NOVETATS EN EL DIAGNÒSTIC DE LA TUBERCULOSI · Sipal et al. (FIND) JCM; 2018 Obtenen 100 anticossos monoclonals en front diferents epítops de LAM. Un grup de 11 funcionen bé in

SCMIMC. GENER 2019

Julià Gonzalez Martin

Servei de Microbiologia-CDB

Hospital Clínic-ISGLOBAL

Departament Fonaments Clínics.

Facultat de Medicina, UB

NOVETATS EN EL DIAGNÒSTIC DE LA

TUBERCULOSI

Perquè el bacteri continua sent un

problema?

Metabolisme lent

Clínica lenta: retard diagnòstic

Respon lent al tractament: risc incompliment

Tendència a la latència

1/3 població del MON infectats (portadors)

Resposta lenta al tractament: risc incompliment

10% infectats emmalalteixen, però quan?

Proves diagnòstiques lentes: retard

diagnòstic

Divisió cada 18-24h

40 cops més lent que

E. coli

Metabolisme dorment o semi-dorment.

“Escapa” parcialment a antibiòtics

Quins són els principals problemes

del diagnòstic?

Mon Nostre entorn

Diagnòstic TB pulmonar en HIV i infants Diagnòstic formes paucibacilars: extra-

respiratòries, infants, immunodeprimits

Diagnòstic de la resistència Diagnòstic TB pulmonar en pacient

DIAGNÒSTIC MICROBIOLÒGIC

El diagnòstic microbiològic ACTUAL es recolza en:

Mostres adequades

Detecció microscòpica

mitjançant tincions

Detecció de material

genètic o d’antígens

Cultiu del

microorganisme

Identificació del

micobacteri i proves

de sensibilitat als

fàrmacs

Pro

ves ràpid

esP

roves len

tes

PL

PL

PR

PR

PR


• Altament diagnòstica si

positiva

• Ràpida i econòmica (<5€)

• Senzilla de fer

• Sensibilitat baixa

• Qüestionar en líquids biològics

• NO aplicable a sang i mostres

hemàtiques

Detecció microscòpica Cultiu

• Prova més sensible

• Permet identificar l’espècie

• Permet fer antibiograma i altres

• Lentitud

• Instal·lació de seguretat

biològica costosa

MGIT

BACT-ALERT

VERSATREK

Límit teòric: 10-100 bacteris/mL.

Mostres respiratòries i teixits sòlids: 70-85%

Mostres amb líquids biològics: 35-50%

Límit teòric: 50.000-100.000 bacteris/mL

Sensibilitat: 20-80% segons mostres. Mostres

respiratòries 45-60%, i teixits 60-80%. Líquids biològics

rarament positiva.


• POTENCIALS MILLORES:

• ús mètodes fluorescents (ja molt

estès), augment 8-10%

Detecció microscòpica Cultiu

• POTENCIALS MILLORES:

• Ús cultius líquids (molt estès).

Sòlid és complementari. Si només

un, líquid

MGIT

BACT-ALERT

VERSATREK

• Límit: pràcticament ja assolit

• Límit: pràcticament ja assolit.

Cap novetat significativa en els

darrers 20 anys

AMPLIFICACIÓ GENÈTICA

Lisi dels bacteris i

extracció de l’ADN

Molts mètodes: manuals, semi-automatitzats,

integrats; temps real, electroforesis

Molt important la simplicitat i poca

manipulació

Principal dificultat des de

l’inici: menor sensibilitat que el

cultiu

Mètode integrat més conegut: Xpert MTB

Introducció de la mostra en cartutx on succeeix des de lisi fins detecció.

Primera versió amplifica gen rpoB, usant sondes fluorescents.

Diagnòstic i també detecció de mutacions de resistència més freqüents

a rifampicina . Procés en 2h. Recomanat per la OMS en 2011.


Xpert MTB RIF Rendiment tuberculosi Pulmonar

Tinció sensibilitat especificitat Status HIV

ZN+ 98% 99%

ZN- 67% 99%

No feta (substitueix a

tinció)

89% 99%

Totes 79% HIV positiu

Totes 86% HIV negatiu

Steingart KR et al. Cochrane Database of Systematic Reviews, 2014

27 treballs, 9557 mostres. 59% de països de baixa i mitjana renda

Respecte a tinció, Xpert aporta 23% més de diagnòstics ràpids


Xpert MTB RIF Rendiment tuberculosi Extrapulmonar

Localització sensibilitat especificitat

Meningitis (LCR) 71,1% 98%

Pleuritis (L.pleural) 50,9% 99%

Pleuritis (L. pleural) en quant clínica 22%

Pleuritis (biòpsia) 31%

Urinaria 82,7% 98,7%

Biòpsia teixit (gàngli, òs, etc) 82% 97%

Kohli et al. Cochrane Database of Systematic Reviews, 2018

66 treballs, 16213 mostres. 76% de països de baixa i mitjana renda. Rendiment en

quant a cultiu

Respecte a tinció, Xpert la diferència es important, ja que la tinció sol ser negativa


Nova versió (2016-17)

amb canvis per augmentar

sensibilitat

Xpert MTB RIF Ultra Detecció rpoB i també IS6110 i IS1081

Millores líquids i cambra d’amplificació i reacció nested amb

sondes Taqman (abans heminested i sondes mol.beacon

5 categories de positiu: high, medium, low, very low, traces

Resistència a rifampicina: si, no, indeterminat ( amb traces)

Límit teòric detecció: 15,6 UFC/mL (9 vegades més que Xpert , 131 UFC/mL


Xpert MTB RIF Ultra

Mostres Sens ultra % Sens Xpert

%

RT-MTB

Abbot

Referència

382 85,4 73 Bisognin PlosPne 2018

104 78,9 66

1520 87,8 82,9 FIND. WHO 2017

2120 63 46 Tinció negativa Dorman Lancet ID 2018

259 73,4 -- Tinció negativa

237 89,3 82,1 78,6 Berhanu JCM 2018

237 64,7 41,2 41,2 Tinció negativa Berhanu JCM 2018

108 75,9% (ganglis

94,1%)

Tinció negativa.

extrapulmonar

Alcaide F 2018


Xpert MTB RIF Ultra: especificitat

• Estudis recents (Dorman S et al. Lancet Infec Dis 2018; Berhanu R et al JCM 2018),

especificitat menor de ultra: 95,6% i 96% vs 98-100%

• Especificitat disminuïda respecte al cultiu, sobretot en positius traces o very low.

Aproximadament 50% d’aquest són cultiu negatiu.

• Falsos positius?

Possible Estratègia: repetir.

positiu: positiu

negatiu: negatiu I seguiment

Us en femta (Banada PP et al. Plos ONE 2016)

Nens, diagnostic de TBP, buscant secrecions deglutides en femta. Preparació senzilla, amb

tampó I filtratge. Limit de detecció 1000 UFC/mL. 9 cops menys sensible que Xpert.

Comparació amb cultiu o Xpert en alters mostres: 85% de sensibiitat.

Valorar facilitat de la mostra


ALTRES PLATAFORMES

• Real Time Nested PCR. Analitzador tipus ELISA. Amplifica IS6110 i Ag proteic b (PAB).

Límit teòric 17 UFC/mL

• Vinuesa et al- Diag Microbiol Inf Dis 2016: 257 mostres respiratòries. Sensibilitat

95,4%, Especificitat 100%.

• Hinic et al. Tuberculosis 2017: 200 mostres respiratòries. Sensibilitat 91,6%,

especificitat 99,5%

ABBOTT Real Time MTB


ALTRES MÈTODES AMPLIFICACIÓ

• Recerca en disseny de mètodes integrats, per proves individualitzades,

portàtils: important en el concepte d’ús in situ (POC, point of care)

• Alternatives a Xpert, més econòmiques : Truenat MTB (India), EasyNAT (Xina),

Vere MTB assay (Singapur)

• Truenat MTB (India), Real Time PCR. Aparell miniaturitzat. Sensibilitat global

91%, especificitat 100%. (Nikam C et at. Int J Mycobacteriol 2014

• EasyNAT (Xina) Amplificació Isotérmica. Sensibilitat en tinció negativa 59% (Ou X

et at. Tuberculosis 2014

• Vere MTB assay (Singapur) Multiplex PCR microarray. Detecció de 10 especies i

mutacions resistència a INH i RIF.


Tulshidas S et al. Exp Op. Ther. Pat. 2018

FUTUR DEL DIAGNÒSTIC

Tinció I cultiu probablement ja han assolit el màxim

Amplificació genètica: queda marge de millora

millorar mètodes actuals: ex. Xpert Ultra

noves metodologies d’amplificació

millora en l’extracció d’ADN (marge mentre el cultiu sigui millor)

Detecció genètica de resistències: queda marge de millora

introduir nous marcadors genètics de resistència

desenvolupar seqüenciació massiva

Buscar biomarcadors/biosensors: queda MOLT marge de millora

Detecció de lipoarabinomanan (LAM) en orina.

Detecció de compostos aromàtics volàtils

Versions de IGRA amb antígens diferents als actuals


Biosensors en el diagnòstic de Tuberculosi

TRANSDUCTOR DE

SENYAL BIORECEPTOR

ANALITZADOR

DE SENYAL


Biosensors en el diagnòstic de Tuberculosi

En base a que detecta En base al transductor usat

ESPUT

Productes volàtils

Cel·lula MT total

DNA

Ag secretats per MT

Ac anti MTB

Altres biomarcadors

Productes volàtils

Cel·lula MT total

DNA

Ag secretats per MT

SANG

ORINA

Potenciometria

Conductometria

Impedància

Longitud d’ona

evanescència

Fibra òptica

quimioluminescència

Piezoelèctric (basat

en microbalanç de

cristalls de quars)

Ressonància

magnètica nuclear

Electroquímic

Òptic

Bassat en massa

Magnètic


Detecció d’antigen lipoarabinomanan (LAM) a orina.

• Actualment existeix un mètode basat en immucromatografia. Es molt poc usat degut a la baixa

sensibilitat.

• Només s’ha vist útil en pacients VIH+ amb menys de 50 CD4.

• Ser una mostra d’emissió espontània i fins a cert punt homogènia la fa interessant.

CD4 Sens %

>200 4

<200 39

<150 45,7

<100 51,7

<50 66,7

Sipal et al. (FIND) JCM; 2018

Obtenen 100 anticossos monoclonals en front diferents epítops de LAM.

Un grup de 11 funcionen bé in vitro. Lectura amb plataforma

electroquimioluminiscència

En orines de 75 pacients adults HIV+ I HIV- amb diagnòstic microbiològic

de TB:

93% sensibilitat; 97% especifcitat.

Només HIV-: sensibilitat 80%

Alere-LAM detecta 33%, només en HIV 13%

Antigen diana: 5-metil-tio-D-xilofuranosa (MTX). Epítop especific de MTC

Tecnologia a desenvolupar

Alere-LAM

Detecció no comercial LAM


Sandlund et al. Diagn Microbiol Infect Dis 2018

Utilització d’un sensor colorimètric per detectar compostos volàtils

Estructura d’array dins cartutx plàstic amb 73 indicadors cromogènics capaços de

canviar de color en combinar-se amb compostos.

Compostos propis del bacteri i/o de l’hoste

Lectura amb un scanner

Dades preliminars:

sensibilitat 50-80%

especificitat 50-70%

Cal millorar

Detecció compostos volàtils a orina


Zetola et al. JID 2017

Utilització de sensors composats d’un array de metal·lo porfirines i un mètode de

microbalança de quars. Davant de diferents compostos aromàtics es produeixen

canvis de freqüència mesurables amb oscil·lòmetre. colorimètric per detectar

compostos volàtils

En pacient i controls recullen alè en recipient com globus. Processament en

2h.Mesura amb els sensors i anàlisi informàtic

51 pacients amb TB (comprovada per cultiu) i 20 controls.

Sensibilitat 94% i especificat 90%

Millorable en el futur

Detecció compostos volàtils a l’alè


Detecció compostos volàtils

Rates a Gambia (Cricetomys gambianus) entrenades per detector compostos

volàtils en mostres d’esput de pacients tuberculosos

https://www.youtube.com/watch?v=KoRvdyuHxdE&index=18&list=UUuK8qSq_q5Lt0RsLGnwXkmQ

IDENTIFICACIÓ

DELS CULTIUS

La majoria de mètodes es basen en amplifcació genètica.

Ample varietat de tècniques

Detecció Ag MP64 per

immunocromatografia

Identifica M.tuberculosis

Dues tecnologies importants. Cobreixen

gran part de les necessitats:

Cultiu a identificar :

M. intracellulare

Perfil patró: M.

intracellulare

Les versions actuals poden identificar

159 de les 170 especies descrites. Prova de referencia per identificar especies

Maldi-TOF

Seqüenciació

DETECCIÓ DE LA

RESISTÈNCIA

Fenotip. Antibiograma, métode

referència. Molt lent

Genotip. Detecció d’algunes

mutacions de resistencia conegudes

Actualment es complementen, NO es pot prescindir del fenotípic.

El antibiograma genotípic avança informació quan es resistent.

També ajuda a confirmar les resistències fenotípiques, sobretot les de baix nivell.

Orienta sobre el grau de resistència:

Isoniazida inhA: resistència creuada amb etionamida i protionamida. Resistència de baix nivell

Isoniazida katG: resistència de baix nivell. NO creuada amb etionamida

Rifampicina rpoB: mutacions als codons 511, 516, 522, possible sensibilitat a rifabutina

Fluorquinolones, gyrA: codó 94 resistència a moxifloxacino, levofloxacino, ofloxacino i ciprofloxacino. Codons

90,91: resistència a ofloxacino i ciprofloxacino, sensibilitat a moxifloxacino.

DETECCIÓ DE LA

RESISTÈNCIA





Actualment s’estan desenvolupant metodologies de seqüenciació massiva per detecció de

resistències. La fita es substituir l’antibiograma (possible a mig termini?)

Un estudi recent publicat a NEJM (Cryptic consortium and the 100,000 genomes project),

caracteritza 10.000 soques de diferents països. Objectiu establir valors de predicció de la

sensibilitat a fàrmacs de 1L:

INH 99,9%, RF 97,5%, EB 94,6%, PZ 91,3%

(menys sensibilitat quan menys es coneixen les mutacions de resistència)

DETECCIÓ DE LA

RESISTÈNCIA





Us també de seqüenciació massiva per diagnòstic.

Limitacions més importants: sensibilitat per a mostres clíniques, encara no suficient.

Accés a la tecnologia, encara escàs per a molts centres

Interpretació de resultats: a mig termini bases d’interpretació accessibles sense coneixements

bioinformàtics (PhyResSE, TBProfiler, CASTB)

Cost: aprox. 250-300€/mostra.


Què millorarà el diagnòstic?

MILLORES en tècniques moleculars, sobretot extracció i equips integrat

Desenvolupament i universalització de seqüenciació massiva

Detecció de biomarcadors: ideal en orina o sang

Desenvolupament de biosensors (nassos electrònics i similars)

Facultat de Medicina

GRISELDA TUDÓ

ALEX LOPEZ

ELENA PORTELL

ROSA MONTÉ

DOLORS RICART

LORENA SAN NICOLÁS

VALNES RODRIGUES

ESTIBALIZ PAREJA

DIEGO MARTINEZ

ANA MARTINEZ

ANGELY ROMAN

MARIANA FERNANDEZ

Documents

NOVETATS EN EL DIAGNÒSTIC DE LA TUBERCULOSI · Sipal et al. (FIND) JCM; 2018 Obtenen 100 anticossos monoclonals en front diferents epítops de LAM. Un grup de 11 funcionen bé in