Биологический факультет МГУ имени М.В. ЛомоносоваБиологический факультет МГУ имени М.В. Ломоносова

ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ ТЕХНОЛОГИИТЕХНОЛОГИИ

Москва 20Москва 201313г.г.

профессор кафедры эмбриологии, д.б.н. профессор кафедры эмбриологии, д.б.н. Мария Львовна СеменоваМария Львовна Семенова

ВРТ: этические проблемы и юридические вопросы:ВРТ: этические проблемы и юридические вопросы:

• Суррогатное материнствоСуррогатное материнство – разрешать или нет – разрешать или нет??

• Кто является родителями ребенка, рожденного Кто является родителями ребенка, рожденного суррогатной матерью: право суррогатной и генетической суррогатной матерью: право суррогатной и генетической матерейматерей??• Может ли неженатый мужчина воспользоваться Может ли неженатый мужчина воспользоваться услугами суррогатной материуслугами суррогатной матери? ?

• Криоконсервация эмбрионовКриоконсервация эмбрионов – разрешать или нет – разрешать или нет??

• Кто распоряжается эмбрионамиКто распоряжается эмбрионами??• Что делать, если генетические Что делать, если генетические родители эмбрионов развелисьродители эмбрионов развелись??• Что делать, если генетические Что делать, если генетические родители умерлиродители умерли??• Сколько хранить эмбрионыСколько хранить эмбрионы??• Юридический статус эмбрионаЮридический статус эмбриона??

Да НетДа Нет• Что делать с Что делать с ““лишнимилишними” ” эмбрионамиэмбрионами??• Что делать с эмбрионами, Что делать с эмбрионами, если их криоконсервировали если их криоконсервировали в другой стране (где это в другой стране (где это разрешено)разрешено)??

Конституция РФКонституция РФ

Кодекс:Кодекс:

Закон:Закон:

Подзаконные Подзаконные акты: акты:

Семейный кодексСемейный кодекс

Приказы Приказы МинздравсоцразвитияМинздравсоцразвития и и

приложения к ним.приложения к ним.

ФЗ № 323-ФЗ ФЗ № 323-ФЗ ““Об основах Об основах охраны здоровья граждан в РФохраны здоровья граждан в РФ””

Юридическое регулирование ВРТ в РФЮридическое регулирование ВРТ в РФ

Статья 55. Применение ВРТ

Приказ №107Н от 30.08.2012

РоссийскРоссийскаяая Ас Асссоциациоциацияя Репродукции Человека Репродукции Человека

http://www.rahr.ru

http://www.hfea.gov.uk

Микроманипуляции в медицине:Микроманипуляции в медицине: ИКСИ – инъекция сперматозоида в ооцитИКСИ – инъекция сперматозоида в ооцит человекачеловека

Трансгенные животные – методы создания Трансгенные животные – методы создания

Инъекция генетической Инъекция генетической конструкции в пронуклеусконструкции в пронуклеус

Инъекция Инъекция модифицированных модифицированных ESES-клеток в полость -клеток в полость бластоцисты бластоцисты (получение (получение инъекционных инъекционных химер)химер)

Микроманипуляции

Эмбриология млекопитающих:

экспериментальные методы

Этапы получения трансгенных животных методом реконструкции Этапы получения трансгенных животных методом реконструкции эмбрионов с использованием эмбриональных стволовых клеток (ЭСК)эмбрионов с использованием эмбриональных стволовых клеток (ЭСК)

2: 2: В В ЭСК вводится генетическая конструкция ЭСК вводится генетическая конструкция Потом проводится молекулярно-генетический Потом проводится молекулярно-генетический анализ колоний, происходящих из трансгенных анализ колоний, происходящих из трансгенных клеток (анализируются встраивание введенного клеток (анализируются встраивание введенного гена в геном клеток, уровень экспрессии белка)гена в геном клеток, уровень экспрессии белка)3-4:3-4: конструирование химерных эмбрионов: конструирование химерных эмбрионов: трансгенные эмбриональные стволовыетрансгенные эмбриональные стволовыеклетки вводятся в полость бластоцистыклетки вводятся в полость бластоцисты

5-6:5-6: После трансплантация этих эмбрионов После трансплантация этих эмбрионов рождаются мышата; часть из них является рождаются мышата; часть из них является химерами, то есть в состав их организма входят химерами, то есть в состав их организма входят как клетки, происходящие из бластоцисты (на как клетки, происходящие из бластоцисты (на рисунке указаны белым цветом), так и клетки-рисунке указаны белым цветом), так и клетки-потомки трансгенных эмбриональных потомки трансгенных эмбриональных стволовых клеток (на рисунке черные). стволовых клеток (на рисунке черные).

7-8:7-8: Для скрещивания отбираются те мыши, у которых процент Для скрещивания отбираются те мыши, у которых процент трансгенных клеток выше. Эти мыши – гетерозиготы по трансгенных клеток выше. Эти мыши – гетерозиготы по трансгену, их еще надо скрещивать между собой, чтобы получить трансгену, их еще надо скрещивать между собой, чтобы получить гомозиготу.гомозиготу.

1:1: Получение ЭСК: бластоцисты оседают на Получение ЭСК: бластоцисты оседают на подложку на дно чашки Петри и распластыва-подложку на дно чашки Петри и распластыва-ются. Клетки ВКМ несколько раз перевивают, и ются. Клетки ВКМ несколько раз перевивают, и некоторые из них дают начало линиям ЭСК.некоторые из них дают начало линиям ЭСК.

Семенова, 2001, СОЖ т.7(4) Семенова, 2001, СОЖ т.7(4)

Клоны в природеКлоны в природе• Клоны растений (усы, корневые отпрыски и т.д.)

• Клоны беспозвоночных животных (бесполое размножение у кишечнополостных, кольчатых червей и т.п.)

• Клоны млекопитающих - монозиготные близнецы (размер клона – 2-3 ребенка у человека, полиэмбриония у броненосцев (размер клона около 10 особей)

Клонирование в лабораторииКлонирование в лаборатории• Разделение эмбрионов на ранних стадиях развития (размер клона не более восьми особей, но как правило, две-три)

• Пересадка ядер соматических клеток в ооцит или зиготу (теоретически размер клона не ограничен)

http://archives.cnn.com/2000/NATURE/01/13/monkey.cloning/

Клонирование методом разделения эмбрионовКлонирование методом разделения эмбрионов

Репродукти́вное клони́рованиеРепродукти́вное клони́рование — — предполагает, что в результате предполагает, что в результате получается целый организм. Кроме получается целый организм. Кроме научных целей оно может применяться научных целей оно может применяться для восстановления исчезнувших видов для восстановления исчезнувших видов или сохранение редких, и др.или сохранение редких, и др.

Терапевти́ческое клони́рованиеТерапевти́ческое клони́рование — — предполагает, что в результате предполагает, что в результате намеренно не получается целого намеренно не получается целого организма. Его развитие останавливают организма. Его развитие останавливают заранее, а получившиеся клетки заранее, а получившиеся клетки используют для выработки нужных используют для выработки нужных тканей или других биологических тканей или других биологических продуктов. Эксперименты показывают, продуктов. Эксперименты показывают, что терапевтическое клонирование может что терапевтическое клонирование может быть с успехом применено для лечения быть с успехом применено для лечения некоторых заболеваний, считающихся некоторых заболеваний, считающихся неизличимыминеизличимыми

Клонирование – создание Клонирование – создание генетической копии организмагенетической копии организма

Клонирование вьюна(Misgurnus fossilis )

Схема опыта доц. Л.А.Слепцовой(каф. эмбриологии МГУ)

Клон личинок вьюна

Искусственное Искусственное конструирование полиплоидовконструирование полиплоидов

«Вьюнопусы»«Вьюнопусы»ядра клеток ксенопуса ядра клеток ксенопуса

пересажены пересажены в яйцеклетки вьюнав яйцеклетки вьюна

«Вьюшка»«Вьюшка» ядро клетки травяной ядро клетки травяной лягушки пересажено в лягушки пересажено в

яйцеклетку вьюнаяйцеклетку вьюна

2 пронуклеуса 2 пронуклеуса ++ пересаженное ядро пересаженное ядро = = 4 4NN

Ксенотрансплантация ядер соматических клеток в зиготы(Л.А.Слепцова, каф. эмбриологии МГУ)

http://en.wikipedia.org/wiki/Dolly_the_Sheephttp://en.wikipedia.org/wiki/Dolly_the_Sheep

Овца ДоллиОвца Долли1996-07-05 - 2003-02-141996-07-05 - 2003-02-14

Долли с ягненком Долли с ягненком

Ian Wilmut, Keith Campbell

Клонирование методом пересадки ядраКлонирование методом пересадки ядрасоматической клеткисоматической клетки

Мышь КумулинаМышь Кумулина

Источник ядер Источник ядер донора – клетки донора – клетки кумулюсакумулюса

клон клонклон клон

суррогатная суррогатная матьмать

донордонорооцитовооцитов

донордонорядерядер

Гавайский университетГавайский университет1997 год1997 год

фолликулфолликул

Клонированные животные:Клонированные животные:

Клонированные поросята Клонированные поросята от создателей овцы Доллиот создателей овцы Долли

март 2000г. март 2000г.

Милли, Криста, Алексис, Милли, Криста, Алексис, Каррел и ДотсонКаррел и Дотсон

Эдинбург, Эдинбург, компания PPL Therapeuticsкомпания PPL Therapeutics

Клонированный поросенок Клонированный поросенок в Австралии в Австралии

Май 2001г. Май 2001г.

Клонирование клоновКлонирование клонов

Телята полученные из клеток клонированных коров Телята полученные из клеток клонированных коров в Японии (2000г.) и Бразилии (2004г.)в Японии (2000г.) и Бразилии (2004г.)

• Клонированные животные живут меньше, чем Клонированные животные живут меньше, чем обычныеобычные. . • В клетках клонов укороченные теломерные В клетках клонов укороченные теломерные участки.участки.

Чтобы проверить, сократиться ли срок жизни клонов Чтобы проверить, сократиться ли срок жизни клонов при повторном клонировании в яйцеклетки при повторном клонировании в яйцеклетки пересадили ядра из клеток клонов.пересадили ядра из клеток клонов.

Клонированные животные:Клонированные животные:

Первый клонированный мул Айдахо Гем

Photo: AFP

                              

Май 2003 Май 2003

Могут ли мулы размножатьсяМогут ли мулы размножаться??

Gordon Woods, Gordon Woods, University of Idaho, University of Idaho, the leader of the mule cloning team.the leader of the mule cloning team.

Могут, Могут, но только методом клонирования….но только методом клонирования….

©2008 by Society for the Study of Reproduction©2008 by Society for the Study of Reproduction

Трансгенные клонированные животныеТрансгенные клонированные животные::Экспрессия красного флуоресцентного белка (Экспрессия красного флуоресцентного белка (RFP)RFP)

у двух трансгенных клонированных котяту двух трансгенных клонированных котят

Yin X J et al. Biol Reprod 2008;78:425-431Yin X J et al. Biol Reprod 2008;78:425-431

Видимый свет: три котенка,Видимый свет: три котенка,Два справа – клоны, Два справа – клоны, несущие чужеродный ген несущие чужеродный ген RFPRFP

Котят освещают светом с длиной Котят освещают светом с длиной волны 540 ± 20 нм (для возбуждения волны 540 ± 20 нм (для возбуждения флуоресценции флуоресценции RFP) RFP) и смотрят на и смотрят на них через фильтр, пропускающий них через фильтр, пропускающий свет длиннее 600 ± 25 nmсвет длиннее 600 ± 25 nm

Трансгенные клонированные свиньи, продуцирующие Трансгенные клонированные свиньи, продуцирующие интегрины (белки клеточной адгезии) человекаинтегрины (белки клеточной адгезии) человека..

Staunstrup NHStaunstrup NH et al., et al., Development of transgenic cloned pig models of skin inflammation by DNA Development of transgenic cloned pig models of skin inflammation by DNA transposon-directed ectopic expression of human β1 and α2 integrin. PLoS One. 2012;7(5). transposon-directed ectopic expression of human β1 and α2 integrin. PLoS One. 2012;7(5).

Для клонирования млекопитающих в Для клонирования млекопитающих в лаборатории нужно:лаборатории нужно:

• Достаточное количество самок – доноров ооцитов/Достаточное количество самок – доноров ооцитов/зигот и иметь условия для их содержания;зигот и иметь условия для их содержания;

• Уметь получать ооциты/зиготы и иметь для этого Уметь получать ооциты/зиготы и иметь для этого оборудование;оборудование;

• Получить культуру клеток той особи, которую вы Получить культуру клеток той особи, которую вы собираетесь клонировать, и иметь оборудование для собираетесь клонировать, и иметь оборудование для клеточного культивирования;клеточного культивирования;

• Владеть методами микрохирургии эмбрионов и Владеть методами микрохирургии эмбрионов и иметь оборудование для этих операций;иметь оборудование для этих операций;

• Уметь пересаживать эмбрионы и иметь Уметь пересаживать эмбрионы и иметь достаточное количество половозрелых самок – достаточное количество половозрелых самок – суррогатных матерейсуррогатных матерей

• Владеть молекулярно-генетическими методами и Владеть молекулярно-генетическими методами и иметь необходимое оборудование для доказательства иметь необходимое оборудование для доказательства идентичности исходной особи и клонаидентичности исходной особи и клона

Цена клонированияЦена клонирования

Щенок Снуппи – первый клон Щенок Снуппи – первый клон собаки и Афган - афганская борзая, собаки и Афган - афганская борзая, из клеток которого он был из клеток которого он был клонирован (Южная Корея, 2005 г.)клонирован (Южная Корея, 2005 г.)

Было созданоБыло создано10951095

реконструированных эмбрионовреконструированных эмбрионов

Они были пересаженыОни были пересажены 123123

суррогатным матерямсуррогатным матерям

РазвилисьРазвились 33 эмбриона:эмбриона:

родился родился мертвыммертвым

погиб во время погиб во время беременностибеременности

СнуппиСнуппи

Lorthongpanich, Solter, LimLorthongpanich, Solter, Lim, 2010, 2010

Эффективность клонирования – обзор данных на 2010г.Эффективность клонирования – обзор данных на 2010г.

Терапевтическое клонирование Терапевтическое клонирование эмбрионов человекаэмбрионов человека

Клонированные эмбрионы пока не получены, но с ними связывают Клонированные эмбрионы пока не получены, но с ними связывают Надежду на получение клеток для аутологической пересадки больномуНадежду на получение клеток для аутологической пересадки больному

Южнокорейский ученый Ву Сук Хванг в 2004 году сообщил о получении человеческих стволовых клеток из клонированных эмбрионов человека,

но его работа оказалась подделкой.

Hwang WS, Roh SI, Lee BC, Kang SK, Kwon DK, Kim S, Kim SJ, Park SW, Kwon HS, Lee CK, Lee JB, Kim JM, Ahn C, Paek SH, Chang SS, Koo JJ, Yoon HS, Hwang JH, Hwang YY, Park YS, Oh SK, Kim HS, Park JH, Moon SY, Schatten G. Patient-specific embryonic stem cells derived from human SCNT blastocysts. Science. 2005 Jun 17;308:1777-83.

Hwang WS, Ryu YJ, Park JH, Park ES, Lee EG, Koo JM, Jeon HY, Lee BC, Kang SK, Kim SJ, Ahn C, Hwang JH, Park KY, Cibelli JB, Moon SY. Evidence of a pluripotent human embryonic stem cell line derived from a cloned blastocyst. Science. 2004 Mar;303:1669-74

Попытки клонирования приматов В 2007 г. группа исследователей под руководством Шукрата Миталипова (Shoukhrat Mitalipov) из Орегонского университета здоровья и науки (Oregon Health and Science University) смогли получить клонированные эмбрионы приматов и извлечь из них две линии эмбриональных стволовых клеток.

Byrne JA, Pedersen DA, Clepper LL, Nelson M, Sanger WG, Gokhale S, Wolf DP, Mitalipov SM. Producing primate embryonic stem cells by somatic cell nuclear transfer. Nature. 2007 Nov 22;450(7169):497-502.

Sotomaru Y, Hirakawa R, Shimada A, Shiozawa S, Sugawara A, Oiwa R, Nobukiyo A, Okano H, Tamaoki N, Nomura T, Hiyama E, Sasaki E. Preimplantation development of somatic cell cloned embryos in the common marmoset (Callithrix jacchus). Cloning Stem Cells. 2009 Dec;11(4):575-83.

Okahara-Narita J, Tsuchiya H, Takada T, Torii R. Cloned blastocysts produced by nuclear transfer from somatic cells in cynomolgus monkeys (Macaca fascicularis). Primates. 2007 Jul;48(3):232-40

Клонированные эмбрионы обезьян были получены только когда ядра для клонирования брали из другого эмбриона

51 эмбрион был пересажен 9 самкам

Meng L, Ely JJ, Stouffer RL, Wolf DP. Rhesus monkeys produced by nuclear transfer. Biol Reprod. 1997 Aug;57(2):454-9

C. Simerly et al., Science 300, 297 (2003)

Молекулярные основы неудач при клонировании приматов:

(A) Дефектное веретено деления с неправильно расположенными хромосомами после пересадки соматического ядра. Центросомальный белок митотического аппарата NuMA в норме в процессе мейоза (B) и митоза (C), отсутствует в веретене деления после переноса ядра (D). После переноса ядра соматической клетки отсутствует центросомальный белок HSET (E), но присутствует белок Eg5 в центромерах. (F). Биполярные веретена деления с правильно расположенными хромосомами и центросомальным белком NuMA после переноса соматического ядра в оплодотворенные яйцеклетки (G). Голубой - ДНК; красный -тубулин; зеленый - NuMA на рис. (B), (C), (D) и (G), HSET – на рис. (E), и Eg5 – на рис. (F).

после переноса ядра соматической клетки в яйцеклетку приматов нарушения в формировании веретена деления приводят к развитию анеуплоидных эмбрионов

Масштабный отрезок – 10 мкм

В некоторых странах (В некоторых странах (Бразилия, Германия, Великобритания, ЯпонияБразилия, Германия, Великобритания, Япония) уголовная ) уголовная ответственность за клонирование установлена специальными законами. ответственность за клонирование установлена специальными законами.

ИспаниИспанияя 1995 г., Сальвадор 1997 г., Колумби 1995 г., Сальвадор 1997 г., Колумбияя 2000 г., Эстони 2000 г., Эстонияя 2001 г., Мексик 2001 г., Мексикаа 2002 г., Молдов2002 г., Молдоваа 2002 г., Румыни 2002 г., Румынияя 2004 2004, , СловениСловения я 2002 г., Словакии — в 2003 г. 2002 г., Словакии — в 2003 г.

Во Во ФранцииФранции дополнения в Уголовный кодекс, предусматривающие ответственность за дополнения в Уголовный кодекс, предусматривающие ответственность за клонирование, были внесены в соответствии с Законом о биоэтике от 6 августа 2004 г.клонирование, были внесены в соответствии с Законом о биоэтике от 6 августа 2004 г.

Федеральный закон ФРГ о защите эмбрионов 1990 г.Федеральный закон ФРГ о защите эмбрионов 1990 г. называет преступлением называет преступлением создание эмбриона, генетически идентичного другому эмбриону, происходящему от живого создание эмбриона, генетически идентичного другому эмбриону, происходящему от живого или мертвого лица.или мертвого лица.

В ВеликобританииВ Великобритании соответствующие уголовные нормы содержит Закон о репродуктивном соответствующие уголовные нормы содержит Закон о репродуктивном клонировании человека 2001 г. клонировании человека 2001 г. (Human Reproductive Cloning Act 2001),(Human Reproductive Cloning Act 2001), который который предусматривает санкцию в виде 10 лет лишения свободы. При этом терапевтическое предусматривает санкцию в виде 10 лет лишения свободы. При этом терапевтическое клонирование человека разрешено.клонирование человека разрешено.

В СШАВ США запрет на клонирование впервые был введен ещё в 1980 г. В 2003 г. Палата запрет на клонирование впервые был введен ещё в 1980 г. В 2003 г. Палата представителей Конгресса США приняла закон представителей Конгресса США приняла закон (Human Cloning Prohibition Act of 2003),(Human Cloning Prohibition Act of 2003), по которому клонирование, нацеленное как на размножение, так и на медицинские по которому клонирование, нацеленное как на размножение, так и на медицинские исследования и лечение, рассматривается как преступление с возможным 10-летним исследования и лечение, рассматривается как преступление с возможным 10-летним тюремным заключением и штрафом в 1 млн долларов. В январе 2009 года запрет на тюремным заключением и штрафом в 1 млн долларов. В январе 2009 года запрет на терапевтическое клонирование был снят.терапевтическое клонирование был снят.

В ЯпонииВ Японии парламентом 29 ноября 2000 г. был принят «Закон, регулирующий применение парламентом 29 ноября 2000 г. был принят «Закон, регулирующий применение технологии клонирования человека и других сходных технологий»технологии клонирования человека и других сходных технологий»

Введение запретов на репродуктивное клонирование человека

Федеральный закон «О временном запрете на клонирование человека» от 20 мая 2002 г. № 54-ФЗ (запрет на репродуктивное клонирование человека на 5 лет)

Продлен весной 2010 года бессрочно: с формулировкой …до вступления в силу закона, устанавливающего порядок применения биотехнологий в этой области….

Законодательное регулирование клонирования человека в Российской федерации

В декабре 2006 года в Австралии был снят запрет на клонирование человеческого

эмбриона.

В сентябре 2008 года правительство Австралии выдало фирме Sydney IVF,

разрешение создавать клонированные эмбрионы человека для получения

эмбриональных стволовых клеток.

Клонирование эмбрионовчеловека в Австралии

В распоряжение фирмы будут предоставлены 7200 человеческих

яйцеклеток

O wonder!O wonder!How many goodly creatures are there here!How many goodly creatures are there here!How beauteous mankind is! O brave new world,How beauteous mankind is! O brave new world,That has such people in't.That has such people in't. — —WilliamWilliam ShakespeareShakespeare, , ””TheThe TempestTempest””

ФакультетФакультет _____________________________ _____________________________

Курс Курс ____________________________________________________________________

Группа Группа ________________________________________________________________

Фамилия Имя ОтчествоФамилия Имя Отчество____________________________________

ДатаДата: : 10 апреля10 апреля 2013 г.2013 г.

Вопрос 1. Вопрос 1. Какова цель терапевтического клонированияКакова цель терапевтического клонирования??

Ответ1:_________________________________Ответ1:_________________________________

Вопрос 2. Вопрос 2. Перечислите млекопитающихПеречислите млекопитающих,, которые были которые были клонированы?клонированы?

Ответ2Ответ2:_________________________________:_________________________________