Oligonukleotidok szintézise

Dezoxinukleinsav szintézis

Elv:N

OOH

O

PO OH

OH

NO

OH

O

PO OH

OH

( )

( )

1. Kondenzáció (módszer)

5-OH + H (3)

2. Vízmentes közeg

3. Védőcsoportok

Módszerek

1. Karbodiimid Tood (Nobel díj 1968)

(1955) Khorana (Nobel díj 1975)

Kapcsoló szer: DCC/Piridin

Védőcsoportok:

N

N

N

N

NH

OO

OH

C

C

O

CH3

N

N

NH

OO

O

O

OH

OH

O

P

C

CH3

O

C

O

CH3

DCCTritil(Tr)

Acetil (Ac)

Acetil (Ac)6

4

Védőcsoportokok eltávolítása

AO

OH

O CO

O

OH

O

P

OH

AO

Tr

O CO

O

OH

O

P

OH

OH TO

O

OH

O

P

OAc

AO

Tr

O CO

O

OH

O

P

OAc

Ac

Ac

1. Lúg

2. Sav

(80% AcOH)

Lúg

+

Láncnövekedés

Megjegyzések:1. Oldatban2. Ribonukleotid sor:

3.

CO védelem (Bz)

AO

MMTr

O

OH

OHO P

OBzCMeO védelem (MMTr)

mono

Bz2

2. Foszfit módszer Beaucage, Caruthers; Matteucci, Caruthers

(szilárd hordozó)

2.1 Szilárd hordozó - szilika- üveggyöngy- műanyag- cellulóz papir

szilika Si OH Si O (CH2)3 NH2szilika

1. borostyánkősavanhidrid

2. védett nukleotid

szilika Si O (CH2)3 NH C (CH2)2 C

O O

O

AO

DMTrBz2

savérzékeny

bázis érzékeny

Si O (CH2)3 NH C (CH2)2 C

O O

O

AO

OH

szilika

BzH +

+ DMTr +

= 498 nm

C+

OCH3

OCH3

DMTr +

2.2 Védőcsoportok

benzoil

CO

N-6-benzoil adenin[ABz]

N-4-benzoli citozin [CBz]

N-2-isobutil guanin [GIBu]

C

O

C

OCH3

OCH3

4,4’-dimetoxitritil

a) CH3-

b) -CN-CH2-CH2-

(-cianoetil)

NP

N,N diizopropil

2.3 Aktiválás

AO

O

O

DMTr

PNH3CO

N

N

N

N

NH2

OOH

O

OH OHP

N

N

NN

AO

O

O

DMTr

PH3CO

N

N

NN

H

Tetrazol

Bz Bz

Diizopropilfoszforamidát

2.4 Kapcsolás

N

N

NN

AO

O

O

DMTr

PH3CO

Bz

GO

OH

O

Szilika

IBu

AO

O

O

DMTr

PH3CO O G

O

OSzilika

IBu

Bz

+ tetrazol

2.5 Oxidáció: „foszforossav foszforsav”

AO

O

O

DMTr

PH3CO O G

O

OSzilika

IBu

Bz AO

O

O

DMTr

P

OCH3

OG

O

O

O

Szilika

IBu

Bz

3

2

1

I2, H2O

kollidin

2.6 Hasítás

1. CH3 eltávolítása (tiofenol)

2. Oligonukleotid hasítása a hordozóról (NH3)

3. Nukleozid bázis védőcsoport (Bz, IBu) eltávolítása (NH4OH + hő)

2.7 Tisztítás HPLCElektroforézis

DNS/oligonukleotid chip (csip)

Expression levels of 50 genes most highly correlated with the acute lymphoblastic leukemia

(ALL) and acute myeloid leukemia (AML).

Expressed in ALL

Expressed in AML

Expression levels greater than the mean: red, below the mean: blue.

TR Golub et al Science 286: 531 (1999)

Koenzimek

KOENZIMEK

Enzim = apoenzim (fehérje) + koenzim (nem-fehérje)

Szubsztrátspecifitás Reakciótípus

Nukleotid Fémion (példa) Egyéb

Fe (citokróm oxidáz)

NAD Cu (aszkorbinsav oxidáz) B1

FADZn (alkohol dehidrogenáz)

B6

ATPMn (hisztidin ammónia-liáz)

B12

koenzimA Co (glutamát mutáz) folsav

Ni (ureáz) pantoténsav

Mo (xantin oxidáz) biotin

V (nitrát reduktáz)

Se (glutation peroxidáz)

Típusai

Nukleotid koenzimek

1. Adenozin mono-, di- és trifoszfát

felfedezés: Lohmann, Fiske (1929)

OO

OHOH

P

O

O-

O- N

N

N

N

NH2

OO

OHOH

P

O

O-

P

O

O

O-

OH

O-O

O

PN

N

N

N

NH2

OO

OHOH

P

O

O-

P

O

O

O-

OHN

N

N

N

NH2

P

O

OH

O-

O-+

+ H2O

adenozin-monofoszfát (AMP)

ATP ADP foszforsav

H° = -31 kJ/mol

-N-glikozid

D-ribóz

észterkötés ciklusos AMP

2. NAD/NADH: oxidáció

N

O

NH2

N

N

NH

N

NH2

nikotinamid

adenin

nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD+)

5’

5’

D-ribóz

Példa:

CH3-CH2-OH + ADH enzim

CH3-COH +

NAD+ NADH

ADH = alkohol dehidrogenáz

acetaldehid

Mechanizmus

N+

O

NH2

H

H

H H

R

N

O

NH2

H

H

H H

R

H

+2e- + H+

NAD+ NADH

3. FAD/FADH2: oxidáció

/enzimkötődés/

Flavin-adenin-dinukleotid (FAD)

4. Koenzim-A (CoA)felfedezés: Lipmann, 1946

adenozin-3’,5’-difoszfát

2,4-dihidroxi-3,3-dimetil-vajsav

-alanin ciszteamin

pantoténsav (vitamin)

5’

3’

észter kötés

észter kötés

savamid kötés

savamid kötés

- NH –(CH2)2 - SH - NH –(CH2)2 - S – CO – CH3

S-acetil koenzim-A (Ac-CoA)

5. Koenzim-Q (ubikinon, CoQ)

Koenzim-Q,ubikinon

szemikinon

ubikinol

Koenzim Q4, n = 4Koenzim Q9, n = 9Koenzim Q10, n = 10