oIDENTIFICAÇÃO DE GENES ASSOCIADOS À

RESPOSTAAO ESTRESSE HÍDRICO EM ESPÉCIESSILVESTRES DE ARACHIS

Ana Cristina Miranda BrasileiroEmbrapaRecursos Genéticos e Biotecnologia. Parque EstaçãoBiológica,CP 02372. Final W5 Norte, Brasília, DF - Brasil;

Carolina MorganteEmbrapaRecursos Genéticos e Biotecnologia. Parque EstaçãoBiológica,CP 02372. Final W5 Norte, Brasília, DF - Brasil;EMBRAPASemiárido, CP 23, Petrolina, PE - Brasil.;

Soraya Cristina Macedo Leal-BertioliEmbrapaRecursos Genéticos e Biotecnologia. Parque EstaçãoBiológica,CP 02372. Final W5 Norte, Brasília, DF - Brasil;

Ana Cláudia Guerra AraújoEmbrapaRecursos Genéticos e Biotecnologia. Parque EstaçãoBiológica,CP 02372. Final W5 Norte, Brasília, DF - Brasil;

Amanda Kristina SilvaEmbrapaRecursos Genéticos e Biotecnologia. Parque EstaçãoBiológica,CP 02372. Final W5 Norte, Brasília, DF - Brasil;Universidadede Brasília, Campus I, Brasília, DF - Brasil;

Andressa MartinsEmbrapaRecursos Genéticos e Biotecnologia. Parque EstaçãoBiológica,CP 02372. Final W5 Norte, Brasília, DF - Brasil;

DavidBertioliUniversidadede Brasília, Campus I, Brasília, DF - Brasil;Universidade Católica de Brasília, Campus 11, 916 Norte,Brasília,DF - Brasil.

Patrícia Messenberg GuimarãesEmbrapaRecursos Genéticos e Biotecnologia. Parque EstaçãoBiológica,CP 02372. Final W5 Norte, Brasília, DF - Brasil;

..•.RESUMO - Os mecanismos de resposta desencadeados porplantassubmetidas a condições de seca afetam o seu crescimento,causandosérias limitações à sua produtividade. As respostas daplantaao déficit hídrico têm sido assim uma das ações de pesquisade interesseestratégico e tomaram-se uma importante temáticado melhoramento genético de plantas. Devido à complexidadedas respostas à seca, a análise em larga escala de sequênciasexpressaspode contribuir para a identificação de genes associadosaos mecanismos de tolerância à seca. O presente estudo visaestudaro perfil de expressão (transcritoma) e identificar genesresponsivosao déficit hídrico nas espécies silvestres de Arachismagna e A. duranensis submetidas a estresse hídrico gradual. A

biblioteca SSH de A. magna gerou 759 etiquetas de sequênciasexpressas (ESTs) dos quais 249 unigenes foram identificados.A biblioteca de A. duranensis sequenciada pela tecnologiaRoche/454 obteve 380.601 sequências e resultou num total de12.792 unigenes. A partir da análise in silico desses unigenes, 46genes candidatos relacionados com a resposta à seca tiveram suaexpressão validada por RT-qPCR. As informações produzidasneste estudo serão um recurso valioso para a identificação degenes, caracterização de novos alelos, e desenvolvimento demarcadores moleculares em amendoim.

Palavras-chave: Arachis spp.; seca; trancritoma; genes-candidatos; amendoim

INTRODUÇÃO

A identificação dos genes de uma determinada espécievegetal, e de sua regulação temporal e espacial sob determinadascondições, permite uma compreensão de como característicasde importância agronômica são controladas, sendo um passopara a compreensão da herança dessas características. Aresposta da planta aos estresses biótico e abiótico tem sidoalvo de ações de pesquisa de interesse estratégico e tornou-se uma importante temática do melhoramento genético deplantas. A prospecção e a identificação de novos genes deresistência/tolerância a estresses em plantas, assim como suadisponibilização para programas de melhoramento genéticosão, portanto, prioridade de pesquisa a nível mundial. Para ~nto,deve-se dispor todos os genes contidos em um determinadogenoma dentro de uma perspectiva funcional, tanto em termosmais básicos, visando identificar qual proteína é codificadapor cada gene, quanto no sentido mais amplo, decifrandoo papel de cada gene no funcionamento geral da célula e doorganismo. Paralelamente, o sequenciamento de genomas ea análise massal do transcritoma de várias espécies vegetaistêm possibilitado a prospecção e identificação de novos genesde interesse, gerando um enorme acúmulo de informações edados. Entretanto, a função biológica da grande maioria dosmilhares de genes identificados em vários projetos genomapermanecem desconhecidas e o controle genético da maioriadas características agronômicas ainda precisa ser determinado.

Torna-se, portanto, essencial a análise e validaçãodessas informações visando um estudo mais acurado da funçãobiológica dos genes identificados. A identificação de genesexpressos pela planta em resposta aos diferentes tipos de estresseé um dos passos críticos que levam a elucidação dos mecanismosde tolerância ao estresse hídrico. Até recentemente, a análise da

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expressão dos genes limitava-se ao estudo de um gene de cadavez. Atualmente, os avanços nas tecnologias em larga escalade sequenciamento e de análise do transcritoma possibilitam oestudo simultâneo da expressão e da regulação de vários genesem diferentes processos biológicos. Em termos de plantas, essasinformações nos permitem realizar comparações entre espécies,revelando importantes informações sobre estrutura de genomase mecanismos de evolução, divergência e domesticação.

O presente estudo visa a utilização de tecnologiase estratégias avançadas na área de genômica funcional,especificamente no transcritoma, para buscar genes associadosà resposta ao estresse hídrico em espécies silvestres de Arachisque possuem um comportamento conservador (mais tolerante)em relação à espécie cultivada (mais suscetível). Germoplasmasilvestre constitui uma excelente fonte de genes de resistênciae tolerância, que podem ser identificados e isolados para seremutilizados como marcadores moleculares em programas deseleção assistida ou serem introgredidoslintroduzidos emespécies cultivadas, oferecendo importantes alternativas para omelhoramento do amendoim cultivado (A. hypogaea).

MATERIAL E MÉTODOS

Para alcançar o objetivo da proposta, as seguintes etapasforam real izadas: (i) realização de ensaios de desidrataçãogradual e controlada (tipo dry down) com plantas de Arachismagna e A. duranensis em casa de vegetação; (ii) extraçãodo RNA total a partir de raízes de plantas em condições deestresse hídrico e do respectivo controle irrigado regularmente;(iii) análise e preparo do material para sequenciamento pelatecnologia 454 para o material deA. duranensis; (iv) construçãode uma biblioteca subtrativa (SSH) e sequenciamento pelométodo Sanger para o material de A. magna; (v) análise insilico das sequências obtidas; (vi) identificação de sequênciasassociadas à resposta ao estresse hídrico e (vii) validação daexpressão dos genes candidatos por RT-qPCR.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O transcritoma de plantas de A. magna submetidas aestresse hídrico gradual, e seu respectivo controle não-estressado,foi analisado pela construção de duas bibliotecas subtrativasde cDNA (SSH). A análise in silico revelou 759 etiquetas desequências expressas (ESTs) que foram agrupadas em 249unigenes (138 singlets e 111 contigs), com um índice de novidadede 32,8%. Vários genes foram identificados como sendoregulados positiva- ou negativamente nas condições de estresseou de controle. O perfil de expressão de alguns desses genesdiferencialmente regulados foi validado pela técnica de RT-qPCR,utilizando o cDNA de raízes e folhas. Genes que codificam, porexemplo, glycine descarboxilase, metallothionein-like protein,drought stress responsive protein e duas proteínas desconhecidassão regulados positivamente durante o estresse hídrico enquantoque o gene que codifica para uma disease responsive protein éregulado negativamente durante o estresse hídrico. Assim, esses

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resultados revelaram que a expressão espacial e temporal dessesgenes estão fortemente correlacionados com os dados da análisein silico e com a resposta ao estresse. Os genes-candidatos deA. magna que se revelaram mais promissores serão, no futuro,introduzidos em plantas transgênicas modelo (como Medicagotruncatula) ou alvo (amendoim) a fim de avaliar a regulação dasua expressão e o seu potencial papel nos mecanismos de respostada planta ao estresse.

Dando continuidade às análises do transcritoma, maisrecentemente, a equipe analisou o perfil global de expressãoem dois tecidos (folha e raiz) de plantas de A. duranensissubmetidas a estresse hídrico gradual, utilizando a tecnologia454 de sequenciamento massa!. Uma única meia-corrida desequenciamento 454 GS-FLX- Titanium de duas bibliotecas decDNA (plantas estressadas e não-estressadas) revelou 380.601sequências com um tamanho médio de 293,24 nuc\eotídeos apóslimpeza. Depois do agrupamento (clustering) e da montagem(assembly), um total de 12.792 unigenes foram geradas paraA.duranensis. A interpretação funcional das sequências obtidas foirealizada por atribuições de Gene Ontology (GO), mostrandouma cobertura para uma ampla gama de categorias GO. Mais de29% dos singlets e dos contigs não tiveram correspondência nobanco de dados públicos e um número significativo de sequênciasfoi identificado como sendo diferencialmente expressos entre asduas bibliotecas. Assim como realizado para A. magna, o perfilde expressão temporal e espacial dos genes-candidatos de A.duranensis foi validado pela técnica de RT-qPCR. Um totãl de18 genes candidatos mostrou-se significativamente regulado nascondições de estresse ou de controlo e dois deles (expansina enitrilase) revelaram níveis elevados de expressão diferencialem plantas estressadas, confirmando o seu envolvimento emresposta seca.

CONCLUSÃO.!

O estudo do perfil de expressão em espécies silvestresde Arachis submetidas a estresse hídrico gradual possibilitaráa rápida e eficiente identificação de genes e de suas interaçõesdurante os processos de estresse abiótico. A análise in silicodessas sequências poderá revelar genes-candidatos, auxiliandona construção de um quadro comparativo em termostranscricionais do processo de resposta e adaptação das plantasao estresse hídrico, podendo ser integrado ao conhecimentoatual da tolerância das plantas ao estresse abiótico. Osconhecimentos gerados proporcionarão importantesalternativas com potencial aplicação na biotecnologia(seleção assistida por marcadores, introgressão/introduçãode genes candidatos no amendoim cultivado), visando odesenvolvimento de cultivares de amendoim mais tolerantes àseca e mais adaptadas a condições ambientais adversas. Atravésde estudos de sintenia e genômica comparativa, será possíveltambém estender esses conhecimentos para outras culturas deimportância econômica para o País. Até o momento, este é oúnico trabalho de análise de transcritoma de espécies silvestresde Arachis submetidas ao estresse hídrico.

Heringeriana Brasília v.6. n." I, p.35-36, Agosto de 2012.