UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO – MATEMATIČKI FAKULTET

DEPARTMAN ZA HEMIJU

Određivanje sadržaja policikličnih

aromatičnih ugljovodonika u uzorcima

kafe

Master rad

Mentor: Autor:

dr Vesna Stankov Jovanović Katarina Petrov

Niš, 2019.

ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ

КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА

Редни број, РБР:

Идентификацион иброј, ИБР:

Тип документације, ТД: монографска

Тип записа, ТЗ: текстуални /графички

Врста рада, ВР: мастер рад

Аутор, АУ: Катарина Петров

Ментор, МН: Весна Станков Јовановић

Наслов рада, НР: Одређивање садржаја полицикличних ароматичних

угљоводоника у узорцима кафе

Језик публикације, ЈП: српски

Језик извода, ЈИ: енглески

Земља публиковања, ЗП: Р. Србија

Уже географско подручје,

УГП:

Р. Србија

Година, ГО: 2019.

Издавач, ИЗ: ауторски репринт

Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33.

Физички опис рада, ФО:

(поглавља/страна/табела/слика) Поглавља 6 /страна 51/табела 8/слика 17

Научна област, НО: Хемија

Научна дисциплина, НД: Аналитичка хемија

Предметна одредница/Кључне

речи, ПО:

Полициклични ароматични угљоводоници,

кафа,QuEChERS,гасна хроматографија, масена

спектрометрија

УДК 547.536 : 663.9

Чува се, ЧУ: библиотека

Важна напомена, ВН: Рад је рађен у лабораторији за аналитичку хемију

Природно-математичког факултета у Нишу

Извод, ИЗ: У оквиру овог мастер рада одређиванa је

концентрација 16 приоритетних полицикличних

ароматичних угљоводоника (ПАУ) у узорцима кафе,

применом ГХ-МС. ПАУ су из узорка екстраховани

применом QuEChERS технике уз употребу смешe

растварача ацетонитрил/вода. Узорци су затим

анализирани методом ГХ-МС. Пирен је у већини

испитиваних узорака присутан у најмањој

концентрацији, а у највећој концентрацији у појединим

узорцима регистровани су аценафтен и фенантрен.

Датум прихватања теме, ДП:

Датум одбране,

ДО:

Чланови

комисије

, КО:

Председник:

др Виолета Митић, ред.проф

Члан: др Јелена Николић, доцент

Члан:ментор: др Весна Станков Јовановић, ред.проф.

ПРИРОДНО – МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ

KEY WORDS DOCUMENTATION

Accession number,

ANO:

Identification number,

INO:

Document type, DT: monograph

Type of record, TR: textual/graphic

Contents code, CC: Universitymasterdegree thesis

Author, AU:

Mentor, MN: Vesna Stankov Jovanović

Title, TI: Determination of polycyclic aromatic

hydrocarbons content in coffee samples

Language of text, LT: Serbian

Language of abstract,

LA:

English

Country of publication,

CP:

Republic of Serbia

Locality of publication,

LP:

Serbia

Publication year, PY: 2019.

Publisher, PB: author’s reprint

Publication place, PP: Niš, Višegradska 33.

Physical description,

PD

Chapters 6/ pages 51 / tables 8/ pictures 17

Scientific field, SF: Chemistry

Scientific discipline,

SD:

Analytical chemistry

Subject/Key words,

S/KW:

Polycyclic aromatic hydrocarbons, coffee,

QuEChERS, gas chromatography, mass

spectrometry UC 547.536 : 663.9

Holding data, HD: library

Note, N:

Abstract, AB: Within this master thesis, the concentration of 16

priority polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH)

in coffee samples was determined using GC-MS.

PAHs were extracted from the sample using the

QuEChERS technique by acetonitrile / water

solvent mixture.The samples were then analyzed

by GC-MS. Pyren was present in the lowest

concentration in most of the analyzed samples,

while acenaften and phenatrene were observed in

the highest concentrations in some samples.

Accepted by the

Scientific Board on,

ASB:

Defended on, DE:

Defended

Board,

DB:

President: Dr Violeta Mitić, full professor

Member: Dr Jelena Nikolić, assistant professor

MemberM

entor:

Dr Vesna Stankov Jovanović, full professor

Eksperimentalni deo ovog master rada je urađen u istraživačkim

labaratorijama Departmana za hemiju Prirodno-matematičkog fakulteta u Nišu.

Želim da se zahvalim svjoj mentorki, profesorki dr Vesni Stankov Jovanović,

redovnom profesoru na Prirodno-matematičkom fakultetu u Nišu na ukazanoj

pomoći prilikom definisanja teme rada, njenih teorijskih okvira i pisanju rada.

Takođe, zahvalila bih se i profesorki dr Violeti Mitić, redovnom profesoru na

Prirodno-matematičkom fakultetu u Nišu na savetima i sugestijama pri pisanju

rada.

Veliko hvala dr Jeleni Nikolić, docentu na Prirodno-matematičkom fakultetu

u Nišu i doktorantu Mariji Dimitrijević na nesebičnoj stručnoj pomoći tokom

izrade celokupnog master rada.

Želela bih da se zahvalim i kompaniji “Dimbo Company” d.o.o. iz Niša,

koja je obezbedila sirovu kafu korišćenu prilikom izrade ovog master rada.

Zahvaljujem se svojim prijateljima i kolegama na pruženoj podršci tokom

studiranja.

Neizmernu zahvalnost dugujem svojoj porodici na bezuslovnoj ljubavi i

podršci koju su mi davali tokom studiranja.

Hvala svima što ste verovali u mene!

Sadržaj:

1. Uvod ................................................................................................................................................... 1

2. Teorijske osnove.................................................................................................................................. 2

2.1. Policiklični aromatični ugljovodonici ............................................................................................ 3

2.1.1. Opšte osobine ......................................................................................................................... 3

2.1.2. Fizičko - hemijske osobine policikličnih aromatičnih ugljovodonika ....................................... 7

2.1.3. Nastajanje i rasprostranjenost policikličnih aromatičnih ugljovodonika ................................... 8

2.1.4. Toksičnost policikličnih aromatičnih ugljovodonika ............................................................. 10

2.2. Kafa ............................................................................................................................................ 11

2.2.1. Opšte osobine kafe ............................................................................................................... 11

2.2.2. Policiklični aromatični ugljovodoici u kafi ........................................................................... 15

2.3 Analiza policikličnih aromatičnih ugljovodonika .......................................................................... 15

2.3.1. Uzorkovanje ......................................................................................................................... 15

2.3.2. Ekstrakcija ........................................................................................................................... 16

2.3.3. Prečišćavanje ....................................................................................................................... 17

2.3.4. QuEChERS (kačers) tehnika ................................................................................................ 18

2.3.5. Instrumentalna analiza ......................................................................................................... 18

2.3.6. Pregled literature .................................................................................................................. 21

2.4. Validacija analitičkih metoda ...................................................................................................... 22

2.4.1. Specifičnost/selektivnost ...................................................................................................... 22

2.4.2. Linearnost ............................................................................................................................ 23

2.4.3. Opseg metode (radno područje) ............................................................................................ 23

2.4.4. Preciznost ............................................................................................................................ 23

2.4.5.Tačnost ................................................................................................................................. 24

2.4.6. Granica detekcije.................................................................................................................. 25

2.4.7. Granica kvantifikacije ......................................................................................................... 26

3. Eksperimentalni deo .......................................................................................................................... 27

3.1. Aparati........................................................................................................................................ 28

3.2. Rastvori i reagensi ...................................................................................................................... 28

3.3. Priprema model uzorka kafe ........................................................................................................ 28

3.4.Optimizacija QuEChERS (kačers) tehnike za ekstrakciju PAU iz uzoraka kafe ............................ 29

3.5. GC – MS analiza ......................................................................................................................... 30

3.6. Analiza realnih uzoraka............................................................................................................... 31

4. Rezultati i diskusija ........................................................................................................................... 32

4.1. Optimizacija i validacija QuEChERS (kačers) tehnike za analizu policikličnih aromatičnih

ugljovodonika u uzorcima kafe .......................................................................................................... 33

4.1.2. Parametri validacije metode za analizu model uzoraka kafe pripremljenih QuEChERS (kačers)

tehnikom upotrebom smeše acetonitril/voda i klinoptilolita kao sorbensa ....................................... 37

4.2. Analiza sadržaja PAU u realnim uzorcima kafe ........................................................................... 40

5. Zaključak .......................................................................................................................................... 47

6. Literatura ........................................................................................................................................... 49

1. Uvod

1

Policiklični aromatični ugljovodonici (PAU), su organska ugljovodonična jedinjenja koja

sadže dva li više kondenzovanih prstenova. U prirodi nastaju kao posledica nepotpunog

sagorevanja nafte, uglja, drveta, otpada i drugih organskih supstancija. To su nepolarna, lipofilna

jedinjenja koja lako isparavaju. Mogu se podeliti na PAU male i velike molekulske mase. PAU

male molekulske mase („laki“ PAU) lako se rastvaraju u vodi, dok se povećanjem molekulske

mase rastvorljivost u vodi smanjuje. Policiklični aromatični ugljovodonici velike molekulske

mase su poznati i kao „teški“ PAU.

PAU imaju dug period degradacije u životnoj sredini i toksično delovanje, pa se

svrstavaju u dugotrajne organske zagađujuće supstancije. Ova grupa jedinjenja je veoma

rasprostranjena u atmosferi, hidrosferi i litosferi.Takođe se mogu naći i u mnogim namiricama

kao što su: biljna ulja, meso sa roštilja, voće, morska hrana, čaj, kafa i mnoge druge. Njihovo

prisustvo u namirnicam i hrani može poticati iz zagađene sredine, gde su dospeli kroz lanac

ishrane ili mogu biti rezultat načina pripreme hrane, koji obično podrazumeva termičku obradu.

Zbog potencijalnog kancerogenog, mutagenog i teratogenog dejstva koje imaju kako ova

jedinjenja, tako i proizvodi njihove degradacije, važno je praćenje njihove koncentracije u

uzorcima iz životne sredine i hrane. Granične koncentracije PAU su propisane za različite uzorke

iz životne sredine, kao i za uzorke hrane.

Postoji preko 100 PAU, ali je za 16 njih (naftalen, acenaftilen, acenaften, fluoren,

fenantren, antracen, fluoranten, piren, benzo[a]antracen, hrizen, benzo[b]fluoranten,

benzo[k]fluoranten, benzo[a]piren, dibenzo[a,h]antracen, benzo[g,h,i]perilen i indeno[l,2,3-

cd]piren) preporučena analiza i praćenje koncentracija.

Pečenje zrna kafe presudan je korak u proizvodnji kafe, jer se time obezbeđuje posebna

aroma, boja i ukus, odnosno određuje se u značajnoj meri kvalitet kafe. Taj proces može dovesti

do stvaranja PAU, s obzirom da se sirova kafa tretira termički.

Analiza PAU je složen proces i sastoji se iz više osnovnih koraka: uzimanje uzorka, ekstrakcija

PAU, prečišćavanje dobijenih ekstrakata i instrumentalna analiza PAU. Za ekstrakciju PAU se

koriste slabo polarni organski rastvarači. Pošto organski rastvarači nisu dovoljno selektivni, iz

uzorka se pored PAU ekstrahuju i neka druga jedinjenja, pa se njihovo uklanjanje postiže

prečišćavajem dobijenog ekstrakta.

Cilj ovog master rada je određivanje policikličnih aromatičih ugljovodnika u uzorcima

kafe gasnom hromatografijom sa masenom spektrometrijom (GC-MS). Najpre je izvršena

optimizacija i validacija metode za određivanje PAU, pripremom i analizom model uzoraka, a

potom je metoda sa optimalim analitičkim karakteristikama primenjena za analizu realnih

uzoraka kafe. U ovom radu kvantifikovano je 16 prioritetnih PAU koje su propisale Evropska

unija i Agencija za zaštitu životne sredine Sjedinjenih američkih država.

2

2. Teorijske osnove

3

2.1. Policiklični aromatični ugljovodonici

2.1.1. Opšte osobine

Policiklični aromatični ugljovodonici (PAU ili eng. PAH), su jedna od

najrasprostranjenijih grupa organskih jedinjenja u životnoj sredini. Hemijski gledano to su

organska jednijenja koja sadrže dva ili više kondenzovanih prstenova, koji su sastavljeni

pretežno od ugljenika i vodonika. Tu spadaju i neki derivati PAU kod kojih atomi ugljenika

mogu biti zamenjeni atomima azota, kiseonika ili sumpora, čineći tako heterociklična jedinjenja.

Postoji oko 100 različitih vrsta PAU sa različitim brojem kondenzovanih prstenova. Osim što se

razlikuju po broju prstenova, mogu se razlikovati i po načinu vezivanja istih. Tako se PAU sa

istim brojem kondenzovanih prstenova mogu razlikovati u pogledu fizičko-hemijskih osobina, u

zavisnosti da li su prstenovi povezani linearno, uglovno ili u obliku klastera. Policiklični

aromatični ugljovodonici koji su najviše zastupljeni u životnoj sredini sadrže od dva do sedam

benzenovih prstenova (Lundstedt S., 2003.).

Zbog svoje toksičnosti i perzistentnosti PAU se detaljno proučavaju sa ciljem zaštite

životne sredine. Agencija za zaštitu životne sredine Sjedinjenih američkih država (eng.

Environmental Protection Agency, EPA USA) je definisala 16 prioritetnih PAU čije se

koncentracije prate u životnoj sredini. Lista prioritetnih PAU data je u Tabeli 1.. (Nikolić J.,

2018.)

Tabela 1. Formule prioritetnih policikličnih aromatičnih ugljovodonika

Naziv Strukturna formula Molekulska

formula CAS broj

Molekulska

masa

Naftalen

C10H8 91-20-3 128

Acenaftilen

C12H8 208-96-8 152

Acenaften

C12H10 83-82-9 154

Fluoren

C13H10 86-73-7 166

Fenantren

C14H10 85-01-8 178

4

Antracen

C14H10 120-12-7 178

Fluoranten

C16H10 206-44-00 202

Piren

C16H10 129-00-0 202

Benzo[a]antracen

C18H12 56-55-3 228

Hrizen

C18H12 218-01-9 228

Benzo[b]fluoranten

C20H12 205-99-2 252

Benzo[k]fluoranten

C20H12 207-08-9 252

Benzo[a]piren

C20H12 50-32-8 252

Indeno[1,2,3-cd]piren

C22H12 193-39-5 276

5

Dibenzo[a,h]antracen

C22H14 53-70-3 278

Benzo[g,h,i]perilen

C22H12 191-24-2 276

Policiklični aromatični ugljovodonici mogu se podeliti na- PAU niskih moleklskih masa

(light molecular weight – LMW), koji sadrže dva do tri kondenzovana prstena, i PAU visokih

molekuskih masa (high molecular weight – HMW), koji sadrže četiri i više prstenova. U životnoj

sredini se najčešće nalaze PAU sa pet i šest kondenzovanih prstenova.

Slika 1. Označavanje ugljinikovih atoma u PAU

6

Postoji nekoliko načina za imenovanje PAU- jedan od njih je trivijalna nomenklatura

(koja ima najveću primenu) i nomenklatura koju je ustanovila Međunarodna unija za čistu i

primenjenu hemiju (International Union of Pure and Applied chemistry – IUPAC), koja se

zasniva na sledećim pravilima (Slika1.)

1. Struktura jedinjenja piše se tako da najveći broj prstenova leži u horizontalnom redu;

2. Horizontalna i vertikalna osa povlače se kroz centar horizontalnog reda, a molekul se

orijentiše tako da maksimalan broj prstenova, koji ne leže u horizontalnoj ravni, bude u

gornjem desnom, a minimalan u donjem levom kvadrantu;

3. Atomi ugljenika se numerišu u smeru kazaljke na satu, pri čemu se sa numeracijom

počinje od ugljenika koji nije deo ni jednog drugog prstena i koji se nalazi na gornjem

desnom prstenu, dok se ugljenikovi atomi koji su deo dva ili više prstenova ne numerišu;

4. Veze između dva atoma koji nisu zajednički za dva ili više prstenova, obeležavaju se sa 1

ili 2;

5. Jedinjenje (ili izomer) koje sadži neki supstituent imenuje se tako što se neposredno

ispred naziva supstituenta u zagradi napiše odgovarajući broj ugljenikovog atoma ili

slovo, kako bi se označilo na kom mestu je došlo do supstitucije.

Pravilo numeracije atoma ugljenika u PAU ilustrovano je na Slici 2.

Slika 2. Pravilo numeracije atoma ugljenika u PAU

7

2.1.2. Fizičko - hemijske osobine policikličnih aromatičnih ugljovodonika

Fizičko - hemijske osobine PAU variraju u zavisnosti od njihove strukture i molekulske

mase (Tabela 2.). Čisti PAU su čvrste, nepolarne supstance, obično obojene belo, bledo zeleno ili

žuto, a neke mogu biti u vidu zelenih kristala. Imaju uglavnom visoke tačke ključanja i tačke

topljenja. (Maagel i sar., 1998.)

Tabela 2. Fizičko – hemijske osobine policiklličnih aromatičnih ugljovodonika

PAU Rastvorljivost

(mmol l-1)

Tačka

topljenja

(ºC)

Tačka

ključanja

(ºC)

Log

Kow

Napon

pare

25 ºC (Pa)

Naftalen 2,4 x 10-1 81 218 3,37 10,9

Acenaftilen n.p. 92 265 3,98 n.p.

Acenaften 2,9 x 10-2 96 278 4,07 5,96 x 10-1

Fluoren 1,2 x 10-2 116 295 4,18 8,81 x 10-2

Fenantren 7,2 x 10-3 101 339 4,45 1,8 x 10-2

Antracen 3,7 x 10-4 216 340 4,45 7,5 x 10-4

Fluoranten 1,3 x 10-3 111 375 4,90 2,54 x 10-1

Piren 7,2 x 10-4 156 360 4,88 8,86 x 10-4

Benzo[a]antracen n.p. 160 435 5,61 7,3 x 10-6

Hrizen 5,7 x 10-7 255 448 5,16 1,3 x 10-5

Benzo[b]fluoranten n.p. 168 481 6,04 1,2 x 10-7

Benzo[k]fluoranten n.p. 217 481 6,06 5,5 x 10-8

Benzo[a]piren 8,4 x 10-7 175 495 6,06 1,5 x 10-5

Indeno[1,2,3-cd]piren n.p. 164 536 6,58 n.p.

Dibenzo[a,h]antracen 3,7 x 10-10 267 524 6,50 0,8 x 10-6

Benzo[g,h,i]perilen 6,0 x 10-8 277 n.p. 6,84 2 x 10-5

Log KOW - vrednost koeficijenta raspodele u sistemu oktanol-voda; n.p.- vrednost nije pronađena

Svi PAU, izuzev naftalena se slabo rastvaraju u vodi. Rastvoriljivost u vodi opada sa

porastom njihove molekulske mase, odnosno sa porastom broja kondenzovanih aromatičnih

prstenova. Na rastvorljivost PAU veliki značaj ima i temperatura, npr. sa povećanjem

temperature od 5 na 30C, rastvorljivost PAU u vodi može se povećati tri do četiri puta. Ova

8

jedinjenja su veoma lipofilna, dobro se rastvaraju u nepolarnim organskim rastvaračima, kao i u

organskim kiselinama.

Kao što je slučaj sa rastvorljivošću, tako i napon pare opada sa porastom broja

kondenzovanih aromatičnih prstenova. Napon pare veoma utiče na perzistentnost PAU, pre

svega u akvatičnom ekosistemu. PAU sa dva ili tri prstena odlikuju se srednjim naponom pare i

relativno su isparljivi, dok oni sa četiri ili više aromatičnih prstenova imaju nizak napon pare i

slabo su isparljivi. (Skupinska i sar., 2004)

PAU se odlikuju relativno visokim koeficijentom raspodele oktanol-voda, što ukazuje na

njihov visok potencijal adsorpcije na čvrstim suspendovanim česticama i mogućnost njihove

biokoncentracije u živim sistemima. Hemijski gledano PAU su veoma stabilna jedinjenja, imaju

karakteristične UV spektre, otporni su na fotorazgradnju i imaju sposobnost fluoresciranja.

Prema nekim istraživanjima utvrđeno je da su PAU adsorbovani na česticama

suspendovanim u vodi otporniji prema fotodegradaciji od PAU koji se nalaze u rastvoru.

Fotooksidacija može hemijski transformisati PAU u jedinjenja koja su kancerogenija i toksičnija

od polaznih jedinjenja.

2.1.3. Nastajanje i rasprostranjenost policikličnih aromatičnih ugljovodonika

Mehanizam nastajanja PAU nije u potpunosti razjašnjen, a glavne reakcije u kojima nastaju su

piroliza i pirosinteza. Jedan od mehanizama nastajanja PAU je Dils-Adlerova cikloadicija (Slika

3.).

Slika 3. Mehanizam nastajanja policikličnih aromatičnih ugljovodonika

Dobijena policiklična jedinjenja su termostabilna, dok su polazna jedinjenja nestabilna na

povišenim temperaturama; udeo PAU je veći pri višim temperaturama (oko 500C); na nižim

temperaturama (oko 100-150C) mogu nastati supstituisani policiklični aromatični

ugljovodonici. (Larsen,2002.)

Izvori PAU se mogu podeliti na prirodne i antropogene.

9

U prirodi se PAU mogu formirati na tri načina:

pirolizom organskih supstancija na visokim temperaturama (sagorevanjem dolazi do

stvaranja slobodnih radikala manje molekulske mase),

dijagenezom sedimentnih organskihsupstancija na niskim ili srednjim temperaturama-tako

dolazi do formiranja fosilnih goriva i

direktnom biosintezom od strane mikroorganizama ili biljaka. (Nikolau i sar., 2009.)

Do povećanja sadržaja PAU u atmosferi dovode sve vrste požara, pre svega šumski

požari i spaljivanje poljoprivrednih otpadaka. Količina PAU i čestičnih materija koje su nastale

na ovaj način varira u zavisnosti od vrste organskih supstancija koje sagorevaju, kao i od prirode

i intenziteta plamena. PAU koji su nastali iz požara imaju tendenciju sorpcije na česticama

supstancija koje se nalaze u atmosferi, i na taj način se postepeno talože u terestičnim i

akvatičnim ekosistemima.

PAU u atmosferi mogu podleći fotolitičkim i hemijskim transformacijama. Vetrom mogu

biti transportovani na velike udaljenosti. Pored požara, značajan prirodni izvor PAU su fosilna

goriva. PAU su prirodno prisutni u bituminoznim fosilnim gorivima (ugalj i nafta). Proces koji

vodi formiranju PAU koji su sadržani u ovim gorivima naziva se dijageneza. Dijageneza

podrazumeva sagorevanje organskih supstancija na 100-150 C u dužim vremenskim periodima.

Ovaj proces dovodi do formiranja alkilovanih PAU, a nastajanje nesupstituisanih PAU je

zanemarljivo. Oko 70-75% ugljenika sadržanog u uglju nalazi se u aromatičnom obliku, gde su

šestočlani aromatični prstenovi dominantni, a petočlani prstenovi su zastupljeni znatno manje.

Prisustvo PAU kao što su benzoaantracen, benzoapiren, benzoepiren, perilen,

fenantren, dibenzoc,d,mpiren identifikovano je u uzorcima uglja. Većina fosilnih goriva se

nalazi deponovana duboko u zemlji, pa postoji vrlo mala verovatnoća da dodje do emisije PAU

iznad Zemljine površine. Ostali prirodni izvori PAU su vulkanska aktivnost i biosinteza od strane

bakterija ili biljaka. Prirodni izvori PAU imaju minimalan doprinos u njihovom ukupnom

sadržaju u životnoj sredini. Koncentracije PAU variraju u zavisnosti od okoline. Koncentracije

su veće u blizini izvora emisije, poput proizvodnje ili upotrebe fosilnih goriva, ili proizvoda

dobijenih iz fosilnih goriva, kao što su katran ili kerozin.

Tokom zime najviše PAU potiče od sagorevanja čvrstog goriva u domaćinstvima i

toplanama. Povećanju koncentracije PAU u atomosferi, doprinosi emisija izduvnih gasova

motornih vozila.Velika količina PAU nastaje u procesima prerade hrane, kao što su dimljenje,

sušenje, roštiljanje, kuvanje i prženje. Na temperaturama većim od 200 C pirolizom masti dolazi

do formiranja PAU. Organske supstancije prisutne u hrani, kao što suproteini i ugljeni hidrati,

pirolizom mogu doprineti formiranju PAU, ali je glavni izvor PAU iz hrane-piroliza masti. Način

termičke obrada mesa (količina masti u mesu i blizina plamena) na roštilju utiče na formiraje

PAU. PAU koji je načešće prisutan u uzorcima hrane je benzo[a]piren, anjegova količina je

odličan indikator za određivanje zagađenosti hrane policiličnim aromatičnim uglovodonicima.

10

2.1.4. Toksičnost policikličnih aromatičnih ugljovodonika

PAU su široko rasprostranjena jedinjenja, koja se mogu nalaziti u vazduhu, zemlji, vodi,

a putem lanca ishrane mogu se uneti u ljudski organizam. Većina PAU su toksične supstance, a

mogu imati kancerogeno, mutageno i teratogeno delovanje.

U industrijskim zonama i urbanim sredinama, vazduh je kontaminiran različitim

zagađjućim jedinjenjima. Kao značajni zagađivači vazduha izdvajaju se i PAU. Pored

respiratornog sistema, čovek može uneti PAU u organizam i preko kože, kao i konzumacijom

hrane koja već sadrži PAU, kao što je na primer pečeno meso ili riba kontaminirana ovim

jedinjenjima.

Različita struktura PAU pokazuje različitu kancerogenu aktivnost, koja raste sa

uvođenjem funkcionalnih grupa u molekul PAU. Sa povećanjem molarne mase raste i

kancerogenost PAU, dok se akutna toksičnost smanjuje. Nesupstituisani PAU nisu jedinjenja

koja reaguju sa DNK, već moraju da se metabolitički aktiviraju i prevedu u jedinjenja koja bi

pokazala svoje genotoksično i kancerogeno delovanje. Kada se PAU nađe u organizmu čoveka,

dospeva u krv i limfu i metaboliše se u jetri i bubrezima. Apsorpcija policikličnih aromatičnih

ugljovodonika u organizam je uslovljena njihovom lipofilnošću.

Prema Internacionalnoj agencija za za istraživanje raka (IARC) većina PAU smatra se za

kancerogene, ali najveći kancerogeni potencijal pokazuje benzo[a]piren, koji je svrstan u prvu

grupu kao dokazani kancerogen (IARC, 2010). Pored benzo[a]pirena dokazani kancerogeni su i

naftalen, hrizen, benzobfluoranten, benzokfluoranten, dibenzo[a,h]antracen, dibenzo[a,e]piren

i dibenzo[a,l]piren. Ova aktivnost je otkrivena primenom pomenutih PAU na eksperimentalnim

životinjama.

Metabolitička aktivnost benzoapirena prikazana je na Slici 4. U prvoj fazi metabolizma

dolazi do formiranja epoksida tako što se vrši oksidacija odgovarajućim enzimima (citohrom P

450). Dobijeni epoksidni intermedijer se redukuje i prelazi u fenol ili se hidrolizuje do

dihidroksi-7,8 dihidrobenzo(a)pirena. Ovi proizvodi se zatim mogu konjugovati sa sumpornom

ili glukuronskom kiselinom i tako formirati proizvod koji se može izlučiti iz organizma.

(Lundstedt, 2003).

Slika 4. Metabolitička aktivnost benzoapirena

11

2.2. Kafa

2.2.1. Opšte osobine kafe

Kafa je najpopularniji napitak na svetu, a dobija se pripremanjem mlevenog zrna

istoimene višegodišnje žbunaste biljke (lat. Coffea). Pripada familiji Rubiaceae. Biljka kafa

može da dostigne visinu od 2 do 5 m, ako se ne obrađuje mogla bi da dostigne visinu od 10 m.

Idealna temperaturaje za uzgoj ove kuture je od 12 do 27C, uz veliku količnu kiše. Cvetovi su

joj igličasti, bele boje. Plod je zelene boje, a u fazi zrenja dobija žućkastu boju koja potamni i

dobija crvenkastu nijansu, i tada je plod spreman za branje. Unutar ovog ploda nalaze se dva zrna

koja su zelenkasto - braon boje. Nakon termičke obrade zrno postaje tamno braon, puca i dobija

prepoznatljiv izgled kafe.

Zemlja porekla kafe je Etiopija. Sa prostora afričke visoravni, kafa se u devetom veku

odomaćila u Arabiji odakle potiče napitak koji mi danas znamo kao kafu. Dvojica Sirijaca su

1555. prvi put doneli kafu u Carigrad. Tu su kafane bili objekti gde se isključivo konzumirala

kafa. Mletački trgovci je 1570. donose u Veneciju i kafa se polako širi čitavom Evropom. Najpre

je bila luksuz, koju je konzumirao samo najbogatiji sloj društva. Sa povećanje uvoza kafe, ona

se ubrzo raširila u svim domaćinstvima i postala deo svakodnevnice čoveka. Proizvodnja kafe je

danas druga najjača industrija u svetu posle nafte.

Postoji mnogo vrsta kafa, ali samo dve vrste se najviše koriste u svetu- to su Arabika i

Robusta. Među ostalim vrstama poznate su Arabusta, nastala ukrštanjem Arabike i Robuste,

Liberica i Excelsa (liberijske kafe), Stenophylla (kafa iz Sijera Leona), Mogeneti i Bonnieri (bez

kofeina), Gallienii (sa kofeinom).

Arabika potiče sa jugozapadnih predela Etiopije. To je prva vrsta kafe koju su ljudi

upotrebljavali, koja uspeva nanadmorskoj visini od 1300 do 1500 m. Stablo je osetljivije na

vremenske promene i upotrebu pesticida od Robuste. Sadrži oko 1,5% kofeina, ima bogat i

prefinjen ukus i manju kiselost zrna. Zbog toga se smatra superiornom i kvalitetnom vrstom kafe.

Robusta potiče iz centralnog dela Afrike. Otpornija je na spoljašnje uticaje i upotrebu

pesticida od Arabike. Nije bila poznata kao vrsta kafe sve do 1897. Pogodnija je za uzgajanje ali

je slabijeg kvaliteta od Arabike. Sadrži oko 2,7% kofeina, ima snažan i jak opor ukus, najčešće

se upotrebljava za dobijanje instant kafe. Zbog njenog intenzivnog gorko-kiselkastog ukusa u

proizvodnji kafe često se meša sa Arabikom. Kafa koja u sebi sadrži Robustu pravi bolju penu.

Osnovna razlika između Arabike i Robuste prkazana je na Slici 5.

12

Slika 5. Razlika između vrsta kafe arabike i robuste

Tehnologija proizvodnje kafe obuhvata tri osnovne faze:

1. pečenje kafe;

2. mlevenje kafe;

3. pakovanje kafe.

Da bi se dobilo pravo svojstvo i karakterističan miris i ukus kafe, potrebna je termička obrada

sirovog zrna. Pečenje je tehnološki postupak toplotne obrade, gde se za obradu koristi topao

vazduh, dok se kod prženja za obradu koristi ulje, pa je zbog toga ispravnije reći da se kafa peče

a ne prži. Aroma se stvara od kompleksa koji je mešavina isparljivih komponenata, a neisparljive

komponente određuju kiselost, gorčinu i ukus.

Proces pečenja kafe deli se u tri faze:

1. inicijalna faza toplotne obrade;

2. prava faza toplotne obrade;

3. završna faza toplotne obrade.

Prva faza je početna faza pečenja zrna kafe. Ova faza je u stvari sušenje zrna kafe, gde dolazi do

smanjenja vlažnosti zrna. Menjaju se miris i boja sirovog zrna, od zelene do zlatno-žute boje. U

drugoj fazi zrno je dvostruko manje, dolazi do otpuštanja velike količine ugljen-dioksida i

nekoliko stotina supstanci koje se udružuju u jedinstvenu aromu kafe. Ovde zrno dobija tamno

braon boju. U početku je proces egzoterman. Reakcija pirolize dostiže maksimum na 220-250C,

kada proces postaje endoterman i dolazi do osobađanja isparljivih komponenata. Reakcije

postaju ponovo egzotermne na temperaturi od 250C. Tokom pečenja, kao rezultat pirolize, se

dobija karakteristična aroma i ukus kafe. Toplota prouzrokuje i rast zapremine, osobađajući

ugljen-dioksid. Tada dolazi do „kokičavog praska“- u ćelijama zrna kafe se oslobađa gas pod

13

pritiskom od oko 26 bara.Vreme i temperatura pečenja zavisi od same vrste kafe koja se termički

obrađuje. Vreme pečenja kreće se od 90 sekundi do 40 minuta u zavisnosti od vrste kafe.U

periodu od jedanaestog do dvanaestog minuta se razvijaju stotine aroma, smanjuje se kiselost i

šećer, a gorčina se povećava. Treća faza je završna faza, i tu se vrši brzo hlađenje da bi se

zaustavile egzotermne reakcije. Za hlađenje se koristi vazduh ili voda, a smatra se da je najbolja

kafa ona koja se naglo ohladi vodom.

U različitim delovima sveta pije se kafa različitog stepena pečenja. Stepen pečenja kafe

može se definisati i prema boji zrna (slika 6.):

lako (svetlo) pečenje – na temperaturi od 205C, zrno kafe bojom podseća na cimet, pa se

ovakva vrsta pečenja naziva i „cimetno“ pečenje. Ovako ispečena kafa je slatkog i blago

kiselog ukusa, grubo se melje pa se koristi za „filter kafu“;

srednje pečenje – na temperaturi od 219C, zrno je tamno smeđe boje, koristi se za

tzv.“tursku kafu“. Ovakvo zrno posle pečenja je uljasto, a aroma izražena i prijatna.

tamno pečenje – na temperaturi od 240C, zrno dobijeno ovim načinom pečenja je tamno

braon do crne boje, sa sjajnom površinom koja potiče od oslobođenog ulja. Ovim

načinom pečenja dobija se „espresso“kafa, pa zbog toga može se nazvati i „espresso“

pečenje. Ovako pečena kafa sejoš naziva i „francuska kafa“. Sadrži znatno manje kofeina

od polazne kafe, zbog intenzivne termičke obrade.

Italijansko pečenje – na temperaturi od 245C, zrna postaju gotovo crne boje, kiselost je

gotovo uklonjena.

Slika 6. Stepeni pečenja kefe

Od kafe se prave različiti topli napici, od kojih su najpopularniji klasična kafa ili

takozvana „turska“kafa, espresso, macchiato, cappuccino, caffe latte, affogato, flat white, caffe

Americano, caffe Coretto, Ice coffe, coffe Mexicano, Irish coffe i mnoge druge.

14

Pored kafe koja se dobija samo iz čistog zrna kafe postoji i tzv. surogat kafa. Surogat

kafu čine prženi plodovi i prženi delovi biljaka bogatih skrobom, šećerima, inulinom koji

prokuvani ili rastvoreni u vodi daju napitak koji se koristi kao zamena za kafu ili se dodaje kafi.

Osnovna sirovina za proizvodnju surogata može da bude ječam, raž, pšenica, rogač, soja i dr.

Većina kafa koja se konzumira nije u potpunosti napravljena samo od zrna kafa, već sadrži

surogat.

Espresso je topli napitak od kafe koji se dobija prolaskom vode pod velikim pritiskom

kroz mlevenu, usitnjenu kafu. Uglavnom je gušći od kafe koja se pravi drugim metodama, ima

veću koncentraciju suspendovanih i rastvorenih čvrstih materija, a na vrhu ima kremu. U napitke

od kafe se dodaju šećer, mleko (caffe latte, cappuccino…), sladoled (kafa affogato), alkohol

(Irish coffe), cimet, smokva, čokolada i mnogi drugi dodaci.

Najskuplja i izuzetno retka kafa je Kopi luvak (kopi luwak) koja potiče sa Filipina i

Indonezije. Ova kafa se dobija iz izmeta cibetke, male životinje iz porodice sisara. Cibetka se u

Indoneziji naziva luvak, a kafa se naziva kopi, pa otuda potiče naziv ove kafe. Cibetka se hrani

zrnima kafe, zatim se zrno vari i izbacuje u vidu izmeta. U toku varenja zrna kafe ostaju

netaknuta, jer se uklanja samo mesnati deo ploda. Enzimi koje luči cibetka u toku varenja,

poboljšavaju sam kvalitet i ukus kafe. Tokom procesa varenja dolazi do smanjenja sadržaja

proteina i kofeina u zrnu kafe, te na taj način zrna postaju manje gorka i dobijaju specifičnu

aromu. Ovakva zrna kafe se suše na suncu i dalje obrađuju.

Prilikom pečenja zrna kafe dolazi do gubitka suve materije, jer dolazi do stvaranja ugjen-

dioksida, vode i isparljivih proizvoda pirolize među kojima se nalaze i PAU. Prilikom tog

procesa dolazi do degradacije polisaharida, amino i hlorogenih kiselina, a povećava se sadržaj

organskih kiselina i lipidnih komponenata. U pečenoj kafi zapaženo je prisustvo limunske,

mlečne i sirćetne kiseline (manje od 1%), dok hlorogena kiselina čini oko 7% suve materije u

kafi Arabika. Kafena i kininska kiselina formiraju hlorogenu kiselinu koja se nalazi u mnogim

vrstama voća, a u najvećoj koncentraciji se nalazi u kafi. Prosečan hemijski sastav pečene kafe

prikazan je u tabeli 3.

Tabela 3. Prosečan hemijski sastav pečene kafe.

Materije %

Voda 1,3

Proteini 14,0

Lipidi 10,3

Ugljeni hidrati 67,7

Pepeo 4,0

Najpoznatiji i najvažniji sastojak kafe je kofein, derivat purina. Kofein lako difunduje u

cerebrospinalnu tečnost, stimuliše centralni nervni sistem (CNS), pa povećava budnost, pažnju i

raspoloženje. Kofein se zadržava u krvi oko 4 sata. Deluje i kao diuretik, najaktivnije deluje na

15

CNS i skeletne mišiće, dok najmanju aktivnost ima na glatke mišiće i srce. (Bogdanović, 1963.)

Ljudi koji uživaju u kafi zapravo uživaju u kofeinu koji je otrovna biljna baza i svrstava se u

droge. Kafa bez kofeina ne postoji, već je moguće samo smanjiti nivo kofeina u kafi na različite

načine. Jedan od načina je da se kafa uroni u kiselinu, čime se smanjuje procenat kofeina, ali se

povećava kiselost kafe.

2.2.2. Policiklični aromatični ugljovodonici u kafi

Kao rezultat intenzivnih toplotnih procesa utoku pečenja može doći do delimične

karbonizacije kafe. U zrnu kafe, na temperturi 220C, dolazi do formiranja fenantrena, antracena

i benzoaantracena. Na temperturi oko 260C dolazi do stvaranja pirena i hrizena, a u manjim

koncentracijama se javlja benzog,h,iperilen. Prenos PAU u infuzu je umeren (malo manje od

35%) pri čemu je niži sadrdžaj PAU zabeležen za tamno prženu kafu u odnosu na svetlo prženu

kafu. (Houessou i sar., 2007.) Izloženost ljudi samo jednoj vrsti PAU nije moguće jer se uvek

nalaze kao složene smeše. Veoma mutagen i kancerogen je benzoapiren, koji je prihvaćen kao

marker kancerogenih PAU u uzorcima hrane i životne sredine.

Na osnovu podatakaAgencije za sigurnost hrane (EFSA) EU kao pogodni markeri PAU u

hrani izabrani su benzoapiren, benzoaantracen, benzobfluoranten i hrizen (EFSA, 2007.)

Prema postojećim propisima sadržaj benzo(a)pirena u nekim namirnicama i u hrani za bebe ne bi

trebalo da prelazi 1g/kg. Međutim, zakonskom regulativom Republike Srbije nije definisana

makismalno dozvoljena količina za PAU u kafi i zamenama za kafu.

2.3 Analiza policikličnih aromatičnih ugljovodonika

U zavisnosti od vrste uzorka koji se analiziraju zavise i metode pripreme uzorka i sama

metoda analize. Za svaki tip uzoraka postupci analize odvijaju se u sledeće četiri faze:

1. Uzorkovanje i homogenizacija uzorka;

2. Ekstrakcija PAU iz složenog matriksa uzoraka;

3. Prečišćavanje, kako bi se uklonile ko-ekstrahovane nečistoće;

4. Analiza, kako bi se utvrdila količina PAU u uzorku.

2.3.1. Uzorkovanje

Uzorkovanje je početni korak svake analize. To je postupak kojim se iz osnovnog skupa

uzima podskup elemenata na kojima bi se vršila analiza. Taj podskup elemenata naziva se uzorak

i on treba da bude što reprezenatativniji. Uzorak mora biti homogen i njegova masa treba da

iznosi nekoliko grama ili miligrama. Ta mala količina uzorka koja se uzima za analizu mora

imati isti prosečan sastav kao masa iz koje je uzet uzorak. U zavisnosti od vrste uzoraka razlikuje

se i način uzorkovanja. Ukoliko se ispituju zrna kafe koja se nalaze u džakovima, uzimanje

16

uzorka se vrši pomoću sonde. Sondom se uzima uzorak sa vrha, sredine i sa dna džakova. Ovako

uzeti uzorci se mešaju i šalju na termičku obradu. Pečena zrna se zatim melju i metodom

četvrtanja dobije pogodan uzorak za ispitivanje.

2.3.2. Ekstrakcija

Ekstrakcije koje se koriste za izolovanje PAU iz različitih uzoraka su:

Ekstrakcija tečno – tečno (engl. LLE, liquid-liquid extraction)

Ekstrakcija čvrstom fazom (engl. SPE, solid phase extraction)

Ultrazvučna ekstrakcija (engl. UAE, ultrasound-assisted extraction)

Mikrotalasna ekstrakcija (engl. MAE, microwave-assisted extraction)

Ekstrakcija rastvaračem pod pritiskom (engl. PFE, pressurized fluid extraction)

Ekstrakcija superkritičnim fluidima (engl. SFE, supercritical fluid extraction)

Ekstrakcija po Soksletu (engl. SE, Soxhlet extraction)

Ekstrakcija tečno – tečno (LLE), koristi se za razdvajanje organskih jedinjenja iz vodenih

rastvora primenom različitih organskih rastvarača koji su nemešljivi sa vodom. Postupak se

zasniva na mešanju uzorka sa organskim rastvaračem, pr čemu dolazi do rastvaranja supstance

koje su rastvorne u organskom rastvaraču, a zatim se organski sloj sakuplja i vrši uparavanje, te

se na taj način koncentruje ekstrakt. Prednost ove metode je laka manipulacija aparatima, a

nedostataci su dugotrajnost i komplikovanost procesa, upotreba većih količina organskih

rastvarača i mogućnost gubitka željenog analita.

Ekstrakcija čvrstom fazom (SPE), slična je ekstrakciji tečno- tečno. U ovom slučaju nema dve

tečnosti, već postoji tečna (tečni uzorak) i čvrsta faza (sorbent). Postupak ove ekstrakcije se

sastoji u nanošenju uzorka na sorbent (pakovan u kolonu, disk ili kao disperzna faza), ispiranju

sorbenta i eluiranju željenog analita. Sorbenti mogu da budu veoma raznovrsni (uglavnom

neorganski ili organski polimeri).

Ultrazvučna ekstrakcija (UAE) se ubraja u najjednostavnije metode, a zasniva se na korišćenju

ultrazvučnih talasa sa minimalnom frekvencijom od 16 kHz. Uzorku se doda rastvarač i tako

pomešani se stave na ultrazvučno kupatilo. Uzorci koji sadrže manju koncentraciju policikličnih

aromatičnih ugljovodonika treba da se ekstrahuju najmanje dva puta. Ultrazvučna ekstrakcija je

jeftina, jednostavna i brza, što predstavlja prednost ove ekstrakcije, a njen nedostatak je niska

selektivnost.

Mikrotalasna ekstrakcija (MAE)-kao izvor zagrevanja smeše uzorak – rastvarač koriste se

mikrotalasi. Rastvarači koji se koriste moraju da apsorbuju mikrotalase.

17

Ekstrakcija rastvaračem pod pritiskom (PFE) je novija tehnika ekstrakcije. Rastvarač se

zagreva iznad temperature ključanja ali i dalje je u tečnom stanju. To se postiže povećanjem

pritiska. Povišen pritisak dovodi do rastvaranja mehurića vazduha, i na taj način omogućava

veću dodirnu površinu između uzorka i rastvarača. Prednosti ove ekstrakcije su mala količina

rastvarača, jeftina i brza ekstrakcija. Nedostaci su niska selektivnost i neophodnost posedovanja

specifične opreme za njeno izvođenje.

Ekstrakcija superkritičnim fluidima (SFE) odvija se pomoću fluida koji ima karakteristike

tečne i gasovite faze, a vrednosti pritiska i temperature su iznad kritičnih. Ovakvi fluidi imaju

veću rastvoriljivost i selektivnost od klasičnih fluida za ekstrakciju. Ova ekstrakcija je brza i

selektivna, a nedostaci su što efikasnost odvajanja zavisi od matriksa uzorka, kao i potreba za

posedovanjem skupe specifične opreme.

Ekstrakcija po Soksletu (SE) je najstarija i najupotrebljavanija tehnika ekstrakcije. Uzorak za

analizu se stavlja u celuloznu čauru koja se smešta u nastavak za ekstrakciju po Soksletu.

Ekstrakcija se vrši rastvaračem uz refluktovanje. Kada se dostigne temperature isparavanja

rastvarača, rastvarač isparava, kondenzuje se u kondenzatoru, tako kondenzovan prolazi kroz

čauru. Na taj način se ekstrahuje analit iz uzorka. Kada se nakupi dovoljna količina ekstrakta,

Soksletov nastavak se prazni i rastvarač sa analitom se vraća u balon. Ekstrakcija često traje i po

nekoliko sati kako bi se dobila zadovoljavajuća efikasnost. Ova metoda ekstrakcije ima dobru

efikasnost određivanja PAU, a nedostaci su dugo vreme potrebno za analizu, kao i utrošak velike

količine rastvarača.

2.3.3. Prečišćavanje ekstrakata

Prečišćavanje nakon ekstrakcije je neophodan proces kojim se omogućava razdvajanje

analita od ko-ekstrahovanih supstanci. Metode prečišćavanja uzorka za analizu PAU mogu se

podeliti u dve grupe, i to na tehnike predfiltriranja i tehnike frakcionisanja.

Tehnika predfiltriranja se koristi za uklanjnje veće količine biogenog materijala zaostalog

posle ekstrakcije. Tehnika frakcionisanja se koristi kako bi se analit odvojio od potencijalno

ekstrahovanih organskih jedinjenja. Ove dve metode se mogu kombinovati ukoliko uzorci sadrže

jedinjenja u tragovima.

Za prečišćavanje uzoraka za analizu PAU mogu se primenjivati adsorpciona

hromatografija, hromatografija na koloni, ekstrakcija čvrstom fazom i tečna hromatografija

visokih performansi (HPLC). (Khan i sar., 2005) HPLC tehnika ima najveću moć razdvajanja i

reproduktivnost, kao i mogućnost povezivanja sa odgovarajućim detektorom čime se ujedno

obezbeđuje i analiza uzoraka.

18

2.3.4. Kačers (QuEChERS) tehnika

QuEChERS (Quick Easy Cheap Effective Rugged Safe) (kačers) je skraćenica za veoma

koristan analiticki pristup koji znatno pojednostavljuje analizu složenih uzoraka. Ova tehnika

kombinuje ekstrakciju tečno – tečno pomoću acetonitrila i prečišćavanje ekstrakata ekstrakcijom

disperznom čvrstom fazom (dispersive solid phase extraction – dSPE). Analiza krajnjeg

ekstrakta može se izvršiti gasnom ili tečnom hromatografijom. Šematski prikaz procesa pripreme

uzorka kačers tehnikom dat je na Slici 7. Prednosti ove metode su: jednostavnost, manja

potrošnja reagensa, efikasnost, mogućnost obrade većeg broja uzorka, niska cena. Ova tehnika se

primenjuje u analizi lekova, antioksidanasa, aditiva, policikličnih aromatičnih jedinjenja i

mnogih drugih jedinjenja. ( Gonzales-Curbelo i sar., 2015.)

Slika 7. Proces pripeme uzorka kačers tehnikom

2.3.5. Instrumentalna analiza

Tehnike pripreme uzorka i sama analiza moraju biti osetljive i specifične, jer je sadržaj

PAU u uzorcima veoma nizak. Zbog toga najširu primenu u analizi PAU imaju gasna

hromatografija sa masenom spektrometrijom (GC-MS) i tečna hromatografija visokih

performansi (HPLC).

Gasna hromatografija sa masenom spektrometrijom

19

Gasna hromatografija (GC) je metoda razdvajanja i detekcije lako isparljivih organskih

jedinjenja. Ovaj vid hromatografije primenjuje se za analizu onih jedinjenja koja se bez

degradacije mogu prevesti u gasovito stanje. Kao mobilna faza se koristi gas, najčešće argon ili

helijum, dok stacionarnu fazučini sloj tečnosti ili polimera na inertnoj čvrstoj podlozi koji se

nalazi unutar kolone. Ispitivani uzorak se meša sa mobilnom fazom, kreće se kroz stacionarnu

fazu čime se razdvaja na komponente, pa ih je moguće dalje analizirati. Različite komponente

uzorka imaju različit afinitet prema stacionarnoj fazi, pa se usled različitih interakcija zadržavaju

na koloni različiti vremenski period. Nakon eluiranja, analit dospeva do detektora koji je

povezan sa računarom na čijem se ekranu prikazuje hromatogram.

Svaki signal u hromatogramu odgovara jednom hemijskom jedinjenju i okarakterisan je

retencionim vremenom i površinom ispod pika. Na Slici 8. prikazana je šema gasnog

hromatografa. Postoje više tipova detektora koji se koriste u gasnoj hromatografiji. Najčešće

korišćeni detektori su termalno provodljivi detektor (TCD) i plameno jonizacioni detector (FID),

ali se sve više kao detektor koristi maseni spektrometar (MS).

Slika 8. Šema gasnog hromatografa

Maseni spektrometar je analitički instrument koji razdvaja naelektrisane čestice (odnos mase i

naelektrisanja, m/z), u kome se dešavaju sledeći procesi:

Nastanak jona iz uzorka u jonizacionom izvoru

Razdvajanje jona prema njihovim m/z vrednostima u masenom analizatoru

Fragmentisanje selektovanih jona i analiziranje fragmenata u drugom analizatoru

Detektovanje jona koji nastaju iz poslednjeg analizatora i merenje njihovog intenziteta

detektorom koji konvertuje količinu i vrstu jona u električne signale

Obrađivanje signala iz detektora koji su preneti do računara i kontrolisanje instrumenta

kroz povratne informacije.

20

Maseni spektrometar se sastoji od izvora jona, elemenata za ubrzavanje i usmeravanje čestica,

analizatora, detektora i vakuum pumpe (Slika 9.)

Uloga jonizatora je da proizvede jone iz atoma i molekula uzorka i da formira i ubrza

jonski snop ka masenom analizatoru. Sastav jonskog snopa mora tačno predstavljati sastav

materijala od koga je sastavljen uzorak. Ni jedan jonski izvor se ne može univerzalno koristiti i

zbog toga postoji veliki broj različitih jonizacionih tehnika. Uopšteno gledano, tehnike jonizacije

se mogu podeliti u dve osnovne grupe i to, na jonizacione i desorpcione tehnike.

Slika 9. Blok šema masenog spektrometra

Maseni analizator je deo masenog spektrometra, gde se joni razdvajaju na osnovu odnosa

mase i naelektrisanja (m/z). Postoji više vrsta masenih analizatora koji se razlikuju po tome što

koriste statičko ili dinamičko električno ili magnetno polje ili njihovu kombinaciju. Maseni

analizatori mogu biti kvadrupolni, magnetni, jon-trap analizatori, kontinualni, analizatori sa

dvostrukim fokusiranjem i analizatori na bazi vremena preleta. Najčešće korišćen analizator u

analizi PAU, je kvadrupolni analizator (Slika 10.). Kroz ulazni razrez prolaze joni različitih

masa. Kada se nađu između četiri štapne elektrode, na kojima je priključen izvor naizmenične

struje, koji dovodi do promene napona, proizvodeći elektromagnetno polje koje dalje dovodi do

odvajanja jona na osnovu njihovih naelektrisanja (m/z). Nakon razdvajanja, joni bivaju usmereni

u detektor koji prevodi količinu i vrstu jona u električni signal koji se može registrovati na

pisaču, računaru ili na nekom drugom uređaju. Električni signali se detektuju u vidu masenih

spektara.

21

Slika 10. Šema masenog analizatora na bazi kvadrupola

2.3.6. Pregled literature

Zbog toksičnosti i drugih štetnih osobina koje poseduju PAU potrebno je pratiti njihovu

koncentraciju u uzorcima iz životne sredine. U poslednje vreme, glavno mesto u analizi

zauzimaju metode gasne hromatografije sa masenom spektrometrijom.

Postoji nekoliko istraživanja na temu sadržaja PAU u kafi. U radu Sadowske-Rociek i

Surme (2014), analiziran je sadržaj policikličnih aromatičnih ugljovodonika u uzorcima kafe.

Benzo[a]antracen nađen je u 11 uzoraka, hrizen u 6 uzoraka, benzo [b]fluoranten u 9 uzoraka i

benzo[a]piren u samo 3 uzorka kafe. Upoređujući dobijene rezultate za date vrste kafa, najniže

koncentracije PAU su pronađene u uzorcima „zamena za kafu“, odnosno surogat kafe, dok su

uzorci prirodne pržene kafe sadržali mnogo više PAU. Koncentracije teških PAU su bile najviše

u prženoj kafi. EU nije propisala maksimalno dozvoljenu količinu za sadržaj PAU u kafi i

zameni za kafu.

U radu Grover i sar., (2013) prikazan je sadržaj13 PAU u četiri marke mlevene kafe.

Koncentracije ukupnih PAU su bile u opsegu od 831,7 do 1589 µg/kg.

U drugoj studiji, koncentracije PAU u deset uzoraka kafe varirale su u intervalu od 0,62

do 53,25 µg/kg (Lee i Shin, 2010).

U radu Orecchio i sar.,(2009), sadržaj ukupnih PAU u kafi varirao je od 0,52 do 1,8 µg/l.

Rezultati studije sprovedene u Indiji (Bishnoi i sar.,2005) pokazali su da je koncentracija

ukupnih PAU u različitim markama uzoraka kafe varirala u granicama od 16,47 do 18,24 µg/l.

U istraživanju Stanciu i sar., (2008), utvrđeno je da koncentracije PAU u uzorcima kafe

variraju od 0,001 do 90,732 µg/kg.

22

Rezutati istraživanja u Poljskoj pokazali su da je najveca koncentracija ispitivanih PAU u

uzorcima kafe pronađena u prirodno pečenoj kafi (0,12 µg/l).

U radu Kruijf i sar., (1987), analiziran je benzo[a]piren u filter kafi i kuvanoj kafi.

Sadržaj benzo[a]piren u filter kafi je bio 0,0008 mg/kg i 0,0010 mg/kg u kuvanoj kafi.

2.4. Validacija analitičkih metoda

Validacija analitičkih metoda je postupak dokazivanja da analitička metoda ispunjava

određene uslove za široku primenu. Validaciju treba izvršiti u sledećim slučajevima:

- pri razvoju i uvođenju nove metode;

- pri promeni bilo kojeg dela analitičke metode koja je već bila validovana;

poboljšanje i prilagođavanje postojeće metode;

promena postojeće metode;

prenošenje metode na drugi instrument;

prenošenje metode u drugu laboratoriju.

Prvo je potrebno definisati svrhu metode, pa onda utvrditi postupak rada. Zatim se izvodi

eksperimenti i prikupljaju rezultati koji dokazuju validnost metode.

Postoje osam osnovnih parametara validacije jedne analitičke metode:

1. Specifičnost/selektivnost;

2. Linearnost;

3. Analitički opseg metode (radno područje) ;

4. Preciznost;

- Ponovljivost,

- Međupreciznost,

- Reproduktivnost ,

5. Tačnost;

6. Granica kvantifikacije;

7. Granica detekcije;

8. Robusnost

2.4.1. Specifičnost/selektivnost

Specifičnost/selektivnost je svojstvo metode da tačno odredi željeni analit u pristvu

ostalih komponenata u matriksu uzorka pod utvrđenim uslovima ispitivanja. Iako se u praksi

često poistovećuju, specifičnost i selektivnost su dva različita svojstva metode. Specifična

metoda je ona kojom se može odrediti samo jedan određeni analit. Metoda kojom se može

određivati više komponenata istovremeno, ali pod uslovima da te komponente pri određivanju ne

smetaju jedna drugoj, naziva se selektivnom. Kod hromatografskih metoda, osim upoređivanja

23

hromatograma referentnog materijala i uzorka, potrebno je dokumentovati i parametre koji

određuju razdvojenost i simetriju pikova, a kod nekih metoda i prikupiti dokaze o čistoći pikova.

2.4.2. Linearnost

Mogućnost metode da u određenom području daje rezultate proporcionalne koncentraciji

analita u uzorku naziva se linearnost. Linearnost se određuje konstruisanjem kalibracione prave.

Linearnost metode se procenjuje matematički i grafički.

Matematički način procene se vrši na taj način što se primenom linearne regresije izrazi

jednačina prave (y = ax + b) i izračuna koeficijent korelacije (r). Nagib prave (a) je parametar

koji ukazuje na osetljivost metode. Što je veća vrednost nagiba prave, metoda je osetljivija.

Odsečak prave (b) može da ukaže na sistematsku grešku. Ako je b < 0, metoda je opterećena

greškom instrumenta, ako je b >0 to znači da na signal analita utiče matriks uzorka. Kriterijum

koji se postavlja prilikom validacije metode podrazumeva da je vrednost koeficijenta korelacije r

≥ 0,99. U slučaju izuzetno niskih koncentracija analita, prihvata se i kriterijum r ≥0,98. Kod

grafičkihg prikaza, najčešće su u upotrebi:

grafički prikaz odstupanja od regresionog pravca u odnosu na koncentracu ili logaritam

koncentracije;

grafički prikaz relativnih signala (odnos signala i odgovarajuće koncentracije) na osi y i

odgovarajućih koncentracija na osi x log skale.

Kalibraciona prava treba da bude linearna, da prolazi kroz nultu tačku i da ne zavisi od matriksa

uzorka.

2.4.3. Opseg metode (radno područje)

Interval između gornje i donje koncentracijske granice analita u uzorku, unutar kojeg

analitički postupak ima zadovoljavajuću preciznost, tačnost i linearnost naziva se radno područje

ili opseg metode. Za određivanje ovog parametra, nije potrebno izvođenje posebnih

eksperimenata, već se opseg metode može odrediti ispitivanjem linearnosti i tačnosti metode.

Raspon koncentracija treba da odgovara stvarnom uzorku, ali treba da uključi i koncentraciju na

granici kvantifikacije kada je ona bitna.

2.4.4. Preciznost

Preciznost predstavlja procenu slaganja između numeričkih vrednosti dva ili više

rezultata dobijenih merenjima, izvedenim na isti način. Preciznost se izražava kao:

Ponovljivost – predstavlja preciznost rezultata analize dobijenih uzastopnim merenjem

istog uzorka istom metodom pod istim uslovima (isti analitičar, isti instrument, ista

laboratorija u kratkom vremenskom intervalu);

24

Srednja preciznost – predstavlja odstupanje rezultata dobijenih merenjem istog uzorka

istom metodom pod različitim uslovima u istoj laboratoriji (različit analitičar, različit

instrument, reagensi različitih dobavljača, duži period);

Reproduktivnost – predstavlja podudaranje rezultata dobijenih uzastopnim merenjem

nekoliko istih uzorka istom metodom u različitim laboratorijima (različit analitičar,

različiti radni uslovi unutar specificiranih parametara metode).

Preciznost se eksperimentalno kvantifikuje vrednošću greške metode, a numerički pokazatelji

toga su standardna devijacija S (Jednačina 1), relativna standardna devijacija (RSD) (Jednačina

2) i varijansa S2(Jednačina 3).

𝑠 = √∑ (𝑥𝑖− ��)2𝑛

𝑛−1

𝑛−1 Jednačina (1)

S - standardna devijacija

xi - pojedinačni sadržaj svake probe, dobijen određivanjem

��- srednja vrednost određivanja

𝑅𝑆𝐷 (%) = 𝑠

�� ∗ 100 Jednačina (2)

RSD - relativna standardna devijacija

S - standardna devijacija

��- srednja vrednost određivanja

𝑠2 = ∑ (𝑥𝑖− ��)2𝑛

𝑖=1

𝑛−1 Jednačina (3)

S2 - varijansa

xi - pojedinačni sadržaj svake probe, dobijen određivanjem

n - broj određivanja

x- srednja vrednost određivanja

2.4.5. Tačnost

Tačnost analitičke metode je stepen saglasnosti između stvarne i vrednosti dobijene primenom

analitičkog postupka određeni broj puta i ukazuje na ispravnost merenja.U praksi se tačnost

analitičke metode proverava

analizom standardnih referentnih materijala (SRM)

određivanjem procenta prinosa (efikasnost)

upoređivanjem sa metodom koja je potvrđena kao tačna standardna metoda

Tačnost u velikoj meri zavisi od načina pripreme uzorka, matriksa i koncentracije uzorka.

Za određivanje tačnosti treba koristiti najmanje tri različite koncentracije analita u uzorcima i

25

svaku pojedinačnu analizu ponoviti najmanje tri puta. Za svaku probu efikasnost se izračunava

na osnovu Jednačine 4.

𝑒𝑓𝑖𝑘𝑎𝑠𝑛𝑜𝑠𝑡 (%) = 𝑠𝑖𝑔𝑛𝑎𝑙 (𝑢𝑧𝑜𝑟𝑎𝑘 +𝑑𝑜𝑑𝑎𝑡𝑎𝑘)

𝑠𝑖𝑔𝑛𝑎𝑙 (𝑑𝑜𝑑𝑎𝑡𝑎𝑘) ∗ 100 Jednačina (4)

Tačnost i preciznost se ponekad pogrešnopoistovećuju.Ako je nešto precizno ne mora da znači i

da je tačno, i obrnuto. Ilustracija preciznosti i tačnosti prikazana je na slici 10.

Slika 10. Ilustracija tačnosti i preciznosti metode

2.4.6. Granica detekcije (limit detekcije)

Najniža koncentracija analita koja se može detektovati u uzorku, ali ne i kvantitativno

odrediti, naziva se granicom detekcije (engl. Limit of Detection – LOD).

Određivanje granice detekcije može biti:

vizuelno

pomoću odnosa signal/šum

statistički

Granica detekcije se vizuelno određuje razblaživanjem rastvora uzorka odgovarajućom

količinom analita. Vizuelno određivanje može se primenjivati kod instrumentalnih i

neinstrumentalnih metoda, a određuje se najmanji signal koji se može uočiti. Odnos signal/šum

(S/N), može se primenjivati samo na metode kod kojih postoji bazna linija. Za granicu detekcije

obično se uzima vrednost koncentracija koje daju S/N = 3 ili S/N = 2. Statistički se granica

detekcije može odrediti na osnovu standardne devijacije odgovora detektora i nagiba kaliracione

prave (S/N). Teorijska granica detekcije se izračunava po Jednačini 5.

𝐿𝑂𝐷 = 3,3 𝑠

𝑎 Jednačina (5)

mala tačnost, mala preciznost

velika tačnost, mala preciznost

mala tačnost, velika preciznost

velika tačnost, velika preciznost

26

LOD - granica detekcije;

s - standardna devijacija odgovora detektora dobijena višestrukim merenjem slepe probe;

a - nagib kalibracione prave.

S se dobija kao standardna devijacija serije merenja signala uzorka bez analita, ili kao standardna

devijacija odsečka na ordinati dobijenog iz kalibracione prave sa koncentracijama bliskim

granici detekcije.

2.4.7. Granica kvantifikacije (limit kvantifikacije)

Granica kvantifikacije (engl. limit of quantification - LOQ) je najmanja količina analita u

uzorku koja se može kvantitativno odrediti sa prihvatljivom preciznošću i tačnošću. Određuje se

na sličan način kao i granica detekcije:

vizuelno - analizom uzorka u kome analit ima tačno poznatu koncentraciju, pa njegovim

razblaženjem i ponovnom analizom do momenta kada sa dovoljnom tačnošću nije

moguće kvantifikovati analit u uzorku;

pomoću odnosa signal/šum – gde seuzima odnos S/N = 10;

statistički – korišćenjem Jednačine 6.

𝐿𝑂𝐷 = 10 𝑠

𝑎 Jednačina (6)

LOQ - granica kvantifikacije;

s - standardna devijacija odgovora detektora dobijena višestrukim merenjem slepe probe;

a - nagib kalibracioneprave.

2.4.8. Robusnost

Robusnost je mera otpornosti analitičkog postupka na male, namerne promene radnih

uslova metode. Ispitivanje robusnosti je važan deo razvoja metode jer pomaže otkrivanju

optimalnih uslova za izvođenje metode i na taj način upućuje na one parametre koje treba

kontrolisati. Tokom eksperimenata menjaju se radni uslovi unutar stvarnih granica, i prati

kvantitativna promena rezultata. Prilikom ispitivanja robusnosti hromatografskih metoda, uslovi

koji se ispituju su: temperatura kolone, zapremina uzoraka koja se injektuje, sastav mobilne faze.

Ako promena nekog radnog uslova ne utiče bitno na rezultat, kaže se da je on u području

robusnosti metode. Uslove za koje je utvrđeno da utiču na rezultat treba držati pod nadzorom i to

jasno naznačiti u opisu metode. Prema podacima o robusnosti postavljaju se parametri za

ispitivanje pogodnosti sistema. Robustnost, kao karakteristika izvođenja metode, nije neophodno

određivati u svakoj laboratoriji. Kada se koristi standardizovana metoda razumno je da se

prihvati da je robustnost metode određena procedurom standardizacije.

27

3. Eksperimentalni deo

28

3.1. Aparati

Aparati koršćeni u ovom radu su:

7890/7000B GC - MS/MS uređaj, sa triplkvadrupolom (QqQ), proizvođača (Agilent

Technologies, SAD) koji je opremljen Combi PAL uzorkivačem (semplerom).

Vaga, Shimadzu AX20

Ultrazvučno kupatilo - J.P.Selectra, s.a. Barselona, Spain

Centrifuga – Hermle Z306

3.2. Rastvori i reagensi

U radu su krišćeni sledeći reagensi i rastvori:

PAH Kit 601-N koji sadrži acenaften, acenaftilen, antracen, benzo[a]antracen,

benzo[a]piren, benzo[b]fluoranten, benzo[g,h,i]perilen, benzo[k]fluoranten, hrizen,

dibenzo[a,h]antracen, fluoranten, fluoren,indeno[1,2,3-cd]piren, naftalen, fenantren i

piren kao čvrste supstance (Supelco, Bellefonte, Pensilvanija),

Unutrašnji standardi acenaften d10 i perilen d12 (Supelco, Bellefonte, Pensilvanija),

Surrogat Standard Mix 4 mg mL-1 koji sadrži 2-hlorfenol-3,4,5,6-d4, 1,2-dihlorbenzen-d4,

2-fluorobifenil, 2-fluorofenol, nitrobenzen-d5, fenol-d6, p-terfenil-d14, 2,4,6-tribromfenol

(Supelco, Bellefonte, Pensilvanija),

Acetonitril, HPLC grade (Sigma Aldrich, Nemačka),

Aceton, HPLC grade (Merck, Darmstadt, Nemačka),

Primarni – sekundarni amin (PSA), (United Chemical Technologies UCT, Horsham,

Pensilvanija),

Dijatomejska zemlja (Sigma Aldrich, Nemačka),

Klinoptilolit (rudnik Zlatokop, Vranjska Banja, Srbija),

MgSO4 (Sigma Aldrich, Nemačka),

NaCl (Sigma Aldrich, Nemačka),

Dejonizovan voda specifečne provodljivosti od 0,05S/cm.

3.3. Priprema model uzorka kafe

Model uzorci kafe pripremljeni su od uzoraka sirove kafe koji su nabavljeni iz trgovine u

hermetički zatvorenoj ambalaži. Pre pripreme model uzorka, utvrđeno je da uzorci kafe iz

hermetički zatvorene ambalaže ne sadrže analizirane komponente po metodi Agencije za zaštitu

životne sredine (EA, 2003). Nakon što je utvrđeno da u ovim uzorcima ne postoje policiklični

aromatični ugljovodonici, izvršeno je spajkovanje uzoraka tj. dodata je određena količina

standardnog rastvora koji sadrži 16 PAU. U uzorke kafe dodat je standardni rastvor PAU, na taj

29

način su dobijeni model uzorci kafe, koji sadrže PAU u koncentracijema 12,5 mg/kg; 1,25 mg/kg

i 0,125 mg/kg ukupnih PAU. Nakon dodataka standardnog rastvora, uzorci su ostavljeni da stoje

12 sati, a zatim je vršena ekstrakcija.

3.4. Optimizacija kačers tehnike za ekstrakciju PAU iz uzoraka kafe

Model uzorci kafe (10g) odmereni su u kačers kivetu od 50 ml, zatim im je dodato 30 ml

smeše rastvarača voda/acetonitril (1:2, v/v). Uzorci su mešani 1 minut, a zatim su ekstrahovani

na ultrazvučnom kupatilu 30 minuta. Potom je u kivete dodato 8g MgSO4 i 2g NaCl2, kivete su

promućkane i centrifugirane 10 minuta na 3500 obrtaja u minutu. Alikvot supernatanta (1,5 ml)

prebačen je u kačers kivetu od 2 ml sa 150 mg MgSO4 i 50 mg sorbensa. Kao sorbenti su

korišćeni PSA (primarni – sekudarni amin), termički tretiran klinoptilolit i dijatomejska zemlja.

Nakon mućkanja, ekstrakti su centrifugirani 10 minuta na 8000 obrtaja u minutu. Zapremina od 1

ml supernatanta prebačena je u vialu, zatim je dodato 200 l unutrašnjeg standarda i vršena je

GC-MS analiza. Unutrašnji standard je smeša 80 g/ml rastvora perilena d12 i 80 g/ml rastvora

acenaftena d10

Slepa proba (uzorci kafe sa verifikovanim odsustvom PAU) tretirani su na isti način kao i

model uzorci kafe.

Dijatomejska zemlja je vrlo porozna stena, nastala taloženjem ostatka silikatnih algi

(dijatomeja) u morima i jezerima. Odlikuje se malom gustinom, poroznošću, malom

provodljivošću toplote i elektriciteta, otporna je prema hemikalijama i ima visoku apsorpcionu

sposobnost.

Klinoptilolit je prirodni alumosilikatni mineral, nastao iz vulkanskih stena zeolitnog tipa.

Njegova opšta hemijska formula je (Na,K,Ca)2-3Al3(Al,Si)2Si3O36•12H2O. Klinoptilolit korišćen

u ovom istraživanju sastojao se od SiO2 (62,28%), Al2O3 (12,33%), Fe2O3 (3,20%), CaO

(6,65%), MgO (1,18%), Na2O (1,46%) i K2O (0,85%). Priprema klinoptilolita kao sorbenta je

opisana u daljem tekstu. Zeolitni materijal veličine zrna 0,063 – 0,1 mm, koji sadrži 90%

klinoptilolita dobijenog iz rudnika Zlatokop (Srbija) ispran je dejonizovanom vodom kako bi se

uklonile nečistoće, zatim je sušen i termički obrađen u peći za žarenje tokom 3 sata na

temperaturi 300C. (Stankov Jovanović i sar., 2015.)

30

3.5. GC-MS analiza

Uzorci su analizirani gasno hromatografskom metodom sa masenom spektrometrijom

(GC-MS). Pripremljeni uzorci analizirani su na 7890/7000B GC -MS/MS triplkvadripol uređaju,

koji je opremljen autosemplerom i kapilarnom kolonom (dimenzije 30m x 0,25mm, 5%

fenilmetilsiloksan, debljina filma 0,25m).

Za utvrđivanje retencionih vremena i karakterističnih jona koji su korišćeni za analizu

odgovarajućih jedinjenja, vršeno je snimanje u SCAN modu. Temperatura je prvih 3 minuta bila

75C, zatim je usledio linearni porast temperature do 280C(6C/min), poslednjih 20 minuta

temperatura je bila 280C. Injektovana zapremina uzorka iznosila je 1l, u split modu (10:1).

Protok helijuma kao nosećeg gasa bio je 1,0 mL/min. jonizacioni potencijal izvora bio je podešen

na -70 eV sa masenim skeniranjem u rasponu 40-650 amu.

Kada je utvrđeno na kom retencionom vremenu se eluiraju analizirana jedinjenja i koji se

joni mogu koristiti za kvantifikaciju, snimanje se dalje vršilo u SIM (signal ion monitoring)

modu. Režim temperature koji se koristio bio je: prvih 3 minuta na 75C, zatim je sledio linearan

porast temperature do 300C (gradijent 6C/min), poslednjih 10 minuta temperatura je bila

300C. Vreme trajanja analize bilo je 50 minuta. Injektovana zapremina u split modu iznosila je

2,5L. Helijum je primenjivan kao noseći gas sa protokom od 1,0 mL/min. Jonizacioni

potencijal izvora bio je -70 eV. Retenciona vremena i odgovarajući joni za kvantifikaciju PAU

dati su u Tabeli 4.

Tabela 4. Retenciona vremena i odgovarajući joni za kvantifikaciju PAU

PAU Rt

(minut)

Kvantifikacioni jon

(m/z)

Naftalen 11,792 128,0

Acenaftilen 17,721 152,0

Acenaften 18,460 153,0

Fluoren 20,380 166,0

Fenantren 24,000 178,0

Antracen 24,177 178,0

Fluoranten 28,575 202,0

Piren 29,383 202,0

Hrizen 34,072 228,0

Benzo[a]antracen 34,238 228,0

Benzo[b]fluoranten 37,937 253,0

Benzo[k]fluoranten 38,103 253,0

Benzo[a]piren 39,039 253,0

Indeno[1,2,3-cd] piren 42,760 277,0

Dibenzo[a,h]antracen 42,878 279,0

Benzo[g,h,i]perilen 43,637 276,0

31

3.6. Analiza realnih uzoraka

Uzorci kafe pripremljeni su optimizovanom kačers tehnikom i analizirani na GC-MS-u.

U kačers kivetu od 50 ml odmereno je po 10 g uzorka i dodato je 30 ml smeše voda/acetonitril

(1:2, v/v). Uzorci su mešani 1 minut, a zatim su ekstrahovani na ultrazvučnom kupatilu 30

minuta. Zatim je u kivete dodato 8 g MgSO4 i 2g NaCl, kivete su promućkane a potom

centrifugirane 10 minuta na 3500 obrtaja u minutu. Alikvot supernatanta (1,5 ml) prebačen je u

kačers kivetu od 2 ml sa 150 mg MgSO4 i 50 mg klinoptilolita. Posle mućkanja, ekstrakti su

centrifugirani 10 minuta na 8000 obrtaja u minutu. Zatim je 1 mlsupernatanta prebačenu vialu, i

dodato je 200 l unutrašnjeg standarda (rastvor perilena d12 (80 g/ml) i acenaftena d10 (80 g/ml

)) i vršena je GC-MS analiza.

Analizirano je osam uzoraka različitih kafa istog proizvođača, kupljenih u trgovini u

hermetički zatvorenoj ambalaži. Opis karakteristika realnih uzoraka kafe za analizu je prikazan u

Tabeli 5.

Tabela 5. Opis karakteristika analiziranih realnih uzoraka kafe

Uzorak Karakteristike

1 Mešavina tradicionalne kafe koja je obogaćena sa 3% prirodnog ekstrakta sirove

kafe. Ekstrakt sirove kafe sadrži određenu količinu antioksidansa.

2 Mešavina arabike od koje potiče intenzivna aroma napitka kafe i različitih

drugih vrsta kafa koje su pomešane u idealnom odnosu.

3 Mešavina arabike koja daje specifičnu aromu i posebno odabrane sorte robuse,

od koje potiče specifična jačina napitka kafe.

4 Mešavina pržene kafe sa kakao prahom i aromom čokolade.

5 Čista arabika sa prostora Kolumbije; ova arabika ima specifičnu slatkoću koja

daje veći osećaj punoće napitka kafe u odnosu na druge vrste arabike.

6 Arabika sa plantaža u centralnoj Americi; ova vrsta arabike ima manju kiselost.

7 Arabika koja potiče sa juga Brazila; zbog klimatskih uslova, nadmorske visine

vulkanskog zemljišta na kom se gaji ova arabika ima specifičan ukus i aromu.

8 Mešavina brazilske arabike i odabrane sorte afričkih i azijskih robusta.

32

4. Rezultati i diskusija

33

4.1. Optimizacija i validacija kačers tehnike za analizu policikličnih

aromatičnih ugljovodonika u uzorcima kafe

Kačers tehnika ima široku primenu pri analizi različitih uzoraka, jer u velikoj meri

skraćuje vreme analize i smanjuje troškove, pa je cilj bio optimizovati ovu tehniku za analizu

policikličnih aromatičnih ugljovodonika u uzorcima kafe. Ispitana je kombinacija rastvarača

acetonitril/voda, sa tri različita sorbenta (PSA, klinoptilolit i dijatomejska zemlja) korišćena za

prečišćavanje dobijenih ekstrakata. Model uzorci kafe, pripremljenisu dodavanjem standardnog

rastvora 16 PAU u sirovu kafu, tako da je njihova ukupna koncentracija u uzorcima kafe

iznosila12,5g/kg, 1,25g/kg i 0,125g/kg. Model uzorci kafe tretirani su kačers tehnikom sa

različitim kombinacijama rastvarač/sorbens i analizirani na GC-MS. Izvršeno je određivanje

osnovnih parametra validacije metode (tačnost, preciznost, LOD, LOQ i linearnost).

Model uzorci kafe koji sadrže 16 PAU u koncentracijama 12,5, 1,25 i 0,125 g/kg

pripremljeni su kačers tehnikom i analizirani GC-MS metodom. Na Slikama 11. -13. prikazani su

hromatogrami dobijeni snimanjem ekstrakta model uzoraka kafe na GC-MS-u.

Slika 11. GC-MS hromatogram dobijen snimanjem ekstrakta uzoraka pripremljenog kačers

tehnikom smešom acetonitril/voda uz klinoptilolit kao sorbent za nivo spajkovanja 0,125 g/kg.

Rel

ativ

ni

inte

nzt

et

34

Slika 12. GC-MS hromatogram dobijen snimanjem ekstrakta uzoraka pripremljenog kačers

tehnikom smešom acetonitril/voda uz klinoptilolit kao sorbent za nivo spajkovanja za nivo

Slika 13. GC-MS hromatogram dobijen snimanjem ekstrakta uzoraka pripremljenog kačers

tehnikom smešom acetonitril/voda uz klinoptilolit kao sorbent za nivo spajkovanja 12,5 g/kg

Rezultati ispitivanja efikasnosti kačers tehnike pripreme uzorka kafe za analizu

policikličnih aromatičnih ugljovodonika upotrebom smeše acetonitril/voda kao ekstrakcionog

rastvarača i sorbenta (PSA, klinoptilolita i dijatomejske zemlje) su prikazani u Tabeli 6.

Rel

ativ

ni

inte

nzt

et

Rel

ativ

ni

inte

nzt

et

35

Tabela 6. Efikasnosti određivanja 16 prioritetnih PAU (PAU niskih molekulskih masa - LMW

PAU, PAU visokih molekulskih masa - HMW PAU) dobijene GC-MS analizom model uzoraka

kafe pripremljenih kačers tehnikom, upotrebom smeše acetonitril/voda i različitih sorbenata

PAU

Koncentracija

pojedinačnih

PAU (µg/kg)

PSA

(efikasnost, %)

Klinoptilolit

(efikasnost, %)

Dijatomejska

zemlja

(efikasnost, %)

LM

W P

AU

Naftalen

12,5 34,1±0,8 72±3 29±2

1,25 29,0±0,3 78±5 37±1

0,125 106±6 83±3 28±2

Acenaftilen

12,5 105±6 97±4 37±2

1,25 86±5 110±5 40±2

0,125 87±4 104±5 89±2

Acenaften

12,5 61±2 71±2 41±1

1,25 73±3 96±3 50,3±0,5

0,125 51±1 119±4 107±4

Fluoren

12,5 74±4 112±5 43,2±0,5

1,25 98±5 109±5 50±2

0,125 55,4±0,4 96±4 76±3

Fenantren

12,5 57,7±0,6 115±5 44,1±0,5

1,25 56,2±0,9 109±4 40,8±0,5

0,125 44,3±0,6 104±4 43,6±0,6

Antracen

12,5 83±4 85±3 46,1±0,7

1,25 85±4 91±3 65±1

0,125 73±3 104±4 86±3

HM

W P

AU

Fluoranten

12,5 79±2 93±4 65,2±0,6

1,25 48,2±0,3 109±4 53,5±0,4

0,125 42,4±0,3 90±3 111±5

Piren

12,5 73±5 99±3 115±5

1,25 76±2 99±3 46,3±0,3

0,125 65±2 97±3 36,1±0,2

Hrizen

12,5 110±6 133±5 107±4

1,25 125±6 125±5 44±1

0,125 123±6 99±4 40,4±0,6

Benzo[a]antracen

12,5 65,2±0,9 120±5 68±2

1,25 96±5 123±5 70±2

0,125 95±5 105±4 76±2

Benzo[b]fluoranten

12,5 38,4±0,6 60±2 35,3±0,6

1,25 49,3±0,6 71±2 17,6±0,2

0,125 42,2±0,1 66±3 56±1

Benzo[k]fluoranten

12,5 35,3±0,4 46,1±0,5 52,7±0,9

1,25 34,2±0,3 46,5±0,6 51,8±0,2

0,125 93±5 59,4±0,3 21,3±0,9

36

Benzo[a]piren

12,5 28±1 77±3 20,5±0,8

1,25 68,7±0,4 100±4 19,3±0,8

0,125 41±1 92±2 20,4±0,9

Indeno[1,2,3-

cd]piren

12,5 45,1±0,9 77±2 57±3

1,25 132±5 85±2,8 39,4±0,3

0,125 10,2±0,1 80±2 25,6±0,3

Dibenzo[a,h]antracen

12,5 45,3±0,7 73±2 23,6±0,7

1,25 32,4±0,4 88±2 34,7±0,4

0,125 10,1±0,8 105±3 20±1

Benzo[g,h,i]perilen

12,5 103±5 51,4±0,5 67±2

1,25 120±4 63,5±0,8 49,7±0,6

0,125 80±2 104±4 13,3±0,5

Od 16 analiziranih PAU za njih 11 (naftalen, acenaftilen, fenanthren, antracen,

fluoranten, piren, benzo[b]fluoranten, benzo[k]fluoranten, benzo[a]piren, indeno[1,2,3-cd]piren i

dibenzo[a,h]antracen) zabeležene su efikasnosti u granicama od 70-120%, za sva tri nivoa

spajkovanja. (Thompson i sar., 2002) Upotrebom kombinacije acetonitrila i vode kao

ekstrakcionog sredstvai PSA kao sorbenta, dobijene su efikasnosti koje su bile u interval od 10 %

za indeno[1,2,3-cd]piren do125 % za hrizen. Ova kombinacija je dala odlične rezultate za sva tri

nivoa spajkovanja kod hrizena (110% do 125%.)

Kombinacija acetonitrila i vode kao ekstrakciononog sredstva i dijatomejske zemlje kao

sorbenta, pokazuje nisku efikasnost, jer su za većinu PAU vrednosti efikasnosti manje od 70%.

Najmanja efikasnost je postignuta za benzo[g,h,i]perilen 13% a najveća za fluoranten 115%.

U kombinaciji acetonitrila i vode kao ekstrakcionog sredstva i klinoptilolita kao sorbenta,

dobijene efikasnosti su bile od 46% za benzo[k]fluoranten do 133% za hrizen. Sva tri nivoa

spajkovanja kod hrizena dale su dobre rezultate (99% do 133%).

Na osnovu tezultata predstavljenih u Tabeli 6. može se zaključiti da klinoptilolit kao

sorbent ima bolju efikasnost u odnosu na ostala dva. Ove kombinacije ekstrakcionog sredstva i

sorbenta daju najbolje rezultate za određivanje PAU niskih molekulskih masa (LMW), a najveća

efikasnost kod određivanja PAU visokih molekulskih masa (HMW) zabeležena je za hrizen

(99% do 133%) i benzo[a]antracen (105% do 123%).

37

4.1.2. Parametri validacije metode za analizu model uzoraka kafe pripremljenih kačers

tehnikom upotrebom smeše acetonitril/voda i klinoptilolita kao sorbenta

Primenjujući pravila dobre analitičke prakse, predložena metoda je validovana u odnosu

na svaki od 16 ciljnih analita i rezultati validacije prikazani su u Tabeli 7.

Na osnovu odnosa signal/šum određene su granice detekcije i kvanitifikacije za svaki od

analiziranih PAU. Granica detekcije (LOD) bila ju u intervalu od 0,12 g/kg za

benzobfluoranten i benzokfluoranten do 8,88 g/kg za antracen. Granica kvantifikacije ima

vrednosti od 0,4 g/kg za benzobfluoranten i benzokfluoranten do 29,6 g/kg za antracen.

Snimanjem serija standardnih rastvora, konstruisane su kalibracione prave za svaki

pojedinačni PAU. Koeficijent korelacije je za većinu PAU iznosio 0,98 i 0,99, osim za piren i

antracen gde su vrednosti koeficijenta korelacije bile 0,97.

Izračunavanjem relativne standradne devijacije određena je preciznost metode, i to

tretiranjem pet spajkovanih uzoraka na isti način od strane istog analitičara na istom aparatu, a

rezultati su prikazani kao RSD vrednosti. Vrednosti za RSD bile su u rasponu od 4,28% za

indeno1,2,3-cd piren do 16,28% za hrizen.

38

Tabela 7. Parametri validacije metode analize 16 prioritetnih PAU dobijene GC-MS analizom u ekstraktima pripremljenim kačers

tehnikom sa kombinacijom acetonitril/voda i klinoptilolita kao sorbenta - Rt (retenciono vreme); LOD (granica detekcije); LOQ

(granica kvantifikacije); RSD (relativna standardna devijacija)

PAU Rt

(minut)

Kvantifikacioni

jon (m/z)

LOD

(µg/kg)

LOQ

(µg/kg)

Jednačina

kalibracione prave

Koeficijent

korelacije RSD (%)

Naftalen 11,906 128,0 3,15 10,5 y =0,1743x + 0,0031 0,99 7,39

Acenaftilen 17,724 152,0 0,87 2,9 y = 0,1497x – 0,0119 0,99 5,98

Acenaften 18,433 153,0 1,88 6,27 y = 0,2485x – 0,0053 0,99 8,06

Fluoren 20,383 166,0 1,04 3,47 y = 0,1416x – 0,0036 0,99 6,22

Fenantren 24,071 178,0 6,24 20,8 y = 0,0853x – 0,0012 0,99 9,01

Antracen 24,150 178,0 8,88 29,6 y = 0,0711x – 0,0039 0,97 4,96

Fluoranten 28,537 202,0 3,54 11,8 y = 0,0466x – 0,0016 0,99 11,32

Piren 29,347 202,0 0,33 1,1 y = 0,2926x – 0,0793 0,97 9,81

Hrizen 34,037 228,0 0,48 1,6 y = 0,2165x - 0,0966 0,99 16,28

Benzoaantracen 34,182 228,0 8,4 28 y = 0,1784x – 0,0475 0,98 14,25

Benzobfluoranten 37,949 253,0 0,12 0,4 y = 0,1912x – 0,0693 0,98 6,71

Benzokfluoranten 38,034 253,0 0,12 0,4 y = 0,3149x – 0,1005 0,99 6,59

Benzoapiren 39,002 253,0 0,18 0,6 y = 0,0811x – 0,0419 0,99 9,73

Indeno1,2,3-cd piren 42,678 277,0 2,49 8,3 y = 0,0251x – 0,0149 0,99 4,28

Dibenza,hantracen 42,950 279,0 0,18 0,6 y = 0,1022x + 0,0271 0,99 7,32

Benzog,h,iperilen 43,648 276,0 5,37 17,9 y = 0,0865x – 0,0329 0,98 8,67

x - intenzitet signala y - koncentracija analita; m/z - odnos mase i naelektrisanja jona

39

Šematski prikaz izvođenja metode koja je predložena za analizu PAU iz uzoraka kafe

prikazana je na Slici 14.

Slika 14. Šema izvođenja metode predložene za analizu PAU u uzorcima kafe

Odmeriti 10 g uzorka kafe i prebaciti u kačers kivetu od 50 ml, dodati surogat standard i 10 ml vode

Dodati 20 ml acetonitrila, mućkati 1 minut i nakon toga ostaviti 30 minuta na ultrazvučnom kupatilu

Dodati 8 g MgSO4 i 2 g NaCl, mućkati 1 minut i centrifugirati 10 minuta na 4000 rpm

Prebaciti 1.5 ml supernatanta u kivetu koja sadrži 150 mg MgSO4 i 50 mg klinoptilolita, mućkati 5 minuta i

centrifugirati 10 minuta na 8000 rpm

Prebaciti 1 ml supernatanta u GC-MS vialu i dodati 200 µl unutrašnjeg standarda

Injektovati 2,5 µ u GC-MS

40

4.2. Analiza sadržaja PAU u realnim uzorcima kafe

Analiza sadržaja PAU u realnim uzorcima je usledila nakon optimizacije i validacije

metode. Analizirano je osam vrsta kafa istog proizvođača, koje se nalaze na tržištu u hermetički

zatvorenoj ambalaži. Uzorci su pripremljeni optimizovanom kačers tehnikom, gde je kao

rastvarač korišćena smeša acetonitril/voda, a kao sorbent klinoptilolit. Dobijeni ekstrakti su

zatom analizirani na GC-MS-u. Rezultati analize su prikazani u Tabeli 8.

41

Tabela 8. Koncentracije policikličnih aromatičnih ugljovodonika u analiziranim uzorcima (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8) kafe (g / kg)

Uzorak 1 2 3 4 5 6 7 8

Naftalen 40,39 33,91 39,17 35,71 20,74 36,72 40,75 49,68

Acenaftilen 13,39 9,58 12,38 117,36 14,54 70,56 113,04 72,26

Acenaften 2,74 2,74 3,67 2,81 25,92 20,88 19,08 192,67

Fluoren 5,40 4,39 6,62 4,68 4,10 21,60 22,90 23,54

Fenantren 21,17 18,14 25,34 19,58 192,96 32,40 29,74 30,31

Antracen 96,84 93,17 10,97 94,46 94,32 n,d, 59,76 59,33

Fluoranten 4,32 4,18 7,20 4,18 6,12 59,04 30,96 30,96

Piren 1,01 1,44 1,73 1,30 0,94 2,88 11,52 n.d.

Hrizen n.d. 39,89 26,93 35,14 60,48 1,15 n.d. n.d.

Benzoaantracen 25,78 35,06 35,57 44,50 7,86 2,16 1,44 16,27

Benzobfluoranten n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.

Benzokfluoranten n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.

Benzoapiren n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.

Indeno1,2,3-

cdpiren n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 3,60 n.d.

Dibenzoa,hantracen n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.

42

Benzo g,h,i perilen 41,76 33,62 n.d. n.d. n.d. 23,04 26,78 17,05

16 PAH 253,79 278,12 172,58 363,71 432,98 276,43 366,57 500,08

LMW PAH 179,93 161,93 98,16 274,61 352,58 182,16 285,26 427,80

HMW PAH 72,86 114,19 71,42 85,10 75,40 88,27 74,30 64,28

n.d. – nije detektovano (vrednost ispod granice detekcije), PAU - policiklični aromatični ugljovodonici, LMW – PAU niskih

molekulskih masa, HMW – PAU visokih molekulskih masa

43

U prvom uzorku kafe, od policikličnih aromatičnih ugljovodonika u najvećoj meri je

prisutan antracen (96,84 g/kg). Pored antracena u većim koncentracijama su prisutni

benzog,h,iperilen (41,78 g/kg) i naftalen (40,39 g/kg), a u najmanjoj koncentraciji je

prisutan piren (1,01 g/kg). Koncentracija benzoapirena, jedinjenja koje je svrstano u grupu

kancerogena za ljude od strane Međunarodne agencije za istraživanje raka, bila je ispod granice

detekcije metode.

Drugi uzorak takođe u najvećoj koncentraciji sadrži antracen (93,17 g/kg), a u

najmanjoj koncentraciji piren (1,44 g/kg). U ovom uzorku nisu detektovani benzobfluoranten,

benzokfluoranten, benzoapiren, indeno1,2,3-cdpiren i dibenzoa,hantracen.

Od svih ispitivanih uzoraka, treći uzorak sadrži najmanju ukupnu količinu PAU (172,58

g/kg). Benzoaantracen je PAU koji je najzastuljeniji u ovom uzorku (35,57 g/kg), dok

benzobfluoranten, benzokfluoranten, benzoapiren, indeno1,2,3-cdpiren,

dibenzoa,hantracen i benzo g,h,i perilen nisu detektovani.

Četvrti uzorak sadrži acenaftilen (117,36 g/kg) i antracen (94,46 g/kg) u najvećoj

koncentraciji, dok je piren kao i u prethodnim uzorcima zastupljen u najmanjoj koncentraciji

(1,30 g/kg). PAU koji nisu detektovani u ovom uzorku su: benzobfluoranten,

benzokfluoranten, benzoapiren, indeno1,2,3-cdpiren, dibenzoa,hantracen i benzo g,h,i

perilen.

Peti uzorak u najvećoj koncentraciji sadrži fenantren (192,96 g/kg), a

benzobfluoranten, benzokfluoranten, benzoapiren, indeno1,2,3-cdpiren,

dibenzoa,hantracen i benzo g,h,i perilen nisu detektovani.

U uzorku broj 6, antracen, jedinjenje koje je u većini uzoraka određeno u najvećoj

koncentraciji, nije detektovan. U ovom uzorku u najvećoj koncentraciji nalazi se acenaftilen

(70,56 g/kg), a u najmanjoj hrizen (1,15 g/kg). Ispod granice detekcije bili su: antracen,

benzobfluoranten, benzokfluoranten, benzoapiren, indeno1,2,3-cdpiren,

dibenzoa,hantracen.

Sedmi uzrak sadrži u najmanjoj koncentraciji benzoaantracen (1,44 g/kg), a antracen

je najzastupljeniji (59,76 g/kg). Indeno1,2,3-cdpiren pronađen je samo u ovom uzorku i

njegova koncentracija iznosila je 3,60 g/kg.

Osmi uzorak sadrži najveću količinu ukupnih PAU (500,08 g/kg) od svih ispitivanih

uzoraka, gde se u najvećoj koncentraciji od 192,67g/kg nalazi acenaften, a najmanju

koncentraciju ima benzoaantracen (16,27 g/kg). U ovom uzorku hrizen i piren, koji su u

prethodnim uzorcima imali najmanje koncentracije, nisu detektovani.

Ukupan sadržaj svih 16 PAU u realnim uzorcima prikazan je na Slici 15.

44

Slika 15. Ukupni sadržaj PAU u realnim uzorcima kafe (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, )

Najveći ukupni sadržaj policikličnih aromatičnih ugljovodonika određen je u uzorku broj

8 (500,08 g/kg). Najniža koncentracija ukupnih PAU iznosila je 172,58 g/kg (uzorak broj 3).

Ukupni sadržaj PAU koji može da se odredi u uzorcima kafe zavisi od vrste ispitivane kafe, da li

je u pitanju mešavna kafa ili čista kafa kao i od načina pripreme uzoraka. Poređenjem dobijenih

rezultata za ukupan sadržaj PAU, sa rezultatima iz rada Grover i sar., 2013., gde je ukupan

sadržaj PAU bio u opsegu od 831,7 do 1589 g/kg, uočava se da je ukupan sadržaj PAU,

određen u ovom radu značajno manji. Poređenjem dobijenih vrednosti sa vrednostima iz rada

Stancic i sar., 2008., gde je publikovana koncentracija ukupnih PAU u opsegu od 0,001 do

90,732 g/kg, može se zaključiti da je ukupni sadržaj PAU određen u ovom radu značajno veći.

Sadržaj policikličnih aromatičnih ugljovodonika niskih molekulskih masa (LMW)

prisutnih u ispitivanim uzorcima prikazan je na Slici 16.

0

100

200

300

400

500

600

1 2 3 4 5 6 7 8

Konce

ntr

acij

a

g/k

g

Uzorak

45

Slika 16. Sadržaj LMW PAU u u realnim uzorcima kafe (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, )

Koncentracija LMW policikličnih aromatičnih ugljovodonika u analiziranim uzorcima kafe je

bila u intervalu od 98,16 g/kg za treći uzorak do 427,80 g/kg za osmi uzorak.

Sadržaj PAU visokih molekulskih masa (HMW) prisutnih u ispitivanim uzorcima

prikazan je na Slici 17.

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

1 2 3 4 5 6 7 8

Konce

ntr

acij

a

g/k

g

Uzorak

46

Slika 17. Sadržaj HMW PAU u u realnim uzorcima kafe (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, )

Koncentracija HMW PAU u analiziranim uzorcima kafe bila je u intervalu od 64,28 g/kg za

uzorak broj 8, do 114,19 g/kg za uzorak broj 2. Koncentracije prisutnih HMW PAU u prvom i

trećem uzorku su vrlo bliskih vrednosti i iznose 72,86 g/kg i 71,42 g/kg. Takođe i

koncentracije HMW PAU u petom i sedmom uzorku imaju veoma bliske vrednosti koje iznose

75,40 g/kg i 74,30 g/kg.

0

20

40

60

80

100

120

1 2 3 4 5 6 7 8

Konce

ntr

aci

ja

g/

kg

Uzorak

47

5. Zaključak

48

Cilj ovog rada bio je određivanje koncentracije policikličnih aromatičnih ugljovodonika

koje je Evropska Unija propisala kao prioritetne: acenaftilen, antracen, acenaften,

benzo[a]antracen, benzo[a]piren, benzo[b]fluoranten, benzo[ghi]perilen, benzo[k]fluoranten,

krizen, dibenzo[a,h]antracen, fluoranten, fluoren, indeno[1,2,3-cd]piren, naftalen, fenantren,

piren u uzorcima komercijalne kafe. Uzorci su pripremani modifikovanom kačers tehnikom, a

kvantitativna analiza pripremljenih uzoraka kafe vršena je primenom GC-MS metode.

Najpre je izvršena optimizacija kačers tehnike, kao jedne od najperspektivnijih metoda

pripreme uzoraka. Ispitana je mogućnost upotrebe tri različita sorbenta u koraku prečišćavanja

ekstrakata- PSA, dijatomejska zemlja i termički tertian klinoptilolit. Najbolji rezultati dobijeni su

upotrebom smeše acetonitri/voda kao ekstrakcionog sredstva i klinoptilolita kao sorbenta.

Policiklični aromatični ugljovodonici su iz uzorka kafe ekstrahovani primenom optimizovane

kačers tehnike. Ova metoda se izvodi za veoma kratko vreme primenom jednostavne

labaratorijske opreme i tehnika, kao i korišćenjem minimalne količine organskih rastvarača i

drugih reagenasa.

Nakon optimizacije i validacije metode, određivane su koncentracije prioritetnih PAU u

osam uzoraka različitih vrsta kafa istog proizvođača. Iz dobijenih rezultata uočeno je da je

najveća koncentracija ukupnih PAU prisutna u uzorku 8 (mešavina arabike, afričke i azijske

robusta kafe), dok je najmanja u uzorku broj 3 (mešavina arabike i odabrane sorte robuste).

Piren je pronađen samo u uzorku 8.

Benzobfluoranten, benzokfluoranten, benzoapiren, dibenzoa,hantracen nisu

pronađeni ni u jednom ispitivanom uzorku kafe, dok je indeno1,2,3-cdpiren pronađen samo u u

uzorku 7, u koncentraciji od 3,6 g/kg.

Fenantren je pronađen u svim ispitivanim uzorcima, ali sa najvećom koncentracijom od

192,96 g/kg nalazi se u uzorku broj 5.

Sadržaj policikličnih aromatičnih ugljovodonika u uzorcima kafe, određen

modifikovanom i validovanom metodom, u skladu je sa podacima iz literature, mada je

evidentno da zavisi od vrste kafe korišćene za pripremu komercijalnih proizvoda, kao i od samog

tehnološkog procesa.

49

6. Literatura

50

Angelica Jimenez, Afolabi Adisa, Cara Woodham, and Mahmoud Saleh, (2014.), Determination

of polycyclic aromatic hydrocarbons in roasted coffee, J Environ Sci Health 49(11): 828–835

Anna Sadowska-Rociek & Magdalena Surma & Ewa Cieślik, (2014.), Determination of

Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Coffee and Coffee Substitutes using Dispersive SPE and

Gas Chromatography-Mass Spectrometry, Food Anal. Methods (2015) 8:109–121

Bogdanović Siniša, Farmakologija, univerzitet u Beogradu (1963). 266-267

EFSA, 2007. Findings of the EFSA date collection on polycyclic aromatic hydrocarbons in food.

https://sr.wikipedia.org/sr-el/kafa_(biljka)

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0165993615001478

https://sr.wikipedia.org/sr-el/kafa

http://kafomanija.com/o-kafi-poreklo-kafe

http://plezirmagazin.net/kafa-istorijat-i-tradicija

http://tehnologijahrane.com/enciklopedija/pečenje-zrna-kafe

Houessou, J.K., Maloug, S., Leveque, A.-S., Delteil, C., Heyd, B., Camel, V., 2007. Effect of

roasting conditions on the polycyclic aromatic hydrocarbon content in ground arabica coffee and

coffee brew. Journal of Agriculture and Food Chemistry 55, 9719–9726.

International Agency for Research on Cancer (IARC), (2010). Some non-heterocyclic polycyclic

aromatic hydrocarbons and some related exposures.

Khan Z., Troquet J., Vachelard C., (2005). Sample preparation and analytical techniques for

determination of polyaromatic hydrocarbons in soils. Int. J. Environ. Sci. Technol. 2: 275-286

Kruijf, N., Schouten, T., & van der Stegen, G. H. D. (1987). Rapid determination of

benzo[a]pyrene in roasted coffee and coffee brew by high-performance liquid chromatography

with fluorescence detection. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 545-549.

Larsen J. C., Alexander J. (2002), Polycyclic Aromatic Hydrocarbons – Occurrence in foods,

dietary exposure and health effects, Brussels Belgium

Luks-Betlej K. (1997), Clean-up methods for polycyclic aromatic hydrocarbons analyses by

capillary gas chromatography, Chromatographia 1997, Volume 45, Issue 1. pp. 243-248

Lundstedt S. (2003), Analysis of PAHs and their transformation products in contaminated soil

andremedial processes, Umeå University, Sweden

51

Maagd, P.G., Hulscher, D.E.M., Heuvel, H., Opperhuizen, A., Sijm, D.T.H.M. (1998)

Physicochemical properties of polycyclic aromatic hydrocarbons: Aqueous solubilities,

octanol/water partition coefficients, and Henry's law constants, Environmental Toxicology and

Chemistry 17, 251-257.

M. A. Gonzalez – Curbelo, B. Socas – Rodriguez, A.V. Herrera – Herrera, J. Gonzalez – Salamo,

J. Hernandez – Borges, M. A. Rodriguez – Delgado, Evolution and applications of the

QuEChERS method: TrAC Trends in Analytical Chemistry, Volume 71, September 2015, Pages

169-185

Nikolaou, A., Kostopoulou, M., Lofrano, G., Meric, S. (2009), Determination of PAHs in marine

sediments: Analytical methods and environmental concerns, Global NEST Journal 11, 391- 405.

Santino Orecchio, Viviana Paradiso Ciotti b,1, Loredana Culotta, (2009.), Polycyclic aromatic

hydrocarbons (PAHs) in coffee brew samples: Analytical method by GC–MS, profile, levels and

sources,Food and Chemical Toxicology 47 (2009) 819–826

Silvia A.V. Tfouni, Camila S. Serrate, Fernanda M. Leme, Monica C.R. Camargo, Camila R.A.

Teles, Kátia M.V.A.B. Cipolli a, Regina P.Z. Furlani (2012.), Polycyclic aromatic hydrocarbons

in coffee brew: Influence of roasting and brewing procedures in two Coffea cultivars,LWT -

Food Science and Technology 50 (2013) 526 -530

Skupinska K., Misiewicz I., Kasprzycka-Guttman, T., (2004). Polycyclic Aromatic

Hydrocarbons: Physicochemical Properties, Environmental Appearance and Impact on Living

Organisms. Acta Pol. Pharm. 61: 233–240.

Stankov Jovanović Vesna, Mitić Violeta, Ilić Marija, Jovanović Snežana, Ćirić Slobodan,

Stojanović Gordana, Primena disperzivne mikroekstrakcije čvrstom fazom kao tehnike pripreme

uzorka za GC – MS analizu PAU u vodi, Zbornik radova 2018. 364-369

Thompson M., Ellison S. L., Wood R., (2002). Harmonized guidelines for single-laboratory

validation of methods of analysis (IUPAC Technical Report). Pure App. Chem. 74: 835-855.