Μετάφραση του mRNA

mRNA Translation

Βιοσύνθεση πρωτεϊνώνΠολυμερισμός αμινοξέων

Γενικά χαρακτηριστικά 1

A. Μετάφραση της αλληλουχίας νουκλεοτιδίων του mRNAσε αλληλουχία αμινοξέων- Γενικές έννοιες

1. Γενετικός κώδικας: Οι κανόνες μετάφρασης/αποκωδικοποίησης

2. Ανοικτό πλαίσιο ανάγνωσης (ORF): Η αλληλουχία διαδοχικών κωδικονίων (τριάδες νουκλεοτιδίων) από το εναρκτήριο έως το τερματικό.

3. Τα μεταφορικά RNAs (tRNAs) είναι τα κλειδιά της αποκωδικοποίησης, που λειτουργούν ως προσαρμοστές/adaptors μεταξύ κωδικονίων και αμινοξέωνλειτουργούν ως «προσαρμοστές/adaptors» μεταξύ κωδικονίων και αμινοξέων

Κάθε αμινοξύ συνδέεται με το δικό του μόριο tRNA, και το αμινοακυλ- tRNA που σχηματίζεται συνδέεται εξειδικευμένα μόνο με το αντίστοιχο κωδικόνιο. ξ μ μ μ χ

Αντίδραση πολυμερισμού2

4. Η αμινο-ομάδα του νέο-εισερχόμενου αμινο-ακυλ-tRNA προσβάλλει τον αμινο-ακυλ εστερικό δεσμό του προ-υπάρχοντος αμινοακυλ- ή πεπτιδυλ-

tRNA ( ύθ Ν’ C’)tRNA (κατεύθυνση Ν’ -> C’)

5. Το mRNA μεταφράζεται με κατεύθυνση 5’ -> 3’

ΑΑΑ ΑΑΑ ΑΑΑ ΑΑΑ ΑΑC

Δομικά στοιχεία των tRNAs Lys Lys Lys Lys Asn 3

Δομικά χαρακτηριστικά των tRNAs

1. Το ~ ½ των νουκλεοτιδίων συνδέονται σε ζεύγη βάσεων

2. Το 3’ άκρο CCA, βραχίονας υποδοχής

3. Η θηλιά ΤψC (ριβο Τ - ψευδο U - C)

4. Ο «μεταβλητός» επιπλέον βραχίονας

5. Η θηλιά διυδροουρακίλης (DHU)

6. Η θηλιά αντικωδικονίου

7 Π λλέ δ θ λ έ7. Πολλές μονο- και δι-μεθυλιωμένεςβάσεις A,U,C,G.

ΔιυδροουρακίληDHU

Ψευδο ουρακίληΨΟυρακίλη

Adaptor Structure4

Η δομή των tRNAs ανταποκρίνεται στο ρόλο του απόλυτα ειδικού «προσαρμοστή» (Adaptor)«προσαρμοστή» (Adaptor)

1. Διαθέτει ελεύθερα άκρα αφενός για τη σύνδεση του αμινοξέος (CCA) και αφετέρου για συμπληρωματικό μ ξ ς ( ) φ ρ γ μ ηρ μζευγάρωμα με το αντίστοιχο κωδικόνιο μέσω του αντικωδικονίου.

2. Αναγνωρίζεται εξειδικευμένα από ΜΙΑ αμινοακυλ-tRNA θ ά

αα – tRNA συνθετάσες

tRNA συνθετάση5

B. Οι Αμινοακυλ-tRNA συνθετάσες είναι τα ένζυμα πουδιαβάζουν/ερμηνεύουν τον γενετικό κώδικα

α) Προσαρτούν κάθε αμινοξύ ) ρ ρ μ ξαυστηρά στο αντίστοιχο tRNA (με το ΣΩΣΤΟ αντικωδικόνιο)

β) Ενεργοποιούν το σωστό αμινοξύ (αμινοακυλ-tRNA = εστέρας αμινοξέος- tRNA) ( μ ρ ς μ ξ ς )ωστε να είναι ενεργειακά επιτρεπτή στη συνέχεια η δημιουργία πεπτιδικώνδεσμών

Συνθετάσες τάξης Ι και ΙΙ:Εστεροποίηση στο 2-ΟΗ ή 3-ΟΗ, αντίστοιχα,

Αδενυλίωση

3 ΟΗ, αντίστοιχα, μονομερείς και διμερείς

6

Οι αμινοακυλ-tRNA συνθετάσες καταλύουν δύο επιμέρους διαδοχικές αντιδράσεις

Α. Τα αμινοξέα ενεργοποιούνται αρχικά με αδενυλίωση

1. αμινοξύ + ΑΤΡ -> αμινοακυλο-ΑΜΡ + ΡΡj μ ξ μ j

Το αμινο-ακυλο αδενυλικό (μικτός ανυδρίτης)ί έ έ δ ά β ό ό

2. ΡΡj -> 2Ρj

είναι ένα ενεργοποιημένο ενδιάμεσο, μεταβατικό, προιόν

Β Και στη συνέχεια εστεροποιούνται με το tRNAΒ. Και στη συνέχεια εστεροποιούνται με το tRNA

3 αμινοακυλο-ΑΜΡ + tRNA -> αμινοάκυλο-tRNA + ΑΜΡ3. αμινοακυλο-ΑΜΡ + tRNA -> αμινοάκυλο-tRNA + ΑΜΡ

Λιπο ακυλ αδενυλικό7

Ενεργοποιημένα ακυλοαδενυλικά ενδιάμεσα δημιουργούνται και σε άλλες βιοχημικές πορείες β χημ ς ρ ς

πχ ενεργοποίηση λιπαρών οξέων για σύνθεση τριακυλογλυκερολών

R-COOH +ATP

ΡΡj

2Ρj

j

Εξειδίκευση tRNA αμινοακυλίωσης 8

Οι αμινοακυλ-tRNA συνθετάσες αναγνωρίζουν τα αμινοξέα τουςμε εξαιρετική ακρίβεια: Το παράδειγμα της θρεονυλ-tRNA συνθετάσηςμε εξαιρετική ακρίβεια: Το παράδειγμα της θρεονυλ-tRNA συνθετάσης

ZZn

ZN

H θρεονυλ- tRNA συνθετάση διακρίνειH θρεονυλ tRNA συνθετάση διακρίνειτη θρεονίνη απ’ τη βαλίνη με βάση το σύμπλοκο συναρμογής Zn – OH - NH3

Διορθωτική ικανότητα

Δεν μπορεί όμως να διακρίνει, με αυτόν το μηχανισμό, τη θρεονίνη απ΄τη σερίνη 9

Η διορθωτική ικανότητα των αμινοακυλ-tRNA συνθετασών εξασφαλίζει μεγαλύτερη εξειδίκευσημεγαλύτερη εξειδίκευση

Πείραμα: Ser έχει συνδεθεί λανθασμένα/τεχνητά με tRNA Thr και το λάθος αμινοαλυλ-tRNA επωάζεται με θρεονυλ-tRNA συνθετάση

S tRNA Th S tRNAThSer-tRNA Thr ---> Ser + tRNAThr

θρεονυλ-tRNA συνθετάση

Συμπέρασμα: Τ λ tRNA λ δ ί ξύΣυμπέρασμα: Το αμινοακυλ-tRNA παλινδρομεί μεταξύκέντρου ενεργοποίησης και κέντρου διόρθωσης και , αν είναι λανθασμένο, μπορεί να υδρολύεται στα συστατικά του (αα = tRNA)( )

Αναγνώριση αντικωδικίου10

Στην εξειδίκευση συμβάλλει η αναγνώριση της θηλιάς του αντικωδικίου ή/και τoυ βραχίονα υποδοχής των μορίων tRNAsή/και τoυ βραχίονα υποδοχής των μορίων tRNAs

Θ λ tRNA θ άΘρεονυλο-tRNA συνθετάση

Γλουταμινυλο-tRNA συνθετάση

Ριβόσωμα 11

Γ. Ριβόσωμα : Η μοριακή μηχανή που πολυμερίζει αμινοξέα συνταιριάζοντας mRNA και αμινοακυλ-tRNAsρ ζ ς μ

ΕυκαρυωτικόΠροκαρυωτικό

~20 aa/sec 2 aa/sec

~2/3

~1/3

Ρόλος της κάθε υπομονάδας Αυτο-συγκρότηση !! 12

Η μικρή υπομονάδα συνταιριάζει το mRNA με το tRNA ενώ η μεγάλη υπομονάδα καταλύει τη δημιουργία πεπτιδικών δεσμώνυπομονάδα καταλύει τη δημιουργία πεπτιδικών δεσμών

Mεγάλη υπομονάδα

A: aminoacyl- ΑcceptorΜικρήυπομονάδα P: Peptide

E: Exitυπομονάδα

Καταλυτικός ρόλος του rRNA13

To 16S rRNA της 30STα rRNAs σχηματίζουν το μεγαλύτερο έ θέ Α Ρ Ε To 16S rRNA της 30Sμέρος των θέσεων Α, Ρ και Ε και

παίζουν κύριο καταλυτικό ρόλο στη πρωτεϊνισύνθεση,

L19

σε αντίθεση με τις απλούστερης–γενικά- δομής ριβοσωμικές πρωτείνες.ρ ς

Mεταφραστική έναρξη14

Shine-Dalgarno και εναρκτήριο AUG προσδιορίζουν το σημείο έναρξης της βακτηριακής μετάφρασηςέναρξης της βακτηριακής μετάφρασης

Α) η αλληλουχία Shine-Dalgarno AGGAGG (U) ζευγαρώνει με την συμπληρωματική CCUCC στο 3’ άκρο του 16S rRNACCUCC στο 3 άκρο του 16S rRNA

Β) το αντικωδικόνιο CAT του Met- tRNAf ζευγαρώνει με το κωδικόνιο έναρξης AUG

Πείραμα προστασίας από RNaseαπό RNase

πολυκιστρονικά mRNAs 15

Θυμηθείτε !!,

Τα βακτηριακά mRNAs είναι πολυκιστρονικά και μεταφραστική έναρξη συντελείται και εσωτερικά !!

Shine-Dalgarno

Τι θα συμβεί εάν οι θέσεις ριβοσωμικής πρόσδεσηςΤι θα συμβεί εάν οι θέσεις ριβοσωμικής πρόσδεσηςμετατραπούν είτε σε ασθενέστερες, είτε σε ισχυρότερες ??

Met-tRNAf

16

fMet-tRNAf

H βακτηριακή μετάφραση αρχίζει με φόρμυλο-μεθειονυλ-tRNA (fMet-tRNAf)

To tRNAf διαφέρει από το tRNAmπου μεταφέρει Met σε εσωτερικά κωδικόνια, παρ’ όλο που και τα δυο , ραναγνωρίζονται από την ίδια συνθετάση

H Met μπορεί να φορμυλιωθεί μόνον ότανμ ρ φ ρμ μείναι προσαρτημένη στο tRNAfσε αντίθεση με την Met που προσαρτάται στο tRNAm

Αυτό είναι αποτέλεσμα τηςεξειδίκευσης της τρανσφορμυλάσης, που

ί ά όαναγνωρίζει tRNAf αλλά όχι tRNAm

Τ ξ ί λί ??Τι εξυπηρετεί η φορμυλίωση ?? Θα το δούμε σε λίγο !!

IF217

IF2

O παράγοντας έναρξης IF2 είναι ένας μοριακός διακόπτης (G protein) που τοποθετεί το fMet-tRNA στη θέση Ρ κατά το IF2τοποθετεί το fMet tRNA στη θέση Ρ κατά το σχηματισμό του συμπλόκου έναρξης 70S

IF2

Εναλλάσσεται μεταξύ δυο μορφών: Συνδεδεμένος είτε GTP, είτε με GDP

Ο IF2-GTP σε συνδυασμό με το fMet-tRNA

IF2

Ο IF2-GTP σε συνδυασμό με το fMet-tRNAoρίζει το πλαίσιο ανάγνωσης στο mRNA οδηγώντας το fMet-tRNA στη θέση Ρ

Αποσύνδεση IF2 και άλλων IFs

Σύνδεση 50Sυπομονάδας

Μεταπίπτει στην μορφή IF2-GDP, αποσυνδέεται, και προκαλεί τη σύνδεση της 50S υπομονάδας και σχηματισμό συμπλόκου έναρξης 70S παραγσυμπλόκου έναρξης 70S. παραγ.

EF-Tu18

O παράγοντας επιμήκυνσης EF-Tu (G protein), ένας δεύτερος μοριακός διακόπτης παραδίδει τα αμινοακυλο tRNAs στη θέση Α

EF-Tu

διακόπτης, παραδίδει τα αμινοακυλο-tRNAs στη θέση Α

Ο EF-Tu δεν αναγνωρίζει fMet-tRNAf . Γι΄αυτό , fMet-tRNAf δεν μεταφέρεται στη θέση Α (αλλά στη Ρ) και fMet δεν

θενσωματώνεται σε εσωτερικές θέσεις

Proofreading -EF-Tuανακύκλωση

19

Ο EF-Tu - GTP μεταπίπτει στη μορφή μ η μ ρφήEF-Tu - GDP και αποσυνδέεται μόνο αν το tRNA ζευγαρώσει σωστά με το αντίστοιχο κωδικόνιο

EF-Tu EF-TuEF-Tu GTP

EF-Tu GDP

EF-TsGTP

EF-Tu + GDP

Ο παράγοντας EF-Ts επάγει τηνΟ παράγοντας EF Ts επάγει την απελευθέρωση του GDP επιτρέποντας στον EF-Tu να επανασυνδεθεί με GTP

N1 Ranεy20

Το αντικωδικόνιο του αμινοακυλ-tRNA και όχι το αμινοξύ καθορίζει την αναγνώριση του αντίστοιχου κωδικονίου στο mRNA και επομένως τοαναγνώριση του αντίστοιχου κωδικονίου στο mRNA, και επομένως το αμινοξύ που τελικά ενσωματώνεται στην πρωτείνη που συντίθεται

Πείραμα:Πείραμα:Εάν η κυστείνη του Cys-tRNAcys μετατραπεί χημικά/τεχνητά σε αλανίνη τότε το Ala-tRNAcys θα συνεχίζει να αναγνωρίζει κωδικόνιο κυστείνης και κατά την πρωτεινοσύνθεση θα ενσωματώσει αλανίνη στη θέση της κυστείνηςτην πρωτεινοσύνθεση θα ενσωματώσει αλανίνη στη θέση της κυστείνης

Εφαρμογή: σύνθεση «αφύσικων» πρωτεϊνών in vitro !!!

Σχηματισμός πεπτιδικού δεσμού

21

Η αντίδραση σχηματισμού πεπτιδικού δεσμού

Η αμινική ομάδα του νέο-εισερχόμενου αμινοακυλο-tRNA στη θέση Α προσβάλλει την καρβονυλική ομάδα του εστερικού δεσμού του προηγούμενου άκυλο-tRNA στη θέση Ρ

Ρόλος φορμυλίωσης22

Ο πιθανός ρόλος της φορμυλίωσης στην εναρκτήρια μεθειονίνη είναι η προστασία του πρώτου πεπτιδυλ tRNA δεσμούπροστασία του πρώτου πεπτιδυλ-tRNA δεσμού

στη πρωκαρυωτική μετάφραση

Η προσβολή του πεπτιδικού δεσμού από την -ΝΗ2 της μεθειονίνης θα οδηγούσε στο σχηματισμό σταθερού εξαμερούς δακτυλίου υδρόλυση του πεπτίδυλ tRNA εστερικού δεσμού

Γιατί αυτό δεν είναι πρόβλημα στην ευκαρυωτική μετάφραση ???

σχηματισμό σταθερού εξαμερούς δακτυλίου, υδρόλυση του πεπτίδυλ-tRNA εστερικού δεσμού και τερματισμό της μετάφρασης

EF-G23

EF-G

O παράγοντας επιμήκυνσης EF-G είναι επίσης μια

ί Gπρωτείνη G,που υδρολύοντας GTPμετατοπίζειτο ριβόσωμα κατάτο ριβόσωμα κατά τρία νουκλεοτίδια.

Μετακινεί τοΜετακινεί το απο-ακυλιωμένο tRNAστη θέση Ε και το πεπτιδυλ-tRNA στη θέση Ρπεπτιδυλ-tRNA στη θέση Ρ, ενώ η μετακίνηση του mRNAανοίγει τη θέση Αανοίγει τη θέση Α στο επόμενο κωδικόνιο

τερματισμός της μετάφρασης

24

RFs:Οι πρωτεϊνικοί παράγοντες τερματισμού RF1, RF2, Rf3 (Release factors) αναγνωρίζουν τα κωδικόνια τερματισμού UAA, UGA, UAG

Επιτρέπουν τη διέλευση ενός μορίου Η2Ο(προσαρτημένο σε Gly-Gly-Gln) στην Α θέση( ρ ρ ημ y y ) η η

με αποτέλεσμα την αυτόματη δ όλ

RFυδρόλυση του πεπτιδυλ-tRNAεστερικού δεσμού

Ο αποκλεισμός του Η2Ο από το κέντρο της πεπτιδυλ-μεταφοράσης προστατεύει τον πεπτιδυλ-tRNA εστερικό δεσμό από αυθόρμητη υδρόλυση

Ταλάντευση 25

Ταλάντευση-wobble: Στερεοχημική χαλαρότητα στο ζευγάρωμα της πρώτηςβάσης του αντικωδικονίου με την τρίτη βάση του κωδικονίουβάσης του αντικωδικονίου με την τρίτη βάση του κωδικονίου

Εάν η αναγνώριση κωδικονίου-αντικωδικονίου προϋπέθετε ζευγάρωμα και των τριών βάσεωνπροϋπέθετε ζευγάρωμα και των τριών βάσεων, τότε κάθε tRNA θα αναγνώριζε μόνο ένα κωδικόνιο.

Όμως π.χ ένα αλανυλ-tRNA μεταφέρει αλανίνησε τρία διαφορετικά κωδικόνια

---

Μηχανισμός αποκωδίκευσης:

Δύο αδενίνες (Α 1492 και Α 1493) στο 3’ άκρο του 16S rRNA της υπομονάδας 30SΔύο αδενίνες (Α 1492 και Α 1493) στο 3 άκρο του 16S rRNA της υπομονάδας 30Sελέγχουν μέσω δεσμών υδρογόνου εάν έχουν ζευγαρώσει οι δυο πρώτες θέσεις του δίκλωνου τμήματος κωδικίου-αντικωδικίου.

Μ ό λέ δ ά ί θέ !!!Μηχανισμός ελέγχου δεν υπάρχει για την τρίτη θέση !!!

Ευκαρυωτική Μετάφραση

26

5. Η ευκαρυωτική μετάφραση είναι πιο σύνθετη και διαφέρει απο την προκαρυωτική κυρίως στο μηχανισμό έναρξης ρ ρ ή ρ ς μηχ μ ρξης

ΕυκαρυωτικόΠροκαρυωτικό

~20 aa/sec 2 aa/sec

~2/3

~1/3

Πού συγκροτούνται οι ευκαρυωτικές ριβοσωμικές υπομονάδες ? eIF4E – Cap

eIF2-GTP - Met-tRNAi - 40S27

eIF4E – CapeIF2-GTP - Met-tRNAi - 40S

Ο ευκαρυωτικός παράγοντας έναρξης eIF4E αναγνωρίζει το 5’ eIF2έναρξης eIF4E αναγνωρίζει το 5 κάλυμμα και ο eIF2-GTP σε σύμπλοκο με το Met-tRNAi και την 40S ριβοσωμική eIF4E

eIF2

την 40S ριβοσωμική υπομονάδα σχηματίζει το σύμπλοκο προέναρξης 43S, που σαρώνει το mRNA

eIF4E

ρψάχνοντας για AUG

Αναφορά στην Kozak consensus-3A, +4G

eIF2-GDP - 80S 28

Η συγκρότηση του 80S συμπλόκου έναρξης πραγματοποιείται με τη ρξης ρ γμ μ ησύνδεση της 60S ριβοσωμικής υπομονάδας, αφού προηγηθεί υδρόλυση του eIF2-GTP σε eiF2-GDP

Η διεργασία επιμήκυνσης και τερματισμού είναι μηχανιστικά ανάλογες με αυτές των προκαρυωτικών συστημάτων

Tι είναι τα πολυσώματα ?29

Πολλά ριβοσώματα μεταφράζουν συγχρόνως το ίδιο μόριο

folding30

Πώς αποκτούν οι πρωτεΐνες την τρισδιάστατη δομή τους ?

1. Αυθόρμητα

Hsps31

2. Με κατανάλωση ενέργειας (ΑΤΡ)

Οι πρωτείνες θερμοπληξίας συντελούν στην αναδίπλωση νεοσυντιθέμενων πρωτεινών

Αντιβιοτικά 32

Αντιβιοτικά στοχεύουν την προκαρυωτική μετάφραση

Η στρεπτομυκίνη παρεμβαίνει στη δέσμευση φόρμυλο μεθειονυλο-tRNA, ενώ άλλες φ ρμ μ , ςαμινογλυκοσίδες (νεομυκίνη, γενταμυκίνη, καναμυκίνη) παρεμβαίνουν στη θέση αποκωδίκευσης (θέση 1492 του 16S rRNA)

Η πουρομυκίνη, που μοιάζει με το αμινο-ακυλικό άκρο ενός αμινοακυλ-tRNAαποσυνδέει την πολυπεπτιδική αλυσίδα η ήαπό το ριβόσωμα

διφθερίτιδα33

Τοξίνες στοχεύουν μεταφραστικούς παράγοντες

Η τοξίνη της διφθερίτιδας (Corynebacterium diphtheriae)

θέ ADP βόζπροσθέτει ADP-ριβόζη στο διφθαμίδιο (τροποποιημένη His) του EF2 με αποτέλεσμα την απόλυτη αδρανοποίησή τουαπόλυτη αδρανοποίησή του

Η τοξίνη της χολέραςADP- ριβοσυλιώνει

ί G λώπρωτείνες G προκαλώνταςμαζική έκκριση υγρών από το λεπτό έντερο,αφυδάτωση και θάνατοφ η

34

ΑσκήσειςStryer Σελ. 946-9472, 4, 10, 14, 17, 18.Lehninger Kεφ 27Lehninger Kεφ. 275, 6, 7, 12.

Επίσης σκεφθείτε και το παρακάτω πρόβλημα:

O Mπάμπης και ο Ερμάνος δίδυμοι που ζουν στο ίδιο άγονο νησί προσβάλλονται απόO Mπάμπης και ο Ερμάνος, δίδυμοι που ζουν στο ίδιο άγονο νησί, προσβάλλονται από το ίδιο –πιθανότατα- παθογόνο βακτήριο.

Στον Ερμάνο ο αγροτικός γιατρός χορηγεί χλωραμφενικόλη και σε λίγες μέρες αναρρώνει. Ο Μπάμπης, με υπόδειξη και βοήθεια της «φίλης» του, παίρνει μερικα mgs κυκλοεξιμίδιο και το ίδιο βράδυ πεθαίνει.

Ο Βιολόγος του σχολείου ισχυρίζεται ότι και οι δύο χημικές ουσίες αναστέλλουν ισχυρά τηνΟ Βιολόγος του σχολείου ισχυρίζεται ότι και οι δύο χημικές ουσίες αναστέλλουν ισχυρά την σύνθεση πρωτεϊνών, ενώ ο φαρμακοποιός του νησιού βεβαιώνει ότι το κυκλοεξιμίδιο δεν διατίθεται ποτέ σε ασθενείς.

Γιατί πέθανε ο Μπάμπης ??35

Ταλάντευση-wobbleΗ ινοσίνη που προκύπτει από μετα-μεταγραφική απαμίνωση αδενοσίνηςΗ ινοσίνη, που προκύπτει από μετα-μεταγραφική απαμίνωση αδενοσίνης, έχει τη μεγαλύτερη ευελιξία γιατί μπορεί να ζευγαρώσει με C,U,A στη τρίτη

θέση του κωδικονίου

36