Embed Size (px)
Citation preview
CINDY BABIN
OPTIMISATION DE LA RÉPONSE CELLULAIRE
INDUITE PAR LES NANOPARTICULES DU PAPMV
FUSIONNÉES À UN ÉPITOPE CTL DU VIRUS
INFLUENZA
Mémoire présenté
à la Faculté des études supérieures et postdoctorales de l’Université Laval
dans le cadre du programme de maîtrise en microbiologie-immunologie
pour l’obtention du grade de Maître ès sciences (M. Sc.)
DÉPARTEMENT DE MICROBIOLOGIE-INFECTIOLOGIE ET
D’IMMUNOLOGIE
FACULTÉ DE MÉDECINE
UNIVERSITÉ LAVAL
QUÉBEC
2012
© Cindy Babin, 2012
II
Résumé
La protéine de capside du virus de la mosaïque de la papaye (PapMV CP)
s’assemble autour d’un ARN simple brin pour former des nanoparticules. Nous avons
montré que ces nanoparticules peuvent être fusionnées à des épitopes peptidiques
permettant le développement d’une réponse immunitaire protectrice. Le C-terminal
de la protéine a été utilisé comme site de fusion dans nos études précédentes.
Récemment, nous avons découvert que des fusions après le résidu 12 ou 187 de la CP
démontrent aussi un potentiel pour fusionner les épitopes d’intérêt. Le but de ce
projet de recherche est de déterminer la capacité d’induire une réponse cellulaire en
utilisant des nanoparticules PapMV CP fusionnées à un épitope cellulaire sur
différents sites de fusion. L’immunisation de souris avec les particules recombinantes
a permis de démontrer qu’une fusion au N-terminus était plus efficace pour induire la
prolifération des lymphocytes T CD8+ spécifiques. De plus, les résultats révèlent que
la multimérisation de la CP sous forme de nanoparticules est un critère requis pour
induire une réponse cellulaire.
III
Avant-Propos
C’est avec la rédaction de ce mémoire que se terminent mes études au
deuxième cycle. Je profite de cette occasion pour remercier les gens qui m’ont
soutenu tout au long de ces deux années. Tout d’abord, un merci tout spécial à mes
parents, Nicole et René, qui, du fin fond de la Gaspésie, m’ont toujours encouragé à
continuer et à voir les choses de façon positive. Merci à mes beaux-parents, Chantale
et Pierre, pour votre écoute et votre gentillesse. Merci de m’avoir considérée comme
votre fille depuis les premiers jours. Une mention spéciale à ma belle-maman
Chantale pour la correction de mon français. Merci à ma grand-maman substitue pour
me laisser participer aux soirées du vendredi et aux séances de magasinage. C’est très
apprécié! Merci à mes deux amours, Antoine et Jade, pour leurs beaux sourires.
Merci à mon amoureux Philippe pour sa patience et son sens de l’humour; deux
qualités qui m’ont permis de passer à travers. Merci à mes amis Christina et Maxime
pour les nombreux soupers du samedi soir.
Un gros merci à tous mes collègues du Centre de recherche en infectiologie et
plus spécialement à mon équipe de recherche. Merci à Annie, Audrey, Caroline,
Claudia, Gervais, Marie, Marie-Christine, Marie-Eve et Marilène pour votre bonne
humeur, votre sens de l’humour et votre entraide. Vous êtes vraiment une équipe de
rêve. Merci également aux anciens membres, principalement Christian et Karine. Un
merci spécial à Gervais pour ses résultats qui ont mené à mon projet de recherche.
Merci à ma co-directrice Nathalie pour m’avoir appris les rudiments de la recherche
et m’avoir conseillé tout au long de ces deux années. Finalement, merci à Denis, mon
directeur de recherche, pour m’avoir accueilli au sein de son équipe et m’avoir
transmis sa passion pour la recherche.
Merci à vous tous!
IV
À toute mon équipe!
V
Table des matières
RÉSUMÉ ............................................................................................................................................ II
AVANT-PROPOS ............................................................................................................................... III
TABLE DES MATIÈRES ........................................................................................................................ V
LISTE DES TABLEAUX ....................................................................................................................... VII
LISTE DES FIGURES ......................................................................................................................... VIII
1. PRINCIPES GÉNÉRAUX DE LA VACCINATION ............................................................................ 1
1.1 HISTORIQUE DU DÉVELOPPEMENT DES VACCINS .................................................................................... 3 1.2 LES DIFFÉRENTS ACTEURS DE LA RÉPONSE IMMUNE ................................................................................ 4
1.2.1 L’immunité innée dirige la réponse immune acquise ....................................................... 4 1.2.2 Les cellules T auxiliaires (TH) ............................................................................................ 6 1.2.3 Les cellules T cytotoxiques (CTL) ...................................................................................... 8 1.2.4 Les anticorps .................................................................................................................... 9
1.3 LES DIFFÉRENTS TYPES DE VACCINS ................................................................................................... 10 1.3.1 Les vaccins composés d’organismes entiers .................................................................. 11 1.3.2 Les vaccins sous-unitaires .............................................................................................. 11 1.3.3 Vaccins à base de pseudo- particules virales ................................................................. 12
2. LES VIRUS VÉGÉTAUX EN VACCINATION ................................................................................ 13
2.1 LA CLASSIFICATION DES VIRUS VÉGÉTAUX ........................................................................................... 14 2.1.1 Les virus hélicoïdaux ...................................................................................................... 15 2.1.2 La famille des Flexiviridea .............................................................................................. 16 2.1.3 Les Potexvirus ................................................................................................................ 17
2.2 LA PROTÉINE DE CAPSIDE DES POTEXVIRUS ........................................................................................ 19 2.2.1 La protéine de capside du PVX ....................................................................................... 19 2.2.2 La protéine de capside du PapMV ................................................................................. 20
2.3 FUSION D’ÉPITOPES D’INTÉRÊT EN VACCINATION ................................................................................. 25 2.3.1 Réponse immunitaire induite par les nanoparticules issues des virus végétaux............ 25 2.3.2 Réponse humorale induite par la PapMV CP ................................................................. 26 2.3.3 Réponse cellulaire induite par la PapMV CP .................................................................. 29
3. HYPOTHÈSES ET OBJECTIFS .................................................................................................... 33
4. MATÉRIEL ET MÉTHODES ....................................................................................................... 34
4.1 CLONAGE .................................................................................................................................... 34 4.1.1 Réactions de polymérases en chaînes (PCR) .................................................................. 35 4.1.2 Criblage des mutants ..................................................................................................... 36
4.2 PRODUCTION DES PROTÉINES RECOMBINANTES DANS E. COLI ................................................................ 37 4.2.1 Induction de la production de protéines ........................................................................ 37 4.2.2 Lyse bactérienne ............................................................................................................ 37 4.2.3 Purification des protéines d’intérêt ................................................................................ 38 4.2.4 Électrophorèse des protéines ......................................................................................... 39 4.2.5 Ultracentrifugation ........................................................................................................ 39 4.2.6 Chimie analytique et microscopie électronique ............................................................. 39
4.3 ANALYSE IN VIVO .......................................................................................................................... 40
VI
4.3.1 Immunisation ................................................................................................................. 40 4.3.2 Extraction des splénocytes ............................................................................................. 41 4.3.3 ELISPOT .......................................................................................................................... 41 4.3.4 Cytofluorométrie intracellulaire ..................................................................................... 42 4.3.5 Infection avec le virus A/WSN/33 .................................................................................. 43 4.3.6 Titration des anticorps par ELISA ................................................................................... 43 4.3.7 Titration des virus au niveau des poumons .................................................................... 43
4.4 ANALYSE STATISTIQUE ................................................................................................................... 44
5. RÉSULTATS ............................................................................................................................ 45
5.1 INSERTION DE L’ÉPITOPE CELLULAIRE NP147-155 AU SEIN DE LA PAPMV CP .............................................. 47 5.2 INDUCTION D’UNE RÉPONSE CELLULAIRE EN SOURIS BALB/C ................................................................. 50 5.3 ÉTUDE DE LA PROTECTION GÉNÉRÉE PAR LES NANOPARTICULES PAPMV NP ............................................. 54 5.4 CRÉATION DE MUTANTS MULTIPLES ET EFFET SUR LA RÉPONSE CELLULAIRE INDUITE.................................... 56
6. DISCUSSION ........................................................................................................................... 59
7. CONCLUSION ......................................................................................................................... 62
BIBLIOGRAPHIE ............................................................................................................................... 64
ANNEXE 1. ALIGNEMENT DES CPS DES POTEXVIRUS ....................................................................... 72
ANNEXE 2. MILIEUX ET TAMPONS .................................................................................................. 75
ANNEXE 3. CARTE DU VECTEUR D’EXPRESSION PET-3D .................................................................. 78
ANNEXE 4. SÉQUENCES DES CLONES ............................................................................................... 79
VII
Liste des tableaux
Tableau 1. Caractéristiques des virus de la famille des Flexiviridea (Adams, Antoniw et al.
2004). ............................................................................................................................ 17
Tableau 2. Amorces utilisées pour fusionner l’épitope CTL sur la PapMV CP. .................. 36 Tableau 3. Taille moyenne des mutants multiples obtenus par la mesure de la taille des
particules par diffraction de la lumière. ....................................................................... 56
VIII
Liste des figures
Figure 1. Mécanisme d’action des récepteurs de l’immunité innée dans l’endosome.
Ces récepteurs reconnaissent des motifs moléculaires conservés associés aux
pathogènes d’origine diverse. (Blasius and Beutler 2010). .................................. 6
Figure 2. Différenciation des cellules TH1, TH2, TH17 et Treg et patron de sécrétion
de cytokines spécifiques à chaque cellule (Saito, Nakashima et al. 2010). .......... 7 Figure 3. Présentation d’antigènes aux lymphocytes T CD8+ menant à la
prolifération de cellules effectrices dans le but d’éliminer les cellules tumorales
(ou dans d’autres cas les cellules infectées) par apoptose. .................................. 8
Figure 4. Expansion clonale de cellules B spécifiques à un antigène donné et
différenciation en plasmocytes et en cellules mémoires. ..................................... 10 Figure 5. Répartition des virus végétaux selon la composition de leur génome. ........ 15
Figure 6. Représentation du virus de la mosaïque de la papaye (PapMV) en
microscopie électronique. ................................................................................... 18 Figure 7. Prédiction de la structure de la protéine de capside du PVX (A) et du PVA
(B) (Nemykh, Efimov et al. 2008). ....................................................................... 20
Figure 8. Analyse des protéines sauvages CPΔN5 (A), E128A (A et D) et K97A (C et
E) sous forme de nanoparticules et sous forme de disques par CD Spectrum
(Tremblay, Majeau et al. 2006). .......................................................................... 21 Figure 9. Test d’affinité de liaison des protéines à l’ARN démontrant l’importance
des acides aminés 97 (C) et 128 (B) (Tremblay, Majeau et al. 2006). ................ 22
Figure 10. Exclusion des protéines CP6-215 et CP27-215 par chromatographie
suggérant l’aspect monomérique des particules CP27-215 (A) (Lecours, Tremblay
et al. 2006). .......................................................................................................... 23 Figure 11. Filtration sur gel suggérant l’importance du N-terminal dans
l’assemblage des nanoparticules. ........................................................................ 24 Figure 12. Réponse humorale induite par les nanoparticules PapMV CP. ................ 27
Figure 13. Importance de la multimérisation des protéines PapMV CP dans
l’induction d’une réponse humorale protectrice au niveau de la réponse
anticorps (A) et de la survie suite à un infection (B,C) (Denis, Acosta-Ramirez et
al. 2008). .............................................................................................................. 29 Figure 14. Réponse cellulaire induite in vitro par les nanoparticules PapMV CP. ... 31 Figure 15. Réponse cellulaire induite in vivo par les nanoparticules. ....................... 32
Figure 16. Induction d’une immunité protectrice par les protéines PapMV-p33
(Lacasse, Denis et al. 2008). ............................................................................... 32 Figure 17. Séquence en acides aminés de la CP6-215 modifié pour contenir les sites de
restrictions SpeI et MluI. ..................................................................................... 34
Figure 18. Séquence en acides aminés de la CP6-215 et prédiction de la structure
secondaire. .......................................................................................................... 45 Figure 19. Titre en anticorps anti-GST-HA11 et anti-PapMV. .................................. 46
Figure 20. Insertion de l’épitope NP147-155 au niveau de la séquence peptidique de la
CP du PapMV. ..................................................................................................... 47 Figure 21. Analyse de l’induction et de l’efficacité de la purification des protéines
par SDS-Page. ..................................................................................................... 48 Figure 22. Microscopie électronique des culots d’ultracentrifugation. ..................... 48
IX
Figure 23. Graphiques de la mesure de la taille des particules mutantes. ................. 50
Figure 24. Réponse cellulaire contre l’épitope de fusion NP147-155. ........................... 52
Figure 25. Titre en anticorps de sous-type IgG2a. ..................................................... 53 Figure 27. Graphique de la perte de poids des souris infectées avec le virus
A/WSN/33 (H1N1) selon leur masse corporelle initiale (en %) en fonction des
jours suivant l’infection. ...................................................................................... 55 Figure 28. Concentration virale au niveau des poumons à la suite d'une infection
avec 250 pfu du virus A/WSN/33. ........................................................................ 55 Figure 26. Analyse de l’induction des protéines multiples sur SDS-Page. ................. 57 Figure 29. Réponse cellulaire contre l’épitope cellulaire NP147-155 suite à l’utilisation
des protéines mutantes multiples. ........................................................................ 58
1
1. Principes généraux de la vaccination
Encore aujourd’hui, la vaccination est considérée comme l’une des plus
puissantes avancées de la médecine moderne (Paolo 1999; Šmahel 2011). En fait, mis
à part l’instauration de systèmes permettant l’approvisionnement en eau potable, le
vaccin est l’outil qui a le plus contribué à la diminution de la mortalité. Divers types
de vaccins ont permis le contrôle de plusieurs maladies infectieuses d’importance
majeure telles que la variole, la diphtérie, le tétanos, la poliomyélite, la rougeole et la
rage (Plotkin 2005). L’élimination complète du virus de la variole, officiellement
éradiqué en 1980 par l’Organisation mondiale de la santé, démontre bien l’efficacité
d’une vaccination massive au sein de la population mondiale (Fenner 1982). Il est
accepté par la communauté médicale et scientifique que la vaccination est la pratique
médicale la moins onéreuse et la plus efficace. Les vaccins les plus « faciles » ont
déjà été créés, nous faisons maintenant face à des maladies chroniques, pandémiques
et aux cancers qui nécessitent le développement de nouvelles technologies qui
permettront de faire face à ces nouveaux défis. Le vieillissement de la population
dans les pays développés amène également de nouveaux défis puisque les personnes
âgées, ayant en général une immunité plus faible, répondent moins bien à la
vaccination. Le développement de nouvelles technologies et d’adjuvants seront donc
un apport important dans les années futures. Les nanoparticules du virus de la
mosaïque de la papaye (PapMV) seront, nous l’espérons, l’une de ces options.
Des vaccins préventifs contre 27 maladies infectieuses différentes sont
disponibles sur le marché. Plusieurs d’entre eux, tel que le vaccin saisonnier contre le
virus Influenza, ne sont que partiellement efficaces. Plusieurs vaccins candidats
ciblant des maladies chroniques et des maladies infectieuses orphelines sont en cours
de développement. Il existe encore de nombreuses maladies infectieuses pour
lesquelles il n’y a aucun vaccin disponible. En effet, pour certains pathogènes, tels
que le virus de l’hépatite C (VHC) et le virus de l’immunodéficience humaine (VIH),
2
les corrélats de protection immunologique sont souvent mal compris (Plotkin 2009).
Ces pathogènes mutent et ont développé des stratégies pour contourner la réponse
immunitaire, ce qui complique le choix des cibles qui permettront le développement
d’anticorps neutralisants. Compte tenu des limitations de la réponse humorale
(anticorps) envers ces pathogènes, la communauté scientifique se penche de plus en
plus sur le développement de vaccins permettant l’induction d’une réponse cellulaire
(CTL) ce qui permet de choisir des cibles antigéniques moins variables. Mis à part les
vaccins composés de virus vivants atténués, que les agences réglementaires hésitent à
supporter, les méthodes traditionnelles de fabrication de vaccins ne sont pas de
bonnes méthodes pour déclencher une réponse cellulaire. Finalement, des
considérations d’ordre économique ralentissent dans bien des cas le développement
de vaccins contre des maladies infectieuses touchant les populations pauvres de la
planète ou ciblant un marché restreint.
En plus d’améliorer les techniques de vaccination traditionnelle et de développer
de nouvelles approches, le domaine de la vaccinologie devra explorer certaines
stratégies afin d’optimiser les méthodes de fabrication et les voies d’administration
utilisées et de mettre sur le marché des vaccins encore plus sécuritaires. De nouveaux
procédés de fabrication plus efficaces et moins onéreux devront être instaurés afin de
répondre à la demande sans cesse croissante. D’un autre côté, l’utilisation de
nouvelles voies d’administration telles que les voies intranasales, orales et
transcutanées devront être prises en considération car elles permettent de mieux
diriger la réponse immunitaire dans les organes ciblés par l’infection. En effet, la voie
d’administration parentérale, bien qu’efficace au niveau systémique, ne permet pas
d’induire une immunité efficace au niveau des muqueuses (Kendall 2010).
La vaccinologie est un domaine de recherche en pleine effervescence et génère
beaucoup d’intérêt. La section qui suit donne un survol du développement des
vaccins dans le temps.
3
1.1 Historique du développement des vaccins
Les chinois ont été les premiers à utiliser le principe de la variolisation qui a
pour but d’inoculer une souche atténuée de la variole isolée d’une personne infectée à
des personnes saines. Même si plus de 1% des personnes variolisées mouraient de
cette intervention, il y avait tout de même un bénéfice car les survivants au traitement
étaient protégés contre la variole. Considérant que les personnes se retrouvant dans
les régions pandémiques touchées par la variole succombaient dans 20-50% des cas,
il s’agissait d’une pratique qui offrait un bénéfice important. Au Moyen-âge, les
européens ont voulu imiter les chinois, mais l’approche a été abandonnée puisque le
taux de mortalité des personnes vaccinées était trop important. Edward Jenner, vers la
fin du 18e siècle, a raffiné cette approche. Ayant observé que les paysans étaient plus
résistants à l’épidémie de la variole, Jenner vint à démontrer que l’inoculation d’un
virus de la variole bovine isolé du pis d’une vache permettait l’établissement d’une
protection contre une exposition subséquente avec la souche humaine du virus de la
variole (Maurice 2000). Le principe fondamental consistait à utiliser un pathogène
bovin qui ne se réplique pas efficacement chez l’humain pour induire une protection
contre un virus apparenté, le virus de la variole humaine. Ce n’est qu’au 19e siècle,
grâce aux découvertes de Louis Pasteur, que l’émergence de nouvelles techniques de
vaccination est apparue. Pasteur remarqua qu’une souche de choléra infectant le
poulet, demeurée tout l’été sur la paillasse au laboratoire, était inefficace à infecter les
poulets. De plus, il observa que cette infection "ratée" rendait les poulets résistants à
une infection subséquente avec une préparation fraîche de bactéries (Plotkin 2005).
Suite à ces observations, Pasteur établit le principe de l’atténuation physico-chimique
des virus les rendant ainsi plus adéquats pour la vaccination. C’est au 20e siècle que le
raffinement des vaccins vivants atténués prit de l’ampleur. Tout d’abord, en 1907,
Calmette parvint à atténuer une souche de la bactérie Mycobacterium bovis par
passages successifs in vitro. Quelques années plus tard, en 1937, Theiler et Smith
utilisent une technique de passages successifs in vivo chez la souris afin d’atténuer le
virus de la fièvre jaune. En parallèle au raffinement des vaccins vivants atténués,
4
l’idée d’utiliser des vaccins basés sur l’inactivation complète des virus se développe.
Au même moment, l’évolution de la compréhension des concepts immunologiques de
base se fait ressentir dans le monde de la vaccinologie. Finalement, le développement
de la biologie moléculaire a permis la découverte de nombreuses techniques de
vaccination raffinées et sécuritaires.
1.2 Les différents acteurs de la réponse immune
Ultimement, la vaccination a pour but d’induire une réponse immunitaire
adaptative spécifique à un pathogène cible. Ainsi, l’individu vacciné sera en mesure
de développer rapidement une réponse immunitaire forte et de longue durée lors
d’une infection subséquente avec le même pathogène. La vaccination permet donc
d’éliminer rapidement le pathogène et, de ce fait, diminue les risques de transmission
et le développement de complications sévères. La réponse adaptative générée
comprend les cellules T auxiliaires (TH), les cellules T cytotoxiques (CTL) et les
anticorps.
1.2.1 L’immunité innée dirige la réponse immune acquise
Le système immunitaire inné est la première ligne de défense contre l’invasion
microbienne. Cette immunité se caractérise par un ensemble de mécanismes de
défense non spécifique aux différents pathogènes (Turvey and Broide 2010).
L’immunité innée est constituée de cellules dotées de récepteurs nommés PRR, du
terme anglais « pathogen recognition receptors », ayant la capacité de reconnaître des
motifs structuraux conservés chez la majorité des micro-organismes. Ces motifs
structuraux conservés ou PAMP, de l’expression anglaise « pathogen associated
molecular pattern », peuvent être de plusieurs types tels que les lipopolysaccharides,
le peptidoglycane, l’ADN non-méthylé et l’ARN simple et double brin (Bianchi
5
2007). Plusieurs familles de récepteurs PRR ont été caractérisées jusqu’à présent
(Kumar, Kawai et al. 2011) dont les récepteurs Toll (Kawai and Akira 2010), les
récepteurs NOD (Chen, Shaw et al. 2009) et les récepteurs de type lectine (Eddie,
Takahashi et al. 2009). Les PRRs sont présents à la surface cellulaire ainsi qu’au
niveau des endosomes des cellules du système immunitaire inné tels que les
monocytes, les macrophages, les neutrophiles et les cellules dendritiques et
permettent la reconnaissance des micro-organismes. Cette reconnaissance induit une
cascade de signalisation qui mène à l’activation des cellules immunes et conduit à
l’endocytose des pathogènes puis à leur destruction. Cette cascade de signalisation
mène également à la production de cytokines et de chimiokines responsables de la
réaction inflammatoire (Figure 1). Une réaction inflammatoire rapide est d’une
grande importance pour l’élimination de certains pathogènes ainsi que pour
l’activation de la réponse immune acquise. En effet, l’activation des cellules
présentatrices d’antigènes, composées principalement des macrophages et des
cellules dendritiques, permet l’internalisation et la fragmentation des pathogènes sous
forme de petits peptides pouvant être chargés et présentés sur les complexes majeurs
d’histocompatibilité de classe I et de classe II (CMH-I et CMH-II) (Reichardt,
Dornbach et al. 2010). Les cellules présentatrices d’antigènes activées migrent vers
les organes lymphoïdes secondaires tels que la rate et les ganglions lymphatiques et
entrent en contact avec les cellules de l’immunité adaptative, soit les lymphocytes B
et les lymphocytes T. De cette façon, les cellules présentatrices d’antigènes font le
lien entre les deux types d’immunité, soit le système immunitaire inné et l’immunité
acquise (Laffont and Powrie 2009).
6
Figure 1. Mécanisme d’action des récepteurs de l’immunité innée dans l’endosome.
Ces récepteurs reconnaissent des motifs moléculaires conservés associés aux
pathogènes d’origine diverse. (Blasius and Beutler 2010).
1.2.2 Les cellules T auxiliaires (TH)
Les cellules T auxiliaires possèdent des récepteurs qui, en combinaison avec le
corécepteur CD4, reconnaissent spécifiquement les complexes peptides-CMH-II
présents à la surface des cellules présentatrices d’antigènes activées. L’engagement
du récepteur induit la prolifération des cellules T et entraîne la sécrétion de cytokines
et de chimiokines spécifiques (Figure 2). Les cellules T auxiliaires peuvent se diviser
en quatre sous-types. Tout d’abord, les cellules TH1 sécrètent des cytokines (IL-2,
IFN-γ et TNF-α) favorisant la mise en place d’une réponse cellulaire efficace via
l’activation des lymphocytes T cytotoxiques et permettent la production d’anticorps
de sous-type IgG2a par les cellules B chez la souris. Ensuite, les cellules TH2
7
sécrètent des cytokines (IL-4 et IL-6) qui augmentent la réaction inflammatoire et
allergique induite et permettent la production d’anticorps d’isotypes IgG1, IgA et IgE
chez la souris. Les anticorps d’isotypes IgA sont associés aux muqueuses alors que
les IgE sont relies à une réaction allergique. D’un autre côté, les cellules TH17
produisent des cytokines (IL-17, IL-21 et IL-22) qui permettent l’établissement d’une
réaction inflammatoire locale et le recrutement des neutrophiles. Finalement, les
cellules Treg se caractérisent par la sécrétion d’IL-10 et par l’expression du facteur de
transcription FoxP3 et permettent la régulation de la réponse immune (Mosmann and
Coffman 1989; Zhu and Paul 2009).
Figure 2. Différenciation des cellules TH1, TH2, TH17 et Treg et patron de sécrétion
de cytokines spécifiques à chaque cellule (Saito, Nakashima et al. 2010).
8
1.2.3 Les cellules T cytotoxiques (CTL)
Les cellules T cytotoxiques reconnaissent les cellules infectées par la liaison de
leurs récepteurs et du corécepteur CD8 aux peptides portés sur les complexes majeurs
d’histocompatibilité de classe I (Bonilla and Oettgen 2010). À la suite de cette
interaction, il y a prolifération de CTLs spécifiques au peptide chargé au niveau du
CMH-I et élimination des cellules infectées par apoptose ce qui permet l’élimination
des pathogènes intracellulaires (Figure 3). Un autre fait à noter est que les CTLs
activées sécrètent plusieurs cytokines dont l’IFN-γ qui interfèrent avec la réplication
virale (Schoenborn and Wilson 2007). Par contre, la réponse médiée par les cellules T
cytotoxiques requiert plusieurs jours avant d’être réactivée ce qui la rend inefficace
pour contrer les infections dues à des pathogènes dont la croissance est très rapide. En
fait, ce type de réponse serait plus adaptée pour contrôler les infections telles que la
grippe, le VHC et le cancer (Flynn, Belz et al. 1998).
Figure 3. Présentation d’antigènes aux lymphocytes T CD8+ menant à la
prolifération de cellules effectrices dans le but d’éliminer les cellules tumorales (ou
dans d’autres cas les cellules infectées) par apoptose.
9
1.2.4 Les anticorps
Les anticorps sont responsables de la protection stérilisante en neutralisant
l’invasion du pathogène dans la cellule hôte et sont à la source de l’efficacité de la
plupart des vaccins sur le marché. Les anticorps sont produits suite à l’association
d’antigènes spécifiques au niveau des récepteurs des cellules B (BCR) présents à la
surface des lymphocytes B (LB). Dans un premier temps, des anticorps de faible
affinité, les IgD et les IgM multimériques, seront sécrétés par les LBs activés
(Schroeder and Cavacini 2010). Le pontage de plusieurs BCR va permettre la
production d’IgM contre des antigènes T-indépendants (Bachmann, Hengartner et al.
1995) alors que la réponse humorale des antigènes T-dépendants sera améliorée par
l’action des lymphocytes TH qui, par la sécrétion de cytokines spécifiques, initieront
la commutation isotypique et la production d’anticorps de haute affinité, tels que les
IgG1 et les IgG2a, par les lymphocytes B. Une partie de ces LBs se différencieront en
plasmocytes et sécréteront des anticorps sériques pour une longue période de temps
alors que l’autre partie des LBs deviendront des cellules mémoires circulant entre le
sang et la lymphe. Ces cellules B mémoires possèdent la capacité de se différencier
en plasmocytes suite à la rencontre d’un antigène (Figure 4).
Les anticorps peuvent aussi participer à la réponse cellulaire induite par les
anticorps («ADCC; antibody dependant cell mediated cell toxicity») ce qui permet la
stimulation des cellules NK («natural killer») et/ou des neutrophiles qui à leur tour
élimineront les cellules du corps recouvertes en surface par des immunoglobulines de
type IgG. Cette activité est à la base de l’utilisation des anticorps en immunothérapie
dans la lutte contre les cancers (Lee, Srivastava et al. 2011).
10
Figure 4. Expansion clonale de cellules B spécifiques à un antigène donné et
différenciation en plasmocytes et en cellules mémoires.
1.3 Les différents types de vaccins
Les vaccins sont composés d’antigènes, provenant de différents pathogènes, qui
seront présentés aux cellules du système immunitaire de façon à induire une
immunité protectrice. Les vaccins peuvent être classifiés selon leur composition ou
selon leur activité. Dépendamment de leur composition antigénique, les vaccins
peuvent se diviser en deux classes : les vaccins entiers composés des antigènes
complets et les vaccins sous-unitaires composés d’antigènes spécifiques (Ertl, Xiang
et al. 2001). La classification des vaccins selon leur activité permet de les diviser en
fonction de leur capacité réplicative, soit les vaccins vivants atténués, capables de se
répliquer, et les vaccins inertes tels que les vaccins inactivés et les vaccins sous-
unitaires.
11
1.3.1 Les vaccins composés d’organismes entiers
Les vaccins composés d’organismes entiers ont été les premiers à être mis sur
le marché. Toutefois, ce type de vaccin exige la production d’une grande quantité de
micro-organismes ce qui s’avère impossible pour plusieurs pathogènes difficilement
cultivés en conditions artificielles (Dougan 2001). Par ailleurs, bien qu’ils
contiennent les antigènes nécessaires à l’effet protecteur du vaccin, la présence de
plusieurs antigènes inutiles à la réponse protectrice peut mener à l’apparition d’effets
secondaires locaux et systémiques. Il existe deux types de vaccins composés
d’organismes entiers, soit les vaccins vivants atténués et les vaccins inactivés. Les
vaccins vivants atténués, organismes génétiquement dérivés ou très apparentés aux
pathogènes cibles, sont capables de se répliquer chez le patient vacciné sans causer de
symptômes cliniques sévères ce qui permet la génération d’une réponse immune
protectrice. Ce type de vaccin permet la stimulation d’une bonne réponse humorale et
cellulaire, mais ce sont les anticorps neutralisants produits qui jouent un rôle majeur
dans la protection générée.
1.3.2 Les vaccins sous-unitaires
La majorité des vaccins actuellement sur le marché sont composés
d’organismes entiers atténués ou inactivés alors qu’une très faible proportion sont de
type sous-unitaires. Les raisons qui ont motivé le développement des vaccins sous-
unitaires sont les effets secondaires associés à l’utilisation des vaccins composés
d’organismes entiers et le risque de réversion vers des souches plus virulentes lié aux
vaccins vivants atténués (Ståhl and Liljeqvist 2001). Les vaccins sous-unitaires
contiennent uniquement les antigènes essentiels à la mise en place d’une réponse
immunitaire permettant de générer une protection contre un pathogène cible. De ce
fait, ce type de vaccins se classe dans la catégorie des vaccins n’ayant pas la
12
possibilité de se répliquer ce qui les rend très sécuritaires. Par ailleurs, ce genre de
vaccins, de par leur faible immunogénicité, requièrent généralement plusieurs doses
et la présence d’un adjuvant. Il existe plusieurs types de vaccins sous-unitaires tels
que les vaccins protéiques, les vaccins à base de polysaccharides, les vaccins à base
de toxoïdes, les vaccins à base de vecteurs, les vaccins à ADN et les vaccins
peptidiques.
1.3.3 Vaccins à base de pseudo- particules virales
Les pseudo-particules virales sont des particules non infectieuses, c’est-à-dire
qu’elles ne possèdent pas les acides nucléiques composant le génome viral, dérivées
des protéines structurales d’un virus. En fait, ces particules reproduisent la structure
d’un virus, mais sont incapables de se répliquer. Elles permettent la production
d’anticorps neutralisants et sont peu toxiques (Roy and Noad 2009). Des particules en
tous points similaires à celles produites lors d’une infection peuvent être obtenues
suite à l’expression des protéines recombinantes chez les bactéries, les levures, les
cellules d’insectes ou les plantes (Roy and Noad 2009). Les pseudo-particules virales
sont rapidement prises en charge par les cellules dendritiques et sont reconnues pour
leur efficacité à générer une réponse immune par les différentes voies
d’administration (Antonis, Bruschke et al. 2006; Young, Wilson et al. 2006). Cette
efficacité à induire une forte réponse immunitaire s’explique par plusieurs de leurs
caractéristiques. Premièrement, le diamètre moyen de ces particules, qui se situe aux
alentours de 50nm, est idéal pour leur prise en charge par les cellules présentatrices
d’antigènes (Fifis, Gamvrellis et al. 2004). Ensuite, les nanoparticules ont la capacité
d’activer la maturation des cellules présentatrices d’antigènes (Lenz, Thompson et al.
2003) et permettent l’induction d’une réponse immunitaire de type cellulaire par la
voie de la présentation croisée (Ruedl, Storni et al. 2002). Finalement, la structure
cristalline et hautement répétitive de certaines de ces pseudo-particules virales non-
enveloppées permet le pontage des récepteurs des cellules B ce qui favorise la
production d’anticorps d’isotype G (Bachmann, Hengartner et al. 1995; Leclerc,
13
Beauseigle et al. 2007). Il existe sur le marché, deux exemples de ce type de vaccins
soit; le vaccin contre l’hépatite B (Valenzuela, Medina et al. 1982) et celui contre le
virus du papillome humain (Garland, Hernandez-Avila et al. 2007). La production de
vaccins à base de pseudo-particules virales contre d’autres pathogènes est également
à l’étude.
2. Les virus végétaux en vaccination
L’intérêt et la compréhension des scientifiques face aux virus d’origine
végétale est en constante expansion. En fait, la structure cristalline et hautement
répétitive des virus végétaux permet une bonne stimulation du système immunitaire
ce qui pousse les chercheurs à développer des plateformes vaccinales versatiles,
efficaces et ce à faible coût. L’organisation mondiale de la santé (OMS) reconnaît le
développement de tel type de plateforme vaccinale universelle. Les virus végétaux
peuvent être utilisés comme adjuvants puisqu’ils possèdent, de façon intrinsèque, la
capacité de stimuler le système immunitaire. De plus, la fusion d’un épitope d’intérêt
en vaccination, au sein de la protéine de structure, permet de présenter des centaines
de copies d’un même épitope aux cellules du système immunitaire. Jusqu’à ce jour,
plusieurs virus d’origine végétale ont fait l’objet de programmes de recherche axés
sur la vaccination tel que le Tobacco Mosaic Virus (TMV), le Potato Virus X (PVX),
le Cowpea Mosaic Virus (CPMV), le Bamboo Mosaic Virus (BaMV) ainsi que le
Papaya Mosaic Virus (PapMV) (Canizares, Nicholson et al. 2005).
Mis à part l’expression de PapMV CP recombinantes chez la bactérie
Escherichia coli, l’ensemble des virus de plantes étudiés en vaccination ont été
produits et purifiés à partir de plants infectés par les virus végétaux recombinants.
L’expression et la purification de virus à partir des plantes est une méthode
intéressante puisque ce procédé requiert peu d’équipement et permet d’obtenir une
grande quantité de virus purifiés par hectare de plants infectés. Cette méthode permet
14
donc la production de plusieurs doses et ce à faible coût (Streatfield and Howard
2003; Smith, Fitzmaurice et al. 2009). Par ailleurs, la limitation principale de cette
approche est que la protéine de capside des virus végétaux est généralement
impliquée dans les étapes importantes du cycle viral tel que le mouvement du virus à
travers la plante (Cruz, Chapman et al. 1996; Lico, Capuano et al. 2006), la
réplication du virus in planta (Bol 2005) et l’assemblage des particules virales
(Tremblay, Majeau et al. 2006). Ainsi, si la fusion d’un peptide antigénique à la
surface des protéines de capside des virus végétaux interfère avec l’une ou l’autre des
fonctions mentionnées précédemment, la quantité de virus recombinants produits sera
considérablement réduite (Bendahmane, Koo et al. 1999). Pour éviter ce problème, la
production de pseudo-particules dans un système hétérologue devient donc une
alternative intéressante. L’expression de la protéine de capside des virus végétaux
chez la bactérie n’est pas relié à la réplication du virus ce qui augmente les chances
de générer des pseudo-virions fusionnés à un peptide antigénique. De plus,
contrairement aux virus purifiés à partir des plantes, les pseudo-particules produites
en bactéries ne contiennent pas le génome viral ce qui est favorisé par les organismes
réglementaires.
2.1 La classification des virus végétaux
Les virus végétaux possèdent un génome viral constitué d’ADN (simple ou
double brin) ou d’ARN (simple ou double brin, de polarité négative ou positive)
protégé, dans la majorité des cas, par la multimérisation de la protéine de capside
autour de celui-ci (Figure 5). Qu’il soit constitué d’ADN ou d’ARN, le génome des
virus végétaux code pour les éléments essentiels à leur réplication, au mouvement et à
leur assemblage en particules virales matures.
15
Les virus végétaux peuvent être divisés, selon la symétrie de leur capside, en 2
groupes, soit les virus possédant une capside icosaédrique et les virus possédant une
capside sous forme hélicoïdale. La structure tridimensionnelle, déduite à partir
d’études cristallographiques, a été élucidé pour plusieurs virus de plantes icosaèdres
(Sachse, Chen et al. 2007) cependant celle des virus hélicoïdaux, de par leur
flexibilité, demeure plus difficile à obtenir.
DNA s
s
DNA R
T-ds
RNA s
s (+
)
RNA s
s(-)
RNA d
s0
250
500
750
Nu
mb
er
of
vir
us
Figure 5. Répartition des virus végétaux selon la composition de leur génome.
Légende = DNA ss : ADN simple brin; DNA RT-ds : ADN double brin rétro-
transcrit; RNA ss : ARN simple brin (+) polarité positive, (-) polarité négative; RNA
ds : ARN double brin. (Tiré du mémoire de maîtrise de Marie-Eve Laliberté Gagné)
2.1.1 Les virus hélicoïdaux
Les virus hélicoïdaux peuvent être divisés en 2 classes selon la flexibilité de
leur capside. En effet, on distingue les virus à bâtonnets rigides comprenant les
genres tobamo-, tobra-, hordei- et furovirus des virus filamenteux flexibles du genre
potex-, poty- et bymovirus. Les virus végétaux sous forme de bâtonnets rigides ont
permis de générer une grande quantité de données structurales et la structure
16
moléculaire de certains virus, tel que le Virus de la Mosaïque du Tabac, a été établi
(Namba, Pattanayek et al. 1989; Bhyravbhatla, Watowich et al. 1998). Par ailleurs, la
structure tertiaire de la capside des virus sous forme de bâtonnets flexibles n’a
toujours pas été établie. Toutefois, il a été démontré que les repliements secondaires
des protéines de capside des virus sous forme de bâtonnets flexibles sont
principalement constitués d’hélices alpha (Tremblay, Majeau et al. 2006).
2.1.2 La famille des Flexiviridea
Les virus végétaux regroupés au sein de la grande famille des Flexiviridea
possèdent plusieurs caractéristiques communes, dont leur structure sous forme de
bâtonnets flexibles de longueurs variables (de 470 nm à plus de 1000 nm) et un
diamètre fixe de 12 ou 13 nm (Adams, Antoniw et al. 2004). Leur génome est
composé d’un ARN simple brin de polarité positive se terminant par une queue
polyadénylée en 3’. Le génome viral code pour 2 à 6 cadres de lecture ouverts (Open
Reading Frames- ORFs). Le premier ORF en 5’ code pour une protéine de réplication
possédant des motifs correspondant à une méthyl-transférase, une hélicase et une
ARN-polymérase-ARN-dépendante (Koonin, Dolja et al. 1993). Les 3 ORFs suivants
codent pour des protéines de mouvement. Le cinquième ORF permet la transcription
de la protéine de capside alors que le sixième ORF coderait pour une protéine
permettant la liaison aux acides nucléiques (Adams, Antoniw et al. 2004). Les
Flexiviridea ont été divisés en 8 genres : les Allexivirus, les Capillovirus, les
Carlavirus, les Foveavirus, les Potexvirus, les Trichovirus, les Vitivirus et les
Mandarivirus. Un résumé des caractéristiques pour chacun des genres est présenté au
Tableau 1.
17
Tableau 1. Caractéristiques des virus de la famille des Flexiviridea (Adams, Antoniw
et al. 2004).
2.1.3 Les Potexvirus
Les virus du genre Potexvirus sont des virus filamenteux flexibles de longueur
variant entre 470 et 580 nm et d’un diamètre fixe de 13 nm (Adams, Antoniw et al.
2004). Leur génome est composé d’un ARN simple brin de polarité positive codant
pour 5 ORFs. Les protéines de capsides sont codées par le cinquième ORF et sont de
poids moléculaire variant entre 18 et 27 kDa. Au-delà de vingt-cinq virus différents
font partie du genre des Potexvirus dont le virus modèle est le virus X de la Pomme
de Terre (PVX).
Le Virus X de la Pomme de Terre
Le PVX est un virus flexible de 515 nm composé de 1300 unités de la
protéine de capside enroulées autour de l’ARN simple brin de 6435 nucléotides
(Huisman, Linthorst et al. 1988). Cet ARN code pour cinq ORFs : l’ORF 1 code pour
la réplicase, les ORFs 2,3 et 4 codent pour des protéines de mouvement alors que
l’ORF 5 code pour la protéine de capside (Huisman, Linthorst et al. 1988).
18
Le Virus de la Mosaïque de la Papaye
Le Virus de la Mosaïque de la Papaye (PapMV) fait partie des virus
filamenteux flexibles de la famille des Flexiviridea du genre Potexvirus. Son hôte
principal est le Carica papaya et, suite à une infection, les symptômes se manifestent
principalement par l’apparition de régions nécrosées sous forme de mosaïque sur les
feuilles des plants infectés. Le génome du PapMV est constitué de 6656 nucléotides
(Sit, Abouhaidar et al. 1989). De façon similaire au PVX, l’ARN simple brin de
polarité positive code pour cinq protéines essentielles : une réplicase, trois protéines
de mouvement et une protéine de capside responsable de la protection du génome
viral. Ainsi, les particules virales sont constituées de l’ARN viral entouré de 1400
copies de la protéine de capside arrangées en hélice (Zhang, Todderud et al. 1993). La
Figure 7 montre une représentation du PapMV en microscopie électronique. Chaque
tour d’hélice est constitué de 8,75 sous-unités de la capside et chaque protéine est
associée à cinq nucléotides de l’ARN (Tollin, Bancroft et al. 1979).
Figure 6. Représentation du virus de la mosaïque de la papaye (PapMV) en
microscopie électronique.
19
2.2 La protéine de capside des Potexvirus
L’alignement des séquences des protéines de capside des membres du genre
Potexvirus permet de démontrer que la portion centrale des protéines de capside est
composée d’acides aminés conservés ou de remplacement conservateurs (Abouhaidar
and Lai 1989). D’un autre côté, cet alignement révèle que l’extrémité N-terminale est
la partie la plus variable de la protéine puisque les différents Potexvirus possèdent
une extrémité N-terminale de longueur très variable (Annexe 1).
2.2.1 La protéine de capside du PVX
Lors de la purification de virus à partir des plants infectés, les particules
virales du PVX peuvent être dégradées par des protéases de la plante. Cette
dégradation permet le clivage de 19 à 21 acides aminés de l’extrémité N-terminale de
la protéine de capside (Baratova, Grebenshchikov et al. 1992). Les résultats obtenus
lors du bombardement au tritium des formes non dégradées et dégradées du PVX
ainsi que ceux obtenus lors de la prédiction de la structure secondaire de la CP
révèlent que 45% du repliement de la protéine est sous forme d’hélices-alpha alors
que seulement 5% est sous forme de feuillets-beta. De plus, le bombardement au
tritium des particules virales non dégradées suggère qu’environ 35 acides aminés de
l’extrémité N-terminale sont situés à la surface des virions. L’utilisation des
particules virales dégradées lors de ces mêmes expériences a permis de démontrer
que la portion N-terminale de la CP masque l’extrémité C-terminale de la protéine.
En effet, la portion C-terminale des virions dégradés est exposée au bombardement
par le tritium. L’ensemble de ces observations ont été utilisées pour développer un
modèle structural de la protéine de capside du PVX (Figure 7).
20
Figure 7. Prédiction de la structure de la protéine de capside du PVX (A) et du PVA
(B) (Nemykh, Efimov et al. 2008).
2.2.2 La protéine de capside du PapMV
La protéine de capside du PapMV est composée de 215 acides aminés et
possède une masse moléculaire estimée à 23 kDa (Verde, Malorni et al. 1989). De
façon similaire au PVX, des prédictions de la structure secondaire suggèrent
qu’environ 50% de la protéine serait repliée sous forme d’hélices-alpha (Tremblay,
Majeau et al. 2006). Une délétion des cinq premiers acides aminés de la protéine de
capside dans sa portion N-terminale (CP6-215), suivi de son expression dans la bactérie
Escherichia coli, permet d’obtenir un assemblage productif à l’intérieur de la
bactérie. Par ailleurs, seulement 20% des protéines produites se retrouvent sous forme
de pseudo-virions alors que les autres sont produites sous formes de particules de
vingt sous-unités de la protéine de capside nommées disques. Les nanoparticules du
PapMV sont formé autour d’ARNs présents dans le cytoplasme, principalement son
propre ARN (Tremblay, Majeau et al. 2006).
Une étude de la protéine de capside du PapMV a permis d’identifier 2
résidues impliqués dans le domaine de liaison à l’ARN, soit les résidues Lys97
et
21
Glu128
. Bien que les structures secondaires et tertiaires des protéines mutantes K97A
et E128A soient similaires à celles de la protéine de capside sauvage (Figure 8), la
mutation K97A empêche la protéine de s’auto-assembler et de lier l’ARN (Figure 9).
Inversement, la mutation E128A semble favoriser l’auto-assemblage de la PapMV
CP sous forme de nanoparticules puisque la totalité des protéines se retrouvent sous
cette forme. De plus, il a été montré que le mutant E128A augmente l’affinité de la
liaison entre la protéine pour son ARN (Figure 9). Ainsi, les résidues Lys97
et Glu128
seraient des joueurs clé dans l’assemblage des particules composées de la PapMV
CP.
Figure 8. Analyse des protéines sauvages CPΔN5 (A), E128A (A et D) et K97A (C et
E) sous forme de nanoparticules et sous forme de disques par CD Spectrum
(Tremblay, Majeau et al. 2006).
22
Figure 9. Test d’affinité de liaison des protéines à l’ARN démontrant l’importance
des acides aminés 97 (C) et 128 (B) (Tremblay, Majeau et al. 2006).
Une autre étude a permis de démontrer l’importance de la portion N-terminale de
la PapMV CP dans la capacité de la protéine à s’auto-assembler et à lier l’ARN. En
effet, la délétion de 26 acides aminés au N-terminal de la PapMV CP mène à la
production de la forme monomérique de la protéine. Ces protéines monomériques
tronquées sont incapables de s’assembler, de former des disques et d’interagir avec
l’ARN lors d’étude in vitro (Lecours, Tremblay et al. 2006). Ainsi, la portion N-
terminale de la protéine de capside du virus de la mosaïque de la papaye semble être
impliquée dans le contact entre les sous-unités des pseudo-particules (Figure 10). Une
analyse exhaustive de nombreux mutants de délétion a permis de déterminer que la
délétion de 13 acides aminés dans la portion N-terminale de la protéine de capside
était suffisante pour mener à la production de protéines sous forme de monomère. De
plus, le résidu F13 de la PapMV CP est essentiel à l’assemblage de la protéine sous
23
forme de pseudo-particules. En effet, le remplacement de cet acide aminé par des
résidus hydrophobes (L ou Y) génère des formes mutantes ayant la capacité de
s’assembler sous forme de nanoparticules alors que le remplacement du résidu en
position 13 par un A, G, R, E ou S affecte l’assemblage de la protéine (Figure 11).
Ainsi, la présence d’une interaction hydrophobique au N-terminal est nécessaire pour
assurer un assemblage productif de la protéine de capside sous forme de
nanoparticules (Laliberté Gagné, Lecours et al. 2008).
Figure 10. Exclusion des protéines CP6-215 et CP27-215 par chromatographie
suggérant l’aspect monomérique des particules CP27-215 (A) (Lecours, Tremblay et al.
2006).
24
Figure 11. Filtration sur gel suggérant l’importance du N-terminal dans
l’assemblage des nanoparticules.
Filtration sur gel des protéines tronquées en N-terminal de la CP (A et B) ainsi que
des mutants F13A, F13G, F13L et F13Y (C et D) démontrant l’importance de
l’interaction hydrophobique en position 13 sur l’assemblage des pseudos particules
(Laliberté Gagné, Lecours et al. 2008).
25
2.3 Fusion d’épitopes d’intérêt en vaccination
La structure cristalline et hautement répétitive des virus végétaux permet leur
utilisation comme adjuvant puisqu’ils possèdent, de façon intrinsèque, la capacité de
stimuler le système immunitaire (Savard, Guérin et al. 2011). De plus, la fusion d’un
épitope d’intérêt en vaccination, au sein de la protéine de structure, permet de
présenter des centaines de copies d’un même épitope aux cellules du système
immunitaire. L’une des propriétés les plus intéressantes des nanoparticules issues des
virus végétaux (TMV, PVX, BaMV, PapMV) est leur capacité à induire une réponse
cellulaire (McCormick, Corbo et al. 2006; Leclerc, Beauseigle et al. 2007; Yang,
Liao et al. 2007; Lico, Mancini et al. 2009). En effet, pour le moment, très peu de
vaccins permettent l’induction de ce type de réponse qui est pourtant cruciale dans le
cas des infections chroniques.
2.3.1 Réponse immunitaire induite par les nanoparticules issues des
virus végétaux
Jusqu’à maintenant, plusieurs plateformes vaccinales issues de virus végétaux
ont fait l’objet d’étude immunologique. Tout d’abord, l’une des plateformes
vaccinales les plus efficaces est composée de la CP du virus de la mosaïque du
bambou (BaMV). Le groupe du Dr. Liang a généré un vecteur recombinant en
remplaçant l’ADN complémentaire (ADNc) codant pour les 35 acides aminés en N-
terminal de la CP du BaMV par l’ADNc codant pour 37 acides aminés de la protéine
VP1 du virus foot-and-mouth disease (FMD). D’autres plateformes vaccinales
(CPMV, TMV) liées à un épitope ou à la protéine complète du virus FMD ont été
étudiées, mais leur stabilité et la réponse immune générée ne permettait pas une
protection complète des animaux infectés (Wigdorovitz, Pérez Filgueira et al. 1999;
Wu, Jiang et al. 2003). Par contre, l’administration de ce vaccin chez les porcs a
26
permis la production d’anticorps neutralisants et la stimulation de lymphocytes T
spécifiques à la séquence VP1 menant à la protection complète des animaux suite à
une infection avec le virus foot-and-mouth disease (Yang, Liao et al. 2007).
La protéine de capside du virus X de la pomme de terre (PVX) a été utilisée
par plusieurs groupes de recherche et a permis la stimulation d’une réponse
immunitaire in vivo contre plusieurs micro-organismes différents. Ainsi, un épitope
de la nucléoprotéine du virus Influenza a été fusionné sur la CP du PVX et les
particules virales chimériques ont été produites chez la plante. Des souris C57BL/6J
ont été immunisées et la réponse cellulaire contre le peptide de fusion a été évaluée
par ELISPOT. Cette expérience démontre la capacité des particules virales
chimériques à induire la prolifération de cellules T CD8+ spécifiques à l’épitope
cellulaire sans l’ajout d’adjuvant. Donc, il est possible de produire chez la plante des
plateformes vaccinales suffisamment stables pour permettre l’induction d’une
immunité cellulaire in vivo (Lico, Mancini et al. 2009).
2.3.2 Réponse humorale induite par la PapMV CP
Une plateforme vaccinale innovatrice, composée de la fusion de l’épitope E2 du
virus de l’hépatite C en C-terminal de la protéine de capside du PapMV, a été
générée. Cette étude a permis de mettre en évidence l’importance de la
multimérisation de la plateforme vaccinale PapMV CP dans l’induction d’une
réponse immunitaire in vivo (Denis, Majeau et al. 2007). En effet, l’immunisation de
souris C3H/HeJ (insensible aux lipopolysaccharides) avec les protéines PapMVCP-
E2 sous forme de nanoparticules permet l’induction d’une réponse humorale de
longue durée (plus de 120 jours) alors qu’aucune réponse immunitaire contre la
plateforme vaccinale n’a été observée lors de l’injection des protéines monomériques
(Figure 12). Cette étude révèle que la qualité de la réponse immunitaire observée in
vivo n’était pas causée par une contamination en lipopolysaccharides des protéines
recombinantes purifiées des bactéries. Le profil de la production d’anticorps (IgG1,
27
IgG2a, IgG2b, IgG3) observé suggère que la PapMV CP induit une réponse
immunitaire balancée, c’est-à-dire tant TH1 que TH2.
Figure 12. Réponse humorale induite par les nanoparticules PapMV CP.
Visualisation de la réponse humorale induite lors de l’immunisation de souris avec
les protéines PapMVCP-E2 et PapMVCP27-215-E2 selon une cinétique des titres
d’anticorps spécifiques produits. (A) Réponse anticorps d’isotype IgG contre la CP.
(B) Réponse anticorps d’isotype IgG contre l’épitope E2. (C) Réponse anticorps
dirigée contre la protéine pIII du CaMV. (D) Différents isotypes induits contre
l’épitope E2. (Denis, Majeau et al. 2007).
28
Avec l’émergence de virus Influenza de plus en plus virulents et les risques de
pandémie qui en découle, le développement d’un vaccin universel est d’une grande
importance. De ce fait, l’épitope universel M2e du virus Influenza a été fusionné en
C-terminal de la PapMV CP. L’immunisation de souris avec les protéines PapMVCP-
M2e sous forme de nanoparticules mène à la production d’anticorps anti-M2e ayant
la capacité de reconnaître les cellules infectées par le virus Influenza (Figure 13).
Suite à une infection avec le virus Influenza A/WSN/33, les souris immunisées au
préalable avec les protéines PapMVCP-M2e sous forme de nanoparticules ont un
meilleur taux de survie que les particules ne portant pas l’épitope universel M2e à
leur surface. Par ailleurs, les protéines PapMVCP-M2e sous forme de disques sont,
comparativement aux nanoparticules, très peu immunogéniques ce qui prouve une
seconde fois l’importance de la multimérisation de la PapMV CP dans l’induction
d’une réponse humorale productive (Denis, Acosta-Ramirez et al. 2008).
29
Figure 13. Importance de la multimérisation des protéines PapMV CP dans
l’induction d’une réponse humorale protectrice au niveau de la réponse anticorps (A)
et de la survie suite à un infection (B,C) (Denis, Acosta-Ramirez et al. 2008).
2.3.3 Réponse cellulaire induite par la PapMV CP
Une plateforme vaccinale versatile se doit d’activer les deux bras du système
immunitaire, soit la réponse humorale et la réponse cytotoxique. La section
précédente a mis en évidence l’efficacité de la plateforme vaccinale du PapMV à
induire une réponse humorale efficace par la production d’anticorps de haute affinité
(IgG2a) spécifique à un peptide en fusion avec la plateforme. Les antigènes exogènes
utilisés en vaccination mènent rarement à l’activation d’une réponse CTL efficace
puisqu’ils n’ont pas la capacité de présenter leurs épitopes aux CMH-I qui sont
utilisés principalement pour les protéines endogènes. Dans certains cas, les antigènes
exogènes peuvent être présentés par les complexes majeurs d’histocompatibilité de
30
classe I par la voie de la présentation croisée. La taille des virus de plantes, se situant
entre 50 et 500nm de longueur, est optimale pour l’activation de la présentation
croisée par les CPAs (Fifis, Gamvrellis et al. 2004; Gonzalez, Plummer et al. 2009).
Les pseudo-particules formées par l’auto-assemblage de la PapMV CP permettent la
présentation des épitopes fusionnés en C-terminal de la protéine aux cellules portant
les CMH-I par ce processus de présentation-croisée. En effet, deux protéines
recombinantes différentes ont été générées ; l’une porte à sa surface un épitope HLA-
A*0201 de la protéine gp100 (antigène tumorale) alors que la seconde possède un
épitope HLA-A*0201 de la protéine M1 du virus Influenza. Lorsque des cellules
présentatrices d’antigènes positives pour l’allèle HLA-A*0201 sont traitées avec
l’une ou l’autre des nanoparticules recombinantes, les lymphocytes T CD8+
spécifiques aux épitopes de fusion sont hautement réactifs à ces cellules immunes
(Figure 14). Ces expériences in vitro démontrent la capacité des nanoparticules du
PapMV à présenter et charger les épitopes d’intérêt sur les CMH-I. De plus,
l’utilisation de deux différents inhibiteurs du protéasome lors des expériences in vitro
démontre que la présentation antigénique induite par les nanoparticules du PapMV se
fait indépendamment du protéasome (Leclerc, Beauseigle et al. 2007).
31
Figure 14. Réponse cellulaire induite in vitro par les nanoparticules PapMV CP.
Activation de lymphocytes T CD8+ spécifiques suite aux chargements des cellules
présentatrices d’antigènes par les protéines PapMV FLU (A) et PapMV gp100 (B)
démontrant la capacité des pseudo-particules à présenter des épitopes aux CMH-I
par la voie de la présentation croisée (Leclerc, Beauseigle et al. 2007).
En plus des analyses in vitro, des souris C57BL/6 ont été immunisées avec des
protéines portant la fusion d’un épitope de la protéine p33 du virus de la
chorioméningite lymphocytaire (LCMV) en C-terminal de la CP du PapMV. En
absence d’adjuvant, la vaccination avec les nanoparticules PapMV-p33 a permis la
maturation des cellules dendritiques et le développement de lymphocytes T CD8+
spécifiques à l’épitope p33 qui se sont rapidement activés suite à l’infection avec le
virus LCMV (Figure 15). La force et la rapidité de l’activation de cette réponse
cellulaire a permis la protection des souris de façon dose-dépendante avec seulement
un épitope CTL (Figure 16) (Lacasse, Denis et al. 2008).
32
Figure 15. Réponse cellulaire induite in vivo par les nanoparticules.
Expansion de lymphocytes T CD8+ effecteurs suite à l’infection de souris immunisées
avec les protéines PapMV-p33 démontré par la production d’IFN-γ (B) et par la
fonction cytolytique de ces cellules (C) (Lacasse, Denis et al. 2008).
Figure 16. Induction d’une immunité protectrice par les protéines PapMV-p33
(Lacasse, Denis et al. 2008).
33
3. Hypothèses et objectifs
Ce projet a pour but d’optimiser la capacité des nanoparticules
recombinantes du PapMV fusionnées à un épitope cellulaire à induire une
réponse cellulaire.
a) Le premier objectif de ce travail est de tester 3 sites de fusion, soit les
positions 12, 187 et C-terminale, sur la CP du PapMV avec un épitope de 19
acides aminés emprunté de la protéine NP du virus de la grippe (NP147-155 :
NLNDA TYQRTRALV RTGMD) et vérifier la capacité de chacune de ces
protéines recombinantes à former des nanoparticules.
b) Le second objectif visé est de vérifier l’importance de la multimérisation en
nanoparticules dans l’induction d’une réponse cellulaire en souris Balb/c en
comparant l’efficacité des disques (environ 20 sous-unités) à celles des
nanoparticules qui font environ 100nm et qui comportent plus de 300 sous-
unités.
c) Le troisième objectif de ce projet est de déterminer l’effet de la fusion de plus
d’un épitope cellulaire à la fois sur la nanoparticule dans le but de bonifier la
réponse cellulaire.
d) Le dernier objectif est de vérifier la capacité de la réponse cellulaire induite à
générer une protection en souris Balb/c suite à une infection avec le virus
influenza murin A/WSN/33.
34
4. Matériel et méthodes
La composition des tampons, des milieux de culture et des réactifs pour les gels
est présenté à l’Annexe 2.
4.1 Clonage
Les différentes constructions portant la fusion de l’épitope cellulaire NP147-155 au
sein de la PapMV CP ont été clonées dans le vecteur d’expression pET-3d à partir du
gène du mutant de délétion CP6-215 effectué précédemment par Nathalie Majeau. Une
alanine en position 2 a été ajoutée lors du clonage par l’utilisation du site de
restriction NcoI codant pour la méthionine initiale suivi d’une alanine. De plus, une
queue de six histidines a été ajoutée en C-terminale de la protéine afin de faciliter sa
purification (Figure 17). La carte du vecteur d’expression pET-3d a été placée à
l’Annexe 3. Les oligonucléotides utilisés pour introduire les épitopes cellulaires au
sein du gène de la protéine de capside ont été synthétisés par la compagnie Integrated
DNA Technologies, Inc (Tableau 2).
L’alanine additionnelle ajoutée par Nathalie Majeau est indiquée en rouge. La queue
de six histidines en C-terminal de la protéine est indiquée en bleu. Les acides aminés
correspondant aux sites de restriction SpeI et MluI, ajouté pour faciliter le clonage
en C-terminal, sont indiqué en vert.
MASTPN IAFPAITQEQ MSSIKVDPTS NLLPSQEQLK SVSTLMVAAK VPAASVTTVA
LELVNFCYDN GSSAYTTVTG PSSIPEISLA QLASIVKASG TSLRKFCRYF APIIWNLRTD
KMAPANWEAS GYKPSAKFAA FDFFDGVENP AAMQPPSGLT RSPTQEERIA NATNKQVHLF
QAAAQDNNFA SNSAFITKGQ ISGSTPTIQF LPPPETSTTR HHHHHH
Figure 17. Séquence en acides aminés de la CP6-215 modifié pour contenir les sites de
restrictions SpeI et MluI.
35
4.1.1 Réactions de polymérases en chaînes (PCR)
L’obtention de l’ensemble des mutants a été réalisée par l’utilisation de
l’enzyme Long Template DNA polymerase (Roche, catalogue # 1759060) lors de la
PCR. La PCR a été réalisée selon les directives de la compagnie. La stratégie utilisée
pour la conception des oligonucléotides (oligos) est le principe de l’insertion de
nucléotides par cercle roulant. Les paires d'amorces contiennent un même site de
restriction avec des séquences de part et d'autre de ce site afin d'amplifier le vecteur
en entier (pour le détail des oligos voir le Tableau 2). Le produit de la PCR comprend
donc le gène de la PapMV CP portant l’épitope cellulaire de 19 acides aminés à la
position désirée ainsi que la totalité du vecteur pET-3d. La longueur du produit
d’amplification a été vérifiée par migration sur gel d’agarose 0,8% et comparée à une
échelle d’ADN (New England Biolabs, catalogue # N3232, N3231). Lorsque la
longueur de l’amplicon correspondait à ~ 5,2 kb, l’ADN a été purifiée à l’aide du kit
de purification des produits PCR (QIAgene, catalogue # 28106). Les extrémités du
produit PCR ont été digérées à l’aide de l’enzyme de restriction requise. Une fois la
réaction complétée, l’enzyme de restriction a été inactivée selon les directives du
fabricant. Afin d’éliminer l’enzyme de restriction inactivée ainsi que les nucléotides
digérés, une précipitation à l’éthanol a été réalisée sur les produits PCR digérés. C’est
la T4 DNA ligase (New England Biolabs, catalogue # M0202) qui a été utilisée pour
circulariser les plasmides.
36
F AGCTCGTACGCGTGCGCTGGTTCGTACCGGTATGGACTTCCCCGCCATCACCCAGGAAC
R TCGACGTACGCTGGTAGGTCGCGTCGTTCAGGTTGGCTATGTTGGGTGTGGATGCC
F AGCTCGTACGCGTGCGCTGGTTCGTACCGGTATGGACAACAACTTTGCCAGCAACTCCGCC
R TCGACGTACGCTGGTAGGTCGCGTCGTTCAGGTTGTCCTGTGCCGCGGCTTGGAAGAG
F ACGTCGTACGCGTGCGCTGGTTCGTACCGGTATGGACACGCGTCACCATCACCATCAC
R TCGACGTACGCTGGTAGGTCGCGTCGTTCAGGTTACTAGTTTCGGGGGG
FAGCTATTTAAATGACGCGACCTACCAGCGTACCCGTGCGCTGGTTCGTACCGGTATGGACAAC
AACTTTGCCAGCAACTCCGCC
R TCGAATTTAAATTGTCCTGTGCCGCGGCTTGGAAGAG
F AGCTGGGCCCTGGTTCGGACCGGTATGGACACGCGTCACCATCACCATCACCATTAG
R TCGAGGGCCCGGGTACGCTGGTAGGTCGCGTCGTTCAGGTTACTAGTTTCGGGGGG
FAGCTCGTACGCGTGCGCTGGTTCGTACCGGTATGGACAACCTGAACGACGCGACCTACCAGCG
CACGCGTGCGCTGGTTCGTACCGGTATGGACTTCCCCGCCATCACCCAGGAAC
RTCGACGTACGCTGGTAGGTCGCGTCGTTCAGGTTGTCCATACCGGTACGAACCAGCGCACGCG
TGCGCTGGTAGGTCGCGTCGTTCAGGTTGGCTATGTTGGGTGTGGATGCC
FACGTCGTACGCGTGCGCTGGTTCGTACCGGTATGGACAACCTGAACGACGCGACCTACCAGCG
CACGCGTGCGCTGGTTCGTACCGGTATGGACACGCGTCACCATCACCATCACCATTAG
RTCGACGTACGCTGGTAGGTCGCGTCGTTCAGGTTGTCCATACCGGTACGAACCAGCGCACGCG
TGCGCTGGTAGGTCGCGTCGTTCAGGTTACTAGTTTCGGGGGG
3NP-C
NP-12
NP-187
NP-C
Ajout NP-187
Ajout NP-C
3NP-12
Tableau 2. Amorces utilisées pour fusionner l’épitope CTL sur la PapMV CP.
L’ensemble des amorces sont présentées dans le sens 5’ vers 3’. Les oligonucléotides
NP-12, NP-187 et NP-C ont été utilisés pour générer les mutants PapMV NP-12,
PapMV NP-187 et PapMV NP-C. Les amorces Ajout NP-187 et Ajout NP-C ont été
utilisés pour créer les mutants doubles et le mutant triple à partir de l’ADN
recombinant PapMV NP-12 et PapMV NP-12-187. Les oligonucléotides 3NP-12 et
3NP-C ont permis l’obtention des clones PapMV 3NP-12 et PapMV 3NP-C.
F=Forward R=Reverse
4.1.2 Criblage des mutants
À partir des colonies obtenues suite à la transformation des bactéries
compétentes E. Coli DH5-, l’extraction et la purification de l’ADN des clones sont
faites en utilisant le kit « QIAprep Spin Miniprep Kit » (QIAgen, catalogue # 27106).
L’ADN purifié de chacun des clones est envoyé au service de séquençage du centre
de recherche du CHUL afin d’être séquencé à l’aide d’une amorce complémentaire au
promoteur T7 situé en amont du site de clonage multiple du vecteur d’expression
pET-3d.
37
4.2 Production des protéines recombinantes dans E. coli
4.2.1 Induction de la production de protéines
Une pré-culture contenant 20 ml de milieu de culture 2xYT et 20 l d’ampicilline
(50 mg/ml) est inoculée avec 10 colonies provenant de la transformation de bactéries
compétentes E. Coli Bl21 (DE3) RIL. La pré-culture est incubée à 37C avec
agitation (250 RPM) pendant 4 heures. Ensuite, une culture contenant 500 ml de
milieu de culture 2xYT et 500 l d’ampicilline (50 mg/ml) est inoculée avec un
volume de pré-culture déterminé par la formule 1000/D.O600 nm. La culture est
incubée à 37C avec agitation (250 RPM) jusqu’à ce que la densité optique à 600 nm
soit d’environ 0,6. À ce moment, un volume de 500 l de la culture est prélevé avant
de l’induire avec 500 l (1 mM) d’isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) et
250 l d’ampicilline (50 mg/ml). La culture est incubée à 22C avec agitation (250
RPM) pendant 16 heures. Un volume de 500 l de la culture est prélevé à la suite de
l’induction.
4.2.2 Lyse bactérienne
La culture est centrifugée pendant 15 minutes à 8000 RPM (4C) et le culot
obtenu est resuspendu avec 20 ml de tampon de lyse froid (voir Annexe 2). Par la
suite, 40 l de PMSF 20 mM (40 M) sont ajoutés à la suspension bactérienne puis
celle-ci est congelée à -80C pour un minimum de 16 heures. Le culot est dégelé dans
un bain d’eau glacée et 135 l de cocktail inhibiteur de protéases 25X (Roche) est
ajouté à la suspension. Les bactéries sont alors lysées à l’aide de la Presse de French à
une pression de 750 PSIG. Un traitement à la DNAse est réalisé par l’ajout de 900 l
de DNASE 10 000 U/ml (Sigma, catalogue # D5025) et 1,5 ml de MgCl2 1M filtré.
La réaction est soumise à une agitation à température pièce pendant 15 minutes. Une
centrifugation à 13 000 RPM pendant 45 minutes à 4C est effectuée afin d’éliminer
38
les débris membranaires. Une deuxième centrifugation à 13 000 RPM pendant 20
minutes à 4C est également réalisée. Finalement, 6 ml de billes Ni-NTA (QIAgen,
catalogue # 30230) sont lavées à deux reprises avec 35 ml de tampon de lyse froid.
Les billes de nickel sont centrifugées à 1500 RPM pendant 2 minutes puis le
surnageant de centrifugation contenant les protéines y est ajouté pour une période de
16 heures à 4C sous agitation. De cette façon, les protéines possédant une queue
d’histidine vont pouvoir se lier aux billes de nickel pour ensuite être purifiées.
4.2.3 Purification des protéines d’intérêt
Les billes de nickel qui ont incubé avec le surnageant de lyse sont centrifugées
puis lavées avec 30 ml de tampon phosphate contenant des quantités croissantes
d’imidazole (Annexe 2, tampon de lavage 1 et 2). Les billes sont ensuite déposées
sur une colonne de polypropylène (Econo-Pac Columns de Bio-Rad laboratories) et
sont lavées à deux reprises avec 5 ml de tampon de lavage 2. Par la suite, les billes
sont lavées avec 15 ml de tampon de lavage contenant 0,5% de Triton 100X et à deux
reprises avec 20 ml de tampon de lavage 4 pour éliminer le détergent (Annexe 2).
Afin d’éliminer les lipopolysaccharides, les protéines liées aux billes sont incubées
pendant 30 minutes avec 5 ml de tampon de lavage 5 (10mM Tris-HCl et 1%
Zwittergent, pH 8.0) à 3 reprises. Pour éliminer le Zwittergent, les billes sont lavées,
2 fois, avec 20 ml de tampon de lavage 4. Afin d’éluer les protéines d’intérêt, celles-
ci sont incubées pendant 16 heures avec 5 ml de tampon d’élution fraîchement filtré
puis les protéines sont récupérées par gravité. Afin de recueillir le maximum de
protéines, 2,5 ml de tampon d’élution est ajouté à la colonne et les protéines sont
récoltées dans l’heure suivante. Les protéines sont immédiatement dialysées pendant
2 heures contre 1L de tampon 10mM Tris-HCl pH 8.0 froid à 2 reprises puis 16
heures dans le même tampon afin d’éliminer l’imidazole. Cette étape favorise
également l’assemblage des protéines en nanoparticules.
39
4.2.4 Électrophorèse des protéines
L’induction et l’efficacité de la purification des protéines sont vérifiées sur gel
de protéines tris-tricine SDS-Page 10% coloré à l’aide du GelCode Blue Stain
Reagent (Pierce 24590). Un marqueur de poids moléculaire, le Prestained protein
marker (NEB P7702S), est utilisé afin d’estimer le poids moléculaire des protéines
purifiées.
4.2.5 Ultracentrifugation
Afin d’isoler la population de protéines assemblées sous forme de disques de
20 sous-unités de la protéine de capside du PapMV de celles assemblées sous forme
de nanoparticules une ultracentrifugation est requise. Ainsi, les protéines dialysées
sont ultracentrifugées à 35 100 RPM pendant 45 minutes dans un rotor Beckman
NVT65. Le surnageant contenant les disques et les formes de faibles poids
moléculaires (< 450kDa) est prélevé, filtré à 0.45 µm et conservé à 4°C. Le culot
d’ultracentrifugation contenant les particules virales est resuspendu dans 1ml de
tampon PBX 1X (Sigma, LPS free), filtré à 0.45 µm et conservé à 4°C.
4.2.6 Chimie analytique et microscopie électronique
Les protéines récoltées sont analysées afin de déterminer leur concentration
approximative, le niveau de contamination par les LPS, leur taille et leur
morphologie. Tout d’abord, la concentration en protéines est évaluée par BCA et la
contamination en lipopolysaccharides est déterminée par le test Limulus Amebocyte
Lysate. Par ailleurs, la morphologie des particules est évaluée grâce au microscope
électronique à transmission (JEOL-1010). Les protéines purifiées sont diluées à une
concentration de 0,02 mg/ml et 10 µl de la suspension protéique est colorée avec 10
µl d’uranyle acétate 3% (w/v) pendant 7 minutes. Ensuite, 8 µl de cette préparation
est ajouté sur des grilles de microscopie 400 mesh de formvar, recouvertes d’une
couche de carbone (Canemco) pendant 5 minutes. Les grilles sont séchées pendant un
40
minimum de 2 heures dans un dessiccateur avant d’être observée au microscope
électronique (JEOL) avec un voltage d’accélération de 80kV en utilisant un
grossissement de 100 000 X. Les images sont prises par une caméra Bioscan de
Gatan (Warrendale, PA, USA) et analysées avec le logiciel d’acquisition de Gatan.
D’un autre côté, afin de déterminer la taille des pseudo-virions et l’homogénéité de la
population, les protéines sont analysées avec le Dynamic Light Scattering (DLS). Les
nanoparticules et les disques sont dilués à une concentration de 0,250 mg/ml dans du
PBS 1X ou du Tris-HCl 10mM selon le cas et la mesure de la taille des particules est
effectuée avec un Zetasizer Nano ZS (Malvern, Worcestershire, UK). La distribution
de la taille des particules est évaluée selon des mesures d’intensité.
4.3 Analyse in vivo
Les expérimentations effectuées en souris ont été réalisées à l’animalerie du
Centre de recherche du CHUL selon les normes établies par l’établissement.
L’ensemble des manipulations a été effectuées sur des femelles de sous-type Balb/C
âgées entre 6 et 8 semaines (Charles River, Wilmington, MA).
4.3.1 Immunisation
Pour chacun des protocoles, les souris Balb/C sont immunisées à 3 reprises (à
2 semaines d’intervalle) par la voie d’administration intrapéritonéale avec 200 µl,
selon les groupes, des protéines PapMV CP sans épitope cellulaire (contrôle négatif),
des protéines PapMV CP portant la fusion de l’épitope cellulaire NP147-155 (NLNDA
TYQRTRALV RTGMD) en position 12, 187 et en C-terminal de la séquence de la
protéine et des particules PapMV CP portant plus d’un épitopes fusionnés sur la
même protéine de capside . De plus, des protéines sous forme de disques ainsi que
celles sous forme de pseudo-virions sont utilisées afin de vérifier la réponse induite
par ces deux types de particules. Afin de déterminer le niveau d’anticorps généré
suite à la vaccination, un prélèvement sanguin par la veine submandibulaire est
réalisé avant chaque immunisation et deux semaines après la dernière dose.
41
4.3.2 Extraction des splénocytes
Afin d’évaluer la réponse cellulaire générée contre le peptide de fusion NP147-
155, les rates des souris immunisées sont prélevées deux semaines après le dernier
traitement et plongées dans du milieu de culture RPMI-1640 complet. Par la suite, les
rates sont broyées et le broyat cellulaire est passé à travers un tamis cellulaire de 100
µm. Les globules rouges sont alors lysés par l’utilisation d’un tampon de lyse et la
suspension cellulaire est lavée à deux reprises avec du PBS 1X stérile. Les cellules
sont resuspendues dans 2 ml de milieu de culture RPMI-1640 complet et le décompte
cellulaire, à l’aide d’un hématimètre, est effectué pour chacune des rates. Les cellules
sont alors diluées à une concentration de 2 500 000 cellules/ml.
4.3.3 ELISPOT
Pour comparer l’efficacité de chacune des protéines à induire une réponse
cellulaire efficace en souris Balb/C, les cellules provenant de la rate de chacune des
souris sont analysées par ELISPOT. Tout d’abord, le jour précédent le prélèvement
des rates, des plaques PVDF (High Protein Binding Immobilon-P membrane,
Millipore, Bedford, MA) traitées avec de l'éthanol 35% sont tapissées avec un
anticorps anti-IFN-γ (anticorps de capture) dilué dans du PBS à raison de 100 µl par
puits. Ces plaques sont incubées à 4°C pendant 16 heures selon les recommandations
du fabricant (Abcam, Cambridge, MA, USA). Les plaques sont ensuite bloquées avec
du PBS contenant du lait écrémé pendant 2 heures à température pièce. Les cellules
sont ajoutées aux plaques à raison de 250 000 cellules par puits et stimulées avec 100
µl des différents stimulants (de la Concanavaline A comme contrôle positif, du milieu
de culture RPMI-1640 complet comme contrôle négatif et le peptide NP147-155). Les
plaques sont incubées pendant 18 heures dans un incubateur à 37°C avec un apport en
CO2 pour que les précurseurs des lymphocytes T spécifiques au peptide de fusion
sécrètent l’IFN-γ. Ensuite, l’anticorps de détection est ajouté et peut ainsi se lier à
l’antigène. Un enzyme, la streptavidine-alkaline phosphatase, est ajouté et va
permettre la visualisation de « spots » lors de l’ajout du substrat BCIP/NBT qui va
42
convertir l’enzyme en une couleur visible au binoculaire. La fréquence des
précurseurs des lymphocytes T spécifiques est déterminée par la soustraction des
« spots » obtenus dans les puits stimulés avec le milieu de culture de ceux dénombrés
dans les puits contenant des cellules réactivées avec le peptide de fusion NP147-155.
4.3.4 Cytofluorométrie intracellulaire
L’ELISPOT permet de visualiser la sécrétion d’une cytokine à la fois et
indique la quantité de cellules spécifiques au peptide fusionné sur la plateforme
vaccinale. Par ailleurs, cette technique ne donne aucune évidence sur la qualité de la
réponse cellulaire induite par le vaccin à l’étude. Ainsi, la cytofluorométrie
intracellulaire est utilisée pour déterminer la qualité de la réponse cellulaire induite
lors de l’étude d’une plateforme vaccinale. Tout comme pour l’ELISPOT, les
splénocytes sont isolés de la rate des souris immunisées et 1 million de cellules par
condition est utilisé. Un pentamère H-2Kd contenant le peptide NP147-155 au niveau de
la niche peptidique de son CMH-I est ajouté aux cellules afin de pouvoir isoler les
lymphocytes T CD8+ spécifiques au peptide de fusion. Les cellules sont ensuite
réactivées avec les différents stimulateurs (la Concanavaline comme contrôle positif,
le milieu de culture comme contrôle négatif et le peptide NP147-155). De la brefeldin A
est ajoutée à chacun des tubes pour empêcher la sécrétion des différentes cytokines à
l’étude. Les cellules sont incubées à 37°C avec un apport en CO2 pendant 18 heures.
Un anticorps anti-CD8 est ajouté afin d’être en mesure de visualiser la population
totale de lymphocytes T CD8. Du paraformaldéhyde est ajouté pour fixer les cellules
et du tampon de perméabilisation permet aux différents anticorps contre les cytokines
IL-2, TNF-α et IFN-γ de pénétrer à l’intérieur de la paroi cellulaire. Les cellules sont
resuspendues dans une solution de fixation pour ensuite être analysées sur le FACS
Canto. Des billes de compensation sont utilisées pour compenser les chevauchements
entre les différents fluorochromes utilisés.
43
4.3.5 Infection avec le virus A/WSN/33
La souche de virus Influenza A utilisée lors de cette étude est le A/WSN/33
(H1N1) dérivé d’un isolat clinique de souris. La dose létale 50 (DL50) a été
déterminée au préalable lors d’une étude pilote et correspond à 250 pfu. Ainsi, les
souris immunisées précédemment avec les protéines PapMV CP contenant un épitope
NP, épitope dérivé de la nucléoprotéine du virus Influenza, sont infectées avec 250
pfu (50 µl) du virus A/WSN/33 par la voie intranasale. La perte de poids, les
symptômes et la mortalité sont notés pendant 14 jours et les souris ayant perdu plus
de 20% de leur masse corporelle initiale sont euthanasiées selon les normes du
CCPA.
4.3.6 Titration des anticorps par ELISA
Afin d’évaluer la réponse humorale générée contre la plateforme vaccinale, le
sérum des souris immunisées avec les différentes protéines est analysé par ELISA
contre la protéine PapMV CP. Les anticorps IgG totaux et de sous-type IgG2a sont
analysés et les résultats sont exprimés en titre d’anticorps selon que la densité optique
soit 3 fois plus élevée que le bruit de fond des sérums de souris naïves.
4.3.7 Titration des virus au niveau des poumons
Les souris immunisées précédemment avec les protéines PapMV CP contenant
l'épitope NP sont infectées avec 250 pfu (50 µl) du virus A/WSN/33 par la voie
intranasale. Les poumons sont prélevés cinq jours post-infection et sont
homogénéisés dans 1ml de tampon PBS-1% GVF. Les broyats pulmonaires sont
centrifugés à 1200 RPM pendant 5 minutes afin d’éliminer les résidus membranaires.
Les surnageants contenant les particules virales sont congelés à -80°C jusqu’à ce que
les cellules requises pour réaliser la titration virale soient prêtes. La titration virale du
virus Influenza A/WSN/33 s’effectue avec les cellules MDBK (Madin-Darby-
44
Bovine-Kidney). La concentration cellulaire est ajustée à 2x105 cellules/ml et 1,2 ml
de ces cellules sont ajoutés dans les puits d’une plaque de 12 puits. Les plaques sont
incubées à 37°C avec un apport en CO2 jusqu’à ce que les cellules forment une
monocouche (de 2 à 3 jours). Lorsque les plaques sont prêtes, les surnageants
contenant les particules virales sont dilués à une dilution de départ de 1/100 et dilués
en série par la suite. Les monocouches cellulaires sont lavées avec du PBS puis avec
du milieu de culture MEM 1X complet et le virus y est ajouté. Les plaques sont
incubées à 37°C avec un apport en CO2 pendant 1 heure puis un mélange de MEM
2X + agarose est ajouté pour recouvrir les puits (2 ml). Les plaques sont incubées à
37°C avec un apport en CO2 jusqu’à ce que la taille des plages de lyse soit optimale
(2-3 jours). Afin de tuer les cellules et les virus survivants, 1,5 ml de formaline 4%
est ajouté dans chacun des puits. La couche d’agarose est enlevée et les monocouches
cellulaires sont colorées avec du violet de cristal. Les plages de lyse sont comptées et
les titres viraux sont calculés selon la formule :
Facteur de dilution du virus X Qté de plages de lyse
Dilution de la plaque X Volume de virus
4.4 Analyse statistique
Les données sont analysées selon un test ANOVA paramétrique (ou non
paramétrique si la variance est significativement différente). Un post-test de Student
ou de Tukey est utilisé pour comparer les différences (titre d’anticorps, ELISPOT)
entre les groupes de souris. Les différences entre les courbes de survie sont analysées
selon un test de Kaplan-Meier. Des valeurs de *p<0,05, **p<0,01 et ***p<0,001 sont
considérées comme statistiquement différentes. Les analyses statistiques sont
effectuées sur le logiciel d’analyse GraphPad PRISM 5.01.
45
5. Résultats
Récemment, une étude bio-informatique a mis en évidence 7 sites de fusion,
autre que le C-terminal, situés dans des régions prédites en surface de la capside du
PapMV. Le peptide HA11 provenant de l’hémagglutinine du virus Influenza a alors
été fusionné à chacun de ces sites (Figure 18). Cette expérience a permis la
découverte de deux nouveaux sites de fusion, en position 12 et en position 187,
permettant la production et l’assemblage de particules sous forme de nanoparticules
(Rioux, Babin et al. 2012). Cette étude met en valeur la capacité de la plateforme
vaccinale PapMV CP à induire la production d’anticorps (réponse humorale)
spécifiques au peptide de fusion (Figure 19). Ce mémoire porte sur la capacité de ces
mêmes sites de fusion à induire une réponse cellulaire spécifique à un peptide
fusionné sur la plateforme vaccinale PapMV CP.
Figure 18. Séquence en acides aminés de la CP6-215 et prédiction de la structure
secondaire.
Les sites de fusion, prédis en bio-informatique pour être dans des régions non-
structurées ou des boucles, sont entre parenthèses. HA12 et HA187 sont les sites de
fusion qui permettent la formation de particules sous forme de nanoparticules (Rioux,
Babin et al. 2012).
46
Figure 19. Titre en anticorps anti-GST-HA11 et anti-PapMV.
Niveau d’anticorps IgG totaux et de sous-type IgG2a contre le peptide de fusion
HA11 et contre la plateforme vaccinale PapMV CP selon le site de fusion au niveau
du sérum des souris immunisées avec les différentes protéines (Rioux, Babin et al.
2012).
L’épitope cellulaire choisit pour évaluer la réponse cellulaire induite par la
plateforme vaccinale PapMV CP provient de la nucléoprotéine du virus Influenza.
L’épitope NP147-155 (NLNDA TYQRTRALV RTGMD) est hautement conservé à
travers les souches virales et est présenté au niveau des CMH-I des cellules d’allèles
H-2Kd ce qui est compatible avec l’utilisation de souris Balb/C. De plus, l'utilisation
de cet épitope dans un étude de vaccin à ADN a permis de démontrer la capacité de
cet épitope dans la stimulation d’une réponse cellulaire significative (Fu, Friedman et
al. 1997; Tao, Luo et al. 2009). L’épitope fusionné possède cinq acides aminés
flanquants de chaque côté afin de favoriser la présentation de l’antigène chez la
souris.
47
5.1 Insertion de l’épitope cellulaire NP147-155 au sein de la
PapMV CP
L’épitope CTL NP147-155 flanqué de cinq acides aminés de chaque côté a été
inséré aux sites de fusion 12 et 187, ainsi qu’en C-terminal à titre de contrôle (Figure
20). La figure 21 montre l’induction de chacune des 3 protéines recombinantes suite à
l’ajout d’IPTG ainsi que l’efficacité des étapes de purification sur la pureté des
protéines.
Figure 20. Insertion de l’épitope NP147-155 au niveau de la séquence peptidique de la
CP du PapMV.
NP = NLNDA TYQRTRALV RTGMD ; les séquences flanquantes sont en italique
alors que l’épitope cellulaire NP147-155 est représenté en gras.
Lors de la purification, les protéines PapMV CP se présentent sous trois
formes: monomériques, en disques (particules comprenant environ 20 unités) et sous
forme de nanoparticules de plusieurs centaines d'unités. Afin d’isoler les
nanoparticules des autres formes de la protéine, les isolats ont été ultracentrifugées à
35 100 RPM pendant 45 minutes. Les culots contenant les nanoparticules ont été
resuspendus dans un tampon PBS. La morphologie et la taille des particules ont été
évaluées en microscopie électronique (Figure 22) ainsi que par le Zetasizer Nano ZS
(Malvern, Worcestershire, UK). En résumé, cet appareil est muni de lasers qui
permettent la mesure de la taille des particules en suspension (Figure 23).
48
Un marqueur de poids moléculaire, le Prestained protein marker (NEB P7708S), est
utilisé afin d’estimer le poids moléculaire des protéines purifiées. 1. NP-12 avant
induction 2. NP-12 après induction 3. NP-12 purifiée 4. NP-187 avant induction 5.
NP-187 après induction 6. NP-187 purifiée 7. NP-C avant induction 8. NP-C après
induction 9. NP-C purifiée
Représentation des particules présentent dans le culot suite à l’ultracentrifugation.
Une image représentant les nanoparticules obtenues suite à la production de
protéines sans la fusion de l’épitope cellulaire a été ajoutée à titre de comparaison.
La barre d’échelle est de 200 nm. A) PapMV NP-12 B) PapMV NP-187 C) PapMV
NP-C D) PapMV CP.
Figure 21. Analyse de l’induction et de l’efficacité de la purification des protéines par
SDS-Page.
Figure 22. Microscopie électronique des culots d’ultracentrifugation.
49
Un échantillon de chacune des nanoparticules a été dilué à une concentration
finale de 0,02 mg/ml puis coloré avec de l’uranyle acétate 3% (w/v). Ces échantillons
ont été déposés sur des grilles de microscopie électronique et les grilles ont été
observées à un grossissement de 100 000 X. Comparativement à la morphologie des
nanoparticules sans peptide de fusion, celles portant l’épitope en position 12 et en C-
terminal de la protéine de capside sont relativement semblables alors que celles
portant l’épitope en position 187 de la protéine sont de très petite taille et n’ont pas
l’aspect longiligne et cristalline des particules contrôles (Figure 22). Ces échantillons
ont également été utilisés, à une concentration de 0,25 mg/ml, pour déterminer la
taille moyenne des particules par diffusion dynamique de lumière (DLS). Ainsi, la
longueur moyenne des nanoparticules PapMV NP-12, PapMV NP-187 et PapMV
NP-C est respectivement de 80 nm, 93 nm et 100 nm (courbes rouges Figure 23). Ces
résultats correspondent assez bien aux particules observées sur les images de
microscopie électronique. En effet, la largeur de la courbe obtenue pour les PapMV
NP-187 VLPs reflète la grande dispersion de l’échantillon, passant de particules de
10nm à 300nm, ce qui suggère que l’assemblage sous forme de nanoparticules est
plutôt difficile (Figure 23). Ainsi, la valeur de 93 nm ne correspond pas à ce qui est
observé en microscopie électronique (Figure 22) et ce phénomène peut possiblement
s'expliquer par la sensibilité des particules à la coloration avec l'uranyl acétate.
Par ailleurs, les disques n’étant pas bien définis à un grossissement de 100 000
X en microscopie électronique, les surnageants d’ultracentrifugation de chacune des
protéines recombinantes ont été analysés uniquement par la mesure de la taille des
particules par diffusion dynamique de la lumière. Théoriquement, un disque est
l’assemblage de 20 sous-unités de la protéine de capside du PapMV et, pour ce qui
est de la PapMV CP contrôle, est d’une longueur moyenne de 20 nm. Les courbes
vertes de la figure 23 démontrent la taille des disques obtenus suite à la production
des constructions PapMV NP-12, PapMV NP-187 et PapMV NP-C et sont
respectivement de 28 nm, 26 nm et 32 nm.
50
Graphiques de la mesure de la taille des particules suite au passage des protéines
recombinantes sur le Zetasizer Nano ZS (Malvern, Worcestershire, UK). La
distribution de la taille des particules est évaluée selon des mesures d’intensité. Les
courbes vertes représentent la moyenne de quatre valeurs obtenues lors du passage
des disques alors que les courbes rouges représentent la moyenne de quatre valeurs
obtenues lors du passage des particules sous forme de nanoparticules.
5.2 Induction d’une réponse cellulaire en souris Balb/C
Pour démontrer l’efficacité des particules, sous formes de nanoparticules et sous
forme de disques, à induire une réponse cellulaire productive contre le peptide de
fusion NP147-155, des souris Balb/C ont été immunisées à 3 reprises, à 14 jours
d’intervalle, avec 100 µg de chacune des protéines recombinantes par la voie
Figure 23. Graphiques de la mesure de la taille des particules mutantes.
51
intrapéritonéale. Ainsi, les rates ont été prélevées deux semaines après la dernière
immunisation et un ELISPOT contre l’IFN-γ a été réalisé sur les splénocytes totaux
réactivés avec le peptide de fusion. La figure 24 démontre l’efficacité de la réponse
induite par les différentes préparations vaccinales en termes de sécrétion d’IFN-γ par
les précurseurs de lymphocytes T spécifiques au peptide de fusion. Seules les
nanoparticules portant la fusion en position 12 ont généré une stimulation de la
sécrétion d’IFN-γ par les cellules de la rate significativement différente des protéines
ne portant pas l’épitope cellulaire à leur surface (PapMV CP). De plus, les résultats
obtenus avec les nanoparticules PapMV NP-12 sont significativement différents de
ceux obtenus pour l’ensemble des groupes ce qui suggère qu’il est préférable de
fusionner cet épitope CTL au N-terminus de la CP plutôt qu’au C-terminal. En ce qui
concerne les deux autres sites de fusion, une faible sécrétion de la cytokine, environ
20 « spots », a été détectée par ELISPOT tant pour les nanoparticules que pour les
disques. Toutefois, cette quantité n’est pas jugée significativement différente lors
d’une analyse ANOVA pour le C-terminal et est faiblement significative pour les
disques portant la fusion en position 187. En somme, la réponse obtenue avec les
particules de petites tailles est semblable pour chacun des sites de fusion puisqu’il n’y
a pas de différence significative entre chacun des groupes. Par ailleurs, une différence
majeure entre les protéines PapMV NP-12 sous forme de nanoparticules et celles sous
forme de disques est observée. Ces résultats témoignent de l’importance de la
multimérisation de la protéine de capside du PapMV dans l’induction d’une réponse
cellulaire productive. Cette expérience a été reproduite et des résultats similaires ont
été obtenus.
52
NP-1
2 V
NP-1
87 V
NP-C
V
Pap
MV C
P V
NP-1
2 D
NP-1
87 D
NP-C
D
Pap
MV C
P D
0
25
50
75
100 ***
*
Nb
re o
f S
po
ts /
250 0
00 c
ells
Figure 24. Réponse cellulaire contre l’épitope de fusion NP147-155.
Efficacité de la réponse cellulaire induite chez les souris Balb/C en fonction de la
position de l’épitope cellulaire NP147-155 au sein de la séquence peptidique de la
PapMV CP ainsi qu’en fonction de la multimérisation des particules.
V= VLPs ou nanoparticules, D= disques. Les *** signifient que NP-12 V est
significativement différent de chacun des groupes avec un niveau de confiance de
99% (*** = p<0,001). L’* signifie que NP-187 D est significativement différent de
PapMV CP D avec un niveau de confiance de 95% (*= p<0,05).
En plus des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques, les lymphocytes T auxiliaires
(TH) ont également un rôle à jouer dans l’établissement d’une réponse cellulaire
efficace. En effet, ce rôle s’explique par l’induction d’une réponse TH1 perçue par la
production d’anticorps de sous-type IgG2a par les plasmocytes. Ainsi, les titres en
anticorps IgG2a contre les protéines recombinantes ont été évalués afin de déterminer
si les cellules T auxiliaires ont un rôle à jouer dans la réponse cellulaire induite
(Figure 25).
53
NP-12 V NP-187 V NP-C V PapMV CP V-2
0
2
4
6
8
10
12
14
***
IgG
2a t
iters
Lo
g (
2x50)
Figure 25. Titre en anticorps de sous-type IgG2a.
Titre en anticorps de sous-type IgG2a (en Log (2 x 50)) contre la plateforme
vaccinale PapMV CP suite à 3 immunisations avec les différentes protéines
recombinantes sous forme de nanoparticules. V= VLPs ou nanoparticules. Les ***
signifient que le groupe NP-187 V est significativement différent de chacun des
groupes avec un niveau de confiance de 99% (*** = p<0,001) selon un ANOVA
paramétrique.
Ce résultat démontre que les particules PapMV NP-12 et PapMV NP-C
stimulent la sécrétion d’anticorps de sous-type IgG2a contre la plateforme vaccinale
de façon identique à la réponse obtenue avec les nanoparticules PapMV CP. Par
contre, le niveau d’anticorps produit par les protéines portant l’épitope cellulaire en
position 187 est extrêmement bas comparativement aux autres protéines. En effet, les
images de ces protéines en microscopie électronique (Figure 22, B) suggèrent que
l’assemblage de ces protéines de capside sous forme de nanoparticules est difficile.
Ainsi, la faible multimérisation des PapMV NP-187 CP engendre une faible
production d’anticorps de sous-type IgG2a. En effet, ces particules seraient moins
immunogéniques chez la souris ce qui les rendraient inaptes à stimuler le système
immunitaire. De plus, l’induction d’une réponse TH1 par les lymphocytes T
auxiliaires, mis en évidence par la production d’IgG2a, ne signifie pas
obligatoirement qu’il y aura stimulation d’une réponse cellulaire efficace en souris.
En effet, les nanoparticules PapMV NP-C ont induit la production d’une grande
54
quantité d’anticorps IgG2a contre la plateforme PapMV CP, mais n’ont pas permis
d’activer la production d’IFN-γ par les lymphocytes T CD8+.
5.3 Étude de la protection générée par les nanoparticules
PapMV NP
Des souris immunisées à 3 reprises avec les particules PapMV NP-12, PapMV
NP-187 et PapMV NP-C ont été infectées avec 250 pfu du virus A/WSN/33 (H1N1).
La nucléoprotéine de ce virus contient l’épitope NP fusionné à la surface de la
plateforme vaccinale. Ce résultat démontre que la présence d’un épitope NP147-155 à la
surface des pseudo-virions PapMV CP ne suffit pas à induire une réponse immune
permettant de conférer une protection contre une infection avec 250 pfu du virus
A/WSN/33. En effet, la figure 27, représentant la perte de poids des souris en
fonction du temps suite à leur infection avec le virus A/WSN/33, révèle que les
particules PapMV NP-12 ne permettent pas de minimiser la perte de poids des souris
malgré qu’elles stimulent la production d’IFN-γ en ELISPOT. Pour valider ce
résultat, des souris immunisées à 3 reprises avec les particules PapMV NP-12 et
PapMV CP ont été infectées avec 250 pfu du virus A/WSN/33 (H1N1) et, au jour 5
post-infection, les poumons des souris ont été prélevés afin de titrer les virus présents
au niveau pulmonaire. Malgré la réponse cellulaire induite par ELISPOT, il n’y a pas
de différence significative entre les souris immunisées avec les nanoparticules
recombinantes de celles ne portant pas la fusion de l’épitope cellulaire quant à la
concentration virale au niveau des poumons (Figure 28).
55
Pourcentage de la masse corporelle initiale des souris ayant survécues à un infection avec
250 pfu du virus Influenza A/WSN/33 (H1N1)
80%
85%
90%
95%
100%
105%
110%
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Jours suivant l'infection
Pert
e d
e p
oid
s s
elo
n l
a m
asse c
orp
ore
lle i
nit
iale
(%
) NP-12 VLPs
NP-187 VLPs
NP-C VLPs
PapMV CP VLPs
Figure 26. Graphique de la perte de poids des souris infectées avec le virus
A/WSN/33 (H1N1) selon leur masse corporelle initiale (en %) en fonction des jours
suivant l’infection.
Pap
MV N
P-1
2
Pap
MV C
P
0
100000
200000
300000
A/WSN/33
Co
ncen
trati
on
of
vir
us
in
th
e lu
ng
s (
pfu
/ml)
Figure 27. Concentration virale au niveau des poumons à la suite d'une infection
avec 250 pfu du virus A/WSN/33.
56
5.4 Création de mutants multiples et effet sur la réponse
cellulaire induite
Pour déterminer si l’addition de plus d’un épitopes NP147-155 à la fois sur une
même nanoparticule PapMV induit un effet synergique sur la réponse cellulaire
générée en souris, les protéines suivantes ont été produites : PapMV NP-12/187,
PapMV NP-12/C, PapMV NP-187/C, PapMV NP-12/187/C ainsi que PapMV 3NP-
12 et PapMV 3NP-C contenant 3 répétitions de la séquence NP en position 12 et C-
terminal respectivement (voir l’Annexe 4 pour la séquence de chaque mutants). La
figure 26 montre l’induction de chacune des protéines recombinantes suite à l’ajout
d’IPTG. Par ailleurs les protéines PapMV NP-12/187/C et 3NP-12 n’ont pas été
utilisées puisque le rendement de la production était extrêmement faible. De plus, la
production des particules composées de la PapMV NP-12/187 CP et de la PapMV
NP-12/C CP n’a pas permis l’obtention de nanoparticules puisque la totalité des
protéines purifiées étaient sous forme de disques. Ainsi, seules les constructions
PapMV NP-187/C et PapMV 3NP-C ont été en mesure de s’assembler de manière
productive suite à la production et à la dialyse des protéines (voir le Tableau 3 pour
un résumé de la taille des particules).
Nom de la protéine recombinante Taille moyenne (nm)
PapMV NP-12/187 37 nm
PapMV NP-12/C 21 nm
PapMV NP-187/C disques 40 nm
PapMV NP-187/C « VLPs » 60 nm
PapMV 3NP-C 145 nm
Tableau 3. Taille moyenne des mutants multiples obtenus par la mesure de la taille
des particules par diffraction de la lumière.
57
Figure 28. Analyse de l’induction des protéines multiples sur SDS-Page.
Un marqueur de poids moléculaire, le Prestained protein marker (NEB P7708S), est
utilisé afin d’estimer le poids moléculaire des protéines induites. 1. NP-12/187 avant
induction 2. NP-12/187 après induction 3. NP-12/C avant induction 4. NP-12/C
après induction 5. NP-187/C avant induction 6. NP-187/C après induction 7. NP-
12/187/C avant induction 8. NP-12/187/C après induction 9. 3NP-12 avant induction
10. 3NP-12 après induction 11. 3NP-C avant induction 12. 3NP-C après induction
Ainsi, 100 µg des mutants multiples ont été injectés, à 3 reprises, chez les souris
Balb/C et un ELISPOT contre l’IFN-γ a été réalisé sur les splénocytes réactivés avec
le peptide de fusion. Un contrôle de l’ELISPOT précédent (PapMV NP-12 VLPs) a
été ajouté afin de comparer les résultats entre eux. Ce résultat démontre qu’il n’y a
aucun bénéfice majeur à fusionner plus d’un épitope NP147-155 à la fois sur la
plateforme vaccinale PapMV CP. La figure 29 démontre que l’immunisation des
protéines recombinantes possédant à leur surface l’épitope cellulaire à deux positions
différentes, soit en position 187/C-terminal et en position 12/187, permet d’obtenir
une réponse significativement différente du contrôle. Par contre, cette réponse n’est
pas équivalente à celle obtenue avec les nanoparticules possédant une insertion au N-
terminal. Donc, l’ajout d’un second épitope sur la plateforme vaccinale ne permet pas
de compenser pour la faible multimérisation des particules lors de l’induction d’une
réponse cellulaire en souris Balb/C (Figure 30).
58
NP-1
87/C
V
3NP-C
V
Pap
MV C
P V
NP-1
2/18
7 D
NP-1
2/C D
NP-1
87/C
D
Pap
MV C
P D
NP-1
2 V
0
25
50
75
100
125
150
175 **
* *
Nb
re o
f S
po
ts /
250 0
00 c
ells
Figure 29. Réponse cellulaire contre l’épitope cellulaire NP147-155 suite à l’utilisation
des protéines mutantes multiples.
Efficacité de la réponse cellulaire induite chez les souris Balb/C, au niveau de la
rate, en fonction de la position de l’épitope cellulaire NP147-155 au sein de la séquence
peptidique de la PapMV CP ainsi qu’en fonction de la multimérisation des particules.
V= VLPs ou nanoparticules, D= disques. Les * signifient que NP-187/C V est
significativement différent de PapMV CP V et que NP-12/187 D est significativement
différent de PapMV CP D avec un niveau de confiance de 95%. Les ** signifient que
PapMV NP-12 V est significativement différent de PapMV CP V avec un niveau de
confiance de 99%.
59
6. Discussion
Malgré les nombreux succès obtenus en vaccination, les vaccins actuels
n’offrent généralement qu’une protection partielle. En effet, le cas du vaccin contre le
virus de la grippe illustre bien ce point puisque son efficacité chez les personnes de
plus de 65 ans se situe entre 30 et 40% (Strassburg, Greenland et al. 1986). La faible
immunogénicité des vaccins actuels repose principalement sur leur incapacité à
induire une réponse cellulaire contre des épitopes conservés. En effet, le principe des
vaccins actuellement sur le marché est d’induire la production d’anticorps
neutralisants ce qui permet de prévenir l’infection des cellules hôtes. Ce type de
réponse immunitaire n’est pas suffisante pour combattre les infections chroniques
(O’Connell, Bailey et al. 2009). Les vaccins présentement en développement sont
généralement composés d’antigènes recombinants hautement purifiés ce qui les rend
peu immunogéniques. Le développement de plateformes vaccinales plus
immunogéniques est une préoccupation importante dans la mise en place de vaccins
innovateurs.
L’utilisation des pseudo-virions (VLPs) dans le domaine de la vaccination est
une avenue de plus en plus prometteuse. Jusqu’à ce jour, des vaccins composés de
VLPs ont été utilisés pour contrer le virus du papillome humain et le virus de
l’hépatite B (Fagan, Tolley et al. 1987; Harper, Franco et al. 2004). Cette approche a
également connu des succès dans la vaccination contre le virus Influenza
(MEDICAGO, NOVAVAX) (Pushko, Tumpey et al. 2007). L’utilisation des virus de
plantes en vaccination est une option à considérer puisque la production de leur
protéine de capside dans les bactéries ou les plantes mène à la formation de particules
de structure cristalline et hautement répétitive qui sont reconnues par le système
immunitaire comme un PAMP (Denis, Acosta-Ramirez et al. 2008; Savard, Guérin et
al. 2011). Plusieurs virus de plante, tel que le TMV, le CPMV le AIMV et le PapMV,
permettent l’induction d’une réponse humorale contre un peptide fusionné
directement à leur surface (Yusibov, Kumar et al. 1996; Liu, Cañizares et al. 2005;
60
Denis, Majeau et al. 2007; Smith, Fitzmaurice et al. 2009). Les pseudo-virions
provenant des virus de plante sous forme de bâtonnets flexibles, tel que le PapMV et
le PVX, ont la capacité d’induire une réponse cellulaire contre un peptide de fusion
(McCormick, Corbo et al. 2006; Leclerc, Beauseigle et al. 2007; Lacasse, Denis et al.
2008; Lico, Mancini et al. 2009). La vaccination avec ces particules recombinantes
permet d’augmenter la quantité de lymphocytes T CD8+ spécifiques à l’épitope
cellulaire ce qui permet de contrôler l’infection.
Ainsi, les nanoparticules du PapMV tolère la fusion d’épitopes en C-terminal
de la protéine de capside et permettent l’induction d’une réponse humorale et
cellulaire contre ces épitopes (Denis, Acosta-Ramirez et al. 2008; Lacasse, Denis et
al. 2008). Suite à une analyse bio-informatique et à des expériences de mutagénèse,
des sites de fusion alternatifs (en position 12 et 187) ont été analysés par l’insertion
de l’épitope HA11 (Tremblay, Majeau et al. 2006; Laliberté Gagné, Lecours et al.
2008). Puisque la phénylalanine en position 13, de par la création d’une interaction
hydrophobique, est nécessaire pour assurer un assemblage productif de la protéine de
capside, l’épitope est inséré avant cet acide aminé pour ne pas empêcher la liaison des
monomères entre eux (Laliberté Gagné, Lecours et al. 2008). La réponse immunitaire
induite suite à l’immunisation des nanoparticules portant l’épitope HA11 aux sites de
fusion alternatifs (Figure 19) a permis de valider le potentiel de fusionner les épitopes
d’intérêt au N-terminus plutôt qu’au C-terminus (Rioux et al. Soumis pour
publication). Cet article démontre l’instabilité des particules lorsque l’épitope HA11
est inséré en C-terminal de la CP. Ainsi, ces résultats suggèrent que le choix du site
de fusion serait épitope dépendant. En effet, selon la longueur et la charge de la
séquence d’intérêt, la thermostabilité des nanoparticules semble être affectée lorsque
la fusion est faite en C-terminal de la CP.
Pour bonifier la réponse cellulaire générée par les nanoparticules PapMV CP,
l’épitope cellulaire NP147-155 a été inséré dans les sites de fusion alternatifs employés
lors des expériences précédentes. Suite à l’immunisation de souris Balb/C avec ces
protéines, la quantité de précurseurs de lymphocytes T CD8+ sécrétant de l’IFN-γ
61
suggère que la présentation de l’épitope cellulaire par les cellules présentatrices
d’antigènes est plus optimale lorsque le peptide d’intérêt se situe au N-terminal plutôt
qu’au C-terminal (Figure 24). Une analyse bio-informatique suggère que le C-
terminal de la protéine de capside du PapMV possède un motif TRIF. Ce motif est un
composant de la voie de signalisation par les TLRs (TLR3). Ainsi, l’insertion d’un
épitope en C-terminal de la CP modifie le motif TRIF ce qui a pu diminuer
l’immunogénicité des nanoparticules et empêcher la prolifération de précurseurs de
lymphocytes T CD8+ spécifiques. D’un autre côté, la différence observée entre le N-
terminus et le C-terminus dans la stimulation d’une réponse cellulaire repose
probablement sur la présentation de l’épitope par les cellules présentatrices
d’antigènes. En effet, il est peut-être plus facile d’exciser l’épitope cellulaire NP à
partir de la position 12. De plus, ces expériences in vivo ont permis de mettre en
évidence l’importance de la multimérisation des particules dans l’induction d’une
réponse cellulaire significative. En effet, l’assemblage de la PapMV NP-12 CP
recombinante sous forme de nanoparticules permet l’induction d’une réponse
cellulaire significativement différente du contrôle sans fusion alors que les particules
sous forme de disques ne stimulent pas cette voie du système immunitaire.
L’incapacité de la construction PapMV NP-187 à former des nanoparticules et
l’absence de réponse cellulaire induite par ces particules suggèrent également que la
multimérisation sous forme de nanoparticules est un critère essentiel.
Par contre, la quantité de lymphocytes T CD8+ activés ne permet pas de
protéger les souris contre une infection avec le virus Influenza A/WSN/33.
L’utilisation de l’épitope cellulaire NP147-155 a permis de valider la possibilité
d’utiliser ce site de fusion pour stimuler la réponse cytotoxique. Par contre, la fusion
d’un autre épitope cellulaire, tel que la gp33 du virus LCMV, permettrait de valider le
potentiel de la réponse cellulaire induite en comparant avec celle obtenue suite à la
fusion de l’épitope au C-terminal (Lacasse, Denis et al. 2008). De plus, la fusion de
plus d’un épitope NP147-155 à la surface de la PapMV CP affecte grandement la
capacité d’assemblage des nanoparticules ce qui empêche l’induction d’une réponse
cellulaire significative (Figure 29). En fait, la présence de plus d’un épitope à la
62
surface de la CP ne permet pas de compenser pour la faible multimérisation des
particules en ce qui concerne la stimulation de l’immunité cellulaire.
La stabilité des particules à la température est un critère important lors
d’expérience in vivo puisque la température corporelle des souris se situe aux
alentours de 37°C. Ainsi, pour que les nanoparticules aient le temps de stimuler le
système immunitaire, il est important qu’elles résistent à des températures similaires
ou supérieures à 37°C. Puisque la stabilité des particules recombinantes diffèrent
dépendamment du site de fusion et du choix de l’épitope, il serait pertinent de vérifier
la stabilité de ces particules à différentes températures.
7. Conclusion
Ce projet de recherche a permis de mettre en évidence la capacité de la
plateforme vaccinale PapMV CP à induire une réponse cellulaire in vivo. En effet,
l’insertion de l’épitope cellulaire NP147-155 à la surface de la protéine de capside du
virus de la mosaïque de la papaye suivi de l’immunisation de souris Balb/C a permis
d’induire la production d’IFN-γ par les précurseurs des lymphocytes T CD8+
spécifiques. Ces résultats démontrent l’avantage de fusionner des épitopes au N-
terminus plutôt qu’au C-terminus. En effet, le choix du site d’insertion semble être
épitope dépendant. Par ailleurs, en comparant la réponse obtenue suite à
l’immunisation de souris avec les nanoparticules de celle obtenue avec les disques, il
est possible d’observer l’importance de la multimérisation de la CP dans la
stimulation d’une réponse cellulaire in vivo. Ainsi, les critères importants pour la
stimulation d’une réponse cellulaire par les nanoparticules composées de la PapMV
CP sont la multimérisation de la CP sous forme de nanoparticules et le choix de la
position pour la fusion de l’épitope CTL.
En perspective, il serait intéressant de valider les résultats obtenus avec un autre
épitope cellulaire, tel que la gp33 du virus LCMV, afin de déterminer s’il est possible
63
de générer une réponse protectrice suite à la fusion après le résidu 12 de la CP. Des
analyses pour déterminer la qualité de la réponse cellulaire générée pourraient
également être effectuées par cytofluorométrie intracellulaire. De plus, il serait
intéressant d’évaluer la thermostabilité de ces protéines recombinantes puisque cette
caractéristique semble être cruciale pour l’induction d’une réponse humorale contre
un épitope à la surface de la CP. Advenant que les protéines recombinantes se
dénaturent à des températures inférieures à 37ºC, les protéines de capside
recombinantes seront appariées chimiquement avec le glutaraldéhyde afin de les
stabiliser. Ensuite, ces protéines seront immunisées chez les souris Balb/C afin de
déterminer la réponse cellulaire induite.
64
Bibliographie
Abouhaidar, M. G. and R. Lai (1989). "Nucleotide Sequence of the 3′-Terminal
Region of Clover Yellow Mosaic Virus RNA." Journal of General
Virology 70(7): 1871-1875.
Adams, M. J., J. F. Antoniw, et al. (2004). "Virology Division News : The new plant
virus family Flexiviridae and assessment of molecular criteria for species
demarcation." Archives of Virology 149(5): 1045-1060.
Antonis, A. F. G., C. J. M. Bruschke, et al. (2006). "A novel recombinant virus-like
particle vaccine for prevention of porcine parvovirus-induced
reproductive failure." Vaccine 24(26): 5481-5490.
Bachmann, M. F., H. Hengartner, et al. (1995). "T helper cell-independent
neutralizing B cell response against vesicular stomatitis virus: Role of
antigen patterns in B cell induction?" European Journal of Immunology
25(12): 3445-3451.
Baratova, L. A., N. I. Grebenshchikov, et al. (1992). "The topography of the surface
of potato virus X: tritium planigraphy and immunological analysis."
Journal of General Virology 73(2): 229-235.
Bendahmane, M., M. Koo, et al. (1999). "Display of epitopes on the surface of
tobacco mosaic virus: impact of charge and isoelectric point of the
epitope on virus-host interactions." Journal of Molecular Biology 290(1):
9-20.
Bhyravbhatla, B., S. J. Watowich, et al. (1998). "Refined Atomic Model of the Four-
Layer Aggregate of the Tobacco Mosaic Virus Coat Protein at 2.4-Å
Resolution." Biophysical Journal 74(1): 604-615.
Bianchi, M. E. (2007). "DAMPs, PAMPs and alarmins: all we need to know about
danger." Journal of Leukocyte Biology 81(1): 1-5.
Blasius, A. L. and B. Beutler (2010). "Intracellular Toll-like Receptors." Immunity
32(3): 305-315.
Bol, J. F. (2005). "Replication of alfamo- and ilarviruses: role of the coat protein."
Annual review of phytopathology 43: 39-62.
Bonilla, F. A. and H. C. Oettgen (2010). "Adaptive immunity." Journal of Allergy
and Clinical Immunology 125(2, Supplement 2): S33-S40.
65
Canizares, M. C., L. Nicholson, et al. (2005). "Use of viral vectors for vaccine
production in plants." Immunol Cell Biol 83(3): 263-270.
Chen, G., M. H. Shaw, et al. (2009). "NOD-like receptors: role in innate immunity
and inflammatory disease." Annual review of pathology 4: 365-398.
Cruz, S. S., S. Chapman, et al. (1996). "Assembly and movement of a plant virus
carrying a green fluorescent protein overcoat." Proceedings of the
National Academy of Sciences 93(13): 6286-6290.
Denis, J., E. Acosta-Ramirez, et al. (2008). "Development of a universal influenza A
vaccine based on the M2e peptide fused to the papaya mosaic virus
(PapMV) vaccine platform." Vaccine 26(27-28): 3395-3403.
Denis, J., N. Majeau, et al. (2007). "Immunogenicity of papaya mosaic virus-like
particles fused to a hepatitis C virus epitope: Evidence for the critical
function of multimerization." Virology 363(1): 59-68.
Dougan, G. (2001). Vaccines: Whole Organism. eLS, John Wiley & Sons, Ltd.
Eddie, W. K., K. Takahashi, et al. (2009). "Mannose-binding lectin and innate
immunity." Immunological Reviews 230(1): 9-21.
Ertl, H. C. J., Z. Q. Xiang, et al. (2001). Vaccines: Presentation. eLS, John Wiley &
Sons, Ltd.
Fagan, E. A., P. Tolley, et al. (1987). "Hepatitis B vaccine: Immunogenicity and
follow-up including two year booster doses in high-risk health care
personnel in a London teaching hospital." Journal of Medical Virology
21(1): 49-56.
Fenner, F. (1982). "Global Eradication of Smallpox." Review of Infectious Diseases
4(5): 916-930.
Fifis, T., A. Gamvrellis, et al. (2004). "Size-Dependent Immunogenicity: Therapeutic
and Protective Properties of Nano-Vaccines against Tumors." The Journal
of Immunology 173(5): 3148-3154.
Flynn, K. J., G. T. Belz, et al. (1998). "Virus-Specific CD8+ T Cells in Primary and
Secondary Influenza Pneumonia." Immunity 8(6): 683-691.
Fu, T. M., A. Friedman, et al. (1997). "Protective cellular immunity: cytotoxic T-
lymphocyte responses against dominant and recessive epitopes of
66
influenza virus nucleoprotein induced by DNA immunization." Journal of
Virology 71(4): 2715-2721.
Garland, S. M., M. Hernandez-Avila, et al. (2007). "Quadrivalent Vaccine against
Human Papillomavirus to Prevent Anogenital Diseases." New England
Journal of Medicine 356(19): 1928-1943.
Gonzalez, M. J., E. M. Plummer, et al. (2009). "Interaction of Cowpea Mosaic Virus
(CPMV) Nanoparticles with Antigen Presenting Cells In Vitro and In
Vivo." PLoS ONE 4(11): e7981.
Harper, D. M., E. L. Franco, et al. (2004). "Efficacy of a bivalent L1 virus-like
particle vaccine in prevention of infection with human papillomavirus
types 16 and 18 in young women: a randomised controlled trial." The
Lancet 364(9447): 1757-1765.
Huisman, M. J., H. J. M. Linthorst, et al. (1988). "The Complete Nucleotide
Sequence of Potato Virus X and Its Homologies at the Amino Acid Level
with Various Plus-stranded RNA Viruses." Journal of General Virology
69(8): 1789-1798.
Kawai, T. and S. Akira (2010). "The role of pattern-recognition receptors in innate
immunity: update on Toll-like receptors." Nat Immunol 11(5): 373-384.
Kendall, M. A. F. (2010). Needle-Free Vaccine Injection
Drug Delivery. M. Schäfer-Korting, Springer Berlin Heidelberg. 197: 193-219.
Koonin, E. V., V. V. Dolja, et al. (1993). "Evolution and Taxonomy of Positive-
Strand RNA Viruses: Implications of Comparative Analysis of Amino
Acid Sequences." Critical Reviews in Biochemistry and Molecular
Biology 28(5): 375-430.
Kumar, H., T. Kawai, et al. (2011). "Pathogen Recognition by the Innate Immune
System." International Reviews of Immunology 30(1): 16-34.
Lacasse, P., J. Denis, et al. (2008). "Novel Plant Virus-Based Vaccine Induces
Protective Cytotoxic T-Lymphocyte-Mediated Antiviral Immunity
through Dendritic Cell Maturation." J. Virol. 82(2): 785-794.
Laffont, S. and F. Powrie (2009). "Immunology: Dendritic-cell genealogy." Nature
462(7274): 732-733.
67
Laliberté Gagné, M. E., K. Lecours, et al. (2008). "The F13 residue is critical for
interaction among the coat protein subunits of papaya mosaic virus."
FEBS Journal 275(7): 1474-1484.
Leclerc, D., D. Beauseigle, et al. (2007). "Proteasome-Independent Major
Histocompatibility Complex Class I Cross-Presentation Mediated by
Papaya Mosaic Virus-Like Particles Leads to Expansion of Specific
Human T Cells." J. Virol. 81(3): 1319-1326.
Lecours, K., M.-H. Tremblay, et al. (2006). "Purification and biochemical
characterization of a monomeric form of papaya mosaic potexvirus coat
protein." Protein Expression and Purification 47(1): 273-280.
Lee, S., R. Srivastava, et al. (2011). "Natural killer (NK):dendritic cell (DC) cross
talk induced by therapeutic monoclonal antibody triggers tumor antigen-
specific T cell immunity." Immunologic Research 50(2): 248-254.
Lenz, P., C. D. Thompson, et al. (2003). "Interaction of papillomavirus virus-like
particles with human myeloid antigen-presenting cells." Clinical
Immunology 106(3): 231-237.
Lico, C., F. Capuano, et al. (2006). "Peptide display on Potato virus X: molecular
features of the coat protein-fused peptide affecting cell-to-cell and phloem
movement of chimeric virus particles." Journal of General Virology
87(10): 3103-3112.
Lico, C., C. Mancini, et al. (2009). "Plant-produced potato virus X chimeric particles
displaying an influenza virus-derived peptide activate specific CD8+ T
cells in mice." Vaccine 27(37): 5069-5076.
Liu, L., M. C. Cañizares, et al. (2005). "Cowpea mosaic virus-based systems for the
production of antigens and antibodies in plants." Vaccine 23(15): 1788-
1792.
Maurice, H. (2000). "Vaccines in historic evolution and perspective: a narrative of
vaccine discoveries." Vaccine 18(15): 1436-1447.
McCormick, A. A., T. A. Corbo, et al. (2006). "Chemical Conjugate TMV−Peptide
Bivalent Fusion Vaccines Improve Cellular Immunity and Tumor
Protection." Bioconjugate Chemistry 17(5): 1330-1338.
Mosmann, T. R. and R. L. Coffman (1989). "TH1 and TH2 cells: different patterns of
lymphokine secretion lead to different functional properties." Annual
review of immunology 7: 145-173.
68
Namba, K., R. Pattanayek, et al. (1989). "Visualization of protein-nucleic acid
interactions in a virus: Refined structure of intact tobacco mosaic virus at
2.9 Å resolution by X-ray fiber diffraction." Journal of Molecular Biology
208(2): 307-325.
Nemykh, M. A., A. V. Efimov, et al. (2008). "One more probable structural transition
in potato virus X virions and a revised model of the virus coat protein
structure." Virology 373(1): 61-71.
O’Connell, K. A., J. R. Bailey, et al. (2009). "Elucidating the elite: mechanisms of
control in HIV-1 infection." Trends in Pharmacological Sciences 30(12):
631-637.
Paolo, B. (1999). "Demographic impact of vaccination: a review." Vaccine 17,
Supplement 3(0): S120-S125.
Plotkin, S. A. (2005). "Vaccines: past, present and future." Nat Med.
Plotkin, S. A. (2009). "Vaccines: the Fourth Century." Clinical and Vaccine
Immunology 16(12): 1709-1719.
Pushko, P., T. M. Tumpey, et al. (2007). "Evaluation of influenza virus-like particles
and Novasome adjuvant as candidate vaccine for avian influenza."
Vaccine 25(21): 4283-4290.
Reichardt, P., B. Dornbach, et al. (2010). APC, T Cells, and the Immune Synapse
Immunological Synapse. T. Saito and F. D. Batista, Springer Berlin Heidelberg. 340:
229-249.
Rioux, G., C. Babin, et al. (2012). "Engineering of Papaya Mosaic Virus (PapMV)
Nanoparticles through Fusion of the HA11 Peptide to Several Putative
Surface-Exposed Sites." PLoS ONE 7(2): e31925.
Roy, P. and R. Noad (2009). Virus-Like Particles as a Vaccine Delivery System:
Myths and Facts
Pharmaceutical Biotechnology. C. A. Guzmán and G. Z. Feuerstein, Springer New
York. 655: 145-158.
Ruedl, C., T. Storni, et al. (2002). "Cross-presentation of virus-like particles by skin-
derived CD8– dendritic cells: a dispensable role for TAP." European
Journal of Immunology 32(3): 818-825.
69
Sachse, C., J. Z. Chen, et al. (2007). "High-resolution Electron Microscopy of Helical
Specimens: A Fresh Look at Tobacco Mosaic Virus." Journal of
Molecular Biology 371(3): 812-835.
Saito, S., A. Nakashima, et al. (2010). "REVIEW ARTICLE: Th1/Th2/Th17 and
Regulatory T-Cell Paradigm in Pregnancy." American Journal of
Reproductive Immunology 63(6): 601-610.
Savard, C., A. Guérin, et al. (2011). "Improvement of the Trivalent Inactivated Flu
Vaccine Using PapMV Nanoparticles." PLoS ONE 6(6): e21522.
Schoenborn, J. R. and C. B. Wilson (2007). Regulation of Interferon‐γ During Innate
and Adaptive Immune Responses. Advances in Immunology. W. A.
Frederick, Academic Press. Volume 96: 41-101.
Schroeder, H. W. and L. Cavacini (2010). "Structure and function of
immunoglobulins." Journal of Allergy and Clinical Immunology 125(2,
Supplement 2): S41-S52.
Sit, T. L., M. G. Abouhaidar, et al. (1989). "Nucleotide Sequence of Papaya Mosaic
Virus RNA." Journal of General Virology 70(9): 2325-2331.
Šmahel, M. (2011). "Antigens in chronic myeloid leukemia: implications for vaccine
development." Cancer Immunology, Immunotherapy 60(12): 1655-1668.
Smith, M. L., W. P. Fitzmaurice, et al. (2009). Display of Peptides on the Surface of
Tobacco Mosaic Virus Particles
Plant-produced Microbial Vaccines. A. V. Karasev, Springer Berlin Heidelberg. 332:
13-31.
Ståhl, S. and S. Liljeqvist (2001). Vaccines: Subunit. eLS, John Wiley & Sons, Ltd.
Strassburg, M. A., S. Greenland, et al. (1986). "Influenza in the elderly: report of an
outbreak and a review of vaccine effectiveness reports." Vaccine 4(1): 38-
44.
Streatfield, S. J. and J. A. Howard (2003). "Plant-based vaccines." International
Journal for Parasitology 33(5-6): 479-493.
Tao, P., M. Luo, et al. (2009). "Enhanced protective immunity against H5N1
influenza virus challenge by vaccination with DNA expressing a chimeric
hemagglutinin in combination with an MHC class I-restricted epitope of
nucleoprotein in mice." Antiviral Research 81(3): 253-260.
70
Tollin, P., J. B. Bancroft, et al. (1979). "Diffraction studies of papaya mosaic virus."
Virology 98(1): 108-115.
Tremblay, M.-H., N. Majeau, et al. (2006). "Effect of mutations K97A and E128A on
RNA binding and self assembly of papaya mosaic potexvirus coat
protein." FEBS Journal 273(1): 14-25.
Turvey, S. E. and D. H. Broide (2010). "Innate immunity." Journal of Allergy and
Clinical Immunology 125(2, Supplement 2): S24-S32.
Valenzuela, P., A. Medina, et al. (1982). "Synthesis and assembly of hepatitis B virus
surface antigen particles in yeast." Nature 298(5872): 347-350.
Verde, C., A. Malorni, et al. (1989). "The primary structure of papaya mosaic virus
coat protein: A revision." Journal of Protein Chemistry 8(6): 795-805.
Wigdorovitz, A., D. M. Pérez Filgueira, et al. (1999). "Protection of Mice against
Challenge with Foot and Mouth Disease Virus (FMDV) by Immunization
with Foliar Extracts from Plants Infected with Recombinant Tobacco
Mosaic Virus Expressing the FMDV Structural Protein VP1." Virology
264(1): 85-91.
Wu, L., L. Jiang, et al. (2003). "Expression of foot-and-mouth disease virus epitopes
in tobacco by a tobacco mosaic virus-based vector." Vaccine 21(27-30):
4390-4398.
Yang, C.-D., J.-T. Liao, et al. (2007). "Induction of protective immunity in swine by
recombinant bamboo mosaic virus expressing foot-and-mouth disease
virus epitopes." BMC Biotechnology 7(1): 62.
Young, S. L., M. Wilson, et al. (2006). "Transcutaneous vaccination with virus-like
particles." Vaccine 24(26): 5406-5412.
Yusibov, V., A. Kumar, et al. (1996). "Purification, characterization, assembly and
crystallization of assembled alfalfa mosaic virus coat protein expressed in
Escherichia coli." Journal of General Virology 77(4): 567-573.
Zhang, H., E. Todderud, et al. (1993). "Crystallization and Preliminary X-ray
Analysis of Papaya Mosaic Virus Coat Protein." Journal of Molecular
Biology 234(3): 885-887.
Zhu, J. and W. E. Paul (2009). "Heterogeneity and plasticity of T helper cells." Cell
Res 20(1): 4-12.
71
72
Annexe 1. Alignement des CPs des Potexvirus
Name: BAMBOO_MOSAIC_VIRUS_CP Len: 276 Check: 2224 Weight: 1.00
Name: FOXTAIL_MOSAIC_VIRUS Len: 276 Check: 1995 Weight: 1.00
Name: CYMBIDIUM_MOSAIC_VIRUS Len: 276 Check: 2111 Weight: 1.00
Name: POTATO_AUCUBA_MOSAIC_VIRUS Len: 276 Check: 8389 Weight: 1.00
Name: NARCISSUS_MOSAIC_VIRUS_CP Len: 276 Check: 9662 Weight: 1.00
Name: SCALLION_VIRUS_X Len: 276 Check: 7794 Weight: 1.00
Name: PEPINO_MOSAIC_VIRUS_CP Len: 276 Check: 7733 Weight: 1.00
Name: WHITE_CLOVER_MOSAIC_VIRUS_ Len: 276 Check: 8132 Weight: 1.00
Name: Altranathera_Potex Len: 276 Check: 800 Weight: 1.00
Name: Cactus_virus_X_CP Len: 276 Check: 9357 Weight: 1.00
Name: PLANTAGO_ASIATICA_MOSAIC_POTEXVIRUS Len: 276 Check: 2033 Weight: 1.00
Name: TULIP_VIRUS_X Len: 276 Check: 1230 Weight: 1.00
Name: CASSAVA_COMMON_MOSAIC_VIRUS Len: 276 Check: 4587 Weight: 1.00
Name: CLOVER_YELLOW_MOSAIC_VIRUS Len: 276 Check: 6966 Weight: 1.00
Name: HOSTA_VIRUS_X_CP Len: 276 Check: 2065 Weight: 1.00
Name: LILY_VIRUS_X_CP Len: 276 Check: 3398 Weight: 1.00
Name: STRAWBERRY_MILD_YELLOW_EDGE-ASSOCIATED Len: 276 Check: 7751 Weight: 1.00
Name: POTATO_VIRUS_X_CP Len: 276 Check: 127 Weight: 1.00
Name: PapMV_CLONE-Pet_MH Len: 276 Check: 9963 Weight: 1.00
1 50
BAMBOO_MOSAI ~~~~~~~~MS GTGTGTGRGT GTGVGGTGGT GGTGGGGTGR GQQAAPQPWE
FOXTAIL_MOSA ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~MATQN ADVTDATDYK
CYMBIDIUM_MO ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~MGEPTPTP AATYSAADPT
POTATO_AUCUB MVDSKKTETP QVVDASKKAE NSKTSQAGRI QFLSAP.... .KQFSASDVR
NARCISSUS_MO ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~MA TPSTQTTDPK PANADLSDPN
SCALLION_VIR ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~MDKLDAG QPQRKQAEPV P..ADLSDPT
PEPINO_MOSAI ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~MPD TTPVAATSSA PPTAKDAGAK .APSDFSNPN
WHITE_CLOVER ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~MATTTAT
Altranathera ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~MSTP....F
Cactus_virus ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~MST TGVQSSQSSG PRSTPQSGPF
PLANTAGO_ASI ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~MALN
TULIP_VIRUS_ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~MALN
CASSAVA_COMM ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~MATPTS TTPTTATITQ AATTPLSALS
CLOVER_YELLO ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~MTDTKKTLF
HOSTA_VIRUS_ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~MASDAPT PPAAPSPVTF
LILY_VIRUS_X ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~MTT
STRAWBERRY_M ~~~~MGDQPR PPVPPAPGSN PLPMGSTPPV LPGRTPNPNA NVANQVGDPF
POTATO_VIRUS ~~~~~~~~~~ ~~~~~~MSAP ASTTQATGST TSTTTKTAGA TPATASGLFT
PapMV_CLONE- ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ MASTPNIA.F
Consensus ---------- --V-----A- --P-GATGST TPTTTPT-P- PA-TP-SDPF
51 100
BAMBOO_MOSAI TKFTKDDLAA IEPKPASANV PNTKQWISIQ AGLIKA.GAT DANFMKVLLG
FOXTAIL_MOSA KPPAETEQKA LTIQPRSNKA PSDEELVRII NAAQKR.GLT PAAFVQAAIV
CYMBIDIUM_MO SAPKLADLAA IKYSPVTSSI ATPEEIKAIT QLWVNNLGLP ADTVGTAAI.
POTATO_AUCUB SSPSLADLDE IAYEVRTTSI ASPAEIEAVC QLWIRNTEIP ADKVALIAI.
NARCISSUS_MO RAPSLEDLKK IKYESTTTAV ATPAEIQLLG DLF.KKLGLD ANSVAP.AMW
SCALLION_VIR RAPSLKELQA VKYVSTTTSV ATPDEIKQLG ELF.QKLGVD GSSIGP.AMW
PEPINO_MOSAI TAPSLSDLKK VKYVSTVTSV ATPAEIEALG KIF.TAMGLA ANETGP.AMW
WHITE_CLOVER TPPSLTDIRA LKYTSSTVSV ASPAEIEAIT KTW.AETFKI PNDVLPLACW
Altranathera PQVTQEQMDA FTPHTTSNLL PSPEQLTTIA SLL.VAAKVP AASTTTIAL.
Cactus_virus QTLSSSQLAA LSLGVTSSLL PSPAELVSIS QAL.TTLGAS ATNLTPLSL.
PLANTAGO_ASI TAPTADALAA MAFPVSSPSV PTAQELDTIT SGL.TTLGVP TDSLLSHAL.
TULIP_VIRUS_ TAPNPEALAA MTLEVSSPAV PTPAELDTIA AGL.TTLGVP ADSLISHAL.
CASSAVA_COMM TAPTDEELSR LDLKPASNLV ASADALSAIA ADW.ASLKVP TAQLMRHAL.
CLOVER_YELLO SAPTDEQLDT LTLTIESNLV PSISELEAIA KDW.KTLGLQ EADFTANAI.
73
HOSTA_VIRUS_ TAPTQEQLTS LALPIISTRL PSPDVLNQIS VKW.QELGVP TASISSTAI.
LILY_VIRUS_X FVPDAKTWAD TAYTAQSESV ATAEELQSIA TLW.EGIGIP AANFFDVAF.
STRAWBERRY_M RVLTPEELAA .PISAASNKV ATREQILGIV AD.LNALGFV GDP..ALGLF
POTATO_VIRUS .IPDGDFFST ARAVVASDAV ATNEDLSEIE AVW.KDMKVP TDTMAQAAW.
PapMV_CLONE- PAITQEQMSS IKVDPTSNLL PSQEQLKSVS TLM.VAAKVP AASVTTVAL.
Consensus TAPTLEDLAA LKY--TSNSV A-PEELEAIA ALWIKALGVP AASVTP-ALW
101 150
BAMBOO_MOSAI .LSLEAFDRG SSEATTWDG. ..ITEGVEHR AAANAIKEAN CPIHKVTYYL
FOXTAIL_MOSA .FTM...DKG ATDSTIFTG. ..KYNTFPMK SLALRCKDAG VPVHKLCYFY
CYMBIDIUM_MO DLARAYADVG ASKSATLLGF CPTKPDVRRA ALAGRSLWPT SPPASFCAYY
POTATO_AUCUB DMARAYADVG ASRKAVLLDA PTLAPTVARS RLAQLKAGAG ISPRQFCSYY
NARCISSUS_MO DLARAYADVQ ASRSAVLSGT TPSNPAITRQ ALARQFYVIN ITPRQFCMYF
SCALLION_VIR DLARAYADVQ SSRSAMLAGT TPSNPAITRQ ALARQFYIVN ITPRQFCMYF
PEPINO_MOSAI DLARAYADVQ SSKSAQLIGA TPSNPALSRR ALAAQFDRIN ITPRQFCMYF
WHITE_CLOVER DLARAFADVG ASSKSELTGD SAALAGVSRK QLA.QAIKIH CTIRQFCMYF
Altranathera ELVNFCYDNG SSAYTVVVGP SS.LAEVSLS QVANIVKASG TSLRKFCRFF
Cactus_virus EIVNYCFDNG SSPETVFKGD ST.V..LQMP SPKSPCHHPI TTLRQFCRYF
PLANTAGO_ASI ALVNACFDAG SSSFVTLSGP SP.TPTISLA QIAGVVKVT. TTLRKFCRFY
TULIP_VIRUS_ ALVNACFDAG SSQFTTISGP SP.TPTITLA QLAGVVKVS. TTLRKFCRFY
CASSAVA_COMM DLVNFCFDSG SSKYTTVEGS SP.TPTIPRA ALAGAVRKH. TTLRQFCRYY
CLOVER_YELLO KIAWFCYHSG SSESVQVQGN ST.SDKIPLY QLAGVVRQH. STLRRFCRYF
HOSTA_VIRUS_ ALCMACYHSG SSGSTLIPGL AP.GTTVNYT SLAAAVK.SL ATLREFARYF
LILY_VIRUS_X QLAMRCSDGH ASSLTVLSGN CTVAPTVTLK AAAGLVKA.V LPLRQFCRYY
STRAWBERRY_M DLAFHCYDIG SSPSAQPVGP SPF..GCSRM QVAAVVR.NH CTLRQLCMFY
POTATO_VIRUS DLVRHCADVG SSAQTEMIDT GPYSNGISRA RLAAAIKE.V CTLRQFCMKY
PapMV_CLONE- ELVNFCYDNG SSAYTTVTGP SS.IPEISLA QLASIVKASG TSLRKFCRYF
Consensus DLARACADVG SS-STTLSGP SPSTPTISRA -LAG-VK-S- TTLRQFCRY-
151 200
BAMBOO_MOSAI AKPTFAIRQS KNLPPANFAK KNVPSQYKWC AFDAFDGLYD PTCL.ASELP
FOXTAIL_MOSA TKPAYANRRV ANQPPARWTN ENVPKANKWA AFDTFDALLD PYVV.PSSVP
CYMBIDIUM_MO AKVVWNLMLA TNDPPANWAK AGFQEDTRFA AFDFFDAVDS TAALEPAE.W
POTATO_AUCUB AKIVWNLMLH KNEPPANWAK IGFKEDYKFA AFDFFDAVDS PAALEPSQ.W
NARCISSUS_MO AKVVWNLLLD SNVPPAGWAK QGLPDDCKFA GFDFFEGVLS PAALDPADGL
SCALLION_VIR AKVVWNMMID SNVPPAGWVK HGLPEDCKFA GFVFFEGVLS PSSLDPADGL
PEPINO_MOSAI AKVVWNILLD SNIPPANWAK LGYQEDTKFA AFDFFDGVTN PASLQPADGL
WHITE_CLOVER ANVVWNIMLD TKTPPASWSK LGYKEESKFA GFDFFDGVNH PAALMPADGL
Altranathera APIIWNLRTD K.TPPANWEA NGFKPTEKFA AFDFFDGVEN PAAMQPPGGL
Cactus_virus AKIIWNYRVS KNLPPAAWEA WAYKPEQKFA AFDFFDGVLN EAALNPIDGL
PLANTAGO_ASI AKIIWNARLA RNLPPAGFAR ANIKFEHRWA GFDFFDGLLN PAALEPPGGL
TULIP_VIRUS_ AKLIWNARLS RNRPPAGFAR AYVKTGQKWA GFDFFDGLLN PAALEPLGGL
CASSAVA_COMM AKIIWNARVK ANIPPAGYAN AHIKPEQAFA GFDFFDGVMN VAALEPSGGL
CLOVER_YELLO AKVIWNYALR KNQPPANWAS QNYKEADRFA AFDFFEGVSS SAALSPPGGL
HOSTA_VIRUS_ APIIWNYAIE HKIPPANWAA MGYKENTKYA AFDTFDSILN PAALQPTGGL
LILY_VIRUS_X AKFVWNWRLS HDLPPANWAD SQFPAEARFA AFDFFDGVTN SAAPQPPDGL
STRAWBERRY_M APSVWNKAVR DNRPPGNWSN LQFTPETKFA AFDFFDGVLN PASQEVP..L
POTATO_VIRUS APVVWNWMLT NNSPPANWQA QGFKPEHKFA AFDFFNGVTN PAAIMPKEGL
PapMV_CLONE- APIIWNLRTD K.MAPANWEA SGYKPSAKFA AFDFFDGVEN PAAMQPPSGL
Consensus AK-VWNLRLD KNLPPANWAK AG-KEETKFA AFDFFDGVLN PAALEPP-GL
201 250
BAMBOO_MOSAI YDAPSEIDRM ASATFKTIQI KIANDQKGFN L.NYNPNVTQ ARLPNA....
FOXTAIL_MOSA YDEPTPEDRQ VNEIFKKDNL SQAASRNQL. L.GTQASITR GRLNGA....
CYMBIDIUM_MO QRRPTDRERA AHSIGKYGAL ARQRIQ.NGG LITNIAEVNQ GPSWSTNTLN
POTATO_AUCUB VRHPTDKERA AHGVVKWASL SRERLQ.EGT SITTVAELNK GHLGGYNNLP
NARCISSUS_MO IRPPSQREIQ AHSTAKYGAL ARQRYRMETS FPPWLKSLT. .....VGSAV
74
SCALLION_VIR IRHPSQREIQ AHSTAKYGAL ARQRIQ.NGN FVSNLAEVTH GRAGGVNSMY
PEPINO_MOSAI IRQPNEKELA AHSVAKYGAL ARQKI.STGN YITTLGEVTR GHMGGANTMY
WHITE_CLOVER IRGPSEAELL AHQTAKQVAL HRDAKRRGTN VVNSV.EITN GRSDPIGPLI
Altranathera VRAPSQAERI ANATNKQVNL FQAAAQDN.N FASNSAFITK GQL..SSNSP
Cactus_virus VRVPNEAERL ANQTNRNVHL FESNAQKN.R ALTTSALVTK GLQ..GSESP
PLANTAGO_ASI SRTPTPDEVT ANETARSLNL FEARASYS.N LASTSTQFTR GQL..SNTAP
TULIP_VIRUS_ TREPTPDEIT ANETARSLGL FESRANSN.N LATTSTQFTR GQL..SNTSP
CASSAVA_COMM VREPTPQEII AAETARSLNL FEAQSKGN.N LATNATQVTR GRL..SSSEP
CLOVER_YELLO IREPSPNERM ANETNKNVHL YQTASRGS.N LATTSTVATK GAY..STNAS
HOSTA_VIRUS_ IRQPTEEELL AHQANSALHI FDSLR..N.D FASTDGRVTR GHI..TSNVN
LILY_VIRUS_X IRPPTELELS AAQTAKFAAL ..ARVRGS.G FVTTAAEITH GRAEVSRT..
STRAWBERRY_M WRQPTPQEIY ASATHKDVAT YRAASKAHDR .ISNSTLLTK G..ASRSTPP
POTATO_VIRUS IRPPSEAEMN AAQTAAFVKI TKARAQSN.D FASLDAAVTR GRITGTTTAE
PapMV_CLONE- TRSPTQEERI ANATNKQVHL FQAAAQDN.N FASNSAFITK GQI..SGSTP
Consensus IREPTEAER- A--TAKYVAL FRARAQ-NGN -ATTSAEVTR GRLGGSNTAP
251 276
BAMBOO_MOSAI PLPALPEPTS D~~~~~~~~~ ~~~~~~
FOXTAIL_MOSA ..PALPNNGQ YFIEAPQ~~~ ~~~~~~
CYMBIDIUM_MO ALPAP~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~
POTATO_AUCUB ALMAPPS~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~
NARCISSUS_MO STPCTPLKHL QNCNRNTSKL KLVCGL
SCALLION_VIR AIEAPPEL~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~
PEPINO_MOSAI AIDAPPEL~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~
WHITE_CLOVER TYPQ~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~
Altranathera TIQYLPPPE~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~
Cactus_virus RIQFLPGPE~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~
PLANTAGO_ASI QVQFLPAPSD ~~~~~~~~~~ ~~~~~~
TULIP_VIRUS_ TVQFLPSPED ~~~~~~~~~~ ~~~~~~
CASSAVA_COMM QVQFLTGVDE ~~~~~~~~~~ ~~~~~~
CLOVER_YELLO NAGFPYHRPE ~~~~~~~~~~ ~~~~~~
HOSTA_VIRUS_ SLNYLPAPEG SS~~~~~~~~ ~~~~~~
LILY_VIRUS_X ..MLLSPP~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~
STRAWBERRY_M ALLPGP~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~
POTATO_VIRUS AVVTLPPP~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~
PapMV_CLONE- TIQFLPPPEH HHHHH~~~~~ ~~~~~~
Consensus A-Q-LPPPE- ---------- ------
75
Annexe 2. Milieux et tampons
Clonage :
Gel d’agarose 0.8 % (1 L) :
8g d’agarose
40µl de bromure d’éthidium
Bleu à ADN 3X :
40% glycérol
0,25% bleu de bromophénol
Milieu LB (1 L) :
10g de peptone
5g d’extrait de levure
10g de NaCl
900 ml d’eau
pH 7.0
Production de protéines :
Milieu 2XYT (1 L) :
16g de peptone
10g d’extrait de levure
5g de NaCl
800 ml d’eau distillée
pH 7.0
Milieu agar 2XYT avec ampicilline :
Milieu 2XYT liquide
20g d’agar
ampicilline 50 µg/ml *
* l’ampicilline est ajoutée après l’autoclavage, lorsque le milieu est
tiède
76
Purification de protéines :
Tampon de lyse (Lysis Buffer) : 50 mM NaH2PO4
300 mM NaCl
10 mM imidazole
pH 8,0
Tampon de lavage 1 : 50 mM NaH2PO4
300 mM NaCl
20 mM imidazole
pH 8,0
Tampon de lavage 2 : 50 mM NaH2PO4
300 mM NaCl
50 mM imidazole
pH 8,0
Tampon de lavage 3 : 10 mM Tris-HCl
50 mM imidazole
0,5% Triton 100X
pH 8,0
Tampon de lavage 4 : 10 mM Tris-HCl
50 mM imidazole
pH 8,0
Tampon de lavage 5 : 10 mM Tris-HCl
1% Zwittergent
pH 8,0
Tampon d’élution : 10 mM Tris-HCl
1 M imidazole
pH 8,0
Préparation de gels de polyacrylamide tris-tricine (2 gels):
Gel d’empilement : 0,5 ml de mélange d’acrylamide**
1,55 ml de tampon de gel***
4,2 ml d’eau
125 μl de persulfate d’ammonium 10 %
12 μl de TEMED
77
Gel de séparation 10% : 3,05 ml de mélange d’acrylamide**
5 ml de tampon de gel***
1,6 ml de glycérol
5,35 ml d’eau
125 μl de persulfate d’ammonium 10 %
12 μl de TEMED
** Solution de mélange d’acrylamide : 49,5 % d’acrylamide
3 % de bisacrylamide
*** Solution de tampon de gel : 3 M Tris-HCl pH 8,45
0,3 % SDS
Bleu dénaturant à protéine 3X :
6% SDS
50% glycérol
0,2M β-mercaptoéthanol
0,3% bleu de bromophénol
Solution de décoloration pour gel de protéine :
360 ml 99% éthanol
360 ml d’eau
80 ml d’acide acétique glacial
78
Annexe 3. Carte du vecteur d’expression pET-3d
79
Annexe 4. Séquences des clones
PapMV NP-12
Séquence en acides nucléiques
ATGGCATCCACACCCAACATAGCCAACCTGAACGACGCGACCTACCAGCGTACGCGT
GCGCTGGTTCGTACCGGTATGGACTTCCCCGCCATCACCCAGGAACAAATGAGCTCG
ATTAAGGTCGATCCAACGTCCAATCTTCTGCCCTCCCAAGAGCAGTTAAAGTCAGTG
TCCACCCTCATGGTAGCTGCTAAGGTTCCAGCAGCCAGTGTTACAACTGTGGCATTG
GAGTTGGTTAACTTCTGCTATGACAATGGGTCCAGCGCGTACACCACAGTGACTGGC
CCATCATCAATACCGGAGATATCACTGGCACAATTGGCCAGCATTGTCAAAGCTTCC
GGCACTTCCCTTAGGAAATTCTGCCGGTACTTCGCGCCAATAATCTGGAATCTGAGG
ACGGACAAAATGGCTCCTGCCAATTGGGAGGCCTCAGGATACAAGCCAAGCGCCAAA
TTTGCCGCGTTCGACTTCTTCGACGGGGTGGAGAATCCGGCGGCCATGCAACCCCCT
TCGGGACTAACCAGGTCGCCGACCCAGGAAGAGCGGATTGCCAATGCCACCAACAAA
CAGGTGCATCTCTTCCAAGCCGCGGCACAGGACAACAACTTTGCCAGCAACTCCGCC
TTCATCACCAAAGGCCAAATTTCTGGGTCAACCCCAACCATCCAATTCCTTCCACCC
CCCGAAACTAGTACCACGCGTCACCATCACCATCACCATTAGTAAGGATCCGGCTGC
TAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGC
ATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAAC
TATATCCGGATATCCACAGGACGGGTGTGGTCGCCATGATCGCGTAGTCGATAGTGG
CTCCAAGTAGCGAAGCGAGCAGGACTGGGCGGCGGCCA
Séquence en acides aminés
MASTPNIANL NDATYQRTRA LVRTGMDFPA ITQEQMSSIK VDPTSNLLPS
QEQLKSVSTL MVAAKVPAAS VTTVALELVN FCYDNGSSAY TTVTGPSSIP
EISLAQLASI VKASGTSLRK FCRYFAPIIW NLRTDKMAPA NWEASGYKPS
AKFAAFDFFD GVENPAAMQP PSGLTRSPTQ EERIANATNK QVHLFQAAAQ
DNNFASNSAF ITKGQISGST PTIQFLPPPE TSTTRHHHHH H
80
PapMV NP-187
Séquence en acides nucléiques
ATGGCATCCACACCCAACATAGCCTTCCCCGCCATCACCCAGGAACAAATGAGCTCG
ATTAAGGTCGATCCAACGTCCAATCTTCTGCCCTCCCAAGAGCAGTTAAAGTCAGTG
TCCACCCTCATGGTAGCTGCTAAGGTCCCAGCAGCCAGTGTTACAACTGTGGCATTG
GAGTTGGTTAACTTCTGCTATGACAATGGGTCCAGCGCGTACACCACAGTGACTGGC
CCATCATCAATACCGGAGATATCACTGGCACAATTGGCCAGCATTGTCAAAGCTTCC
GGCACTTCCCTTAGGAAATTCTGCCGGTACTTCGCGCCAATAATCTGGAATCTGAGG
ACGGACAAAATGGCTCCTGCCAATTGGGAGGCCTCAGGATACAAGCCAAGCGCCAAA
TTTGCCGCGTTCGACTTCTTCGACGGGGTGGAGAATCCGGCGGCCATGCAACCCCCT
TCGGGACTAACCAGGTCGCCGACCCAGGAAGAGCGGATTGCCAATGCCACCAACAAA
CAGGTGCATCTCTTCCAAGCCGCGGCACAGGACAACCTGAACGACGCGACCTACCAG
CGTACGCGTGCGCTGGTTCGTACCGGTATGGACAACAACTTTGCCAGCAACTCCGCC
TTCATCACCAAAGGCCAAATTTCTGGGTCAACCCCAACCATCCAATTCCTTCCACCC
CCCGAAACTAGTACCACGCGTCACCATCACCATCACCATTAGTAAGGATCCGGCTGC
TAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGC
ATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAAC
TATATCCGGATATCCACAGGACGGGTGTGGTCGCCATGATCGCGTAGTCGATAGTGG
CTCCAGTAGCGAAGCNAGCAGGACTGGGCGGC
Séquence en acides aminés
MASTPNIAFP AITQEQMSSI KVDPTSNLLP SQEQLKSVST LMVAAKVPAA
SVTTVALELV NFCYDNGSSA YTTVTGPSSI PEISLAQLAS IVKASGTSLR
KFCRYFAPII WNLRTDKMAP ANWEASGYKP SAKFAAFDFF DGVENPAAMQ
PPSGLTRSPT QEERIANATN KQVHLFQAAA QDNLNDATYQ RTRALVRTGM
DNNFASNSAF ITKGQISGST PTIQFLPPPE TSTTRHHHHH H
81
PapMV NP-C
Séquence en acides nucléiques
ATGGCATCCACACCCAACATAGCCTTCCCCGCCATCACCCAGGAACAAATGAGCTCG
ATTAAGGTCGATCCAACGTCCAATCTTCTGCCCTCCCAAGAGCAGTTAAAGTCAGTG
TCCACCCTCATGGTAGCTGCTAAGGTTCCAGCAGCCAGTGTTACAACTGTGGCATTG
GAGTTGGTTAACTTCTGCTATGACAATGGGTCCAGCGCGTACACCACAGTGACTGGC
CCATCATCAATACCGGAGATATCACTGGCACAATTGGCCAGCATTGTCAAAGCTTCC
GGCACTTCCCTTAGGAAATTCTGCCGGTACTTCGCGCCAATAATCTGGAATCTGAGG
ACGGACAAAATGGCTCCTGCCAATTGGGAGGCCTCAGGATACAAGCCAAGCGCCAAA
TTTGCCGCGTTCGACTTCTTCGACGGGGTGGAGAATCCGGCGGCCATGCAACCCCCT
TCGGGACTAACCAGGTCGCCGACCCAGGAAGAGCGGATTGCCAATGCCACCAACAAA
CAGGTGCATCTCTTCCAAGCCGCGGCACAGGACAACAACTTTGCCAGCAACTCCGCC
TTCATCACCAAAGGCCAAATTTCTGGGTCAACCCCAACCATCCAATTCCTTCCACCC
CCCGAAACTAGTAACCTGAACGACGCGACCTACCAGCGTACGCGTGCGCTGGTTCGT
ACCGGTATGGACACGCGTCACCATCACCATCACCATTAGTAAGGATCCGGCTGCTAA
CAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATA
ACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTAT
ATCCGGATATCCACAGGACGGGTGTGGTCGCCATGATCGCGTAGTCGATAGTGGCTC
CAAGTAGCGAAGCGAGCAGGACTGGGCGGCGGCCAAAG
Séquence en acides aminés
MASTPNIAFP AITQEQMSSI KVDPTSNLLP SQEQLKSVST LMVAAKVPAA
SVTTVALELV NFCYDNGSSA YTTVTGPSSI PEISLAQLAS IVKASGTSLR
KFCRYFAPII WNLRTDKMAP ANWEASGYKP SAKFAAFDFF DGVENPAAMQ
PPSGLTRSPT QEERIANATN KQVHLFQAAA QDNNFASNSA FITKGQISGS
TPTIQFLPPP ETSNLNDATY QRTRALVRTG MDTRHHHHHH
82
PapMV NP-12/183
Séquence en acides nucléiques
ATGGCATCCACACCCAACATAGCCAACCTGAACGACGCGACCTACCAGCGTACGCGT
GCGCTGGTTCGTACCGGTATGGACTTCCCCGCCATCACCCAGGAACAAATGAGCTCG
ATTAAGGTCGATCCAACGTCCAATCTTCTGCCCTCCCAAGAGCAGTTAAAGTCAGTG
TCCACCCTCATGGTAGCTGCTAAGGTTCCAGCAGCCAGTGTTACAACTGTGGCATTG
GAGTTGGTTAACTTCTGCTATGACAATGGGTCCAGCGCGTACACCACAGTGACTGGC
CCATCATCAATACCGGAGATATCACTGGCACAATTGGCCAGCATTGTCAAAGCTTCC
GGCACTTCCCTTAGGAAATTCTGCCGGTACTTCGCGCCAATAATCTGGAATCTGAGG
ACGGACAAAATGGCTCCTGCCAATTGGGAGGCCTCAGGATACAAGCCAAGCGCCAAA
TTTGCCGCGTTCGACTTCTTCGACGGGGTGGAGAATCCGGCGGCCATGCGACCCCCT
TCGGGACTAACCAGGTCGCCGACCCAGGAAGAGCGGATTGCCAATGCCACCAACAAA
CAGGTGCATCTCTTCCAAGCCGCGGCACAGGACAATTTAAATGACGCGACCTACCAG
CGTACCCGTGCGCTGGTTCGTACCGGTATGGACAACAACTTTGCCAGCAACTCCGCC
TTCATCACCAAAGGCCAAATTTCTGGGTCAACCCCAACCATCCAATTCCTTCCACCC
CCCGAGACTAGTACCACGCGTCACCATCACCATCACCATTAGTAAGGATCCGGCTGC
TAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGC
ATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAAC
TATATCCGGATATCCACAGGACGGGTGTGGTCGCCATGATC
Séquence en acides aminés
MASTPNIANL NDATYQRTRA LVRTGMDFPA ITQEQMSSIK VDPTSNLLPS
QEQLKSVSTL MVAAKVPAAS VTTVALELVN FCYDNGSSAY TTVTGPSSIP
EISLAQLASI VKASGTSLRK FCRYFAPIIW NLRTDKMAPA NWEASGYKPS
AKFAAFDFFD GVENPAAMRP PSGLTRSPTQ EERIANATNK QVHLFQAAAQ
DNLNDATYQR TRALVRTGMD NNFASNSAFI TKGQISGSTP TIQFLPPPET
STTRHHHHHH
83
PapMV NP-12/C
Séquence en acides nucléiques
ATGGCATCCACACCCAACATAGCCAACCTGAACGACGCGACCTACCAGCGTACGCGT
GCGCTGGTTCGTACCGGTATGGACTTCCCCGCCATCACCCAGGAACAAATGAGCTCG
ATTAAGGTCGATCCAACGTCCAATCTTCTGCCCTCCCAAGAGCAGTTAAAGTCAGTG
TCCACCCTCATGGTAGCTGCTAAGGTTCCAGCAGCCAGTGCTACAACTGTGGCATTG
GAGTTGGTTAACTTCTGCTATGACAATGGGTCCAGCGCGTACACCACAGTGACTGGC
CCATCATCAATACCGGAGATATCACTGGCACAATTGGCCAGCATTGTCAAAGCTTCC
GGCACTTCCCTTAGGAAGTTCTGCCGGTACTTCGCGCCAATAATCTGGAATCTGAGG
ACGGACAAAATGGCTCCTGCCAATTGGGAGGCCTCAGGATACAAGCCAAGCGCCAAA
TTTGCCGCGTTCGACTTCTTCGACGGGGTGGAGAATCCGGCGGCCATGCAACCCCCT
TCGGGACTAACCAGGTCGCCGACCCAGGAAGAGCGGATTGCCAATGCCACCAACAAA
CAGGTGCATCTCTTCCAAGCCGCGGCACAGGACAACAACTTTGCCAGCGACTCCGCC
TTCATCACCAAAGGCCAAATTTCTGGGTCAACCCCAACCATCCAATTCCTTCCACCC
CCCGAAACTAGTAACCTGAACGACGCGACCTACCAGCGTACCCGGGCCCTGGTTCGG
ACCGGTATGGACACGCGTCACCATCACCATCACCATTAGTAAGGATCCGGCTGCTAA
CAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATA
ACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTAT
ATCCGGATATCCACAGGACGGGTGTGGTCGCCATGAT
Séquence en acides aminés
MASTPNIANL NDATYQRTRA LVRTGMDFPA ITQEQMSSIK VDPTSNLLPS
QEQLKSVSTL MVAAKVPAAS ATTVALELVN FCYDNGSSAY TTVTGPSSIP
EISLAQLASI VKASGTSLRK FCRYFAPIIW NLRTDKMAPA NWEASGYKPS
AKFAAFDFFD GVENPAAMQP PSGLTRSPTQ EERIANATNK QVHLFQAAAQ
DNNFASDSAF ITKGQISGST PTIQFLPPPE TSNLNDATYQ RTRALVRTGM
DTRHHHHHH
84
PapMV NP-187/C
Séquence en acides nucléiques
ATGGCATCCACACCCAACATAGCCAACCTGAACGACGCGACCTACCAGCGTACGCGT
GCGCTGGTTCGTACCGGTATGGACTTCCCCGCCATCACCCAGGAACAAATGAGCTCG
ATTAAGGTCGATCCAACGTCCAATCTTCTGCCCTCCCAAGAGCAGTTAAAGTCAGTG
TCCACCCTCATGGTAGCTGCTAAGGTTCCAGCAGCCAGTGTTACAACTGTGGCATTG
GAGTTGGTTAACTTCTGCTATGACAATGGGTCCAGCGCGTACACCACAGTGACTGGC
CCATCATCAATACCGGAGATATCACTGGCACAATTGGCCAGCATTGTCAAAGCTTCC
GGCACTTCCCTTAGGAAATTCTGCCGGTACTTCGCGCCAATAATCTGGAATCTGAGG
ACGGACAAAATGGCTCCTGCCAATTGGGAGGCCTCAGGATACAAGCCAAGCGCCAAA
TTTGCCGCGTTCGACTTCTTCGACGGGGTGGAGAATCCGGCGGCCATGCGACCCCCT
TCGGGACTAACCAGGTCGCCGACCCAGGAAGAGCGGATTGCCAATGCCACCAACAAA
CAGGTGCATCTCTTCCAAGCCGCGGCACAGGACAATTTAAATGACGCGACCTACCAG
CGTACCCGTGCGCTGGTTCGTACCGGTATGGACAACAACTTTGCCAGCAACTCCGCC
TTCATCACCAAAGGCCAAATTTCTGGGTCAACCCCAACCATCCAATTCCTTCCACCC
CCCGAGACTAGTACCACGCGTCACCATCACCATCACCATTAGTAAGGATCCGGCTGC
TAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGC
ATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAAC
TATATCCGGATATCCACAGGACGGGTGTGGTCGCCATGATC
Séquence en acides aminés
MASTPNIAFP AITQEQMSSI KVDPTSNLLP SQEQLKSVST LMVAAKVPAA
SVTTVALELV NFCYDNGSSA YTTVTGPSSI PEISLAQLAS IVKASGTSLR
KFCRYFAPII WNLRTDKMAP ANWEASGYKP SAKFAAFDFF DGVENPAAMR
PPSGLTRSPT QEERIANATN KQVHLFQAAA QDNLNDATYQ RTRALVRTGM
DNNFASNSAF ITKGQISGST PTIQFLPPPE TSNLNDATYQ RTRALVRTGM
DTRHHHHHH
85
PapMV NP12/187/C
Séquence en acides nucléiques
ATGGCATCCACACCCAACATAGCCNNCCTGAACGACGCGACCTACCAGCGTACGCGT
GCGCTGGTTCGTACCGGTATGGACTTCCCCGCCATCACCCAGGAACAAATGAGCTCG
ATTAAGGTCGATCCAACGTCCAATCTTCTGCCCTCCCAAGAGCAGTTAAAGTCAGTG
TCCACCCTCATGGTAGCTGCTAAGGTTCCAGCAGCCAGTGCTACAACTGTGGCATTG
GAGTTGGTTAACTTCTGCTATGACAATGGGTCCAGCGCGTACACCACAGTGACTGGC
CCATCATCAATACCGGAGATATCACTGGCACAATTGGCCAGCATTGTCAAAGCTTCC
GGCACTTCCCTTAGGAAGTTCTGCCGGTACTTCGCGCCAATAATCTGGAATCTGAGG
ACGGACAAAATGGCTCCTGCCAATTGGGAGGCCTCAGGATACAAGCCAAGCGCCAAA
TTTGCCGCGTTCGACTTCTTCGACGGGGTGGAGAATCCGGCGGCCATGCAACCCCCT
TCGGGACTAACCAGGTCGCCGACCCAGGAAGAGCGGATTGCCAATGCCACCAACAAA
CAGGTGCATCTCTTCCAAGCCGCGGCACAGGACAATTTAAATGACGCGACCTACCAG
CGTACCCGTGCGCTGGTTCGTACCGGTATGGACAACAACTTTGCCAGCAACTCCGCC
TTCATCACCAAAGGCCAAATTTCTGGGTCAACCCCAACCATCCAATTCCTTCCACCC
CCCGAAACTAGTAACCTGAACGACGCGACCTACCAGCGTACCCGGGCCCTGGTTCGG
ACCGGTATGGACACGCGTCACCATCACCATCACCATTAGTAAAGATCCGGCTGCTAA
CAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCATAACTAGCATAAC
CCCTTGGGGCCTCTAACGGGTCTTGNGGGGTTTTTG
Séquence en acides aminés
MASTPNIANL NDATYQRTRA LVRTGMDFPA ITQEQMSSIK VDPTSNLLPS
QEQLKSVSTL MVAAKVPAAS ATTVALELVN FCYDNGSSAY TTVTGPSSIP
EISLAQLASI VKASGTSLRK FCRYFAPIIW NLRTDKMAPA NWEASGYKPS
AKFAAFDFFD GVENPAAMQP PSGLTRSPTQ EERIANATNK QVHLFQAAAQ
DNLNDATYQR TRALVRTGMD NNFASNSAFI TKGQISGSTP TIQFLPPPET
SNLNDATYQR TRALVRTGMD TRHHHHHH
86
PapMV 3NP-12
Séquence en acides nucléiques
ATGGCATCCACACCCAACATAGCCAACCTGAacGACGCGACCTACCAGCGCACGCGT
GCGCTGGTTCGTACCGGTATGGACAACCTGAACGACGCGACCTACCAGCGTACGCGT
GCGCTGGTTCGTACCGGTATGGACAACCTGAACGACGCGACCTACCAGCGCACGCGT
GCGCTGGTTCGTACCGGTATGGACTTCCCCGCCATCACCCAGGAACAAATGAGCTCG
ATTAAGGTCGATCCAACGTCCAATCTTCTGCCCTCCCAAGAGCAGTTAAAGTCAGTG
TCCACCCTCATGGTAGCTGCTAAGGTTCCAGCAGCCAGTGTTACAACTGTGGCATTG
GAGTTGGTTAACTTCTGCTATGACAATGGGTCCAGCGCGTACACCACAGTGACTGGC
CCATCATCAATACCGGAGATATCACTGGCACAATTGGCCAGCATTGTCAAAGCTTCC
GGCACTTCCCTTAGGAAATTCTGCCGGTACTTCGCGCCAATAATCTGGAATCTGAGG
ACGGACAAAATGGCTCCTGCCAATTGGGAGGCCTCAGGATACAAGCCAAGCGCCAAA
TTTGCCGCGTTCGACTTCTTCGACGGGGTGGAGAATCCGGCGGCCATGCAACCCCCT
TCGGGACTAACCAGGTCGCCGACCCAGGAAGAGCGGATTGCCAATGCCACCAACAAA
CAGGTGCATCTCTTCCAAGCCGCGGCACAGGACAACAACTTTGCCAGCAACTCCGCC
TTCATCACCAAAGGCCAAATTTCTGGGTCAACCCCAACCATCCAATTCCTTCCACCC
CCCGAAACTAGTACCACGCGTCACCATCACCATCACCATTAGTAAGGATCCGGCTGC
TAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGC
ATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCT
Séquence en acides aminés
MASTPNIANL NDATYQRTRA LVRTGMDNLN DATYQRTRAL VRTGMDNLND
ATYQRTRALV RTGMDFPAIT QEQMSSIKVD PTSNLLPSQE QLKSVSTLMV
AAKVPAASVT TVALELVNFC YDNGSSAYTT VTGPSSIPEI SLAQLASIVK
ASGTSLRKFC RYFAPIIWNL RTDKMAPANW EASGYKPSAK FAAFDFFDGV
ENPAAMQPPS GLTRSPTQEE RIANATNKQV HLFQAAAQDN NFASNSAFIT
KGQISGSTPT IQFLPPPETS TTRHHHHHH
87
PapMV 3NP-C
Séquence en acides nucléiques
ATGGCATCCACACCCAACATAGCCTtCCCCGCCATCACCCAGGAACAAATGAGCTCG
ATTAAGGTCGATCCAACGTCCAATCTTCTGCCCTCCCAAGAGCAGTTAAAGTCAGTG
TCCACCCTCATGGTAGCTGCTAAGGTTCCAGCAGCCAGTGTTACAACTGTGGCATTG
GAGTTGGTTAACTTCTGCTATGACAATGGGTCCAGCGCGTACACCACAGTGACTGGC
CCATCATCAATACCGGAGATATCACTGGCACAATTGGCCAGCATTGTCAAAGCTTCC
GGCACTTCCCTTAGGAAATTCTGCCGGTACTTCGCGCCAATAATCTGGAATCTGAGG
ACGGACAAAATGGCTCCTGCCAATTGGGAGGCCTCAGGATACAAGCCAAGCGCCAAA
TTTGCCGCGTTCGACTTCTTCGACGGGGTGGAGAATCCGGCGGCCATGCAACCCCCT
TCGGGACTAACCAGGTCGCCGACCCAGGAAGAGCGGATTGCCAATGCCACCAACAAA
CAGGTGCATCTCTTCCAAGCCGCGGCACAGGACAACAACTTTGCCAGCAACTCCGCC
TTCATCACCAAAGGCCAAATTTCTGGGTCAACCCCAACCATCCAATTCCTTCCACCC
CCCGAAACTAGTAACCTGAACGACGCGACCTACCAGCGCACGCGTGCGCTGGTTCGT
ACCGGTATGGACAACCTGAACGACGCGACCTACCAGCGTACGCGTGCGCTGGTTCGT
ACCGGTATGGACAACCTGAACGACGCGACCTACCAGCGCACGCGTGCGCTGGTTCGT
ACCGGTATGGACACGCGTCACCATCACCATCACCATTAGTAAGGATCCGGCTGCTAA
CAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATA
ACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGTTTTTG
Séquence en acides aminés
MASTPNIAFP AITQEQMSSI KVDPTSNLLP SQEQLKSVST LMVAAKVPAA
SVTTVALELV NFCYDNGSSA YTTVTGPSSI PEISLAQLAS IVKASGTSLR
KFCRYFAPII WNLRTDKMAP ANWEASGYKP SAKFAAFDFF DGVENPAAMQ
PPSGLTRSPT QEERIANATN KQVHLFQAAA QDNNFASNSA FITKGQISGS
TPTIQFLPPP ETSNLNDATY QRTRALVRTG MDNLNDATYQ RTRALVRTGM
DNLNDATYQR TRALVRTGMD TRHHHHHH
