Obiljeene imunokemijske metode

Princip imunokemijskih metoda: reakcija At-Ag Ako se u otopinu ili gel s

antitijelom dodaje otopina s antigenom, kod odreene koncentracije antigena (u zoni ekvivalencije) poet e se stvarati precipitat. Ako se dodavanje nastavi, precipitat e se otopiti

Princip razliitih imunokemijskih metoda i u otopini i u gelu

HeidelbergerKendall-ova krivulja precipitacije

Pripadaju najvanijim analitikim metodama u klinikoj kemiji

Princip mjerenja: mjeri se primarna reakcija izmeu Ag i At uz

koritenje obiljeenih reaktanata obiljeivai pojaavaju osjetljivost Monoklonska antitijela - vea specifinost

Podjela: Kvantitativne i kvalitativne metode Metode u otopini i metode na vrstom nosau

Velika osjetljivost metoda: omogueno je mjerenje tvari koje se u organizmu

nalaze u vrlo malim koliinama

Obiljeene imunokemijske metode

Ag

At

Kvantitativne obiljeene imunokemijske metode

Mjerenje koncentracije spojeva koji se u biolokim tekuinama nalaze u vrlo niskim koncentracijama Vitamini, hormoni, tumorski biljezi, autoantitijela....

Antigeni ili antitijela se obiljeavaju razliitim spojevima: radioizotopom - radioimunokemijske metode (RIA) enzimom, inhibitorom, kofaktorom ili supstratom

enzima - enzimimunokemijske metode, (ELISA) luminiscentnim spojem - luminoimunokemijske

metode (LIA) fluorescentnim spojem - fluoroimunokemijske

metode (FIA) i Osjetljivost metoda 10-15 do 10-20 mol/L

Radioimunokemijske metode (RIA) Metode s radioaktivno obiljeenim At ili Ag

Obiljeivai: I125 , I131... Prve obiljeene imunokemijske metode

(inzulin, 1960. god.); vrlo osjetljive Kompetitivni princip testa: Neobiljeeni (hladni") Ag (iz uzorka) se natjeu

za slobodna mjesta na At (iz reagensa) i zamjenjuju radioaktivno obiljeene Ag. Ag vezani za At se centrifugiranjem odvajaju od slobodnih Ag, a radioaktivnost vezanih Ag se mjeri scintilacijskim brojaem (cpm). Koncentracija ispitivanog Ag se oitava iz krivulje

Koncentracija Ag je obrnuto proporcionalna koliini izmjerenih cpm

Odreivanje hormona, autoantitijela (npr. AChR)..

Nedostatak: RADIOAKTIVNOST!

Enzimimunokemijske metode (EIA) Metode kod kojih je Ag ili At obiljeeno enzimom Najee koriteni enzimi: peroksidaza, alkalna

fosfataza Heterogene metode ELISA

Ag ili At se prvo vee na vrsti nosa (epruvete, mikrotitarske ploice, magnetske estice), a zatim se kvantitativno mjeri samo koliina vezanog. Nosa odvaja vezano od nevezanog At ili Ag

Homogene metode EMIT Nema odvajanja vezanog od nevezanog Ag ili At,

jednostavnije Npr. uzorak s nepoznatom koliinom Ag (npr.

serum) mijea se s poznatom koliinom istog Ag obiljeenog enzimom (konjugat). Dodaje se ograniena (poznata) koliina At, a neobiljeeni Ag i konjugat kompetiraju (natjeu se) za vezna mjesta na At. Vezivanjem konjugata s At blokira se enzimska aktivnost. to je vea koliina neobiljeenog Ag vea je enzimska aktivnost.Intenzitet obojene reakcije proporcionalan je koliini Ag u smjesi.

KOMPETITIVNE I NEKOMPETITIVNE METODE

Kompetitivne enzimimunokemijske metode Reakcije se odvijaju uvijek uz viak

Ag (ispitivana supstanca) Ag obiljeen enzimom (konjugat)

mijea se s uzorkom koji sadri nepoznatu koliinu Ag (serum) kompeticija za vezna mjesta na poznatoj koliini At vezanog na nosau

Obiljeeni Ag i neobiljeeni Ag se veu na At u omjeru u kojem su u otopini - to je vie neobiljeenog Ag, manje e se obiljeenog Ag vezati na At - obrnuto proporcionalni odnos

Indikatorska enzimska reakcija: dodatkom supstrata nastaje obojeni spoj, mjeri se intenzitet boje obrnuto proporcionalan koncentraciji ispitivanog Ag

Nekompetitivne enzimimunokemijske metode Heterogene metode, na vrstom

nosau Kod odreivanja koncentracije Ag,

At vezano na nosa je uvijek u suviku u odnosu na ispitivani Ag. U prvoj reakciji se vee sav Ag iz uzorka.

Koriste se dva At: primarno (specifino za Ag kojeg se odreuje) i sekundarno (specifino za primarno At) sendvikompleks

Sekundarno At je obiljeeno enzimom

Odreivanje koncentracije antigena u uzorku

Ag je vezan na vrstom nosau Nakon dodatka uzorka, At (ako su

prisutna) se veu za Ag Sekundarno At obiljeeno enzimom Dodatak supstrata razvija se boja;

intenzitet boje proporcionalan je koliini At u uzorku

Odreivanje koncentracije antitijela u uzorkuNekompetitivne enzimimunokemijske metode

Razliite izvedbe EIA metoda u praksi!

Sloeni sustavi za detekciju stvorenog Ag-At kompleksa

Velika osjetljivost metoda iroka primjena u klinikoj praksi

Kemiluminiscentne imunokemijske metode (ECLIA)

Biotinizirano monoklonsko Ag- specifino antitijelo i monoklonsko Ag-specifino At obiljeeno rutenij-kompleksom reagira s Ag iz uzorka stvarajui sendvi kompleks. U drugoj inkubaciji se sendvikompleks vee za mikroestice obloene streptavidinom putem biotin-streptavidin interakcije

U mjernoj jedinici mikroestice se magnetski veu za povrinu elektrode. Primjenom napona na elektrodu inducira se kemiluminiscentna emisija iji intenzitet se mjeri fotomultiplikatorom

Potpuno automatizirane metode brzina!

Primjer: mjerenje T4 iz seruma

Obiljeene imunokemijske metode -kvalitativne

Specifino dokazivanje, ali kvalitativno (ima-nema)

Najee: imunoblot tehnike Western blot

Princip: proteini se razdvoje elektroforezom u gelu, a razdvojeni proteini se prenesu na vrsti nosa (nitrocelulozni ili najlonski filtar) na kojem se izvodi identifikacijska reakcija (Ag-At)

Imunoblot

1. Prijenos (transfer) proteina s gela na nosa (nitroceluloza)

2. Specifina identifikacija uz pomo monoklonskog ili poliklonskog atitijela

3. Detekcija enzimskom reakcijom nastaje obojeni produkt

Prijenos proteinskih vrpci nakon elektroforeze s gela na membranu s ciljem detekcije na membrani

Princip imunoblota:

I stupanj: prijenos proteina razdvojenih elektroforezom na membranu

Membrane: Nitrocelulozna (NC) Polivinildifluorid (PVDF)

Signal za detekciju(kolorimetrija, kemiluminiscencija)

Enzimski supstratEnzim kovalentno vezan na sekundarno antitijelo

Antitijelo na ciljni protein (primarno antitijelo)

Ciljni proteinMembrana

II stupanj: identifikacija proteina

Sekundarno antitijelo(na primarno)

Primjena imunoblota u laboratorskoj dijagnostici:

Dokazivanje razliitih strukturnih varijanti (fenotipova) proteina npr. alfa-1-antitripsina, haptoglobina, apoproteina i dr.

Fenotipovi alfa-1-antitripsina (deficijentni aleli Z i S)

Primjena IK metoda: brzi testovi

Prednosti imunokemijskih metoda

Vrlo osjetljive Specifina identifikacija Mogunost automatizacije Brzina Cijena?

Nedostaci imunokemijskih metoda Interferencije (obiljeivai) Krine reakcije (vezivanje At na neke

druge supstance osim ciljnog Ag) Nespecifina vezanja (ivotinjska At,

npr. HAMA* uzokuju lano pozitivne nalaze)

Utjecaj matriksa Utjecaj endogenih tvari (npr.

albumina ili komplementa) Hook effect- kod vrlo visokih

koncentracija Ag - lano negativni rezultati zbog potronje At iz reagensa (tumorski biljezi!)

* HAMA=human anti-mouse antibodies

Interferencije se mogu smanjiti kvalitetnim reagensima!