Ortsgerichtete Mutagenese zur Erstellung von Sequenz

Ortsgerichtete Mutagenese zur Erstellung von

Sequenz-Funktionsbeziehungen von

Acyltransferasen aus der Polyketidbiosynthese

Masterarbeit

zur Erlangung des akademischen Grades

Master of Science in Biochemie

der Naturwissenschaftlichen Fakultät der

Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf

vorgelegt von

Carolin Bisterfeld

Dortmund

2012

Referent: Professor Dr. Jörg Pietruszka

Koreferent: Professor Dr. F. Schulz

Diese Arbeit wurde in der Zeit von April 2012 bis September 2012 unter der Leitung

von Professor Dr. F. Schulz am Max-Planck-Institut für molekulare Physiologie in

Dortmund angefertigt.

Danksagung

Gerne möchte ich all den Personen danken, die diese Arbeit erst möglich gemacht

haben.

Dabei gilt mein größter Dank Herrn Prof. Dr. Frank Schulz, der mir die Möglichkeit

gab, die Arbeit in seinem Institut zu absolvieren und mir dieses faszinierende Thema

überlies, dem ich mich mit viel Freude gewidmet habe. Bei auftretenden Problemen

hast du mich stets unterstützt und mich mit neuen Anregungen und Hilfestellungen

motiviert. Vielen Dank für dein Vertrauen in mich!

Ein großer Dank gilt auch Herrn Prof. Dr. Jörg Pietruszka, der sich bereiterklärt hat

diese Arbeit zu betreuen. Deine Unterstützung und dein Einsatz, auch über die

Entfernung, haben mir sehr geholfen.

Uschi Sundermann danke ich für die Betreuung meiner Arbeit. Du hast mich in

dieses komplexe Thema eingeführt und mir einige Kniffe bei den praktischen

Arbeiten beigebracht. Du hattest stets ein offenes Ohr für mich und durch deine

herzliche und positive Art fühlte ich mich sehr wohl und motiviert. Vielen Dank, du

warst eine fantastische Betreuerin!

Ich möchte auch allen anderen Mitgliedern des Arbeitskreises für die herzliche

Aufnahme und die nette Arbeitsatmosphäre danken. Die Zusammenarbeit mit euch

hat mir sehr viel Spaß gemacht. Ein besonderer Dank gilt hierbei Stephan Klopries,

der mir für die chemischen Arbeiten Platz in seinem Abzug zur Verfügung stellte und

mich bei allen Fragen rund um die Synthese unterstützt hat.

Ein ganz persönliches Dankeschön gilt meinem Freund Tobias, meinen Eltern und

Geschwistern, ohne die mein Studium nicht möglich gewesen wäre. Eure Liebe,

bedingungslose Unterstützung und Fürsorge geben mir stetig neue Kraft und neues

Selbstvertrauen.

Inhaltsverzeichnis | 1

INHALTSVERZEICHNIS

1 EINLEITUNG ....................................................................................................... 6

1.1. Polyketide .................................................................................................. 7

1.1.1. Polyketidsynthasen – Die Biosynthese von Polyketiden ........................ 8

1.1.1.1. Biosynthese von Erythromycin ...................................................... 10

1.1.1.1.1. Spezifität und biotechnologisches Potenzial der

AT-Domäne der Erythromycin-PKS .......................................... 14

2 AUFGABENSTELLUNG ................................................................................... 17

3 ERGEBNISSE UND DISKUSSION ................................................................... 24

3.1. Mutagenese der AT6-Domäne aus DEBS3 ............................................. 24

3.1.1. Wiederherstellung der Wildtyp Aktivität von S. erythraea∆AT6hygR .... 24

3.1.2. Präparation der AT6* Mutanten zur Stereospezifität ........................... 29

3.1.2.1. Sättigungsmutagenese zur Erstellung der

Stereospezifitätsvarianten ............................................................. 29

3.1.3. Restriktionanalyse und Sequenzierung zur Verifizierung der

präparierten Plasmide; Stereospezifität ............................................... 33

3.1.4. Konjugation der AT6* Varianten in S. erythraea∆AT6hygR;

Stereospezifität .................................................................................... 36

3.1.5. Analyse der AT6* Varianten in S. erythraea∆AT6hygR;

Stereospezifität .................................................................................... 36

3.1.5.1. Fermentation in 24-Lochplatten und anschließende

Massenanalyse ............................................................................. 36

3.1.5.2. Fermentation zur präparativen Gewinnung von Erythromycin und

Analyse mittels 1H-NMR ................................................................ 39

3.1.5.3. Fermentation und Aufarbeitung von S. erythraea NRRL-B-24071

(Wildtyp) ........................................................................................ 40

3.1.5.4. Fermentation und Aufarbeitung von erzeugten S. erythraea

Varianten ....................................................................................... 45

3.1.6. Präparation der AT6* Mutanten zur Substratspezifität ......................... 47


3.1.6.1. Sättigungsmutagenese zur Erstellung der AT6* Varianten;

Substratspezifität ........................................................................... 47

3.1.7. Restriktionsanalyse und Sequenzierung zur Verifizierung der

präparierten Plasmide; Substratspezifität ............................................ 49

3.2. Synthese des SNAC aktivierten rac-Methylmalonat 13 ........................... 50

3.3. Fütterungen mit Malonaten ...................................................................... 53

3.4. Abschließende Diskussion ....................................................................... 54

4 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK ........................................................ 57

4.1. Projekt zur Erweiterung der Stereospezifität ............................................ 58

4.2. Projekt zur Erweiterung der Substratspezifität ......................................... 60

4.3. Fütterung mit Malonaten .......................................................................... 60

5 MATERIAL UND METHODEN .......................................................................... 62

5.1. Mikroorganismen, Plasmide, Oligonukleotide .......................................... 62

5.1.1. Mikroorganismen ................................................................................. 62

5.1.2. Vektoren und Plasmide ....................................................................... 62

5.1.3. Oligonukleotide .................................................................................... 64

5.2. Nährmedien ............................................................................................. 68

5.2.1. Nährmedien für S. erythraea ............................................................... 68

5.2.2. Nährmedien für E. coli ......................................................................... 69

5.3. Allgemeine Lösungen und Puffer ............................................................. 69

5.3.1. Antibiotika ............................................................................................ 69

5.3.2. Lösungen für die Plasmid Isolation ...................................................... 70

5.3.3. Lösungen für die Konjugation .............................................................. 70

5.3.4. Lösungen für die Präparation ultra-kompetenter Zellen ....................... 70

5.3.5. Lösungen für die Gelelektrophorese .................................................... 71

5.3.6. Substrat-Puffer für die Fütterung ......................................................... 71

5.4. Enzyme .................................................................................................... 71

5.5. Allgemeine Methoden der Molekularbiologie ........................................... 72


5.5.1. Lagerung und Kultivierung der Mikroorganismen ................................ 72

5.5.1.1. Lagerung von E. coli ..................................................................... 72

5.5.1.2. Lagerung von S. erythraea ............................................................ 72

5.5.1.3. Kultivierung von E. coli .................................................................. 72

5.5.1.4. Kultivierung von S. erythraea ........................................................ 72

5.5.1.5. Screening von S. erythraea in 24-Lochplatten des System

Duetz[53] ......................................................................................... 73

5.5.1.6. Extraktion mit Ethylacetat .............................................................. 74

5.5.1.7. Fermentation zur Gewinnung von Erythromycin in präparativen

Mengen ......................................................................................... 74

5.5.1.8. Extraktion und Aufreinigung von Erythromycin aus

Fermentationskulturen .................................................................. 75

5.5.2. Plasmidpräparation .............................................................................. 76

5.5.3. Ethanol-Präzipitation ........................................................................... 77

5.5.4. PCR-Protokolle .................................................................................... 77

5.5.4.1. Kolonie-PCR ................................................................................. 77

5.5.4.2. Zielgerichtete Mutagenese durch overlap extension PCR ............ 78

5.5.4.2.1. DpnI Verdau des Mutterstranges nach der PCR................... 81

5.5.5. Agarose-Gelelektrophorese von DNA ................................................. 81

5.5.5.1. Konzentrationsbestimmung mittels Gelelektrophorese ................. 82

5.5.6. Aufreinigung von DNA mittels Gelelektrophorese................................ 82

5.5.7. Restriktionsanalyse ............................................................................. 83

5.5.7.1. Restriktionsverdau vor der Polymerase Kettenreaktion ................ 83

5.5.7.2. Restriktionsverdau vor der Klonierung .......................................... 83

5.5.7.3. Kontrollverdau ............................................................................... 84

5.5.8. Klonierungen mittels SLIC-MIX ........................................................... 85

5.5.9. Einbringen genetischer Information in E. coli ...................................... 87

5.5.9.1. Präparation von ultra-kompetenten E. coli-Zellen ......................... 87


5.5.9.2. Transformation durch Hitzeschock ................................................ 88

5.5.10. Einbringen genetischer Information in Actinomyceten mittels

Konjugation ......................................................................................... 88

5.5.10.1. Vorbereitung des E. coli Donorstammes ....................................... 89

5.5.10.2. Vorbereitung des S. erythraea Rezipientenstammes .................... 89

5.5.10.3. Konjugation und Selektion ............................................................ 89

5.5.11. Testung auf antimikrobielle Aktivität .................................................... 90

5.5.12. Sequenzierung .................................................................................... 90

5.5.13. Protokolle zur Mutagenese der AT6-Domäne ..................................... 91

5.5.13.1. Wiederherstellung der Wildtyp Aktivität ......................................... 91

5.5.13.2. Präparation der Stereospezifitäts-Mutanten .................................. 91

5.5.13.3. Präparation der Substratspezifitäts-Mutanten ............................... 93

5.5.13.4. Protokolle zur Konjugation der erzeugten DEBS3AT6*

Expressionsplasmide in S. erythraea∆AT6hygRAT6*;

Stereospezifitätsvarianten ............................................................. 95

5.5.13.5. Screening der Stereospezifitätsmutanten ..................................... 96

5.5.14. Fütterungsexperimente mit Malonaten ................................................ 96

5.6. Allgemeine chemische Methoden ............................................................ 98

5.6.1. Geräte und Chemikalien ...................................................................... 98

5.6.1.1. Geräte ........................................................................................... 98

5.6.1.2. Chemikalien .................................................................................. 98

5.6.2. Chromatographische Verfahren........................................................... 98

5.6.2.1. Säulenchromatographie ................................................................ 98

5.6.2.2. Dünnschichtchromatographie........................................................ 98

5.6.2.3. Präparative Dünnschichtchromatographie .................................... 98

5.6.3. Analytische Verfahren ......................................................................... 99

5.6.3.1. NMR-Spektroskopie ...................................................................... 99

5.6.3.2. Massenspektrometrie .................................................................. 100


5.6.3.2.1. GC-MS ................................................................................ 100

5.6.3.2.2. LC/ESI-MS zur allgemeinen Analyse der Masse ................ 100

5.6.3.2.3. LC/ESI-MS zur Analyse von Fermentationsprodukten ........ 101

5.6.3.2.4. MS/MS ................................................................................ 101

5.6.3.2.5. Hochauflösende Massen Spektrometrie (HRMS) ............... 102

5.7. Synthese des Substrates rac-Methylmalonyl-SNAC (13) ...................... 102

5.7.1. N-(2-mercaptoethyl)acetamid (SNAC) (14) ....................................... 102

5.7.2. 3-(tert-butoxy)-2-methyl-3-oxopropansäure (11) ............................... 103

5.7.3. tert-Butyl-3-((2-acetamidethyl)thio-2-methyl-3-oxopropanat (12) ....... 104

5.7.4. 3-((2-acetamidethyl)thio)-2-methyl-3-oxopropanoat (13) ................... 105

5.7.5. Erythromycin A (7) ............................................................................. 105

6 ABKÜRZUNGEN UND AKRONYME .............................................................. 106

7 REFERENZEN ................................................................................................ 111

8 ANHANG ......................................................................................................... 114

8.1. NMR-Spektren ....................................................................................... 114

9 EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG................................................................ 117

10 STRUKTUREN DER SUBSTANZEN .............................................................. 118

Einleitung | 6

1 Einleitung

Viele der heute verwendeten pharmazeutischen Wirkstoffe sind Naturstoffe oder von

diesen abgeleitet. Mit einem Anteil von 50 % der zugelassenen Medikamente sind

sie nicht mehr aus der heutigen Medizin wegzudenken.[1] Diese enorme Bedeutung

der Natur beruht auf der fantastischen strukturellen und funktionellen Vielfalt an

Substanzen, die darüberhinaus bis heute nur in einem geringen Maß erforscht

wurde. Neben dem pharmazeutischen und auch agrarökologischen Interesse, bieten

die hochkomplexen Substanzen zudem eine Herausforderung für die chemische

Synthese.[2] Es ist also nicht verwunderlich, dass ein großes interdisziplinäres

Forschungsinteresse an Naturstoffen und deren Funktionen besteht.

Die Wirkung einiger pflanzlicher Substanzen war bereits früh erkannt. Die Menschen

nutzten dieses Wissen nicht nur zur medizinischen Versorgung, sondern zum

Beispiel auch als Waffen. So wurde bereits in der Steinzeit das Gift aus Tollkirschen

– Tropan (1) – als Pfeilgift verwendet. Eine der ältesten heute erhaltenen

Aufzeichnungen aus dem Jahre 2600 v.Chr. beschreibt die Gewinnung von

Substanzen aus Myrrhe und Schlafmohn, die auch heute noch als Arzneien

verwendet werden.[3] Ein Meilenstein der jüngeren Naturstoff-Geschichte setzte

Alexander Fleming 1928 mit der Entdeckung des Penicillins (2) aus einem

Schimmelpilz, eines der bis heute bekanntesten Antibiotika.[4] Dies war auch der

Beginn der Nutzung von Bakterien als Quelle für neue Wirkstoffe.

Abbildung 1: Strukturen von Tropan (1) und Penicillin (2).

Heute wird kontinuierlich nach neuen Substanzen mit antibiotischen Eigenschaften

gesucht. Neben den terrestrischen Lebewesen, geraten in den letzten Jahren auch

zunehmend marine Organismen als mögliche Ressource für neue Naturstoffe in den

Fokus. Die Zahl der bekannten Naturstoffe ist dabei stetig angestiegen. So wurden

von 2000-2008 300 Substanzen mit antimikrobieller Wirkung und allein 2008 1065

neue marine Verbindungen beschrieben.[5,6]

Einleitung | 7

Die Nutzung eines Naturstoffes als kommerziellen Arzneistoff setzt die mögliche

Bereitstellung in großen Mengen voraus. Dies ist über eine klassische chemische

Synthese aufgrund der komplexen Strukturen meist sehr aufwendig und kostspielig,

und daher häufig nicht umsetzbar. Die Biotechnologie bietet hier die Möglichkeit

durch Nutzung von einzelnen Enzymen oder ganzen Mikroorganismen die Strukturen

zugänglich zu machen.[7] Zusätzlich können durch die Kombination der

Biotechnologie und chemischer Synthese eine Vielzahl von neuen Derivaten erzeugt

werden. Dies ist besonders bezogen auf die ständig zunehmende Resistenz vieler

Bakterien gegenüber den bisher eingesetzten Antibiotika von großem Interesse.

Hierbei gibt es verschiedene Ansätze. Die Partialsynthese, eine Kombination der

Biotechnologie und chemischer Synthese bietet die Möglichkeit eine Vielzahl von

Derivaten bereitzustellen. Dazu werden Fermentationsprodukte durch nachfolgende

chemische oder enzymatische Syntheseschritte in vitro modifiziert.[8] Ein weiterer

Ansatzpunkt ist die Versorgung der produzierenden Organismen mit modifizierten

Vorstufen.

Durch die enormen Fortschritte der Molekularbiologie rücken auch zunehmend

biochemische Methoden in den wissenschaftlichen Fokus. Durch die

kombinatorische Biosynthese sollen die am natürlichen Syntheseweg beteiligten

Enzyme verändert werden, um somit die Bereitstellung von alternativen,

nicht-natürlichen Produkten zu ermöglichen.[9]

1.1. Polyketide

Eine prominente Klasse der Naturstoffe sind die Polyketide. Diese strukturell und

funktionell hoch heterogenen Substanzen werden hauptsächlich von Bakterien,

Pilzen und Pflanzen gebildet.[10] Es sind Sekundärmetabolite, die unterschiedliche

biologische Funktionen erfüllen. Während sie in Pflanzen zum Beispiel als Farbstoff

dienen, setzen Bakterien sie als Abwehr- oder Botenstoffe ein.[11] Diverse biologische

Aktivitäten (antibiotische, fungizide, antivirale, immunsuppressive, etc.) qualifizieren

viele Polyketide als pharmakologische Wirkstoffe.[12,13,14] Zu den Polyketiden gehören

Polyphenole, Makrolide, Polyene, Endiine und Polyether.[15]

Einleitung | 8

Abbildung 2: Strukturen von Polyketiden, die als pharmazeutische Arzneistoffe eingesetzt werden. Reduzierte Polyketide: Rapamycin (3), Lovastatin (5), Monensin A (6), Erythromycin A (7). Aromatische Polyketide: Doxorubicin (4).

Trotz ihrer enormen strukturellen und funktionellen Diversität haben alle Polyketide

einen gemeinsamen Biosyntheseweg, bei dem erstaunlicherweise das

vergleichsweise einfache Molekül Acetat als Baustein dient.[15] Die Umsetzung zum

komplexen Polyketid erfolgt über eine kontrollierte iterative Abfolge von

decarboxylierenden Claisen-Thioester-Kondensationen, die von Polyketidsynthasen

selektiv katalysiert werden.[15]

1.1.1. Polyketidsynthasen – Die Biosynthese von Polyketiden

Im Jahre 1893 beschäftigte sich James N. Collie mit der Synthese eines Polyketids

und prägte dabei auch den Begriff.[16] Seitdem wurde interdisziplinär geforscht um

den Mechanismus der hochspezifischen Umwandlung von Carbonsäuremonomeren

zu komplexen Substanzen zu entschlüsseln. Es wurde begonnen, die für die

Biosynthese verantwortlichen Enzyme durch Klonierung und Isolierung zu

charakterisieren.[17,18] Nach den ersten Erkenntnissen wurden die Polyketidsynthasen

(PKS) nach ihrer Struktur und ihrem Reaktionsmechanismus in drei Klassen

unterschieden.[19] Die Typ-I-PKS bauen reduzierte Polyketide auf. Es sind riesige

Enzymkomplexe, die sich aus mehreren aneinandergereihten katalytisch aktiven

Einleitung | 9

Modulen zusammensetzen.[15] Die Typ-II-PKS sind bisher nur in Prokaryonten

bekannt und sind für die iterative Synthese aromatischer Polyketide verantwortlich.

Sie bestehen aus kleineren Enzymen, die in einem dissoziierbaren Komplex

angeordnet sind und mehrere Kettenverlängerungen katalysieren. [20] Daneben gibt

es noch die Chalconsynthasen, die in eine dritte Klasse – die Typ-III-PKS –

eingeordnet werden.[15]

Der prinzipielle Ablauf der Polyketidbiosynthese steht in Analogie zu der

Fettsäurebiosynthese. Bei beiden werden aktivierte Acyl-Startereinheiten mit

ebenfalls aktivierten Malony-CoA Derivaten aus dem Primärmetabolismus über

decarboxylierende Claisen-Thioester-Kondensationen zu β-Ketoacylpolymeren

umgesetzt. Dabei bleiben sie über eine Thiolbindung mit dem Enzym kovalent

verbunden.[15]

Abbildung 3: Übersicht der Fettsäure- und Polyketidbiosynthese. Der Aufbau der wachsenden Kette während der Fettsäurebiosynthese erfolgt durch eine Reihe von Claisen-Kondensationen, die durch Ketosynthasen (KS) katalysiert werden. Nach jedem Kondensationsschritt wird die Ketofunktion des so initial synthetisierten β-Ketoesters in drei Schritten vollständig reduziert, bevor die nächste Runde der Kettenverlängerung initiiert werden kann. Bei der Synthese aromatischer Polyketide hingegen entfallen die Reduktionsschritte komplett, sodass der β-Ketoester nicht modifiziert wird. Dies resultiert in einem hochreaktiven poly-β-Ketoester, der in weiteren Reaktionen durch Enzyme cyclisiert wird resultierend in aromatischen Strukturen. Bei reduzierten Polyketiden finden einzelne Reduktionsschritte nur optional statt, wodurch es zu einer Vielfalt aus Hydroxyl-, Carbonylgruppen, Doppelbindungen und Methylengruppen kommt. Abbildung in Anlehnung an Hopwood 1997.

[21]

Einleitung | 10

Der β-Ketoester durchläuft bei den Fettsäuresynthasen (FAS) nach jeder

Kettenverlängerung einen obligatorischen reduktiven Zyklus, katalysiert durch drei

Enzyme.[22] Auch bei den Polyketidsynthasen gibt es drei reduzierende Enzyme,

jedoch sind die reduktiven Schritte bei Typ-I-PKS optional und können teilweise oder

vollständig übersprungen werden. Diese Variabilität resultiert in einer deutlich

komplexeren Strukturdiversität, da sowohl β-Ketone, β-Hydroxyl- oder Enoylgruppen

auftreten können.[23]

Nach der für das spezifische Polyketid notwendigen Anzahl an Verlängerungs-Zyklen

werden die Substrate vom Enzymkomplex abgespalten. Es folgen post-PKS

Prozessierungen, die in den endgültigen Strukturen der Polyketide resultieren.[24] Die

optionalen Reduktionsschritte, sowie die Modifikationen der Primärprodukte

ermöglichen die große Zahl von bisher mehr als 7000 natürlichen Polyketiden.

Da diese Arbeit sich mit der Typ-I-PKS der Erythromycin A (7)-Biosynthese in dem

Bodenbakterium Saccharopolyspora erythraea beschäftigt, wird im Folgenden näher

auf dessen Reaktionsmechanismus eingegangen.

1.1.1.1. Biosynthese von Erythromycin

Die Erythromycin-PKS (DEBS) aus dem Bodenbakterium Saccharopolyspora

erythraea katalysiert die Synthese des 6-Desoxyerythronolid [6-dEB (8)], welches

durch post-PKS Modifikationen zum Erythromycin A (7) umgesetzt wird.[25]

Die DEBS ist ein Archetyp der nicht-iterativen Typ-I-PKS, die als erste modulare PKS

durch Sequenzierung der korrespondierenden Gene identifiziert wurde.[26,27] Es ist

ein multimodulares Enzym, welches zu den größten bisher bekannten Proteinen

zählt. Die einzelnen Module sind an einem linearen Fließband angeordnet, wobei die

Übergänge zwischen den einzelnen Enzymen fließend ineinander übergehen.

Einleitung | 11

Abbildung 4: Grundmechanismen der Erythromycin A (7) Biosynthese.[26,27]

Abkürzungen: ACP: Acylcarrierprotein, AT: Acyltransferase, DH: Dehydratase, ER: Enoylreduktase, KR: Ketoreduktase, KS: Ketosynthase, TE: Terminale Esterase. Die Biosynthese wird von der Polyketidsynthase DEBS katalysiert. Dieser 2 MDa große Multienzymkomplex besteht aus drei Enzymen, DEBS1, 2 und 3, die nicht kovalent miteinander verknüpft als molekulares Fließband agieren. Jedes dieser Enzyme beinhaltet zwei bis drei Module (schwarze Kästen), die kovalent miteinander verknüpft sind. Als Startereinheit dient Propionyl-CoA, welches mit sechs Äquivalenten Methylmalonyl-CoA als Verlängerungsbausteine verknüpft wird. Ein minimales Modul (vgl. Modul 3) besteht aus drei Domänen, die eine Kettenverlängerung um 2 C-Atome inklusive der Seitenkette (resultierend in der Bildung eines β-Ketoesters) katalysieren: Eine Ketosynthase, welche eine decarboxylierende Claisenkondensation katalysiert, eine Acyltransferase welche den Baustein auswählt und diesen auf das Acylcarrierprotein überträgt. Der β-Ketoester kann dann nachfolgend durch die reduktiven Domänen weiter prozessiert werden. Die Anzahl der reduktiven Domänen des jeweiligen Moduls bestimmt hierbei den Grad der Reduktion der wachsenden Kette. Final spaltet eine Terminale Esterase die Polyketidkette vom Enzym ab und ermöglicht eine Zyklisierung. Durch Post-PKS Prozessierungen wie Glykosylierungen und Methylierungen wird die Biosynthese des biologisch aktiven, komplexen Naturstoffes Erythromycin A (7) komplementiert.

Einleitung | 12

Insgesamt codieren drei Gene (eryAI, eryAII und eryAIII) für jeweils ein Enzym

(DEBS1, 2 und 3), die mit je etwa 350 kDa eine außergewöhnliche Größe

besitzen.[17],[28] Jedes DEBS-Enzym setzt sich aus zwei Modulen zusammen, die je

einen Kettenverlängerungsschritt katalysieren. Jedes Modul besteht aus einer

Ketosynthase (KS), einer Acyltransferase (AT) und einem Acylcarrierprotein (ACP),

sowie einer variierenden Zahl von reduktiven Domänen. Zusätzlich gibt es noch ein

Lademodul (bestehend aus einer AT und einem ACP) und die Terminale Esterase

am Ende der PKS (vgl. Abbildung 4). Durch den iterativen Mechanismus der PKS,

wird jedes Modul nur einmal durchlaufen, sodass vom Aufbau der PKS auf die

korrelierende Struktur des Primärproduktes geschlossen werden kann. Dieser

Zusammenhang wird als Prinzip der Kolinearität bezeichnet.[15]

Die ACP-Domänen der DEBS werden posttranslational durch eine

Phosphodiesterbindung eines konservierten Serin-Restes an Coenzym A aktiviert.

Diese Bindung resultiert in einer Konformationsänderung des ACP (inaktive

apo-Form aktive holo-Form), die durch eine Phosphopantetheinyltransferase

(PPTase) katalysiert wird.[29]

Abbildung 5: Aktivierung des ACP durch Coenzym A katalysiert durch eine PPTase. Der Phosphopantetheinarm wird vereinfacht durch eine Wellenlinie mit der aktiven Thiol-Gruppe am Ende dargestellt.

Die AT-Domäne des Lademoduls ist für die Substratauswahl – hier Propionyl-CoA –

verantwortlich. Durch einen nukleophilen Angriff des Thiolrestes wird das Substrat

auf das ACP übertragen und anschließend auf die Ketosynthase des ersten Moduls

transferiert (vgl. Abbildung 6 A). Ketosynthasen katalysieren die Kettenverlängerung

Einleitung | 13

über eine Thio-Claisen-Kondensation, wobei ein β-Ketoester entsteht. Dabei greift

die am ACP kovalent gebundene Verlängerungseinheit Methylmalonyl-CoA die

wachsende Kette an, die zuvor auf die Ketosynthase-Domäne übertragen wurde.

Hierbei liefert die Abspaltung des CO2 die nötige Energie für die Reaktion (vgl.

Abbildung 6 B).

Abbildung 6: Mechanismen der Erythromycin-Biosynthese. A: Wahl der Verlängerungseinheit durch die AT-Domäne und Transfer auf das ACP durch einen nukleophilen Angriff am Beispiel des Moduls 1. B: Kettenverlängerung durch eine carboxylierende Claisen-Kondensation zwischen ACP

und KS am Beispiel des Modul 1.

Die Ketoreduktase (KR), die Dehydratase (DH) und die Enoylreduktase (ER) sind als

optionale reduktive Domänen für die komplexe β-Ketoprozessierungen der Polyketid-

Seitenketten verantwortlich. So wird in den Modulen 1, 2, 5 und 6 jeweils nach der

Kondensation eine Reduktion des β-Carbonyls durch die entsprechende KS

katalysiert. Die selektive Reduktion liefert einen sekundären Alkohol (vgl. Abbildung 7

und Abbildung 8).

Abbildung 7: Mechanismus der Ketoreduktion am Beispiel der KR-Domäne aus Modul 1. Das Diketid an dem ACP wird durch NADPH als Reduktionsmittel aktiviert. Die β-Carbonylgruppe wird durch Wasserstoffbrückenbindungen an ein Tyrosin und ein Serin des aktiven Zentrums stabilisiert. Nach dem nukleophilen Angriff des Hydrid-Ions vom NADPH akzeptiert das Sauerstoffatom ein Wasserstoff vom Tyrosin. Die resultierende sekundäre Hydroxylgruppe ist (R)-konfiguriert.

[30]

Die Dehydratisierung durch die DH-Domäne wird durch eine Histidin-

Asparaginsäure-Dyade im aktiven Zentrum über eine syn-selektive E1cb-Eliminierung

katalysiert. Durch die Eliminierung von Wasser als gute Abgangsgruppe, wird der

Einleitung | 14

sekundäre Alkohol zu einer Doppelbindung reduziert. Die ER-Domäne ist in der Lage

mit dem Cofaktor NADPH als Reduktionsmittel die Doppelbindung weiter zu

reduzieren, was in einer Methylengruppe resultiert (vgl. Abbildung 8).[31]

Abbildung 8: Überblick über die reduktive Schleife innerhalb einer modularen PKS. A: Viertes Modul der Erythromycin-PKS mit allen reduktiven Domänen. B: Reduktive Schritte der KR-, DH- und

ER-Domänen.

Die Abwesenheit von reduktiven Domänen in Modul 3 (vgl. Abbildung 4) resultiert in

der Ketogruppe an Position 9 des 6-Desoxyerythronolid (8). Im vierten Modul findet

eine vollständige Reduktion der entsprechenden Carbonylgruppe durch die KR-, DH-

und ER-Domäne, was in einer Methylengruppe resultiert.

Durch die Terminale Esterase wird die Abspaltung der kovalent gebundenen

Polyketidkette von dem ACP des sechsten Moduls katalysiert. Dadurch wird ein

Carbanion an C1 gebildet, welches vom Hydroxyl-Sauerstoff am C13 nukleophil

angegriffen wird. Das so entstandene 6-dEB (8) wird durch post-PKS Modifikationen

zum Erythromycin A (7) prozessiert. Dabei entsteht über Hydroxylierungen und

Glycosylierungen mit dem Zucker Mycarose und einem Aminozucker die biologisch

aktive Verbindung. Die Intermediate Erythromycin B bis D entstehen durch

nicht-vollständige Prozessierungen, sie kommen nur zu einem geringen Anteil in

Fermentationen von S. erythraea vor.[32]

1.1.1.1.1. Spezifität und biotechnologisches Potenzial der AT-Domäne der

Erythromycin-PKS

Da diese Arbeit sich speziell mit der AT6-Domäne beschäftigt, soll im Folgenden

näher auf die AT-Domänen eingegangen werden.

Die AT-Domänen der Erythromycin-PKS besitzen mit der ausnahmslosen Auswahl

des Methylmalonyl-CoA als Verlängerungseinheit eine sehr hohe Substratspezifität.

Zugleich weisen sie eine erstaunliche Stereoselektivität auf, da sie

Einleitung | 15

interessanterweise einzig das 2(S)-Enantiomer des Methylmalonyl-CoA

einbauen.[33,34] Die entsprechenden Stereozentren des Erythromycin A (7) sind

jedoch ausschließlich (R)-konfiguriert. Somit muss die -Methylgruppe jeweils nach

der ersten, fünften und sechsten Kondensation selektiv epimerisiert werden. Bisher

ist leider noch nicht bekannt, wodurch diese Epimerisierungen kontrolliert werden.

Innerhalb der PKS werden das ACP, sowie die KS-Domänen als mögliche

Katalysatoren diskutiert.[35,36]

Bei Überlegungen zur Erzeugung von Erythromycin-Derivaten, ein zentrales Ziel der

Wissenschaft zur Evaluierung von Leitstrukturen[37], bietet die Spezifität der

AT-Domänen einen aussichtsreichen Ansatzpunkt. Es wurden verschiedene

Methoden zur Etablierung von allgemeingültigen Strategien angewandt.

Dazu gehört zum Beispiel ein Ansatz der kombinatorischen Biosynthese[9], bei dem

durch Substitution der AT-Domänen mit denen alternativer Spezien neue

Polyketid-Varianten erzeugt werden sollen.[38,39,40] Eine bemerkenswerte Arbeit ist

der Aufbau einer Bibliothek aus 61 Analoga von 6-dEB (8) mitunter durch

Austausche der AT-Domänen zwischen der Erythromycin- und der Rapamycin-PKS

in einem gentechnisch veränderten Wirt.[41] Hierbei wurden die Experimente an einer

vollständigen PKS durchgeführt. Da Hybrid-PKS, die aus diesen domain swapping-

Experimenten resultierten, jedoch häufig eine geringere Produktion des gewünschten

Produktes aufweisen als die entsprechenden Wildtypen, konnten die Derivate nicht in

präparativen Mengen erhalten werden.[42,43]

Diese, sowie zahlreiche weitere Swapping-Experimente führten zur erfolgreichen

Generierung von Hybrid-PKS, jedoch resultierten viele Ansätze auch in

nicht-funktionellen Enzymen.[40] Dies liegt vor allem an der Problematik die Modul-

und Domängrenzen zu erkennen und der strukturellen Integrität der erzeugten

Hybrid-PKS.[12]

Eine neue Strategie der kombinatorischen Biosynthese ist die Einführung von

Punktmutationen. Somit werden einige Problematiken wie die Fehlfaltung von

Proteinen bei Swapping-Experimenten umgangen. Es konnten bereits Erfolge dieses

Ansatzes, zum Beispiel durch die Relaxation der Substratspezifität von

AT-Domänen[44], verzeichnet werden. Eine systematische Anwendung von

Punktmutationen ermöglichte einen Zugang zu einer Reihe von neuen

Einleitung | 16

Polyketid-Derivaten.[45] Schwierigkeiten liegen hierbei im Verständnis der

Enzymchemie und der strukturellen Auswirkungen von Aminosäureaustausche.[20]

Daneben ist es ohne Kristallstruktur schwierig sinnvolle Aminosäurepositionen für

einen Austausch zu definieren. Dies kann teilweise durch die Anwendung von

Homologiemodellen umgangen werden. Problematisch bleibt jedoch die Analyse der

resultierenden Ergebnisse, besonders wenn sie nicht den, auf Basis des Modells

gestützten, Erwartungen entsprechen. In der Arbeitsgruppe wurden bereits

Untersuchungen zu Sequenz-Funktionsbeziehungen der AT6 unternommen. Hierbei

wurden auf der Basis von Alignments 14 Positionen identifiziert, die mit der

Substratspezifität bezüglich des Einbaus von Methylmalonyl-CoA versus Malonyl-

CoA korrelieren. Es konnten drei Varianten erzeugt werden, die

2-Desmethylerythromycin (9) liefern.[46]

Abbildung 9: Struktur des 2-Desmethylerythromycin (9). Ein durch Punktmutation erzeugtes

Erythromycin-Derivat.[46]

Aufgabenstellung | 17

2 Aufgabenstellung

Ein wichtiges strukturelles Element der Polyketide ist ihre Stereochemie.

Erythromycin A (7) besitzt allein 18 Stereozentren und damit theoretisch 218 mögliche

Stereoisomere. Tatsächlich ist aber bisher nur ein einzelnes Isomer gefunden

worden.[47]

Abbildung 10: Erythromycin A (7) mit seinen 18 Stereozentren.

Die Stereochemie übt einen großen Einfluss auf die globale Struktur des Moleküls

aus und prägt dessen Funktion bzw. biologische Wirkung entscheidend.[48] Die Natur

hat hier Wege gefunden, nur eine spezifische Struktur zu synthetisieren. Dies wirft

die Frage nach dem mechanistischen Ursprung der Spezifität auf.[49] Die Chemie

beschäftigt sich bereits seit Jahrzehnten mit der Frage, wie die Konfiguration von

Stereozentren kontrolliert werden kann. In den letzten Jahren geriet dabei auch

zunehmend die Biokatalyse in den wissenschaftlichen Fokus.[50] Es wurden Modelle

entwickelt, die die Stereospezifität von Enzymen erklären sollen. Häufig fehlt jedoch

noch das nötige Verständnis, um den Mechanismus vollständig aufzuklären. Bei den

hochkomplexen Polyketidsynthasen ist die Stereochemie der reduktiven Domänen

bereits recht gut verstanden.[30,31] Die AT-Domänen jedoch sind bisher

vergleichsweise schlecht untersucht. Es ist aktuell noch nicht bekannt, ob die

Konfiguration der Seitenkette allein durch die AT-Domänen bestimmt wird, oder ob

weitere Domänen wie beispielsweise die KS oder das ACP auch eine Rolle dabei

spielen.

Die Arbeitsgruppe Schulz beschäftigt sich seit geraumer Zeit mit der

Substratspezifität von Acyltransferasen. Als Modellsystem wurde die AT6-Domäne

der Erythromycin Biosynthesemaschinerie (DEBS) gewählt. Durch vorrangegangene

Untersuchungen von Struktur-Funktionsbeziehungen konnte ein Bild der

Substraterkennung durch die DEBS AT6-Domäne gewonnen werden. So wurde der


Einfluss von verschiedenen Resten auf die Enzymaktivität untersucht. Weitergehend

konnte in der Arbeitsgruppe aufgezeigt werden, dass in Folge einer einzelnen

Punktmutation innerhalb dieser AT6-Domäne in Folge einer Punktmutation die

Substratspezifität relaxiert werden kann, wodurch der Einbau des sterisch

anspruchsvolleren Propargylmalonats ermöglicht wurde.[46] Diese Punktmutation an

der Aminosäureposition Val295 belegt, dass diese in direktem Kontakt mit der

Seitenkette des Substrates steht. Diese Aminosäureposition konnte erst mit Hilfe

eines Modells der substratgebundenen AT6-Domäne – durch Kooperation der

Arbeitsgruppe Schulz mit der Arbeitsgruppe für Theoretische Chemie um Dr. Elsa

Sanchez-Garcia vom MPI für Kohlenforschung entworfen – identifiziert werden.

Abbildung 11: Modellstruktur der DEBS AT6 Region. Die Aminosäuren Met235 (gelb) und Val295 (blau), sowie das Substrat (S)-MM-CoA sind gekennzeichnet. Das Modell stammt vom

Kooperationspartner Kenny Bravo-Rodriguez.

Das Modell zeigt, dass die Seitenkette des Malonats auf das Val295 zeigt. Basierend

auf den experimentellen Daten erfolgte eine nähere Auswertung des Modells,

resultierend in einer möglichen Erklärung zum ausschließlichen Einbau des

(S)-Methylmalonats. Ein auf Basis eines Modells getroffenes Ergebnisbild ist zwar

recht suggestiv, jedoch konnte durch erfolgreiche Mutagenese-Experimente die

Qualität der modellierten Struktur bestätigt werden. Die Aminosäure Val295 besitzt

also eine Wirkung auf die Substraterkennung jenseits der offensichtlichen

suggestiven Grafikdarstellung. Eine weitere Deutung des Modells zeigte auf, dass

die Aminosäuren Val295 und Met235, die in der Substratbindetasche gegenüber


liegen, aller Wahrscheinlichkeit nach ein Einbau des (R)-Methylmalonats

ausschließen. Es wurden Modelle berechnet, bei denen die Substratbindung im

nativen Zustand und bei einem Austausch der Aminosäuren Val295 und Met235

untersucht wurden. Die Berechnungen weisen darauf hin, dass die Variante

Val295Met & Met235Val in der Lage sein könnte das (R)-Methylmalonat einzubauen.

Abbildung 12: Aktives Zentrum der AT6. Wildtyp mit Met235 (gelb), Val295 (blau) und (S)-MMCoA.

Abbildung 13: Aktives Zentrum der AT6. Doppelmutante Met235Val (blau), Val295Met (gelb) und (R)-MMCoA.

Auf Basis dieser Ergebnisse entwickelte sich das Projekt dieser Arbeit. Ziel war es

eine Variante der AT6 zu generieren, die das Substrat (R)-Methylmalonat akzeptiert

und einbaut. Dabei war es sinnvoll sich auf die AT6 zu konzentrieren, da hierzu in

der Arbeitsgruppe bereits Untersuchungen gemacht wurden und daher ein Spektrum

aus verschiedenen Methoden zur Mutation entwickelt worden ist. Zudem wurde das


Modell auf der Basis der AT6-Domäne entwickelt. Es wurde eine Bibliothek von

Enzymvarianten konstruiert, die auf die Aminosäurepositionen Val295 und Met235

fokussiert ist.

Tabelle 1: Geplante Bibliothek der Enzymvarianten zur Stereospezifität.

Einzelaminosäureaustausche Doppelaminosäureaustausche

# 235 295 # 235 295

WT Met Val #667 Val Met

#665 Met Met #668 Gly Met

#660 Val Val #669 Ile Met

#661 Gly Val #670 Leu Met

#662 Ile Val #671 Ala Met

#663 Leu Val #672 Val Glu

#664 Ala Val #673 Gly Glu

#666 Met Glu #674 Ile Glu

#675 Ala Glu

#676 Leu Glu

Neben dem doppelten Aminosäureaustausch Met235Val & Val295Met sollten für die

Position Met235 einige hydrophobe Aminosäuren ausgewählt werden, die

möglicherweise einen Einfluss auf die Substratbindung haben könnten. Als sterisch

anspruchsvoller Ersatz für Val295 soll Glutamat eingesetzt werden.

Zur Untersuchung der Enzymvarianten ergaben sich bei der Planung eines

geeigneten Screeningsystems einige Schwierigkeiten. So wurde auf eine Analyse in

einem vereinfachten System aus isolierten Enzymen verzichtet, da aufgrund der

komplexen Enzymaschinerie die auf diesem Wege gewonnenen Ergebnisse häufig

nicht auf die Produktion in vivo übertragbar sind.[51] Daher soll die Analyse durch

Produktion von Erythromycin im natürlichen Produzenten S. erythraea erfolgen.

Hierbei stellte sich jedoch ein anderes Problem dar. Wie bereits in der Einleitung

erwähnt findet eine Epimerisierung der Stereozentren des (S)-Methylmalonats statt,

die bisher noch nicht vollständig verstanden ist. Sollte hierbei die KS-Domäne einen

Einfluss haben, ist nicht klar was passiert, wenn die AT-Domäne das (R)-Enantiomer

des Substrates einbaut. Zusätzlich ist noch zu beachten, dass S. erythraea zwar

natürlich das (R)-Methylmalonat nicht bei der Biosynthese von Erythromycin A (7)

einbaut, jedoch wird dieses für andere Stoffwechselwege verwendet. Es ist eine

Racemase im Organismus zu finden, die die beiden Enantiomere ineinander

umwandeln kann.[52]


Der Einbezug des globalen Kontexts einer intakten PKS in sämtlichen

Untersuchungen hat hierbei den Preis eines Screeningsystems mit einem komplexen

Auslesen der Resultate, da eine Observable mehrere Determinanten enthält. Die

Mutanten der AT6-Domäne werden in vitro durch zielgerichtete Mutagenese erzeugt

und durch einen Vektor und einen Donorstamm mittels intergenetischer Konjugation

in S. erythraea eingebracht. Durch Fermentation sollen präparative Mengen des

putativen Erythromycin-Stereoisomers zugänglich gemacht werden. Bei der

Doppelmutante Val295Met & Met235Val sollte die Aktivität der PKS vollständig

inaktiv sein, außer die Konzentration des in vivo produzierten (R)-Methylmalonats ist

groß genug, um als Substrat zur Verfügung zu stehen. Da dies jedoch als eher

unwahrscheinlich betrachtet wird, soll mit einer Fütterung mit rac-Methylmalonyl-

SNAC (13) komplementiert werden. Der einfachste Nachweis, ob bei einer

Enzymvariante das (R)-Methylmalonat eingebaut wurde resultierend in einer

Konfigurationsänderung des Zielmoleküls, ist durch eine NMR-Analyse des

produzierten Erythromycin-Derivates.

Insgesamt sollen also S. erythraea_AT6* Varianten erzeugt und fermentiert werden.

Erythromycin soll aus den Fermentationskulturen extrahiert und isoliert werden, um

mittels 1H-NMR analysiert zu werden. Zur Vorauswahl geeigneter Kandidaten der

präparativen Fermentation soll eine Kultivierung der S. erythraea_AT6* Varianten in

24-Lochplatten des System Duetz durchgeführt werden. Die Fermentationsprodukte

sollen mittels LC/ESI-MS analysiert werden, um die Produktion von Erythromycin

festzustellen. Das Substrat rac-Methylmalonyl-SNAC (13) zur Fütterung soll dabei

über eine chemische Synthese im Rahmen dieser Arbeit hergestellt werden. Die

Synthese des enantiomerenreinen (R)-MM-SNAC ist in diesem Fall nicht sinnvoll, da

es durch die oben erwähnte Racemase des Organismus epimerisiert werden würde.

Somit kann auf eine deutlich anspruchsvollere enantiomerenreine Synthese

verzichtet werden.


Abbildung 14: Syntheseplanung des Substrates rac-Methylmalonyl-SNAC (13).

Ausgehend von tert-Butylpropionat (10) soll über eine Carboxylierung mit CO2 die

geschützte Methylmalonsäure 11 hergestellt werden. Im Anschluss soll diese mit

SNAC (14) gekoppelt werden. SNAC (14) ist ein Coenzym A Mimetikum, welches die

Malonsäure aktiviert. Die Vorteile gegenüber Coenzym A sind die

Membrangängigkeit, sowie die deutlich einfachere und preiswertere Synthese. Als

letzten Schritt folgt die Entschützung des Substrates 13.

Ein weiteres Ziel dieser Arbeit ist die Erweiterung der Substratspezifität der

AT6-Domäne. Dazu wurde, aufbauend auf den Ergebnissen von Uschi

Sundermann[45], eine Bibliothek von Enzymvarianten geplant. Durch

Mutageneseexperimente zeigte sich, dass die Aminosäurepositionen Tyr297 und

Ser299 ebenfalls in direktem Kontakt zum akzeptierten Substrat stehen. Durch

spezifische Aminosäureaustausche an diesen beiden Positionen konnte der Einbau

von Propargylmalonat erzielt werden. Erstaunlich ist, dass eine Mutation von nur

einer der beiden Positionen nicht zu diesem Ergebnis führte. Diese Ergebnisse

stimmen ebenfalls mit dem Modell der AT6 überein und bestätigten dessen Wert.[46]

Um eine mögliche Erweiterung der Substratakzeptanz zu erreichen, wurde eine

Bibliothek geplant, die auf diesen Aminosäurepositionen fokussiert ist. Auch hier

sollten die Mutationen durch Sättigungsmutagenese eingebracht werden. Das

Screening sollte über Fermentationen von S. erythraea in 24-Lochplatten des System

Duetz mit Fütterung von Propargylmalonat und anfolgender Analyse der

Erythromycin-Derivate über LC/ESI-MS erfolgen.


Tabelle 2: Geplante Bibliothek von Enzymvarianten zur Substratspezifität.

Tyr297X Ser299X

Val -

His -

Ala Ala

Gly Gly

Leu Leu

WT WT

Des Weiteren soll eine Untersuchung von S. erythraea zur Aufnahme von nicht

aktivierten Malonaten stattfinden. Dazu sollen der S. erythraea WT (NRRL-B-24071)

und die Mutante S. erythraea∆AT6hygR_pKSSU656 (Val295Ala) fermentiert werden.

Diese AT6 Variante baut neben Methylmalonat auch Propargylmalonat ein und weist

damit eine erweiterte Substratspezifität auf. Aufgrund fehlender Crotonylreduktase-

Aktivität ist Ethylmalonyl-CoA nicht in S. erythraea vorhanden.[40] Um zu testen, ob

diese Mutante auch Ethylmalonat akzeptiert, soll daher eine Fütterung der Kulturen

mit Diethylethylmalonat (15) erfolgen. Zusätzlich soll auch Diethylpropargylmalonat

(16) gefüttert werden, um einen Vergleich der Einbauraten zu der SNAC-aktivierten

Malonsäure zu erhalten und somit eine Kontrolle bezüglich fehlender SNAC-

Aktivierung zu generieren. Eine Analyse der Fermentationsprodukte soll zeigen, ob

die Malonate – auch ohne Aktivierung – eingebaut werden können.

Abbildung 15: Strukturen von Diethylethylmalonat (15) und Diethylpropargylmalonat (16).

Ergebnisse und Diskussion | 24

3 Ergebnisse und Diskussion

3.1. Mutagenese der AT6-Domäne aus DEBS3

Die Mutagenese der AT6-Domäne aus DEBS3 stellt durch die hohe Komplexität des

Enzymes eine große Herausforderung dar. In der Arbeitsgruppe konnten durch

intensive Forschungsarbeit ein Spektrum an gentechnischen Methoden zum

Einbringen von zielgerichteten Mutationen in die PKS etabliert werden. Diese werden

zur Erzeugung der Stereo- und Substratspezifitätsvarianten in diesem Projekt

angewandt. Die erzeugten AT6 Varianten werden nicht heterolog in Wirten, sondern

in S. erythraea, dem Erythromycin-Originalproduzenten exprimiert.

3.1.1. Wiederherstellung der Wildtyp Aktivität von S. erythraea∆AT6hygR

Der Stamm S. erythraea∆AT6hygR, der in dieser Arbeitsgruppe konstruiert wurde, ist

nicht in der Lage Erythromycin zu bilden, da das Enzym DEBS3 durch das Inserieren

der Hygromycin-Kassette an die Position der AT6-Domäne inaktiv ist. Das Plasmid

pKSSU89 wurde ebenfalls in der Arbeitsgruppe konstruiert, um eine schnelle und

gezielte Integration in das Genom der Actinomyceten zu erzielen. Es trägt eine

vollständige DEBS3 kodierende Gensequenz, einen Actinorhodin-Promotor (actII),

eine Apramycin Resistenzkassette sowie eine attP Integrasebindestelle des

Bakteriophagen VWB (für eine gezielte Integration in das Genom von

Actinomyceten).

Abbildung 16: Shuttle-Vektor pKSSU89. Die Aminosäurepositionen Val295 und Met235, sowie die NotI Schnittstellen sind gekennzeichnet.

Wird dieser Vektor (pKSSU89) in den Stamm S. erythraea∆AT6hygR transformiert, so

kann er über die Integrasebindestelle an das Genom binden. Dabei wird der Vektor

in das Genom integriert. Dieser Vorgang ist jedoch nicht dauerhaft stabil und kann

pKSSU89


auch wieder rückgängig gemacht werden. Aus diesem Grund muss bei der

Kultivierung der Selektionsdruck mit dem entsprechenden Antibiotikum aufrecht

gehalten werden.

Ist der Vektor in das Genom von S. erythraea∆AT6hygR integriert, so ist der Stamm

wieder in der Lage Erythromycin zu bilden. Das durch den Vektor pKSSU89 kodierte

Enzym DEBS3 übernimmt das Intermediat, welches von DEBS1 und 2 produziert

wurde. Wird der Vektor pKSSU89 innerhalb der AT6 kodierenden Region vor der

Konjugation mutiert (AT6*), können S. erythraea Mutanten erzeugt werden, die einen

Aminosäureaustausch innerhalb der AT6-Domäne aufweisen (S. erythraeaAT6*).

Hierbei ist es notwendig die S. erythraea∆AT6hygR Mutante zu verwenden, um den

natürlichen Produktionsweg von Erythromycin zu unterbinden und so sicherzustellen,

dass die DEBS3 Variante das Intermediat weiter prozessiert.

Zuerst mussten ausreichende Mengen des Vektors pKSSU89 generiert werden.

Dazu wurde die Plasmid-DNA mittels alkalischer Lyse isoliert. Die erhaltene DNA

wurde mittels Kolonie-PCR, sowie Restriktionsanalyse mit dem Enzym NotI

verifiziert.

Abbildung 17: Kolonie-PCR von pKSSU89 tragenden Transformanden.

Um S. erythraeaAT6_pKSSU89 zu generieren – sprich Wildtyp Aktivität

wiederherzustellen – musste der Vektor pKSSU89 zuerst in E. coli

ET12567/pUZ8002 Zellen transformiert werden. Positive Klone (Selektion über

entsprechende Antibiotika) wurden anschließend als Donorstamm für eine

intergenetische Konjugation in S. erythraea∆AT6hygR Zellen eingesetzt. Die

Transkonjuganten wurden durch Überschichtung mit antibiotikahaltigem LB-Agar

identifiziert.

5.0 kb

1.5 kb

1.0 kb

0.5 kb


Zur Überprüfung der Erythromycin-Produktion der Stämme S. erythraea

NRRL-B-24071, S. erythraea∆AT6hygR und S. erythraea∆AT6hygR_pKSSU89 sollte

zunächst ein Hemmhoftest durchgeführt werden. Dazu wurden Proben von

Fermentationskulturen der Stämme in ausgestanzte Löcher einer Agarplatte

gegeben. Bacillus subtilis diente hierbei als Referenzstamm.

Abbildung 18: Untersuchung der antimikrobiellen Aktivität durch einen Hemmhoftest unter Verwendung von Bacillus subtilis als Referenzstamm. Die Fermentationskultur des Wildtyps erzeugt eine deutlich sichtbare Wachstumsinhibitionszone, wohingegen bei S. erythraeaΔAT6hyg

R

keine Ausbildung einer Inhibitionszone zu beobachten ist.

Anhand der Abbildung 18 ist zu erkennen, dass der Stamm S. erythraea

NRRL-B-24071 (Wildtyp) einen Hemmhof aufweist. Durch vorhandenes Erythromycin

wird Bacillus subtilis am Wachstum gehemmt. Der Stamm S. erythraea∆AT6hygR

dagegen weist erwartungsgemäß keinen Hemmhof auf, da hier die Produktion von

Erythromycin durch die Hygromycin-Kassette inaktiv ist. Der Stamm

S. erythraea∆AT6hygR_pKSSU89 sollte ebenfalls einen Hemmhof aufweisen, da

durch die Integration der Vektor-DNA die Fähigkeit zur Produktion von Erythromycin

wiederhergestellt sein sollte. Auf der Platte ist jedoch nur ein minimaler Hemmhof

erahnbar. Da gentechnisch veränderte S. erythraea Kulturen häufig eine geringere

Produktion als der Wildtyp aufweisen, wurde eine nähere Analyse durch eine

LC/ESI-MS Messung durchgeführt.

Für die LC/ESI-MS Messungen wurden die Fermentationsprodukte aus den Kulturen

mit Ethylacetat extrahiert. Nach Entfernen des Lösungsmittels wurden die Proben in

Methanol aufgenommen und der Massenanalyse unterzogen. Dabei konnte eindeutig

detektiert werden, dass der S. erythraea Wildtyp NRRL-B-24071 Erythromycin

produziert [vgl. Abbildung 19 (A)], wohingegen die Fermentation der DEBS3

S. ery∆AT6hygR_

pKSSU89

S. ery∆AT6hygR

S. ery WT


inaktiven Variante S. erythraeaΔAT6hygR kein Erythromycin aufweist [vgl. Abbildung

19 (B)].

Abbildung 19: LC/ESI-MS Daten der Ethylacetatextrakte aus Fermentationen des S. erythraea Wildtyps NRRL-B-24071 (A) und S. erythraeaΔAT6hyg

R (B). Erythromycin eluiert mit einer

Retentionszeit von 6.84 min und ist lediglich bei der Fermentation des Wildtyps nachweisbar.


Die Analyse der Messungen der S. erythraea∆AT6hygR_pKSSU89 Fermentationen

zeigt, dass die Erythromycin-Produktion wiederhergestellt ist.

Abbildung 20: LC/ESI-MS Analyse des wiederhergestellten Wildtyps S. erythraea ∆AT6hyg

R_pKSSU89. Die zwei Abbildungen zeigen Unterschiede im Erythromycin-

Produktionsniveau verschiedener Klone.


Bei der Analyse von mehreren Klonen der Mutante zeigen sich Unterschiede im

Produktionsniveau von Erythromycin. Diese hohe Klon-zu-Klon Variabilität ist typisch

für gentechnisch veränderte S. erythraea Stämme.[46]

3.1.2. Präparation der AT6* Mutanten zur Stereospezifität

Die Präparation der Sterospezifitätsvarianten Bibliothek – fokussiert auf die

Positionen Val295 und Met235 – erfolgte mittels Sättigungsmutagenese. Der Vektor

pKSSU89 trägt die vollständige DEBS3 Gen-Kassette und wird in der PCR als

Template verwendet. Die Enzymvarianten sollten mittels spezifisch definierten

Oligonukleotiden erzeugt werden, um aussagekräftige Datensätze mit einem

praktikablen Screening-Aufwand zu erhalten. Die präparierten PCR-Produkte sollten

in einen E. coli Shuttle-Vektor pKSSU96 (basiert auf pKSSU89 Vektor, AT6 Region

durch eine Hygromycin-Resistenz Kassette ausgetauscht, DEBS3 inaktiv) kloniert

werden. Die resultierenden wiederhergestellten pKSSU89* Plasmide sollten dann in

S. erythraea∆AT6hygR konjugiert werden, um das inaktive DEBS3 zu

komplementieren.

3.1.2.1. Sättigungsmutagenese zur Erstellung der Stereospezifitätsvarianten

Die Präparation der Einzelaminosäureaustausche erfolgte zuerst. Dazu wurden die

entsprechenden Oligos in der zweistufigen overlap extension PCR eingesetzt.

Abbildung 21: Schema zum Arbeitsablauf der zielgerichteten Mutagenese am Beispiel der Mutation Met235Val.

Da nicht immer eine nebenproduktfreie Amplifizierung möglich war, wurde nach

beiden PCR Durchgängen eine Gelaufreinigung durchgeführt.


Abbildung 22: Sättigungsmutagenese mittels overlap extension PCR. Die Fragmente (M1 und

M2) der Konstrukte #660-666 wurden in zwei separaten PCR assembliert.

Nach der Gelaufreinigung der PCR-I-Produkte wurden die Teilstücke M1 und M2 in

der zweiten PCR zur Amplifizierung der gewünschten Zielsequenzen eingesetzt.

Anhand der Gelelektrophorese konnten die Produkte (P) mit einem Molekulargewicht

von etwa 1.7 kb bestimmt werden.

Abbildung 23: Zweite PCR der overlap extension PCR. Die Produkte (P) der Mutationen #660-666

wurden mit den entsprechenden Fragmenten (M1 und M2) assembliert.

Für die Klonierung wurde der Vektor pKSSU96, bei dem die AT6 Region durch eine

Hygromycin-Kassette ausgetauscht wurde, verwendet. Die Hygromycin-Kassette ist

mit ScaI Schnittstellen flankiert und kann somit durch einen Verdau mit diesem

Restriktionsenzym entfernt werden. Die Klonierung mittels SLIC-MIX resultiert

anschließend in pKSSU89* Vektoren, die die spezifische Mutation AT6* tragen.

M1 M2

5.0 kb

1.5 kb

1.0 kb

0.5 kb

M1

5.0 kb

1.5 kb

1.0 kb

0.5 kb

P


Abbildung 24: Vektor pKSSU96 für die Klonierung mittels SLIC-MIX. Die Hygromycin-Kassette (blau), sowie die Schnittstellen der Restriktionsenzyme ScaI und FseI sind gekennzeichnet.

Nach erfolgter Klonierung und Transformation in E. coli OmniMAX™ 2 T1 Zellen

wurde am darauffolgenden Tag zur Identifizierung potenziell richtiger (Insert-

tragender) Klone eine Kolonie-PCR durchgeführt. Hierbei bindet ein Oligonukleotid

spezifisch innerhalb des Inserts, wohingegen das zweite Oligonukleotid an DEBS3

annealt. Somit ist eine Kontrolle des positiven Einbaus des Inserts gewährleistet.

Abbildung 25: Kolonie-PCR zur Identifizierung Insert-tragender Klone (#660-666). Die 1.7 kb

großen PCR Produkte konnten in allen untersuchten Klonen nachgewiesen werden.

Die ausgewählten Klone sind hier meist positiv, wodurch bestätigt wird, dass die

Klonierung mit der SLIC-MIX Methode sehr zuverlässig ist. Die Klone wurden

weitergehend mittels Restriktionsanalyse mit dem FastDigest Enzym NotI und einer

Sequenzierung verifiziert (vgl. 3.1.3).

Die Plasmide wurden über eine Miniplasmidpräparation isoliert und als Template für

die Präparation der Doppelaminosäureaustausche eingesetzt. Dazu wurde erneut die

overlap extension PCR mit den entsprechenden Oligonukleotiden eingesetzt. Es

5.0 kb

1.5 kb

1.0 kb

0.5 kb

pKSSU96


erfolgte nach den beiden PCR Durchgängen je eine Gelaufreinigung der DNA-

Fragmente.

Abbildung 26: Sättigungsmutagenese mittels overlap extension PCR. Die Fragmente (M1 und M2) wurden in zwei separaten PCR generiert. A: Produkte der Konstrukte #667-671. B: Produkte der

Konstrukte #672-676.

Die Fragmente M1 und M2 wurden in der zweiten PCR eingesetzt, resultierend in

den Konstrukten #667-676. Die Konzentration der Produkte (P) wurde mittels

Agarosegelelektrophorese bestimmt. Die Kontrukte #667-671 konnten mit einer

Konzentration von 42 ng/µl und #672-676 mit einer Konzentration von 27 ng/µl nach

der Gelaufreinigung isoliert werden. Die Produkte wurden mittels SLIC-MIX in den

Vektor pKSSU96 kloniert und anschließend in E. coli OmniMAX™ 2 T1 Zellen

transformiert.

Abbildung 27: Zweite PCR der overlap extension PCR. Die Produkte (P) mit einer Größe von 1.7 kb der Mutationen #667-671 (A) und #672-676 (B) wurden mit den entsprechenden Fragmenten

M1 und M2 assembliert.

Zur Kontrolle Insert-tragender Klone wurde eine Kolonie-PCR durchgeführt. Die hohe

Zahl an positiven Transkonjuganten ist anhand von Abbildung 28 zu sehen. Analog

A) B)

B) A)

M1 M2 M1 M2

P P

5.0 kb

1.5 kb

1.0 kb

0.5 kb

5.0 kb

1.5 kb

1.0 kb

0.5 kb


zu den Einzelaminosäureaustauschen erfolgte hier die weitere Kontrolle über eine

Restriktionsanalyse mit dem FastDigest Enzym NotI und einer Sequenzierung der

isolierten Plasmid-DNA (vgl. 3.1.3).

Abbildung 28: Kolonie-PCR zur Identifizierung Insert-tragender Klone (#667-676). Die PCR-

Produkte (1.7 kb) sind in allen untersuchten Klonen sichtbar.

3.1.3. Restriktionanalyse und Sequenzierung zur Verifizierung der

präparierten Plasmide; Stereospezifität

Der Restriktionsverdau der präparierten Plasmide pKSSU89* wurde mit dem

FastDigest Enzym NotI durchgeführt. Die Plasmide enthalten drei Schnittstellen, falls

das Insert erfolgreich kloniert wurde. Somit ergeben sich bei positiven Klonen drei

DNA-Fragmente mit einer Größe von etwa 8.5 kb, 6.6 kb und 1.6 kb. Eine

Gelelektrophorese zeigt den erfolgreichen Verdau und damit auch den positiven

Einbau des amplifizierten Inserts (im Vergleich zu 2 Schnittstellen des pKSSU96

ohne Insert) (vgl. Abbildung 29).

Abbildung 29: Restriktionsanalyse der pKSSU89* Plasmide mit den erzeugten AT6* Varianten. Durch den Verdau mit dem Restriktionsenzym NotI ergeben sich bei Insert-tragenden Klonen drei

Fragmente mit den Größen 8.5 kb, 6.6 kb und 1.6 kb.

5.0 kb

1.5 kb

1.0 kb

0.5 kb

5.0 kb

1.5 kb

1.0 kb

0.5 kb


Die Sequenzanalyse der präparierten Plasmide pKSSU89* erfolgte über Alignments

(T-Coffee – Multiple Sequence Alignment) mit dem Wildtyp. Die Sequenzvergleiche

sind in der Abbildung 30 und Abbildung 31 aufgeführt und zeigen die

Aminosäureaustausche an den Positionen Met235 und Val295 der AT6-Domäne. Die

Sequenzen zeigen die erfolgreichen Aminosäureaustausche der Mutanten #660-666

(vgl. Abbildung 30). Die Varianten #667-676 mit doppelten Aminosäureaustauschen

wurden mit den Plasmiden der Einzelaminosäureaustausche als Template generiert.

Die Plasmide mit den Konstrukten #667-671 zeigen die geplanten Mutationen,

jedoch weisen die Konstrukte #672-676 an der Position Val295 die Aminosäure

Glutamin statt Glutamat auf. Dies liegt an einer fehlerhaften Bestellung der

Oligonukleotide. Da die Aminosäure Glutamat aus sterischen Gründen gewählt

wurde und Glutamin eine ähnliche Größe aufweist, wurden die Plasmide dennoch für

das im Weiteren folgende Screening über Fermentation verwendet.

# 235 AS # 295 AS

WT ATG Met WT GTG Val

660 GTC Val 665 ATG Met

661 GGC Gly 666 GAG Glu

662 ATC Ile

663 TTG Leu

664 GCC Ala

Abbildung 30: Nukleotidsequenzvergleich der AT6-Domäne von S. erythraea NRRL-B-24071 (Wildtyp) mit den korrespondierenden Sequenzen der Mutanten mit einem Aminosäureaustausch #660-666 im Bereich um Met235 sowie Val295. "***" zeigen die Aminosäureaustausche.


# 235 AS 295 AS

WT ATG Met GTG Val

667 GTC Val ATG Met

668 GGC Gly ATG Met

669 ATC Ile ATG Met

670 TTG Leu ATG Met

671 GCC Ala ATG Met

672 GTC Val CAG Gln

673 GGC Gly CAG Gln

674 ATC Ile CAG Gln

675 TTG Leu CAG Gln

676 GCC Ala CAG Gln

Abbildung 31: Nukleotidsequenzvergleich der AT6-Domäne von S. erythraea NRRL-B-24071 (Wildtyp) mit den korrespondierenden Sequenzen der Mutanten mit doppeltem Aminosäureaustausch #667-676 im Bereich um Met235 sowie Val295. "***" zeigen die Aminosäureaustausche.


3.1.4. Konjugation der AT6* Varianten in S. erythraea∆AT6hygR;

Stereospezifität

Die Einbringung der heterologen Plasmid-DNA in S. erythraea erfolgte über

intergenetische Konjugation. Die häufig verwendete Transformation ist bei

Actinomyceten meist nicht ohne Weiteres möglich, da es sich um Gram-positive

Bakterien handelt. Die Konjugation liefert hier jedoch zuverlässig eine hohe Zahl von

positiven Transkonjuganten, ist jedoch aufwendiger in der Durchführung als die

üblicherweise eingesetzte Transformation. Es wurde E. coli ET12567/pUZ8002 als

Donorstamm verwendet. Dieser Stamm ist methylierungsnegativ und trägt einen

F-Faktor, der für die Übertragung der DNA notwendig ist. Um eine Integration der

übertragenden DNA in das Genom von S. erythraea zu erreichen, wurden integrative

Vektoren verwendet. Diese enthalten Integrasestellen (basierend auf Phasen-

Integrasen), die an spezifischen Stellen innerhalb des Genoms integrieren können.

Da diese Integration auch umkehrbar ist, womit eine relativ geringe Stabilität

einhergeht, ist es notwendig einen Selektionsdruck mit den entsprechenden

Antibiotika stetig aufrecht zu halten. Nach etwa 7 Tagen konnten positive

Transkonjuganten isoliert werden. Diese wurden auf ABB13-Agarplatten kultiviert, bis

sie eine ausreichende Größe hatten. Im Anschluss wurden die Kolonien in einer

Fermentation eingesetzt oder für kurze Zeit bei Raumtemperatur gelagert.

3.1.5. Analyse der AT6* Varianten in S. erythraea∆AT6hygR; Stereospezifität

3.1.5.1. Fermentation in 24-Lochplatten und anschließende Massenanalyse

Abbildung 32: Kultivierung der Hauptkulturen in 24-Lochplatten des System Duetz.[53]


Die Analyse der AT6* Varianten erfolgte durch Fermentation inklusive Fütterung der

Bakterien mit dem SNAC aktivierten rac-Methylmalonat (rac-MM-SNAC) (13) und

anschließender Extraktion von Erythromycin. Es wurden alle Varianten und der

Wildtyp mit und ohne Zugabe des Substrates 13 untersucht. Um die AT6* Varianten

auf eine positive Erythromycin-Produktion zu testen, wurden alle erzeugten Varianten

in 24-Lochplatten des System Duetz[53] kultiviert. Diese Kultivierung der Varianten in

kleinen Medienvolumina ermöglichte die Fermentation einer großen Zahl von

Kulturen in einem praktikablen Zeit- und Arbeitsaufwand. Zusätzlich liefert sie den

Vorteil einer gleichmäßigen Belüftung der Kulturen. Nach einer Kultivierungsdauer

von insgesamt 7 Tagen (2 Tage Vorkultur und 5 Tage Hauptkultur) wurden die

Fermentationsprodukte mit Ethylacetat extrahiert. Die Extrakte wurden nach

Verdampfung des Lösungsmittels in Methanol gelöst und über eine LC/ESI-MS

Messung analysiert. Konnte Erythromycin in den Proben nachgewiesen werden,

erfolgte eine quantitative Analyse der gefundenen Menge im Vergleich zum analog

fermentierten Wildtyp. Um statistisch signifikante Resultate zu bekommen, wurden

jeweils vier Klone jeder Variante parallel fermentiert und analysiert.

Tabelle 3: LC/ESI-MS Analyse des Einflusses der Stereospezifitätsmutanten auf die Erythromycin-Produktion. Die Werte sind jeweils die Mittelwerte der vier analysierten Klone. Alle Werte beziehen sich prozentual auf den fermentierten Wildtyp (100 %). Die schraffierten Felder zeigen die Varianten auf, bei denen keine Produktion von Erythromycin zu beobachten war. n.e.: nicht eindeutig (die Analyse der Messungen ergab kein eindeutiges Ergebnis). Grau hinterlegte Spalten: Fermentation ohne Fütterung mit dem Substrat 13. Violett hinterlegte Spalten: Fermentation mit Fütterung des Substrates 13.

Val295

Val Met Glu Gln

Me

t23

5

Met 100 100 31.89 7.02 0 0 - -

Val 82.16 13.61 2.00 0.27 - - 1.54 0.54

Gly 0.12 0.04 1.69 0.25 - - 0 0

Ile 0.15 0.05 30.90 8.81 - - 0.41 0.20

Leu 32.65 8.54 9.40 5.73 - - 1.34 0.33

Ala 3.68 0.90 0.17 n.e. - - 0.52 1.56

Die Analyse der Messungen zeigt, dass erstaunlich viele Aminosäureaustausche

immer noch eine Erythromycin-Produktion ermöglichen. Nur die Varianten

Val295Glu, sowie Met235Gly & Val295Gln unterbinden die Biosynthese von

Erythromycin. Möglicherweise sind diese inaktiven Varianten auf eine Fehlfaltung der

Acyltransferase bzw. des gesamten DEBS3 zurückzuführen. Insgesamt deutet


dieses Ergebnis mit nur zwei inaktiven bei insgesamt 17 analysierten Varianten auf

eine recht große Toleranz der AT6 in den Positionen 235 und 295 bezogen auf

dessen Aktivität. Auffällig ist auch, dass einige Mutationen in einer sehr geringen

Aktivität gegenüber dem Wildtyp resultieren. Dies zeigt einen negativen Effekt des

Aminosäureaustausches auf das Erythromycin-Produktionsniveau. Indes resultiert

keine der Varianten in einem positiven Einfluss gegenüber dem Wildtyp, was jedoch

nicht überraschend ist, da S. erythraea insgesamt sehr empfindlich auf

gentechnische Manipulation reagiert.[46] Während die Einzelmutante Met235Val noch

eine recht hohe Erythromycin-Produktion gegenüber dem Wildtyp aufweist, ist diese

bei der Mutation Val235Met deutlich geringer. Die Doppelmutante Met235Val &

Val295Met dagegen weist mit 2 % ohne Fütterung und 0.27 % mit Fütterung fast

keine Aktivität mehr auf. Aufgrund der Fütterung zusammen mit der Vermutung der

Akzeptanz von (R)-Methylmalonat dieser Variante entspricht eine geringere Aktivität

mit Fütterung keineswegs den Erwartungen. Dieser Effekt kann auf einer Inaktivität

des Enzyms beruhen oder möglicherweise durch eine komplexe Selektivität des

Enzyms verursacht worden sein. So besteht die Möglichkeit, dass die Doppelmutante

kein (S)-Methylmalonat akzeptiert und ein zusätzlicher Selektivitätsfilter

(beispielsweise die KS-Domäne – bereits in der Aufgabenstellung diskutiert) das

eingebaute (R)-Methylmalonat nicht toleriert. Dieses Ergebnis ist durchaus

interessant und sollte durch weitere Experimente untersucht werden.

Die Varianten mit Glutamin an der Position 295 zeigen durchweg ein vergleichsweise

schlechtes Erythromycin-Produktionsniveau. Scheinbar ist also die Aminosäure

Glutamin an der Position 295 nicht förderlich für die Erythromycin-Produktion.

Welchen Einfluss die Varianten auf die Stereospezifität der AT6 haben ist durch die

LC/ESI-MS Analyse allein nicht zu klären. Dazu muss eine 1H-NMR-Analyse

durchgeführt werden.


3.1.5.2. Fermentation zur präparativen Gewinnung von Erythromycin und

Analyse mittels 1H-NMR

Abbildung 33: Fermentation von S. erythraea in 5 L Kolben mit Stahlfeder.

Zur Gewinnung von präparativen Mengen des Erythromycins wurde S. erythraea in

einem Gesamtvolumen von 1 L (0.5 L pro 5 L Kolben) fermentiert. Das produzierte

Erythromycin sollte aus den Kulturen isoliert werden, um eine Analyse der

Konfiguration durchführen zu können. Die Fermentation erfolgte in Glaskolben mit

einer Stahlfeder am Boden und verlief inklusive Vor- und Hauptkultur über 7 Tage. Im

Anschluss wurden die Kulturen eingefroren, um das Erythromycin aus den Zellen

freizusetzen. Die Schwierigkeiten bei der Präparation von Erythromycin aus

Fermentationskulturen bestehen in der großen Anzahl von Fermentationsprodukten

sowie im Etablieren geeigneter reproduzierbarer Methoden. In dieser Arbeit wurde

eine Extraktionskaskade mit anfolgender präparativer Dünnschichtchromatographie

durchgeführt. Durch die Extraktion mit Ethylacetat sollen organische Substanzen aus

der Fermentationskultur isoliert werden. Die folgende Extraktion mit Wasser (pH 4.5)

soll die Separation von z. B. Lipiden ermöglichen. Im dritten Schritt der Extraktion soll

Erythromycin wieder in die organische Phase überführt werden (vgl. Abbildung 34).


Abbildung 34: Schema für die Isolation von Erythromycin aus einer S. erythraea Fermentation über Extraktion mit Ethylacetat (pH 9.5), sowie Wasser (pH 4.5).

Die anschließende präparative Dünnschichtchromatographie ermöglichte eine

schnelle Separation der extrahierten Substanzen. Schwierigkeiten ergaben sich, da

Erythromycin nicht UV-aktiv ist und somit ohne Anfärben nicht sichtbar ist. Dieses

Problem wurde gelöst, indem ein schmaler Streifen der DC-Platte mit einer

Kaliumpermanganatlösung angefärbt wurde, was nur zu einem geringen Verlust des

Produktes führte und die Position der Substanzen anzeigte.

3.1.5.3. Fermentation und Aufarbeitung von S. erythraea NRRL-B-24071

(Wildtyp)

Zur Etablierung der Methoden wurde der S. erythraea Wildtyp fermentiert und

aufgearbeitet. Zur Analyse wurden nach den Aufarbeitungsschritten LC/ESI-MS

Messungen durchgeführt. Die Analyse der organischen Phase aus dem zweiten

Extraktionsschritt ergab, dass hier nach einmaliger Extraktion mit leicht saurem

Wasser (pH 4.5) noch Erythromycin vorhanden war. Durch eine viermalige Extraktion

der EtOAc-Phase mit Wasser konnte der Großteil des Erythromycins in die wässrige

Phase überführt werden.

Nach dem dritten Extraktionsschritt, wurde der Extraktionsrückstand der

Fermentation auf eine präparative DC-Platte aufgetragen. Der Rf-Wert des als


Referenz aufgetragenen käuflichen Erythromycins betrug 0.66. Das Erythromycin

aus dem Fermentationsrückstand konnte auf einem Bereich mit einem Rf-Wert von

0.14-0.66 detektiert werden. Dieser breite Bereich deutet darauf hin, dass das

Erythromycin wahrscheinlich teilweise protoniert vorlag. Aufgrund der großen Fläche

des Produktes wurde er in drei Fraktionen unterteilt, um eine möglichst reine Probe

zu gewinnen. Das Kieselgel wurde von der DC-Platte gekratzt und mit einem 2:1

Gemisch aus Chloroform und Methanol extrahiert. Nach Entfernen des

Lösungsmittels wurden die Proben erneut durch eine LC/ESI-MS Messung

analysiert. Die drei Fraktionen nach der DC wiesen alle Erythromycin auf. Dies zeigt,

dass es möglich ist Erythromycin durch diese Methode zu isolieren und bis zu einem

gewissen Grad aufzureinigen. Die LC/ESI-MS Messungen zeigten neben den

Erythromycin Derivaten B und C, die nicht durch die verwendeten Methoden zu

separieren sind, zu einem geringen Anteil noch weitere Verunreinigungen.

Erythromycin eluiert mit einer Retentionszeit von 6.8 min und weist ein Masse zu

Ladungsverhältnis von 734.74 (m/z = M+H+) auf. Die reinste Fraktion wurde zur

näheren Analyse einer MS/MS Analyse unterzogen. Das Fragmentierungsmuster

verifizierte das Resultat.

Tabelle 4: Bestimmung der einzelnen Fragmente von Erythromycin A (7) mittels MS/MS Analyse, sowie Bestimmung der Masse durch HR-MS.

Fragmente m/z theoretisch m/z gefunden

C37H68NO13 734.47 734.74

C37H66NO12+ 716.46 716.50

C37H64NO11+ 698.45 698.50

C29H54NO10+ 576.38 576.55

C29H50NO8+ 540.36 540.49

C29H52NO9+ 558.37 558.49

C29H47NO7+ 522.35 522.50


Abbildung 35: Fragmentierung von Erythromycin A (7).

Die Fraktion der Wildtypfermentation, die neben Erythromycin am wenigsten

Verunreinigungen aufwies wurde mittels 1H-NMR untersucht. Als Referenz wurde ein

Spektrum von kommerziell erhältlichem Erythromycin aufgenommen. Anhand einer

1H-NMR Auswertung der Literatur wurde das Signal des H-2 identifiziert.[54] Sowohl

im NMR-Spektrum der Referenz, als auch im Spektrum des Erythromycins aus der

Wildtypfermentation konnte das Signal bei 2.84 ppm detektiert werden. Zur Analyse

der Konfiguration an der Position C2 muss vor allem dieses Signal betrachtet

werden. Da die Aufspaltung der Signale für eine Auswertung der Multiplizitäten nicht

ausreichend war, wurden die Spektren übereinandergelegt, um eine Analyse der

Signale durchführen zu können. Die übereinstimmenden Signale deuten darauf hin,


dass Erythromycin in der Probe vorhanden ist. Für eine eindeutige Auswertung der

Signale sollte jedoch Erythromycin weiter aufgereinigt werden.

Abbildung 36: 1H-NMR Spektrum (600 MHz) von kommerziell erhältlichem Erythromycin in

deuteriertem Chloroform.

Abbildung 37: 1H-NMR Spektrum (600 MHz) von Erythromycin in deuteriertem Chloroform,

welches aus einer Fermentation von S. erythraea NRRL-B-24071 isoliert wurde.


Abbildung 38: Übereinandergelegte 1H-NMR Spektren von kommerziell erhältlichem und aus

einer Fermentation von S. erythraea NRRL-B-24071 isoliertem Erythromycin. Grün: käufliches

Erythromycin. Schwarz: Aus der Fermentation isoliertes Erythromycin.

Um die Reproduzierbarkeit der Aufarbeitungsmethoden zu bestätigen wurde der

Wildtyp erneut fermentiert und mittels LC/ESI-MS Messungen analysiert. Erneut

konnte Erythromycin in den Fraktionen nachgewiesen werden. Die Massen der

erhaltenen Fraktionen wurden bestimmt und sind in folgender Tabelle dargestellt.

Tabelle 5: Massen der Fraktionen bei der Extraktion und Reinigung des Erythromycins aus Fermentationskulturen. Angaben in [mg].

WT1 WT2

EtOAc-Phase 54.6 65.2

Spot1 9.5 11.6

Spot2 20.7 22.2

Spot3 50.3 51.5

Ein Vergleich der Fraktionen der Wildtypfermentationen zeigt durch die große

Ähnlichkeit der Massen die Reproduzierbarkeit der hier angewandten Methoden.

Dies ist notwendig um die Resultate der Fermentationen von S. erythraea Kulturen

der AT6* Varianten auswerten zu können.


3.1.5.4. Fermentation und Aufarbeitung von erzeugten S. erythraea Varianten

Die aufwendige Fermentation im präparativen Maßstab erfolgte aus Zeitgründen

nicht mit allen Varianten. Es wurden die Mutationen Met235Val & Val295Met, sowie

die Einzelaminosäureaustausche Met235Val und Val295Met ausgewählt. Die

Aufreinigung des Erythromycins erfolgte analog zum S. erythraea Wildtyp über

Extraktion gefolgt von einer präparativen Dünnschichtchromatographie.

Die erhaltenen Massen der Proben der jeweiligen Fermentation wurden bestimmt

und sind in Tabelle 6 dargestellt. Es wurden Proben nach der Extraktionskaskade

(EtOAc-Phase), sowie nach der DC (Spot 1-3) vermessen. In allen Proben konnte

durch eine LC/ESI-MS Messung Erythromycin nachgewiesen werden.

Tabelle 6: Massen der Fraktionen bei der Extraktion und Reinigung des Erythromycins aus Fermentationskulturen. Angaben in [mg]. Grau hinterlegte Spalten: Fermentation ohne Fütterung mit dem Substrat 13, Violett hinterlegte Spalten: Fermentation mit Fütterung des Substrates 13.

WT1 WT2

Met235Val & Val295Met

Met235Val & Val295Met

Val295Met Met235Val

EtOAc-Phase 54.6 65.2 34.23 52.6 n.b. 70.4

Spot1 9.5 11.6 28.2 9.0 30.9 8.6

Spot2 20.7 22.2 39.3 27.7 32.8 35.2

Spot3 50.3 51.5 32.8 10.5 40.4 13.9

Bei der Betrachtung der erhaltenen Massen wird deutlich, dass die drei Spots nach

der präparativen DC (Spot 1, 2 und 3) zusammen eine größere Masse innehaben,

als nach der letzten Extraktion. Dies ist wahrscheinlich auf das durch Methanol

gelöste Kieselgel zurückzuführen. Um eine genaue Analyse durchführen zu können,

muss das Kieselgel aus den Proben entfernt werden.

Ein Vergleich der Massen der Fermentationen der Mutante Met235Val & Val295Met

mit und ohne Fütterung mit rac-Methylmalonyl-SNAC (13) kann Rückschlüsse auf

den Einbau des gefütterten Substrates zulassen. Die Massen der Spots der

Fermentation mit Fütterung sind geringer, als die ohne Zuführung des Substrates 13.

Dies entspricht den Ergebnissen aus den LC/ESI-MS Analysen, jedoch nicht den

Erwartungen, dass das Erythromycin-Produktionsniveau mit Fütterung größer ist.

Auch ist hier die Masse der Fraktionen der Fermentationen der Varianten Val295Met

und Met235Val höher, als bei der Doppelmutante. Eine Analyse der S. erythraea AT6

Varianten mittels 1H-NMR ist aktuell in Arbeit. Die Analyse der Spektren, speziell des

Signals des H-2 (wahrscheinlich etwa bei 2.84 ppm) kann Aufschluss über die


Stereospezifität der Mutanten liefern. Hier ist es sehr spannend, welche Resultate

sich aus der Analyse der Spektren ergeben. Sollte das C2 Stereozentrum des

Erythromycin A (7) (R)-konfiguriert sein (also Wildtyp-Zustand) so wäre dies

zusammen mit dem geringen Produktionsniveau ein weiterer Hinweis für die bereits

erwähnte Hypothese, dass die KS-Domäne das von der AT-Domäne eingebaute

(R)-Methylmalonat nicht akzeptiert und die Biosynthese damit abgebrochen wird.


3.1.6. Präparation der AT6* Mutanten zur Substratspezifität

Die Varianten zur Untersuchung einer erweiterten Substratspezifität basieren auf

Ergebnissen von Uschi Sundermann.[46] In einer Analyse von 14 Aminosäuren der

AT6 wurden die Positionen 297 und 299 als vielversprechend identifiziert, da

Punktmutationen an diesen Positionen zu einer erweiterten Substratspezifität führten.

Die erstellte Bibliothek aus 23 Enzymvarianten ist auf diese Positionen fokussiert.

Die Präparation der Substratspezifitätsvarianten verlief analog zu denen der

Stereospezifität. Die Mutanten sollten mittels overlap extension PCR amplifiziert, in

den Shuttle-Vektor pKSSU96 kloniert und in den DEBS3 inaktiven Stamm

S. erythraeaΔAT6hygR konjugiert werden.

3.1.6.1. Sättigungsmutagenese zur Erstellung der AT6* Varianten;

Substratspezifität

Die Erstellung der Substratspezfitätsbibliothek mittels overlap extension PCR wurde

mit dem Vektor pKSSU89 als Template durchgeführt. Die Amplifizierung der

Doppelmutanten erfolgte hierbei nicht auf Basis von zuvor präparierten

Einzelmutanten, sondern ebenfalls mit dem Vektor pKSSU89 als Template für die

PCR indem entsprechende Oligonukleotide mit zweifachen Codonaustauschen

verwendet wurden. Die erste PCR ergab die beiden Fragmente der Konstrukte (M1

und M2).

Abbildung 39: Sättigungsmutagenese mittels overlap extension PCR. Die Fragmente (M1 und

M2) wurden in zwei separaten PCR generiert.

Um die Nebenprodukte der PCR zu entfernen, wurde im Anschluss eine

Gelaufreinigung durchgeführt. Die beiden Fragmente wurden in der zweiten PCR zu

den entsprechenden Produkten verknüpft. Die resultierenden Konstrukte haben ein

Molekulargewicht von etwa 1.7 kb.

M1 M1 M1 M2 M2 M2

5.0 kb

1.5 kb

1.0 kb

0.5 kb


Abbildung 40: Zweite PCR der overlap extension PCR. Die Produkte (P) mit einer Größe von

1.7 kb der Mutationen wurden mit den entsprechenden Fragmenten M1 und M2 assembliert.

Nach einer Gelaufreinigung wurden die AT6* Konstrukte über die SLIC-MIX Methode

in den Vektor pKSSU96 kloniert. Die daraus resultierenden pKSSU89*

Shuttle-Vektoren wurden in E. coli OmniMAX™ 2 T1 Zellen transformiert und auf

apramycinhaltigen LB-Agarplatten ausplattiert. Zur Überprüfung positiver

(Insert-tragender) Klone wurde eine Kolonie-PCR durchgeführt. Die amplifizierten

Produkte wurden mit einer Gelelektrophorese ausgewertet.

Abbildung 41: Kolonie-PCR zur Identifizierung Insert-tragender Klone. Die PCR-Produkte

(1.7 kb) sind in einigen der untersuchten Klonen sichtbar.

Die Plasmid-DNA der Insert-tragenden Klone wurden isoliert und mittels

Restriktionsanalyse mit dem FastDigest Enzym NotI analysiert. Zusätzlich soll ein

Sequenzvergleich durchgeführt werden.

P P P

5.0 kb

1.5 kb

1.0 kb

0.5 kb

5.0 kb

1.5 kb

0.5 kb

5.0 kb

1.5 kb

0.5 kb


3.1.7. Restriktionsanalyse und Sequenzierung zur Verifizierung der

präparierten Plasmide; Substratspezifität

Der Kontrollverdau mit dem FastDigest Enzym NotI soll in drei Fragmenten mit den

Größen 8.5 kb, 6.6 kb und 1.6 kb resultieren.

Abbildung 42: Restriktionsanalyse der pKSSU89* Plasmide mit den erzeugten AT6* Varianten zur Substratspezifität. Durch den Verdau mit dem Restriktionsenzym NotI ergeben sich bei Insert-

tragenden Klonen drei Fragmente mit den Größen 8.5 kb, 6.6 kb und 1.6 kb.

Die Restriktionsanalyse zeigt, dass die untersuchte Plasmid-DNA das Insert tragen.

Eine Sequenzanalyse zur endgültigen Verifizierung der geplanten Mutationen der

Plasmide ist aktuell in Arbeit.

Die Konjugation in S. erythraea∆AT6hygR und Screening durch Fermentation fand

aus Zeitgründen nicht statt.

5.0 kb

1.5 kb

1.0 kb

0.5 kb


3.2. Synthese des SNAC aktivierten rac-Methylmalonat 13

Die Synthese des SNAC aktivierten rac-Methylmalonats (rac-MM-SNAC) (13)

erfolgte weitestgehend nach einer in der Arbeitsgruppe entwickelten dreistufigen

Syntheseroute. Lediglich der erste Schritt der Synthese, die Präparation des

geschützten rac-Methylmalonats (11) wurde von der bekannten Route abgewandelt.

Das Coenzym A Mimetikum SNAC (14) wurde vorab über eine Acetylierung von

Cysteaminhydrochlorid (17) selbst hergestellt.

Abbildung 43: Synthese des Coenzym A Mimetikums SNAC (14). i):2.5 Äq. NaHCO3, 1.0 Äq.

KOH, 1.0 Äq. Ac2O, H2O, RT, 2 h.

Die Acetylierung erfolgte nach einer Aktivierung des Cysteaminhydrochlorids (17) mit

Natriumhydrogencarbonat und Kaliumhydroxid. Nach Zugabe von

Essigsäureanhydrid konnte SNAC (14) nach der Aufarbeitung in einer moderaten

Ausbeute von 64 % isoliert werden.

Die dreistufige Synthese des rac-MM-SNAC (13) wurde ausgehend von

tert-Butylpropionat (10) durchgeführt. Durch Einleiten von Kohlenstoffdioxid in die

Lösung konnte nach Deprotonierung durch NaHMDS die Säure 11 generiert werden.

Abbildung 44: Synthese der Verbindung 11. i): NaHMDS, THF, -78 °C-RT, 1 h. ii) CO2, 14 h.

Das Produkt 11 konnte durch Extraktion in sehr reiner Form jedoch nur mit einer

geringen Ausbeute von 32 % isoliert werden. Eine weitere Aufreinigung war nicht

notwendig. Zur Erzeugung des CO2 Gases wurde Trockeneis bei Raumtemperatur in

einen Kolben gefüllt und in die Reaktionslösung geleitet. Die Ausbeute konnte gering

verbessert werden, indem das naszierende Gas durch ein mit Molekularsieb gefülltes

Gefäß geführt wurde. Die dennoch mäßige Ausbeute wurde wegen der praktisch

einfach durchführbaren, sowie wenig zeitaufwendigen Synthesevorschrift toleriert.

Ein Vergleich mit der in der Arbeitsgruppe entwickelten Synthese des

tert-Butylmethylmalonats (11) basierend auf einer Methylierung von


tert-Butylhydrogenmalonat (18) zeigt die Vorteile der Carboxylierungsreaktion

(Abbildung 44 und Abbildung 45).

Abbildung 45: In der Arbeitsgruppe durchgeführte Synthese des tert-Butylmethylmalonats (11). i) 2.1 Äq. LDA, MeI, THF, -78 °C-RT, Schutzgasatmosphäre, 16 h. Die Ausbeuten lagen durchschnittlich bei 35-70 %.

Die Durchführung der Synthese ist durch die benötigte Schutzgasatmosphäre sehr

aufwendig. Zusätzlich muss das Substrat vor Verwendung säulenchromatographisch

aufgereinigt werden, da es in käuflicher Form nicht die benötigte Reinheit hat. LDA

muss ausgehend von Diisopropylamin, welches zuvor frisch destilliert werden sollte,

am Tag der Synthese hergestellt werden. Des Weiteren nimmt die Bildung des

dialkylierten Malonates bei der Hochskalierung als unerwünschtes Nebenprodukt zu

und lässt sich nur schwer vom monoalkylierten Produkt trennen, so dass die erzielten

Ausbeuten bei Ansätzen von größer 500 mg stark sanken.[55] Durch die

Carboxylierung ausgehend von tert-Butylpropionat (10) kann diese sehr

zeitaufwendige Synthese, sowie der Einsatz des sehr giftigen Methyliodids

umgangen werden. Diese Vorteile amortisieren die geringere Ausbeute der

Carboxylierung von 32 % gegenüber den durchschnittlich erreichten Werten der

Methylierung von 35-70 % Ausbeute.

Im zweiten Schritt wurde die Methylmalonsäre 11 mit SNAC (14) gekoppelt um somit

eine zellwandpermeable, tert-Butyl-geschützte, Thioester-aktivierte rac-

Methylmalonsäure zu erhalten. Die Kupplung erfolgte nach einer Aktivierung der

Carbonsäure 11 durch CDI und DMAP. Durch die Bildung des hydrolysempfindlichen

gemischten Anhydrids durch CDI war die Durchführung der Reaktion unter

Schutzgas notwendig.

Abbildung 46: Synthese der Verbindung 12. Kupplung der tert-Methylmalonsäure (11) mit SNAC (14). i): 1.2 Äq. CDI, 0.3 Äq. DMAP, THF, 0 °C, 2 h. ii): 1.5 Äq. SNAC (14), RT, 16 h.

Nach einer säulenchromatographischen Aufreinigung konnte das Produkt 12 in

kristalliner Form mit einer zufriedenstellenden Ausbeute von 74 % isoliert werden.


Die Entschützung als finalen Schritt der Synthese des Substrates 13 erfolgte am Tag

der Fütterung, da die Substanz 13 säure-, base-, und temperaturlabil ist und nur in

verdünnten wässrigen Natriumcarbonat-Puffer hinreichend stabil ist um

Fütterungsexperimente durchzuführen.

Abbildung 47: Synthese des rac-MM-SNAC (13). Entschützung des tert-Butyl-MM-SNAC (12).

i): 2.25 Äq. TiCl4, DCM, 0 °C-RT, 6.5 h.

Das Produkt 13 wurde in Substrat-Puffer (ein Glucose-Natriumcarbonat-Puffer, pH 8)

aufgenommen und nach Entfernen des Lösungsmittels und des ausgefallenen

Titandioxids, sowie einer Sterilfiltration direkt der Fermentation zugeführt.

Insgesamt konnte das Substrat (13) mit einer Gesamtausbeute von 24 % über drei

Stufen synthetisiert werden. Es konnte eine Lagerstabilität von tert-

Butylmethylmalonat-SNAC (12) bei -20 °C für einige Wochen beobachtet werden. Da

das Endprodukt 13 jedoch sehr instabil war, wurde der letzte Schritt erst am Tage

der Fütterung durchgeführt.


3.3. Fütterungen mit Malonaten

In der Arbeitsgruppe konnte eine AT6* Variante generiert werden, die eine erweiterte

Substratspezifität aufweist. So konnte der Einbau von SNAC aktiviertem

Propargylmalonat nachgewiesen werden. Die Mutante basiert auf einem

Aminosäureaustausch an der Position Val295 (S. erythraea∆AT6hygR_pKSSU656

Val295Ala).[46] Da Mutanten der ersten Generation häufig ein sehr breites

Substratspektrum aufweisen, sollte nach der Bildung weiterer Erythromycin-Derivate

durch diese Mutante gescreent werden. Möglicherweise kann die Variante auch

Ethylmalonat einbauen, jedoch konnten Stassi und Katz et al. nachweisen, dass

S. erythraea keine Crotonylreduktase besitzt und damit kein Ethylmalonyl-CoA

herstellen kann.[40] Daher muss Ethylmalonat der Fermentation zugeführt werden. In

swapping-Experimenten konnte bereits aufgezeigt werden, dass eine Fütterung mit

Diethylethylmalonat (15) zur Synthese eines Erythromycin-Derivates führt. Hierbei

scheint eine Aktivierung mit SNAC (14) nicht notwendig zu sein.

Aufgrund dieser Resultate wurde eine Fermentation der Variante S. erythraea

∆AT6hygR_pKSSU656 (Val295Ala) mit Fütterung von Diethylethylmalonat (15)

durchgeführt. Um einen Vergleich der Aufnahmekapazität in die Zellen zu erhalten,

sollte auch eine Fütterung mit Diethylpropargylmalonat (16) stattfinden.

Eine Analyse der LC/ESI-MS Messungen ergab, dass Propargylmalonat eingebaut

wurde, jedoch konnte das entsprechende Erythromycinderivat nur in sehr geringen

Mengen nachgewiesen werden. Die Mengen sind mit einem Faktor 2 geringer als mit

einer SNAC-Aktivierung.

Die Masse des 2-Ethylerythromycin-Derivat konnte nur im Rauschen detektiert

werden. Es ist möglich, dass ein Einbau stattfindet, die Kapazität der

Zellwandpermeabilität jedoch zu gering ist um eindeutige Aussagen treffen zu

können. Hier sollte eine Fütterung mit SNAC-aktiviertem Ethylmalonat durchgeführt

werden um eindeutige Ergebnisse zu erhalten.


3.4. Abschließende Diskussion

Die Präparation von 17 S. erythraeaAT6* Varianten zur Untersuchung der

Stereospezifität basierend auf den Aminosäurepositionen Met235 und Val295 konnte

erfolgreich durchgeführt werden. Die dafür verwendete overlap extension PCR

lieferte zuverlässig die geplanten Mutanten. Die Abweichung der Varianten

pKSSU672-676 mit der Aminosäure Glutamin, statt des geplanten Glutamats, liegt

an einer fehlerhaften Bestellung der hierfür eingesetzten Oligonukleotide. Da

Glutamin einen ähnlichen sterischen Anspruch wie Glutamat besitzt wurden diese

Varianten jedoch weiter verwendet. Alle erzeugten AT6* Konstrukte konnten

erfolgreich mittels SLIC-MIX kloniert werden. Diese Klonierungsmethode ist äußerst

zuverlässig, was durch die positiven Klone der Kolonie-PCR bestätigt wurde. Die

durch intergenetische Konjugation erhaltenen S. erythraea∆AT6hygR_pKSSU89*

Varianten wurden in 24-Lochplatten des System Duetz kultiviert und mit dem

synthetisierten Substrat rac-Methylmalonyl-SNAC (13) gefüttert. Die Synthese konnte

erfolgreich über drei Stufen mit einer Gesamtausbeute von 24 % durchgeführt

werden. Der sogenannte Flaschenhals dieser Syntheseroute ist die Carboxylierung

mit Kohlenstoffdioxid mit einer Ausbeute von 33 %. Durch eine Optimierung dieser

Reaktion könnte die Gesamtausbeute deutlich gesteigert werden.

Eine LC/ESI-MS Analyse der Fermentationsprodukte zeigte, dass die Positionen

Met235 und Val295 eine erstaunliche Toleranz aufweisen. Nur zwei der 17

Mutationen führten hier zu einer vollständigen Unterdrückung der Erythromycin-

Produktion. Die Analyse der LC/ESI-MS Daten ermöglichte jedoch keinen

Rückschluss auf das eingebaute Substrat. Hierzu muss eine 1H-NMR-Analyse der

erhaltenen Fermentationsprodukte erfolgen. Bei der Fermentation zur Gewinnung

von präparativen Mengen des Erythromycins mussten erst einige Hürden wie eine

optimale Extraktion und gute Aufreinigung überwunden werden. Durch den Einsatz

einer dreistufigen Extraktionskaskade und einer präparativen

Dünnschichtchromatographie ist es gelungen Erythromycin aus einer S. erythraea

NRRL-B-24071 (Wildtyp) Kultur zu isolieren. Eine 1H-NMR-Messung sowie ein

Vergleich mit käuflich erworbenem Erythromycin bestätigten den Befund. Als

abschließender Aufreinigungsschritt steht hier nun die Entfernung des in der Probe

befindlichen Kieselgels an. Die Menge und Reinheit des isolierten Produktes ist

jedoch für eine genaue Analyse der Multiplizitäten der NMR-Signale nicht

ausreichend gewesen.


Die Analyse der fermentierten S. erythraea∆AT6hygR_pKSSU89* Varianten mittels

LC/ESI-MS ergab, das auch hier Erythromycin isoliert werden konnte. Die erhaltenen

Massen an Erythromycin resultierten in einer Hypothese über die

Stereospezifitätskontrolle der Acyltransferase. Das niedrige Erythromycin-

Produktionsniveau der Fermentation mit Zugabe des Substrates 13 impliziert die

Hypothese, dass möglicherweise die Acyltransferase das (R)-Methylmalonat

akzeptiert, die Ketosynthase das Zwischenprodukt jedoch nicht toleriert und es somit

zu einem Abbruch der Biosynthese kommt. Dies setzt voraus, dass die Ketosynthase

einen Einfluss auf die Stereokontrolle der Seitenketten des Polyketids hat. Um diese

hochspekulative Hypothese genauer zu untersuchen, sollten weitere Experimente,

vielleicht eine Untersuchung in einem vereinfachten System, stattfinden.

Eine nähere Analyse der Stereochemie des isolierten Erythromycins mittels 1H-NMR

steht noch aus. Die hieraus erhaltenen Ergebnisse könnten zu einer Identifikation der

Aminosäuren führen, die einen Einfluss auf die Selektivität der Acyltransferase

haben.

Die Präparation der AT6* Varianten basierend auf Tyr297 und Ser299 erfolgte bis zur

Klonierung in den Vektor pKSSU96. Sobald die Sequenzanalyse der erzeugten

pKSSU89* Plasmide abgeschlossen ist, sollten diese über intergenetische

Konjugation in S. erythraea∆AT6hygR eingebracht werden, um entsprechende

S. erythraea∆AT6hygR_pKSSU89* Varianten zu erzeugen. Diese sollten

anschließend durch ein Screening in 24-Lochplatten des System Duetz inklusive

Fütterung von SNAC aktiviertem Propargylmalonat untersucht werden.

Das Fütterungsexperiment mit nicht aktivierten Malonaten lieferte zwar ein

Erythromycinderivat mit einem Progargylrest an der C2-Position (nachgewiesen

durch eine Analyse der LC/ESI-MS Daten), jedoch war die Menge mit einem Faktor 2

geringer als es bei der Fütterung mit SNAC-aktiviertem Propargylmalonat der Fall

war.[46] Dies zeigt, dass auch bei weiteren Fütterungsexperimenten eine

SNAC-Aktivierung der Substrate durchgeführt werden sollte, um eindeutige

Ergebnisse zu erhalten. Die bei der Analyse der LC/ESI-MS Spektren gefundenen

Spuren an 2-Ethylerythromycin deuten darauf hin, dass die untersuchte Mutante

S. erythraea∆AT6hygR_pKSSU656 (Val295Ala) auch Ethylmalonat als Substrat

einbauen kann. Durch eine Fütterung mit SNAC-aktiviertem Ethylmalonat könnte

dieser Verdacht bestätigt werden.


Die durchgeführten Experimente zeigen, dass eine Mutagenese von Polyketid-

Synthasen sehr aufwendig ist. Durch den komplexen Biosyntheseweg ist eine

Deutung der erhaltenen Ergebnisse des Screenings oft sehr vielschichtig und bedarf

weiterer Analysen.

Zusammenfassung und Ausblick | 57

4 Zusammenfassung und Ausblick

Erythromycin ist ein Makrolid-Antibiotikum einer der größten Naturstoffklassen – den

Polyketiden. Diese strukturell und funktionell hoch heterogenen Substanzen werden

von Pilzen, Pflanzen und Bakterien synthetisiert. Erythromycin gehört zu den

reduzierten Polyketiden und wird von einer Typ-I-Polyketid Synthase generiert. Die

6-Desoxyerythronolid B Synthase (DEBS) aus dem Bodenbakterium

Saccharopolyspora erythraea bildet einen Enzymkomplex aus drei nicht kovalent

verknüpften Enzymen und ist für die Biosynthese des Erythromycins verantwortlich.

Abbildung 48: Grundmechanismen der Erythromycin A (7) Biosynthese.[26,27]

Dieser 1.8 MDa große Multienzymkomplex (Monomer) besteht aus drei Enzymen, DEBS1, 2 und 3, die nicht kovalent miteinander verknüpft als molekulares Fließband agieren. Jedes dieser Enzyme beinhaltet zwei bis drei Module (schwarze Kästen), die kovalent miteinander verknüpft sind. Ein minimales Modul (vgl. Modul 3) besteht aus drei Domänen, die eine Kettenverlängerung um 2 C-Atome inklusive der Seitenkette (resultierend in der Bildung eines β-Ketoesters) katalysieren: Eine Ketosynthase (KS), die eine decarboxylierende Claisenkondensation katalysiert, eine Acyltransferase (AT), die den Baustein auswählt und diesen auf das Acylcarrierprotein (ACP) überträgt. Der β-Ketoester kann dann nachfolgend durch die reduktiven Domänen weiter prozessiert werden. Eine vollständige reduktive Schleife besteht aus einer Ketoreduktase (KR), einer Dehydratase (DH) und einer Enoylreduktase (ER). Die Anzahl der reduktiven Domänen des jeweiligen Moduls bestimmt hierbei den Grad der Reduktion der wachsenden Kette. Final spaltet eine Terminale Esterase (TE) die Polyketidkette vom Enzym ab und ermöglicht eine Zyklisierung. Durch Post-PKS Prozessierungen wie Glykosylierungen und Methylierungen wird die Biosynthese des biologisch aktiven, komplexen Naturstoffes Erythromycin A (7) komplementiert.

Der funktionale Komplex der Polyketidsynthase liegt als Dimer mit einer Größe von

etwa 3.5 MDa vor und ist eines der größten bekannten Proteine. Es stellt damit im

Hinblick auf enzyme engineering Strategien eine Herausforderung dar. Im Rahmen

dieser Arbeit wird die Strategie der Punktmutation einer spezifischen Domäne

angewandt. Dieser Weg der kombinatorischen Biosynthese führte bereits in früheren

Experimenten zu einigen Erfolgen.[44,45,46] Eine zusätzliche Herausforderung stellte

hier die Verwendung von S. erythraea als Erythromycin-Originalproduzent dar.


Dieses Gram-positive Bakterium ist genetisch nur schwer zu manipulieren und stellt

besondere Ansprüche an eine produktive Fermentation.

Um eine Diversitätserhöhung von Erythromycin zu erreichen wurden anhand der

Acyltransferase aus Modul 6 mittels Sättigungsmutagenese Bibliotheken präpariert,

die zu einer Erweiterung der Stereo- bzw. Substratspezifität führen sollten.

4.1. Projekt zur Erweiterung der Stereospezifität

Eine Analyse eines Modells der DEBS AT6-Domäne durch die Arbeitsgruppe von

Dr. Elsa Sanchez Garcia (Theoretische Chemie) des Max-Planck-Instituts für

Kohlenforschung (Mülheim) zeigte zwei Aminosäurepositionen auf, die scheinbar für

den selektiven Einbau des (S)-Methylmalonyl-CoA verantwortlich sind – Met235 und

Val295.

Abbildung 49: Aktives Zentrum der AT6-Domäne. A: Wildtyp mit Met235 (gelb), Val295 (blau) und (S)-MMCoA. B: Doppelmutante Met235Val (blau), Val295Met (gelb) und (R)-MMCoA. Das Modell stammt vom Kooperationspartner Kenny Bravo-Rodriguez.

Die geplanten Mutationen konnten über eine overlap extension PCR präpariert

werden. Eine anschließende Klonierung mittels SLIC-MIX resultierte in pKSSU89*

Plasmiden, die die gewünschten Mutationen innerhalb der AT6-Domäne trugen. Die

Plasmid-DNA wurden mittels Restriktionsanalyse und Sequenzvergleich verifiziert.

Nach einer intergenetischen Konjugation in S. erythraea∆AT6hygR, ein Stamm bei

dem DEBS3 durch das Inserieren einer Hygromycin-Kassette inaktiviert wurde,

wurden die Varianten über Kultivierung inklusive Fütterung mit rac-Methylmalonyl-

SNAC (13) in Lochplatten des System Duetz[53] und folgender LC/ESI-MS Analyse

der Fermentationsextrakte gescreent. Dazu wurde das Substrat rac-Methylmalonyl-

SNAC (13) über eine dreistufige chemische Synthese hergestellt. Diese

Syntheseroute ermöglichte eine schnelle Präparation der Verbindung. Der Einsatz

einer Carboxylierung mit Kohlenstoffdioxid ermöglichte zudem eine wenig

A B


aufwendige Reaktion, die eine mühsame Methylierungsreaktion sowie den Einsatz

von giftigem Methyliodid umgeht (vgl. 3.2). Da die Substanz 13 säure-, base-, und

temperaturlabil ist und nur in verdünnten wässrigen Natriumcarbonat-Puffer

hinreichend stabil ist, wurde der letzte Schritt der Synthese am Tag des

Fütterungsexperiments durchgeführt.

Abbildung 50: Prinzipieller Ablauf des Screenings auf Erythromycin-Produktion der Stereoselektivitätsbibliothek.

Es konnte aufgezeigt werden, dass eine große Toleranz gegenüber den eingeführten

Mutationen der zwei entsprechenden Aminosäurepositionen besteht. Eine

1H-NMR-Analyse sollte weitere Auskünfte über die Konfiguration des C2

Stereozentrums von Erythromycin geben. Hierzu musste zuerst eine Methodik zur

Aufarbeitung und Isolation des Erythromycins aus Fermentationskulturen geschaffen

werden. Dies gelang über eine dreistufige Extraktionskaskade, sowie einer

präparativen Dünnschichtchromatographie. Mittels LC/ESI-MS sowie 1H-NMR-

Analyse konnte nachgewiesen werden, dass es gelungen war Erythromycin aus

einer S. erythraea NRRL-B-24071 (Wildtyp) Fermentation zu isolieren. In den

fermentierten Varianten der Mutationen Met235Val & Val295Met, sowie den

Einzelaminosäureaustauschen Met235Val und Val295Met konnte ebenfalls durch

eine LC/ESI-MS Analyse Erythromycin nachgewiesen werden, jedoch ist für eine

Analyse der Konfiguration der Stereozentren eine 1H-NMR-Analyse notwendig. Diese

Analyse kann Aufschluss darüber geben, ob die eingebrachten Mutationen zu einer

Erweiterung der Stereoselektivität der AT6-Domäne geführt haben. Die bisher

erzielten Ergebnisse des Screenings stellen eine Quelle für Spekulationen dar. So

könnte die geringe Erythromycin-Produktivität der Doppelmutante Met235Val &

Val295Met darauf hindeuten, dass neben der Acyltransferase auch die Ketosynthase

für die Stereoselektivität der Polyketid-Seitenketten verantwortlich sein könnte. Zur

näheren Untersuchung sollten weitere Experimente durchgeführt werden.

Shuttle-Vektor

DEBS3*-kodierend

S. erythraea∆AT6hygR

Screening der Mutanten


4.2. Projekt zur Erweiterung der Substratspezifität

Die Bibliothek zur Substratspezifität fokussiert auf den Aminosäurepositionen Tyr297

und Ser299 wurde basierend auf Erkenntnissen geplant, die durch vorrangegangene

zielgerichtete Mutagenese-Experimente erlangt wurden.[46] Durch overlap extension

PCR und Klonierung mittels SLIC-MIX wurden die pKSSU89* Plasmide mit den

entsprechenden Mutationen in Analogie zu den Stereospezifitätsvarianten (vgl.

Abschnitt 4.1) konstruiert. Die Plasmide wurden mittels Restriktionsverdau durch das

FastDigest Enzym NotI auf das Vorhandensein des Inserts (Klonierungserfolg)

kontrolliert. Eine Sequenzanalyse zur Verifizierung der Plasmid-DNA wird aktuell

durchgeführt. Sind die geplanten Mutationen vorhanden, sollte die Plasmid-DNA über

intergenetische Konjugation in das Genom von S. erythraea∆AT6hygR eingebracht

werden. Die resultierenden S. erythraea∆AT6hygR_pKSSU89* Varianten sollten zur

Analyse in Lochplatten des System Duetz fermentiert werden. Dabei sollte mit SNAC

aktivierten Malonatderivaten, wie Propargylmalonat gefüttert werden, um auf eine

erweiterte Substratspezifität zu testen. Die Fermentationsextrakte können mittels

LC/ESI-MS Messungen untersucht werden, da eine Akzeptanz von z.B.

Propargylmalonat zu einem Erythromycin-Derivat mit einer veränderten Masse führt.

Es bleibt abzuwarten, welche Ergebnisse sich aus den noch folgenden Experimenten

ergeben.

4.3. Fütterung mit Malonaten

Die Variante S. erythraea∆AT6hygR_pKSSU656 (Val295Ala) zeigt bereits eine

erweiterte Substratakzeptanz, da sie neben Methylmalonat auch Propargylmalonat

einbaut.[46] Eine Untersuchung mit Diethylethylmalonat (15) sollte aufzeigen, ob auch

dieses Derivat als Substrat akzeptiert wird. Hierbei konnte jedoch festgestellt werden,

dass der Einbau nicht SNAC aktivierter Substanzen zu gering ist, um eindeutige

Aussagen treffen zu können. Da nur Spuren des 2-Ethylerythromycins in den

Fermentationsextrakten gefunden wurden, sollte eine Fütterung der Mutante mit

SNAC-aktiviertem Ethylmalonat durchgeführt werden, um die Ergebnisse zu

verifizieren. Hierbei könnte auch die Fütterung weiterer Malonatderivate auf die

Akzeptanz durch die Val295Ala Mutante der AT6-Domäne getestet werden.

Insgesamt beschäftigte sich diese Arbeit mit der aufwendigen genetischen

Manipulation der Acyltranferase aus Modul 6 der Erythromycin-Polyketidsynthase.

Bei dem Versuch eine Änderung der Stereoselektivität zu erzielen ergaben sich


sowohl Schwierigkeiten bei der Auswahl eines geeigneten Sceeningsystems, als

auch bei der Auswertung der Ergebnisse. Da die endgültigen 1H-NMR-Analysen der

untersuchten AT6* Varinaten noch nicht vorliegen, bleibt abzuwarten welche

Rückschlüsse gezogen werden können. Möglicherweise ist es notwendig weitere

Untersuchungen zum Verständnis der Stereokontrolle der Polyketidsynthase zu

machen. Ebenso sind auch bei den Projekten zur erweiterten Substratspezifität noch

weitere Experimente durchzuführen, um eine Aussage über die Auswirkung der

eingebrachten Mutationen treffen zu können.

Die Ergebnisse zeigen, dass die Manipulation eines der größten bekannten Enzyme,

der Erythromycin-Polyketidsynthase (DEBS) eine komplexe Aufgabe ist. Die in dieser

Arbeit erlangten Erkenntnisse sind jedoch ein weiterer Schritt auf dem Weg diese

Enzyme zu verstehen und nutzen zu können. Zudem können sie Ansatzpunkt für das

Konstruieren weiterer aussichtsreicher Experimente dienen.

Material und Methoden | 62

5 Material und Methoden

5.1. Mikroorganismen, Plasmide, Oligonukleotide

5.1.1. Mikroorganismen

Tabelle 7: In den Experimenten eingesetzte Stämme.

Stamm Genotyp/Phenotyp Herkunft

OmniMAX™ 2 T1

Phage-Resistant

F′ {proAB+ lacIq lacZΔM15 Tn10(TetR) Δ(ccdAB)} mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80(lacZ)ΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 endA1 recA1 supE44 thi-1 gyrA96 relA1 tonA panD

Invitrogen

E. coli BL21Gold(DE3) B F- omp T hsdSB(rB-mB

-) dcm+ Tetr gal λ(DE3) endA Hte

Stratagene

E. coli ET12567/pUZ8002 F−, dam-13::Tn9, dcm-6 hsdM, hsdR, zjj- 202::Tn10, recF143, galK2, galT22, ara-14, lacY1, xyl15, leuB6, thi1, tonA31, rpsL136, his64, tsx78, mtlI, glnV44

AK Leadlay

Saccharopolyspora erythraea

NRRL-B-24072

n.a. ARS Culture Col.

Bacillus subtilis DSM-10 DSMZ

Saccharopolyspora erythraea

ΔAT6hygR

NRRL-B-24071 mit Austausch der

AT6-Domäne innerhalb von eryAIII

gegen ΩhygR

AK Schulz

5.1.2. Vektoren und Plasmide

Tabelle 8: In dieser Arbeit verwendete und konstruierte Plasmide.

Plasmid kb Basierend auf Resistenz Herkunft

pKSSU89 16.9 pKSSU40, DEBS3 kodierend unter

Kontrolle von PactIII

Apramycin AK Schulz

pKSSU96 16.7 Austausch der AT6 Kassette innerhalb von

pKSSU89 gegen Ωhyg

Apramycin,

Hygromycin

AK Schulz

pKSSU660 16.9 pKSSU89 mit AS Austausch: Met235Val Apramycin diese Arbeit

pKSSU661 16.9 pKSSU89 mit AS Austausch: Met235Gly Apramycin diese Arbeit

pKSSU662 16.9 pKSSU89 mit AS Austausch: Met235Ile Apramycin diese Arbeit

pKSSU663 16.9 pKSSU89 mit AS Austausch: Met235Leu Apramycin diese Arbeit

pKSSU664 16.9 pKSSU89 mit AS Austausch: Met235Ala Apramycin diese Arbeit

pKSSU665 16.9 pKSSU89 mit AS Austausch: Val295Met Apramycin diese Arbeit

pKSSU666 16.9 pKSSU89 mit AS Austausch: Val295Glu Apramycin diese Arbeit



pKSSU667 16.9 pKSSU89 mit AS Austausch: Met235Val

und Val295Met

Apramycin diese Arbeit

pKSSU668 16.9 pKSSU89 mit AS Austausch: Met235Gly

und Val295Met


pKSSU669 16.9 pKSSU89 mit AS Austausch: Met235Ile und

Val295Met


pKSSU670 16.9 pKSSU89 mit AS Austausch: Met235Leu

und Val295Met


pKSSU671 16.9 pKSSU89 mit AS Austausch: Met235Ala

und Val295Met


pKSSU672 16.9 pKSSU89 mit AS Austausch: Met235Val

und Val295Gln


pKSSU673 16.9 pKSSU89 mit AS Austausch: Met235Gly

und Val295Gln


pKSSU674 16.9 pKSSU89 mit AS Austausch: Met235Ile und

Val295Gln


pKSSU675 16.9 pKSSU89 mit AS Austausch: Met235Leu

und Val295Gln


pKSSU676 16.9 pKSSU89 mit AS Austausch: Met235Ala

und Val295Gln


pKSSU687 16.9 pKSSU89 mit AS Austausch: Tyr297Val Apramycin diese Arbeit

pKSSU688 16.9 pKSSU89 mit AS Austausch: Tyr297Val und

Ser299Ala



Ser299Gly



Ser299Leu


pKSSU691 16.9 pKSSU89 mit AS Austausch: Tyr297His Apramycin diese Arbeit

pKSSU692 16.9 pKSSU89 mit AS Austausch: Tyr297His und

Ser299Ala



Ser299Gly



Ser299Leu


pKSSU695 16.9 pKSSU89 mit AS Austausch: Tyr297Ala Apramycin diese Arbeit



pKSSU696 16.9 pKSSU89 mit AS Austausch: Tyr297Ala und

Ser299Ala



Ser299Gly



Ser299Leu


pKSSU699 16.9 pKSSU89 mit AS Austausch: Tyr297Gly Apramycin diese Arbeit

pKSSU700 16.9 pKSSU89 mit AS Austausch: Tyr297Gly

und Ser299Ala



und Ser299Leu



und Ser299Leu


pKSSU703 16.9 pKSSU89 mit AS Austausch: Tyr297Leu Apramycin diese Arbeit

pKSSU704 16.9 pKSSU89 mit AS Austausch: Tyr297Leu

und Ser299Ala



und Ser299Gly



und Ser299Leu


pKSSU707 16.9 pKSSU89 mit AS Austausch: Ser299Ala Apramycin diese Arbeit

pKSSU708 16.9 pKSSU89 mit AS Austausch: Ser299Gly Apramycin diese Arbeit

pKSSU709 16.9 pKSSU89 mit AS Austausch: Ser299Leu Apramycin diese Arbeit

5.1.3. Oligonukleotide

Oligonukleotide wurden als entsalzene Lyophilisate bei Eurofins MWG Operon

bestellt und in ddH2O gelöst. Vor dem Einsatz der Oligonukleotide wurden 1:10

Verdünnungen mit ddH2O angesetzt (10 pmol/µl). Die zur Sequenzierung

verwendeten Oligos wurden 1:3 mit ddH2O verdünnt (33.3 pmol/µl).

Tabelle 9: In den Experimenten eingesetzte Oligonukleotide. Die Schmelztemperaturen Tm wurden mit DNAClub by Xiongfong Chen berechnet, Ta: Annealingtemperaturen.

Name Nukleotidsequenz (5´3´) Tm [°C]

206_DEBS3_AT6-for ttacggcaagtcgcgcgggtcgtcgggcccggtgctgctgggttc

ggtg

82 (Ta 72)

207_DEBS3_AT6-rev aagccgccttccaggtccaccggcgtggtggccagcggtcgcc

agtcg

83 (Ta 72)



213_hygSca-100_for atcacgggcgcggatgtggccgtgg 69

184_DEBS3-seq19-rev acagccgcgccagcgacacc 63

451_Sonde_AT6_fwd tggcaggcgaccacgaacagctccgcggg 73

665_Asn336_seq tgcgctggcgggcaaggg 62

932_Seq_Met235_DEBS3_fwd tcgacgtcgtacagccggtgttg 57

847_Met235Val_fwd ctggcgggcaagggcggcGTCgtctcgttggcggctccc 79

848_Met235Val_rev gggagccgccaacgagacGACgccgcccttgcccgccag 79

849_Met235Gly_fwd ctggcgggcaagggcggcGGCgtctcgttggcggctccc 81

850_Met235Gly_rev gggagccgccaacgagacGCCgccgcccttgcccgccag 81

851_Met235Ile_fwd ctggcgggcaagggcggcATCgtctcgttggcggctccc 79

852_Met235Ile_rev gggagccgccaacgagacGATgccgcccttgcccgccag 79

853_Met235Leu_fwd ctggcgggcaagggcggcTTGgtctcgttggcggctccc 79

854_Met235Leu_rev gggagccgccaacgagacCAAgccgcccttgcccgccag 79

855_Met235Ala_fwd ctggcgggcaagggcggcGCCgtctcgttggcggctccc 81

856_Met235Ala_rev gggagccgccaacgagacGGCgccgcccttgcccgccag 81

857_Val295Met_fwd cgcgccaagacgctcccgATGgactacgcctcgcactcc 74

858_Val295Met_rev ggagtgcgaggcgtagtcCATcgggagcgtcttggcgcg 74

859_Val295Glu_fwd cgcgccaagacgctcccgGAGgactacgcctcgcactcc 75

860_Val295Glu_rev ggagtgcgaggcgtagtcCTCcgggagcgtcttggcgcg 75

877_Val295Gln_fwd cgcgccaagacgctcccgCAGgactacgcctcgcactcc 75

878_Val295Gln_rev ggagtgcgaggcgtagtcCTGcgggagcgtcttggcgcg 75

956_Val297_fwd ccaagacgctcccggtggacGTGgcctcgcactcccgccac

gtcgaggag

83

957_Val297_Ala299_fwd ccaagacgctcccggtggacGTGgccGCCcactcccgcca

cgtcgaggag

84

958_Val297_Gly299_fwd ccaagacgctcccggtggacGTGgccGGCcactcccgcca

cgtcgaggag

84

959_Val297_Leu299_fwd ccaagacgctcccggtggacGTGgccTTGcactcccgcca

cgtcgaggag

82

960_His297_fwd ccaagacgctcccggtggacCACgccTCGcactcccgcca

cgtcgaggag

83

961_His297_Ala299_fwd ccaagacgctcccggtggacCACgccGCCcactcccgcca

cgtcgaggag

84

962_His297_Gly299_fwd ccaagacgctcccggtggacCACgccGGCcactcccgcca

cgtcgaggag

84

963_His297_Leu299_fwd ccaagacgctcccggtggacCACgccTTGcactcccgcca

cgtcgaggag

82



964_Ala297_fwd ccaagacgctcccggtggacGCCgccTCGcactcccgcca

cgtcgaggag

83

965_Ala297_Ala299_fwd ccaagacgctcccggtggacGCCgccGCCcactcccgcca

cgtcgaggag

85

966_Ala297_Gly299_fwd ccaagacgctcccggtggacGCCgccGGCcactcccgcc

acgtcgaggag

85

967_Ala297_Leu299_fwd ccaagacgctcccggtggacGCCgccTTGcactcccgcca

CgtCgaggag

81

968_Gly297_fwd ccaagacgctcccggtggacGGCgccTCGcactcccgcca

cgtcgaggag

83

969_Gly297_Ala299_fwd ccaagacgctcccggtggacGGCgccGCCcactcccgcc

acgtcgaggag

85

970_Gly297_Gly299_fwd ccaagacgctcccggtggacGGCgccGGCcactcccgcc

acgtcgaggag

85

971_Gly297_Leu299_fwd ccaagacgctcccggtggacGGCgccTTGcactcccgcca

cgtcgaggag

82

972_Leu297_fwd ccaagacgctcccggtggacTTGgccTCGcactcccgcca

cgtcgaggag

82

973_Leu297_Ala299_fwd ccaagacgctcccggtggacTTGgccGCCcactcccgcca

cgtcgaggag

83

974_Leu297_Gly299_fwd ccaagacgctcccggtggacTTGgccGGCcactcccgcca

cgtcgaggag

83

975_Leu297_Leu299_fwd ccaagacgctcccggtggacTTGgccTTGcactcccgcca

cgtcgaggag

81

976_Ala299_fwd ccaagacgctcccggtggactacgccGCCcactcccgccac

gtcgaggag

82

977_Gly299_fwd ccaagacgctcccggtggactacgccGGCcactcccgccac

gtcgaggag

82

978_Leu299_fwd ccaagacgctcccggtggactacgccTTGcactcccgccacg

tcgaggag

80

1002_Val297_rev ctcctcgacgtggcgggagtgcgaggcCACgtccaccggga

gcgtcttgg

83

1003_Val297_Ala299_rev ctcctcgacgtggcgggagtgGGCggcCACgtccaccggg

agcgtcttgg

84

1004_Val297_Gly299_rev ctcctcgacgtggcgggagtgGCCggcCACgtccaccggg

agcgtcttgg

84

1005_Val297_Leu299_rev ctcctcgacgtggcgggagtgCAAggcCACgtccaccggg

agcgtcttgg

82

1006_His297_rev ctcctcgacgtggcgggagtgcgaggcGTGgtccaccggga

gcgtcttgg

83



1007_His297_Ala299_rev ctcctcgacgtggcgggagtgGGCggcGTGgtccaccggg

agcgtcttgg

84

1008_His297_Gly299_rev ctcctcgacgtggcgggagtgGCCggcGTGgtccaccggg

agcgtcttgg

84

1009_His297_Leu299_rev ctcctcgacgtggcgggagtgCAAggcGTGgtccaccggg

agcgtcttgg

82

1010_Ala297_rev ctcctcgacgtggcgggagtgcgaggcGGCgtccaccggga

gcgtcttgg

83

1011_Ala297_Ala299_rev ctcctcgacgtggcgggagtgGGCggcGGCgtccaccggg

agcgtcttgg

85

1012_Ala297_Gly299_rev ctcctcgacgtggcgggagtgGCCggcGGCgtccaccggg

agcgtcttgg

85

1013_Ala297_Leu299_rev ctcctcgacgtggcgggagtgCAAggcGGCgtccaccggg

agcgtcttgg

81

1014_Gly297_rev ctcctcgacgtggcgggagtgcgaggcGCCgtccaccggga

gcgtcttgg

83

1015_Gly297_Ala299_rev ctcctcgacgtggcgggagtgGGCggcGCCgtccaccggg

agcgtcttgg

85

1016_Gly297_Gly299_rev ctcctcgacgtggcgggagtgGCCggcGCCgtccaccggg

agcgtcttgg

85

1017_Gly297_Leu299_rev ctcctcgacgtggcgggagtgCAAggcGCCgtccaccggg

agcgtcttgg

82

1018_Leu297_rev ctcctcgacgtggcgggagtgcgaggcCAAgtccaccggga

gcgtcttgg

82

1019_Leu297_Ala299_rev ctcctcgacgtggcgggagtgGGCggcCAAgtccaccggg

agcgtcttgg

83

1020_Leu297_Gly299_rev ctcctcgacgtggcgggagtgGCCggcCAAgtccaccggg

agcgtcttgg

83

1021_Leu297_Leu299_rev ctcctcgacgtggcgggagtgCAAggcCAAgtccaccggga

gcgtcttgg

81

1022_Ala299_rev ctcctcgacgtggcgggagtgGGCggcgtagtccaccggga

gcgtcttgg

82

1023_Gly299_rev ctcctcgacgtggcgggagtgGCCggcgtagtccaccggga

gcgtcttgg

82

1024_Leu299_rev ctcctcgacgtggcgggagtgCAAggcgtagtccaccgggag

cgtcttgg

80


5.2. Nährmedien

Die verwendeten Medien für E. coli wurden ohne Zusatz der Antibiotika in der

Medienküche des Max-Planck-Instituts für molekulare Physiologie in Dortmund

hergestellt und bei 121 °C für 20 min bei 2 bar autoklaviert. Die Nährmedien für

S. erythraea wurden selbst angesetzt und autoklaviert (121°C, 2 bar, 20 min). Hierbei

erfolgte der Zusatz der Antibiotika und anderer Medienadditive erst kurz vor

Benutzung der Medien. Zur Herstellung der festen Medien wurden in der Regel 2 %

(w/v) Kobe Agar hinzugefügt.

5.2.1. Nährmedien für S. erythraea

Tabelle 10: Rezepte der Medien für S. erythraea.

Medium Bestandteile Konzentration

ABB13[56] Pepton aus Soja 5.00 g/L

CaCO3 3.00 g/L

MOPS 2.10 g/L

Lösliche Stärke 5.00 g/L

SY[57] Lösliche Stärke 10.00 g/L

Hefeextrakt 2.00 g/L

SM3[58] Glucose 5.00 g/L

Glucidex 50.00 g/L

Sojamehl 25.00 g/L

Rübenkraut 3.00 g/L

K2HPO4 0.25 g/L

CaCO3 2.50 g/L

SCM (pH 7.0) Lösliche Stärke 15 g/L

Pepton aus Soja 20 g/L

CaCl2 0.10 g/L


Sojaöl 50 ml/L

MOPS 10.50 g/L

TSB Tryptic Soybroth (Sigma Aldrich) 30.00 g/L


5.2.2. Nährmedien für E. coli

Tabelle 11: Die in dieser Arbeit verwendeten Medien für E. coli.

Medium Bestandteile Konzentration

LB (pH 7.4) Trypton 10.00 g/L


NaCl 10.00 g/L

SOB (pH 7.0) Trypton 20.00 g/L


NaCl 0.58 g/L

KCl 0.19 g/L

MgCl2 x 6 H2O 2.03 g/L

MgSO4 x 7 H2O 2.46 g/L

SOC (pH 7.0) SOB-Medium

Glucose 20 mM

5.3. Allgemeine Lösungen und Puffer

Die in diesem Abschnitt aufgeführten Lösungen wurden mit ddH2O auf das

gewünschte Volumen aufgefüllt. Alle Lösungen (mit Ausnahme der Lösungen für die

Gelelektrophorese) wurden separat autoklaviert oder sterilfiltriert (Porengröße:

0.2 μm, Schleicher&Schell). Medienadditive, wie Antibiotika oder die Lösungen für

die Konjugation wurden dem jeweiligen Medium erst nach dessen Autoklavieren

zugegeben. Die Lagerung der Lösungen erfolgte wenn nicht anders angegeben bei

Raumtemperatur.

5.3.1. Antibiotika

Tabelle 12: In den Experimenten verwendete Antibiotika.

Antibiotikum Stock

solution

Lösungs-

mittel

Endkonzen-

tration Quelle Lagerung

Kanamycin 50 mg/mL ddH2O 50 µg/mL Roth 4 °C

Chloramphenicol 50 mg/mL Ethanol 25 µg/mL Gerbu 4 °C

Apramycin 100 mg/mL ddH2O 50 µg/mL Sigma Aldrich 4 °C

Hygromycin 100 mg/mL ddH2O 50 µg/mL Roth 4 °C

Phosphomycin 100 mg/mL ddH2O 80 µg/mL Sigma Aldrich 4 °C


5.3.2. Lösungen für die Plasmid Isolation

Tabelle 13: Eingesetzte Lösungen zur Plasmid-Isolation.

Lösung Bestandteile Konzentration Anmerkung

MP1 Tris pH 8 25 mM bei 4 °C lagern

EDTA 10 mM

Glucose 50 mM

RNAse 200 µg/mL

MP2 NaOH 0.2 M

SDS 1 %

MP3 NaOAc 3 M pH 4.8 – 5.2

MP4 Lithiumchlorid 5 M

5.3.3. Lösungen für die Konjugation

Tabelle 14: Bei der Konjugation verwendete Lösungen.

Lösung Stammlösung Pro Liter Medium Anmerkung

Thiamin 1 % 1 mL Lagerung bei 4 °C

FeSO4 1.2 % 1 mL Zugabe einiger Tropfen HCl,

Lagerung bei 4 °C

MgCl2 10 mM 10 mL

5.3.4. Lösungen für die Präparation ultra-kompetenter Zellen

Tabelle 15: Bei der Präparation von ultra-kompetenten Zellen verwendete Lösung.


TB-Puffer PIPES 10 mM pH 6.7, Lagerung bei 4 °C

CaCl2 15 mM

KCl 250 mM

MnCl2 55 mM


5.3.5. Lösungen für die Gelelektrophorese

Tabelle 16: Verwendete Lösungen für die Gelelektrophorese.


TAE-Puffer 50x (pH 8.5) Tris 242.00 g/L pH 6.7

Essigsäure 2 M

EDTA (0.5 M) 50 mM

DNA-Ladepuffer 6x Saccharose 30 % (m/v) Lagerung bei 4 °C

Glycerol 20 %

Orange G 0.20 %

Ethidiumbromid Ethidiumbromid 10 µg/ml

5.3.6. Substrat-Puffer für die Fütterung

Tabelle 17: Verwendeter Puffer für die Fütterungsexperimente.

Puffer Bestandteile Konzentration

Substrat-Puffer Glucose 5 g/L

Glucidex 50 g/L

NaHCO3 83.88 g/L

NaCO3 185.90 mg/L

5.4. Enzyme

Tabelle 18: In dieser Arbeit eingesetzte Enzyme.

Enzym Aktivität Bezugsquelle

ET-SSB 500 µg/mL NEB

Phire Hot-Start DNA Polymerase Biozym

Phusion Flash High-Fidelity Master Mix Biozym

RecA 5 µg/µL Biozym

Restriktionsendonukleasen NEB

Restriktionsendonukleasen „fast digest“ Fermentas

RNAseA 70 U /mg Applichem

DnaseI 3000 U/mg Applichem

T4 DNA-Ligase 5 U/µL Fermentas

T4 DNA-Polymerase 5 U/µL Fermentas


5.5. Allgemeine Methoden der Molekularbiologie

5.5.1. Lagerung und Kultivierung der Mikroorganismen

Im Vorfeld dieser Arbeit wurden die optimalen Wachstumsbedingungen zur

Kultivierung, sowie die Fermentationsbedingungen von S. erythraea NRRL-B-24071

in der Arbeitsgruppe untersucht und optimiert. Die resultierenden Protokolle wurden

für diese Arbeit übernommen. Sie werden in den folgenden Abschnitten geschildert.

5.5.1.1. Lagerung von E. coli

Die langfristige Lagerung von E. coli Zellen erfolgte als Glycerolgefrierkulturen. Dazu

wurden bewachsene Kulturen in LB-Medium mit einer 80 %-igen Glycerollösung

versetzt, sodass die Endkonzentration 20 % Glycerol betrug. Die Stammlösungen

wurden bei -80 °C gelagert. Für ein bis zwei Tage wurden E. coli-Zellen in

LB-Medium oder auf LB-Agar Platten bei 4 °C gelagert.

5.5.1.2. Lagerung von S. erythraea

Die Lagerung der Stammkultur erfolgte bei -80 °C als Glycerolgefrierkultur. Für den

regelmäßigen Gebrauch wurde S. erythraea auf ABB13-Agar Platten ausplattiert und

bei 30 °C bis zur Sporenbildung kultiviert. Die bewachsenen Platten wurden bei

Raumtemperatur gelagert. Für längere Lagerzeiten wurde eine Übernachtkultur in

TSB erzeugt und mit dem gleichen Volumen einer 2 M Sorbitollösung vermengt. Die

Sorbitolstammlösungen wurden bei -80 °C aufbewahrt.

5.5.1.3. Kultivierung von E. coli

Die Kultivierung von E. coli Zellen erfolgte bei 30 °C und 180 rpm in LB-Medium

unter Zusatz der entsprechenden Antibiotika. (Apramycin bei E. coli_pKSSU89 oder

bei auf dem Vektor pKSSU89 basierenden Konstrukten, Apramycin und Hygromycin

bei E. coli_pKSSU96).

5.5.1.4. Kultivierung von S. erythraea

Bei der Kultivierung von S. erythraea ist eine hohe Belüftungsrate der Kulturen zu

beachten. Dazu wurden die verwendeten Glaskolben mit Stahlfedern am Boden

ausgestattet. Bei Verwendung von 24-Lochplatten wurden einige Glasperlen (3-4) in

jedes Loch gegeben.

Die Vorkultur von S. erythraea wurde bei 30 °C und 180 rpm für zwei Tage kultiviert.

Als Medium diente bei der Vorkultur das TSB-Medium, dagegen erfolgte die


Erythromycin-Produktion in der Regel in SM3-Medium. In Ausnahmefällen wurde das

SCM-Medium für die Fermentation verwendet. Für die Vorkultur wurde mit einer

Pipettenspitze ein Stück aus einer bewachsenen ABB13-Agarplatte ausgeschnitten

(ca. 0.5 cm2) und in einen Kolben gegeben. Gegebenenfalls wurde das

entsprechende Antibiotikum (Resistenz durch integrierten Vektor vermittelt)

zugegeben. Die Hauptkultur wurde mit 1/20 Volumen der Vorkultur ohne Zusatz

eines Antibiotikums angeimpft und bei 30 °C und 180 rpm für fünf Tage geschüttelt.

5.5.1.5. Screening von S. erythraea in 24-Lochplatten des System Duetz[53]

Abbildung 51: Kultivierung der Hauptkulturen in 24-Lochplatten des System Duetz.

Die Fermentationen für die initialen Screens der S. erythraea AT6* Mutanten wurden

in 24-Lochplatten (Leervolumen 5 mL) des System Duetz[53] kultiviert. Je vier

einzelne Klone wurden pro Mutante eingesetzt. Als Referenz diente die parallele

Kultivierung des S. erythraea Wildtyps (NRRL-B-24071). Für die Vorkultur wurden je

2 mL TSB mit Apramycin in ein Loch überführt und mit einem ca. 0.5 cm2 großen

Stück von einer ABB13 Agarplatte der jeweiligen Transkonjugante versetzt. Die

24-Lochplatten wurden mit einem luftdurchlässigen Verschlussfilm für Zellkulturen

verschlossen und in den Halterungen des System Duetz befestigt. Die Vorkultur

wurde für zwei Tage bei 30 °C und 180 rpm kultiviert. Anschließend wurde die

Hauptkultur in frischen Lochplatten angesetzt. Hierfür wurden 3 mL SM3-Medium mit

1/10 Volumen der Vorkultur angeimpft. Dazu wurden je 300 µL einer 100 mM Lösung

(Endkonzentration 10 mM) der SNAC aktivierten rac-Methylmalonsäure (13)

gegeben. Als Referenz diente hier die analoge Kultivierung der Klone ohne Zusatz


des Substrates 13. Die Platten wurden mit dem Deckel des System Duetz

verschlossen, befestigt und für fünf Tage bei 30 °C und 180 rpm fermentiert (vgl.

Abbildung 51). Zur Erstellung von Stammlösungen wurde der Rest der Vorkulturen

mit 80 % Glycerol (Endkonzentration 20 %) versetzt und bei -80 °C gelagert. Im

Anschluss an die Kultivierung wurden die einzelnen Kulturen in 15 mL Röhrchen

überführt und für eine Nacht bei -20 °C eingefroren, um durch eine Öffnung der

Zellen Erythromycin freizusetzen.

5.5.1.6. Extraktion mit Ethylacetat

Die Kulturen wurden in 15 mL Reaktionsgefäße überführt und nachfolgend mit dem

zweifachen Volumen Ethylacetat versetzt und über Nacht bei 19 °C und in der Regel

180 rpm geschüttelt. Es folgte die Zentrifugation bei 4 °C, 4000 g für 10 min.

Anschließend wurde die organische Phase in Reagenzgläser überführt und in einer

Vakuumzentrifuge bei 37 °C bis zur Trockne eingeengt. Die Rückstände wurden in

500 µl Methanol resuspendiert und für 30 min bei 13200 g zentrifugiert. Der

Überstand wurde in Probenröhrchen pipettiert und mittels LC/ESI-MS analysiert.

5.5.1.7. Fermentation zur Gewinnung von Erythromycin in präparativen Mengen

Abbildung 52: Fermentation von S. erythraea in 5 L Kolben mit Stahlfeder.

Zur NMR-Analyse von Erythromycin ist die Präparation in größeren Mengen

notwendig. Dazu wurden Kulturen in einem Gesamtvolumen von 1 L fermentiert. Für

die Vorkultur wurden 30 mL TSB-Medium (enthielt Apramycin, außer beim WT) in


einem 250 mL Kolben mit 1.5 mL Flüssig-Glycerolstammlösung oder einem 1 cm2

großem Stück aus einer bewachsenen ABB13-Agarplatte angeimpft und bei 30 °C

und 180 rpm kultiviert bis die Kultur dicht bewachsen war (etwa 1-2 Tage). Die

Kulturen wurden mit weiteren 30 mL TSB-Medium verdünnt, auf zwei 250 mL Kolben

aufgeteilt und unter den gleichen Bedingungen für 24 h weiter geschüttelt. Die

Hauptkulturen aus 1 L SM3-Medium wurden mit 50 mL Vorkultur angeimpft und in

zwei 5 L Kolben mit Spirale für 5 Tage bei 30 °C und 180 rpm fermentiert. Da eine

sehr hohe Schaumentwicklung zu beobachten war, wurde meist am zweiten Tag der

Fermentation tropfenweise Antischaum (Antifoam Y-30, Sigma Aldrich) zu den

Kulturen gegeben, bis kein Schaum mehr vorhanden war (etwa 0.5 ml).

Für die Fütterung mit der SNAC aktivierten Methylmalonsäure (13) wurde beim

Ansetzen der Hauptkulturen der erzeugten S. erythraea AT6* Klone 100 mL einer

100 mM Lösung des Substrates in Substrat-Puffer hinzugegeben.

Nach dem Ablauf der fünftägigen Fermentation wurden diese in Glasflaschen

überführt und bei -80 °C für eine Nacht tiefgefroren, um die Zellen zu öffnen.

5.5.1.8. Extraktion und Aufreinigung von Erythromycin aus Fermentations-

kulturen

Zur Isolierung und Aufreinigung von Erythromycin wurden die tiefgefrorenen Kulturen

bei 4 °C über Nacht aufgetaut. Im Anschluss wurden die Zellen und festen

Medienbestandteile durch Zentrifugation bei 4 °C, 4000 g für 20 min (Sorvall

Evolution RC) sedimentiert. Der Überstand wurde filtriert und das Filtrat mit

Ethylacetat extrahiert. Dabei wurde ein Protokoll zur Extraktion von

Erythromycin A (7) aus einer S. erythraea Fermentationskultur von Beran et al.[59]

angewandt. Das Protokoll wurde zur Erhöhung der Ausbeute wie im Folgenden

geschildert optimiert. Nachdem das Erythromycin A (7) mit EtOAc aus der

Fermentationskultur extrahiert wurde, erfolgte die Extraktion der EtOAc-Phase mit

angesäuertem Wasser (pH 4.5). Hierbei wurde nicht einmal, sondern viermal

extrahiert. Das resultierende Protokoll ist in Abbildung 53 schematisch dargestellt.

Zur Analyse wurden von den eingeengten organischen Phasen Proben genommen

und mittels LC/ESI-MS vermessen (im Schema mit einem "*" gekennzeichnet). Zur

weiteren Aufreinigung wurde der erhaltene Feststoff einer präparativen DC (vgl.

5.6.2.3) unterzogen.


Abbildung 53: Schema für die Isolation von Erythromycin aus einer S. erythraea Fermentation."*": Von diesen Phasen wurden nach Entfernen des Lösungsmittels Proben für eine

LC/ESI-MS Messung genommen.

5.5.2. Plasmidpräparation

Die Plasmidpräparation aus E. coli Zellen erfolgte ausgehend von einer

Übernachtkultur, die zuvor bei 30 °C und 180 rpm kultiviert worden ist. Es wurden je

1.5 mL der Zellsuspensionen für 2 min (4 °C, 13200 rpm) zentrifugiert. Der

Überstand wurde verworfen und das Zellsediment wurde dem folgenden Protokoll

unterzogen:

(Die Zusammensetzung der Lösungen MP1-MP4 sind in Tabelle 13 beschrieben)

Resuspendieren der Zellen in 50 µL MP1

Zelllyse durch Zugabe von 100 µL MP2, durch Invertieren mischen, Inkubieren

(max. 5 min) bis die Lösung klar ist

Zugabe von 75 µL MP3, mischen durch Invertieren

Zugabe von 225 µL MP4, mischen durch Invertieren

Sedimentieren von Proteinen, genomischer DNA und Zellbestandteile durch

Zentrifugation (10 min, 4 °C, 13200 rpm)


Überstand abnehmen und zum Fällen der Plasmid-DNA mit 900 µL absolutem

Ethanol versetzen, durch Invertieren mischen

Pelletieren der Plasmid-DNA durch Zentrifugation für 15 min (4 °C,

13200 rpm)

Überstand wird verworfen, das Sediment wird zum Waschen mit 300 µL

70 %-igem Ethanol versetzt und 2-3 min (4 °C, 13200 rpm) zentrifugiert

Überstand wird verworfen, erneut kurz zentrifugiert und der restliche

Überstand entfernt

Die gefällte und pelletierte DNA wird bei RT getrocknet

Lösen der Plasmid-DNA in 40 µL ddH2O

5.5.3. Ethanol-Präzipitation

Zur Fällung und Reinigung von Plasmid-DNA wurden die wässrigen DNA-Lösungen

nach folgendem Protokoll behandelt:

Zugabe von 1/10 Probenvolumen MP3 (vgl. Tabelle 13)

Zugabe von eiskaltem, absolutem Ethanol (2.5-faches Volumen)

Mischen durch Invertieren

Zentrifugation bei 4 °C, 13200 g für 10 min

Der Überstand wird verworfen

Die sedimentierte DNA wird mit 70 %-igem Ethanol gewaschen und im

Anschluss bei RT getrocknet

Resuspension der DNA im ½ Volumen ddH2O

Die Konzentration wird mittels Gelelektrophorese bestimmt

5.5.4. PCR-Protokolle

5.5.4.1. Kolonie-PCR

Die Kolonie-PCR diente der Identifizierung möglicher positiver Transkonjuganten

(Insert-tragender Klone). Von bewachsenen Agarplatten wurden einzelne Kolonien

mit Hilfe einer Pipettenspitze partiell von der Agarplatte abgestrichen und in

PCR-Gefäße, die mit 5 µL ddH2O gefüllt waren, überführt. Es folgte die Inkubation

bei 99 °C für 10 min. 1 µL der Zellsuspension wurde dann nachfolgend in die

eigentliche PCR eingesetzt. Das Pipettierschema eines PCR-Ansatzes ist in Tabelle

19 aufgeführt.


Tabelle 19: Pipettierschema für die Kolonie-PCR.

Komponente Menge

Betain (5 M) 2 µL

206_DEBS3_AT6-for (10 µM) 1 µL

207_DEBS3_AT6-rev (10 µM) 1 µL

Zellsuspension 1 µL

2x Mastermix Phire 5 µL

Das verwendete Temperaturprofil der PCR kann der Tabelle 20 entnommen werden.

Da die Schmelztemperatur Kann der Oligonukleotide >72 °C ist, konnte auf einen

separaten Annealing-Schritt verzichtet werden.

Tabelle 20: Temperaturprofil der Kolonie-PCR.

Schritt Temperatur Zeit

Denaturierung 99 °C 3 min

Denaturierung 99 °C 50 sec

Annealing/Elongation 72 °C 1 min

Finale Elongation 72 °C 1 min

Ende 4 °C ∞

Im Anschluss wurden 2 µL DNA-Ladepuffer zu den PCR-Produkten gegeben, die

gesamte Probe in ein 1 %-iges Agarosegel pipettiert und zusammen mit dem

Längenstandard (GeneRulerTM 1 kb Plus DNA Ladder, Fermentas) einer

Gelelektrophorese unterzogen.

5.5.4.2. Zielgerichtete Mutagenese durch overlap extension PCR

Die einzelnen Aminosäureaustausche innerhalb der DEBS AT6-Domäne wurden

mittels Sättigungsmutagenese mit spezifischen Oligonukleotiden durchgeführt.

Dieses Verfahren besteht aus zwei PCR Schritten (vgl. Abbildung 54).

25x


Abbildung 54: Schema zum Arbeitsablauf der zielgerichteten Mutagenese am Beispiel der Mutation Met235Val.

Da die Klonierung mittels SLIC-MIX (vgl. Kapitel 5.5.8) erfolgen sollte, mussten die

entsprechenden Sequenzen mit endständigen, komplementären Sequenzen

flankierend zum Zielvektor pKSSU96 versehen werden. Als Template diente das

mittels EcoRV linearisierte Plasmid pKSSU89. Die eingesetzten Oligonukleotide

waren durch die benötigten komplementären Sequenzen vergleichsweise lang. In der

ersten PCR wurden in getrennten Ansätzen separat je zwei Fragmente erzeugt, die

einen überlappenden Bereich von etwa 15 Nukleotiden links und rechts der

einzufügenden Mutation besaßen. Das Pipettierschema, sowie das eingesetzte

Temperaturprofil werden in Tabelle 19 und Tabelle 20 aufgeführt.

Tabelle 21: Pipettierschema der zielgerichteten Mutagenese, PCR Schritt I.

Komponente Menge

Fragment 1 Fragment 2

Betain (5 M) Betain (5 M) 2 µL

206_DEBS3_AT6-for (10 µM) 207_DEBS3_AT6-rev (10 µM) 1 µL

Oligo_rev (10 µM) Oligo_fwd (10 µM) 1 µL

Linearisierte Vektor DNA

(ca. 50 ng/µL)

Linearisierte Vektor DNA

(ca. 50 ng/µL)

1 µL

Mastermix Phusion 2x Mastermix Phusion 2x 5 µL


Tabelle 22: Temperaturprofil zur zielgerichteten Mutagenese, PCR Schritt I.

Schritt Temperatur Zeit

Denaturierung 99 °C 3 min

Denaturierung 99 °C 15 sec

Annealing 60 °C 1 sec

Elongation 72 °C 50 sec

Finale Elongation 72 °C 1 min

Ende 4 °C ∞

Zur Überprüfung der PCR wurde im Anschluss mit 3 µL des PCR-Produktes eine

Gelelektrophorese durchgeführt. Bei erfolgreicher PCR, wurde der Ansatz mit

insgesamt 30 µL Volumen wiederholt. Nach erneuter Kontrolle mittels

Gelelektrophorese wurden die DNA-Fragmente gelaufgereinigt.

In einer zweiten PCR wurden die beiden gereinigten Fragmente durch den Einsatz

der beiden äußeren Oligos assembliert. Der verwendete Ansatz wird in Tabelle 23

dargestellt. Das verwendete Temperaturprofil ist analog zur ersten PCR (Tabelle 22).

Tabelle 23: Pipettierschema der zweiten PCR zielgerichteten Mutagenese, overlap extension PCR, Schritt II.

Komponente Menge

Betain (5 M) 2 µL

206_DEBS3_AT6-for (10 µM) 1 µL

207_DEBS3_AT6-rev (10 µM) 1 µL

Fragment 1 0.5 µL

Fragment 2 0.5 µL

Mastermix Phusion 2x 5 µL

Auch hierbei wurde zunächst der Erfolg der PCR mittels Gelelektrophorese (mit 3 µL

PCR-Produkt) überprüft und im Anschluss der Ansatz auf 30 µL hochskaliert. Nach

erneuter Gelelektrophorese wurden die PCR-Produkte gegebenenfalls einem DpnI-

Verdau unterzogen und dann gelaufgereinigt. Die Konzentration der isolierten und

gereinigten DNA wurde durch ein Agarose-Gel bestimmt.

25x


5.5.4.2.1. DpnI Verdau des Mutterstranges nach der PCR

Die Template-DNA aus E. coli liegt methyliert vor. Durch Verdau mit dem

Restriktionsenzym DpnI wird diese methylierte DNA abgebaut. So kann nach

erfolgter PCR sichergestellt werden, dass die parentale DNA abgebaut wird. Der

dafür pipettierte Ansatz kann der Tabelle 24 entnommen werden.

Tabelle 24: Verdau der PCR-Produkte durch das FastDigest Enzym DpnI von Fermentas.

Komponente Volumen

PCR-Produkte 27 µL

FastDigest-Puffer 10x 3 µL

DpnI 1 µL

Der Ansatz wurde für 30 min bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurde Ladepuffer

hinzugefügt und die gesamte Probe einer Gelaufreinigung unterzogen.

5.5.5. Agarose-Gelelektrophorese von DNA

Die Gelelektrophorese wurde mit 1 %-igen Agarosegelen durchgeführt. Zur

Herstellung der Gele wurde 1 % (w/v) Agarose in 1x TAE-Puffer angesetzt und in der

Mikrowelle aufgekocht bis alles gelöst war. Die abgekühlte, aber flüssige

Agaroselösung wurde mit Ethidiumbromid (etwa 15 µL einer 10 mg/mL Lösung auf

200 mL Agaroselösung) versetzt und in eine Gelform gegossen. Das ausgehärtete

Gel wurde in eine Gelkammer gelegt und mit TAE-Puffer befüllt bis das Gel

vollständig mit Flüssigkeit bedeckt war. Die zu untersuchenden DNA-Proben

(1-15 µL) wurden mit 1/6 Volumen DNA-Ladepuffer versetzt und in die Geltaschen

gegeben. Zusätzlich wurde der Längenstandard GeneRulerTM 1 kb Plus DNA Ladder

(Fermentas, vgl. Abbildung 55), der zuvor mit Ladepuffer und Wasser (1:3) verdünnt

wurde, aufgetragen.


Abbildung 55: Längenstandard für die Agarosegele: GeneRulerTM 1 kb Plus DNA Ladder.

Die Auftrennung der DNA-Fragmente wurde bei 120 V für etwa 26 min durchgeführt.

5.5.5.1. Konzentrationsbestimmung mittels Gelelektrophorese

Zur Konzentrationsbestimmung der DNA-Proben nach der Ethanol-Fällung oder

Gelaufreinigung wurden je 1 µL der vorliegenden Proben und 1 µL einer 1:10

Verdünnung mit ddH2O in ein Gel eingetragen. Daneben erfolgte die Auftragung des

Längenstandards in Volumina von 1 µL sowie 5 µL. Nach erfolgter Gelelektrophorese

wurde die Intensität der DNA-Banden verglichen und mittels der angegebenen

DNA-Mengen des Längenstandards die Konzentration abgeschätzt.

Eine Berechnung der Konzentration wird hier beispielhaft gezeigt: Ist die Intensität

einer Bande der aufgetragenen Probe mit der der 1500 bp DNA-Bande des

Längenstandards vergleichbar, so ist bei 1 µL aufgetragener Probe die Konzentration

gleich 80/3 ng/µL (1:3 Verdünnung des Standards). Bei 5 µl aufgetragener Probe

wird zusätzlich mit dem Faktor fünf multipliziert (80/3*5 ng/µL).

5.5.6. Aufreinigung von DNA mittels Gelelektrophorese

Zur nebenproduktfreien Isolierung der Ziel-DNA nach einer PCR wurde eine

Gelaufreinigung durchgeführt. Dabei wurde die DNA-Probe entsprechend ihres

Volumens auf mehrere Taschen aufgeteilt. Nach erfolgter Gelelektrophorese konnten

die Banden durch das Interkalieren des Ethidiumbromids in die DNA-Fragmente

unter UV-Licht detektiert und ausgeschnitten werden. Hierbei ist wichtig, dass die

Dokumentation des Gels erst nach Ausschneiden der Gelstücke erfolgt, damit die


DNA nicht unnötig geschädigt wird. Das Gelstück wurde in ein

1.5 mL-Reaktionsgefäß überführt und die DNA mittels Gel Extraktions Kit von

PEQLAB Biotechnologie GmbH isoliert. Dabei wurde das Kurzprotokoll von PEQLAB

befolgt. Der optionale Waschschritt mit Binding Buffer wird nicht durchgeführt.

5.5.7. Restriktionsanalyse

5.5.7.1. Restriktionsverdau vor der Polymerase Kettenreaktion

Um die PCR zu erleichtern und somit eine erhöhte Effizienz zu erzielen, wurden die

eingesetzten Vektoren zuvor linearisiert. Hierzu wurden FastDigest Enzyme

verwendet. Für die Linearisierung von pKSSU89 wurde EcoRV eingesetzt. Der

Reaktionsansatz kann der folgenden Tabelle entnommen werden. Er wurde bei

37 °C für 30 min inkubiert.

Tabelle 25: Ansatz für den Restriktionsverdau.

Komponente Volumen

DNA (Plasmid) 20 µL

Puffer 10x (FD) 5 µL

Restriktionsendonuklease (FD) 3 µL

ddH2O 22 µL

5.5.7.2. Restriktionsverdau vor der Klonierung

Abbildung 56: Vektor pKSSU96. Die Hygromycin-Kassette (blau), sowie die Schnittstellen der Restriktionsenzyme ScaI und FseI sind gekennzeichnet.

Vor der Klonierung wurde der Vektor pKSSU96 linearisiert, indem die Hygromycin-

Kassette herausgeschnitten wurde. Dazu wurde das FastDigest Enzym ScaI

pKSSU96


verwendet. Wegen der enormen Größe des Vektors (ca. 16.8 kb) ist eine

Gelaufreinigung mit einer Ausbeute von nahezu 0 ng/µL nicht sinnvoll. Daher wird

zusätzlich ein FseI Verdau durchgeführt. Die FseI-Schnittstellen liegen innerhalb der

Hygromycin-Kassette. Damit wird sichergestellt, dass der Vektor nahezu vollständig

linearisiert vorliegt. Der Verdau mit ScaI erfolgt für 45 min bei 37 °C. Der dafür

pipettierte Ansatz kann der Tabelle 26 entnommen werden.

Tabelle 26: ScaI Verdau des Vektors pKSSU96.

Komponente Volumen


Puffer 10x (FD) 5 µL

ScaI (FD) 3 µL

ddH2O 22 µL

Für den Verdau mit FseI wurde die DNA präzipitiert. Der Verdau erfolgte für 30 min

bei 37 °C. In Tabelle 27 ist der hierfür verwendete Ansatz aufgeführt.

Tabelle 27: FseI Verdau des Vektors pKSSU96.

Komponente Volumen


Puffer 4 5 µL

FseI 1 µL

BSA 0.4 µL

ddH2O 18.6 µL

Nach erneuter Ethanolpräzipitation wurde die DNA resuspendiert und die

Konzentration über eine Agarose-Gelelektrophorese ermittelt.

5.5.7.3. Kontrollverdau

Die Verifizierung von Konstrukten wurde durch einen Verdau mit einem

Restriktionsenzym überprüft. Hier wurde NotI, ein FastDigest Enzym von Fermentas,

eingesetzt. In der Ziel-DNA-Sequenz bestehend aus Vektor inklusive Insert waren

drei Schnittstellen für NotI vorhanden. Davon liegt eine innerhalb der Insert-DNA und

zwei liegen im Vektorrückgrat. Dementsprechend gibt es bei positivem Einbau des

Inserts drei DNA-Fragmente.


Abbildung 57: Shuttle Vektor pKSSU89*. Die Aminosäurepositionen Val295 und Met235, sowie die NotI Schnittstellen sind gekennzeichnet. Die Fragmente nach einem Restriktionsverdau mit NotI haben ein Molekulargewicht von etwa 9.9, 5.2 und 1.6 kb.

Der pipettierte Ansatz kann der folgenden Tabelle entnommen werden. Die Zugabe

des Restriktionsenzyms erfolgte zuletzt und im Anschluss wurde der Ansatz für

15 min bei 37 °C inkubiert.

Tabelle 28: Kontrollverdau mit dem FastDigest Enzym NotI von Fermentas.

Komponente Volumen

DNA 4 µL

Puffer 10x 1 µL

NotI 1 µL

ddH2O 4 µL

Der verdauten Plasmid-DNA wurden 2 µL DNA-Ladepuffer hinzugefügt und die

gesamte Probe wurde auf ein 1%-iges Agarosegel aufgetragen und einer

Gelelektrophorese unterzogen.

5.5.8. Klonierungen mittels SLIC-MIX

Der in dieser Arbeit verwendete SLIC-MIX zur Klonierung basiert auf dem von Li und

Elledge[60] entwickeltem sequence and ligation independent cloning (SLIC).

Entscheidend hierbei sind der Einsatz von Vektor und Insert in äquimolaren Mengen,

sowie der Zusatz von T4-DNA Polymerase, die durch die Abwesenheit von

Nukleotiden ihre 3´-5´-Endonukleaseaktivität ausübt. Es entstehen kurze

einzelsträngige DNA Fragmente mit überhängenden Enden. Um eine erfolgreiche

Verknüpfung der beiden Fragmente zu ermöglichen wird das Insert mit flankierenden

pKSSU89*


Sequenzen (mindestens 15 nt lang) amplifiziert (vgl. 5.5.4.2), welche komplementär

zu den Enden des linearisierten Vektors sind. Nach Transformation in E. coli werden

die Doppelstrangbrüche (Nicks) geschlossen.

Die Weiterentwicklung der SLIC Methode in der Arbeitsgruppe[61] resultiert in einer

Erhöhung der Klonierungseffizienz durch den Einsatz von ET-SSB – einem

Einzelstrang stabilisierenden Protein – während der T4-DNA Polymerase

Behandlung. Die Methode dient vor allem dem Klonieren von großen und GC-reichen

PCR-Produkten. Der zuvor linearisierte Vektor und das mittels PCR amplifizierte

Zielgen wurden separat in äquimolaren Mengen für 60 min bei 22 °C mit

T4 DNA-Polymerase inkubiert. Es wurden in der Regel 500 ng Vektor-DNA

eingesetzt. Der vollständige Reaktionsansatz kann dem folgenden Pipettierschema

(vgl. Tabelle 29) entnommen werden.

Tabelle 29: Ansatz der SLIC-MIX Klonierung.

Lösung Vektor Insert

DNA 500 ng Äquimolar

10x T4-DNA Polymerase Puffer 1 µL 1 µL

BSA (100x) 0.10 µL 0.10 µL

ET-SSB (1:10) 1.60 µL 0.80 µL

T4-DNA Polymerase (Fermentas) 0.33 µL 0.10 µL

ddH2O Ad 10 µL Ad 10 µL

Durch Zugabe von dCTP (1/10 Volumina, 10 mM) wurde der Abbau des

Doppelstranges gestoppt. Anschließend wurde in einem zweiten Schritt jeweils 1 µL

beider behandelter DNA-Fragmente in ein neues Reaktionsgefäß pipettiert. Die

in vitro Verknüpfung von Insert und Vektor wird durch das Enzym Rekombinase A

(RecA) katalysiert. Der Ansatz wird für 45 min bei 37 °C inkubiert.

Tabelle 30: Pipettierschema für den Schritt 2 der SLIC MIX-Klonierung.

Lösung Mengenangabe

Vektor-DNA 1 µL

Insert-DNA 1 µL

10x T4 DNA Ligase Puffer (Fermentas) 0.5 µL

RecA (1:25) 0.1 µL

ddH2O Ad 5 µL


Die Klonierung mittels SLIC-MIX ist in Abbildung 58 schematisch dargestellt.

Abbildung 58: Schematische Darstellung der SLIC-MIX Methode[61]

Abkürzungen: Nukleotide (nt), Einzelstrangbindendes Protein (SSB), T4 DNA Polymerase (T4 DNA Pol), Rekombinase A (Rec A), Replikationsursprung E. coli (colE1ori), Apramycin Resistenzkassette [aac(3)IV], Origin des Plasmidtransfers (orIT RK2), Integrase des Bakteriophagen φ BT1(IntB1).

Es wurden 4 µL des Klonierungsansatzes in 50 µL chemisch kompetente

OmniMAXTM 2T1R Zellen transformiert (vgl. 5.5.9). Die Zellen wurden auf

Apramycin-haltige LB-Agarplatten ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert.

5.5.9. Einbringen genetischer Information in E. coli

5.5.9.1. Präparation von ultra-kompetenten E. coli-Zellen

Zur Steigerung der Transformationseffizienz wurden ultra-kompetente E. coli-Zellen

nach einem literaturbekannten Protokoll nach Inoue et al[62] präpariert. Dazu wurde

1 µL der entsprechenden Zellen mit ddH2O verdünnt (1:10) und auf einer

LB-Agarplatte mit entsprechendem Antibiotikum ausgestrichen. Die Platte wurde

über Nacht bei 37 °C inkubiert.


Es wurden 10-12 große Kolonien gepickt und in 250 mL SOB-Medium in

einem 1 L Kolben bei 19 °C und 120 rpm kultiviert, bis eine OD600 von 0.5

erreicht worden ist (etwa 24-36 h)

Der Kolben wurde für 10 min auf Eis aufbewahrt und anschließend wurde die

Kultur in sterile Zentrifugengefäße überführt

Zentrifugation bei 4000 rpm und 4 °C für 10 min pelletierte die Zellen

Der Überstand wurde verworfen und das Sediment behutsam in 20 mL

TB-Puffer (eiskalt) und 1.4 mL DMSO (wurde für eine Nacht bei -20 °C

gelagert) resuspendiert

Die Zelllösung wurde aliquotiert (50-100 µL), in flüssigem Stickstoff

schockgefroren und bei -80 °C gelagert

5.5.9.2. Transformation durch Hitzeschock

Die Transformation durch Hitzeschock erfolgte mit chemisch kompetenten E. coli

Zellen. Dazu wurde folgendes Protokoll befolgt:

Ein 50 µL Aliquot der ultra-kompetenten Zellen wird auf Eis aufgetaut

4-5 µL des zu transformierenden Plasmids werden hinzugegeben

15 min auf Eis inkubieren

Die Zellen werden für 1 min bei 42 °C einem Hitzeschock ausgesetzt

(Thermomixer, Eppendorf)

Anschließend werden die Zellen direkt auf Eis gegeben und für 2-5 min

inkubiert

Es werden 200 µL SOC-Medium hinzugegeben

Zur Regeneration der Zellen werden sie für mindestens 45 min bei 37 °C

inkubiert (Thermomixer, Eppendorf)

Die Zellsuspension wird auf antiobiotikabeinhaltende LB-Platten (Resistenz

durch transformiertes Plasmid vermittelt) ausgestrichen und über Nacht bei

37 °C kultiviert

5.5.10. Einbringen genetischer Information in Actinomyceten mittels

Konjugation

Ein Transfer der Plasmid-DNA aus einem E. coli-Donorstamm in einen

Actinomyceten als Rezipient kann über intergenetische Konjugation erfolgen. In

dieser Arbeit wurde als Donor der methylierungsdefiziente Stamm E. coli ET12567

eingesetzt. Dieser enthält das Plasmid pUZ8002, ein sich selbst nicht


transferierendes RP4 Derivat, wodurch der Stamm zum DNA-Transfer fähig ist. Als

Rezipent diente S. erythraea∆AT6hygR.

5.5.10.1. Vorbereitung des E. coli Donorstammes

Nach erfolgter Transformation des zu übertragenden Plasmids in E. coli

ET12567/pUZ8002 und Inkubation der Zellen bei 37 °C auf antiobiotikabeinhaltenden

LB-Platten über Nacht wurde je eine Kolonie von der Agarplatte gepickt und damit

eine 2 mL LB-Medium Übernachtkultur angeimpft. Das Medium enthielt die

entsprechenden Antibiotika (hier: Apramycin – Resistenz durch zu transformierendes

Plasmid vermittelt, Chloramphenicol und Kanamycin – Resistenz durch pUZ8002

vermittelt). Die Kultur wurde über Nacht bei 30 °C und 180 rpm geschüttelt.

Anschließend wurde die bewachsene Flüssigkultur mit frischem LB-Medium (enthielt

die entsprechenden Antibiotika) in einem Verhältnis von 1:5 verdünnt und für weitere

3 h bei 30 °C und 180 rpm inkubiert. Die Zellsuspension wurde zentrifugiert (5 min,

4000 g, RT) und die pelletierten Zellen zweimal mit etwa 5 mL TSB-Medium

gewaschen, bevor sie in etwa 125 µL TSB-Medium resuspendiert wurden.

5.5.10.2. Vorbereitung des S. erythraea Rezipientenstammes

Es wurde die Sorbitolstammlösung von S. erythraea∆AT6hygR verwendet. Pro

Konjugationsansatz wurden 2 mL dieser Myceliumlösung eingesetzt. Die Lösungen

wurden bei RT aufgetaut und zentrifugiert (5 min, 4000 g, RT). Nach zweimaligem

Waschen der Zellpellets mit TSB-Medium wurden die Zellen in TSB-Medium

resuspendiert. Dabei wurden je Konjugationsansatz 200 µL Myceliumlösung

verwendet.

5.5.10.3. Konjugation und Selektion

Es wurden je 125 µL E. coli Kultur und 200 µL Myceliumlösung für einen

Konjugationsansatz gemischt (gründliches Auf- und Abpipettieren). Die Suspension

wurde tropfenweise auf sehr trockene SY-Agarplatten (komplettiert mit Thiamin,

FeSO4 und MgCl2) pipettiert. Nach einer kurzen Antrocknungszeit (etwa 5 min) im

laminaren Luftstrom der Sterilbank wurde die Zellsuspension gründlich mit einem

Einwegspatel auf der Agarplatte verteilt. Im Anschluss wurden die Platten für weitere

15-20 min getrocknet. Als Negativkontrolle wurden auf einer Platte einzig 200 µL

Mycelium ausplattiert und in gleicher Weise wie die Konjugationsansätze behandelt.

Die Platten wurden bei 30 °C für etwa 16-18 h inkubiert, bevor sie mit Soft-Agar

bestehend aus TSB-Medium und SY-Agar (4:1), sowie mit den Antibiotika Apramycin


und Phosphomycin (zur Abtötung der E. coli-Zellen) komplementiert, überschichtet

wurden. Nach kurzer Antrocknungszeit wurden die Platten bei 30 °C weiter inkubiert,

bis kleine Kolonien sichtbar wurden (etwa 5 Tage). Die Kolonien wurden mit einem

Zahnstocher auf ABB13-Platten (enthielt Phosphomycin und Apramycin) übertragen.

Nach einer weiteren Inkubationsphase bei 30 °C für etwa 5 Tage wurden die Platten

bei Raumtemperatur gelagert.

5.5.11. Testung auf antimikrobielle Aktivität

Zur Bestimmung der antimikrobiellen Aktivität wurde der Hemmhof-Test mit dem

Gram-positiven Bakterium Bacillus subtilis (DSM10) durchgeführt. Hierzu wurden

200 µL einer B. subtilis Sporensuspension zu 200 mL abgekühltem, flüssigen

LB-Agar pipettiert und in Petrischalen gegossen. Mit Hilfe einer umgekehrten 50 µL

Pipettenspitze wurden Löcher im Agar erzeugt. In diese Löcher wurden 50 µL

Fermentationssuspension pipettiert und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die vom

Wachstum ausgesparten Hemmhöfe erlauben eine Beurteilung der antimikrobiellen

Aktivität der zu testenden Substanzen.

5.5.12. Sequenzierung

Um die korrekte Amplifikation der gewünschten Mutationen zu bestätigen, wurden

nach der Plasmidpräparation Sequenzierungen bei StarSEQ GmbH in Auftrag

gegeben. Dazu wurden je 4 µL Plasmid-DNA, 2 µL Betain (5 M) und 1 µL des

entsprechenden Oligos (10 µM) zusammen pipettiert und eingeschickt. Die

verwendeten Oligos für die jeweiligen Plasmide sind in Tabelle 31 aufgeführt.

Tabelle 31: Verwendete Oligonukleotide für die Sequenzierung der entsprechenden Vektoren.

Vektor Oligo 235 Oligo 295 Oligo 297 und 299

pKSSU660-676 451_Sonde_AT6_fwd bzw.

932_Seq_Met235_DEBS3_fwd

665_Asn336_seq -

pKSSU687-709 - - 665_Asn336_seq

Die erhaltenen Ergebnisse wurden über Alignments mit T-Coffee – Multiple

Sequence Alignment ausgewertet.


5.5.13. Protokolle zur Mutagenese der AT6-Domäne

5.5.13.1. Wiederherstellung der Wildtyp Aktivität

Zur Wiederherstellung der Wildtyp Aktivität wurde das DEBS3 kodierende Plasmid

pKSSU89 in E. coli ET12567/pUZ8002 transformiert und anschließend über

intergenetische Konjugation in S. erythraea∆AT6hygR übertragen. Die

Transkonjuganten wurden auf SY-Agarplatten bei 30 °C kultiviert und am nächsten

Tag mit den Antibiotika Apramycin sowie Phosphomycin überschichtet. Die Klone

wurden gepickt und auf ABB13 Agarplatten übertragen. Nach erneuter Inkubation bei

30 °C wurden vier Klone in 24-Lochplatten fermentiert. Die Analyse der

Erythromycin-Produktion erfolgte mittels LC/ESI-MS und einem Hemmhoftest. Dabei

diente der S. erythraea Wildtyp als Vergleich.

5.5.13.2. Präparation der Stereospezifitäts-Mutanten

Zur Erzeugung der Mutanten-Bibliothek bestehend aus 17 Mutanten wurde die

overlap extension PCR in Kombination mit dem SLIC-MIX verwendet. Zuerst

erfolgten die Einzelaminosäureaustausche mittels PCR. Als Template diente der

zuvor durch einen EcoRV Verdau linearisierte Vektor pKSSU89. Die Doppelmutanten

wurden nachfolgend mit den Vektoren, die die entsprechenden

Einzelaminosäureaustausche enthalten, amplifiziert. Diese Vektoren wurden

ebenfalls vor Einsatz in der PCR mittels EcoRV linearisiert.

Die erzeugten Mutanten mit den ensprechenden als Template dienenden Vektoren

und die verwendeten Oligos sind in Tabelle 32 aufgeführt.

Tabelle 32: Bibliothek der Stereospezifitäts-Mutanten mit den entsprechend verwendeten Plasmiden und Oligos.

Plasmid Mutante Template Oligo fwd Oligo rev

pKSSU660 Met235Val pKSSU89 847_Met235Val 848_Met235Val

pKSSU661 Met235Gly pKSSU89 849_Met235Gly 850_Met235Gly

pKSSU662 Met235Ile pKSSU89 851_Met235Ile 852_Met235Ile

pKSSU663 Met235Leu pKSSU89 853_Met235Leu 854_Met235Leu

pKSSU664 Met235Ala pKSSU89 855_Met235Ala 856_Met235Ala

pKSSU665 Val295Met pKSSU89 857_Val295Met 858_Val295Met

pKSSU666 Val295Glu pKSSU89 859_Val295Glu 860_Val295Glu

pKSSU667 Met235Val, Val295Met pKSSU665 847_Met235Val 848_Met235Val

pKSSU668 Met235Gly, Val295Met pKSSU665 849_Met235Gly 850_Met235Gly



pKSSU669 Met235Ile, Val295Met pKSSU665 851_Met235Ile 852_Met235Ile

pKSSU670 Met235Leu, Val295Met pKSSU665 853_Met235Leu 854_Met235Leu

pKSSU671 Met235Ala, Val295Met pKSSU665 855_Met235Ala 856_Met235Ala

pKSSU672 Met235Val, Val295Gln pKSSU660 877_Val295Gln 878_Val295Gln

pKSSU673 Met235Gly, Val295Gln pKSSU661 877_Val295Gln 878_Val295Gln

pKSSU674 Met235Ile, Val295Gln pKSSU662 877_Val295Gln 878_Val295Gln

pKSSU675 Met235Leu, Val295Gln pKSSU663 877_Val295Gln 878_Val295Gln

pKSSU676 Met235Ala, Val295Gln pKSSU664 877_Val295Gln 878_Val295Gln

Die Ansätze der Einzelaminosäureaustausche (pKSSU660-666) erfolgten

notwendigerweise zuerst. Nach der ersten PCR wurden die Produkte einem

DpnI-Verdau unterzogen, wodurch die Template-DNA zerstört werden sollte. Die

Produkte wurden über eine Gelelektrophorese analysiert und im Anschluss erfolgte

die Gelaufreinigung der Fragmente. Die zweite PCR, in der jeweils die zueinander

gehörigen Fragmente eingesetzt wurden, resultierte in je einer Ziel-DNA-Sequenz

(AT6*). Diese PCR-Produkte wurden mittels Gelelektrophorese überprüft und erneut

gelaufgereinigt.

Für die Doppelaminosäureaustausche (pKSSU667-676) wurden die klonierten

Vektoren der Einzelaminosäureaustausche als Template verwendet (vgl. Tabelle 32).

Das Protokoll der overlap extension PCR erfolgte analog zu dem der

Einzelmutanten, mit Ausnahme des DpnI Verdaus nach der ersten PCR. Die

DNA-Fragmente wurden hier direkt gelaufgereinigt und für die zweite PCR

verwendet.

Von allen Ziel-DNA Sequenzen wurde die Konzentration mittels

Agarose-Gelelektrophorese anhand des Größenstandards berechnet.

Die gereinigte AT6* Ziel-DNA mit den zum Vektor komplementären Enden wurde

über die SLIC-MIX-Methode in den Vektor pKSSU96 integriert. Dieser wurde dafür

mit den Restriktionsenzymen ScaI und FseI geschnitten. Es folgte eine

Ethanolfällung und Bestimmung der Konzentration der Vektor-DNA. Die linearisierte

DNA und die AT6*-DNA-Sequenzen wurden in äquimolaren Mengen im SLIC-MIX

eingesetzt. Da der Vektor mit ca. 1.6 kb etwa 10x größer ist als das zu inserierende

Insert mit 1.7 kb wurde 500 ng Vektor und 50 ng Insert – sprich äquimolare Mengen


– verwendet. Nach der Ligation von Vektor und Insert durch die Rekombinase A im

dritten Schritt des SLIC-MIX wurden je 4 µL der neuen Vektor-DNA in kompetente

E coli OmniMAX™ 2 T1 transformiert. Die Zellen wurden auf LB-Platten mit

Apramycin ausplattiert und über Nacht bei 37 °C inkubiert.

Am darauffolgenden Tag wurden die Klone mit einer Kolonie-PCR überprüft. Dafür

wurden in der Regel 3-8 Klone jeder Platte zur Hälfte abgestrichen. Hierfür wurden

die Oligos mit den Nummern 206 und 207 verwendet. Die erfolgreiche Klonierung

wurde mittels einer Agarose-Gelelektrophorese überprüft. Wurde das Insert

amplifiziert, konnte eine Bande bei etwa 1.7 kb beobachtet werden. Mit den positiven

Klonen wurden Übernachtkulturen in LB-Medium (komplettiert mit Apramycin)

angeimpft.

5.5.13.3. Präparation der Substratspezifitäts-Mutanten

Die Mutagenese zur Erzeugung der Substratspezifitäts-Mutanten erfolgte auch hier

mittels zielgerichteter PCR. Alle Mutanten wurden mit dem Plasmid pKSSU89 als

Template erzeugt. Der Vektor wurde vor dem Einsatz in der PCR durch das Enzym

EcoRV linearisiert. Die verwendeten Oligos enthielten – falls nötig – zwei Mutationen.

Somit konnten alle Mutanten parallel präpariert werden. Die für die jeweilige Mutante

verwendeten Oligos sind in Tabelle 33 aufgeführt.

Tabelle 33: Bibliothek der Substratspezifitäts-Mutanten mit den entsprechend verwendeten Plasmiden und Oligos.


pKSSU687 Tyr297Val pKSSU89 956_Val297 1002_Val297

pKSSU688 Tyr297Val,

Ser299Ala

pKSSU89 957_Val297_Ala299 1003_Val297_Ala299

pKSSU689 Tyr297Val,

Ser299Gly

pKSSU89 958_Val297_Gly299 1004_Val297_Gly299

pKSSU690 Tyr297Val,

Ser299Leu

pKSSU89 959_Val297_Leu299 1005_Val297_Leu299

pKSSU691 Tyr297His pKSSU89 960_His297 1006_His297

pKSSU692 Tyr297His,

Ser299Ala

pKSSU89 961_His297_Ala299 1007_His297_Ala299

pKSSU693 Tyr297His,

Ser299Gly

pKSSU89 962_His297_Gly299 1008_His297_Gly299

pKSSU694 Tyr297His,

Ser299Leu

pKSSU89 963_His297_Leu299 1009_His297_Leu299


pKSSU695 Tyr297Ala pKSSU89 964Ala297 1010_Ala297

pKSSU696 Tyr297Ala,

Ser299Ala

pKSSU89 965_Ala297_Ala299 1011_Ala297_Ala299

pKSSU697 Tyr297Ala,

Ser299Gly

pKSSU89 966_Ala297_Gly299 1012_Ala297_Gly299

pKSSU698 Tyr297Ala,

Ser299Leu

pKSSU89 967_Ala297_Leu299 1013_Ala297_Leu299

pKSSU699 Tyr297Gly pKSSU89 968_Gly297 1014_Gly297

pKSSU700 Tyr297Gly,

Ser299Ala

pKSSU89 969_Gly297_Ala299 1015_Gly297_Ala299

pKSSU701 Tyr297Gly,

Ser299Leu

pKSSU89 970_Gly297_Gly299 1016_Gly297_Gly299

pKSSU702 Tyr297Gly,

Ser299Leu

pKSSU89 971_Gly297_Leu299 1017_Gly297_Leu299

pKSSU703 Tyr297Leu pKSSU89 972_Leu297 1018_Leu297

pKSSU704 Tyr297Leu,

Ser299Ala

pKSSU89 973_Leu297_Ala299 1019_Leu297_Ala299

pKSSU705 Tyr297Leu,

Ser299Gly

pKSSU89 974_Leu297_Gly299 1020_Leu297_Gly299

pKSSU706 Tyr297Leu,

Ser299Leu

pKSSU89 975_Leu297_Leu299 1021_Leu297_Leu299

pKSSU707 Ser299Ala pKSSU89 976_Ala299 1022_Ala299

pKSSU708 Ser299Gly pKSSU89 977_Gly299 1023_Gly299

pKSSU709 Ser299Leu pKSSU89 978_Leu299 1024_Leu299

In der ersten PCR wurden zwei Fragmente erzeugt, die einen überlappenden

Bereich in der Mitte enthalten. Nach einer Agarose-Gelelektrophorese zur Kontrolle

der PCR und Gelaufreinigung der Fragmente, wurden diese in einer zweiten PCR

zusammengefügt. Die Ziel-DNA AT6* wurde auch mittels Gelelektrophorese

überprüft und gelaufgereinigt. Die Konzentration der DNA wurde anhand eines

Größenstandards durch eine Agarose-Gelelektrophorese bestimmt.

Die Klonierung erfolgte – analog zur Präparation der Stereospezifitätsvarianten – in

den Vektor pKSSU96. Auch hier wurde dafür die SLIC-MIX Methode verwendet. Der

Vektor wurde zuvor durch einen ScaI und FseI Verdau geschnitten. Im ersten Schritt

der Klonierung wurden Vektor und Insert in äquimolaren Mengen eingesetzt und


parallel, jedoch getrennt voneinander mit der T4-Polymerase behandelt. Nach

Stoppen dieser Reaktion durch Zugabe von dCTP wurden Vektor und Insert im

folgenden Schritt durch Einsatz des Enzyms Recombinase A ligiert.

Nach der Klonierung erfolgte die Transformation der Plasmide pKSSU89* in

kompetente E coli OmniMAX™ 2 T1 Zellen. Die transformierten Zellen wurden auf

LB-Platten ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert.

Am darauffolgenden Tag wurden 1-4 Klone zur Hälfte abgestrichen und in eine

Kolonie-PCR (Oligos 206 & 207) eingesetzt. Klone, bei denen durch die PCR das

Insert nachgewiesen werden konnte, wurden in LB-Medium mit entsprechendem

Antibiotikum kultiviert.

Nach Inkubation über Nacht wurden die Kulturen zentrifugiert und die Plasmide über

eine Plasmidpräparation isoliert. Durch einen Kontrollverdau mit NotI wurde das

Vorhandensein des gewünschten Plasmides pKSSU89* kontrolliert. Die positiv

getesteten Plasmide wurden bei -20 °C gelagert.

5.5.13.4. Protokolle zur Konjugation der erzeugten DEBS3AT6* Expressions-

plasmide in S. erythraea∆AT6hygRAT6*; Stereospezifitätsvarianten

Die Konjugation in S. erythraea∆AT6hygR erfolgte über einen intergenetischen

Plasmidtransfer mit E. coli ET12567/pUZ8002 als Donorstamm.

Zunächst wurde die Vektor-DNA (pKSSU660-672) aus den Übernachtkulturen

(E. coli OmniMAX™ 2 T1) über eine Miniplasmidpräparation isoliert. Es wurden 4 µL

der isolierten DNA für einen Kontrollverdau mit NotI verwendet, um die erfolgreiche

Klonierung erneut zu überprüfen. Die Plasmide einer der positiv getesteten Klone

wurden und in E. coli ET12567/pUZ8002 Zellen transformiert. Die transformierten

Zellen wurden auf Apramycin beinhaltenden LB-Agarplatten ausgestrichen und über

Nacht bei 37 °C inkubiert. Am darauffolgenden Tag wurde ein Klon gepickt und in

einer Übernachtkultur (LB-Medium mit entsprechendem Antibotikum) kultiviert. Die

Übernachtkultur wurde am nächsten Tag 1:5 verdünnt und nochmal für 5 h kultiviert.

Nach der Wachstumsphase wurden die E. coli ET12567 Zellen, die das gewünschte

Plasmid beinhalten, zentrifugiert und zusammen mit vorbereiteten

S. erythraea∆AT6hygR Zellen auf SY-Agarplatten konjugiert. Als Negativkontrolle

diente eine Agarplatte auf denen nur S. erythraea Zellen ausplattiert wurden. Nach

Inkubation über Nacht wurden die Platten mit TSB:SY-Agar (4:1) überschichtet und


für etwa 5 Tage weiter inkubiert bis Kolonien sichtbar wurden. Wenn die

Negativkontrolle ohne Bewuchs war, wurden die Kolonien auf ABB13-Agarplatten

übertragen und für weitere 5 Tage inkubiert.

5.5.13.5. Screening der Stereospezifitätsmutanten

Die erzeugten S. erythraeaAT6* Varianten wurden einem Screening unterzogen.

Dazu wurden je vier Klone einer Mutante von der jeweiligen ABB13-Agarplatte

ausgewählt und in 24-Lochplatten des System Duetz fermentiert. Die Vorkulturen

wurden mit je einem Agarstück angeimpft (etwa 0.5 cm2). Die Hauptkulturen erfolgten

anschließend parallel mit und ohne Zugabe des Substrates (13). Der Wildtyp wurde

als Kontrolle ebenfalls mit und ohne Zugabe des synthetischen Bausteins 13

fermentiert. Im Anschluss an die Fermentation wurden die Kulturen mit Ethylacetat

extrahiert und mittels LC/ESI-MS analysiert.

Anhand der Daten des Screenings in Lochplatten wurden Mutanten bestimmt, die für

ein Screening im 1 L-Maßstab sinnvoll erschienen. Es wurden die Zellen mit den

Vektoren pKSSU667, pKSSU665 und pKSSU660 im 1 L-Maßstab mit Fütterung des

Substrates 13 fermentiert. Als Vergleichswert wurde die Mutante pKSSU667

ebenfalls ohne zusätzliche Substratzugabe fermentiert. Als Kontrolle der

Fermentationen diente die Kultivierung des Wildtyps ohne Fütterung.

Die Extraktion des Erythromycins erfolgte im Anschluss an die Fermentation nach

dem in 5.5.1.6 aufgeführten Protokoll. Die weitere Aufreinigung wurde mittels

präparativer DC durchgeführt (vgl. 5.6.2.3). Die gewonnene Probe wurde mittels

LC/ESI-MS und 1H-NMR analysiert.

5.5.14. Fütterungsexperimente mit Malonaten

Die Kultivierung der S. erythraea Kulturen entspricht dem Protokoll aus Kapitel

5.5.1.4. Die Fütterung wurde mit käuflich erworbenem Diethylpropargylmalonat (16)

und Diethylethylmalonat (15) durchgeführt. Es wurde die Mutante S. erythraea

∆AT6_pKSSU656 (Val295Ala) und als Referenz der S. erythraea Wildtyp

(NRRL-B-24071) untersucht. Die Kulturen wurden in 50 mL Kolben mit Spirale

angesetzt. Es wurden Kulturen vom Wildtyp und von je vier Klonen der Mutante

angesetzt. In der Vorkultur der Mutante wurde das TSB-Medium mit dem

Antibiotikum Apramycin (Resistenz vermittelt über das Plasmid) versetzt. Die

Fütterung mit den Malonaten erfolgte in drei Endkonzentrationen (10, 15 und


20 mM). Zur Kontrolle wurde jeder Klon und der Wildtyp ohne Substratzugabe

kultiviert. Nach der Fermentation wurden die Lösungen in 15 mL Gefäße überführt

und bei -20 °C über Nacht eingefroren. Die Extraktion erfolgte nach dem in Kapitel

5.5.1.5 aufgeführten Protokoll. Die Proben wurden mittels LC/ESI-MS und MS/MS

analysiert.


5.6. Allgemeine chemische Methoden

5.6.1. Geräte und Chemikalien

5.6.1.1. Geräte

Für Reaktionen unter Schutzgasatmosphäre wurden nach den üblichen Verfahren

(Schlenk)-Kolben verwendet, die vor Benutzung im Trockenschrank bei 110 °C

ausgeheizt und unter Hochvakuum getrocknet wurden. Als Schutzgas wurde hier

Argongas verwendet.

5.6.1.2. Chemikalien

Die verwendeten Chemikalien stammten entweder aus Schenkungen oder wurden

bei den Firmen Sigma Aldrich, Alfa Aesar und VWR käuflich erworben. Die

Lösungsmittel wurden i.A. in trockener Form käuflich erworben. Wasserfreies DCM

wurde mit CaH2 unter Argonatmosphäre frisch destilliert.

5.6.2. Chromatographische Verfahren

5.6.2.1. Säulenchromatographie

Die Säulenchromatographie erfolgte über Kieselgel der Firma Acros mit einer

Partikelgröße von 35-70 µm. Die Beladung der Säule erfolgte stets mit einer

Suspension aus Kieselgel und dem verwendeten Lösungsmittelgemisch. Das

verwendete Lösungsmittelgemisch ist bei den entsprechenden Versuchsvorschriften

angegeben.

5.6.2.2. Dünnschichtchromatographie

Für die Dünnschichtchromatographie wurden ausschließlich Aluminium-Fertigfolien

Silicagel 60 mit Fluoreszenzindikator F-254 der Firma Merck eingesetzt. Die

Detektion erfolgte über UV-Absorbtion oder durch Entwicklung mit einem Heizluftfön

nach Behandlung mit einer Permanganatlösung (2 mL 5 % NaOH, 6.6 g K2CO3, 1 g

KmnO4, 100 mL H2O).

5.6.2.3. Präparative Dünnschichtchromatographie

Die präparative Dünnschichtchromatographie wurde auf 20x20 cm PLC Platten, mit

einer 2 mm Kieselgel 60 Schicht, einer Konzentrierungszone (20x4 cm) und einem

Fluoreszenzindikator F-254 von Merck durchgeführt. Das verwendete Protokoll ist

einer literaturbekannten Vorschrift[59] angelehnt.


Die extrahierten Feststoffe wurden in dem kleinstmöglichen Volumen (etwa 100 µL

für ca. 50 mg) Chloroform:MeOH 2:1 gelöst. Es wurde eine möglichst dünne Linie

innerhalb der Konzentrierungszone aufgetragen. Zusätzlich wurde als Referenz

käuflich erworbenes Erythromycin aufgetragen. Die Platte wurde getrocknet, damit

das aufgetragene Lösungsmittel vollständig verdampft war bevor die DC-Platte in die

DC-Kammer gestellt wurde. Das verwendete Laufmittel war ein Gemisch aus

Chloroform, Methanol und Ammoniaklösung in einem Volumenverhältnis von

(90:10:1). Zur Detektion des nicht UV-aktiven Erythromycins wurde ein 1-2 cm breiter

Streifen am Rand der DC-Platte mit einer Permanganatlösung (vgl. 5.6.2.2)

angefärbt und mittels Heizluftfön (max. 50 °C) entwickelt. Auf der Höhe des/der

sichtbaren Flächen wurde das Kieselgel mit Hilfe eines Spatels von der Platte

gekratzt und in ein 15 bzw. 50 mL Röhrchen überführt. Die abgekratzten

Kieselgelproben wurden mit dem zweifachen Volumen eines Chloroform:Methanol-

Gemisches (2:1) versetzt und über Nacht bei 19 °C und 150 rpm geschüttelt.

Anschließend wurde die Suspension filtriert und das Lösungsmittel am

Rotationsverdampfer eingeengt. Zur Analyse wurde eine Probe entnommen.

5.6.3. Analytische Verfahren

5.6.3.1. NMR-Spektroskopie

Alle Messungen wurden in deuterierten Lösungsmittel aufgenommen. Als interner

Standard dienten die Restprotonen der deuterierten Lösungsmittel CDCl3-d1

( H = 7.26 ppm, singulett, C = 77.0 ppm, triplett), MeOD-d4 ( H = 3.31 ppm, quintett,

H = 4.84 ppm, singulett, C = 49.05 ppm, septett), D2O-d2 ( H = 4.79 ppm, singulett).

Die Messungen der 1H-NMR-Spektren und der 13C-NMR-Spektren erfolgten auf

einem Varian Mercury 400 Spektrometer (Messfrequenz 400 MHz bzw. 101 MHz)

oder an einem Bruker 600 (600 MHz). Die 1D und 2D-NOESY-Spektren wurden an

einem Bruker 600 (600 MHz) Spektrometer aufgenommen.

Chemische Verschiebungen wurden in ppm und die Größe der

Kopplungskonstanten J in Hz angegeben. Die Zuordnung der Signale erfolgte falls

nötig anhand der Kopplungskonstanten, DEPT-, COSY-, HSQC-, TOCSY-, HMBC-

Spektren. Für die Beschreibung der Multiplizität der Signale wurden die gängigen

Abkürzungen verwendet: s (Singulett), d (Duplett), t (Triplett), q (Quartett), quin

(Quintett), m (Multiplett), mc (zentriertes Mutiplett).


5.6.3.2. Massenspektrometrie

5.6.3.2.1. GC-MS

Die aufgeführten Massen wurden mittels GC-MS bestimmt. Es wurde ein Hewlett

Packard 6890 Serie GC-System mit einem Hewlett Packard 5973 Mass Selective

Detector eingesetzt. Mit einer HP19091M-102 HP-5 (325°C max.) Trace Analysis

Säule. Für die Analyse wurden 2 Methoden verwendet:

Tabelle 34: Systemeinstellungen der Methoden bei der Massenspektrometrie.

# Methode Druck Flussrate

1 DB_50_S 2.100 bar 105 mL/min

2 DB_100_S 2.499 bar 105 mL/min

Methode 1 beginnt mit 50 °C für 2 min unter anschließendem Erhitzen mit einem

Temperaturgradienten von 40°C/min für 5.75 min auf 300 °C und einer weiteren

Verweilzeit von 14 min bei 300°C.

Methode 2 beginnt mit 100 °C für 1 min unter anschließendem Erhitzen mit einem

Temperaturgradienten von 40°C/min für 5 min auf 300 °C und einer weiteren

Verweilzeit von 11 min bei 300 °C.

5.6.3.2.2. LC/ESI-MS zur allgemeinen Analyse der Masse

Für die allgemeine Analyse der Massen wurde eine LC/ESI-MS Messung an einem

Hewlett Packard Series 1100/Finnigan LCQ Advantage MAX System mit einer

CC125/4 Nucleodur C18 Gravity (Macherey & Nagel) 3 μm Chromatographiesäule

eingesetzt. Die Detektion erfolgte bei 280 nm, die Flussrate Betrug 1.0 ml/min.

Eluent A: H2O + 0.1 % HCOOH; Eluent B: Acetonitril + 0.1 % HCOOH.

Verwendeter Gradient: 0-1 min: 90 % A/10 % B

1-10 min: 0 % A/100 % B

10-12 min: 0 % A/100 % B

12-12.1 min: 90 % A/10 % B

12.1-15 min: 90 % A/10 % B


5.6.3.2.3. LC/ESI-MS zur Analyse von Fermentationsprodukten

Die Untersuchung von Fermenationsextrakten wurde an einer HPLC mit

anschließendem Massenspektrometer durchgeführt. Dabei diente das Accela

HPLC-System (bestehend aus Pumpe, Autosampler, Säulenofen, PDA Detektor und

UV-Detektion bei 210 nm und 254 nm) der Separation der Extraktionsprodukte.

Durch die Kopplung der HPLC mit einem Orbitrap Massenspektrometer (ausgestattet

mit einer LTQ XL linear ion trap; Thermo Electron Corporation Deutschland) konnten

die Massen der einzelnen Bestandteile gemessen werden. Es wurden nur

Lösungsmittel mit HPLC-Grad von Chromasolv, Deutschland eingesetzt. Bis zu 15 µL

der jeweiligen Probe wurden mittels Autosamlpler (T= 10 °C) bei einer Flussrate von

500 µL/min auf eine CC12514 Nucleodur C18 Gravity Säule (3 µm, Macherey-Nagel

Deutschland) aufgetragen.

Der eingesetzte lineare Gradient kann dem folgenden Schema entnommen werden

(Eluent A: doppeltdeionisiertes Wasser mit 0.1 % Ameisensäure; Eluent B: Acetonitril

mit 0.1 % Ameisensäure):

Start 80 % Eluent A/20 % Eluent B

Innerhalb von 10 min zu 0 % Eluent A/100 % Eluent B

Waschen für 5 min 0 % Eluent A/100 % Eluent B

Reäquilibrierung innerhalb von 5 min 80 % Eluent A/20 % Eluent B

Die anschließende Analyse der Masse erfolgte über EI im positiven

Ionisationsmodus. Hier wurde eine Spannung von 4 kV verwendet. Die Kappilare

wurde auf eine Spannung von 18 V bei einer Temperatur von 275 °C eingestellt. Die

aufgenommenen Spektren erfolgten bei einem Massen-zu-Ladung Verhältnis (m/z)

von 200 bis 2000.

5.6.3.2.4. MS/MS

In einigen Fällen wurde zusätzlich eine Fragmentierung der Moleküle analysiert.

Nach einem Scan von 200-2000 erfolgte die Fragmentierung bei 35 % über die

collisoin induced dissociation (CID).


5.6.3.2.5. Hochauflösende Massen Spektrometrie (HRMS)

Die hochaufgelösten Massenspektren wurden mit LTQ Orbtitrap gekoppelt mit einem

Accela HPLC-System (Säule Hypersil Gold, Länge 50 mm, Innendurchmesser 1 mm,

Partikelgröße 1.9 µm, Ionisierungsmethode: Elektrospray Ionisation) aufgenommen.

Dabei wurden Wellenlängen im Bereich von 200-600 nm gemessen und Massen im

m/z-Bereich von 150-2000 detektiert.

5.7. Synthese des Substrates rac-Methylmalonyl-SNAC (13)

5.7.1. N-(2-mercaptoethyl)acetamid (SNAC) (14)

Nach einer Synthese von Hughes and Keatinge-Clay [63] wurden 11.4 g

Cysteaminhydrochlorid (17) (100 mmol) in 500 mL H2O gelöst. Nacheinander wurden

25.2 g (300 mmol, 3 Äq.) Natriumhydrogencarbonat und 5.6 g (100 mmol, 1 Äq.)

KOH zugegeben. Nachdem sich alles gelöst hat wurden 10 mL (100 mmol, 1 Äq.)

Essigsäureanhydrid zugetropft. Der Reaktionsansatz wird 2 h bei Raumtemperatur

gerührt bevor er mit HCl auf pH 5-6 angesäuert wurde. Es wurde mit EtOAc

extrahiert, über NaSO4 getrocknet und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer

entfernt. Es konnten 7.56 g (63.4 mmol, 64 %) des Rohprodukts 14 als gelbliches Öl

isoliert werden, die ohne weitere Aufreinigung eingesetzt wurden.

Rf-Wert: 0.42 (DCM:MeOH 9:1).

HRMS (GC-MS): 120.04730 [M+H+], berechnet 120.04776 [M+H+].

GC-MS: tR = 5,329 min; DB_50_S; m/z 119 [M+], m/z 102 [M-C2H5+H+].

1H-NMR: (400 MHz, CDCl3-d1) = 2.00 (s, 3 H, 4-H), 2.66 (m, 2 H, 1-H), 3.41 (m, 2

H, 2-H), 6.05 (s, 1 H, SH).

13C-NMR: (101 MHz, CDCl3-d1) = 23.3 (C4, CH3), 24.7 (C1, CH2), 42.6 (C2, CH2),

170.39 (C3, C=O).


5.7.2. 3-(tert-butoxy)-2-methyl-3-oxopropansäure (11)

Unter Argonatmosphäre wurden 300 mL trockenes THF auf -78 °C temperiert und

10 g (76.9 mmol) tert-Butylpropionat (10) darin gelöst. Dazu wurden 85 mL NaHMDS

(1 M in THF) zugetropft und für 1 h gerührt. Der Reaktionsansatz wird langsam auf

Raumtemperatur erwärmt, wobei die Einleitung von CO2-Gas (Leitung über

Molekularsieb zur Trocknung) gestartet wird. Überschüssiges Gas wird über einen

mit Öl gefüllten Blasenzähler ausgeleitet. Der Reaktionsansatz wurde für 18 h bei RT

gerührt. Nach Zugabe von ges. NH4Cl-Lösung wird THF unter reduziertem Druck

entfernt und NaHCO3 wird zur Reaktionsmischung gegeben. Es wird mit EtOAc (2x)

extrahiert. Die wässrigen Phasen werden vereint und mit konzentrierter HCl

angesäuert (pH 1). Nach erneuter Extraktion mit EtOAc (3x) werden die organischen

Phasen vereint, über NaSO4 getrocknet und das Lösungsmittel unter Vakuum

entfernt. Das Produkt wird ohne weitere Aufarbeitung eingesetzt. Es konnten 4.19 g

(24.1 mmol, 32 %) der Malonsäure 11 isoliert werden.

Rf-Wert:0.48 (CHCl3:MeOH 9:1).

HRMS (GC-MS): 175.09634 C8H15O4 [M+H+], 197.07835 C8H15O4Na [M+Na+],

berechnet: 175.09649 C8H15O4 [M+H+], 197.07843 C8H15O4Na [M+Na+].

GC-MS: DB_100_S, m/z: 229 M+H+, m/z:.200., m/z: 155., m/z: 126.

1H-NMR: (400 MHz, CDCl3-d1) = 1.43 (d, 3J4-H,2-H = 7.3 Hz, 3 H, 4-H). 1.47 (s, 9 H,

tBu), 3.38 (q, 3J2-H, 4-H = 7.3 Hz, 1 H, 2-H).

13C-NMR: (101 MHz, CDCl3-d1) = 14.0 (C4, CH3), 28.09 (C6, tBu), 46.86 (C2, CH),

82.71 (C5, Cq-tBu), 169.79 (C1, COOH), 175.54 (C3, COOR).


5.7.3. tert-Butyl-3-((2-acetamidethyl)thio-2-methyl-3-oxopropanat (12)

Unter Schutzgasatmosphäre wurden 6.1 g (35.02 mmol) der Malonsäure 11 in

100 mL THF gelöst. Der Reaktionsansatz wurde auf 0 °C gekühlt und mit 6.8 g

(41.94 mmol, 1.2 Äq.) CDI, sowie 1.28 g (10.48 mmol, 0.3 Äq.) DMAP versetzt. Es

wurde für zwei Stunden bei 0 °C gerührt und anschließend 6.24 g (52.35 mmol,

1.5 Äq.) SNAC (14) zugegeben. Nach weiteren 16 h Rühren bei RT wurde THF unter

reduziertem Druck entfernt und das Rohprodukt 12 wurde säulenchromatographisch

aufgereinigt (DCM:MeOH 100:0 bis 99:1). Es konnten 7.09 g (25.75 mmol, 74 %) des

Produktes isoliert werden.


HRMS (LC/ESI-MS): 276.12654 C12H22O4NS [M+H+], 298.10841 C12H22O4NSNa

[M+Na+], berechnet: 276.12641 C12H22O4NS [M+H+], 298.10835 C12H22O4NSNa

[M+Na+].

LC/ESI-MS: tR = 7.31 min; pos. Mode; m/z : 275.92 [M+H+].

1H-NMR: (400 MHz, CDCl3-d1) = 1.34 (d, 3J4-H,2-H = 7.2 Hz, 3 H, 4-H), 1.39 (s, 9 H,

tBu), 1.90 (s, 3 H, 4´-H), 2.92- 3.08 (m, 2 H, 1´-H), 3.45 – 3.30 (m, 2 H, 2´-H), 3.51 (q,

3J2-H,4-H = 7.2 Hz, 1 H, 2-H).

13C-NMR: (101 MHz, CDCl3-d1) = 14.23 (C4, CH3), 23.3 (C4´, CH3), 28.07 (C6,

tBu), 28.95 (C1´, CH2), 39.68 (C2, CH), 55.52 (C2´, CH2), 82.4 (C5, Cq-tBu), 168.6

(C3, COOR), 170.52 (C3´, C=O), 197.02 (C1, C=O).


5.7.4. 3-((2-acetamidethyl)thio)-2-methyl-3-oxopropanoat (13)

Unter Argonatmosphäre wurden 300 mL trockenes DCM auf 0 °C gekühlt. Darin

wurden 3 g (10.9 mmol) der tBu geschützten SNAC-gekoppelten Malonsäure 12

gelöst. Nach Zugabe von 2.7 mL (24.6 mmol, 2.25 Äq.) Titan(IV)chlorid wurde für

0.5 h bei 0 °C und für weitere 4-6 h (DC-Kontrolle) bei Raumtemperatur gerührt. Der

Reaktionsansatz wurde nach vollständigem Umsatz mit 109 mL Substrat-Puffer

(Endkonzentration 100 mM, vgl. 0) gequencht. DCM wurde unter reduziertem Druck

bei RT entfernt. Die wässrige Lösung wurde 10 min bei 4 °C, 4000 g zentrifugiert.

Der Überstand wurde abgenommen und sterilfiltriert. Die Lösung wurde am gleichen

Tag der Fermentation beigefügt.


5.7.5. Erythromycin A (7)

Erythromycin A (7) wurde aus Fermentationskulturen von S. erythraea über eine

Extraktionskaskade extrahiert (vgl. 5.5.1.8). Nach Aufreinigung durch eine

präparative DC wurde die Probe mittels LC/ESI-MS und 1H-NMR analysiert.

Rf-Wert: 0.66.

LC/ESI-MS: tR = 6.8 min; pos. Mode; m/z : 734.74 [M+H+].

Abkürzungen und Akronyme | 106

6 Abkürzungen und Akronyme

6-DEB 6-Desoxyerythronolid

A

A Adenin, Adenosin

ACP Acyl Carrier Protein

Apr Apramycin

Äq. Äquivalente

AS Aminosäure

AT Acyltransferase

ATP Adenosintriphosphat

B

bp Basenpaar

BLAST Basic Logical Alignment Search Tool

B. subtilis Bacillus subtilis

bzw. beziehungsweise

C

C Cytosin

ca. circa

Cam Chloramphenicol

CDI Carbonyldiimidazol

CoA Coenzym A

COSY correlated spectroscopy

D

D Dalton

DC Dünnschichtchromatographie

DCM Dichlormethan

dCTP Desoxycytosintriphosphat

DEBS 6-Desoxyerythronolid B Synthase

DH Dehydratase


ddH2O Doppelt destilliertes Wasser

DMAP 4-N,N-Dimethylaminopyridin

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure

Dnase Desoxyribonuklease

E

E. coli Escherichia coli

EI Elektronenstoß-Ionisation

ER Enoylreduktase

Ery Erythromycin

ESI Elektronenspray-Ionisation

et al. und andere

EtOAc Ethylacetat

ET-SSB Einzelstrangstabilisierendes Protein

F

FAS Fettsäurebiosynthese

fwd Vorwärts (forward)

G

G Guanin

GC Guanin Cytosin

GC-MS Gaschromatographie gekoppelt mit einer Massenspektrometrie

H

h Stunden

HMBC heteronuclear multiple bond correlation

HPLC high performance liquid chromatography

HRMS Hochauflösende Massen Spektrometrie

HSQC heteronuclear single quantum coherence

hyg Hygromycin


J

J Kopplungskonstante

K

Kann Kanamycin

kb Kilobasen

KR Ketoreduktase

KS Ketosynthase

L

LB Lysogeny Broth

LC liquid chromatography

LDA Lithiumdiisopropylamid

M

MeOH Methanol

min Minute

MMCoA Methylmalonyl-CoA

MPI Max-Planck-Institut

MS Massenspektrometrie

m/z Masse- zu Ladungsverhätnis

N

n.a. nicht angegeben

NADPH Nicotinsäureamid-Adenin-Dinukleotidphosphat

NaHMDS Natrium-bis(trimethylsilyl)amid

n.b. nicht bestimmt

n.e. nicht eindeutig

NMR nuclear magnetic resonance

NRRL ARS Culture Collection

nt Nukleotide

O

OD Optische Dichte


o/n over night

Ori Replikationsursprung

P

PCR Polymerasekettenreaktion

Phm Phosphomycin

PIPES Piperazin-1,4-bis(2-ethansulfonsäure)

PK Polyketid

PKS Polyketid Synthase

ppm parts per million

PPTase Phosphopantetheinyltransferase

R

R Resistenz

rac Racemat

RecA Rekombinase A

rev Rückwärts (revers)

Rf Retentionsfaktor

Rt Retentionszeit

RT Raumtemperatur

S

s Sekunde

S. ery Saccharopolyspora erythraea

S. erythraea Saccharopolyspora erythraea

SLIC Sequence and ligation independent cloning

SNAC S-Nitroso-N-acetylcystein

SOB Super Optimal broth

SOC Super Optimal broth with Catabolite

T

t Zeit

T Thymin, Thymidin

Ta Annealingtemperatur


TAE Tris-Acetat-EDTA

tBu tert.-Butyl

TE Terminale Esterase

tert tertiär

THF Tetrahydrofuran

Tm Schmelztemperatur

Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan

U

UV Ultra-Violettstrahlung

V

v.Chr. vor Christus

vgl. vergleiche

W

w/v Gewicht/Volumen

WT Wildtyp

Darüber hinaus verwendete Abkürzungen sind IUPAC- bzw. SI-konform. Die

Aminosäuren wurden nach dem international üblichen Ein- bzw. Dreibuchstabencode

abgekürzt (IUPAC-IUB Comission of Biochemical Nomenclature, Pure Appl. Chem.

1982, 54, 1517 und 1525).

Referenzen | 111

7 Referenzen

[1] D. J. Newman, G.M. Cragg, J.Nat.Prod. 2012,75, 311-335.

[2] P. M. Dewick, Medicinical Natural Products – A Biosynthetic Approach, 3 rd ed., John Wiley & Sons Ldt, Chichester, 2009.

[3] B. Jessel, O. Tschimpke, M. Walser, HOFFMANN UND CAMPE VERLAG, 2009, Produktivkraft Natur.

[4] A. Fleming, Br J. Exp. Pathol. 1929, 10, 226–236.

[5] M. Saleem, M. Nazir, M. S. Ali, H. Hussain, Y. S. Lee, N. Riaz, A. Jabbar, Nat. Prot. Rep. 2010, 238-254.

[6] J. W. Blunt, B. R. Copp, M. H. G. Munro, P. T. Northcote, M. R. Prinsep, Nat. Prod. Rep. 2010, 165-237.

[7] K. Buchholz, V. Kasche, U. T. Bornscheuer, Biocatalysts and Enzyme Technology, WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim, 2005.

[8] C. Cuevas, M. Pérez, M. J. Martín, J. L. Chicharro, C. Fernández-Rivas, M. Flores, A. Francesch, P. Gallego, M. Zarzuelo, F. de la Calle, J. García, C. Polanco, I. Rodríguez, I. Manzanares, Org. Lett. 2000, 2, 2545-2548.

[9] U. Sundermann, S. Kushnir, F. Schulz, Nachrichten aus der Chemie, 2011, 59, 297-318.

[10] J. Clardy, C. Walsh, Nature 2004, 432, 829-837.

[11] C. R. Hutchinson, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 1999, 96, 3336-3338.

[12] K. J. Weissman, P. F. Leadlay, Nat. Rev. Microbio.l 2005, 3, 925-936.

[13] C. Khosla, Chem. Rev. 1997, 97, 2577-2590.

[14] S. G. Van Lanen, B. Shen, Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 2008, 11, 186-195.

[15] C. Hertweck, Ange. Chem. Int. Edit. 2009, 48, 4688-4716.

[16] J. N. Collie, J. Chem. Soc. Transactions 1893, 63, 329-337.

[17] J. Staunton, K. J. Weissman, Nat. Prod. Rep. 2001, 18, 380-416.

[18] R. Bentley, J. W. Bennett, Annu. Rev. Microbiol. 1999, 53, 411-446.

[19] B. Shen, Curr. Opin. Chem. Biol. 2003, 7, 285-295.

[20] U. Sundermann, S. Kushnir, F. Schulz, Nachr. Chem. 2011, 59, 29-35.

[21] D. A. Hopwood, Chem. Rev. 1997, 97, 2465-2498.

[22] K. Magnuson, S. Jackowski, C. O. Rock, J. E. Cronan, Jr., Microbiol. Rev. 1993, 57, 522-542.

[23] M. A. Fischbach, C. T. Walsh, Chem. Rev. 2006, 106, 3468-3496.

Referenzen | 112

[24] U. Rix, C. Fischer, L. L. Remsing, J. Rohr, Nat. Prod. Rep. 2002, 19, 542-580.

[25] J. Staunton, B. Wilkinson, Chem. Rev. 1997, 97, 2611-2630.

[26] J. Cortes, S. F. Haydock, G. A. Roberts, D. J. Bevitt, P. F. Leadlay, Nature 1990, 348, 176-178.

[27] S. Donadio, M. Staver, J. McAlpine, S. Swanson, L. Katz, Science 1991, 252, 675-679.

[28] S. Donadio, L. Katz, Gene 1992, 111, 51-60.

[29] K. J. Weissman, Vol. 51 (Eds.: W. Wohlleben, T. Spellig, B. Müller-Tiemann), Springer Berlin Heidelberg, 2005, pp. 43-78.

[30] Keatinge-Clay, A.T.; Stroud, R.M., Structure 2006, 14, 737-748.

[31] X. Guo, T. Liu, C. R. Valenzano, Z. Deng, D. E. Cane, J. AM. CHEM. SOC. 2010, 132, 14694–14696.

[32] C. Olano, C. Mendez, J. A. Salas, Nat. Prod. Rep. 2010, 27, 571-616.

[33] C. Khosla, J. Org. Chem. 2009, 74, 6416-6420.

[34] C. Khosla, R. S. Gokhale, J. R. Jacobsen, D. E. Cane, Annu. Rev. Biochem. 1999, 68, 219-253.

[35] L. Katz, G. W. Ashley, Chem. Rev. 2005, 105, 499-528.

[36] D. H. Kwan, F. Schulz, Molecules 2011, 16, 6092-6115

[37] K. J. Weissman, in Methods in Enzymology, Vol. Volume 459 (Ed.: A. H. David), Academic Press, 2009, pp. 3-16.

[38] M. Oliynyk, M. J. B. Brown, J. Cortés, J. Staunton, P. F. Leadlay, Chem. Biol. 1996, 3, 833-839.

[39] J. Lau, H. Fu, D. E. Cane, C. Khosla, Biochem. 1999, 38, 1643-1651.

[40] D. L. Stassi, S. J. Kakavas, K. A. Reynolds, G. Gunawardana, S. Swanson, D. Zeidner, M. Jackson, H. Liu, A. Buko, L. Katz, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 1998, 95, 7305-7309.

[41] R. McDaniel, A. Thamchaipenet, C. Gustafsson, H. Fu, M. Betlach, M. Betlach, G. Ashley, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 1999, 96, 1846-1851.

[42] L. B. Pickens, Y. Tang, Y.-H. Chooi, Annu. Rev. Chem. Biomol. 2011, 2, 211-236.

[43] L J. Staunton, B. Wilkinson, Curr. Opin. Chem. Biol. 2001, 5, 159-164.

[44] C. D. Reeves, S. Murli, G. W. Ashley, M. Piagentini, C. R. Hutchinson, R. McDaniel, Biochemistry 2001, 40, 15464-15470.

[45] S. Kushnir, U. Sundermann, S. Yahiaoui, A. Brockmeyer, P. Janning, F. Schulz, Minimally invasive Mutagenesis gives rise to a Biosynthetic Polyketide Library, Angew Chem Int Ed Engl, in press.

[46] U. Sundermann, Dissertation, TU Dortmund 2012.

[47] D. H. Kwan, F. Schulz, Molecules 2011, 16, 6092-6115.

Referenzen | 113

[48] H. J. Roth, C. E. Müller, G. Folkers, Stereochemie und Arzneistoffe, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft, 1998.

[49] J. Weyer, Angew. Chem, 86, 17, 604-611.

[50] M. T. Reetz, Angew. Chem. 2011, 123, 144-182.

[51] D. H. Kwan, M. Tosin, N. Schläger, F. Schulz, P. F. Leadlay, Org. Biomol. Chem., 2011, 9, 2053-2056.

[52] M. Oliynyk, M. Samborskyy, J. B. Lester, T. Mironenko, N. Scott, S. Dickens, S. F. Haydock, P.F. Leadlay, Nat. Biotechnol. 2007, 25, 447-453.

[53] W. A. Duetz, L. Ruedi, R. Hermann, K. O'Connor, J. Buchs, B. Witholt, Appl. Environ. Microbiol. 2000, 66, 2641-2646.

[54] A. M. El-Brondkly, H. I. Abd-Alla, M. Shaaban, K. A. Shaaban, Indian J. Pharm Science 2008, 70, 310-319.

[55] S. Klopries, Masterarbeit, TU Dortmund 2010.

[56] N. B. Fitzgerald, R. S. English, J. S. Lampel, T. J. Vanden Boom, Appl. Environ. Microbiol. 1998, 64, 1580-1583.

[57] T. Kieser, M. J. Bibb, M. J. Buttner, K. F. Chater, D. A. Hopwood, Practical streptomyces genetics, John Innes Foundation, 2000.

[58] A. Ranganathan, M. Timoney, M. Bycroft, J. Cortés, I. P. Thomas, B. Wilkinson, L. Kellenberger, U. Hanefeld, I. S. Galloway, J. Staunton, P. F. Leadlay, ChemBiol 1999, 6, 731-741.

[59] M. Beran, V. Přikrylová, P. Sedemera, J. Novák, J. Zima, M. Blumauerová, J. Chrom. 1991, 558, 265-272.

[60] M. Z. Li, S. J. Elledge, Nat. Meth. 2007, 4, 251-256.

[61] S. Kushnir, U. Sundermann, F. Schulz, Asian Journal of Biotechnologie, 2012, under revision.

[62] H. Inoue, H. Nojima, H. Okayama, Gene 1990, 96, 23-28.

[63] J. Hughes, A. Keatinge-Clay, Chemistry & Biology 2011, 18, 165-176.

http://www.uniprot.org/uniprot/?query=author:%22Oliynyk+M.%22

http://www.uniprot.org/uniprot/?query=author:%22Samborskyy+M.%22

http://www.uniprot.org/uniprot/?query=author:%22Lester+J.B.%22

http://www.uniprot.org/uniprot/?query=author:%22Mironenko+T.%22

http://www.uniprot.org/uniprot/?query=author:%22Scott+N.%22

http://www.uniprot.org/uniprot/?query=author:%22Dickens+S.%22

http://www.uniprot.org/uniprot/?query=author:%22Haydock+S.F.%22

http://www.uniprot.org/uniprot/?query=author:%22Leadlay+P.F.%22

http://dx.doi.org/10.1038/nbt1297

Anhang | 114

8 Anhang

8.1. NMR-Spektren

Abbildung 59: 1H-NMR Spektrum der Verbindung 11.

Abbildung 60: 13

C-NMR Spektrum der Verbindung 11.

11

11

Anhang | 115


Abbildung 62: 13


12

12

Anhang | 116


Abbildung 64: 13


14

14

Eidesstattliche Erklärung | 117

9 Eidesstattliche Erklärung

Hiermit versichere ich an Eides statt, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig und

nur mit den angegebenen Hilfsmitteln angefertigt habe.

Hamm, den 9/20/2012

Strukturen der Substanzen | 118

10 Strukturen der Substanzen

7 8 9

10 11 12

13 14 15

16

Documents

Ortsgerichtete Mutagenese zur Erstellung von Sequenz