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Online-Derivatisierung von Fettsäuren
Dr. Klaus Schrickel Thermo Fisher Scientific Dreieich, Germany
2
Anwendungsbeispiele Fettsäureanalytik
• Lebensmittel-Überwachung
• Nahrungsergänzungsmittel
• Medizinische Diagnostik
• Kosmetische Produkte
• Biokraftstoffe Bilderquelle: Google
3
SFA, MUFA, PUFA... • Gesättigte Fettsäuren (SFA, Saturated Fatty Acids)
• Kohlenstoffketten ohne Doppelbindung • Gesättigte Fettsäuren kommen meist in tierischen Lebensmitteln vor (wie Fleisch, Butter, Käse). • Sie können vom Körper selbst gebildet werden. Sie müssen daher nicht in großen Mengen mit
der Nahrung aufgenommen werden. • Eine zu hohe Aufnahme an SFA erhöht den LDL-Cholesterinwert ("schlechtes" Cholesterin) und
den Gesamtcholesterinspiegel. • Einfach ungesättigte Fettsäuren (MUFA, Mono Unsaturated Fatty Acids)
• Kohlenstoffketten mit einer Doppelbindung • Einfach ungesättigte Fettsäuren können vom Körper selbst gebildet werden. • Sie sind vor allem in Pflanzenölen (wie Oliven- und Rapsöl) enthalten. • Sie verbessern die Balance der Blutcholesterinwerte: Das "gute" HDL-Cholesterin bleibt gleich
oder steigt. Das "schlechte" LDL-Cholesterin wird gesenkt. • Mehrfach ungesättigte Fettsäuren (PUFA, Poly Unsaturated Fatty Acids) – lebensnotwenig
• Kohlenstoffketten mit mehreren Doppelbindungen • Mehrfach ungesättigte Fettsäuren können vom Körper nicht gebildet werden. Die Zufuhr mit der
Nahrung ist lebensnotwenig (essentiell). • Sie kommen vor allem in Meeresfischen aus kalten Gewässern (Lachs, Makrele, Thunfisch), in
Nüssen und manchen Pflanzenölen vor (Maiskeim-, Sonnenblumen-, Distelöl). • Eine hohe Aufnahme an PUFA senkt den "schlechten" LDL-Cholesterinwert und den
Gesamtcholesterinspiegel.
https://www.wien.gv.at/lebensmittel/lebensmittel/inhaltsstoffe/fett/qualitaet.html
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ISO 5508
https://law.resource.org/pub/et/ibr/et.iso.5508.1990.pdf
5
Analyse als Fettsäuremethylester (FAME) mittels GC
• Säule: Thermo Scientific™ TRACE™ TR-FAME GC Säule 60m x 0,25mm x 0,25µm, PN: 260M154P
• Vorsäule: Guard Gold, 2m x 0.25mm + SilTite SS union • Detektor: FID, 280°C • Injektor: SSL, 280°C, 4mm Splitlos-Liner + Glaswolle
• Trägergas: He, 1.5 mL/min constant flow, Split 10 mL/min
• Ofenprogramm: 80°C – 4min – 15°C/min – 170°C – 0min – 3°C/min – 240°C – 1min
• Injektionsvol.:1 µL, Standard in Hexan (Cold Needle)
6
Probe: 37 FAME-Mix (Supelco®)
0.3 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 16.0 18.0 20.0 22.0 24.0 26.0 28.0 30.0 31.7-1.70.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
35.0
40.0
45.0
50.0
55.0
60.0
65.0
70.072.4
1 -
4.0
9C
4:0
C6
:0
C8
:0
C1
0:0
C1
1:0
C1
2:0
C1
3:0
C1
4:0
C1
4:1
C1
5:0
C1
5:1
C1
6:0
C1
6:1
C1
7:0
C1
7:1
C1
8:0
C1
8:1
n9
tC
18
:1n
9c
C1
8:2
n6
tC
18
:2n
6c
C1
8:3
n6
C1
8:3
n3
C2
0:0
C2
0:1
n9
cC
21
:0C
20
:2C
20
:3n
6C
20
:4n
6C
20
:3n
3C
22
:0C
22
:1n
9C
20
:5n
3C
23
:0C
22
:2
C2
4:0
C2
4:1
C2
2:6
n3
min
pAFAME2 #9 FAME Mix 1:50 FID
7
Methoden zur Derivatisierung
• Alkalische Umesterung in Na-Methylat
• Alkalische Verseifung mit NaOH und anschließende Methylierung mit BF3/Methanol
• TMSH-Verfahren: Hydrolyse und Methylierung im GC-Injektor oder in GC-Vial
8
Reaktionen
Quelle: Wikipedia
1. Verseifung
2: Veresterung
BF3
9
Probenvorbereitung nach Bedarf
• Als Instrumentenmethoden stehen zwei Basismethoden bereit, die in den Einzelparametern beliebig einstellbar sind
• Methode 1 mit alkalischer Verseifung von Glyceriden und anschließender Methylierung der freien Fettsäuren
• Methode 2 mit Methylierung freier Fettsäuren ohne vorgeschalteten Verseifungsschritt
• Jeweils mit der Option, die Probe direkt nach der Derivatisierung in den GC zu injizieren. Hierfür kann in der optionalen ATC-Station eine Injektionsspritze vorgehalten werden.
10
Ablauf
1. Aufheizen der Probe im Agitator 2. Zugabe von KOH/MeOH in Tray 1 3. Intensivschütteln im Vortexer 4. Inkubation und Verseifung im Agitator 5. Entnahme eines Aliquots von Tray 1 und Dosierung in Tray2 6. Zugabe von BF3/MeOH zur Methylierung 7. Intensivschütteln im Vortexer 8. Inkubation und Methylierung im Agitator 9. Zugabe von Heptan in Tray 2 für Extraktion FAME aus Wasser in Heptan 10.Zugabe von NaCl-Lösung in Tray 2, Hilfsreagenz zur besseren Extraktion 11. Intensivschütteln im Vortexer 12.Abwarten in Tray 2 bis Phasentrennung erreicht ist 13.Entnahme der überstehenden Heptanphase von Tray 2 und Dosierung in Tray 3
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Samplerkonfiguration Übersicht
12
Traykonfiguration am Probenhalter, Park Station, Inkubationsofen (Agitator) und Vortexer
Traykonfiguration am Probenhalter
13
Konfiguration der Lösungsmittel- und Waschstationen
14
Custom Methode am TriPlus RSH
15
Stand – alone Derivatisierungs-Roboter
16
Vollautomatische Analysenstation
17
Biodiesel
0.00 1.25 2.50 3.75 5.00 6.25 7.50 8.75 10.0011.2512.5013.7515.0016.2517.5018.7520.0021.2522.5023.7525.0026.2527.5028.7530.00-200-1000
100200300400500600700800900
1,0001,1001,2001,3001,4001,5001,600
C4:0 C6:0 C8:0C10
:0C12
:0C14
:0C14
:1C15
:0
C1 6 : 0
C1 6 : 1
C1 7 : 0
C1 7 : 1
C1 8 : 0
C1 8 : 1
c + t
C1 8 : 2
c + t
C1 8 : 3
n 3
C2 0 : 0
C2 0 : 1
C2 0 : 2
C2 2 : 0
C2 2 : 1
C2 2 : 2
C2 3 : 0
C2 4 : 0
C2 4 : 1
min
mV 11 - C1 6 : 012 - C1 6 : 1 13 - C1 7 : 0 14 - C1 7 : 1 15 - C1 8 : 0 16 - C1 8 : 1 c + t 17 - C1 8 : 2 c + t 18 - C1 8 : 3 n 319 - C2 0 : 0 20 - C2 0 : 1 21 - C2 0 : 2 22 - C2 2 : 0 23 - C2 2 : 1 24 - C2 2 : 225 - C2 3 : 0 26 - C2 4 : 0 27 - C2 4 : 1 1 - C4:02 - C6:03 - C8:04 - C10:05 - C12:06 - C13:07 - C14:08 - C14:19 - C15:010 - C15:1FAME Profile #14 Biodiesel ohne IS (Channel 1) techCHROM
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Chromatogaphy Data System (CDS) - Sequenz
Thermo Scientific™ Dionex™ Chromeleon CDS
19
Chromatogramm + Interaktive Charts
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Chromatogramm + Interaktive Charts - Ausschnitt
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Beispiel-Report
Probeninfo
Gruppen-Auswertung
Chromatogramm
Auswertung Einzelpeaks
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Zusammenfassung
• Vollautomatische Analyse von Fettsäuren in einem System umfasst: • Online-Probenvorbereitung • GC-Analyse • Berechnung aller relevanten Ergebnisse • Grafische Darstellung der Ergebnisse im Report
• Verschiedene Optionen zur Verschachtelung zur optimalen Abbildung
der Labor-Abläufe • Automatische Abläufe minimieren Fehlerquellen • Automatische Probenvorbereitung schafft Kapazitäten für andere,
wichtige Tätigkeiten – z.B. QS
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Kontakt
Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit!
Dr. Klaus Schrickel
Produktspezialist GC, GC/MS Thermo Fisher Scientific Chromatography and Mass Spectrometry Division Im Steingrund 4 – 6 63303 Dreieich Germany Phone: +49 6103 / 408 - 1269 Mobil: +49 172/7214580 [email protected]