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Nouveaux outils de cytog énétique moléculaire (MLPA et CGH) utilis és en constitutionnel
COUTTON Charles
EC GénétiqueJeudi 12 Janvier 2012
Remaniements génomiques
• Regroupent les duplications, les délétions, les insertions, les inversions et les translocations.
• Impliquent des régions d’une centaine de paires de bases jusqu’à plusieurs millions
• A l’origine de: – polymorphismes bénins – maladies génétiques regroupées sous le nom
de maladies ou désordres génomiques
Mécanismes• Trois principaux mécanismes:
– NAHR (Non Allelic Homologous Recombination) ou recombinaison homologue non allélique
– NHEJ (Non Homologous End Joining) ou raccordement d’extrémités non homologues
– FoSTeS (Fork Stalling and Template Switching)
• Surviennent aussi bien dans les cellules germinales (méiose) que dans les cellules somatiques (mitose / mosaïque)
=> maladies génétiques / cancers
NAHR• Dérive d’un mécanisme de réparation d’une CDB de l’ADN• Recherche d’une matrice contenant une séquence homologue =>
erreurs possibles si une mauvaise matrice de réparation est utilisée => NAHR
• Du à des séquences répétées appelées LCR (Low copy repeat) (5 % de notre génome , forte homologie (>90%)
• A proximité de structures génomiques capables de générer des CDB
NAHR
Pathogène ou bénin ?Bénin +++
Risque pour la descendance
NHEJ• Mécanisme biochimique
de réparation de l’ADN
• Perte d'information : les extrémités de la cassure double brin sont souvent digérées avant d'être recollées
• Impliqués dans les • recombinaisons
«physiologiques» V(D)J•• En pathologie: cancers
+++, DMD…
FoSTeS• Lié à la réplication (pas
de CDB)
• Entraine la formation de réarrangements non récurrents complexes
• En pathologie: Pelizaeus-Merzbacher, Potocki-Lupski (PTLS)
• Nécessite « que » des micro-homologies de séquences
Copy Number Variation
• Si le réarrangement génomique entraine une variation du nombre de copies (gain / perte) d’un segment d’ADN de 1 kb et plus, on parle de CNV (Copy Number Variation)
• Soit polymorphes, soit pathogènes:⇒ Intérêt médical⇒ Intérêt d’étude et de détection
CNV et polymorphismes
Cohorte d’individus « apparemment » sains
CNVs et polymorphismes
� Répertoriés dans des bases de données (DGV)
� 57 000 CNVs décrits
� Représenterait 13 à 20% du génome
� Situés dans des régions pauvres en gènes ou liés àl’environnement (R olfactifs)
� Si F > 1% : CNP (copy number polymorphism)
CNVs et pathologiesPhénotype anormal: RM + dysmorphie
Répertoriées dans des bases de données(DECIPHER)
Méthodes de detection
1970
1990
2000
.
.
.
Premier caryotype
« banding »
« banding » haute-résolution
FISH
MLPA, QMPSF
CGH-array
.
.
.
.
.
.
1956
CGH
.
.
.
FISH
MLPACaryotype
CGH-array
Approche globale Approche ciblée
Choix des techniques
Choix des techniques
ATGCACTGATGAATGCATGCAATATGCACTGATGAATGCATGCAAT
Gène moyen: 2.104 pb
Sous-bande: 2.105 pb
Bande chromosomique: 3.106 pb
Exon: 50 à 1000 pb
Caryotype
FISH
Séquençage
CGH-array
MLPA
Paire de bases
Réso
luti
on
Caryotype / FISH
Carotype
Résolution entre 3 et 5 Mb
Inconvénients: long ; faible résolution; cout
Avantages: mécanismes remaniements
FISH
Résolution: 150KbInconvénients: petite duplication, cout,culture, banque de clonesAvantages: mécanismes remaniements
FISH
CGH-array
• Technique d’hybridation comparative génomique sur microréseau(puce à ADN).
• Technique de quantification relative: mise en évidence de pertes ou de gains de matériel chromosomique (par rapport àune référence).
• Digestion de l'ADN génomique par les enzymes AluI et RsaI– Obtention de produits de digestion dont la
taille varie entre 100 et 500 pb• Marquage fluorescent de l'ADN digéré
– Alexa Fluor 5 et Alexa Fluor 3• Purification sur colonne de l'ADN digéré et
marqué• Vérification du marquage au Nanodrop
– Rejet des échantillons si marquage insuffisant
CGH-array
CGH-array
Dans chaque spot:� Fragment spécifique d’ADN simple brin de petite taille (60 pb)� Dépôt multiple du même oligonucléotide
• Hybridation sur lame CGH– 4x180K– Caisson ozone free– Durée 24 h à 65°C
ADN Patient
ADN Témoin
CGH-array
• LavagesCGH-array
• Scan des lames et extraction des données– Mesure des intensités de fluorescence – Logiciels d'extraction des données et
d'analyse
CGH-array
• Interprétation
Quantité d’ADN identique chez le patient et le témoin
- fluorescence jaune
- ratio de fluorescence log2(2/2) = 0
Patient Témoin Patient TémoinPatient Témoin
=
CGH-array
Log2(R/V)
• Interprétation
Quantité d’ADN identique chez le patient et le témoin
- fluorescence jaune
- ratio de fluorescence log2(2/2) = 0
Patient Témoin Patient TémoinPatient Témoin
=
Quantité d’ADN moindre chez le patient par rapport au témoin
- délétion
- fluorescence verte
- ratio de fluorescence log2(1/2) = -1
CGH-array
Log2(R/V)
• Interprétation
Quantité d’ADN identique chez le patient et le témoin
- fluorescence jaune
- ratio de fluorescence log2(2/2) = 0
Patient Témoin Patient TémoinPatient Témoin
=
Quantité d’ADN moindre chez le patient par rapport au témoin
- délétion
- fluorescence verte
- ratio de fluorescence log2(1/2) = -1
Quantité d’ADN supérieure chez le patient par rapport au témoin
- duplication
- fluorescence rouge
- ratio de fluorescence log2(3/2) = 0,58
CGH-array
Log2(R/V)
Expérience en quatuor:
CGH-array
Patient A en Al5 et B en Al3 (témoin)
CGH-array
Délétion ?
Duplication ?
• Patient A en Al5 et B en Al3 (témoin) : courbe rouge
• Courbe rouge : log2(1/2) = -1• 1 copie patient / 2 copies témoins
• Patient A en Al3 et D en Al5 : courbe verte
• Courbe verte : log2(2/1) = 1• 2 copies témoins / 1 copie patient
=> Image en miroir⇒ Délétion chez A confirmée
• Pas de miroir pour la duplication⇒ CNV n'appartiennent pas à A
CGH-array
• Avantages du quatuor et dye swap– Moindre coût : 4 patients par lame– Confirmation de l’anomalie qui apparaît en miroir– Bonne attribution des CNV– Lecture plus facile quand la courbe est bruitée– Attention : ne pas associer patients avec clinique strictement
identique
Expérience en quatuor:
CGH-array
CGH-array
Délétion 4q21.22q22.3 ~ 15.2 Mb
Détection d’anomalies au niveau de régions pauvres en bandes
CGH-array
Délétion
DuplicationInv dupdel (8p)
Détection facilité des anomalies complexes
Détection de petits remaniements
Duplication de 30 Kb
CGH-array
Duplication 1qcenq24.2 de 35 Mb en mosaïque à 23 %
Détection de faibles mosaïques
CGH-array
CGH-array
• Différents type de puces CGH-array (en f° des cibles)
– BAC/PAC: robuste, sensible, contrôle aisé, faible résolution (80-200 Kb), limite de la banque
– Oligonucléotides: résolution: < 30kb moy.• Longs: CNV seulement; excellente spécificité• Courts: détection des CNV + SNPS (LOH)
– cDNA: étude du niveau d’expression
• Puces ciblées– Hyperdense sur un région d’intérêt (< 1 kb)– Limitées à des régions précises (résolution std)
• Choix de la plate-forme dépend aussi du cout et des outils d’analyse bio-informatique.
FISH
MLPACaryotype
CGH-array
Approche globale Approche ciblée
Choix des techniques
DenaturationHybridation
MLPA
Ligation
MLPA
Ligation
MLPA
1
2
3
45
1
2
3
45
Amplification
MLPA
Triple X
Témoin
Patient
Séparation électrophorétique
Une différence relative de la hauteur ou surface d’un pic indique une variation du nombre de copie de la séquence cible.
MLPA
Normalisation
• Permets une quantification relative des signaux de chaque sonde:
• par rapport aux sondes contrôles (c)
• par rapport à un témoin négatif (sain)
⇒ obtenir un ratio
⇒ apprécier le nombre de copie de la région cible
Témoin
Exemple
0.5
1.5
0
1 11
c c
MLPA
MLPA et 22q11
Témoin
Patient
ComparaisonDélétion
22q11
Région
22q11
MLPA / CGH-array
Analyse des
signaux
Quantification
MLPA CGH-array
Hybridation
sondes / cibles
• Avantages
• Pas de culture (ADN)• Analyse pangénomique• Haute résolution• Haut débit• Automatisable• Tous types de tissus
• Pas de culture (ADN)• Multiplexage• Spécificité 100%• Sensibilité 100%• Coût• Rapide (48h)• Tous types de tissus
CGH-arrayMLPA
MLPA / CGH-array
CGH-array et RM
• Patients avec RM + dysmorphie:
– Le caryotype seul: 3 à 5% de diagnostic– Caryotype + FISH: 8 à 10% de diagnostic– CGH-array: 9 à 13% d’anomalies supplémentaires
par rapport au caryotype => 12 à 18% de diagnostic
CGH-array en première intention en post-natal ?
MLPA et 22q11
La MLPA détecte 100% des anomalies impliquées
LA FISH ne détecte « que » 95% des anomalies
Stachon et al. 2007. AJMG
• Limites
• Ne détecte pas lesremaniements équilibrés• Anomalie de la ploïdie• Prix• Mécanisme de l’anomalie• Éthique• Interprétation complexe
• Ne détecte pas lesremaniements équilibrés• Anomalie de la ploïdie• Analyse ciblée• Mécanisme de l’anomalie• Faux positifs• Pas automatisable
CGH-arrayMLPA
MLPA / CGH-array
Perte d’un gène suppresseur de tumeur (TP53)Impliqué dans le syndrome de Li-Fraumeni => attitude ?
Ethique
Interprétation
• Que faire quand on trouve des délétions ou des duplications ?
– Est-ce un CNV (Copy Number Variation) bénin ?
– Est-ce un CNV responsable de la maladie ?
– Bases de données
– Vérification de la variation chez le cas index
– Analyse des parents
Interprétation
• Anomalies héritées = polymorphismes ??
- L’expressivité variable : une même maladie s’exprime de manière différente chez plusieurs personnes porteuses de la même anomalie génomique.
- La pénétrance incomplète : elle consiste en l’absence d’expression de la maladie chez une personne porteuse d’une même anomalie génétique.
- La récessivité ou hétérozygote composite : un gène inclus dans la région délétée peut avoir son deuxième allèle porteur d’une mutation révélant ainsi une maladie récessive autosomique.
- L’empreinte parentale : elle consiste en l’expression différentielle de régions génomiques selon qu’elles sont héritées du père ou de la mère du patient.
- La régulation épigénétique : la méthylation ou l’acétylation différentielles de certaines régions génomiques entraînent une modification du niveau d’expression des gènes.
Interprétation
Van Ommen GJ
Nat Genet 37:333-4, 2005
Array CGH
NormalCNV
Polymorphisme(CNP)
ConnuInconnu
Héritéde novo
Anomalie causale
Analyser les parents
Anomaliecausale
Critères de Lee
Guidelines :Vermeesch et al, Shaffer et al
Interprétation
Interprétation
Anomalie de novo dans une région dépourvue de gènes et non répertoriée dans les bases de données
=> interprétation ?
Interprétation
Interprétation
Interprétation
• L’association de plusieurs CNVs apparemment bénins et/ou l’association avec d’autres facteurs comme des facteurs environnementaux peut favoriser l’apparition d’une maladie.
• Depuis quelques années, certains CNVs ont été clairement identifiés comme facteurs de prédisposition ou de susceptibilité à des maladies complexes multifactorielles (cancers, neuro-dégénératives etc…).
Signes d'appel écho ne justifiant pas à eux seuls l'IMG
CNV inconnus
Hérités ?CNV dans les gènes de
prédisposition aux cancers
Technique longue et coûteuse
Interprétation
• CNVs et prénatal
Séquençage haut-débit
• Séquenceurs nouvelles génération
– Séquençage d’un grand nombre de fragments d’ADN au hasard (« shotgun »)
– Séquences générées alignées sur séquence de référence
– Application en cancéro / constitutionnel• Efficacité validée mais recherche fondamentale• Niveau de résolution meilleure que puces