NIP6;1agscij.agr.ku.ac.th/phocadownload/2560-48-2/ASJ-48-2-174...>>¼¯Çµ $ ·· · ®¿ NI61 ษ¼ล 174 i i 2017 Vo 48 (2 การจ าแนก และร ปแบบการแสดงออกของย

การแสดงออกของยน NIP6;1 ในปาลมน�ามนชนดเทอเนรา>>

174 Agricultural Sci. J. 2017 Vol. 48 (2)

การจ�าแนก และรปแบบการแสดงออกของยน NIP6;1 (Boric Acid Channel for Preferential Transport of Boron) ในปาลมน�ามนชนดเทอเนรา

Identification and Functional Expression Pattern of NIP6;1, a BoricAcid Channel for Preferential Transport of Boron in Ternera Oil Palm

อญชนา รอดรงนก1,2 กนกวรรณ เทยงธรรม3 และ สนธชย จนทรเปรม1,2,3,*

Aunchana Rodrungnok1,2, Kanokwan Teingtham3 and Sontichai Chanprame1,2,3,*

1 ศนยเทคโนโลยชวภาพเกษตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตก�าแพงแสน นครปฐม 731402 ศนยความเปนเลศดานเทคโนโลยชวภาพเกษตร ส�านกพฒนาบณฑตศกษาและวจยดานวทยาศาสตรและเทคโนโลย ส�านกงานคณะกรรมการ

การอดมศกษา กรงเทพฯ 109003 ภาควชาพชไรนา คณะเกษตร ก�าแพงแสน มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตก�าแพงแสน นครปฐม 731401 Center for Agricultural Biotechnology, Kasetsart University, Kamphaeng Saen Campus, Nakhon Pathom 73140, Thailand 2 Center of Excellence on Agricultural Biotechnology (AG–BIO/PERDO–CHE), Bangkok 10900, Thailand3 Department of Agronomy, Faculty of Agriculture at Kamphaeng Saen, Kasetsart University Kamphaeng Saen Campus,

Nakhon Pathom 73140, Thailand รบเรอง: กรกฎาคม 2559 Received: July 2016 รบตพมพ: สงหาคม 2559 Accepted: August 2016* Corresponding author: [email protected]

ABSTRACT: Boron (B) is an essential micronutrient required for plant growth and development which affects not only yield but also the quality of crop. Boron deficiency is major agricultural problems worldwide and frequently observed because boric acid in soil is easily leached under high rainfall condition as found in oil palm (Elaeis guineensis Jacq.) plantation. Recent reports suggest that boron can be retranslocated from old tissues to young tissues or can be preferentially transported to sink tissues under boron deficiency. The objectives of this study were to clone full length of EgNIP6;1 gene and study the expression pattern of EgNIP6;1 gene in oil palm during boron deficiency boron sufficiency and toxicity treatment using real–time PCR technique. In this study we cloned an NIP6;1–like gene (named as EgNIP6;1) from Tenera oil palm. The full length of EgNIP6;1 was 858 bp and encoded a protein of 285 amino acid residues. The phylogenetic tree analysis indicated that EgNIP6;1 protein belonged to NIPs subgroup II. Sequence analysis showed the EgNIP6;1 was highly conserved with NIP in other plant species such as date palm, cotton, Arabidopsis, and soybean. For the expression pattern analysis, root and leaves samples were collected randomly at 7, 14, 28 and 56 days after boron deficiency, boron sufficiency and boron toxicity treatment. The result showed the EgNIP6;1 expression level in leaves was induced and increased at 7 and 28 days after boron deficiency treatment as compared with that 0 day (control) and mainly expressed in leave as compared with root.

Keywords: Channel for preferential transport of boron, NIP6;1, quantitative real time PCR, oil palm

Agricultural Sci. J. (2017) Vol. 48(2): 174–185 ว. วทย. กษ. (2560) 48(2): 174–185

ส.วก.ท.

175วารสารวทยาศาสตรเกษตร ปท 48 ฉบบท 2 พฤษภาคม - สงหาคม 2560

บทคดยอ

โบรอนเปนธาตอาหารรองทมความส�าคญตอการเจรญเตบโตและพฒนาของพช โดยสงผลทงตอปรมาณและคณภาพของผลผลตของพช ปญหาการขาดธาตโบรอนพบไดในทกประเทศทวโลก เนองจากโบรอนในดนสวนใหญอยในรปของกรดบอรกทสามารถละลาย น�าได จงถกชะลางไดงายโดยเฉพาะในพนทเพาะปลกทมฝนตกชก เชนเดยวกบพนททใชปลกปาลมน�ามน จากการศกษาเมอไมนานมาน พบวา โบรอนสามารถเคลอนยายจากเนอเยอแกไปยงเนอเยอทก�าลงพฒนาผานทางทอล�าเลยงอาหารภายใตสภาวะขาดโบรอน การศกษาในครงนจงมวตถประสงคเพอจ�าแนก full length ของยน NIP6;1 ในปาลมน�ามนชนดเทอเนรา รวมถงศกษารปแบบการแสดงออกของยน NIP6;1 ในปาลมน�ามนทไดรบสภาวะขาดโบรอน โบรอนเพยงพอ และโบรอนเปนพษดวยเทคนค real–time PCR จากการศกษาสามารถจ�าแนก full–length ของยน NIP6;1 ในปาลมน�ามนภายใต สภาวะขาดโบรอนได เป นยนทมขนาด 858 นวคลโอไทด และแปลรหสพนธกรรมไดเปนโปรตนทประกอบดวย 285 กรดอะมโน และเมอวเคราะหหาคาความเหมอนของล�าดบกรดอะมโน พบวา มคาความเหมอนกบยน NIP6;1 ทรายงานในพชหลายชนด ไดแก อนทผลม ฝาย Arabidopsis และถวเหลอง และจากการวเคราะห phylogenetic tree พบวา โปรตน EgNIP6;1 จดอยในกลม NIPs subgroup II เมอศกษารปแบบการแสดงออกของยน EgNIP6;1 จากตวอยาง cDNA ทสงเคราะหไดจากรากและใบปาลมน�ามนทไดรบสภาวะขาดโบรอน โบรอนเพยงพอ และโบรอนเปนพษเปนเวลา 7 14 28 และ 56 วน ดวยเทคนค real–time PCR พบวายน EgNIP6;1 มระดบการแสดงออกในใบสงกวาราก โดยมการแสดงออกสงขนท 7 วนและสงสด 28 วนหลงไดรบสภาวะขาดโบรอนเมอเปรยบเทยบกบวนท 0

ค�าส�าคญ: ระบบขนสงโบรอน, NIP6;1, ปรมาณ PCR, น�ามนปาลม

บทน�า

โบรอน (boron, B) ในสารละลายดนตามธรรมชาตสวนใหญจะอยในรปของกรดบอรก (boric acid, H

3BO

3) เปนสารทมโมเลกลขนาดเลก มขนาด

โมเลกลเทากบ 2.573 Å เปนโมเลกลไมมประจ เชนเดยวกบยเรย เปนกรดออน มคา pK

a เทากบ 9.24

โบรอนเปนธาตอาหารทจ�าเปนตอการเจรญเตบโตของพช diatom cyanobacteria และสาหรายทะเล (Loomis and Dust, 1992) นอกจากนยงจ�าเปนตอการเจรญเตบโตของสตว เชน zebrafish (Danio rerio) และ trout (Oncorhynchus mykiss) (Rowe and Eckhert, 1999)

ใ นพ ช โบรอนมความส�าคญ เน อ งจาก โบรอนจ ะ ท� า ปฏก ร ยาร วม กบโม เ ล ก ลของ rhamnogalcturonan–II (RG–II) เพอสรางโมเลกล ในรปแบบ cross–link ไดสารทเปนองคประกอบส�าคญของสารประกอบ pectin polysaccharide ในผนงเซลล (cell wall) โมเลกลของ RG–II มความส�าคญอยางยง ตอความแขงแรงของโครงขายสารประกอบเพกตน ในผนงเซลล (O’Neill et al., 2004)

อาการขาดโบรอนในพชจะปรากฏชดเจนในบรเวณทก�าลงมการเจรญเตบโต เชน ใบออน บรเวณรากทก�าลงยดตว ผล และเมลด การเจรญของสวน ตาง ๆ ดงกลาวจะหยดชะงกลงหรอถกยบยงเมอพชขาดโบรอน (Shorrocks, 1997) อาการขาดโบรอนเหลานจงอาจท�าใหสรปไดวาโบรอนในพชไมสามารถเคลอนยายในทอล�าเลยงอาหาร (phloem) แตจากการศกษาเมอไมนานมานพบวา มการเคลอนยายโบรอนในพชจากเนอเยอแก (old tissue) ไปยงเนอเยอทก�าลงพฒนา (young tissue or sink tissue) หรออาจเรยกไดวาเปนการ retranslocate ของโบรอนในพช Brown and Shelp (1997) รายงานวา พชทสามารถเคลอนยายโบรอนผานทางทอล�าเลยงอาหารได นนเป นพช ทสามารถผลตน�าตาลแอลกอฮอล (sugar alcohol) ไดแก น�าตาล manitol และ sorbitol เนองจากน�าตาล



แอลกอฮอลมสวนประกอบของหม cis-hydroxyl ภายในโมเลกลเปนสวนทสามารถจบกบโบรอนและสรางเปนสารประกอบ poly–boron complex ในรปทสามารถเคลอนยายไดผานทางทอล�าเลยงอาหารในพช นอกจากนยงมรายงานการเคลอนทของโบรอนในพชผานทางทอล�าเลยงอาหารในพชทไมสามารถผลตน�าตาลแอลกอฮอลได โดยเปนการตอบสนองชวงสนในสภาวะทพชขาดโบรอน พบใน white lupin (Lupinus albus) (Huang et al . , 2008) อะราบด อบซส (Arabidopsis thaliana) (Noguchi et al., 2000) บรอคโคล (Brassica oleracea) และ lupin (Shelp et al., 1998) คาโนลา (Brassica napus) (Stangoulis et al., 2001) และทานตะวน (Helianthus annuus) (Matoh and Ochiai, 2005)

ปจจบนเปนททราบกนแลววา กระบวนการเคลอนยายโบรอนในพชสามารถแบงออกไดเปน 3 รปแบบ ไดแก (1) passive diffusion across lipid bilayer (2) channel mediated boron transport by transporter (ยน NIPs) และ (3) active boron transport (ยน BORs) โดยยนทควบคมกระบวนการเคลอนยายโบรอนในพชคอ NIP5;1 และ BOR1 และจดเปนยนประเภท transporter (Miwa et al., 2010) ยน NIP5;1 และ BOR1 ทจ�าแนกไดจาก Arabidopsis thal iana เป นยนท ม ความส� าคญในการเพ มประสทธภาพของการเคลอนยายโบรอนผานเยอหมเซลลของพช (Takano et al., 2002, 2006) โดย AtBOR1 มการแสดงออกทงในสวนยอดและราก โดยมบทบาทในการเพมประสทธภาพในการเคลอนยายโบรอนในสวนของ xylem เรยกวา xylem loading ซงเปนขนตอนส�าคญทเพมการสะสมโบรอนในสวนยอดของพชในสภาวะทมโบรอนจ�ากด (Takano et al., 2008) ส�าหรบ AtNIP5;1 เปนโปรตนทพบในเยอหมเซลล มการแสดงออกในสวนรากมากกวาสวนยอด มผลในการควบคมกระบวนการดดซมโบรอนจากรากโดยมบทบาทเปน channel (Takano et al., 2008)ในป 2004 Wallace และ Roberts ไดรายงานการคน

พบยน AtNIP6;1 ใน A. thaliana เปนยนทม homology กบ AtNIP5;1 ยนทงสองชนดจดอยในกลมของ major intrinsic protein (MIPs) ชนดหนงในกล มของ nodulin–26–like intrinsic protein (NIPs) subgroup II จากการศกษาของ Tanaka et al. (2008) รายงานวา AtNIP6;1 เปนยนทเกยวของกบกระบวนการเคลอนยายโบรอนในพช โดยท�าหนาทเปนชองทาง (channel) แสดงออกในเนอเยอสวนยอดทก�าลงพฒนา AtNIP6;1 มบทบาทส�าคญในการเพมประสทธภาพการเคลอนยายกรดบอรกผ านเยอห มเซลล จดเป น plasma membrane protein มการแสดงออกสงสดในสวนขอของล�าตนเนองจากเปนบรเวณทมการเคลอนยายสารระหวางทอล�าเลยงน�าและอาหารในพช และรองลงมาคอบรเวณสวนยอด ดงนนการวจยในครงน จงมวตถประสงคเพอจ�าแนก full length ของยน NIP6;1 ในปาลมน�ามนชนดเทอเนรา และศกษารปแบบการแสดงออกของยนดงกลาวเมอกลาปาลมน�ามนไดรบสภาวะขาดโบรอน โบรอนเพยงพอ และโบรอนเปนพษ โดยใชเทคนค real–time PCR การศกษาเพอเขาใจถงกระบวนการเคลอนยายโบรอนจากเนอเยอแกไปยงเนอเยอทก�าลงเจรญเตบโตในปาลมน�ามน มความส�าคญตอการพฒนาระบบการจดการการเพาะปลกปาลมน�ามนไดในอนาคต

อปกรณ และวธการพชทดลอง

ปลกตนกลาปาลมน�ามนชนดเทอเนราอาย 6 เดอน จ�านวน 12 ตน ทไดจากการเพาะเลยงเนอเยอพช ในสภาพโรงเรอน โดยปลกในกระถางทม vermiculite พรอมทงใหสารละลาย complete nutrient solution (CNS) (Pinho et al., 2010) ทมธาตอาหารครบถวนเปนเวลา 1 เดอนเพอใหตนกลาปรบตว โดยเปลยนสารละลายใหมทก 3 วน จากนนแบงตนกลาปาลมน�ามนออกเปน 4 ตนตอการทดลอง ดงน ไดรบสภาวะขาดโบรอน ไดรบสภาวะโบรอนเพยงพอ และไดรบสภาวะโบรอนเปนพษ โดยใหสารละลาย CNS ท

ส.วก.ท.


มโบรอน 0, 1.0 และ 10.0 มลลกรมตอลตรตามล�าดบ เกบตวอยางใบออนและปลายรากท 0, 7, 14, 28 และ 56 วนหลงการไดรบโบรอนทง 3 ระดบ

การสกดอารเอนเอ และสงเคราะห first–strand cDNA

น�าตวอยางใบออนและรากมาสกดอารเอนเอตามวธการของ Laksana and Chanprame (2015) ตรวจสอบคณภาพและปรมาณของอารเอนเอทไดดวยการท�า electrophoresis บนอะกาโลสเจลเขมขน 1.2 เปอรเซนต และเครอง nanodrop spectrophotometer 8000 (Eppendrof) จากนนก�าจดดเอนเอดวยเอนไซม DNase I (Promega, USA) โดยน�าตวอยางอารเอนเอบมรวมกบเอนไซมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส นาน 30 นาท น�ามาใชเปนตนแบบในการสงเคราะห first–strand cDNA ดวยไพรเมอร oligo dT (20–mer) รวมก บ Reve r t A i d Reve r s e Tr an s c r i p t a s e (ThemoScientific, USA) และปรบความเขมขนเทากบ 300 นาโนกรมตอไมโครลตร

การโคลนยน NIP6;1 จากปาลมน�ามนออกแบบไพรเมอรส�าหรบสงเคราะห full–

length ของยน NIP6;1 ในปาลมน�ามนโดยอาศยหลกการ alignment เพอหาสวนของล�าดบนวคลโอไทดอนรกษ โดยเลอกใชยนในฐานขอมล GenBank database (www.ncbi.nlm.nih.gov) เปนตนแบบ

สงเคราะห fullvlength ของยน NIP6;1 โดยใช first–strand cDNA ของปาลมน�ามนเปนตนแบบดวยเทคนคพซอารรวมกบเอนไซม Platinum Taq DNA polymerase (Invitrogen, USA) และไพรเมอร FullEgNIP6;1F 5´-ATGCCGGAGACGGAGACCG–3´ และ FullEgNIP6;1R 5´–CTAGCGGCGG AAGCTTCGG-3´ ในเครองเพมปรมาณดเอนเอ (Biometra T1 Thermal Cycler) ก�าหนดปฏกยาดงน initial denaturation ทอณหภม 94 องศาเซลเซยส นาน 2 นาท ตามดวย denaturation ทอณหภม 94 องศาเซลเซยส นาน

30 วนาท primer annealing ทอณหภม 56 องศาเซลเซยส นาน 30 วนาท และ primer extension ทอณหภม 72 องศาเซลเซยส นาน 2 นาท จ�านวน 35 รอบ และ f inal extension ทอณหภม 72 องศาเซลเซยส นาน 10 นาท ตรวจสอบผลผลตทได โดยการท�า electrophoresis ในอะกาโรสเจลเขมขน 1.0 เปอรเซนต สกดชนดเอนเอทไดจากเจลโดยใช PCR cleanup and gel extraction kit (Nucleospin® Extract II) จากนนโคลนเขาส pGEM–T® easy vector (Promega, USA) และถายเขาสคอมพลเทนตเซลลแบคทเรย Escherichia coli (E. coli) สายพนธ DH5α โดยเทคนค heat shock เพอเพมปรมาณ และสงไปหาล�าดบนวคลโอไทด โดยบรษท 1st base laboratory ประเทศมาเลเซย

การวเคราะหข อมลล�าดบนวคล โอไทด และ bioinformatics

น�าล�าดบนวคลโอไทดของ full–length ของยน NIP6;1 ทไดจากปาลมน�ามน แปลรหสพนธกรรมเปนล�าดบกรดอะมโนดวยโปรแกรม MEGA6 จากนนจงวเคราะห multiple sequence alignment ดวยโปรแกรม BLAST ในฐานขอมล GenBank (www.blast .ncbi.nlm.nih.gov) และ ClustalW2 (www.ebi.ac.uk) สราง phylogenetic tree ดวยโปรแกรม MEGA6 โดยวธ neighbor-joining (bootstrap value 1,000 replicate) และวเคราะห hydrophobic plot ดวยโปรแกรม TMpred (www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)

การศกษารปแบบการแสดงออกของยน NIP6;1 ในปาลมน�ามนดวยเทคนค real-time PCR

ออกแบบไพรเมอรทจ�าเพาะตอการสงเคราะหสายดเอนเอส�าหรบยน NIP6;1 ในปาลมน�ามน ดวยโปรแกรม primer3 (http;//simgene.com/Primer3) ดงน RTNIP6;1F: 5´–CATACATAGCTGCCCAAGTC-3´และ RTNIP6;1R: 5´-CGAACAAGAGATTGAAGGTG–3´



และ Actin ทใชส�าหรบเปนยนอางอง (reference gene) ดงน RTActinF: 5´AGGGAACATGGTTGATCCTC–3´ และ RTActinR: 5´–TTGGTGCAGAGAGATTCAGG–3´ สายดเอนเอทสงเคราะหไดมขนาด 152 และ 150 ค เบสตามล�าดบศกษาระดบการแสดงออกของ ยน NIP6;1 ในใบและรากปาลมน�ามนทไดรบสภาวะขาดโบรอน โบรอนเพยงพอ และโบรอนเปนพษเปนเวลา 0, 7, 14, 28 และ 56 วน จ�านวน 3 ซ�า ดวยเทคนค real–time PCR ใช cDNA ปรมาณ 300 นาโนกรม เปนตนแบบ รวมกบ SensiFast SYBR No–Rox kit (BioLines, USA) ท�าปฏกรยา real–time PCR ดวยเครองเพมปรมาณดเอนเอ Masterclcler® ep realplex4 (Eppendrof, USA) ก�าหนดปฏกรยาดงน initial denaturation ทอณหภม 95 องศาเซลเซยส นาน 2 นาท ตามดวย denaturation ทอณหภม 95 องศาเซลเซยส นาน 15 วนาท primer annealing ทอณหภม 56 องศาเซลเซยส นาน 15 วนาท และ primer extension ทอณหภม 72 องศาเซลเซยส นาน 20 วนาท จ�านวน 45 รอบ โดยระดบการแสดงออกของยนเปรยบเทยบกบตวอยางท 0 วน (control) และมจ�านวน technical replication จ�านวน 3 ซ�า

ผลการทดลอง และวจารณ

การโคลนยน NIP6;1 จากปาลมน�ามน วเคราะหขอมลล�าดบนวคลโอไทด และ bioinformatics

จากการท�าปฏกรยาพซอารโดยใชไพรเมอรทออกแบบมาใหจ�าเพาะกบปลายดาน 5´ และ 3´ ของยน NIP6;1 โดยใช cDNA ของปาลมน�ามนเปนแมแบบ สามารถจ�าแนก full–length ของยน NIP6;1 และตงชอวา EgNIP6;1 ประกอบดวยนวคลโอไทดขนาดเทากบ 858 คเบส (Figure 1) โดยมปลาย 5´ และ 3´ เปนล�าดบ นวคลโอไทดของ start และ stop codon ตามล�าดบ และแปลรหสพนธกรรมเปนโปรตนทประกอบดวย กรดอะมโน 285 กรดอะมโน (Figure 2) จากนนวเคราะห membrane spanning region ดวยโปรแกรม TMpred พบวาล�าดบกรดอะมโนทแปลงมาจากยน EgNIP6;1 มส วนประกอบของ transmembrane domain จ�านวน 6 domain โดยเชอมตอกนดวย loop A–E และม NPAs (Asn–Pro-Ala) boxes จ�านวน 2 box (Figure 3)

Figure 1 Nucleotide sequence of a full–length NIP6;1 synthesized from first–strand cDNA of tenera oil palm (Elaeis guineensis Jacq.)

ATGGGCGAAGACGGCGCCTCTGCACTGGAAAACCCCGGAGTTCCACTCCTTGGAGGGCACAAGTCCAGTCGGTTCGCCGATAGGTGGCGTTCACTACTTGGCCGCGGCAATTGCTTCGCAGTTAAGCCTTGGACCATCGACGACGATGGCCCAAGCATCCCAGCTTCCGGTTCCCTTGTAAGAAAGGTGGGGGCTGAGTTCATTGGCACTTTCATGCTAGTGTTCGCCAGCACGGCTGCGGCAATTATCGATCAGCAGTCCAACGGTGCCGTCACCTTATTAGGCCTAGCAGCCTGTTCCGGCATCGCCGCCATGATCATCATCCTCTCGACCGGCCACATCTCCGGTGCTCACCTCAATCCATCTGTCACTATTGCCTTTGCCACCTTCAAACACTTCTCTTGGGAGAAGGTACTGGTATACATCGCTGCACAATTGTCGGCATCACTATGCGCGGCATTTGCATTGAAGGCAATCTTTTATCCGATTTTGGGAGAAGGTGTAACGGTGCCAAGTGGTAGTGCGGGTGCGGCGTTTGTAATGGAGTTTATTATTGGATTCAATCTCATGTTTGTCACCACGGCAGTTGCCACTGATGTTAGAGCAGTTGGGGAGCTGGCTGGGATCACGGTAGGAGCAACTGTGGCAATGAACAACATCATTGCTGGGAGGATTAGCGGGGCATCTATGAATCCAGCGAGGACGCTGGGCCCGGCGGTGGCGGCAAACAACTACAAGGCCATATGGGTATACTTCACGGCACCAATCCT

ส.วก.ท.


MGEDGASALENPGVPLLGGHKSSRFADRWRSLLGRGNCFAVKPWTIDDDGPSIPASGSLVRKVGAEFIGTFMLVFASTAAAIIDQQSNGAVTLLGLAACSGIAAMIIILSTGHISGAHLNPSVTIAFATFKHFSWEKVLVYIAAQLSASLCAAFALKAIFYPILGEGVTVPSGSAGAAFVMEFIIGFNLMFVTTAVATDVRAVGELAGITVGATVAMNNIIAGRISGASMNPARTLGPAVAANNYKAIWVYFTAPILGTLTGAGAYTAVKLTEDDGTPTMRSFRR

Figure 2 The deuced amino acid sequence of EgNIP6;1 of tenera oil palm (Elaeis guineensis Jacq.)

Figure 3 The hydrophobicity plot of EgNIP6;1 amino acid sequence of tenera oil palm (Elaeis guineensis Jacq.) analyzed by TMpred program. The x–axis represents the amino acid 1–285 residues. The areas above the x–axis indicate the hydrophobic amino acid residues. The protein composes of 6 hydrophobic domains and 2 NPAs (Asn–Pro–Ala) boxes

เมอน�าล�าดบกรดอะมโนของยน EgNIP6;1 มาวเคราะห multiple sequence alignment ดวยโปรแกรม ClustalW2 พบวา ล�าดบกรดอะมโนทถอดรหสพนธกรรมจากยน EgNIP6;1 มความเหมอนกบยน

NIP6;1 ทรายงานในพชหลายชนด ไดแก GaNIP6;1 (Gossypium arboretum) (KHG25640.1), PtNIP6;1 (Populus trichocarpal) (XP002297797.2) AtNIP6;1 (Arabidopsis thaliana) (NP178191.1) and GsNIP6;1



(Glycine soja) (KHN22407.1) มคาความเหมอนเทากบ 66%, 63%, 60% และ 60% ตามล�าดบ นอกจากนยงประกอบดวยบรเวณทเรยกวา NPAs เชนเดยวกบทพบในยน NIP6;1 ของ Arabidopsis (AtNIP6;1) (Figure 4)

Figure 4 Multiple amino acid sequence alignment analysis of EgNIP6;1 protein using ClustalW2 with NIPs proteins reported in certain plant species such as GaNIP6;1 (Gossypium arboretum) (KHG25640.1) (KHG25640.1) PtNIP6;1 (Populus trichocarpal) (XP002297797.2) AtNIP6;1 (Arabidopsis thaliana) (NP178191.1) and GsNIP6;1 (Glycine soja) (KHN22407.1). NPAs indicate the Asn–Pro–Ala boxes

ส.วก.ท.


เมอวเคราะหหาคาความสมพนธเชงววฒนาการรวมกบยน NIPs ทรายงานในพชชนดตาง ๆ และสรางเปน phylogenetic tree แสดงใหเหนวา โปรตน EgNIP6;1 จดอยในกลม NIPs subgroup II ซงจดอยในกลมเดยวกบโปรตนจากพชทพบในพชหลายชนด

เชน AtNIP5;1 (Q9SV84) OsNIP3;1 (Q01WF3) ZmNIP3;1 (Q9ATN1) CiNIP5;1 (AFN37617.1) OsN I P3 ; 3 ( XP01564959 . 1 ) OsN I P3 ; 2 (XP01564938.1) AtNIP7;1 (NP566271.1) และ AtNIP6;1 (NP178191.1) (Figure 5)

Figure 5 Phylogenetic tree among different species that was constructed based on deduced amino acid sequences by neighbor–joining method with 1,000 bootstrap replication using MEGA6 program

การศกษารปแบบการแสดงออกของยน NIP6;1 ในปาลมน�ามนดวยเทคนค real−time PCR การศกษาแสดงออกของยน EgNIP6;1 โดยใชเทคนค real–time PCR ในใบและรากของปาลมน�ามนทไดรบสภาวะการขาดโบรอน โบรอนเพยงพอ และ

โบรอนเปนพษ พบวา ระดบการแสดงออกของยน EgNIP6;1 ในใบมคาสงกวาราก โดยในใบมคาการแสดงออกของยนสงสดท 28 วนหลงไดรบสภาวะขาดโบรอน มคาเทากบ 72.4 คดเปน 19 เทาของคาการแสดงออกของยนในรากทมคาเทากบ 3.69 (Figure 6B)



เมอพจารณาในใบปาลมน�ามนทไดรบสภาวะขาดโบรอน โบรอนเพยงพอ และโบรอนเปนพษ พบวา ระดบการแสดงออกของยน EgNIP6;1 ในใบทขาดโบรอนมคาการแสดงออกของยน EgNIP6;1 สงสด โดยมการแสดงออกสงขนในวนท 7 และสงสดในวนท 28 หลงไดรบสภาวะขาดโบรอน เมอเปรยบเทยบกบวนท

0 (มคาเทากบ 1) หลงจากนนการแสดงออกจงลดลง และการแสดงออกของยนดงกลาวในสภาพขาดโบรอนจะสงกวาในสภาพโบรอนเพยงพอและโบรอนเปนพษในเกอบทกชวงเวลา ยกเวนในวนท 14 ทสภาพทไดรบโบรอนเพยงพอจะกระต นใหยนแสดงออกสงกวา สภาพขาดหรอโบรอนเปนพษ (Figure 6A)

Figure 6 Relative expression of EgNIP6;1 gene of tenera oil palm by real–time PCR (A) relative expression of EgNIP6;1 in root receiving boron deficiency, sufficiency, and toxicity for 7, 14, 28 and 56 days (B) The comparison of relative expression of EgNIP6;1 in root with leaves of oil palm subjected to boron deficiency for 7, 14, 28 and 56 days

ส.วก.ท.


วจารณ

กระบวนการดดซมและเคลอนยายโบรอนในพชจากสารละลายดน เรมตนดวยการดดซมโบรอนโดยรากพชโดยอาศยการท�างานของยน NIP5;1 (boric acid channel) จากนนจงเคลอนทผานเนอเยอรากและเขาส ทอล�าเลยงน�าโดยอาศยการท�างานของยน BOR1 (borate exporter) เพอเคลอนยายไปยงสวนตาง ๆ ของพชตอไป (Miwa et al., 2010) นอกจากนยงมยนทชวยเพมประสทธภาพในการเคลอนยายโบรอนจากเนอเยอแกไปสเนอเยอออนหรอเนอเยอทก�าลงพฒนา หรออาจเรยกวาการ retranslocation โดยเปนการเคลอนยายโบรอนผานทางทอล�าเลยงอาหารของพช โดยอาศย การท�างานของยน NIP6;1 (Tanaka et al., 2008) จากการศกษาในครงนสามารถจ�าแนกยน NIP6;1 จากปาลมน�ามนชนดเทอเนรา และใหชอวา EgNIP6;1 โดยเปนยนทมขนาด 858 คเบส เมอแปลรหสใหเปนโปรตนไดเปนโปรตนทประกอบดวยกรดอะมโน 285 กรดอะมโน จากผลการวเคราะห hydrophobic plot ดวยโปรแกรม TMpred พบวา โปรตน NIP6;1 มสวนประกอบของ transmembrane domain จ�านวน 6 domain โดยเชอมตอกนดวย loop A–E และม NPAs (Asn–Pro–Ala) boxes จ�านวน 2 box ซงเปนลกษณะเฉพาะทสามารถพบไดในโปรตนชนด aquaporin หรอ MIPs เทานน (Wallace et al., 2006)

จากการศกษาความสมพนธเชงววฒนาการและสรางเปน phylogenetic tree โดยเปรยบเทยบความสมพนธระหวางยน EgNIP6;1 และยน NIPs ทรายงานในพชหลายชนดแสดงใหเหนวายน EgNIP6;1 จดอยในกลมของ NIP II ทมความสมพนธใกลชดกบยน AtNIP6;1 และ OsNIP3;1 (Figure 5) ทไดรบการพสจนแลววาท�าหนาทในการเคลอนยายกรดบอรกในสภาวะทพชขาดโบรอน ในปจจบนโปรตน NIP สามารถแบงออกไดเปน 3 กลมยอยตามขนาดของสารทโปรตน NIP สามารถน�าพาได โดยขนาดของสารทน�าพาไดนขนอยกบขนาดของชองทางทโปรตนชนดนสรางขน ซงขนอย กบ

ต�าแหนงของ ar/R (aromatic/arginine) ทอยบนสาย โพลเปปไทด (Wallace and Roberts, 2004) โปรตน NIPs กลมยอย II มบทบาทส�าคญในการเคลอนยายสาร ทมโมเลกลขนาดกลางและไมมประจ เชน ยเรย และ ฟอรมาไมด (Wallace and Robert, 2005) และ กรดบอรก (Takano et al., 2006) ใน Arabidopsis พบวายน AtNIP5;1 และ AtNIP6;1 มบทบาทในการเพมประสทธภาพการเคลอนยายโบรอน แตพบวายนทงสองมการแสดงออกเพอสงเสรมการเคลอนยายโบรอนในชนดของเนอเยอทตางกนคอ AtNIP5;1 พบวามการแสดงออกมากในรากเพอชวยดดซมโบรอนจากสารละลายดนเขาสราก ในขณะท AtNIP6;1 มการแสดงออกมากในสวนล�าตนและใบเพอชวยในกระบวนการ retranslocate โบรอนในพช (Tanaka et al., 2008) แตการศกษาในขาว พบวามเพยงยน OsNIP3;1 ทควบคมการเคลอนยายครอบคลมทงราก ล�าตน และใบ (Hanako and Fujiwara, 2007) ดงนนเมอพจารณารปแบบการแสดงของยน EgNIP1;6 ในปาลมน�ามน ทพบการแสดงออกในสวนของใบออนสงกวารากอยางเหนไดชด (Figure 6B) แสดงใหเหนวายน EgNIP6;1 มการท�างานทคลายกบยน AtNIP6;1 นอกจากนเมอพจารณารปแบบการแสดงออกนนยงมแนวโนมในทศทางเดยวกน จงอาจสรปไดวา EgNIP6;1 นนมบทบาทเปน boric acid channel ทเกยวของกบการเคลอนยายโบรอนภายในเนอเยอในปาลมน�ามนทมการแสดงออกในระดบสงภายใตสภาวะการขาดโบรอน

สรป

การโคลนยนดวยเทคนคทางอณวทยารวมกบไพรเมอรทมความจ�าเพาะเจาะจง สามารถจ�าแนกยน NIP6;1 ในปาลมน�ามนและใหชอวา EgNIP6;1 โดยเปนยนทมขนาด 858 ค เบส เมอแปลรหสใหเปนโปรตนจะไดโปรตนทประกอบดวยกรดอะมโน 285 กรดอะมโน และเมอพจารณาผลการว เคราะห



คณสมบตตาง ๆ ทางดาน bioinformatics ทงการวเคราะห hydrophobic plot การวเคราะห multiple sequence alignment การสราง phylogenetic tree รวมกบการศกษารปแบบการแสดงออกของยนในตนกลาปาลมน�ามนทไดรบสภาวะขาดโบรอน โบรอนเพยงพอ และโบรอนเปนพษ แสดงใหเหนถงลกษณะเฉพาะของยนทคลายคลงกบยน AtNIP6;1 ทรายงานใน Arabidopsis และ OsNIP3;1 ทรายงานในขาว จงอาจสรปไดวา EgNIP6;1 ทจ�าแนกไดจากปาลมน�ามนน มบทบาทส�าคญในการเคลอนยายโบรอนในใบออน โดยเฉพาะเมอปาลมน�ามนไดรบสภาพขาดโบรอน

กตตกรรมประกาศ

ขอขอบคณโครงการเครอขายเชงกลยทธเพอผลตและพฒนาอาจารยในสถาบนอดมศกษา ส�านกงานคณะกรรมการการอดมศกษาทใหทนสนบสนนการวจย และศนยเทคโนโลยชวภาพเกษตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตก�าแพงแสน และศนยความเปนเลศดานเทคโนโลยชวภาพเกษตร ส�านกพฒนาบณฑตศกษาและวจยดานวทยาศาสตรและเทคโนโลย ส�านกงานคณะกรรมการการอดมศกษา ทใหความอนเคราะหเครองมอ อปกรณ และสถานทในการท�าวจย

เอกสารอางอง

Brown, P.H. and B.J. Shelp. 1997. Boron mobility in plants. Plant Soil. 193: 85–101.Hanako, H. and T. Fujiwara. 2007. Channel–mediated boron transport in rice. Plant Cell Physiol. 48:

S227. Huang, L., W.L. Bell and B. Dell. 2008. Evidence of phloem boron transport in response to interrupted

boron supply in white lupin (Lupinus albus L. cv. Kiev Mutant) at the reproductive stage. J. Exp. Bot. 16: 447–456.

Laksana, C. and S. Chanprame. 2015. A simple and rapid method for RNA extraction from young and mature leaf of oil palm (Elaeis guineensis Jacq.). ISSAAS. 21(1): 96–106.

Loomis, W.D. and R.W. Dust. 1992. Chemistry and biology of boron. Biofactors 3(4): 229–239.Matoh, T. and K. Ochiai. 2005. Distribution and partitioning of newly take up boron in sunflower.

Plant Soil. 278: 351–360.Miwa, K., J. Takano, T. Kamiya and T. Fujiwara. 2010. Chapter7: Molecular mechanisms of boron

transport in plants: Involvement of Arabidopsis NIP5;1 and NIP6;1. In T.P. Jahn and G.P. Bienert, eds. NIPs and Their Role in the Exchange of Metalloids. Springer, USA.

Noguchi, K., F. Dannel, H. Pfeffer, V. Romheld, H. Hayashi and T. Fujiwara. 2000. Defect in root-shoot translocation of boron in Arabidopsis thaliana mutant bor1-1. J. Plant Physiol. 156: 751–755.

O’Neill, A., T. Ishii, P. Albersheim and A.G. Darvill. 2004. Rhamnogalacturonan II. structure and function of borate cross-linked cell wall pectin polysaccharide. Annu. Rev. Plant Biol. 55: 109–139.

Pinho, L.G.R., E. Campostrini, P.H. Monnerat, A.T. Netto, A.A. Pires, C.R. Mariano and Y.J.B. Soares. 2010. Boron deficiency affects gas exchange and photochemical efficiency (JPT test parameters) in green dwarf coconut. J. Plant Nutr. 33: 439–351.

ส.วก.ท.


Rowe, R.I. and C.D. Eckhert. 1999. Boron is required for zebrafish embryogenesis. J. Exp. Biol. 202: 1649–1654.

Shelp, B.J., A.M. Kitheka, R.A. Vanderpool, O.R. van Cauwenberghe and G.A. Spiers. 1998. Xylem-to-phloem transport of boron in broccoli and lupin during early reproductive growth. Physiol. Plant. 104: 533–540.

Shorrocks, V.M. 1997. The occurrence and correction of boron deficiency. Plant Soil. 193: 121–148.Stangoulis, J.C., P.H. Brown, N. Bellaloui, N. Reid and R.D. Graham. 2001. The effect of boron utilization

in canola. Aust. J. Plant Physiol. 28: 1109–1114.Takano, J., K. Miwa and T. Fujiwara. 2008. Boron transport mechanisms: collaboration of channels

and transporters. Trends Plant Sci. 13(8): 451–457.Takano, J., K. Noguchi, M. Yasumori, M. Kobayashi. Z. Gajdos, K. Miwa, H. Hayashi, T. Yoneyama and T.

Fujiwara. 2002. Arabidopsis boron transporter for xylem loading. Nature 420: 337–340.Takano, J., M. Wada, U. Ludewig, G. Schaaf, N. Wiren and T. Fujiwara. 2006. The arabidopsis major

intrinsic protein NIP5;1 is essential for efficient boron uptake and plant development under boron limitation. Plant Cell 18: 1498–1509.

Tanaka, M., I.S. Wallace, J. Takano, D.M. Roberts and T. Fujiwara. 2008. NIP6;1 is a boric acid channel for preferential transport of boron to growing shoot tissues in Arabidopsis. Plant Cell. 20: 2860–2875.

Wallace, I.S., W.G. Choi and D.M. Roberts. 2006. The structure, function and regulation of the nodulin 26-like intrinsic protein family of plant aquaglyceroporins. BBA. Biomembranes 1758: 1165–1175.

Wallace, I.S. and D.M. Roberts. 2004. Homology modeling of representative subfamilies of Arabidopsis major intrinsic protein classification based on the aromatic/arginine selectivity filter. Plant Physiol. 135: 1059–1068.

Wallace, I.S. and D.M. Roberts. 2005. Distinct transport selectivity of two structural subclasses of the nodulin–intrinsic protein family of plant aquaglyceroporin channels. Biochemistry 44: 16826–16834.

Documents

NIP6;1agscij.agr.ku.ac.th/phocadownload/2560-48-2/ASJ-48-2-174...>>¼¯Çµ $ ·· · ®¿ NI61 ษ¼ล 174 i i 2017 Vo 48 (2 การจ าแนก และร ปแบบการแสดงออกของย