Optimización de La Producción de Ácido Indolacético

8/17/2019 Optimización de La Producción de Ácido Indolacético

1/33

OPTIMIZACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE ÁCIDOINDOLACÉTICO POR BACTERIAS PROMOTORAS

DE CRECIMIENTO Y EVALUACIÓN DE SU

EFECTIVIDAD BIOLÓGICA EN PAPA

Grupo:01.Equipo: 06.Integrantes:

Sheltzi Natiely Escamilla LuJuan Luis Jaramillo López Ingrid Penélope López Esp

Erika Leticia Sánchez Arre

Universidad Autónoma de Nuevo León

Facultad de Ciencias Químicas

Químico Farmacéutico Biólogo

Unidad de Aprendizaje :Aplicaciones de la microbiología

Evidencia 4

Profesor Responsable: M.C. Julio Silva Mendoza.


2/33

INTRODUCCIÓN


3/33

INTRODUCCIÓN

Tras el descubrimiento del ácido indol-3-acético (AIA) se produjo una explosión de

investigaciones. De inmediato se desarrollaron dos líneas de investigación: una, de

sentido puramente fisiológico, causada por la curiosidad de determinar los

mecanismos de acción de esas sustancias en la planta e interpretar los fenómenos de

crecimiento que producen. La otra línea de investigación se ha enfocado

principalmente a las aplicaciones agrícolas que tienen las fitohormonas

*fitohomona: son sustancias producidas por células vegetales en sitios estratégicos de la planta y estas hormona

de regular de manera predominante los fenómenos fisiológicos de las plantas


4/33

INTRODUCCIÓN

El hecho fundamental, es que modifican el metabolismo de los vegetales logrando resul

favorecen al hombre en su búsqueda incesante de acrecentar la producción de alimento

otros productos de origen vegetal


5/33

PRINCIPALES HORMONAS QUE PROMUEVEN ELCRECIMIENTO

Auxinas Citoquininas Etileno Ácido Abscísico (ABA) Giberelinas (GAs)

ácido indolacético (AIA) , inicia

Replicación celular


6/33

OPTIMIZACIÓN DE ÁCIDO INDOLACÉTICO

La producción de AIA depende de la especie, las cepas, las condiciones de cultivo, concentra

Triptófano, pH 5.5, oxigenación y la fase de crecimiento. La cepa A. brasilense UAP 154 ais

maíz, produce AIA


7/33

MATERIALES Y MÉTODOS


8/33

CUANTIFICACIÓN, Y CARACTERIZACIÓNOPTIMIZACIÓN

Origen de la cepa

Cuantificación ycaracterización de

promotores de crecimientoa partir de extractos de

crecimiento bacteriano pormétodos analíticos.

Optimizacproducción de

establecerproductividad d

de crecim

Evaluación debiológico de e

obtenidos en la oen germinación

diferentes concenplántula

Diferentes concentracionesen plántulas.


9/33

AISLAMIENTO DE PROMOTORES DE CRECIMIEN

Las bacterias promotoras de crecimiento se aislaron a partir deplantas de gramínea (Zea mays) por personal de la compañíaBiorganix Mexicana S. A de C. V. S

Se utilizó el medio de bacterias fijadoras de nitrógeno (Nfb),adicionando:

• 3 g·L-1 de ácido málico• 2 g·L-1 glucosa• 2 mL (solución 10%) de

MgSO4·7H2O• 2 mL (solución 1%) CaCl2·2H2O• 2 mL verde bromocresol (0.5%) y 2

g·L-1 agar.

• 5 g·L1 de sacarosa• 5 g·L-1 de glucosa• 0.2 g·L-1 de MgSO4

• 0.2 g·L-1 de NaCl• 0.2 g·L-1 de CaSO4• 5 g·L-1 de CaCO3

También se utilizo el medio deAshby, adicionando:

*Además, se probó medio Burk y JenseRhizobium y Azotobacter sp


10/33

PRODUCCIÓN DEL ÁCIDO INDOLACÉTICO (AIA)

Se elaboro con:10 g·L-1 de triptona

5 g·L-1 de extracto de levadura

5.8 g·L-1 de NaCl adicionado con triptófano 1 mg·mL-1

Posteriormente, se trasfirieron a 100 mL de medio de cultivo en matraces de 250 mL previamy se dejaron en agitación constante a 150 rpm durante 96 horas a 28°C para la producción

Cuantificación

Se centrifugaron por 10 minutos a 14000 rpm para mantener el caldo libre de células yreactivo de Salkowski (600 mL de H2SO4 18M + 4.5 g de FeCl3 anhidro y se completó hdestilada) en una relación 1:1.

Estos cultivos se incubaron a temperatura ambiente por 30 minutos y se determinó la absorbaun Espectrofotómetro. Se elaboró una curva patrón con AIA sintético a concentraciones d

hasta 0.25 mg·mL-1 .


11/33

CINÉTICA DE FERMENTACIÓN MICROBIANA

Las bacterias se inocularon con 100 µL de la suspensión bacteriana a 540 nm en medio dBertanii (LB).

Se colocaron 100 mL de esta muestra en matraces de 250 mL, las cuales se nombraron codenominaron así por el medio de cultivo utilizado JR2= Jensen de raíz dilución 2, y AR9= A9.

Con tres repeticiones cada una. (JR1, JR2, JR3 y AR91 AR92, AR93). Teniendo así 6 matracemuestras por triplicado ya que una se utilizó para conocer su densidad óptica en espectofo

Thermospectronic) a 540 nm,

Otra se centrifugó a 14,000 rpm por 10 minutos (microcentrífuga, Spectrafuge 16M) y popara determinar el crecimiento microbiano por colorimetría utilizando el reactivo de Salkows18M, + 4.5 g de FeCl3 anhidro y se completó hasta 1 L con agua destilada) en una relació

Por último, se dejó incubando por 30 minutos a temperatura ambiente y después se leyó e

530 nm (Genesys 20, Thermospectronic), realizándose cada tiempo por duplicado.


12/33

OPTIMIZACIÓN DE PARÁMETROS CINÉTICOS PARPRODUCCIÓN DE ÁCIDO INDOLACÉTICO.

Primera cinética de fermentación para obtener tiempo de incubación

Para conocer el tiempo óptimo s e usaron matraces de 250 mL con 100 mL de muestra del caldo de cultivo microbcon un pH de 7.5 Los tiempos que se manejaron para la evaluación fueron cada 8 y 16 horas: 8, 24, 32, 48, 56, 7una muestra de cada repetición, de 1 mL cada una y se colocaron en tubos Eppendorf de 1.5 mL de capacidad.

1. Se leyó la densidad óptica de las muestras en el Espectrofotométro a 540 nm

2. Después, centrifugo las muestras a 14 ,ooo rpm x 10 min y se tomó una alícuota 1 mL

3. Se puso en tubos de ensaye y de éstos se tomaron alícuotas de 500µl por duplicado

4. Se les agregó la misma cantidad del reactivo de Salkowski y se dejaron incubando por 30 minutos a temperse leyeron en espectrofotómetro a 530 nm

Efecto del pH en la producción de AIA

Se evaluaron 6 variables: pH de 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5 y 8.

La cantidad de pH descrita, se ajustó usando Ácido fosfórico para disminuir el valor e Hidróxido de Potasioutilizando un potenciómetro (Denver Instrument UB-10) el cual se ajustó con solución buffer de 4 y 7 al iniciar la eva


13/33

EFECTO DE LA TEMPERATURA EN LA PRODUCCIÓ

La evaluación se consideró como factor A la temperatura y como factor b el pH. La temperatura a evaluar fu30°C y 32°C .

Cada una de estas interactuó con el pH de 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5 y 8.0 con 3 repeticiones cada una. Se utili250 mL de capacidad con 100 mL de muestra cada uno, los matraces se incubaron a las diferentes temperapor el tiempo establecido en la primera cinética de fermentación.

Las alícuotas de 2 mL de cada matraz, (una para el análisis colorimétrico y otra para HPLC), se cuantificaronreactivo de Salkowsky antes descrito. Éstas se evaluaron por duplicado excepto la de 26°C que se hizo por tr

Efecto de la concentración triptófano en la producción de AIA

Se trabajó con seis concentraciones las cuales fueron 100, 200, 500, 1000, 1500 y 2000 mg·L, los matracecon 100 mL de medio de cultivo LB a los cuales se les añadió 50µl de inoculo.

Se incubaron por 80 horas a 32°C con un pH de 7.5. Se realizaron 3 repeticiones de cada concentración, matraces en total. Se tomaron alícuotas de 1 mL por duplicado de cada matraz para analizarlos por la téantes descrita.


14/33

SEGUNDA CINÉTICA DE FERMENTACIÓN MICROBILA PRODUCCIÓN DE ÁCIDO INDOLACÉTICO.

Se realizó una cinética cada ocho horas y los últimos dos tiempos cada 4 horas ,se usaronmatraces de 250 mL con 100 mL de muestra del caldo LB con la concentración de triptófanoóptima y se incubaron (Shaker Fine PCR SV12) a la temperatura óptima y pH óptimo.

Se leyó la densidad óptica de las cuatro muestras de cada tiempo, y se analizó laproducción de AIA por colorimetría.

Purificación parcial del ácido indolacético

Primeramente se centrifugaron las muestras de 1mL de AIA a 14,000 rpm por 10 minutos. Elsobrenadante, posteriormente se

filtro utilizando un sistema de filtración milipore® por 0.2 µm para obtener un caldo defermentación libre de células.

Las muestras ya filtradas se enviaron al CINVESTAV,

Unidad Saltillo, al departamento de Recursos Naturales para el análisis por cromatografíade líquidos de alta presión, HPLC para obtener la cantidad exacta de AIA en la muestra ysu evaluación en plántulas


15/33

EVALUACIÓN DE LA EFECTIVIDAD BIOLÓGICA DINDOLACÉTICO PURIFICADO EN CULTIVOS DE INTERÉS ANIVEL IN VITRO (MICROPROPAGACIÓN IN VITRO DE PAPA)

Medio de Cultivo

Se utilizó fueron las sales inorgánicas del medio Murashige-Skoog con laadición de mio-inositol; glicina, piridoxina, acnicotinico y tiamina comofuentes de vitaminas y aminoácidos, así como sacarosa como fuente decarbono. Este se esterilizó en una autoclave eléctrica a una presión de 1kg/cm2 y a unatemperatura de 121°C durante 15 minutos.

Evaluación del efecto biológico de extractos obtenidos en la optimización

en germinación in vitro a diferentes concentraciones en plántulas.

Para evaluar el efecto del AIA en explantes de papa se utilizó un diseñoexperimental completamente al azar evaluando la exposición del extractobacteriano a diferentes concentraciones (0.25, 0.5, 1.0 y 2.0 ppm), más untestigo.


16/33

Cada evaluación constó de 5 tratamientos

Con tres repeticiones cada uno y cada repetición con 6 plántulas.

Teniendo así 18 plantas por tratamiento, 90 por evaluación.

Este experimento se realizó por duplicado. Las condiciones de incubación fueron de 16:8 hor

oscuridad con temperatura de 25 °C


17/33

VARIABLES EVALUADAS

Altura foliar

Para la altura foliar (AF) se midió en centímetros(cm) con una hoja milimétrica.

Longitud de Raíz

Para conocer la longitud de raíz (LR) de cadavitroplanta se midió en centímetros (cm) con unahoja milimétrica.

Peso fresco y seco de raíces

Para obtener el peso fresco (PF) se cortaron lasraíces de las vitroplantas y se les quitó el excesode agar, se pesó en una balanza analítica, enmiligramos. Después se dejaron secar atemperatura ambiente entre 3 a 5 días para así obtener el peso seco (PS) de la misma manera.


18/33

DISCUSIÓN Y RESULTADOS


19/33

CINÉTICA DE FERMENTACIÓN MICROBIANA

Ambas bacterias tienede AIA

El mayor crecimiento microbiano obtenido por densidad óptica, se encontró a las60 horas para ambas cepas, estabilizándose en las horas posteriores

Referencia: Los gé

demostrado que anitrógeno en forma asisegregan sustancias crecimiento


20/33

Las cepas JR2 y AR9 mostraron la producción a las 80 horas

Referencia: Cepas de Klebsielconcentración más elevada incubación con valores máximo


21/33

Rango de producción de auxina de 3,00 ppm de aislados de los géneros AzotobaAzospirillum sp.

1120 y 1200 ppm de la cepa JR2 y AR9horas respectivamente

Las cepas utilizadas se extienden en u

rango de producción de AIA a los comanteriormente


22/33

CINÉTICA DE FERMENTACIÓN PARA OBTENERTIEMPO DE INCUBACIÓN

Antes de las 80 horas las cepas llegan a su crecimiento máximocon una producción de 1.34 mg•mL-1

Referencia:Producción de AIA de 60 ug•mL-1 0 ug•mL-1 en medio TSB en el sexto

Obtenido:

Producción de AIA de 1340 ug•mLcepa JR2 al tercer día de cultivo utadicionado con triptófano como pr


23/33

EFECTO DEL PH EN LA PRODUCCIÓN DE AIA

pH optimo de producción de AIA fulos cuales no muestran diferencias entre sí con los valores de producció0.85 ug•mL-1 respectivamente

Referencia:Se utilizó medio de cultivo LB con un Para la producción de AIA el pH fuun valor de 6.8 al medio liquido de


24/33

EFECTO DE LA TEMPERATURA EN LA PRODUCCDE AIA

La temperatura optima de producción fuvalor de producción de 0.94 mg•mL-1

Referencia:Se emplearon temperaturas de 28 producción


25/33

CONCENTRACIÓN DE TRIPTÓFANO

No existen diferencias significaticantidades de triptófano con 12000 mg•L-1 de triptofano con vde0.92, 1.00, 0.94 mg•mL-1 respe


26/33

CINÉTICA DE FERMENTACIÓN MICROBIANA PARA LPRODCCIÓN DE ÁCIDO INDOLACÉTICO CON LOSPARÁMETROS CINÉTICOS EVALUADOS

Para corroborar los parámanteriormente, se corrió una cde 7.5, triptófano de 1000

temperatura de 32° C, producción promedio de 0.84 horas


27/33

MICROPROPAGACIÓN IN VITRO DE PAPA

Los resultados del análisis de varianzamuestran diferencias altamentesignificativas (P ≤ 0.05) entre lasconcentraciones de AIA aplicadas almedio de cultivo para las 6 variablesevaluadas, registrando:

altura foliar promedio 4.45 cmlongitud de raices 5.06 cmnúmero de racices 5.51número de explantes 5,2Peso fresco de raices 31.81 mgPeso seco de raíces 3.88 mg


28/33


29/33

LONGITUD DE RAÍCES

Todos los tratamientos evaluados fueron estadísticamente diferentes (P

Estos resultados muestran que la LR se disminuye conformeaumenta la concentración de AIA en el medio de cultivo.

0.25 y 0.5ppm

registraronuna LR de

hasta 5.98 cm.

1.0 ppmregistro una LR

de 2.80 cm.

Testigoregistro una LR

6.93 cm.

Existiedifeent

tratacon AAIA (del 6


30/33


31/33

NUMERO DE RAÍCES

1 y 2ppmregistraron7.22 raíces

0.25 y 0.5registraron5.11 raíces

Testigoregistro

3.58 raíces

Exisdifedel

Estos resultados muestran que el extracto de AIA a una mayor concentración prominducción de raíces comprobándose el efecto auxínico del extracto bacteriano uti

Existe una diferencias significativas (P ≤ 0.05) entre los tratamientos evaluad


32/33

PESO FRESCO RADICULAR

Existe diferencias significativas (P ≤ 0.05) entre los tratamientos evaluad

1.0 ppm seregistro

45.65 mg.

0.25 y 2.0ppm

registraron

40 mg.

0.5 ppmregistro

25.15 mg

Testigoregistro

14.65 mg.

Existe una diferencia entre el mejor tratamiento con AIA(1.0 ppm) y el tratamiento sin AIA (testigo) del 68 %.


33/33

PESO SECO RADICULAR

1 ppmregistro5.73 mg.

0.25 y 0.5ppm

registraron4.16 mg.

2.0

ppmregistro3.39 mg.

Testigoregistro2.28 mg.

Exdifde

Existe una diferencias significativas (P ≤ 0.05) entre los tratamientos evaluad

El PS radicular aumenta conforme aumenta la concentración de AIA en el medio de c

Documents

Optimización de La Producción de Ácido Indolacético