Organismos modificados gen éticamente No autorizados ... · Centro Nacional de Alimentación Jornadas de Referencia. 2014 Análisis de Alimentos. Centro Nacional de Alimentación,

Jornadas de Referencia. 2014 Análisis de Alimentos. Centro Nacional de Alimentación, 10-12 junio

CENTRO NACIONAL DE ALIMENTACIÓN

Organismos modificados genOrganismos modificados genééticamente ticamente

No autorizados. Papaya MGNo autorizados. Papaya MG

Servicio de Biotecnología

Silvia Gil Alcalde

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Jornadas de Referencia 2014 Análisis de Alimentos. Centro Nacional de Alimentación, 10-12 junio

INTRODUCCIÓNCARACTERÍSTICAS:Fruta tropical, origen americanoAlto contenido en azúcar, vit C y carotenoidesAgradable olor aromático

PRINCIPALES PRODUCTORES:Brasil, México, Nigeria, Indonesia, India, Etiopía, Congo, Perú, China y Filipinas.

PRINCIPALES EXPORTADORES:México y Brasil (Mercado USA)USA (Hawai) y Filipinas y Tailandia (Mercado japonés)Brasil (proveedor UE)

Carica papaya L.

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INTRODUCCIÓNUSOS

•Frutos de la papaya madura: se consumen frescos y procesados en forma de mermelada, jalea, dulces, purés…

•Frutos verdes o inmaduros: se añaden como vegetales a las comidas o forman parte de un producto llamado achara*.

•El látex de la papaya verde o inmadura es fuente de papaína utilizada en varios pasos de procesamiento de alimentos como ablandador.También se ha utilizado en la industria farmacéutica y cosmética.

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PRINCIPALES VARIEDADES COMERCIALIZADAS

•Hortus Gold y Honey Gold frutas delgadas de color amarillo dorado.Sur de África

•Solo fruto de Hawai, doble tamaño que surafricanas, pero más pequeña y delgada que la tropical americana.Se ha utilizado para obtener las líneas Sunrise, Sunset, Kapoho solo, Waimanalo,

Higgins y Wilder. Así como las líneas transgénicas SunUp (pulpa roja) y Rainbow

(pulpa amarilla).

•Cartagena, Cedro y Santa Cruz cultivares de América Central, gran tamaño (melón)

•Coorg Honey Dew cultivar típico de la India

•Improved Petersen, Guinea Gold y Sunnybank cultivos mayoritarios de Australia, tamaño intermedio y de pulpa amarilla.

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PROBLEMAS DE LA INDUSTRIA DE LA PAPAYA

INFECCIÓN POR EL VIRUS Papaya ringspot virus (PRSV)

VIDA ÚTIL CORTA

Calidad de los frutos sufre durante almacenamiento, transporte, distribución y venta

Pobre apariencia, textura, sabor y aceptabilidad en general

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En 1940 se descubrió el virus PRSV PRSV responsable de la casi total eliminación de los cultivos de papaya en la isla Oahu años 50. Reubicación de la producción de papaya en distrito de Puna por sus condiciones de pluviosidad, disposición del terreno y libre de PRSV.

ORIGEN DE LA PAPAYA MODIFICADA GENÉTICAMENTE

PRSV (Grupo potyvirus)

PRSV-w Afecta a cucurbitáceas no papaya

PRSV-p El más dañino y extendido. Varios tipos o variedades.

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Plantas infectadas•Pierden capacidad fotosintética•Retraso en crecimiento•Frutos peor calidad (manchas y menor contenido azúcares)

ORIGEN DE LA PAPAYA MODIFICADA GENÉTICAMENTE

PRSV tiene un control difícil y una vez infectada no hay tratamiento eficaz

Se transformaron embriones jóvenes de la variedad “Sunset” con el gen de cubierta proteica del virus PRSV aislado en Hawai. Surgió la línea 55-1 que mostró resistencia al virus.

A mediados años 80 proyecto basado en “resistencia derivada de patógenos”.

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PAPAYA MG: TIPOS CONOCIDOS

Línea 55-1 (resistente a PRSV) se

desarrollaron 2 cultivares:

� SunUpPulpa roja, homocigoto para el gen de la cubierta proteica del virus insertado

� RainbowPulpa amarilla obtenida de híbrido F1 de SunUp y la no transgénica Kapoho.

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EVENTO 55-1 Código identificador: CUH-CP551-8

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EVENTO 63-1No contiene gen gus

Código identificador: CUH-CP631-7

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OTRAS LÍNEAS:

•Huanong No.1

•X17-2 (UFL-X17CP-6)

•KN 116/5

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Num Año Nombre País Comercializada Ensayo

completado

Todavía

en ensayo

Secuencia

disponible

?

1 1998 SunUp USA Si si

2 1998 Rainbow USA Si si

3 2002 Laie Gold USA Si si

4 2004 X17-2 USA No si

5 2006 Huanong 1 China Si si

6 1999 Varias líneas Brasil No no

7 2005 Varias líneas Jamaica No si no

8 2004 Varias líneas Taiwan No si no

9 2005 Varias líneas Tailandia No si no

10 2004 Varias líneas Filipinas No si no

11 2002 Varias líneas Malasia No si no

12 2002 Varias líneas Vietnam No si no

13 2004 Varias líneas Venezuela No si no

14 2002 Varias líneas Indonesia No si no

15 2002 Varias líneas Australia No si no

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GENÉTICA DE LA PAPAYA MG.Elementos utilizados para el desarrollo de papaya MG

�PROMOTOR: 35S (Cauliflower mosaic virus CaMV 35S promoter)

�TERMINADOR: NOS (Nopaline synthase terminator)

�MARCADORES DE SELECCIÓN:

•nptII Secuencia codificante de la enzima NPTII (neomicin phosphotransferase) del Tn5 transposon de E.coli. Confiere resistencia a Neomicina y Kanamicina

•bar Enzima fosfinotricin acetil transferasa (PAT). Resistencia a herbicidas•gus beta-glucuronidasa confiere resistencia a herbicidas•uidA Secuencia que codifica la enzima GUS (B-D-Glucuronidasa) de E.coli•pmi Fosfomanosa isomerasa, marcador de selección antimetabolito

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SITUACIÓN ACTUAL DE LA PAPAYA EN EUROPA

•Enero 2003, Canadá permitió la importación de papaya transgénica.

•La Unión Europea no permite la importación de papaya transgénica en su territorio.

•En 2004 primeros hallazgos de papaya origen Hawai en UE (Busch et al.)

• En 2005, se publican métodos de PCR construcción específica de papaya MG SunUp/Rainbow (eventos 55-1, 63-1)

•A partir de 2010 se han encontrado en el mercado papayas MG no autorizadas. Por el momento no se han desarrollado métodos de control para detección en los productos importados.

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EU Database of Reference Methods for GMO Analysis

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0

5

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15

20

25

30

2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013

year

RASFF Notifications

Estados Unidos(Hawai)

Tailandia(1x Vietnam)

Notificaciones RASFF

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PAÍS NOTIFICACIONES PAÍS NOTIFICACIONES

Alemania 22 abril – RASFF No. 2013.0571

24 abril – RASFF No. 2013.AUZ

3 mayo – RASFF No. 2013.0623

10 mayo – RASFF No. 2013.AXY

18 junio – RASFF No. 2013.0859

3 julio – RASFF No. 2013.0933

22 julio – RASFF No. 2013.BIV

23 julio – RASFF No. 2013.BIW

27 agosto -RASFF No.2013.1176

2 dic – RASFF No.2013.1588

Francia

Luxemburgo

4 julio – RASFF No.2013.0947


9 julio– RASFF No.2013.0968


8 agosto – RASFF No.2013.1100


Bélgica 4 abril – RASFF No. 2013.0474

16 mayo – RASFF No. 2013.0681



2 julio – RASFF No. 2013.BFP

3 julio – RASFF No. 2013.BFR

5 julio – RASFF No. 2013.0953

20 agosto – RASFF No.2013.1149

Austria

Suiza

Grecia


3 dic – RASFF No. 2013.1598

19 abril – RASFF No. 2013.AUL

NOTIFICACIONES AÑO 2013

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Green papaya MG de Tailandia

• CONTIENE : • Promotor P35S• Terminador Tnos

• NO ESTAN PRESENTES:Las construcciones específicas:

P35S-CP (ISO 21569)Pnos-nptII

Presentes en la papaya de Hawai (SunUp/Rainbow)

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Genetic elements and constructs in SunUp papaya

construct-specific detection

Pnos-nptII

T-nosnptIIP-nos T-35SCP (coat protein) gene

P35S T-nosGUSP35S

element-specific detection

by P-35S, T-nos, P-nos methods

(QL-ELE-00-012/13 & §64 LFGB)

construct-specific detection

P35S-CP

ISO 21569 method(annex of Amd 2013)

Offical method§64 LFGB

R. Reiting, unpublished

construct-specificdetection

35S-GUS/GUS-Tnos

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T-nosnptIIPnos T-35S

CP geneP35S T-nos

GusP35S SunUp / Rainbow

(55-1 (Acc.: FJ467933)

nptIIP35S green papayafrom

Thailand

R. Reiting (2010)

construct-specificdetectionP35S-nptII

R. Reiting (unpublished)

construct-specificdetection

P35S-CP & CP-Tnos

CP geneP35S

Detección de construcciones en papaya MG de Tailandia

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T-nosnptIIPnos T-35SCP geneP35S T-nosGusP35S

SunUp 55-1 (Acc.: FJ467933)

T-35SnptIIP35S T-nosCP geneP35SGM papaya fromThailand(according to Reiting)

NGS ofGM papaya from Thailand(according to BVL)

T-nosCP genenptII T-35S blagene

P35S Col1E(pUC19)

Several insertions ?!

Resumen:Construcciones MG detectadas en frutas de papaya importadas de Tailandia

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ORIGEN Evento P35S T-nos P-nos nptII Pnos-nptII

P35S-nptII

P35S-cp

cp-Tnos

cp-T35S

35S-gus

gus-Tnos

Hawai 55-1 + + + + + - + - + + +

Hawai 63-1 + + + + + - + - + - -

Tailandia ?? + + - + - + + + - - -

TABLA RESUMEN

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MÉTODOS DE EXTRACCIÓN

•Preparación de la muestra

•Pelar la fruta y separar la pulpa de las semillas

•Cortar en piezas y lonchas . Secar en estufa a 37ºC 12 horas

•Almacenar a -80º C

•Homogenizar con Nitrógeno líquido

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• Método EN ISO 21571:2002. • 200 mg de muestra triturada • Eluir el extracto de ADN en 60 µl de buffer TE 0.1

MÉTODO CTAB

MÉTODO WIZARD

200 mg de muestra triturada con 860 µl de buffer TNE (5mM Tris-HCL, pH 8.0, 2mM EDTA, 150mM NaCl, 1 % SDS). Añadir 100 µl de clorhidrato de guanidina y 40 µl de proteinasa K.

•Incubar a 58ºC 5 horas, mezclando ocasionalmente.

•La mezcla se centrifuga 10 min a 13000 g.

•Coger 500 µl de sobrenadante y añadir 10 µl de RNasa.

•Incubar 10 min a 65ºC.

•Purificar con las columnas Wizard DNA Clean-Up System (Promega, Madison, USA).

GENESPIN DNA ISOLATION KITPartimos de 200 mg de muestra triturada y siguiendo los protocolos del kit.

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Secuencias génicas analizadas

Kit comercial (GeneScan)

Secuencias C.N.A.

Nº Muestra

Marca Comercial Procedencia Método de Extracción

Gen endógeno (papaina)

Transgen SunupTM

Gen endógeno papaina (211bp)

Sunup af/ar

(152bp)

T-nos (118bp)

P-35s (123bp)

35s-Gus (250bp)

1 Carica Pentágona Brasil CTAB + Nd + Nd Nd Nd Nd

2 Agronol Fruits Canarias CTAB + Nd + Nd Nd Nd Nd

3 Agronol Fruits Canarias CTAB + Nd + Nd Nd Nd Nd

4 Kipapaya Brasil CTAB + Nd + Nd Nd Nd Nd

5 HLB Tropical Food Brasil CTAB + Nd + Nd Nd Nd Nd


7 Cozumel Canarias CTAB + Nd + Nd Nd Nd Nd

8 Cozumel Canarias CTAB + Nd + Nd Nd Nd Nd

9 Fyffes Brasil CTAB + Nd + Nd Nd Nd Nd

10 Caliman Brasil CTAB + Nd + Nd Nd Nd Nd

11 - Brasil CTAB + Nd + Nd Nd Nd Nd

12 - Brasil CTAB + Nd + Nd Nd Nd Nd


14 - Dinamarca CTAB + Nd + Nd Nd Nd Nd

15 Trechas Méjico CTAB + Nd + Nd Nd Nd Nd

ESTUDIOS CNA

Control endógeno papaya positivo: ADN pGSE316 nat (Papaya)Control papaya MG: ADN pGSE644 (SunUpTMpapaya)

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Kits comerciales y materiales de referencia

•Kit for identification of genetically modified papaya. GMOIdentSunUpTM

Eurofins GeneScanRef. 5221103309

•Kit GMOScreen 35S/NOS Eurofins GeneScan Ref. 5221102210 / 5221103510

•Material de Referencia plasmid DNA pGSE644 (SunUpTMPapaya) EurofinsGeneScan 0,15 ml (100 cp/ml) Ref. 5211515401

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ESTADO ACTUAL

•JRC: análisis de secuenciación de las muestras recibidas de German Federal Office y Belgian Wallon Agricultural Research Centre.

•Comparación bioinformática de las secuencias disponibles publicadas de la variedad MG rainbow

•Presencia de muchos elementos genéticos en el nuevo genoma de la papaya:- secuencias de codificación de CP (Coat protein), algunos aparentemente no

funcional- elementos 35S y T-nos - nptII y genes de betalactamasas

La organización de los tres fragmentos de inserción totalmente caracterizados, confirma los resultados de la detección realizada por la Oficina Federal Alemana .

•Algunos suplementos de papaya (cápsulas o comprimidos) se han encontrado elementos positivos 35S, T-nos y nptII

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Servicio de BiotecnologíaMª Isabel Prieto Santos [email protected] 91 3380688Silvia Gil Alcalde [email protected] 91 3380888Josefina Gangoso Herreras Mª Luisa Salvador PulgarEsther Rico CañadaMíriam Gómez MartínMª del Camino Martín ForeroMercedes Fernández de la PueblaMª Isabel Rodríguez Pérez

MUCHAS GRACIAS

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