1

1

• Nörofarmakolojide in vivo Voltametri ile L-glutamat ve Diğer Nörotransmitterlerin

Ölçüm Teknikleri

Doç.Dr. Ahmet Hacımüftüoğlu

15. Farmakoloji Eğitim Sempozyumu,30 Mayıs 2008, Erzurum

2

GİRİŞ

• L-glutamat, memelilerin Merkezi Sinir Sistemi (MSS)’nde major eksitatörnörotransmitterdir. Parkinson, epilepsi, şizofreni, ilaç bağımlılığı ve birçok beyin hastalığında rolü vardır. Son 10–20 yıldır çok yaygın şekilde kullanılan mikrodiyaliz metodlar, L-glutamatındakika başı ölçümlerini vermiştir. Fakat L-glutamatın ve diğer nörotransmitterlerin hızlı dinamikleri, saniye temelinde ölçüm yapan bir tekniğe ihtiyaç doğurmuştur.

2

3

MİKRODİYALİZ–VOLTAMETRİNİN KARŞILAŞTIRILMASI

Şimdilik yok

VarBirden fazla analizatıneşzamanlı ölçümü

25 – 50 nMPikomolarTespit duyarlık düzeyi

YokVarHücre dışı alanda değişiklik-zarar

1 – 200 Hz(saniyeninaltında)

1 – 20 dak.Örnekleme oranı hızı

KüçükVoltametrielektrodunagöre en az 10 kat büyük

Probbüyüklüğü

VOLTAMETRİ

MİKRODİYALİZ

W4

20x150 μm

4

Nörotransmitterlerle ilişkili hastalıklar:

• Parkinson------------- dopamin, glutamat, GABA, norepinefrin

• Huntington----------- GABA, glutamat

• Epilepsi--------------- glutamat, GABA

• Major Depresyon---- serotonin, norepinefrin

• Şizofreni-------------- dopamin, serotonin, glutamat

• İlaç bağımlılığı------- dopamin, glutamat

3

5

Voltametrik metodla çalışılmış majorbileşikler (oksidasyon +0.25 - +1.3 volts )

• Dopamin (DA+) – [DOPAC, - ; HVA, -]• Norepinefrin (NE+) – [MHPG, DOPEG]• Serotonin (5-HT+)- [5-HIAA, -]• Nitrik oksit (NO.), [nitrit, - ], [nitrat,. -]• H2O2 enzim temelli problar (~20 molekül)• Ürik Asit (UA, -),• Askorbik asit (AA, -)

6

İN VİVO ELEKTROKİMYANIN TEMEL PRENSİPLERİ

• İn vivo elektrokimya, memeli MSS’neyerleştirilebilen mikroelektroları kullanır. Nöronlardaki kimyasal sinyallerin kaydedilmesini sağlar. Mikroelektrotlar, Platin (Pt) ve karbon (C) gibi elementler kullanılarak imal edilir. Bu elektrotlara, bir potansiyel uygulanır. Bu potansiyel bilgisayar kontrolü altındadır. Birçok kayıt, tek elektrodun birden fazla kayıt yüzeyinden aynı anda yapılabilir.

4

7

• Mikroelektrot yüzeyindeki potansiyel eğer yeterliyse, çalışma elektrodu, kayıt bölgesi üzerindeki molekülleri direkt olarak okside veya redükte edebilir (kendi iç elektrokimyasal özelliklerine göre). Okside moleküller, kayıt bölgesine bir veya daha çok okside molekül verirken, redükte moleküller kayıt bölgesinden elektron alırlar. Bu Faradaik reaksiyonlardan oluşan akımlar, mikroelektrot çevresindeki dokulardaki elektroaktifmoleküllerin yoğunluklarıyla birebir orantılıdır. Bu temel prensip, in vitro kalibrasyon (ölçümleme) metodlarının in vivo çalışmalar için kullanılmasına imkan verir.

8

Elektrokimyasal kayıt metodları

• Amperometrik (DC-Devamlı potansiyel)

• Siklik voltametri (CV-üçgen dalgalar)

• Kronoamperometri (kare dalgalar)

• Farklı puls voltametrisi (DPV, Kare dalgalar+üçgen dalgalar)

5

9

• En basit elektrokimyasal tekniklerden biri, devamlı sabit bir potansiyelde ölçüm yapılabilen amperometridir. Akım devamlı olarak monitörizeedilebilir. Olaylar ≤1 milisaniyede ölçümlenebilir.Çalışma elektroduna devamlı voltaj uygulanmasından itibaren, mikroelektrottarafından kaydedilen diğer non-Faradaikakımlar azdır. Bu teknik elektrokimyasal olarak aktif moleküllerin duyarlı ölçümlerine imkan sağlar.

10

• MSS’de düşük veya yüksek oksidasyonpotansiyelinde, Pt kayıt bölgelerinde elektrokimyasal olarak aktif olabilen hücre dışı maddeler arasında; askorbik asit (AA), dopamin (DA), norepinefrin (NE), 5-hidroksitriptamin (5-HT), Homovanilik Asit (HVA), Nitrik Oksit (NO), Ürik asit (UA), Dihidroksifenil Asetik Asit (DOPAC), 5-Hidroksiindol Asetik Asit (5-HİAA) vardır.

6

11

• Ayrıca, elektrokimyasal olarak aktif olmayan moleküller, elektrokimyasal olarak aktif olan haberci molekülü (sıklıkla H202), kayıt yüzeyine enzim uygulanması sonucunda oluşturabilir. Ag/AgCl referans elektroda karşı uygulanan 0.7 V potansiyel, Pt kayıt yüzeyine uygulanır, elektronların transferiyle akımda değişim olur. Oksidasyon enzimleri için O2 kofaktördür. Haberci molekül H2O2’ nin oksidasyonu, devam eden reaksiyonlarda O2 oluşturur.

12

Reaksiyonlar

(1) L-Glutamat + H2O + Glutamat Oksidaz/FAD ==> alfa-ketoglutarate + NH3 + Glutamat Oksidaz/FADH2

(2) Glutamat Oksidaz/FADH2 + O2 ==> Glutamat Oksidaz/FAD + H2O2

(3) H2O2 ==> O2 + 2H+ + 2e-

L-glutamat reaksiyon 1 ve 2 sonucu H2O2 oluşturur. Hidrojen peroksitte platin elektrot yüzeyinde okside olabilir (Euygulanan= +0.70 V Ag/AgCl referans elektroduna karşı).

+0,7 V

7

13

NO.’ in tesbiti

• 2NO. + O2 2NO2- (3. derece reaksiyon)

• NO. NO+ + 1e-

K3

+0.90 V

14

Voltametrik kayıtlardaki temel matematiksel prensipler

• *it=nFACbM M=D1/2/π1/2t1/2 (Cottrell eşitliği)

• i= Ölçülen Faradaik Akım• n= Elektron Sayısı• Cb= Analit konsantrasyonu • A= Elektrot “aktif” bölge• M= Sensor yüzeyine transfer olan kütle

8

15

• Mikroelektrotların kayıt bölgesi, çevresindeki küçük bir dokuda analiz yapabilir. Bu durum küçük ve katmanlı yapıların analizinde (sıçan ile farenin beyin ve omuriliği gibi) avantaj sağlar. Mikroelektrotların çoklu kayıt yüzeyi 2 veya daha fazla beyin bölgesinden analit (tayini istenen madde) ölçüm imkanı sağlar. Ayrıca mikroelektrotlar, amperometrik tekniklerle birleştirilince, ilgilenilen maddenin ölçümünü hızlı zaman dilimlerinde (1–1000 ms) yapabilir. Bu durumda nörotransmitter alımının/gerialımının veya salınımının kinetikleri ölçülebilir.

16

ENZİME DAYALI ÇOK BÖLÜMLÜ (MULTİSİTE) MİKROELEKTROT ÖLÇÜMLERİ

• Enzim temelli multikanallı mikroelektrotlar fotolithografikmetodla üretilirler. Bu metod 5-10 µm (mikrometre-mikron)’lik kayıt yüzeylerin üretimini rutin şekilde sağlar. Ayrıca bu metodla birçok çeşitte multikanallımikroelektrot tasarımı yapılabilir. Mikroelektrotlar, İnce Film Teknolojisiyle güçlendirilmiştir. 2,5x2,5 cmx125 mm kalınlıkta seramik levha (Alumina, Al2O3 v.s.) mikroelektrot ölçümleri için ortak alttaştır. Seramik, komşu hatlardan gelen gürültüyü azaltmaktadır. Ayrıca, seramik yapı dokuların içerisine esneme veya kırılma olmadan stereotaksik konumlandırmaya yardımcı olacak şekilde yerleştirilebilir.

9

17

• Sonuçta fotolitografik metodla çoklu kayıt noktalarına sahip birçok mikroelektrot tasarımı çeşitli geometrik konfigürasyonlarda üretilebilmektedir. En sık kullanılan konfigürasyonlar 4 Pt kayıt noktalı olanlardır. Ancak 8 kayıt noktalı mikroelektrotlar da kullanılabilmekte ve 16 kayıt noktalı olanlar geliştirilme aşamasında bulunmaktadır. R1 elektrotları, geniş beyin bölgeleri içinveya tabakalı yapılar için kullanışlı olan daha geniş bir kayıt mesafesi sağlarken, S2 daha küçük beyin yapılarında algılama imkanı sunar. Dahası çoklu kayıt noktalarının avantajı ile öz-referans teknikleri ile çoklu analitlerin algılanması mümkün olabilir.

18

Voltametri

-Anesteziye hayvanlar (kemirgenler) -Hücre kültürleri-Beyin dilimleri/doku parçaları -Şuuru açık serbest hareket edebilen hayvanlar

S1

15x333 μm

R1

50x150 μm

10

19

FARELERDE KULLANILAN ELEKTROTLAR

20

• FAST-16 sistemi, kontrol kutusu ve bir A/D (AnalogdanDijitale Dönüştürücü) bilgisayar kartı elemanları yardımıyla, oksidasyon veya indirgenme reaksiyonlarının ürettiği elektrik akımını yükseltir ve bu akımı sayısallaştırır. Windows tabanlı FAST-16 sistem yazılımı, saniyede 1 kayıt veya daha hızlı şekilde veri dosyalarını kaydedebilir. Yazılım, yeni nesil mikroelektrotların artan Pt kayıt noktalarının sayısına göre artırılabilen sekiz eş zamanlı kanal kaydına uygun yazılmıştır. FAST-16 göstergeleri, akım ve renk akım kayıtları, 40 Hz’e kadar olan kayıtları gösterebilir. Kaydedilen dosyalar diğer Windows tabanlı (Excel gibi) uygulamalarla da veri işlemeye imkan sağlar veya doğrudan veri işleme analiz programına aktarılabilir.

11

21

FAST KAYITSİSTEMİ

22

• Maymun ve insan beyinlerinde daha derin yapısal bölgelerden kayıt yapabilmek için daha esnek, çok bölmeli mikroelektrodlarşu an test edilmektedir. Çok bölmeli mikroelektrodları tasarlamadaki uzun vadeli amaç, aynı beyin bölgesinde eş zamanlı olarak çok sayıda nörotransmitterin kaydının yapılabilmesidir.

12

23

MİKROELEKTROT HAZIRLAMA

• TEMİZLEME PROSEDÜRÜ

• Yeni elektrotların uçları, citrisolvsolüsyonunda 5 dk. bırakılır. Sonra 5 dk. didistile H2O (ddH20) ile hafifçe yıkanır. Bu yıkama sonrası, Pt kayıt bölgesinde ince bir film tabakası oluşabilir. İnce kâğıt peçete ile bu film kaldırılır. Sonra 15 dk. 105–115ºC’de fırında kurutulur.

•

24

• Enzim kullanılan mikroelektrotlar, kalibrasyon kriterlerini sağlarlarsa birden fazla deney için kullanılabilirler. Uzun kullanımlarda, enzim tabakası uygulaması analit tesbitinizorlaştırır. Önceden enzimle kaplanmış olan elektrotlara biraz farklı bir temizlik prosedürü uygulanır. Bu enzim tabakası öncelikle temizlenir.

• Mikroelektrodun uç kısmı, 80ºC’de karışmakta olan ddH2O’ya sokulur. Pt kayıt bölgesindeki protein matriksyumuşatılır. 30 dk. sonra çıkarılır ve yukarıda tarif edilen yeni elektrot gibi temizlenir. Mikroelektrot kayıt bölgelerinin duyarlığından emin olunması için H2O2’ye cevabı test edilir.

13

25

BARİYER KAPLAMA

• Başarılı bir temizlemeden sonra bariyer kaplaması yapılır. Bariyer, MSS’de yüksek düzeyde bulunan AA veya DOPAC gibi ölçümü istenmeyen aktif maddeleri bloklamak ve minimize etmek için uygulanır. Bu bloklamayla mikroelektrotilgilenilen analit için daha seçici olur.

26

• Çok kanallı mikroelektrotların düzlemsel geometrisi sıklıkla kayıt bölgelerinin materyalle nasıl temas ettiğini belirler. Bariyer ve enzim kaplama, difüzyon bariyeri oluşturarak bileşiklerin mikroelektrot yüzeyine difüzyonunu azaltır veya yok eder. Bu inhibisyonmikroelektrodun analizi istenen maddeye karşı cevaplama zamanını da geciktirebilir. Bu yüzden elektrot kaplama parametrelerinin, enzim ve bariyer kaplama için optimal prosedürdeyapılması gerekir.

14

27

NAFİYON BARİYERİ

• Nafion, anyonik teflon derivesidir ve MSS dokularında voltametrik kayıtların seçiciliğini artırmak için yaygın şekilde kullanılır.

• Negatif yüklü sülfonik asit grupları, nafionunpolimer matriksi ile yer değiştirir ve Pt kayıt bölgelerindeki anyonları geri iter. Eğer bu anyonlar geri itilmezse, yüksek arka plan sinyaline neden olur ve gerçek kayıtlarda karışıklık (gürültü) oluşturur. Aynı zamanda nafiondaki negatif yüklü sulfonik asit grupları DA, NE, 5-HT gibi katyonik türleri yoğunlaştırır. Nafion, Pt yüzey üzerinde okside olabilen katekolaminleri Pt kayıt bölgesine çekebilirler.

28

Karbon elektrotların Nafionkaplaması

Pozitif etkiler:• Aminlere karşı artmış duyarlılık (>1000:1 DA/AA)• Artmış sinyal/gürültü• Dokuda değişmeden kalabilme• Uzun saklama zamanı• Artmış elektrofizyolojik kayıtlar

Negatif etkiler:• Yavaşlamış cevap• Nafion elektrottan çıkarılamaz

15

29

• Nafion (%5), 300 mikrolitrelik santrifüj tüplerine konur. Mikroelektrodun ucu nafionun içine daldırılır ve bir dönüş 1 s. sürecek şekilde sıvının içinde döndürülür. Mikroelektrot nafionsolüsyonundan çıkarılır. 165–175ºC’de 4 dak. fırına konur. Nafion, elektrodun ucunda kurur. Genel olarak, düşük ısıda kurutma, yüksek ısıda kurutmaya göre daha kalın bir film tabakası oluşturur. Ayrıca, uzun kurutma zamanı (yüksek ısılarda) mikroelektrotların AA ve L-glutamat gibi analite karşı daha düşük cevap oluşturmasına yol açar.

30

• Aşırı nafionla kaplı mikroelektrotlar elektrokimyasal olarak aktif moleküllere karşı tesbit edilebilen cevabı azaltır veya yok eder. Yetersiz nafionla kaplanmış mikroelektrotlar ise beyne sokulduğunda arka planda yüksek AA seviyeleri kaydedilmektedir. Nafionsertleştikten sonra, enzim kaplamadan önce 30 dakikalığına oda sıcaklığında kurumaya bırakılır.

• Burada hiç unutulmaması gereken nokta nafion kaplı mikroelektrodun sulu solusyona (beher veya beyin ortamı gibi) bir kez girdimi, hep sulu ortam içinde kalması gerekliliğidir veya çok sınırlı bir süre sıvı ortamdan çıkarılabilir. Eğer nafion sıvı ortama sokulduktan sonra kurursa, kaplamada çatlak oluşur ve interferentler(parazit oluşturanlar) küçük yarıklardan geçerler ve Ptkayıt bölgelerinde okside olabilirler. Eğer bu durum oluşursa elektrot ölçülecek olan analit için artık seçici olmaz.

16

31

1,3 FENİLENDİAMİN BARİYERİ• 1,3 fenilendiamin(mPD), Pt kayıt bölgeleri için

bariyer oluşturan bir başka kimyasaldır. mPDsolüsyonuna, Pt kayıt bölgelerinde elektropolimerizasyonoluşturabilmesi için bir potansiyel uygulanır. mPD veya derivesi 1,2 fenilendiamin (o-fenilendiamin), karbon mikroelektrotların seçiciliği için ve karbon elektrodunyüzeyinde okside olabilen serotonin gibi moleküllerin yapışmasını ve hata oluşmasını önlemek için kullanıldı. Elektropolimerize olmuş mPD seçiciliği, AA, DA, DOPAC gibi daha büyük moleküllerin kayıt bölgesine ulaşmasını önleyerek yani büyüklüğe göre seçici bariyer oluşturarak sağlar. NO ve Peroksit gibi daha küçük moleküller, matriksten geçebilir. Peroksit, oksidaz enzimleri için haberci molekül olduğundan, bu durum mPD’yi bizim multikanallı mikroelektrotlarımız için ideal bariyer tabakası yapmaktadır.

32

• Elektropolimerizasyon prosedürü, nafion kaplama prosedüründen farklıdır ve bazı avantajları vardır;

• DA, NE, 5-HT’nin Pt kayıt bölgesine ulaşması mPDmatriksi ile önlenir.

• mPD, elektrot enzimle kaplandıktan sonra elektropolimerize edilir. Bu yüzden ilave mPD’ye ihtiyaç duyulursa, mikroelektrot temizlenmeden tekrar mPDelektropolimerizasyonu yapılabilir. Eğer matrikste deney sürensince bir azalma olursa mikroelektrot tekrar kaplanabilir, tekrar kalibre edilebilir ve tekrar kullanılabilir. mPD başarı ile elektropolimerize edildikten sonra sıvıda beklerse matriksini yavaşça kaybeder.

17

33

• 0.05 M PBS solüsyonuna 20 dak. nitrojen gazı uygulanarak oksijen gazı solüsyondan çıkartılır. Sonra 5 mM mPD, gazı alınmış 0.05 M PBS’deçözülür. mPD solüsyonu, ışıktan oksidasyonuönlemek için kahverengi cam şişede depo edilir. Eğer mPD solüsyonu yeşile dönerse, okside olmuştur ve elektopolimerize olmaz. Bu depolama metodlarına rağmen, 5mM mPDsolüsyonu 3 saat içinde okside olabilmektedir. O yüzden solüsyon hazırlandıktan sonra hemen kullanımı tavsiye edilmektedir.

34

• 40 ml, 5mM mPD, 50 ml’lik beher içine konur. Mikroelektrot, tepesi yarıya kadar solüsyona, Ag/AgCl referans elektroduyla sokulur. mPDsolüsyonu hazırlandığı zaman FAST–16 kayıt sistemine adapte edilir. 0.5 voltluk devamlı potansiyel 15 dak. uygulanır (mPD’nin Pt kayıt bölgelerinde elektropolimerizasyonu için). 15 dakika sonra mikroelektrodun tepesi mPDsolüsyonundan çıkarılır. ddH2O ile yıkanır. Kalibrasyondan önce 24 saat oda sıcaklığında bekletilir.

18

35

ENZİM KAPLAMALARI

• OKSİDAZ ENZİMLERİ• Enzimler, elektro aktif olmayan ve bu yüzden

ölçülemeyen maddeleri, peroksit gibi platin kayıt bölgesinde okside olabilen haberci moleküle çevirerek maddelerin ölçümünü sağlarlar. Enzimatik süreçte peroksitin oksidasyonusonrası ölçülen akım, analit konsantransyonuyladirekt olarak orantılıdır. Asetilkolin ve Glutamingibi bazı bileşikler haberci moleküle dönüşebilmek için birden fazla enzime ihtiyaç duyarlar.

36

L-GLUTAMAT OKSİDAZ KAPLAMA PROSEDÜRÜ

• İyice temizlenmiş mikroelektrotlar enzim uygulaması için hazırdır. L-glutamat oksidazın stok solüsyonu, 50 mikrolitre ddH2O ilave edilerek final konsantrasyon 1UI/µl ???? olarak hazırlanır. Tüm protein ve enzimler oda sıcaklığına getirilir. 0.1 gram BSA (sığır serum albümini) 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpünde 985 µl likddH2O ile birleştirilir ve çalkalanır. Çözülme sonrası 5 µl gluteraldehit solüsyonu (%25), BSA karışımına ilave edilir ve karıştırılır. Sonra karışım açık sarıya dönene kadar 5 dk. dışarıda bekletilir.

19

37

• 9 mikrolitre BSA- Gluteraldehit karışımı alınır ve 300 µl mikrosantrifüj tüpüne konur ve 1 mikrolitre L-glutamatoksidaz stok solüsyonu ilave edilir ve pipetle karıştırılır. Bu 10 mikrolitrelik solüsyonun son konsantrasyonları %1 BSA, %0.125 gluteraldehid ve yaklaşık %1 L-glutamatoksidaz içerir. Solüsyonlar 25 µl Hamilton mikro iğnesiyle ucunda küçük damlalar oluşturacak şekilde elektrodunüzerine damlatılır. Bu işlem mikroskop altında yapılır. Solüsyon hızlıca kurur. İnce, ışık geçirebilen ve mikroskop altında görülebilen bir katman oluşur. Aynı yolla kaplamalara birer dakika arayla görülebilir bir film oluşana kadar devam edilir.

38

• BSA ve gluteraldehit, elektrot üzerinde oksidazenzim aktivitesinin uzun süre kalabilmesini sağlar.

• Çok kanallı mikroelektrodun kullanım avantajlarından biri kanallardan bir kısmına enzim karışımı, diğer kanallara ise inaktif protein matriksinin (BSA ve guluteraldehit) aynı anda uygulanabilmesidir. Bu teknik self-referensing(öz-referanslama) adını alır. Enzim veya inaktifprotein matriksi uygulandıktan sonra mikroelektrotlar oda sıcaklığında 48–72 saat bekletilir sonra kalibrasyonları yapılır.

20

39

• Tam kuruma, enzimin mikroelektrot yüzeyine adezyonunu artırır. Bu da L-glutamata karşı daha iyi duyarlık sağlar ve mikroelektrodun raf ömrünü uzatır. Mikroelektrotlar kaplamadan sonraki üç hafta içerisinde kullanılmalıdır. Enzim protein katmanları tam kurumamış olursa, bu katmanlar solüsyona konduğu anda çözünebilir. Optimal kuruma süresi ısıya, neme ve enzim tipine bağlı olarak değişebilir. Nanolitredüzeyinde enzim solüsyonlarının elektrot kaplamada kullanılabilmesi için mikrokaplamacihazı şu an geliştirilme aşamasındadır.

40

KALİBRASYON (ÖLÇÜMLEME)

• Mikroelektrottaki platin kayıt bölgeleri perokside ve L-gutamata farklı cevaplar verebilir. Standart eğimlerin tesbit edilebilmesi için deneyden önce in vitro olarak kalibre edilmesi gerekir. Bu yüzden kalibrasyonlar, L-glutamatın oluşturduğu peroksitten oluşan analitkonsantrasyonundaki değişimi, peroksidin oksidasyonuyla oluşan akım değişimine eşitlemek için kullanılır. Yoğunluğu bilinen analit, 37º’de 40 mililitrelik 0.05 M PBS solüsyonuna eklenir ve FAST–16 sisteminde ölçülebilen pikoamper seviyelerinde bir akım oluşturur.

21

41

• FAST-16 sistem yazılımı, her bir analit ilavesiyle akımları kaydeder. Her bir platin kayıt bölgesi için kalibrasyon eğimi oluşturur ve bu kalibrasyon eğimlerini depolar. Aynı zamanda AA gibi bilinen interferentler, kalibrasyon esnasında teste ilave edilir ve istenen analitininterferente göre seçiciliği test edilir. İn vivodeney esnasında kalibrasyon dataları geri çağırılır ve analitin konsantrasyonunun tespit edilebilmesi için kullanılır.

42

KALİBRASYONUN HAZIRLANMASI

• Nafion kaplı mikroelektrotlar, 37º, 0.05 M PBS solüsyonunda en az bir saat bekletilir. Bu mikroelektrotlar solüsyona bir gece önceden de bırakılabilir. Suya batırma zamanı, analitin nafionkatından daha iyi difüzyonuna ve enzim katmanının aktivasyonuna izin verir. Fakat mPDkaplı mikroelektrotlar suya daldırılmamalıdır. Mikroelektrot ucun, mPD ve kalibrasyon solüsyonunda kaldığı zaman dilimi, uygun enzim aktivasyonu için yeterlidir.

22

43

• Solüsyonlar;• 20 mM AA• 20 mM L-glutamik asit sodyum tuz hidrat• 2 mM DA • 8.8 mM Hidrojen peroksit olarak hazırlanır• Solüsyonlar buzdolabında 4 derecede depolanır.

AA ve hidrojen peroksit günlük taze hazırlanır. L-glutamat haftada bir hazırlanır. DA 0.01 M perklorik asit içeren stok solüsyonu ise ayda birhazırlanabilir.

44

KALİBRASYON PROSEDÜRÜ

• 40 mililitre 0.05 M PBS, 50 mililitre behere konur. İçindeki sıvı 37ºC’ye ısıtılır. Çünkü L-gutamat oksidazın fizyolojik olarak bulunduğu derece 37º’dir. Sıvı küçük karıştırıcı ile yavaşça karıştırılır. Ag/AgCl referans elektrodu solüsyona konur. Mikroelektrodun yarısı solüsyona indirilir.

23

45

Kalibrasyon

• Ameliyat ve elektrot yerleştirme işleminden önce kalibre edilir.

– Seçicilik belirlenir• Askorbat

– Duyarlılık belirlenir• Glutamat

46

• FAST-16 başlangıç bilgileri girildikten sonra, mikroelektrot kayıt bölgesine +0.7 V voltaj uygulanır. Glutamat dışı ölçümlerde farklı voltajlar uygulanabilir. Kalibrasyona başladıktan sonra akımın sabit bir baseline (taban seviye) ’a ulaşması beklenir (10–15 dakika ya da daha uzun). Sabit baseline oluştuktan sonra bilgisayarda baseline tuşuna basılır. Sonra 500 µl, 20 mM AA (interferent), sonuç beher konsantrasyonu 250 µM olacak şekilde eklenir.

24

47

• Yeni bir sabit taban seviyeye ulaşıldığında interferenttuşuna basılır. Sonra üç kere 40 mikrolitre, 20 mM L-glutamat, sonuç beher konsantrasyonu 20, 40 ve 60 mikromolar L-glutamat olacak şekilde ilave edilir. Analither bir ilaveden ve kalibrasyon eğimi oluşumundan sonra kaydedilir. Analitin üç defa daha ilavesinden sonra 40 mikrolitre, 2 mM DA (2 mikromolar son beher konsantrasyonu) test maddesi olarak solüsyona eklenir ve işaretlenir. En son 40 mikrolitre, 8.8 mM hidrojen peroksit mikroelektrot duyarlığını kesinleştirmek için eklenir. Test maddesi, seçiciliği kontrol etmek için eklenir, enzim kaplı ve enzim olmayan öz-referans kayıtlarını normalize etmek için kullanılabilir.

48

• Test maddesinin ilavesi, istenen analitin standart eğiminin hesaplanmasına etki etmez. İn vivo kullanılan tüm kimyasalların, in vitro platin kayıt bölgelerinde elektrokimyasal olarak aktif olmadıklarından emin olunması gerekir. Bir kimyasalın platin kayıt bölgesine deney boyunca uygulanması öncesi elektrokimyasal olarak aktif olup olmadığı önemlidir. Bu durumda in vitroveya in vivo analit yoğunluk değişiminin ilacın lokal uygulamasından veya analitten kaynaklanıp kaynaklanmadığı test sonucu anlaşılmış olur. Kalibrasyonun bitiminde program durdurulur. Data kaydedilir. Mikroelektrot solüsyondan çıkarılır ve depo edilir. Nafion kaplı mikroelektrot uçları, 0.05 M PBS içine konur. mPD mikroelektrotları ise kuru saklanır.

25

49

MİKROELEKTROT KALİBRASYON KRİTERLERİ

• Kalibrasyon esnasında FAST-16 kayıt sistemi, L-glutamatın AA’ya göre seçiciliğini, eğrinin eğimini (analit için mikroelektrodun duyarlığını), tespit limitini (LOD) ve çizgiselliğini (R2) otomatik olarak hesaplar. L-glutamata karşı cevabın R2≥0.99 olması gerekir. Düşük R2, iyi mikroelektrotlarda nadir görülür.

50

-0.7

-0.6

-0.5

-0.4

-0.3

-0.2

-0.10 200 400 600 800

Time (seconds)

Cur

rent

(nA)

-0.7

-0.6

-0.5

-0.4

-0.3

-0.2

-0.10 100 200

Glutamate Conc. (μM)

Cu

rre

nt

(nA

)

LOD - glutamat 0.20µM/s (n=20)

Çizgisellik 0.997 R2

Cevaplama zamanı (500:1 özgüllük

Özgüllük >500:1 ( AA, UA, DOPAC için)

26

51

• Mikroelektrodun eğimi veya duyarlığı, L-glutamattaki değişimin hangi iyilikte ölçülebileceğini gösterir. Eğim, aynı zamanda mikroelektrodun kullanımı için en güvenilir ölçüt olan LOD’unhesaplanmasında da kullanılır. Mikroelektrot seçiminde LOD kullanılır. LOD mikroelektrot için tespit limitidir.

52

• Analit yoğunluğu, kayıt sisteminin arka plan gürültüsünün üç katına eşit elektrot cevabıdır. LOD, bu gürültüye atfedilemeyen, analityoğunluğundaki en düşük tespit edilebilir değişimdir. Kullandığımız mikroelektrotlardaLOD 0,2–1 mikromolardır. Bu da kayıt enzim içeriğine ve bölgelerin kayıt stabilitesine göre değişebilir. Kullanıcı, görmek istediği cevaptan daha düşük LOD’lu mikroelektrotları seçmek zorundadır.

27

53

• Seçicilik; L-glutamatın AA gibi interferentleregöre duyarlılık oranını gösterir. L-glutamateğiminin AA eğimine bölümüyle hesaplanır. 100/1 selektif mikroelektrot demek, 100 mikromolarlık AA konsantrasyon artışının L-glutamatta yalnızca 1 mikromolar konsantrasyon artışına yol açacağını gösterir. 100/1 seçicilikte kullanıcı mikroelektrodun AA’ yı %99 etkinlikte blokladığını bilir. 100/1 ve üstü seçicilik iyi ve idealdir. Fakat 20/1 selektivite oranlarında da mikroelektrotlar kullanılabilmektedir.

54

LOKAL İLAÇ VERMEK İÇİN CAM MİKROPİPETLER

• Kalibrasyonlar tamamlandıktan sonra bir cam mikropipet, elektrota eklenir ve Pt kayıt bölgeleri boyunca uzanır. Bu cam mikropipetsayesinde merkezi sinir sisteminin lokal farmakolojik uygulamaları için ilaç solüsyonları basınçla injekte edilir. Vertikal pipet çekici, cam pipet hazırlamada kullanılır. Isıtarak çekme işlemi yapar. 1 mm dış çap, 0.58 mm iç çapa sahip mikropipet hazırlanır. Mikroskop kullanarak mikropipetin ucu kırılarak, tepesi 12–15 mikromilim olacak şekilde hazırlanır.

28

55

• Cam mikropipet macun ve mumla birlikte kayıt bölgelerinin ortasına gelecek şekilde pozisyonlandırılır. Sonra mumla sabitleştirilir. Camın ucunun seramik yüzeye dokundurulmaması gerekir. Hatta platin kayıt bölgelerinden 50–100 mikron mesafede olması yeğlenmelidir. Bu mesafe, beyine indirildiği zaman mikroelektrot ve cam pipet arasına optimum miktarda merkezi sinir sistemi dokusunun girişine izin verir. Mikroelektrot, kayıt bölgelerine çok yakın olursa, basınçlı sıvının injeksiyonu in vivo dilüsyon etkisi oluşturur. Mesafe uzak olursa; L-glutamatın gliaya daha fazla alımına ve platin kayıt bölgelerine sınırlı difüzyonuna sebep olur.

56Hascup et al 2006

Cam pipetin elektroda göre duruş pozisyonları

29

57

• Tam uygun pozisyonun anlaşılabilmesi için, mikroelektroda mikroskopta iki farklı açıdan bakılması gerekir. Bu uygulama için iki bakış açılı mikroskop geliştirilmektedir. Bunların dışında ikili ve üçlü cam mikropipetlerüretilmiştir. Bu sayede aynı beyin bölgesine iki veya üç farklı ilaç solüsyonu uygulanabilir. Cam mikropipetin ilave edilmesi, deneydeki en zor aşamalardan birisidir. Pratiklik önemlidir çünkü mikroelektrot performansı bozulmadan kısa bir zamanda bu işlemin yapılması gerekir.

58

Elektrod-cam pipet

Hascup et al 2006

30

59

• Önce ilaç solüsyonu 1 ml lik tüberkülin iğnesine çekilir. Sonra 0.22 mikromilimlik steril filtreden geçirilir. Diğer uçtan 30-nolu hipodermik iğneye aktarılır. İğne cam mikropipetin içine sokulur. Cam pipet doldurulur ve hava kabarcığı oluşturulmadığından emin olunur. Hava kabarcığı ilacın basınç injeksiyonuyla etkili bir şekilde ulaştırılmasını önler ve ne kadar sıvının gönderildiğinin ve ne kadar ilacın verildiğinin tespitini zorlaştırır. Mikroelektrot beyine implante edilmeden basınç injeksiyonu test edilir. Solüsyon geri alınması gerekiyorsa 30-nolu iğne sokularak madde geri çekilir.

60

Ag/AgCl REFERANS ELEKTRODU

• Büyük cam Ag/AgCl referans elektrodu, mPDelektropolimerizasyonu ve mikroelektrotkalibrasyonu için uygundur fakat birçok biyolojik uygulama için bu elektrot çok büyüktür. Bu yüzden daha küçük tel yapıda Ag/AgCl referans elektrodu her deneye başlarken hazırlanmalıdır. Minyatür Ag/AgCl referans elektrodu, gümüş telden teflon kaplamayla hazırlanır. Ucu FAST–16 ile ilişkilendirilir. Diğer ucu NaCl ile doyurulmuş 1 M HCl içine yerleştirilir. Bir platin kablo zıt elektrot olarak solüsyona sokulur.

31

61

• 9 volt DC adaptör kullanılır. Uygulanan potansiyel, kloru kabloya hareketlendirir ve AgCl oluşur. Elektrik potansiyeli yaklaşık 10–15 dakika uygulanır. Tam iletim sağlandığında, platin zıt elektroduçevresinde kabarcıklar görülür. Bu minyatür Ag/AgCl referans elektrotları in vivo kullanım öncesi 3 M NaCl içine sokulur.

62

SİNYAL ANALİZİ

• Pikosipritzer III veya ilişkili donanım, FAST 16 kayıt sistemine bağlanır ve cam mikropipettensolüsyonlar basınçla injekte edildiğinde veya deneysel olaylar geliştiğinde yazılım olayları kaydeder. FAST 16 kayıt sistemi, her 4 kanalda otomatik olarak amperometrik veya kronoamperometrik bilgileri, zamanı ve basınç injeksiyon uygulamalarını kaydeder.

• Stereomikroskop cam mikropipetteki basınç injeksiyonu sonrası solüsyondaki değişimi gösterebilir.

32

63

• 70 milimolar KCl’nin basınçla injeksiyonu, depolarizasyona yol açar ve L-glutamatın hücre dışı boşluğa salınımına ve baseline ile karşılaştırılınca L-glutamatta yükselmeye yol açar. Konsantrasyondaki maksimum değişiklik, L-glutamat sinyalinin maksimum amplitüdü olarak düşünülür. Bu değer mikromolar olarak kaydedilir. Sonra sinyalin maksimum amplitüdüsitumulus yapan miktara bölünür (cam mikropipetteninjekte edilen hacim). İnjekte edilen sıvı stereomikroskopla görülür. Hacim değişimi pipetin iç çapına göre kalibre edilir. (Bizim cam pipetimiz milimetresinde 250 nanolitre solüsyon içerir). İnjekteedilen sıvı hacmi nanolitre olarak kaydedilir ve sonra amplitüt/nanolitre (mikromolar/nanolitre) nöronların eksitabilitesini verir.

64

• Sonuçta sinyalin baseline’dan maksimum amplitüdeulaşma zamanı, yükselme zamanı olarak adlandırılır (TR). Maksimum amplitüdden sonra baseline’a doğru sinyal azalması olur. L-glutamatın klirensi L-gutamatınglial ve nöronal taşıyıcılarla hızlı alımı sonucudur. L-glutamat sinyalinin azalması verinin doğal logaritmik taransformasyonunun çizgisel azalmasının eğimidir. Bu da k-1 adını alır. k-1 sinyalin maksimum amplitüdüyleçarpıldığında alım-gerialım oranı veya saniyede ekstraselüler boşluktan uzaklaştırılan L-glutamatınmikromoları elde edilir. Sonuçta sinyal azalması, azalmanın farklı persantillerinde değerlendirilebilir. Genel olarak T50 ve T80 iniş zamanı kullanılır.

33

65

SELF-REFERANS (ÖZ-REFERANS) MİKROELEKTROT ÖLÇÜMÜNÜN ÖNEMİ

• Mikroelektrot tasarımın fotolitografik fabrikasyonunun avantajı dar bir alanda birçok kayıt bölgesine geometrik olarak yerleştirilebilmesidir. Çoklu kayıt bölgeleri, analit sinyalinin kimyasal interferentlerininçıkarılmasına yardımcı olur. L-glutamat oksidaz iki bölgede uygulanır. Diğer iki bölge protein matriks içerir ve sentinel bölgeler adını alır. Sentinel bölge enzim içermeyen kontrol bölgesi olarak da düşünülebilir. L-glutamat oksidaz kaplı platin kayıt bölgeleri hücre dışı L-glutamat konsantrasyonunu tesbit eder ve ayrıca interferentleri (AA, DOPAC, DA, NE,5-HT) tesbit eder. Sentinel bölgeler ise sadece interferentlere cevap verir. Bariyerler de interferentlerin geçişi önler.

66

34

67

• İnaktif protein matriks kaplaması olmayan sentinelbölgeler, interferentlere L-glutamat oksidaz bölgesinden daha hızlı cevap verebilir. Bu nedenle sentinel bölgelerin enzim içermeyen protein matriksle kaplanması gerekir. Protein katları, bu iki bölge arasındaki zamansal kayıt özellikleri arasındaki farklılıkları minimize etmede yararlıdır. Deneysel olarak analitin nitel ve nicel ölçümü için faydalıdır. FAST 16 sisteminde L-glutamat oksidazkaplı bölgede pik görülmüşse ve inaktif protein matrikskaplı bölgede görülmemişse bu iyi nitelikte bir L-glutamatölçümünü göstermektedir. Nicel olarak self-referans metodu daha güçlüdür.

68

Şekil . Paklitaksel verilmiş hayvanda self-referensing yöntemi ile pikin glutamata ait olduğunun gösterilmesi. Değerler ortalama±standart hata olarak ifade edilmiştir. Amplitüt değerleri: Glu ox içeren

grup= 151.40±7.57. Glo ox içermeyen grup= 8.40±3.78, Z: -2.619 (p< 0.01).

35

69

70

Şekil . 0.7 ve 0.2 volt altında glutamat mikroinjeksiyonuyla oluşan amplitütler. Değerler ortalama±standart hata olarak ifade edilmiştir. Amplitüt değerleri: 0.7 volt için= 200±10.58. 0.2 volt

için= 13.33±2.31, Z: -1.99 (p< 0.05).

36

71

• L-glutamat oksidaz kaplı bölgelerden elde edilen akımlardan sentinel bölgelerden elde edilen akımlar çıkarılarak faradaik cevaplar ölçülür. Bu yeni akım, interferentlerden bağımsız L-glutamat yoğunluğu hakkında bilgi verir.

• Öz-referanslama kayıtları, periyodik veya rastlantısal gürültüyü uzaklaştırabilir. Bunun açık bir avantajı, küçük değişimlerin (düşük tespit limitleri) bile gözden kaçmamasını sağlamasıdır. L-glutamat akımlarından sentinel bölge akımlarının çıkarılması ve L-glutamatoksidazın eğimine bölünmesi ile piklerin sinyal gürültü oranı iyi bir şekilde değerlendirilebilir. Gürültü eksiltme yaklaşımı elektro fizyoloji ve spektroskopide de kullanılmaktadır.

72

NÖROTRANSMİTTERLERİN FAZİK SALINIMI

• Artmış KCl uyarımıyla nöronların depolarizasyonu, nörottansmitter salınımının in vivo analizi için ortak bir metottur. Eğer bir uyarı nöronu, sinir lifini ve sinir terminalini depolarizeetmiyorsa; selektif olarak nörotransmittersalıveremez. Aksine solüsyon birçok nörotransmitterin salınımına yol açar. Bu hücre dışı alana ilave nörotransmitter salınımının analitcevabına katkı yapma potansiyeli vardır.

37

73

• DA ve 5-HT merkezi sinir sisteminde NE’ye göre daha yüksek seviyelerdedir ve bu yüzden KCl’ nin uyardığı L-glutamat cevabına katkısı olabilir. Self-referens tekniği ile bu katkılar kolay bir şeklilde uzaklaştırılır. Yapılan çalışmalar DA ve L-glutamatın KCl uygulamasıyla göreceli olarak hızlı salındığını, geri alınırken ise DA’nın L-glutamatla karşılaştırıldığında daha yavaş gerialındığını göstermiştir. Bu yavaş gerialım, in vivo DA sinyalinin L-glutamat sinyalinden ayrıştırılabilmesini sağlar.

74

• DA sinyalinin inişi dakikalar sürerken L-glutamatın inişi saniyeler sürer. Dopamin cevabı, L-glutamat oksidaz kaplı bölgelerde L-glutamatcevabıyla çakışır. Bu bize pik-kubbe cevabı denilen rahat ayrıştırılabilir bir cevap oluşturur. Pik, L-glutamatın hızlı salınım ve gerialınımınakarşılık gelir. L-glutamat cevabı inişe geçtiğinde DA salınımı ve difüzyonu devam etmekte ve daha yavaş geri alınımı kubbe cevabı oluşturmaktadır.

38

75

• Daha önce söylendiği gibi nafion kaplı mikroelektrotlar platin kayıt bölgelerine DA, NE ve 5-HT’ yi çekerler ve mPD kaplaması DA, NE ve 5-HT cevabını her zaman bloke edemeyebilir. Bu yüzden self-referens kayıtları, interferentcevaplarının analit cevaplarından ayrılmasında önemlidir.

• D-Amfetamin, veratridin, tiramin gibi kimyasal uyarılar da nörotransmitter salınımı için kullanılmışlardır.

76

NÖROTRANSMİTTERLERİN TONİK VEYA BAZAL SALINIMI

• Fotolitografik fabrikasyon metotları çoklu kayıt bölgelerinin birbirine yakın şekilde modellenmesini sağlamıştır. Bu bize nörotransmitterlerin bazal seviyelerinin ölçümü için fırsat vermiştir. Bazal salınımlar MSS için önemlidir ve nörotransmitterlerin düşük seviyeleri devamlı olarak hücre dışı alanda bulunur. AA gibi interferentlerin in vivo yüksek yoğunlukları L-glutamat bazal cevabına kısmen katkı yapabilir. Yine self-referens metodu interferent sinyallerinin ortadan kaldırılmasını sağlar.

39

77

• Bir sodyum iyon kanal blokeri olan tetradotoksin (TTX) ve eksitatör aminoasit alım inhibitörü treobenziloksiaspartat (TBOA)’nın lokal uygulamaları ile bazal L-glutamat konsantrasyonları üzerinde çalışılmıştır. Çalışmalar TTX’ in bazal L-glutamatıazalttığı, TBOA’ nın ise L-glutamat oksidaz kaplı mikroelektrotlarda bazal L-glutamatı artırdığı göstermiştir (5). Sentinel bölgeler bu ilaçların verilmesi sonrasında bazal kayıtlar herhangi bir değişiklik oluşturmamıştır. Öz-referanslama mikroelektrodu farmakolojik manipülasyonların etkilerini nitel olarak tespit eder. Bu ölçüm ilacın lokal uygulaması ve FAST-16 kayıt sisteminde görülmesiyle yapılır.

78

• Öz-referanslama prensibi in vivoelektrokimyasal kayıtların geleceğinde önemli olacaktır. Analit kayıt bölgelerine yakın bir kontrol kayıt bölgesi oluşturur. Bu teknik kullanıcıya deney boyunca analitsinyalini kesinleştirici nitel ölçüm imkanı verir. İlave olarak intreferentlerin ve gürültünün veri analizinden çıkarılabilmesi ile hatasız ve analitin küçük konsantrasyonlarının tesbitine imkan verir.

40

79

İN VİVO ANESTEZİYE HAYVAN KAYITLARI

•• Enzim temelli çok kanallı mikroelektrotlarla

anesteziye hayvanlarda in vivo kayıt gerçekleştirebilme bu teknolojinin en önemli olayıdır. L-glutamat, L-laktat, asetilkolin ve kolin ölçümleri sıçan, fare ve maymun beyinlerinden yapılmıştır (20,21,22,23). Sıçan omuriliğinden L-glutamat ölçümü yapılabilmektedir.

80

HAYVAN ANESTEZİSİ VE DENEYİN UYGULANIMI

• Mikroelektrot kalibre edildikten sonra kemirgenler üretan veya kloralhidrat gibi uygun bir anestezikle anesteziye edilir. Karbon fiber mikroelektrotlarla yapılan DA çalışmalarında üretan tercih edilir. Çünkü üretan diğer anesteziklerden farklı olarak ekstraselüleralanda DA klirensini fazla etkilemez. Üretanuzun dönem cerrahi müdahaleleri için faydalıdır. Bu tip deneylerde kullanılan ketamin gibi diğer anestetiklerin glutamaterjik fonksiyonları etkilediği bildirilmiştir (24,25,26).

41

81

• Hayvan anestezi işleminden sonra stereotaksikcihaza yerleştirilir. Hayvanın ısısının 37 derecede tutulabilmesi için hayvan ısıtıcı petlerle yanlardan desteklenir. Kafatasının orta kısmından kesi yapılır. Sıçanlar için 107, fareler için 105 nolu delici ile kafatası delinir ve kafatasının bir kısmı çıkarılır. Forsepsle dura yana alınarak beyin yüzeyine ulaşılır. Ag/AgClreferans elektrodu için küçük bir çukur açılır. Kaplanmış Ag/AgCl referans elektrodu beyne sokulur ve diş sementiyle sabitleştirilir.

82

• Mikromanipülatör, stereotaksik cihaza birleştirilir ve mikroelektrotun çok küçük düzeylerde alçaltma ve yükseltilmesinde kullanılır. Cam mikropipet, mikroelektroda birleştirilir ve solüsyonla doldurulur. Pikosipritzer III, cam mikropipete iliştirilir. Basınçlı injeksiyonlaimplantasyon öncesi kontrol yapılır. Uygunsa mikroelektrot istenen beyin bölgesine indirilir. Kalibrasyon parametreleri FAST–16 kayıt sisteminden geri çağrılır. Mikroelektrot sabit bir baselineye ulaştığında (15-20 dk) deneysel çalışma başlar.

42

83

İMPLANTASYONUN HİSTOPATOLOJİSİ

• Kronik olarak implante edilen L-glutamat elektrodlarınçevre beyin dokusunda ya çok az ya da hiç beyin hasarına yol açmadığı gösterilmiştir. Sıçanlara 2, 4 veya 8 hafta süresince kronik olarak mikroelektrotlar implanteedilmiş ve bu sürelerin sonunda sıçanların beyinleri çıkarılmış, kesitlere ayrılmış ve hem astrositler hem de mikroglialar boyanmıştır. Boyama sonucunda her üç zaman periyodu içinde implant çevresinde kontrol ile kıyaslanınca astrositlerin sayısında ve mikrogliaaktivasyonunda kontrole göre istatistiksel bir fark görülmemiştir.

84

• Prof.Dr. Robert Stephens• Prof.Dr. Fatma Göçer• Doç.Dr. Halis Süleyman• Yard.Doç.Dr. Zekai Halıcı• Araş.Görv. Elif Çadırcı• Araş.Görv. Beyzagül Polat• Dr.A,Mecit Albayrak

• Prof.Dr. Şenol Dane• Prof.Dr. Greg Gerhardt ve

Kentucky Üniversitesi Sensor Teknolojisi Çalışanları

• Doç.Dr. Kenan Gümüştekin• Res.Ass. Chalonda Handy• M.Erdem Sağsöz, PhD

TEŞEKKÜR