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MARIA APARECIDA FERNANDES
PADRÕES TEMPORAIS E GRAU DE DIVERSIFICAÇÃO CARIOTÍPICA
EM ESPÉCIES ATLÂNTICAS DA FAMÍLIA ACANTHURIDAE
(PERCIFORMES)
Orientador: Prof. Dr. Wagner Franco Molina
NATAL-RN
2015
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Sistemática e Evolução
da Universidade Federal do Rio Grande do
Norte, em cumprimento às exigências para
obtenção do título de Mestre em Sistemática
e Evolução.
1
Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial do Centro
de Biociências
Fernandes, Maria Aparecida.
Padrões temporais e grau de diversificação cariotípica em espécies
Atlânticas da família Acanthuridae (Perciformes) / Maria Aparecida
Fernandes. – Natal, RN, 2015.
54 f.: il.
Orientador: Prof. Dr. Wagner Franco Molina.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do
Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em
Sistemática e Evolução.
1. Evolução cromossômica. – Dissertação. 2. Fusões cêntricas. –
Dissertação. 3. Acanthuridae. – Dissertação. I. Molina, Wagner Franco
II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título.
RN/UF/BSE-CB CDU 575
2
MARIA APARECIDA FERNANDES
PADRÕES TEMPORAIS E GRAU DE DIVERSIFICAÇÃO CARIOTÍPICA
EM ESPÉCIES ATLÂNTICAS DA FAMÍLIA ACANTHURIDAE
(PERCIFORMES)
Área de concentração: Sistemática e Evolução
Aprovada em 26/03/2015
BANCA EXAMINADORA:
__________________________________________________________
Dr. Wagner Franco Molina
Universidade Federal do Rio Grande Do Norte
(Orientador)
___________________________________________________________
Dra. Sathyabama Chellappa
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
___________________________________________________________
Dr. Roberto Ferreira Artoni
Universidade Estadual de Ponta Grossa
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Sistemática e Evolução
da Universidade Federal do Rio Grande do
Norte, em cumprimento às exigências para
obtenção do título de Mestre em Sistemática
e Evolução.
3
DEDICATÓRIA
A meus pais Vilmar (In memoriam) e Inácia,
por todo amor, conselhos e dedicação, e a
meu esposo Leandro pelo incondicional
apoio ao longo desses anos. A vocês todo
meu amor e gratidão.
4
AGRADECIMENTOS
Gostaria de agradecer especialmente aos meus pais, por todo esforço empenhado em minha
educação. As minhas irmãs (Josivânia e Josenilda) e irmãos (Adriano, Mariano e João Paulo)
pela maravilhosa convivência familiar, pelo carinho demonstrado e principalmente pela
compreensão nos momentos difíceis!
Ao meu esposo Leandro pelo companheirismo e por contribuir sempre de maneira
incondicional para o meu crescimento pessoal e profissional.
Ao professor Dr. Wagner Franco Molina, pelo apoio, orientação e confiança depositados
durante a realização deste trabalho.
Aos companheiros de luta do LGRM: Gideão, Karlla, Rafael, Rodrigo, Amanda, Paulo,
Clóvis, Juliana, Inailson, Allyson, Josi, Roberta, Calado e Cris. Obrigada a todos pelas
significativas contribuições seja nos procedimentos laboratoriais e/ou em campo, e pelos
momentos de descontração durante nossos cafezinhos.
Registro também meu agradecimento à minha querida professora Drª. Simone Almeida por
todo apoio, disponibilidade e conselhos (acadêmicos e pessoais) desde os primeiros
momentos da minha vida acadêmica.
Agradeço também as professoras Drª Danielle Pereti, Danielly Alves e Drª Maisa Clari pelo
apoio durante a graduação e a transição para o mestrado.
À CAPES pela concessão da bolsa de estudos.
À UFRN e ao Programa de Pós-Graduação em Sistemática e Evolução por me permitir
concluir mais esta estapa de meu processo educacional.
Ao CNPq pelo suporte financeiro (Processo No. 556793/2009-9), INCT “Ciências do Mar,”,
FAPESB (no. APP0064/2011) e ICMBio/SISBIO (licenças 19135-1, 131360-1, e 27027-2)
pela autorização de coleta de espécimes.
5
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO
1.1. Família Acanthuridae 11
1.2. Filogenia e evolução da família Acanthuridae 12
1.3. Aspectos biológicos e taxonômicos do gênero Acanthurus 13
1.4. Citogenética como ferramenta para inferências evolutivas
16
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral 19
2.2. Objetivos específicos
19
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Material 20
3.2. Métodos 20
3.2.1. Obtenção de cromossomos mitóticos 20
3.2.2. Análises cromossômicas e montagem do cariótipo 20
3.2.3. Detecção de regiões organizadoras de nucléolo 21
3.2.4. Detecção de heterocromatina constitutiva 21
3.2.5. Dupla coloração com fluorocromos base-específicos 21
3.2.6. Hibridação in situ fluorescente FISH 22
3.2.6.1. Obtenção de sondas para hibridação 22
3.2.6.2. Hibridação cromossômica
22
4. CAPÍTULO I - Sequential Steps of Chromosomal Differentiation in
Atlantic Surgeonfishes: Evolutionary Inferences
24
5. CAPÍTULO II - Atlantic Surgeonfishes Bear Only Minor
Microstructural Changes in Highly Derived Karyotypes
37
6. CONCLUSÕES
48
7. REFERÊNCIAS 49
6
LISTA DE FIGURAS
Parte introdutória
Figura 1. (a) Hipótese filogenética para a família Acanthuridae,
modificado de Sorenson et al. (2013). (b) Relações entre
espécies do gênero Acanthurus presentes no Atlântico, proposta
por Bernal & Rocha (2011).
13
Figura 2. Espécime de Acanthurus coeruleus. Em destaque indivíduo na
fase juvenil. Barra: 2 cm.
15
Figura 3. Espécime de Acanthurus chirurgus. Barra: 2 cm. 15
Figura 4. Espécime de Acanthurus bahianus. Barra: 2 cm. 16
Capítulo 1
Figura 1.
Mapa da América do Sul mostrando os pontos de coleta de
Acanthurus coeruleus (a), A. bahianus (b), e A. chirurgus (c) no
estado do Rio Grande do Norte (1) e Bahia (2), nordeste do
Brasil.
26
Figura 2.
Figura 3.
Cariótipos de Acanthurus coeruleus ((a) e (b)) com 2𝑛 = 48, A.
bahianus ((c) e (d)) com 2𝑛 = 36, e A. chirurgus ((e) e (f) ) com
2𝑛 = 34, após coloração convencional com Giemsa ((a), (c), e
(e)) e badamento-C ((b), (d) e (f)). Os cromossomos portadores
de RONs, de cada espécie, após tratamento com nitrato de prata
são apresentados em caixas (par 2 de A. coeruleus e par de 8 de
A. bahianus e A. chirurgus).
Idiogramas de conjuntos cromossômicos de Acanthurus
coeruleus (a), A. bahianus (b), e A. chirurgus (c) mostrando as
características citogenéticas mais conspícuas divididas em
caixas. Em (d), o cariótipo basal dos Perciformes (2𝑛 = 48a) e
uma hipótese filogenética com base em rearranjos
28
29
7
cromossômicos sequênciais inferidos nas três espécies
Acanthurus.
Capítulo 2
Figura 1. Cariótipo e metáfases de A. coeruleus (A), A. bahianus (B) e A.
chirurgus (C) após a coloração Giemsa (esquerda), two-color
FISH (centro) com DNAr 18S (vermelho) e 5S DNAr (sinais
verdes) distribuição de sondas de (TTAGGG)n sequências
(direita). Caixa, os cromossomos portadores de RONs são
mostrados após a coloração de nitrato de prata (esquerda) e
coloração com fluorocromos (centro). Barra = 5m.
40
Figura 2.
Idiograma de A. coeruleus (A), A. bahianus (B) e A. chirurgus
(C), combinando os resultados de NOR / localização de região
rica em GC e mapeamento físico de ribossomal e sequências
teloméricas. Os cromossomos homeólogos derivados de
inversões pericêntricas (cromossomos sm-st) e fusões cêntricas
(m-cromossomos) são destacados nas caixas. O asterisco no par
7 de A. chirurgus indica uma suposta autapomorfia (fusão em
tandem) para esta espécie.
44
8
LISTA DE ABREVIATURAS
2n – Número diploide
a – Acrocêntrico
AFLP – Amplified fragment lenght polymorphism
AgNO3 – Nitrato de prata
Ag-RONs – Regiões organizadoras de nucléolo evidenciadas pela impregnação com nitrato
de prata
AT – Adenina e Timina
Ba(OH)28H2O – Hidróxido de bário
BC – Bandamento C
CMA3 – Cromomicina A3
DAPI – 4`4’,6-diamidino-2-fenilindol
DNA – Ácido desoxirribonucleico
DNAr/rDNA – Ácido desoxirribonucleico ribossômico
FISH – Fluorescence in situ hybridization
GC – Guanina e Citosina
HCl – Ácido clorídrico
KCl – Cloreto de potássio
LGRM – Laboratório de Genética de Recursos Marinhos
m – Metacêntrico
Ma – Milhões de anos
MM - Mitramicina
n – Número amostral
NF – Número fundamental
RN – Rio Grande do Norte
RNAr/rRNA – Ácido ribonucleico ribossômico
RONs – Regiões organizadoras de nucléolo
sm – Submetacêntrico
st – Subtelocêntrico
UFRN – Universidade Federal do Rio Grande do Norte
9
RESUMO
A família Acanthuridae é um grupo bastante representativo dentre os peixes marinhos e que
desempenha um papel fundamental na dinâmica ecológica dos recifes de corais. Três espécies
pertencentes ao gênero Acanthurus são comuns ao longo dos recifes costeiros do Atlântico
Ocidental: A. coeruleus, A. bahianus e A. chirurgus. No presente estudo, são apresentados
dados citogenéticos para estas três espécies de Acanthurus com base em métodos
citogenéticos clássicos e no mapeamento de sequências ribossomais repetitivas, como DNAr
18S e 5S, além de sondas teloméricas com a finalidade de auxiliar na compreensão da
carioevolução deste grupo. O padrão citogenético dessas espécies indica que as etapas
sequenciais de rearranjos cromossômicos, que datam 19-5 milhões de anos atrás (Ma), são
responsáveis por suas diferenças interespecíficas. Acanthurus coeruleus (2n=48; 2sm + 4st +
42a), A. bahianus (2n=36; 12m + 2sm + 4st + 18a) e A. chirurgus (2n=34; 12m + 2sm + 4st +
16a) compartilham um antigo conjunto de três pares cromossômicos originados através de
inversões pericêntricas. Um conjunto de seis grandes pares metacêntricos formados por
translocações Robertsonianas (Rb) encontrado em A. bahianus e A. chirurgus e uma suposta
fusão em tandem presente em A. chirurgus são eventos mais recentes. A falta de sequências
teloméricas intersticiais (ITS), apesar de várias fusões cêntricas em A. bahianus e A.
chirurgus pode estar relacionada com o longo período de tempo após a sua ocorrência
(estimado em 5 Ma). Além disso, as homeologias entre os pares de cromossomos que
carregam os genes ribossomais, além de outras características estruturais, destacam grandes
regiões cromossômicas conservadas nas três espécies. Nossos resultados indicam que as
mudanças macroestruturais ocorreram durante a cladogênese dessas espécies não foram
seguidas por rearranjos microestruturais visíveis nos cariótipos.
Palavras-chave: Evolução cromossômica; fusões cêntricas; rearranjos Robertsonianos;
Acanthuridae; telômeros.
10
ABSTRACT
The Acanthuridae family is a representative group from the marine fish that plays a key role
in ecological dynamics of coral reefs. Three species are common along coastal reefs of
Western Atlantic: Acanthurus coeruleus, Acanthurus bahianus and Acanthurus chirurgus. In
the present study, cytogenetic data are presented for these three species Acanthurus based on
classical cytogenetic methods and mapping of repetitive sequences such as ribosomal 18S and
5S rDNA and telomeric repeats to improve their karyotype evolutionary analyses. The
cytogenetic pattern of these species indicated sequential steps of chromosomal
rearrangements dating back 19 to 5 millions of years ago (M.a.) that accounted for their
interspecific differences. A. coeruleus (2n=48; 2sm+4st+42a), A. bahianus (2n=36;
12m+2sm+4st+18a) and A. chirurgus (2n=34; 12m+2sm+4st+16a) share an older set of three
chromosomal pairs that were originated through pericentric inversions. A set of six large
metacentric pairs formed by Robertsonian (Rb) translocations found in A. bahianus and A.
chirurgus and a putative in tandem fusion found in A. chirurgus are more recent events. The
lack of interstitial telomeric sequences (ITS) in spite of several centric fusions in A. bahianus
and A. chirurgus might be related to the long period of time after their occurrence (estimated
in 5 M.a.). Furthermore, the homeologies among the chromosome pairs bearing ribosomal
genes, in addition to other structural features, highlight large conserved chromosomal regions
in the three species. Our findings indicate that macrostructural changes occurred during the
cladogenesis of these species were not followed by conspicuous microstructural
rearrangements in the karyotypes.
Keywords: Chromosomal evolution; centric fusions; Robertsonian rearrangements;
surgeonfish; telomeres.
11
1. INTRODUÇÃO
1.1. Família Acanthuridae
A família Acanthuridae está inserida na Ordem dos Perciformes, subordem
Acanthuroidei. Esta família conta com seis gêneros (Acanthurus, Ctenochaetus, Naso,
Paracanthurus, Prionurus e Zebrasoma) subdivididos em 80 espécies (NELSON, 2006). É
caracterizada morfologicamente por indivíduos de pequeno a médio porte, podendo chegar a
36 cm, com um corpo alto, oval e comprimido lateralmente (RANDALL, 2001).
São conhecidos popularmente como peixes-cirurgião (surgeonfishes), devido à
presença de um espinho dobrável alojado dentro de uma bainha em cores, em ambos os lados
do pedúnculo caudal, utilizado durante comportamentos agressivos inter e intraespecíficas.
Tal característica constitui-se como a autapomorfia compartilhada pelo grupo (RANDALL,
2001).
Os cirurgiões são exclusivamente marinhos e distribuídos em mares tropicais e
subtropicais de todo o mundo, sendo ausentes somente no Mediterrâneo (NELSON, 2006). A
maioria das espécies de Acanthuriadae são herbívoras errantes diurnos com associação
obrigatória a ambientes recifais (BELLWOOD; WAINWRIGHT, 2002; NELSON, 2006). A
maioria das espécies de Acanthuridae têm estômagos com paredes finas e pastam em algas, e
alguns têm estômagos semelhantes a moelas, com paredes espessas estes utilizam a areia para
macerar detritos (FERREIRA et al., 2004; RANDALL, 2005).
Este grupo possui uma posição relevante do ponto de vista ecológico e evolutivo nas
comunidades dos recifes tropicais. Sendo um importante agente físico (bioerosão) devido sua
atividade de escavar o substrato contribuindo para sedimentação intensiva e biológica
(herbivoria) influenciando na composição, desenvolvimento, abundância e padrão de
distribuição da população de algas e comunidades associadas (HORN, 1989).
Ao longo de sua história de vida sofrem mudanças ontogenéticas sobre os aspectos
da preferência por tipos de habitats (FERREIRA et al., 2004; ROCHA, 2002) com ovos
planctônicos que eclodem após cerca de um dia, um período pelágico larval relativamente
longo variando entre 51 até 75 o que lhes conferem enorme capacidade de dispersão e adultos
sedentários associados a recifes de corais (THRESHER, 1984; MUSS et al., 2001; ROCHA et
al., 2002, RANDALL, 2005).
Em ambiente natural os adultos podem ser observados geralmente formando
pequenos cardumes, e eventualmente indivíduos isolados. Entretanto, em períodos de
reprodução, ou, quando estão forrageando em territórios defendidos por outros peixes, podem
12
ser encontrados constituindo grandes cardumes heterogêneos (RISK, 1998; LAWSON, et al.,
1999; BELL e KRAMER, 2000; ROCHA et al., 2002).
1.2. Filogenia e evolução da Familia Acanthuridae
Acanthuridae é um grupo monofilético relativamente antigo, com cerca de 54
milhões anos (SORBINI e TYLER, 1998; TANG et al., 1999; SORENSON et al., 2013). A
primeira aparição da família se deu no Eoceno Médio. A maioria dos acanthurideos fósseis
conhecidos foi encontrada na região do Monte Bolca, no norte da Itália, que é a região mais
representativa da rica ictiofauna recifal do Eoceno (BELLWOOD, 1996; CLEMENTS et al.,
2003;. KLANTEN et al., 2004).
Embora muitos dos caracteres supraespecíficos que definem este grupo tenham uma
duração prolongada no registro fóssil, o moderno conjunto de espécies parece ser de origem
recente. Apoio à origem recente das espécies de peixes de recife é fornecido por McMillan e
Palumbi (1997), que apresentaram argumentos para especiação recente ligada às mudanças no
nível do mar, temperatura dos mares e clima global, ocorridas no Pleistoceno.
Questões referentes à filogenia desta família têm sido estudadas profundamente
através de evidências morfológicas (WINTERBOTTOM, 1993; GUIASU e
WINTERBOTTOM, 1993; TYLER et al., 1989) e análises moleculares (HOLCROFT e
WILEY, 2008; KLANTEN et al., 2004; TANG et al., 1999). De forma geral, as relações
filogenéticas dentro da família Acanthuridae estão bastante esclarecidas, entretanto, a relação
entre os gêneros Acanthurus e Ctenochaetus tem gerado controvérsias ao longo das décadas.
Embora a possibilidade de parafiletismo entre esses dois grupos já tivesse sido
sugerida com base em caracteres osteológicos compartilhados e caracteres merísticos
(RANDALL, 1955; WINTERBOTTOM, 1993; GUIASU e WINTERBOTTOM, 1993), esta
questão só foi elucidada por Clements et al. (2003) e mais tarde corroborada por Sorenson et
al. (2013), estabelecendo uma filogenia mais compreensiva desta família através de análises
moleculares (Figura1a). Além da corroboração da hipótese de parafiletismo entre os gêneros
Acanthurus/Ctenochaetus, existem indícios de que os gêneros desta família são relativamente
antigos, com intensos episódios de especiação, pelo menos três ao longo da história
filogenética (SORENSON et al., 2013; BERNAL e ROCHA, 2011).
Análises filogeográficas identificaram que A. bahianus, em relação às espécies A.
chirurgus e A. coeruleus, parece altamente sensível a restrição ecológica imposta pela pluma
de água doce do Orinoco-Amazonas (ROCHA et al., 2002) e tem sido utilizada como
exemplo de profunda estruturação populacional devido à separação evolutiva por uma barreira
13
geográfica. De fato, as linhagens do Atlântico Sul e do Caribe de A. bahianus são, na verdade,
espécies diferentes, a linhagem caribenha foi nomeada como A. tractus (Figura 1b) (BERNAL
e ROCHA, 2011).
O plano corporal comum aos cirurgiões atuais apareceu no limite entre o
Paleoceno/Eoceno Inferior, e passou por uma dramática radiação durante o Eoceno Médio (50
Ma). Dentro do gênero Acanthurus a irradiação da espécie A. coeruleus ocorreu em meados
do Mioceno (20 Ma) e a separação entre A. chirurgus e A. tractus (espécie irmã da A.
bahianus) no Final do Mioceno (10 m.a.) (SORENSON et al., 2013).
1.3. Aspectos biológicos e taxonômicos do gênero Acanthurus
O gênero Acanthurus possui ao todo 36 espécies, sendo o único, dentre toda a
família, a ocorrer no Atlântico Ocidental (RANDALL, 2002). Na costa brasileira podemos
encontrar três espécies deste gênero: Acanthurus coeruleus Bloch & Schneider (1801),
Acanthurus chirurgus (BLOCH, 1787), Acanthurus bahianus Castelnau (1855) (RANDALL,
1956; MENEZES e FIGUEIREDO, 1985; FLOETER et al., 2008; BERNAL e ROCHA,
2011).
A taxonomia detalhada das espécies citadas é representada por:
Filo - Chordata
Subfilo - Craniata
Figura 1. (a) Hipótese filogenética para espécies do gênero Acanthurus, modificado de Sorenson et al. (2013).
(b) Relações entre espécies do gênero Acanthurus presentes no Atlântico, proposta por Bernal & Rocha (2011).
a b
14
Superclasse - Gnasthostomata
Classe - Actinopterygii
Subclasse - Neopterygii
Divisão - Teleostei
Subdivisão - Euteleostei
Superordem - Acanthopterygii
Série - Percomorpha
Ordem - Perciformes
Subordem - Acanthuroidei
Família - Acanthuridae
Subfamília - Acanthurinae
Tribo - Acanthurini
Gênero - Acanthurus Forsskål (1775)
Espécies - Acanthurus chirurgus (BLOCH, 1787)
Acanthurus coeruleus Bloch & Schneider (1801)
Acanthurus bahianus Castelnau (1855)
A espécie A. coeruleus (Figura 2), exibe um comportamento territorialista, embora
possam eventualmente, formar pequenos cardumes. São quase que exclusivamente
herbívoros, e por isso, diferentemente das demais espécies aqui estudadas, possui um
estômago com parede mais finas. Pode ser encontrada em profundidades que variam de 2-60
metros (LAWSON e KRAMER, 1999; ROCHA et al., 2000). Sua diagnose apresenta 9
espinhos e 26-28 raios na nadadeira dorsal e anal com 3 espinhos e 24-26 raios. A coloração
do corpo quando juvenis é na cor amarela passando gradativamente ao azul violáceo com
linhas estreitas e escuras no flanco quando adultos; eventualmente, durante o período
reprodutivo, os machos podem adquirir um padrão bicolor, mais escuro na porção anterior e
mais claro na porção posterior do corpo (CERVIGÓN et al., 1993; FIGUEIREDO e
MENEZES, 2000; ARAÚJO et al., 2004).
15
A mais comum dentre as espécies de acanthurideos encontradas no litoral brasileiro,
A. chirurgus (Figura 3), geralmente, formam grandes cardumes, tem preferência por recifes
mais rasos e possui hábito alimentar semi-detritívoro (DIAS et al., 2001; FRANCINI-FILHO
et al., 2010). Morfologicamente se diferencia das demais espécies por apresentar a nadadeira
dorsal com 9 espinhos e 24-25 raios; a nadadeira anal com 3 espinhos e 22-23 raios e caudal
emarginada. A coloração do corpo é acinzentada com 10 barras verticais mais escuras e o
pedúnculo caudal mais claro que o restante do corpo (CERVIGÓN et al., 1993;
FIGUEIREDO e MENEZES, 2000; CARPENTER, 2002).
A espécie A. bahianus (Figura 4) é caracterizada por apresentar na nadadeira dorsal
com 9 espinhos e 23-26 raios e anal com 3 espinhos e 21-23 raios. O padrão de cor do corpo é
semelhante ao A. chirurgus, com ausência das barras verticais nos flancos e uma nadadeira
caudal lunada (CERVIGÓN et al., 1993; FIGUEIREDO e MENEZES, 2000; CARPENTER,
2002). Ocorre em grupos de cinco ou mais indivíduos, habitando recifes rasos de até 25
Figura 2. Espécime de Acanthurus coeruleus. Em destaque indivíduo na fase juvenil. Barra: 2 cm.
Figura 3. Espécime de Acanthurus chirurgus. Barra: 2 cm.
16
metros (ROCHA, 2002). Considerada também como semi-detritívora, tem em comum com A.
chirurgus e algumas outras espécies do gênero, a presença de um estômago constituído por
paredes grossas semelhantes a uma “moela” onde a areia ingerida ajuda a triturar as algas
(FERREIRA e GONÇALVES, 2006; DIAS et al., 2001; FRANCINI-FILHO et al., 2010).
1.4. Citogenética como ferramenta para inferências evolutivas
Análises citotaxonômicas contribuem significativamente para o estudo da evolução
pelo fato do material genético estar contido nos cromossomos (ALMEIDA-TOLEDO, 1998).
Portanto, alterações como, rearranjos cromossômicos, polimorfismos estruturais e/ou
numéricos, poliploidia natural, sistemas de cromossomos sexuais entre outros, são quase
sempre significativas para que se possa inferir o rumo evolutivo das espécies (GUERRA,
1988).
As técnicas citogenéticas convencionais (Giemsa, banda-C, Ag-RONs) e moleculares
como a marcação com fluorocromos base-específicos (DAPI/MM) e o desenvolvimento nos
últimos anos, de novas ferramentas de análise mais aprofundadas como a técnica de
Hibridação in situ Fluorescente (FISH), são de grande importância na identificação de
diversificação cromossômica. Juntas, a citogenética clássica e a molecular têm fornecido
contribuições importantes para o entendimento da composição e estrutura dos cromossomos e
em estudos que visem à formulação de hipóteses filogenéticas (BERTOLLO et al., 1978;
FELDBERG et al., 2003; MARTINS et al., 2011).
A técnica por impregnação por nitrato de prata (Ag-RONs) é utilizada para
evidenciar as Regiões Organizadoras de Nucléolos (RONs), porção particulalrmente variável
do genoma eucarioto, as quais possuem sítios ribossômicos ativos, que podem estar
Figura 4. Espécime de Acanthurus bahianus. Barra: 2 cm.
17
localizados nas posições terminais ou intersticiais dos cromossomos (FORESTI e TOLEDO,
1985). A caracterização do número e posição das RONs tem sido muito utilizada em peixes e
pode constituir um excelente marcador citotaxonômico para alguns grupos (GALETTI, 1998;
MOLINA et al., 2002).
Os bandamentos cromossômicos foram as primeiras ferramentas usadas para
comparação de genomas, pois, espécies próximas apresentam um padrão muito similar de
bandas tornando o estudo comparativo viável. O bandamento C permite a localização de
regiões ricas em heterocromatina constitutiva (sequências de DNA altamente repetitivas). Em
estudos evolutivos, a análise de heterocromatina pode fornecer dados para a caracterização de
ocorrência de rearranjos em espécies próximas (MEDRANO et al., 1988).
O uso de fluorocromos é muito importante, principalmente DAPI e MM tem sido
muito usados para discriminar a composição de bases da região heterocromática e o número e
localização dos sítios de DNA ribossomal (MARTINS et al., 2011).
Com o desenvolvimento da técnica de hibridação in situ fluorescente (FISH), a
citogenética obteve avanços significativos para o conhecimento do genoma com base nos
cromossomos (MARTINS et al., 2011). Esta técnica definiu a transição da era clássica da
citogenética à era molecular, permitindo estudos mais detalhados com a integração da
informação molecular das sequências de DNA e sua localização física ao longo dos
cromossomos e genomas (SCHWARZACHER, 2003; JIANG e GILL, 2006).
Análises citogenéticas moleculares utilizando a técnica de FISH são atualmente
muito utilizadas e vêm se mostrando eficientes ferramentas no estudo da evolução cariotípica
em peixes, devido ao mapeamento de sequências ribossomais 5S e 18S (MARTINS e
GALETTI, 2001; MOLINA, 2002; MARTINS et al., 2011a; MOTTA-NETO et al., 2011b;
CALADO et al., 2013; CALADO et al., 2014).
Informações citogenéticas em peixes marinhos têm aumentado nas últimas décadas,
Entretanto, somente cerca de 7% das espécies, em sua maioria da Ordem Perciformes, grupo
mais representativo entre os teleósteos (NELSON, 1996; GALLETTI et al., 2000). Onde, em
grande parte de suas espécies, um padrão marcante de conservadorismo cromossômico, com
número diploide composto por 48 cromossomos acrocêntricos (MOLINA, 2007; MOTTA-
NETO et al., 2011).
Uma maior divergência de padrões cariotípicos em Perciformes é geralmente descrita
para espécies dulcícolas, representada pela família Cichlidae e Percidae (OHNO, 1974), ou
em grupos sedentários como Gobiidae e Bleniidae (BRUM e GALETTI, 1997). Além disso,
variações genéticas no ambiente marinho podem ser principalmente encontradas em espécies
18
que se mostram adaptadas ou isoladas em ambientes singulares, como, as que são associadas a
recifes de corais e ilhas oceânicas, onde as massas de água que os circundam podem funcionar
como a barreira geográfica e limitar a dispersão (PALUMBI, 1994; ROCHA, 2003).
Os peixes recifais são principalmente compostos por Perciformes e contêm uma
elevada diversidade de espécies que representam linhagens evolutivas distintas. Dentre os
Perciformes um dos grupos mais representativos e carismáticos é a família Acanthuridae
(ROBERTSON, 1983; LAWSON et al., 1999), que devido a sua diversidade na forma de
forrageamento e sua forte associação com recifes de corais são um grupo bastante utilizado
em estudos que busquem identificar o ritmo de evolução que conduz a biodiversidade em
peixes de corais, e na investigação da importância dos fatores ecológicos na diversificação de
ambientes recifais (SORENSON et al., 2013).
A família Acanthuridae é relativamente bem estudada, sobretudo sob aspectos da
evolução morfológica (TYLER, 1970a, b; GUIASU e WINTERBOTTOM, 1993; BORDEN,
1998; WINTERBOTTOM, 1993), e da filogenia molecular (ROCHA et al., 2002;
CLEMENTS et al., 2003; BERNAL e ROCHA, 2011; SORENSON et al., 2013). Entretanto,
no que tange a evolução cromossômica, a família Acanthuridae ainda está sub-representada,
menos de 5% das espécies, sendo todas no oceano Pacífico (ARAI, 2011).
As três espécies analisadas do Pacífico, Acanthurus triostegus (LINNAEUS, 1758),
Prionorus scalprum Valenciennes, 1835 (ARAI e INOUE, 1976) e Ctenochaetus striatus
(QUOY e GAIMARD, 1825) (OJIMA e YAMAMOTO, 1990) mostram um cariótipo
conservado com 2n=48 acrocênticos, considerado basal entre os Perciformes (BRUM e
GALETTI, 1997; ARAI, 2011). Não existem quaisquer informações sobre espécies de
Acanthuridae presentes no Oceano Atlântico, a ausência destas informações impede
inferências filogenéticas e dificulta uma visão mais ampla dos processos de evolução
cariotípica do grupo.
19
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral
Tendo em vista a importância das informações citogenéticas e a carência delas no
que diz respeito às espécies da família Acanthuridae, o presente trabalho tem como foco
principal estabelecer aspectos carioevolutivos, com base em análises da citogenética clássica e
molecular de três espécies da família Acanthuridae presentes no Atlântico Ocidental.
2.2 Objetivos específicos
Caracterizar cromossomicamente por meio de bandamento C, Ag-RONs e coloração
com fluorocromos base-específicos MM/DAPI as espécies A. coeruleus, A. bahianus e
A. chirurgus.
Mapear as sequências das subunidades ribossomais DNAr 5S e 18S por meio de dual-
color FISH das espécies analisadas das famílias Acanthuridae.
Identificar os mecanismos evolutivos envolvidos na diferenciação cariotípica das
espécies estudadas.
20
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Material
Os exemplares das espécies A. coeruleus (n=23), A. bahianus (17) e A. chirurgus
(12) foram coletados ao longo da costa de Natal, Rio Grande do Norte (5o46'S, 35
o12'O) e
Salvador, Estado da Bahia (13°00'S, 38°32'O), nordeste do Brasil. As coletas ocorreram por
meio de mergulho livre em recifes costeiros nas áreas citadas utilizando-se de apetrechos de
pesca como puçás e tarrafas. Após a coleta os exemplares foram transportados vivos ao
Laboratório de Genética de Recursos Marinhos, da Universidade Federal do Rio Grande do
Norte, e mantidos em aquários aerados até que se procedesse à realização de preparações
cromossômicas.
3.2. Métodos
3.2.1. Obtenção de cromossomos mitóticos
Vinte e quatro horas antes da preparação cromossômica, os animais foram
inoculados via intramuscular com uma solução de complexos antígenos para indução mitótica
(MOLINA et al., 2010). Após esse período, os exemplares foram anestesiados e sacrificados
seguindo procedimento estabelecido por Blessaing et al. (2010).
Para obtenção de cromossomos mitóticos, fragmentos do rim anterior foram
adicionados em meio de cultura RPMI 1640 de acordo com a técnica in vitro preconizada por
Gold et al. (1990). Os fragmentos foram dissociados em 9 ml de meio de cultura RPMI 1640
através de aspirações com seringas de vidro de 10 ml até obter um mistura homogênea, onde
foi adicionado 5 gotas de colchicina 0,025%, deixando agir por 30 minutos em temperatura
ambiente. Após o processo anterior o material foi centrifugado por 10 minutos a 1000 rpm.
Após descarte do sobrenadante, foi adicionado 8 ml da solução hipotônica de KCl a 0,075M,
que após ser homogeneizada agiu por 28 minutos em temperatura ambiente. A suspensão
celular foi pré-fixada com 0,5 ml de solução de metanol e ácido acético (3:1) recém-
preparado. Após homogeneização a suspensão foi centrifugada por 10 minutos. O processo de
fixação do material foi repetido por 3 vezes, após o que as suspensões celulares foram
estocados em tubos Eppendorf de 1,5 ml à -20oC.
3.2.2. Análises cromossômicas e montagem do cariótipo
As suspensões celulares foram gotejada sobre uma lâmina recoberta por um filme de
água destilada aquecido a 60°C e corada com solução de Giemsa a 5%, diluída em tampão
fosfato pH 6,8.
21
As análises foram realizadas em microscópio óptico de epifluorescência Olympus™
BX51 e fotografadas sob aumento de 1.000X através de sistema digital de captura Olympus
DP70 utilizando o software DPController 1.2.1.108 (Olympus Optical Co. Ltd.). Cerca de
trinta metáfases foram analisadas para cada espécime. As melhores metáfases foram
selecionadas para montagem do cariótipo a partir da nomenclatura preconizada por Levan et
al. (1964) com modificações, onde os cromossomos foram definidos, quanto à posição dos
centrômeros, em metacêntricos (m), com a razão entre o braço maior e menor (RB) variando
de 1,00 a 1,70; submetacêntricos (sm), RB=1,71–3,00; subtelocêntricos (st), RB=3,01–7,00; e
acrocêntricos (a), RB>7,01.
3.2.3. Detecção de regiões organizadoras de nucléolos
A detecção de regiões organizadoras de nucléolos foi obtida pela técnica de
impregnação por prata preconizada por Howell & Black (1980). Sobre uma lâmina
previamente preparada com suspensão celular foram adicionadas 7 gotas de solução
gelatinosa (1g de gelatina incolor, dissolvida em 50ml água e 0,5ml ácido fórmico), e 6 gotas
de solução de nitrato de prata (AgNO3) à 50%. A solução foi homogeneizada com a
extremidade de uma lamínula e recoberta por ela sendo então incubada em estufa a 60°C, até
obtenção da cor amarelo escuro. Após a remoção da lamínula com jatos de água destilada,
eventualmente, para destacar as marcações argênteas, as preparações podiam ser coradas por
cerca de 20 segundos com solução de Giemsa a 5%.
3.2.4. Detecção de heterocromatina constitutiva
A análise das regiões heterocromáticas foi realizada através do bandamento-C,
segundo Sumner (1972). Foram utilizadas lâminas com material envelhecido em estufa a
37°C por no mínimo 3 dias, após esse período a lâmina foi imersa em HCl 0,2 N por 14
minutos em temperatura ambiente, sendo lavada com água destilada e seca. Posteriormente a
lâmina foi mergulhada em uma solução a 5% de Ba(OH)28H2O à 42°C por cerca de 1 minuto
e 35 segundos sendo rapidamente lavadas em HCl 0,1N e posteriormente água destilada. Após
secar ao ar, a lâmina foi então imersa em solução salina 2x SSC a 60°C em estufa por 40
minutos. Para análise o material foi corado com Giemsa 5% por 8 minutos.
3.2.5. Dupla coloração com fluorocromos base-específicos
Fluorocromos base-específicos foram utilizados para detectar regiões ricas em pares
de bases, como a Mitramicina (MM) para pares de bases GC e DAPI para regiões ricas em
22
pares de bases AT, de acordo com Carvalho et al. (2005). As lâminas com suspensão celular
de cada exemplar foram coradas com 30µl de (MM) 0,5 mg/ml cobertas com lamínulas e
depositadas em câmara úmida, no escuro, sendo lavadas com água destilada após 60 minutos,
coradas com 30 µl de DAPI 2µl/ml, cobertas por lamínulas e colocada em câmara úmida, no
escuro, por 30 minutos. Posteriormente as lâminas foram lavadas com água destilada e
montadas com tampão glicerol-Mcllvaine pH 7,0 (1:1) coberto com lamínula e selado com
esmalte incolor. As lâminas foram então guardadas à 4oC em câmara escura e analisadas após
3 dias (DAPI) e 15 dias (MM) com fotomicroscópio de epifluorescência (Olympus™ BX51)
com filtros apropriados, em aumento de 1.000x. As preparações foram capturadas pelo
sistema digital Olympus DP73 com uso do software DPController, v. 1.2.1.108 (Olympus
Optical Co. Ltd.).
3.2.6. Hibridação in situ fluorescente – FISH
3.2.6.1. Obtenção de sondas para hibridização
A FISH foi realizada de acordo com Pinkel et al. (1986) usando sondas teloméricas
de 18S e 5S. As sondas de DNAr 5S (200 pb) e 18S DNAr (1400 pb) foram obtidos a partir
de amostras de DNA de A. coeruleus via PCR utilizando os iniciadores A 5'-TAC CCG CGA
TCT CGT CCG ATC-3 '/ B 5'-CAG GGT GCT ATG CCG GTA AGC-3' (PENDAS et al.,
1994) e NS1 5'-GTC ATA GTA TGC TTG TCT C-3' / NS8 5'-TCC GCA GGT TCA CCT
ACG AG-3' (WHITE et al., 1990), respectivamente. A sonda 18S foi marcada por nick
translation digoxigenina-11-dUTP (Roche) e a sonda DNAr 5S foi marcada por nick
translation biotina-14-dATP (Roche) , de acordo com as especificações do fabricante. As
sequências (TTAGGG)n foram mapeadas pela técnica de FISH com Kit FISH Telomere
PNA/FITC de acordo com as instruções do fabricante (DakoCitomation).
3.2.6.2. Hibridização cromossômica
FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) foi realizada em metáfases mitóticas
(PINKEL et al., 1986) das três espécies. Análise por dual-color FISH foi desenvolvida usando
sondas DNAr 18S e DNAr 5S. Os cromossomos foram tratados com RNAse livre de DNAse
(20mg / mL em 2xSSC ) à 37°C por 1 hora, com pepsina (0,005 % em HCl 10mM) à 37°C
por 10 minutos e fixados com formaldeído a 1% por 10 minutos, em seguida desidratados em
série alcoólica. Os cromossomos foram, então, desnaturados em 70% formamida/2×SSC a
72°C por 5 minutos. A solução de hibridização consistiu em 50% de formamida, 2×SSC, 10%
de sulfato de dextran e a sonda desnaturada (5 ng/µl). Após hibridação, overnight à 37°C, as
23
lâminas foram lavadas em 15% formamida/0.2×SSC à 42°C por 20 minutos, 0,1×SSC à 60 °C
por 15 minutos e Tween20 0,5%/4×SSC à temperatura ambiente. O sinal de hibridização da
sonda foi detectado usando avidin-FITC (Sigma) para a sonda DNAr 5S e anti-digoxigenina
rodamina conjugada (Roche) para a sonda DNAr 18S. Os cromossomos foram contracorados
com Vectashield/DAPI (1,5 µg/ml). As análises da FISH e registro fotográfico foram
realizados conforme descrito para as análises de fluorocromos.
24
4. Capítulo I
Abstract
Surgeonfishes are a species-rich group and a major biomass on coral reefs. Three species are
commonly found throughout South Atlantic, Acanthurus bahianus, A. chirurgus, and A.
coeruleus. In this paper, we present the first cytogenetic data of these species, revealing a
sequential chromosomal diversification. A. coeruleus was characterized by a relatively
conserved karyotype evolved by pericentric inversions of some pairs (2n = 48, 2sm + 4st +
42a). In contrast, the karyotypes of A. bahianus (2n = 36) and A. chirurgus (2n = 34) were
highly differentiated by the presence of six large metacentric pairs in A. bahianus (12m + 2sm
+ 4st + 18a) and A. chirurgus (12m + 2sm + 4st +1 6a) probably derived by chromosomal
fusions that corroborate their closer relationship. A discernible in tandem fusion represents an
autapomorphic character to A. chirurgus. In spite of macrostructure variation, single nucleolar
organizer regions (NORs) on short arms of a subtelocentric pair and similar distribution of C-
bands were observed in the three species. Overlapping of chromosomal data with molecular
phylogeny indicated pericentric inversions which took place nearly at 19Ma while centric
fusions are as recent as 5Ma. A physical mapping of coding and noncoding sequences in
Acanthurus could clarify the role of additional rearrangements during their chromosomal
evolution.
25
1. Introduction
Acanthuridae are a monophyletic fish family composed of about 80 species,
popularly known as surgeonfishes or tangs (NELSON, 2006). This is an ancient group (nearly
54Ma) and most of genera (Acanthurus, Ctenochaetus, Naso, Paracanthurus, Prionurus e
Zebrasoma) diverged between 17 and 21 Ma in Early Miocene (NELSON, 2006).
Apparently, the Pacific Ocean is the center of origin of surgeonfishes, retaining most
of Acanthuridae richness (TANG et al., 1999; GUIASU e WINTERBOTTOM, 1993). Further
colonization events resulted in distribution of this family to virtually all tropical and
subtropical seas of the world, but Mediterranean Sea (SORENSON et al., 2013; TANG et al.,
1999) The genus Acanthurus is the largest within the family, but monophyly of the genus is
still controversial (TANG et al., 1999; CLEMENTS et al., 2003). This fish group is
morphologically and ecologically diversified, mainly in relation to foraging behavior and
dentition, composing one of themost representative herbivorous fish group on coral reefs
(TANG et al., 1999; FRANCINI-FILHO et al., 2010)
A total of four species of Acanthuridae, all belonging to the genus Acanthurus, are
present in western Atlantic (BERNAL e ROCHA, 2011). Three species are common along the
Brazilian coast (Western South Atlantic): Acanthurus coeruleus (blue tang), A. bahianus
(barber surgeonfish), and A. chirurgus (doctorfish) (BERNAL e ROCHA, 2011;
FIGUEIREDO e MENEZES, 2000). Another Acanthurus species (A. monroviae) was also
recorded off southeastern coast of Brazil, but it seems to be an occasional occurrence (LUIZ
JR. et al., 2004). Moreover, A. bahianus was thought to range from USA to southern Brazil,
but morphological and genetic analyses have shown that populations from Massachusetts to
Caribbean actually refer to another species, validated as A. tractus (FIGUEIREDO e
MENEZES, 2000).
In spite of the low diversity of Atlantic species when compared to Pacific and Indian
oceans, surgeonfishes are a dominant fish group forming large assemblages in several reef
areas from South Atlantic (TANG et al., 1999). A. coeruleus specimens are usually solitary
due to their territoriality behavior, while A. bahianus and A. chirurgus are commonly found in
small to large schools, depending on the ontogenetic stage (LAWSON et al., 1999). As most
Acanthurids, these species present relatively long pelagic larval stages with a mean duration
from 51,6 to 55,2 days (ROCHA et al., 2002). Usually, wide-range reef fish species with long
pelagic larval development are characterized by a lack of genetic subdivision among
populations (EBLE et al., 2011) and low rates of chromosomal variation (MOLINA, 2007).
26
However, reports about cytogenetic patterns of Acanthuridae are still
underrepresented (less than 5% of species) and restricted to Indo-Pacific species (ARAI,
2011). The three analyzed species from Pacific, Acanthurus triostegus, Prionurus scalprum
(ARAI & INOUE 1976), and Ctenochaetus striatus (OJIMA e YAMAMOTO, 1990) all share
a conservative Perciformes-like karyotype with 2𝑛 = 48a, considered basal to this fish group
(BRUM e GALETTI, 1997).
In order to increase the karyotypic data of Acanthuridae and to infer the
chromosomal evolution of Atlantic species, cytogenetical analyses were carried out for three
Acanthuridae species from Brazilian coast, South Atlantic.
2. Material and Methods
Nine individuals of A. coeruleus, four individuals of A. bahianus, and 17 individuals
of A. chirurgus were cytogenetically studied. Animals were collected using hand nets (60x100
cm) by snorkeling at coastal reef areas from the states of Rio Grande do Norte (5°46’S,
35°12’W) and Bahia (13°00’S, 38°32’W and 13°52’S, 38°56’W) in northeastern Brazilian
shore (Figure 1). Right after collection, specimens were transported in plastic bags with
Figure 1. Map of South America showing the collections sites of Acanthurus coeruleus (a), A. bahianus (b),
and A. chirurgus (c) in the states of Rio Grande do Norte (1) and Bahia (2), northeastern Brazil.
27
oxygen to the laboratories and placed in 60 L tanks equipped with filtration and aeration
systems.
Twenty-four hours prior to chromosomal preparation, the animals were inoculated
via intramuscular with a solution of antigen complexes (Munolan) for mitotic induction
(MOLINA et al., 2010). After this period, the specimens were anesthetized and euthanized by
immersion in in water at 0–4º Cup to complete interruption of gill movements (Blessaing et
al., 2010). To obtain mitotic chromosomes in vitro, portions of anterior kidney were removed
and transferred to RPMI medium (Cultilab) with about 50 𝜇L of 0.025% colchicine, followed
by hypotonic treatment (KCL 0.075M) for 20 minutes at 37∘C and fixation in Carnoy’s
fixative (methanol : acetic acid 3 : 1) (GOLD et al., 1990). Chromosomes were stained with
5% Giemsa in phosphate buffer (pH 6.8) for karyotypic analyses. Nucleolus organizer regions
(NORs) were detected by silver nitrate staining (Ag-NORs) (HOWELL e BLACK, 1980),
whereas heterochromatic regions were evidenced by Cbanding (SUMNER, 1972).
Metaphases were photographed using an Olympus BX51 (Olympus, Tokyo, Japan)
epifluorescence photomicroscope equipped with digital capture system. Chromosomes were
classified as metacentric (m), submetacentric (sm), subtelocentric (st), and acrocentric (a)
based on arm ratio (LEVAN, 1964). The pairs were arranged in decreasing order size
according to each morphological category (m, sm, st, and a) in karyotypes using the software
Adobe Photoshop CS6 v. 13.0.
3. Results
The three Acanthurus species showed remarkable karyotype diversification.
Acanthurus coeruleus presented 2𝑛=48, composed of two submetacentric, four subtelocentric,
and 42 acrocentric chromosomes (Figure 2(a)). The diploid number of A. bahianus equals
2𝑛=36 with a karyotype composed of 12 large metacentric, two submetacentric, four
subtelocentric, and 18 acrocentric chromosomes (Figure 2(c)) while A. chirurgus was
characterized by 12 large metacentric, two submetacentric, four subtelocentric, and 16
acrocentric chromosomes (2𝑛=34) (Figure 2(e)).
Small amounts of heterochromatin were detected mainly at pericentromeric regions
and interspersed with NORs in studied species (Figures 2(b), 2(d), and 2(f)). In A. bahianus,
terminal C-bands were also observed in some pairs (Figure 2(d)).
28
Single nucleolar organizer regions (NORs) were located by silver nitrate staining on
short arms of the largest subtelocentric pair in the three Acanthuridae species (Figure 2,
inbox). Based on chromosomal data, idiograms were generated to highlight particular
karyotype traits for each species and the inferred pathways of chromosomal differentiation
based on a phylogenetic hypothesis to Atlantic Acanthurus (Figures 3(a)–3(d)).
Figure 2: Karyotypes of Acanthurus coeruleus ((a) and (b)) with 2𝑛=48, A. bahianus ((c) and (d)) with 2𝑛=36,
and A. chirurgus ((e) and (f)) with 2𝑛=34 after conventional Giemsa staining ((a), (c), and (e)) and
C-banding ((b), (d), and (f)). The NOR-bearing chromosomes after silver nitrate staining of each
species are shown in boxes (pair 2 of A. coeruleus and pair 8 of A. bahianus and A. chirurgus).
29
4. Discussion
It is assumed that the presence of 48 acrocentric chromosomes represents a
plesiomorphic feature within Perciformes (BRUM e GALETTI JR., 1997; GALETTI JR. et
al., 2006). This condition is particularly frequent among marine fish and could be related to
Figure 3. Idiograms of chromosomes sets of Acanthurus coeruleus (a), A. bahianus (b), and A. chirurgus (c)
showing the most conspicuous shared cytogenetic traits in boxes. In (d), the basal karyotype of
Perciformes (2n=48a) and a phylogenetic hypothesis based on sequential chromosomal
rearrangements inferred in the three Acanthurus species.
30
dispersal abilities (high gene flow) between populations, thereby preventing the fixation of
new chromosomal rearrangements and karyotypic divergence (MOLINA, 2007). In fact, the
low genetic structure in reef fish species has been correlated to the production of planktonic
eggs and/or larvae that can be dispersed over large distances (EBLE et al., 2011). This trend
(2n=48a) seems to be valid for Acanthuridae species from Indo-Pacific Ocean of different
genera, such as Acanthurus, Ctenochaetus, and Prionurus (ARAI, 2011). However,
inconsistent relationship between pelagic larval duration (PLD) and genetic connectivity or
chromosomal patterns has been reported in some marine species (ROCHA et al., 2002;
AFFONSO e GALETTI JR., 2005). In these cases, ecological and biogeographic aspects of
each species might be more relevant to explain the genetic variation than PLD itself, as
observed in the present study.
As expected for widely distributed species with long PLD, A. coeruleus presented
typical Perciformes-like features, that is, a diploid number of 48, single NORs, and a large
number of acrocentric chromosomes (Figure 2a).The karyotype of this species (2sm + 4st +
42a) demonstrates the occurrence of pericentric inversions in three chromosome pairs (1st,
2nd, and 3rd pairs), a common rearrangement in Perciformes that accounts for most of
karyotype diversification in marine fish (GALETTI JR. et al., 2006).
A similar set of three chromosomal pairs in both morphology and size is also
observed in A. bahianus and A. chirurgus, represented by a submetacentric pair and two
subtelocentric pairs, including the NOR-bearing pair. Because of the high resemblance of
such pairs in the three Acanthurus species, they are supposed to share a common origin before
the differentiation of each lineage, thereby indicating a symplesiomorphic trait. Estimates of
divergence time between the subclade that comprises A. coeruleus and that clusters A.
chirurgus and A. tractus (SORENSON et al., 2013), a sister-species of A. bahianus, suggest
that these putative homeologous pairs (sm and st) had arisen at nearly 19Ma.
On the other hand, A. bahianus and A. chirurgus presented an evolutionary
chromosomal pattern rarely found in typical marine fishes. The drastic reduction in diploid
number from 48 chromosomes to 2n=36 and 2n=34, respectively, along the presence of
large metacentric pairs is evidence of sequential Robertsonian rearrangements or centric
fusions (Figures 2c and 2e). Indeed, the uniqueness of Robertsonian translocations in
karyotypes of A. bahianus and A. chirurgus (Figure 3), and similar size of metacentric pairs
reinforces these rearrangements are a recently shared trait between both species. An
additional fusion representing an autapomorphic condition is presented in A. chirurgus
31
karyotype since this species has an exclusive large sm pair (7th) and lacks the smallest
acrocentric pair observed in the other two species (Figure 2e).
The chromosomal speciation observed in Acanthurus species of South Atlantic is
likely to reflect historical events. Extensive analysis of biogeography and evolution of reef
fish from Atlantic indicated that changes in ocean dynamics over the past 10Ma have
determined the differential richness and endemism levels of fish genera and families of reef
fish (FLOETER et al., 2008). As discussed by Galetti et al. (2006) the rate of chromosomal
evolution in reef fish from Atlantic Ocean also seems to be strongly related to habitat
isolation of coastal areas during glaciation periods followed by further sea level uprising.
Unfortunately, no reports about time of divergence between A. bahianus and A.
chirurgus are available, thus hindering the minimum time span after Robertsonian
rearrangements that gave rise to the large metacentric chromosomes, herein referred as a
single trait. However, estimates inferred for A. chirurgus and A. tractus (SORENSON et al.,
2013) being the latter a sibling species of A. bahianus (FRANCINI-FILHO et al., 2010),
point out that these rearrangements took place by at least 5Ma. Even though the time
estimates for the occurrence of chromosomal fusions in both Acanthurus species might
require some bias correction, they are intermediary to periods of major biogeographic
isolation events in Atlantic Ocean such as Amazon outflow (∼10Ma) and uplifting of
Panama isthmus (∼3Ma) (Rocha, 2003). Nonetheless, the influence of these biogeographic
barriers in the putative fixation of chromosomal rearrangements remains unclear and further
cytogenetic studies in other species, particularly A. tractus, are highly encouraged.
Different from pericentric inversions, centric fusions or Robertsonian rearrangements
are usually reported in non-Perciformes marine fish, such as flatfish (Pleuronectiformes)
(BITENCOURT et al., 2014) toadfish (Batrachoidiformes) (COSTA e MOLINA, 2009) and
some mullets (Mugiliformes) (NIRCHIO et al., 2005) Centric fusions are particularly
common in Batoidea (stingrays, guitarfish, and skates), the most derived superorder of
elasmobranchs (ROCCO et al., 2007). Conversely, these rearrangements have been scarcely
identified in Perciformes at a polymorphic stage in Pomacentridae (MOLINA e GALETTI
JR., 2002) Gobiidae (GILES et al., 1985; THODE et al., 1985), Lutjanidae (NIRCHIO et al.,
2008), Apogonidae (OJIMA e KOJIMA, 1985) and Uranoscopidae (VITTURI et al., 1991)
or else restricted to a particular taxon like Sparisoma (parrotfishes) (SENA e MOLINA,
2007). Therefore, the karyotypes of A. bahianus and A. chirurgus can be regarded as highly
derived in relation to basal karyotype suggested to Perciformes.
32
While the macrostructure was variable, the NOR-bearing chromosomes seem to be
conserved in the three species (Figure 2, inbox). This pattern indicates that these
chromosomal regions as poor cytotaxonomic markers, differing from other Atlantic fishes in
which the identification of ribosomal cistrons has proved to be efficient to distinguish
apparently homogeneous karyotypes, as in Lutjanidae (ROCHA e MOLINA, 2008)
Serranidae (MOLINA et al., 2002) and Gerreidae (CALADO et al., 2012) or even
population units (ACCIOLY et al., 2012) Similarly, heterochromatin was virtually similar
among A. coeruleus, A. bahianus, and A. chirurgus, being mainly dispersed over
centromeres and NORs, as commonly found in most Perciformes (MOLINA et al., 2013)
Therefore, it is unclear if the deep divergences in these fish karyotypes are followed by
microstructural changes. Further analyses using other banding methodologies and mapping
of sequences by fluorescence in situ hybridization (FISH) are required to evaluate the
extension of such apparent homogeneity of specific chromosomal regions in Acanthurus.
The amount of chromosomal traits in the three Acanthurus species from Brazilian
coast allows raising a phylogenetic hypothesis to them. Indeed, the ordination and sharing of
the traits show a closer phylogenetic relationship between A. bahianus and A. chirurgus than
to A. coeruleus. This result is corroborated by previous genetic analyses. Indeed, analysis of
CytB sequences showed a more basal condition between A. coeruleus in relation to the other
two congeners (FRANCINI-FILHO et al., 2010). Recently, a phylogenetic analysis of
Acanthuridae based on sequence data of two mitochondrial and seven nuclear genes
(SORENSON et al., 2013) corroborated the ancestral position of A. coeruleus in relation to
A. chirurgus and A. tractus, which replaces A. bahianus in the Caribbean (FRANCINI-
FILHO et al., 2010; CALASTELLANOS-GELL et al., 2012).
Thus, for analyzed Atlantic species, the chromosomal traits show robust support to
clarify the phylogenetic arrangement among them serving as useful markers to evolutionary
studies in Acanthuridae. Moreover, in agreement with phylogeographic studies (ROCHA et
al., 2002; FLOETER et al., 2008), the chromosomal differences between Atlantic species of
Acanthurus seem to be more related to ecology and evolutionary history than to dispersal
potential since the three species share a relatively long PLD.
5. Conclusion
In conclusion, the chromosomal analyses in Acanthurus allowed identifying
sequential events related to speciation process that differ from most cytogenetical reports on
marine Perciformes, where specific rearrangements are often unclear. A step-by-step
33
karyotype modification can be inferred from the most basal pattern, involving few structural
rearrangements (pericentric inversions in A. coeruleus) to high derived ones, originated by
Robertsonian fusions in both A. bahianus and A. chirurgus and additional in tandem fusion in
A. chirurgus. This scenario reveals a unique condition to tracing back the order of
chromosomal evolutionary changes in Atlantic surgeonfish.
Acknowledgments
The authors thank CAPES, CNPq (no. 556793/2009-9), INCT “Ciências do Mar,”
and FAPESB (no. APP0064/2011) for the financial support and ICMBio/SISBIO (licenses
19135-1, 131360-1, and 27027-2) for the authorization in collecting specimens. They are
also grateful to Dr. José Garcia Júnior for the taxonomic identification of specimens.
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37
5. Capítulo II
Abstract
Acanthurus is a representative and widespread genus of marine fish that plays a key role in
ecological dynamics of coral reefs. Three species are common along coastal reefs of Western
Atlantic: A. coeruleus, A. bahianus and A. chirurgus. The cytogenetic pattern of these species
indicated sequential steps of chromosomal rearrangements dating back 19 to 5 millions of
years ago (M.a.) that accounted for their interspecific differences. Acanthurus coeruleus
(2n=48; 2sm+4st+42a), A. bahianus (2n=36; 12m+2sm+4st+18a) and A. chirurgus (2n=34;
12m+2sm+4st+16a) share an older set of three chromosomal pairs that were originated
through pericentric inversions. A set of six large metacentric pairs formed by Robertsonian
(Rb) translocations found in A. bahianus and A. chirurgus and a putative in tandem fusion
found in A. chirurgus are more recent events. In the present study, new cytogenetic data are
being reported for these three Acanthurus species based on mapping of repetitive sequences
such as ribosomal 18S and 5S rDNA and telomeric repeats to improve their karyotype
evolutionary analyses. The lack of interstitial telomeric sequences (ITS) in spite of several
centric fusions in A. bahianus and A. chirurgus might be related to the long period of time
after their occurrence (estimated in 5Ma). Furthermore, the homeologies among the
chromosome pairs bearing ribosomal genes, in addition to other structural features, highlight
large conserved chromosomal regions in the three species. Our findings indicate that
macrostructural changes occurred during the cladogenesis of these species were not followed
by conspicuous microstructural rearrangements in the karyotypes.
38
1. Introduction
The Acanthuridae family (Perciformes) is a monophyletic and relatively ancient
group of marine fishes (nearly 54 millions of years ago) with fast evolutionary divergence
(CLEMENTS et al., 2003; SORENSON et al., 2013). Nowadays, this family is divided into
six genera and comprises about 80 species, popularly known as surgeonfishes (NELSON,
2006).
The genus Acanthurus Forsskål (1775) is one of the mostemblematic groups of
surgeonfishes closely associated to coastal reefs (BELLWOOD and WAINWRIGHT, 2002;
NELSON, 2006). This genus is widespread over tropical and subtropical seas, playing a major
role in the ecology and evolution of coral reefs due to their herbivory habit (VALENTINE
and HECK JR., 1999). The large assemblages of Acanthuridae and other grazers (e.g.
parrotfishes and damselfishes) influence the coral reef structure by promoting bioerosion and
controlling the spread of macroalgae cover (HORN, 1989; PADDACK et al., 2006).
Four Acanthurus species are recorded in Western Atlantic, being three of them
commonly found throughout brazilian coast; A. coeruleus Bloch and Schneider (1801), A.
bahianus Castelnau (1855), and A. chirurgus (BLOCH, 1787) (BERNALL and ROCHA,
2011; MENEZES and FIGUEIREDO, 1985). These three species present highly differentiated
karyotypes (2n=48, 36, and 34, respectively) in which Robertsonian rearrangements reduced
the diploid values from 2n=48 to 2n=36 in A. bahianus and 2n=34 in A. chirurgus.
In fact, six large metacentric pairs, which are absent in A. coeruleus, were derived
from centric fusions and are apparently homeologous between A. bahianus and A. chirurgus,
corroborating their close phylogenetic relationship. Such remarkable differences in the
karyotype macrostructure are rare in marine fishes. Comparing these results to molecular data
available for Acanthuridae, it was possible to infer that centric fusions have taken place about
5 M.a. while the pericentric inversions shared by the three species were more ancient events
(nearly 19 M.a.) (AFFONSO et al., 2014).
In view of the unusual cytogenetic variation in Atlantic Acanthurus, chromosomal
banding and cytogenetic mapping of ribossomal genes and telomeric sequences were
performed in A. coeruleus, A. bahianus and A. chirurgus. Our purpose was to infer if
microstructural chromosome differentiation also followed the diversification in the karyotype
macrostructure.
39
2. Material and methods
Cytogenetic analyses were carried out in specimens of A. coeruleus (N=23), A.
bahianus (N=12) and A. chirurgus (N=17) collected along the shoreline of Natal, Rio Grande
do Norte state (5o46’S, 35
o12’W) and Salvador, Bahia state (13°00’S, 38°32’W), northeastern
Brazil. Mitotic stimulation was performed by the inoculation of antigen complexes in the
specimens (MOLINA, 2001, MOLINA et al., 2010). After 24 h, the animals were
anesthetized with crave oil (1 mL/15 L of salt water) and euthanized for removal of anterior
kidney. The experiments and euthanasia of specimens were authorized by the Committee of
Animal Ethics (CEUA/UESB) from Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia (#32/2013).
Chromosomal spreads were obtained by interrupting the cell cycle in vitro (GOLD et
al., 1990). The active nucleolar organizer regions (NORs) were detected by silver nitrate
staining (HOWELL and BLACK, 1980). Once heterochromatin patterns have been previously
reported in the analyzed species (AFFONSO et al., 2014), chromosomes were stained with
base-specific fluorochromes to locate GC- and AT-rich sites by mithramycin (MM) and 4’-6-
diamino-2-fenilindole (DAPI), respectively (SCHWEIZER, 1980).
FISH was performed according to Pinkel et al. (1986) using 18S, 5S and telomeric
probes. The probes of 5S rDNA (nearly 200 bp) and 18S rDNA (nearly 1400 bp) were
obtained from DNA samples of A. coeruleus via PCR using the primers A 5’-TAC GCC
CGA TCT CGT CCG ATC-3’/B 5’-CAG GCT GGT ATG GCC GTA AGC-3’ (Pendás et al.,
1994) and NS1 5’-GTA GTC ATA TGC TTG TCT C-3’/NS8 5’-TCC GCA GGT TCA CCT
ACG GA-3’ (WHITE et al., 1990), respectively. Both probes were labeled by nick translation
(Roche, Mannheim, Germany). The 5S rDNA probes were labeled with biotin-14-dATP
(Invitrogen) and detected with avidin-FITC (Sigma); while the 18S rDNA probes were
labeled with digoxigenin-11-dUTP (Roche) and detected with anti-digoxigenin-rhodamin
(Roche). The (TTAGGG)n sequences were mapped by FISH using Telomere PNA FISH
Kit/FITC according to manufacturer’s instructions (DakoCitomation).
The micrographs were obtained using an epifluorescence photomicroscope
OlympusTM
BX51 (Olympus, Tokyo, Japan) with appropriate filters equipped with digital
capture system Olympus DP73 using the software CellSens (Olympus). The karyotypes were
arranged as previously defined by Affonso et al. (2014) with identification of metacentric (m),
submetacentric (sm), subtelocentric (st) and acrocentric (a) chromosomes based on arm ratio.
An idiogram was built based on the structural features of chromosomal pairs of each species
combining the results of mapped sequences.
40
3. Results
The karyotypic patterns agree with the previous results reported for the three
Acanthurus species (AFFONSO et al., 2014). Therefore, A. coeruleus presented 2n=48
(2sm+4st+42a; NF=54), A. bahianus 2n=36 (12m+2sm+4st+18a; NF=54) e A. chirurgus
2n=34 (12m+2sm+4st+16a; NF=52) (Figure 1A-C). Active NORs were located at terminal
position on short arms of the largest st pair of each species, corresponding to pairs 2, 8 and 8
of A. coeruleus, A. bahianus and A. chirurgus, respectively (Figure 1, inbox). The GC-rich
sites (MM+/DAPI
-) were identified only at active NORs while AT-rich heterochromatin
segments were absent in the three species.
Figure 1. Karyotypes and metaphases of A. coeruleus (a), A. bahianus (b) and A. chirurgus (c) after Giemsa
staining (left column), two-color FISH (middle column) with 18S rDNA (magenta signals) and 5S
rDNA (green signals) probes and distribution of (TTAGGG)n sequences (right column). Inbox, the
NOR-bearing chromosomes are shown after silver nitrate staining (left column) and fluorochrome
staining (middle column). Bar = 5µm.
41
The 18S rDNA sites were coincident with Ag-NORs in all species, except for A.
coeruleus that presented an additional and probably inactive NOR site (unidentified by silver
nitrate staining) on pair 13. On the other hand, the 5S rDNA sites were invariably located in
the largest acrocentric pair of the three acanthurids, corresponding to pair 4 in A. coeruleus,
and pair 10 in both A. bahianus and A. chirurgus. The (TTAGGG)n sequences were located
exclusively at terminal chromosomal regions (Figure 1). The two-color FISH with ribossomal
probes showed lack of synteny between the 18S and 5S rDNA sites.
4. Discussion
Previous cytogenetic reports allowed tracing back the occurrence of chromosomal
rearrangements in the Atlantic surgeonfish A. coeruleus, A. bahianus and A. chirurgus
(AFFONSO et al., 2014). These authors verified that a set of sm-st chromosomes (pairs 1 to 3
in A. coeruleus and 7 to 9 in A. bahianus and A. chirurgus) shared by these species derived
from relatively ancient pericentric inversions when compared to the basal karyotype of
Perciformes (2n=48a). On the other hand, a set of large metacentric pairs (1 to 6), associated
with the drastic reduction in 2n values of A. bahianus and A. chirurgus, indicated a more
recent event of Rb translocations that corroborates the closer phylogenetic relationship
between both species in relation to A. coeruleus.
This approach was favored by the rare possibility of dating chromosomal
rearrangements in this group. The divergence period estimated for the three Acanthurus
species (considering A. tractus as sister-group of A. bahianus) by molecular analyses
(SORENSON et al., 2013) provides a reliable indication that the set of six metacentric
chromosomes related to Rb rearrangements and shared by A. bahianus and A. chirurgus has
arisen at least 5 Ma (AFFONSO et al., 2014). In the face of karyotype macrostructure
variation in Acanthuridae from brazilian coast, the mapping of repetitive sequences is
particularly useful to the identification of possible shared chromosomal similarities as well as
refining the understanding about the interspecific differentiation after the origin of
chromosomal rearrangements.
In the three Acanthurus species, the heterochromatin is mainly distributed over
pericentromeric regions and interspersed to NORs. Following this trend, the qualitative
analysis of heterochromatic segments presented in this study also revealed similar base
composition with homogenous amounts of GC and AT content after fluorochrome staining.
The only exception were the GC-rich sites (MM+/DAPI
- signals) at NORs, as usually detected
in teleosteans.
42
This reduced and quite homogenous heterochromatic pattern of Acanthuridae
(AFFONSO et al., 2014) has been considered as an obstacle to evolutionary changes in
karyotypes of marine Perciformes (MOLINA, 2007). Indeed, the mapping of repetitive
sequences in several families of this order, characterized by stable karyotypes, revealed a
reduced phylogenetic variation (MOTTA-NETO et al., 2011a, b; CALADO et al., 2013). On
the other hand, heterochromatin heterogeneity has been reported in some fish groups with
remarkable karyotypic changes such as Gobiidae (CAPUTO et al., 1997; LIMA-FILHO et al.,
2014; MOLINA et al., 2014), Characidae (MANTOVANI et al., 2000) and Erythrinidae
(CIOFFI et al., 2009; BLANCO et al., 2011).
For instance, some species of marine Perciformes like Centropyge aurantonotus
(Pomacanthidae), presented unusual karyotype for the family and a unique richness of C-
bands and GC-rich sites (AFFONSO et al., 2005). Therefore, the absence of heterochromatin
variation in the differentiated karyotypes of Acanthurus species in the present work represents
an unusual condition. However, it should be pointed out that heterochromatin might be more
complex than previously thought after analyses of other repetitive sequences (histones,
transposons, retrotransposons and microsatellites), as revealed in some Perciformes species
(COSTA et al., 2013; COSTA et al., 2014).
The location of 18S and 5S rRNA genes has been proved to be efficient
cytotaxonomic markers in distinct marine fish groups like Gerreidae (CALADO et al., 2013;
CALADO et al., 2014), Lutjanidae (ROCHA and MOLINA, 2008) and Nototheniidae
(PISANO and GHIGLIOTTI, 2009). Usually, both families of these ribosomal genes are not
syntenic (GORNUNG, 2013), as observed in Acanthurus (Figure 1). Nonetheless, the
distribution of both 18S and 5S rDNA sites were quite similar among the three species, being
apparently located in homeologous pairs.
The major NOR-bearing pairs identified by silver nitrate and fluorochrome staining
as well as by FISH with 18S rDNA probes were included in “sm-st chromosomes set”
possibly formed by pericentric inversions that took place before the split of the three
Acanthurus species around 19 Ma (SORENSON et al., 2013). In spite of the conservatism of
NORs in these acanthurids, an additional 18S rDNA site was located on pair 13 in the
karyotype of A. coeruleus, regarded as the most basal taxon among the analyzed species
(BERNAL and ROCHA, 2011; CASTELLANOS-GELL et al., 2012; SORENSON et al.,
2013). Differently from the rDNA at pair 2 identified by both FISH and silver nitrate staining,
the ribosomal site in pair 13 lacks argyrophylic nature indicating either an inactive copy of
43
ribosomal gene (SANTORO, 2005) or pseudogenes (AFFONSO et al., 2005; LIMA-FILHO
et al., 2014).
The lack of conspicuous microstructural changes in karyotypes of Acanthurus
contrasts with the remarkable variation in chromosomal number and morphology found in A.
bahianus and A. chirurgus, particularly caused by Robertsonian (Rb) translocations or centric
fusions that formed the “m-chromosomes set” pairs in both species.
Previous reports in fishes suggested that Rb rearrangements are favored by the
presence of terminal 18S or 5S rDNA sites interspersed with heterochromatin in formerly
acrocentric chromosomes (FUJIWARA et al., 1998; MOLINA and GALETTI, 2002). This
seems to be the case of Selene setapinnis (Carangidae) in which a Rb translocation was
inferred to explain internalized 18S rDNA regions previously located at terminal regions
(Jacobina et al., 2013). Similarly, biarmed chromosomes derived from centric fusions in the
pomacentrids Chromis flavicauda and C. jubauna shared 5S rDNA sites (MOLINA and
GALETTI, 2002). The mapping of 18S rDNA in A. bahianus and A. chirurgus did not show
these sequences in the m-chromosomes set. However, the presence of an extra rDNA site in
the terminal position of an acrocentric pair of A. coeruleus, a species carrying the basal
karyotype 2n=48, does not excludes the role of this DNA family in the Rb processes occurred
in the Acanthurus genus.
The mapping of telomeric sequences by FISH is highly indicated to species or
populations with reduced chromosomal numbers by centric fusions (REED and PHILLIPS,
1995). This approach is able to reveal internal telomere sequences (ITS) that serve as
evidence of Rb rearrangements (BITENCOURT et al., 2014; MEYNE et al., 1990). However,
several cases of centric fusions are not followed by the presence of these ectopic sites. In
vertebrates, this lack of correlation between Rb rearrangements and ITS has been related to
losses during centric fusions or modification of telomeric sequences after long periods of
internalization (NANDA et al., 1995; OCALEWICZ, 2013). Likewise, ITS were absent in the
fused chromosomes of A. bahianus and A. chirurgus. Taking into account that Rb
rearrangements in both species have probably taken place at nearly 5Ma it seems plausible to
infer that the telomeric-like sequences internalized by fusions accumulated enough mutations
or were lost during this long period of time.
A more recent chromosomal rearrangement was inferred in A. chirurgus and
representing an autapomorphic feature. Putatively, the reduction of the chromosomal number
(2n=34) in this species was derived from a tandem fusion of a small acrocentric pair (present
in A. bahianus) on the short arms of the chromosomal pair 7 in A. chirurgus (Figure 2).
44
Usually, ectopic telomeric sequences could also be preserved after tandem fusions (CIOFFI et
al., 2011; HARTMANN and SCHERTHAN, 2004). However, internal (TTAGGG)n
sequences were not identified in this case and could have been probably lost during the
chromosomal rearrangements.
In conclusion, the refined analysis of karyotypic features in the three species of
Acanthurus showed little microstructural changes despite of their long-term evolutionary
history of chromosomal rearrangements. The coincident distribution of ribosomal genes, as
well as the presence of homeologous and phylogenetically related sets of sm-st chromosomes
(3 pairs) and m chromosomes (6 pairs) reveals the conservatism of large syntenic
chromosomal regions in these species. This condition has been reported in other marine
Perciformes (MOLINA, 2007; MOLINA et al., 2013; MOTTA-NETO et al., 2011a),
revealing that chromosomal rearrangements have probably taken place during cladogenesis of
these groups and remained fixed ever since.
Acknowledgments
The authors thank CNPq (#556793/2009-9; 301409/2009-9), INCT “Ciências do
Mar”, and FAPESB (#APP0064/2011) for the financial support, CAPES for the MSc
Figura 2. Idiogram of A. coeruleus (a), A. bahianus (b) and A. chirurgus (v) combining the results from
NOR/GC-rich region location and physical mapping of ribossomal and telomeric sequences. The
homeologous chromosomes derived from pericentric inversions (sm-st chromosomes set) and
centric fusions (m-chromosomes set) are highlighted in boxes. The asterisk in pair 7 of A. chirurgus
indicates a putative autapomorphy (in tandem fusion) to this species.
45
scholarship to M.A.F., and ICMBio/SISBIO (licenses 19135-1, 131360-1, and 27027-2) for
the authorization in collecting specimens. We are also grateful to Dr. José Garcia Júnior for
the taxonomic identification of specimens.
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48
6. CONCLUSÕES
As espécies de Acanthurus do Atlântico Ocidental apresentam cariótipos
conspicuamente diferenciados.
Diferentes rearranjos estruturais tiveram participação na diferenciação dos cariótipos
das espécies. Inversões pericêntricas em A. coeruleus, fusões Robertsonianas em A.
bahianus e A. chirurgus, espécies que apresentaram maior derivação, e uma possível
fusão em tandem com ocorrência adicional em A. chirurgus.
Os padrões de divergência citogenética são concordantes com processos sequenciais
de cladogênese destas espécies. Estes conjuntos de rearranjos datam de 19 milhões
(inversões pericêntricas) a 5 milhões (translocações Robertsonianas) de anos atrás.
A distribuição coincidente de genes ribossomais, bem como a presença de conjuntos
homeólogos de cromossomos sm-st (3 pares) e cromossomos m (6 pares) revela o
conservadorismo em grandes regiões cromossômicas sintênicas nestas espécies.
As espécies de Acanthurus apresentam uma microestrutura cromossômica conservada,
com poucas modificações, apesar da ocorrência de rearranjos cromossômicos antigos
ao longo de sua história evolutiva.
As informações obtidas estimulam o uso de marcadores citogenéticos mais
resolutivos, proporcionados pelo mapeamento sequências repetitivas de DNA, para um
melhor entendimento dos processos envolvidos na diversificação cromossômica da
família.
49
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