독 전체 시험연구 표

종보고

년 월2009 4

연구

한양 학 산학 력단

국 립 경 과 학 원

출

국립환경과학원장 귀하

본 보고 를 독 체 시험연구의 표 과 의[ ]

최종 보고 로 출합니다.

2009. 04.

한양 학 산학 단

참여 연구진

□□□ 연구자

책임연구원 황승용 한양 학 분자생명과학부( )

참여 연구원

주 지노첵( )

승 지노첵( )

지노첵( )

연종 지노첵( )

맹 한양 학 분자생명과학부( )

이승용 한양 학 분자생명과학부( )

리 한양 학 분자생명과학부( )

□□□ 자 원

류재천 한국과학 연구원( )

이미 천향 학 의과 학( )

이행 주 미래( ) E&I

강주희 인하 학 의과 학( )

1

- 1 -

장 개 요1 .

경 요1.

¡

¡

¡

¡

¡

- 2 -

연구목표 범2.

연구목표2.1.

연구범2.2.

- 3 -

- 4 -

장 사업내용 결과2 .

부과 독 체 시험체계 법론 립 한 연구조사1. 1 :

학 질 해 평가를 한 독 체 시험지침 조사1.1.

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m

m

- 5 -

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m

m

- 6 -

Regulatory Resources

GROUP S DOCUMENTS

FDA Center fo r Drug Evaluation and Research (CD ER)

http://www.fda.gov/cder

Nationa l Research C ounil (NRC) Committin g on Emerg ing Issu es and

Data on Env iromental Contaminants

http://dels.nas.edu/emergingi ssues/index .asp

Microarray Gene Expression Data (MGED)Society

http://www.mged .org

Guidane for Industry:Pharmacogen omicsData Submission

http ://www.fda.gov/cder/guidaqnce/ index.htm

Interim Policy on Genomics

http:/ /epa.gov/osa/spc/htm/genomics.pdf

Mini-Monograph: Genomics and Risk Assessmen t http:/ /ehp.niehs.nih.gov/txg/docs/2004/112-4/toc.

Poten tial Implicat ion s of Genomics for R egulatory and Ri sk Assessment App lica tions at E PA

http:/ /www.epa.gov/osa/genomics-external-review.draft.pdf

가 미국 의 역할( ) FDA

나 미국 의 역할( ) NIH/NIEHS

m

- 7 -

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m

m

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- 8 -

m

다 국 로그램 동향 국 구의 역할( )

m

m

- 9 -

m

라 등 국 구 동향( ) OECD IPCS

m

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- 10 -

m

m

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- 11 -

m

m

- 12 -

MAQC(Microarray Quality Control) ToxCastTM

미 산하 개 센터를 심으로 다FDA 6

양한 분석을 위한 가이드Microarry data

라인 개 을 하 위하여 제안 됨

의 분자스크리닝 프로젝트의 한OECD/ EPA

분야로서 를 포함한Microarray HTS, HCS

식을 이 한 학물 들의 잠재적 유해성

을 측 판정하 위하여 제안됨,

MGED(Microarray and Gene Expression

data) Society

� MIAME-Tox(Minimum information

about a microarray experiment)

� ArrayTrack

� ACToR(Aggregated Commutational

Toxicology Resources)

� DSSTox(Dixtributed Structure

searchable Toxicology)

� ToxRefDB(Toxicity Reference

Database)

� NCGC(Narional Institute of Health

Chemical Genomics Center)

- 13 -

category Description Acronym Domain

Omics technology

communications

T e c h n o l o g y - d r i v e n

의 개 을 위한 아standards

카 믹한 분야의 전문가들과

상업적인 분야의 전문가들의

임

MGED

PSI

SMRS

Microarray

Proteomics

Metabolomics and

metabonomics

Measurement and

methods validations

물 실험 에 선정

에 른 프로그램을validation

점적으로 논의함

ECVAM

ERCC

MARG

ABRF

MFB

A r r a y - b a s e d

toxicogenomics

Microarrays and

quantiative RT-PCR

Microarray

Regulatory driven

discussion fora

믹스 이터 분석 을

체계 하 위한 내 을

점적으로 논의함

CDISC

PGx

SEND

Clinical data

Phamacogenomics data

Animal toxicity data

Domain-driven

discussion fora

학물 로 인한 성부분과

경 성학 분야의 이터 통

합 련 가 점적임dusr

DSSTOX

SEEK

Chemical toxicity data

Ecological data

World -wide

Organizations

성유전체학을 제적으로

공통된 주제 가이드라인

제정을 위해 노력함

IPCS

NAS

OECD

BSC IEEE

Toxicogenomics

(Eco)toxicogenomics

Ecotoxicogenomics

Bioscience

Infrastructures

다양한 이터들을 통합적으

로 정리할 수 있는

S t a n d a r d s - c o mp l i a n t

infrastructure

ArrayExpress

and

Tox-MIAMExp

ress

CEBS

CTD

maxd

TIS

(ArrayTrack)

Array- based data and

toxicology endpoints

values

Toxicogenomics

Genes and proteins

Array-based data and

Environmental metadata

Toxicogenomics

- 14 -

독 체 시험자료의 리 활용 마1.2

m

m

m

m

m

- 15 -

m

· Array design description;

· Gene expression experiment description.

2a) For each reporter type

· the type of the reporter: synthetic oligo-nucleotides, PCR products, plasmids,

colonies, other

· single or double stranded

2b) For each reporter

· sequence or PCR primer information:

· sequence or a reference sequence (e.g., for oligonucleotides), if known

· sequence accession number in DDBJ/EMBL/GenBank, if exists

· primer pair information, if relevant

· approximate lengths if exact sequence not known

· clone information, if relevant (clone ID, clone provider, date, availability)

· element generation protocol that includes sufficient information to reproduce

the element for custom-made arrays that are not generally available

3a) For each feature type

· dimensions

· attachment (covalent/ionic/other)

· technology used to generate the feature

3b) For each feature

· which reporter and the location on the array

4) For each composite sequence

· which reporters it contains

· the reference sequence

· gene name and links to appropriate databases (e.g., SWISS-PROT, or

organism specific databases), if known and relevant

- 16 -

5) Control elements on the array

· position of the feature (the abstract coordinate on the array)

· control type (spiking, normalization, negative, positive)

· control qualifier (endogenous, exogenous)

Experiment description

1. Toxicogenomic experimental design

2. Biological materials used, extract preparation and labeling, toxicological

assays.

3. Hybridization procedures and parameters

4. Gene expression measurement data and

5. Specifications of data processing

1. Toxicogenomic experimental design

1.1 Authors, laboratory, contact

1.2 Type of the experiment for instance:

· Acute, pre-chronic or chronic treatment

· multiple tissue comparison

· temperature shock

· biomarker identification

· normal vs. diseased comparison

· treated vs. untreated comparison

· time course

· dose response

· effect of gene knock-out

· effect of gene knock-in (transgenics)

- 17 -

1.3 Experimental factors, i.e. organisms, parameters or conditions tested, for instance,

· species

· strain

· sex type

· age and weight

· cell line

· cell type

· developmental stage

· disease state

· genotype

· protocol

· route of exposure

· temperature

· time of treatments and observations

· dose(s) in standard units

· genetic variation

· response to a treatment or compound

1.4 How many hybridizations in the experiment?

1.5 If a common (standard) reference material used for all hybridizations

1.6 Quality control steps taken:

· Replicates done (yes/no), type of replicates, description

· biological

· technical

· if pools of extracts (yes/no) were used versus extracts from individual

samples, description

· whether dye swap is used (only for two channel platforms)

· other (e.g., polyA tails, low complexity regions, unspecific binding)

· other.

1.7 A brief description of the experiment and its goal and a link to a publication if

one exists

- 18 -

2. Biological materials used, extract preparation and labeling, toxicological assays.

Source of the sample (biosource properties);

Treatments applied to the samples (manipulations);

Toxicological assessments;

Extract preparation;

Extract labelling; and

Hybridization controls.

2.1 Biosource properties

· organism (NCBI taxonomy)

· sample source provider

· descriptors relevant to the particular sample, such as

sex

age

weights

development stage

organism part (tissue) of the organism's anatomy from which the biological

material is derived (if samples are cells)

cell type

animal/plant strain or line

genetic variation (e.g., gene knockout, transgenic variation)

individual genetic characteristics (e.g., disease alleles, polymorphisms)

disease state or normal

additional clinical information available (link)8 Links (URL), citations

an individual identifier (for interrelation of the biological materials in the

experiment)

For recommendations on controlled vocabularies that can be used see

- 19 -

2.2 Sample manipulations: laboratory protocols and relevant parameters, such as:

· facilities details

· animal husbandry and housing details

· cell culture conditions

· growth conditions (passage level and frequency)

· metabolic competency of cell strains

· treatment (stressor), in vivo, in vitro

· treatment type (e.g., compound, small molecule, heat shock, cold shock, food

deprivation, diet)

· treatment compound name and grade formulation, including manufacturer

· type of compound (e.g. chemical, drug or solvent)

· CASRN, chemical structure/molecular formula

· vehicle for chemical treatment

· exposure method (route of administration, e.g. oral, gavage, mucolar, medium,

intraperitoneal, intramuscular, intravenous, topical)

· duration

· dose (and unit)

· separation technique, for tissues or cells from a heterogeneous sample (e.g.,

none, trimming, microdissection, FACS)

· date/time at death or at sacrifice

· sacrifice method

For recommendations on controlled vocabularies that can be used see

- 20 -

2.3. Toxicological assessments: laboratory protocols and relevant parameters

measured and data files e.g.,

Clinical observations

· weight

· survival (yes/no)

· signs (e.g., general, behavior)

· site of application

· lesions

· color effects

· other

Gross necropsy examination

· organs and tissues examination list

· organs and tissues collection list

· organs and tissues weight list

· organs and tissues storage method and location

Histopathology evaluation

· which biological materials (control and experimental)

· slide preparation, storage method and location

· topography (definite anatomical region)

· system

· organ

· sites

· cell type(s)

· morphology(s)

· qualifier(s) for the morphology(s)

Clinical pathology

· hematology (e.g., erythrocyte count, mean corpuscular volume, hemoglobin)

· clinical chemistry (e.g.,sorbitol dehydrogenase (SDH), alkaline phosphatase

(ALP), creatine kinase (CK))

· other parameters measured, e.g., sperm morphology and vaginal cytology

evaluation (SMVCE)

· estrous cycle length

· micronucleated erythrocytes determination

· functional observation battery

· other.

- 21 -

2.4 Hybridization extract preparation protocol for each extract prepared from the

biological material, including

· extraction method

· whether total RNA, mRNA, or genomic DNA is extracted

· amplification (RNA polymerases, PCR)

2.5 Labeling protocol for each labeling prepared from the extract, including

· amount of nucleic acids labeled

· label used (e.g., A-Cy3, G-Cy5, 33P, .)…

· label incorporation method

· Facility details (if this part of the experiments has been carried out in facility

different from the sample treatment and toxicological assessments steps above,

e.g. consortium, contracting out.

2.6 External controls added to hybridization extract(s) (spiking controls)

· element on array expected to hybridize to spiking control

· spike type (e.g., oligonucleotide, plasmid DNA, transcript)

· spike qualifier (e.g., concentration, expected ratio, labelling methods if different

than that of the extract)

3. Hybridization procedures and parameters

Each hybridization description should include information about which labelled extract

(related to which biological material, which extract) and which array (e.g., array design, batch

and serial number) has been used in the experiment; and the hybridization protocol, normally

including:

· the solution (e.g., concentration of solutes)

· blocking agent

· wash procedure

· quantity of labeled target used

· time, concentration, volume, temperature

· description of the hybridization instruments

- 22 -

4. Measurement data and specifications of data processing

We distinguish between three levels of data processing raw data (images),–

image quantitations and gene expression data matrix. Each hybridization has at

least one image, each image has a corresponding image quantitation table, where

a row represents an array design element and a column to a different quantitation

types, such as mean or median pixel intensity. Several quantitation tables can be

combined using data processing metrics to obtain the ‘final’ gene expression

measurement table associated with the experiment.

1) Raw data description should include for each scan laboratory protocol for

scanning, including scanning hardware and software, scan parameters, including

laser power, spatial resolution, pixel space, PMT voltage: scanned images;

It should be noted that MGED does not have consensus whether the provision

of images is a part of MIAME.

2) Image analysis and quantitation: image analysis software specification and

version, availability, and the description or identification of the algorithm and all

the parameters used for each image the complete image analysis output (of the

particular image analysis software)

3) Normalized and summarized data gene expression data matrix data–

processing protocol, including normalization algorithm

- 23 -

1. Abstract

2. Experiment design

- Author, laboratory, and contact

- Experimet type

- Experiment Description

- Experimental factor

- Number of hybridization replicated

- Common reference

- Quality control steps

- Qualifier, value, source

3. Array design

- Array design name

- Platform type

- Surface and coating specification

- Array dimensions

- Number of features on the array

- production protocol

- provider

3.2 Reporter related information

- Reporter type

- Reporter sequence information

- Reporter approximate length

- Clone information

- Reporter generation protocol

3.3 Features related information

- For each feature tupe

- For each feature reporter and location

3.4 Composite sequence related information

- composite sequence information

- Gene name Qualifier, value, source(may use more than once)

3.5 Control Elements related information

- Control element position

- Control

- Type

- 24 -

4. Biomaterials

4.1 Biosource properties

- Organism

- Sample contact details

- cell type- sex, Age

- Developmental stage

- Organism part

- strain or line

- Genetic variation

- Individual number

- Individual genetic characteristics

- Disease state

- Targeted cell type

4.2 Biomaterial manipulation

- In vivo treatment

- In vitro treatment

- Treatment type

- Compound

- Separation technique

4.3 Hybridization extract preparation

- Extraction me

- Nucleic acid type

- Amplification method

4.4 Sample labeling

- Amount of nucleic acid labeled

- Label used

- Label incorporation method

4.5 Spiking control

- Spiking control feature

- Spike type and qualifier

- Qualifier, value, source

5. Hybridization

- Relationship between samples and arrays

- Hybridization protocol

- Qualifier, value, source

6. Raw data

- scanner image file

- scanning protocol

6.2 Image analysis and quantitation

- Image analysis output & protocol

6.3 Normalized and summarized data

- Data processiong protocol

- Final gene expression table

- Qualifier, value, source

- 25 -

Amplification

method

Control

qualifier(array)

Label incorporation

methodReporter

Array designControl

type(array)Label used Scanner image file

Array design nameDimension

(feature)Location (feature)

Sequence

information

Array related

informationElements(array) Measurements

Single or double

stranded

Attachment

Element

generation

protocol

Normalized and

summarized data

Splike type and

Qualifier

Author, laboratory,

and contactExperiment

Numerical biological

ednpoint data

Spiking control

(hybridization)

Biological materialExperimental

factor

Physical

dimensions(array)

Spiking control

element(array)

Biosource propertiesExtraction

method

Position(control

elements)

Texual biological

endpoint data

Clinical observation Feature(array) Primer information

Toxicogenomics

experiment

description

Clinical pathologyGross necropsy

examination

Production protocol

(array)

Toxicogenomics

experimental design

Clone information Hybridization Qualifier, value, sourceToxicological

assessments

Common reference

material

Hybridization

extract

preparation

Quality control steps Type of experiment

Composite

sequence

Hybridization

protocolRow data

Control

elements(array)

Image analysis

and quantitation

Reference sequence

(reporter)

- 26 -

2. 부과 독 체 시험연구 데이 의 질 리 략 립2 :

독 체 시험 연구의 질 리 사 조사2.1.

MAQC(MicroArray Quality Control) Project※

m

개요MAQC project

� 주 미국 산하 개 미국내 개 이 공동참여: FDA 6 ( 51 , :Phase 1)

� 목 실험 분 한 가이드라인 공: microarray data

� 간 월 일 월 일1st phase :2005 2 11 -2006 9 8

� 결과1st phase

편- Nature Biotechnology, september 8, 2006. 6

- GEO(Gene Expression Omnibus)

- ArrayExpress

- ArrayTrack

- the MAQC website

� 월 료2nd phase-'Pratical Application' 2008 12 (2006.09~ 2008.12)

� 결과 보고 상2nd phase : 2009

m

m

- 27 -

m

m

m

MAQC-I Dataset 실험 방법

Ea ch site of each platform

A DC B

• A = Strata gene Unive rsal Hum an Reference RNA.

• B = Am bio n Hum an Brain Refe rence RNA.• C and D = M ixtures of A and B at de fin ed ratios of 3:1 (C) and 1:3 (D).

• S even m icroarray platforms were evalu ated. • E ach platfo rm was deplo yed at th ree independent test sites.

• T hree alternative expression profil ing techn ologie s (e.g., TaqMan).

- 28 -

Disease/StudyNumber of

samples

Number of

Test sites

Number of

Microarrays

Miroarray

platform

sample

sources

Hamner 100 1 100Affymetrix

Mouse 430 2.0Hamner

NB

(Neuroblastoma)350 1 350

Agilent

One-color

Univ. of

Cologne

MM

(Multiple Myeloma)

100 1 100Affymetrix

U133Plus2UAMS

2,000

(DNA)1 2,000

Affymetrix

SNP 6.0

BR

(Breast Cancer)

125 3+1+1 625Affymetrix

U133and Plus2MDACC

etc.125 3+1+1 625

Agilent

One-and Two

color

: Summary of the 8 th MAQC Project Meeting, March 24-26, 2008, US FDA, Rockville, MD

- 29 -

: summary of the 6 th MAQC Project Meeting, November 28-29,2006, Washington

DC and Silver Spring MD

Data SetData

SourcesPhenotype Information Platform

Iconix Rat Liver

ToxicityIconix

Liver toxicity. Clinical chemistry and

histopathology data availableCodeLink

Iconix Rat Liver

CancerIconix

Carcinogenicity. ALT, necrosis,

hypertroph relative liver weight data

available

CodeLink

Iconix Rat Kidney

ToxicityIconix

Kidney toxicity. Albumin, BUN, CRE, and

cholesterol data availableCodeLink

CIIT Mice Lung

TumorCIIT

Lung tumor formation in 2 year rodent

cancer bioassay.

Histopathology, serum NMR (subset of

samples), liver gene expression (subset of

samples) available

Affymetrix

NIEHS Rat Liver

ToxicityNIEHS

Liver toxicity (various phenotypes).

Clinical chemistry and liver histopathology data

available

Affymetrix

Agilent

EPA/Iconix Rat

Liver

Toxicity

EPA

Liver toxicity.

Clinical chemistry and

histopathology data available

CodeLink

Affymetrix

AB (day

3 only)

EPA/Gene Logic

Rat Liver ToxicityEPA

Liver toxicity. Clinical chemistry and

histopathology data availableAffymetrix

EPA Rat/Human

HepatocytesEPA

Liver toxicity.

Cytotoxicity data availableAffymetrix

- 30 -

AffymatrixCold Spring

Harbor LaboratoryFDA/CVM Illumina

TeleChem

Arraylt

Agilent Duke University FDA/NCTR MD AndersonUCLA/Cedarssina

i

Ambion EPAFull Moon

BiosystemsNIH/NCBI UCSF

Applied

BiosystemsEppendorf GE Healthcare NIH/NCI UIUC

Biogen IdecExpression

analysis

Gene expression

Inc.NIST Umase Boston

Burnhan

InstituteFDA/CBER Genospectra Novartis

Vanderbilt

University

CapialBio FDA/CDERGenUS

biosystemsSAS ViaLogy

Clontech FDA/CDRHHarvard/

Children's hospital

Stanford

University

Wake Forest

University

Combimatrix FDA/CFSAN Icoria Stratagene Yale University

Working Group Coordinator Responsibility

RNA Samples FDA/NCTRSelecting two RNA samples for each

species(human, mouse, and rat)

Microarray FDA/CDRHDesigning the main study, generating

microarray datasets

Titration GE HealthcareDesigning the RNA titration(mixing) study

and generating the datasets

QRT-PCR FDA/CDERSelecting ~1,000 genes for QRT-PCR,

generating QRT-PCR datasets.

Scanner FDA/CBEREvaluating the performances of commonly

used microarray scanners.

Bioinformatics FDA/NCTRManaging, sharing and analyzing the

MAQC datasets.

- 31 -

Feb. 11, 2005Launch of phase I of the MAQC project(MAQC-1) on

microarray technical performance

October 21, 2005 Completion of MAQC main study(data generation)

Dec. 1-2, 2005Face-to-face meeting in Palo Alto, California to discuss

results on the analysis of the MAQC datasets.

June 5, 2006 Submission of MAQC manuscripts

September 8, 2006 Publication of MAQC results in Nature Biotechnlogy

September 8, 2006 The MAQC datasets are publicly available

September 21, 2006Launch of PhaseII OF THE MAQC project(MAQC-II) on

predictive classifiers(signatures)

March, 2009Submission of MAQC II manuscripts(21 paper to Nature

Biotechnology)

Late, 2009 Publication of MAQC-II results

2) ToxCast TM

m

m

- 32 -

: EPA( 9 )

: ,

: Phase 3 Phase1 ('07.4 - '08.5)

Phase 1('07.4 - '08.5) : 320

Phase 2('08 - '09) : 1,000

Phase 3('10 - '12) :

: 1 ('08.6)

- OECD ('08.6) Phase 2

- '08 Phase 2

m

PhaseNumber of

ChemicalsChemical Criteria Purpose

Est. Cost per

Chemical

Target

Date

I 320Data Rich

(pesticides)

Signature

Development$20k FY07-08

II Up to 1000Expanded Structure

and Use Diversity

Evaluation and

Extension$15-20k FY08-09

III Thousands Data poorPrediction and

Prioritization$10-15k FY10-12

: 42nd joint Meeting Toxicogenomics: Molecular Screening Project: ToxCast phase 1

time line

- 33 -

m

m

o ArrayTrack-microarray DB

: MAQC Web

[http://www.fda.gov/nctr/science/centers/toxicoinformatincs/ArrayTrack/index.htm]

o MGED-Microarray and Gene Expression database

[http://www.mged.org/index.html]

:Microarray MIAME check point

GeneSpring- microarray data

: clustering, data normalization

o DAVID- The database for annotation, visualization and Integrated discovery

[http://david.abcc.ncifcr.gov/home.jsp]

: annotation web visual data

o GSEA- Gene set-enrichment analysis

[http://www.broad.mit.edu/gsea/index.jsp]

:

GenMAPP2-pathway

[http://www.genmapp.org/default.html]

: pathway

- 34 -

마이크로어 이를 이용한2.2 독 체 표 시험지침

마이크로어 이를 이용한 자 분 표DNA※

w 마이크로어 이의 품질 리DNA

w 마이크로어 이의 작DNA

w 마이크로어 이의 표시 재사항DNA

w 마이크로어 이 실험 한 체시료추출법 품질 평가DNA

w 직 표지를 통한 마이크로어 이 실험 법DNA

w 미량 시료 증폭법

w 상분 품질 통 법 데이 처리 과 통한 자 값,

사 검 사항1.1

검체는 실험자의 리 취 법에 라 체 의 양이나 품질에 많 향- , RNA

미친다 검체 내에 존재하는 체 의 품질이 지 있도록 취 리를 철. RNA ,

히 하도록 한다.

일 로 체 는 단일가닥 로 이루어 있어 실 등에 불 함 나타- RNA

내 에 상 에 실 에 의 보 체 의 분해를 야 하므로 체RNA ,

의 품질 지하 해 이하에 검체를 보 하거나 경우에 라RNA -70 ,℃

의 해 가 포함 용액에 검체를 고 이하에 보 한다RNase -70 .℃

실험에 충분한 양의 체 를 얻 하여 충분한 양의 검체를 사용하여 체- RNA

를 추출하며 매우 양의 체 가 함 어 있는 검체인 경우 사용 시RNA , RNA

료의 양 늘 체 를 추출한다RNA .

검체는 체 가 추출 지 포 내외의 의 향 지 도록 동결- RNA RNase

등의 법 통한 취 보 이 요하다, .

탁 쉬운 포주 같 시료인 경우 페놀류 등의 포 용매를 이용하여 추출-

하며 조직과 같 고체 시료의 경우 액체질소 막자사 등 이용하여 검체를 충,

분히 갈 추출하며 이 경우에 막자사 의 차 염 특히 주의하고 시료는 마쇄,

과 에 항상 동결상태를 지하도록 한다.

- 35 -

체 의 추출1.2 RNA

검체에 분리한 체 의 품질 독 체 분 용 로 재 과 복 지- RNA

야 하 에 양질의 체 를 얻 해 는 추출 시에RNA RNase genomic

의 염 차단해야 하고 용매처리를 하여 다당류를 거하고 분 과 차후DNA ,

실험에 해가 있는 추출 용해시의 충용액이나 침 단계에 의 염 충분히/

거해야 한다.

체 추출시 용해가 충분치 경우에는 추출 효 이 낮 지므로 시료가 충- RNA

분히 녹 있 만큼의 양 로 용해야 한다.

추출 체 는 가 없는 증류 같 한 용액에 용해하여- RNA RNase -70 ℃

이하의 도에 보 한다.

체 의 추출 법 추출 후에 품질평가를 통하여 차후 실험에 용여부가 결- RNA

므로 추출 법 한 후 복하여 추출 인 행하여 맞 법

택하여야 한다.

체 는 구조 로 불 하여 쉽게 분해 므로 체 추출 시간 최- RNA RNA

한 짧게 하고 이하의 도에 분주 상태로 보 하며 동결과 해동 복-70 ℃

로 하지 는다.

체 추출과 에 사용 는 액체시약 시약이 들어 있는 용 를 충분히- RNA

들어 주어 균질 하여 사용해야 하며 고체시약 조업체에 추천하는 용매를 사,

용하여 당한 농도로 용해하여 사용해야 한다.

라스틱 소모품류 자류 등의 구는 체 의 변 이나 분해에 향- RNA

요인 히 거한 후 사용해야 한다.

미량 시료 증폭 행할 는 주 이 는 체 증폭 산 인 의 품질- RNA cRNA

이 지 있는 최 의 취 리가 요구 다, .

- 36 -

체 의 량 품질 검1.3 RNA

각각 다른 체 추출 법의 효 하고 농도를 결 하 하여 체- RNA

의 량 핵산 분자의 장의 빛에 한 흡 도를 하는 법과RNA 260 nm

동 후 얻어진 핵산 드의 양 하는 법 등 사용하지만 동의,

경우는 이 흡 도를 하는 것에 해 낮 에 흡 도 우 시한

다.

한 량 해 보 용 표 질 사용하며 농도를 고 있는 핵산 용액- ,

표 질로 사용하 사용 는 표 질 국내외 표 과 같 참고자료로써

소 이 지 어야 한다.

추출 체 도는 흡 도 를 통- RNA 260 nm /230 nm , 260 nm /280 nm ratio

해 평가하며 체 의 여부는 의 통해 평가한다RNA (integrity) rRNA .

추출 체 의 량 품질 검 의 사항 고 하여 이용- RNA , nano

한 등과 같 장 를 사용하여 분 하여 하는 것agilent bioanalyzer

우 시 한다.

- 37 -

미량 시료1.4

미량 시료 증폭 행할 는 주 이 는 체 증폭 산 인 의 품질- RNA cRNA

이 지 있도록 항상 주의 취 리를 해야 한다 주 로 사용 는, .

체 에 주어진 법 이용하여 증폭한 증폭 산 의 품질 체 의 품질RNA RNA

검과 동일하게 검해야 한다.

미량의 체 를 증폭하 해 는 체 에 택 로 결합하는- RNA RNA mRNA

라이 가 요하고 통상 로 리고 라이 또는 랜덤 라이 가 사용dT

다.

증폭 법 의 시험 내 사가 가능하도록 특 로모 염 열 첨가- cDNA

한 후 합효소를 사용하여 사 행하여 의 태로 증폭하는RNA RNA

법과 를 주 로 하여 특 라이 를 사용하여 증폭 행함 로써cDNA ,

의 태로 증폭하는 법이 있 며 증폭 행 시 에 요한 라이DNA ,

로모 효소 조건 등 사 실험 통해 해당 실험실에 합한, ,

것 증폭효 재 등 고 하여 하고 진행하도록 한다 다만 조군의, . /

실험 법 동일시하게 진행하는 것 원칙 로 한다.

- 38 -

사 검 사항2.1

표지를 한 체 의 역 사에 사용 는 역 사 효소는 효소 용 충- RNA

용액 리고 표지염료등 드시 이하의 냉동 조건에, dNTP, dT, -20 ℃

보 어야 한다.

표지를 한 역 사 실험에 사용 는 라스틱 소모품류 등 주 로 사용-

는 가 상의 에 의해 변 이나 분해 지 도록 향 요인RNA RNase

히 거한 후 사용해야 한다.

표지2.2

표지를 해 로 역 사하는 법 직 로 리고 를 라이 로- cDNA dT

사용하여 역 사하는 법 사용하며 원핵생 이용한 시험에 는 랜덤 라이,

를 사용하여 역 사하는 법 사용해야한다.

역 사 해 리고 라이 를 합할 시료인 체 를 특- dT RNA

도로 가 하여 차 구조를 하고 있는 체 를 차 구조로 변 시 리2 RNA 1

고 라이 의 결합부 인 특이 가 노출 도록 하여 실험하며dT mRNA- poly A ,

가 이후에는 냉 에 보 하여 결합 의 를 지해야 한다.

역 사 질표지를 동시에 행할 는 첨가 는 의 양과 질이- dNTP

결합 의 몰 계산하여 동일한 의dNTP (molar ratio) dATP, dCTP,

가 첨가 도록 한다 이는 표지의 효 에 많 향 가하는 요소dGTP, dTTP .

이 에 각 실험실에 사용 는 염료 검체의 종류에 인하여 사 결

이 이루어 야 한다.

체 를 이용하여 마이크로어 이 실험 할 경우에는 가능한- RNA DNA 50 gμ

도의 체 로 약 에 해당 를 사용해야 한다 시료의 양이RNA (mRNA 1~2 g ) .μ

보다 경우는 실험 자체는 가능하나 분 시 류 양 요인이 다 생하

게 다 사용 는 체 의 양 사용 의 랫폼에 라 조 있다. RNA array .

- 39 -

2.3

표지 타겟 용액과 합한 후 가열하여 차 구조 한다- cDNA 1 .

시의 도는 도에 해 고 일 경우 이 일어-

나지 고 일 경우 특이 결합이 많이 일어나 에 각 실험실에 사

실험 통해 재 신뢰 이 높 도를 택하여 용해야 한다.

시의 시간도 역시 시간에 해 많거나 경우 특이 인 결합-

시간 부족 로 인한 결과 미도출 등의 결과가 생 므로 또한 사 실험

통해 시간 택해야 한다.

이후 특이 결합 거하 한 척 단계를 진행하며 척용- ,

용액 용액에 쓰인 분과 동일해야 하며 도 농도를 단계 하여 척

행하며 척 후 원심 분리등의 법 통하여 어 이의 분 히 거하,

고 로 스캐닝 행하여 상 한다 로 스캐닝 통하여 상 하지 못할 시에.

는 빛이 차단 고 고 다습하지 장소에 보 하여 분해가 일어나지 게,

주의해 보 해야 한다.

- 40 -

마이크로어 이 실험 후 스캔 통하여 지 자 스 들의 시그-

로 상 분 행하며 시그 각 자의 값들의 차, mRNA 2

원 상이며 이를 로 상 분 통해 자의 값 지 한다.

상 분 해 상 분 용 소 트웨어 이 소 트웨어가 지원하는 식의- ,

마이크로어 이를 스캔 한 상이 요하며 상 분 의 결과는 자 스DNA ,

자체의 시그 스 주변 시그 포함하며 시그 의 차이로 실 값 나타,

낸다.

자 스 외의 시그 이 높 면 지나 흠집에 의해 손상 시그 일 있-

므로 분 에 는 외해야 한다.

스 시그 의 경 과 경 의 로 산출 는- (foreground) (background) SN

에 경 특이 인 결합 이므로 경과 경의ratio (non-specific binding)

차이가 크지 스 의 시그 노이즈일 률이 높 에 분 에 는 외해

야 한다.

특 스 이 포 시그 로 는 경우는 스캐 의 검출 한계를 과한 경우이-

며 이는 스 의 자 이 매우 높 경우일 도 있지만 일 로 염 로,

인하여 래 었 률이 높 에 분 에 외해야 한다.

상 분 용 소 트웨어에 는 각 통계 인 치 데이 포 스 불- (SN ratio, ,

량 스 등 를 통하여 실험의 도를 단하는 를 도출해 낼 있 며) QC data ,

이러한 결과를 이용하여 추후 분 여부 재실험 여부를 결 하여야 한다.

- 41 -

신뢰도를 높이 한 규 시에 각 스 들의 시그 주 의 스 의 시그-

슷한 강도를 보이는 스 의 시그 들 통해 보 므로 신뢰도가 낮 스 의 존

재로 체 인 데이 에 손상 률이 높 에 외해야 한다.

분 경 값과 경 값 로부 스 의 표 는 값 한다 하나의 스- .

이루는 소들의 산 평균 취하는 법과 앙값 취하는 법이 있다 격히.

다른 이상 시그 의 향 게 는 앙 값 취하는 법이 권장 다(outlier) .

마이크로어 이실험에 시 닌 염료의 질 인 특 이 다르 에 실험에-

사용 는 시 닌 염료 간에 열이나 빛 등에 한 민감도 차이가 있 있

므로 특 염료가 스캔 시에 다른 염료보다 상 로 높 감도를 보이는 편

향이 생 며 이러한 편향 규 를 통하여 보 해야 한다.

도 습도에 민감한 학 이므로 실험이 진행 는 시 공간의- , ,

차이에 라 편향이 생 며 이러한 경우도 규 를 통하여 보 해야 한다.

마이크로어 이를 생산 시에 고 체 에 로 를 고 시키는 들의 리 인-

차이로 인하여 각 스 에 고 는 로 들의 개 나 도가 다를 경우 편향이

생 며 이러한 편향 또한 규 를 통하여 보 해야 한다, .

이러한 편향들 각 스 에 자의 값이 동일한 조건에 었-

다는 가 에 에 드시 규 과 거쳐야 한다.

상 분 통해 최 로 얻어진 각 스 의 시그 도 리 과 과 규 과-

통해 신뢰 이 보 며 그 스 이 가리키는 자의 최종 값 로 결 한

다.

- 42 -

부과 독 체 시험연구 표 를 한 사 연구3. 3 :

질 경3.1.

m

(cancer)

m

性

m

․

m

- 43 -

m

시험 목3.2.

m

m

H uman cell line

D ATA analysis

Hybridization

to ta l RNA extract ion

Scan

P rob e Labeling

MCF-7, H epG2 cell line: 독 에 잘 알 진 포주

공식 로 신뢰있는 Qiagen mini prep kit을 이용하여시료의 증폭없이 RN A 추출 및 해진 량방법에 의해순도

반복실험을 통해 량의 20 ug direct labe lin g

조사의 매뉴얼에 맞게 42℃ , 12h을 지하고가능한 MAUI 12-Bay sys tem 이 용

Axon scan ner, NimbleScan 2 .4(마이크로어레이 플랫폼에서 추천하는 프로그램을 이 하여 SOP 에 맞게 행 )

Ge neS pring GX, clus terin g, DEG selection택한 프로그램의 시 QC 방법 수

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시험 법 내용3.3.

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- 47 -

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- 51 -

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- 55 -

MCF-7 HepG2

3hr 48hr 3hr 48hr

Cellular process

cell growth 4 2 10 39

cell death 8 32 57 158

cell cycle 14 30 59 185

cell communication 85 164 255 793

cell adhesion 17 19 36 139

cell motility 10 17 27 74

cell proliferation 12 30 58 146

intracellular signaling cascade 29 58 77 235

intracellular transport 10 30 39 144

transcription 38 81 162 156

translation 10 20 35 143

gametogenesis 6 17 13 49

spermatogenesis 5 15 11 38

Developmental process

development 50 92 170 466

morphogenesis 26 30 59 194

cell differentiation 22 36 72 168

cell development 7 11 21 49

Metabolic process

catabolism 14 25 35 161

biosynthesis 26 46 61 181

DNA metabolism 13 27 41 146

RNA processing 7 23 24 115

Immune system process

defense response 23 49 78 211

inflammatory response 1 13 20 50

immune response 19 43 68 188

Response to stimulus

response to stress 20 47 66 254

response to external stimulus 18 34 48 173

response to endogenous stimulus 6 12 20 65

total 389 857 1358 4313

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변이 실험 결과3.5 microRNA

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사 시험 결과에 한 자체 평가3.6.

¡

¡

¡

¡

¡

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결론4.

m

m

m

m

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m

m

m

m

m

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m

m

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참고 헌5.

β

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