoán bệnh GM

• Phản ứng không đặc hiệu:

– Phát hiện reagin /máu bn

– Phản ứng lên bông –V.D.R.L

– Phản ứng KHBT

• Phản ứng bán đặc hiệu

– KN: T.reiter không gây bệnh pƣ KHBT

• Phản ứng đặc hiệu

– Pƣ KT huỳnh quang

– Pƣ bất động XK

12

NHUỘM NHA BÀO

THUỐC NHUỘM

• Dung dịch A:

– Malachite green 5g 5%

– DW 100ml 5%

• Dung dịch B:

– Saframine 0,5g 0,5%

– DW 100ml 0,5%

13

• Phết bản VK để khô bằng lửa.

• Phủ dung dịch A hơ nóng bằng hơi nƣớc (5-

10’) để nguội

• Rửa

• Phủ dung dịch B 30’’ – 1’ – Saframine

• Rửa nƣớc – thấm khô – xem vật kính dầu

14

Nhuộm vỏ nhầy (Capsule)

Phương pháp nhuộm âm bản• Vật liệu, hoá chất:

– Mực tàu

– Metanol

– Dung dịch safranin 0,5%

• Các bước tiến hành:– VK hoà vào giọt nƣớc phiến kính.

– Nhỏ thêm 1 giọt mực tàu, trộn đều. Dùng cạnh lamen dàn mỏng vết bôi, làm khô trong không khí.

– Cố định vết bôi nhỏ metanol lên vết bôi, giữ trong 1 phút.

– Thêm dần dần dung dịch Safranin 0,5% lên vết bôi để rửa metanol, sau đó giữ trong 30 giây để nhuộm lại, rửa nƣớc, thấm khô.

– Soi kính: dùng vật kính dầu 100×.

• Kết quả:– Nền vi trƣờng màu đen, tế bào màu đỏ, vỏ nhầy màu hồng.

15

CÁCH PHA LOÃNG HUYẾT THANH

• Chuẩn bị dụng cụ:– Sesingue loại 5ml– Kim số 14, 16– Ống nghiệm Đảm bảo vô trùng.– Bông cồn– Kẹp– Dây garo– Đèn cồn– Cốc nước lạnh– Khay

16

• Cách lấy máu:– Vô trùng tuyệt đối– Bn nằm– Garo cánh tay vùng trên khuỷu chỗ lấy máu– Sát trùng– Dùng kim lấy 2-3ml máu TM– Tháo dây garo– Bỏ kim vào cốc nước lạnh.– Bơm máu vào ON (sát thành ống tránh bọt)– ON nghiêng 450

đông tủ ủ 370C/30’ lóc chân cục máu đông ống thế đứng tủ lạnh 40 sau 10-12 giờ.

– Pipett vô trùng rút HT vàng.– HT bảo quản 40C/ lâu hơn -> dd merthiolate Na 1:10000 ->

đông băng.

17

CÁCH PHA LOÃNG HUYẾT THANH(tt)

• Lưu ý:

– Chiết xuất HT, tránh vỡ HC

– Cần lấy máu đúng thời gian bệnh

18

CÁCH PHA LOÃNG HUYẾT THANH(tt)

• Pha HT 1:5 - 1 phần HT + 4 phần NMSL

• 0,5ml NMSL 5 ON

19

CÁCH PHA LOÃNG HUYẾT THANH(tt)

Thànhphần

Độ loãng huyết thanh

ON 11:10

ON 21:20

ON 31:40

ON 41:80

ON 51:160

NMSL (ml)

0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

HT 1:5 (ml)

0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Độ loãng cuối cùng

1:10 1:20 1:40 1:80 1:160

CÁM ƠN!

20

NHUỘM XOẮN KHUẨN LEPTOSPIRA THEO

PHƢƠNG PHÁP VIOLET DE GENTIAN.• Thuốc nhuộm:

-Dd A: Mercurochrome : 2g

Nƣớc cất : 100ml

-Dd B: Violet de gentian : 1g

Nƣớc cất : 100ml

• Cách làm:– Tiêu bản để khô tự nhiên.

– Nhỏ dd A, hơ nóng vừa bốc hơi 5’ thì ngƣng.

– Rửa nƣớc, vẩy khô

– Nhỏ dd B, hơ nóng vừa bốc hơi 5’ thì ngƣng.

– Rửa nƣớc, vẩy rẩy.

– Thấm khô, xem vật kính dầu.

• KQ:– XK màu tím

– 2 đầu cong nhƣ móc. 21

KỸ THUẬT LÀM PHẢN ỨNG

V.D.R.L

• 3 ml máu bn chiết xuất HT hâm 56ᴼC/30’.

• Pipette Pasteur 0,05 ml HT phiến kính

1 giọt KN xấp xỉ 1/60 ml.

• Lắc ở máy lắc 180 vòng/phút x 4’ (MT ẩm).

• Đọc kết quả KHV (VK 10x):

(+):kết cụm – đám/nƣớc trong

Pha loãng HT 1:2, 1:4, 1:6, 1:8

Mỗi độ pha loãng + 1 giọt KN lắc (ấm)

Đọc KQ hiệu giá KT.

22

• Phản ứng không đặc hiệu:

– KN: cardiolipin - lipid từ tim bê – diphosphatidyl

glycerol + leucithin + cholesterol phát hiện

reagin /máu bn

– Phản ứng lên bông – Flocculation test: pƣ kết tủa

(Precipitation reaction) VDRL

– Phản ứng KHBT (complement fixation test)

2 pƣ thuộc 2 nguyên lý khác nhau và nhiều lần.

23

• Phản ứng đặc hiệu:

– Pƣ KT huỳnh quang

• KN –XK chết + HT bn +gamma globulin gắn chất

huỳnh quang.

– Pƣ bất động XK (Treponema pallidum

Immobilization - TPI) trƣớc khi bn dùng PNC

• KN – XK sống + HT bn mất di động XK.

24