土壌からの酵素生産微生物の分離

**** アミラーゼ・プロテアーゼ生産微生物の分離と検出*****

スーパーマーケットで調達できる培地成分

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プロトコル

寒天培地を作製する（電子レンジ滅菌可）

土壌試料を希薄な水溶液にして塗布する

30℃または室温で培養する

微生物の集落を観察する

アミラーゼ生産菌の検出

プロテアーゼ生産菌の検出

微生物の顕微鏡観察

酵素生産微生物の分離 (高校で簡単に実施できる)

顕微鏡観察と撮影 微生物の同定 （大学で実施）

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寒天培地上での土壌微生物の分離

② ③

⑤

◆ 土壌サンプルを耳かき一杯程度取って、試験管の蒸留水に懸濁する（原液）。さらに、蒸留水により、10 - 50 倍に希釈する（希釈水）。原液および希釈液をそれぞれ、デンプンプレートに0.1 mlずつ塗布する。 ◆ 30℃または37℃で1 - 2日間培養する。室温で1週間程度放置しても良い。 ○ 培地をさまざまに工夫して、有用微生物を単離しよう。

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デンプン培地によるアミラーゼ生産菌の観察

①

② ③

④

⑤

デンプン培地（廉価版） コンソメの元 片栗粉 棒寒天 水道水

1/2 個 2 g 3 g 200 ml

【ルゴール液】 アミラーゼ活性判定用 ヨウ化カリウム (KI) ヨウ素 (I2) 蒸留水 (H2O)

0.2 g 2.0 g 300 mL

◆ プレートに生育したコロニーを観察・単離した後，ルゴール液を10 mLほどかける。 ◆ アミラーゼによりデンプンが分解したところは透明に抜けて見える。 ○ イソジンで代用できます

＜注意＞ 可溶性デンプンを用いないこと

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スキムミルク培地によるプロテアーゼ生産菌の観察

スキムミルク培地　　 スキムミルク 寒天

0.5% 1.5%

◆ 粉末のスキムミルクに寒天を混ぜて加熱滅菌し，シャーレに流し込んでスキムミルク培地を作製する。スキムミルク中のカゼインがツブツブの固まりになっているが気にしない。 ◆ 土壌サンプルを塗布して培養し，コロニーが生育してきたとき，プロテアーゼによってカゼインの顆粒が溶解したところが透明に抜けて見える。

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Bacillus属細菌の内生胞子

◆ 形成された細菌のコロニーを顕微鏡観察

◆ アミラーゼやプロテアーゼを生産する微生物としてBacillus属細菌が単離されることが多い

◆ 内生胞子は簡便な顕微鏡でも確認することができる。内生胞子が観察されれば、Bacillus属細菌である可能性が高い。

○ 正確な同定のためには、グラム染色をはじめとする各種生理試験や16S rDNA配列解析を行う

桿菌の形態 A 長桿菌 B 短桿菌 C 内生胞子　　　　　

球菌の集合状態 C 単球菌　　　 E 連鎖球菌 D 双球菌　　　 F ブドウ球菌　　

らせん菌　　 H コンマ菌 I スピロヘータ

[A] [B]

[C]

[D] [E]

[F] [G]

[H]

[ I ]

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グラム陽性細菌の分類

細胞形態 運動性と鞭毛

酸素要求性 内生胞子 その他の特徴 推定される属

Staphylococcus Streptococcus Leuconostoc

Planococcus Sporosarcina Lactobacillus Propionibacterium

Corynebacterium Arthrobacter

Bacillus Clostridium

球菌

桿菌

周鞭毛

なし

なし

球菌

なし 好気性

微好気性

好気性

絶対嫌気性

Micrococcus なし 糖の分解性微弱

糖を嫌気的に分解する

連鎖球菌

糖より乳酸を生産する なし

あり 球菌 好気性 なし

桿菌 なし

微好気性

好気性

なし

なし

糖より乳酸を生産する

プロピオン酸発酵する

多型性のものがある

桿菌 あり

代表的な一部の属のみを示している

駒形和男編「微生物の分類と同定」より

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グラム陰性細菌の分類

細胞形態 運動性と鞭毛

酸素要求性 その他の特徴 推定される属

Veillonella Escherichia Enterobacter Serratia Azotobacter Rhizobium Agrobaterium Achromobacter Alcaligenes Flavobacterium

Nitrosomonas Nitrobacter Thiobacillus Gluconobacter Pseudomonas Xanthomonas

Acetobacter

Vibrio Spirillum

球菌

桿菌

桿菌

曲がった菌 極鞭毛

極鞭毛

周鞭毛

なし

周鞭毛

なし

桿菌

なし 好気性

通性嫌気性

好気性

好気性

好気性

嫌気性

Neisseria 嫌気性

窒素固定 共生的窒素固定

植物の腫瘤を形成する 糖の分解が微弱か分解しない

アルコールを強く酸化

アンモニアを酸化 亜硝酸を酸化

硫黄・鉄を酸化

有機物を好気的に酸化（pH2で生育可） 有機物を好気的に酸化（pH2で生育不可）

植物病原性をもつ黄色細菌

コンマ状の細菌

らせん状の細菌

糖を嫌気的に分解する

　（腸内細菌）

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