P-SA-64 PROCEDIMIENTO TECNICO METODO HORIZONTAL … · Fundamento Técnica Método Horizontal para la detección de las Salmonella spp ... las colonias típicas de Salmonella crecen

PROCEDIMIENTO TÉCNICO METODO HORIZONTAL PARA LA DETECCION DE LA

SAMONELLA SPP. ISO 6579:2002 Cor 1:2004 (e)

CODIGO: P-SA-64 FECHA DE EMISION: 27/10/2015

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PROCEDIMIENTO TÉCNICO METODO HORIZONTAL PARA LA DETECCION DE LA SAMONELLA SPP.

ISO 6579:2002 Cor 1:2004 (e)

ELABORÓ REVISÓ APROBÓ

REFERENTE DE LABORATORIO REPRESENTANTE DE CALIDAD

DIRECTOR (S) TECNICO (S)

SECRETARIO DE SALUD

REPRESENTANTE DE LA DIRECCIÓN




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1. OBJETIVO

Establecer el Procedimiento para la Determinar la presencia de Salmonella spp. Por la Técnica Método Horizontal para la detección de las Salmonella spp. ISO 6579:2002 Cor 1:2004 (e) en un alimento. 2. ALCANCE

Esta técnica aplica para los siguientes productos: Productos cárnicos (crudos, cocido, madurado); aves (crudo, cocido); pescados y productos alimenticios marinos (crudos, cocidos); productos de frutas y a base de vegetales (crudos) productos lácteos (crudos, congelados, secos, procesados); productos de chocolate y panadería; misceláneos (salsa, huevos y derivados, enriquecidos, precocidos, deshidratados). 3. DEFINICIONES § Salmonella: El género Salmonella pertenece a la tribu Salmonelleae de la familia

Enterobacteriaceae. Los microorganismos del genero Salmonella son bacilos gram – negativos, no esporulados, móviles (excepto S. gallinarum y S. pollorum) mesofilicos anaeróbicos facultativos están distribuidos ampliamente en la naturaleza, se encuentran en el tracto gastrointestinal de mamíferos domésticos y salvajes, en humanos puede haber un estado de portador asintomático.

§ ATCC = American Type Culture Collection. Es un material biológico de referencia certificado. La colección certifica que se suministra una determinada cepa, que es un cultivo puro, y que se han observado las convenientes pruebas morfológicas, bioquímicas y moleculares.

§ Ausencia / Presencia: Forma de obtener datos cualitativos en caso que bacteria sea positiva o negativa en el análisis.

4. RESPONSABLES

Será responsabilidad del profesional asignado a la sección del Análisis Microbiológico del Laboratorio de Salud Pública del Meta de aplicar este procedimiento en forma adecuada, sin hacer ningún cambio o variación que no esté debidamente documentado, autorizado y se ejecutara según cronograma de análisis de muestras. 5. GENERALIDADES La puerta de entrada de la Salmonella spp. En humanos y en animales es la vía oral, a través del consumo de alimentos contaminados con excretas y orina o por contaminación de los alimentos debido a las malas prácticas higiénicas de manipuladores que son portadores asintomáticos, por contaminación cruzada de productos crudos a cocidos o por deficiencias en buenas prácticas de manufactura.




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Las infeccione por Salmonella son de distribución mundial, la tasa de prevalencia de la infección es mayor en lactantes y en niños de corta edad. El período de incubación es de 12 a 36 horas manifestando síntomas como náuseas, dolor abdominal, somnolencia, diarrea, fiebre, septicemia.

6. REFERENCIAS § Método horizontal para la detección de las Samonella spp (Instituto Nacional de Vigilancia

de Medicamentos y Alimentos – INVIMA - SO 6579:2002 Cor 1:2004 (E)). § Manual de técnicas de análisis para control de calidad microbiológico de alimentos para

consumo humano. INVIMA - 1998 7. DESARROLLO

7.1. FUNDAMENTO

Fundamento Técnica Método Horizontal para la detección de las Salmonella spp. ISO 6579:2002 Cor 1:2004 (e): La presente técnica para la detección de Salmonella en alimentos, describe un esquema general que consiste de 5 pasos básicos: § Preenriquecimiento, es el paso en donde la muestra es enriquecida en un medio nutritivo

no selectivo, que permite restaurar las células de Salmonella dañadas, logrando de esta manera una condición fisiológica estable.

§ Enriquecimiento selectivo, se logra a partir de un medio de cultivo que conjunte dos condiciones, por un lado debe incrementar las poblaciones de Salmonella y por otro inhibir otros microorganismos presentes en la muestra.

§ Selección en medios sólidos, este punto se deriva directamente del anterior y se utilizan medios selectivos, que restringen el crecimiento de otros géneros diferentes a Salmonella y que permitan el reconocimiento visual característico de colonias sospechosas.

§ Identificación bioquímica, este paso permite la identificación genérica de los cultivos de Salmonella y la eliminación de cultivos sospechosos falsos.

§ Serotipificación, es una técnica inmunológica (antígeno-anticuerpo) que permite la identificación específica de un microorganismo.

7.2. MATERIALES Tener en cuenta los materiales e insumos para la preparación de la muestra se realizara conforme al P-SA—83 Procedimientos generales de los Análisis Microbiológicos de muestras de alimentos para consumo humano. 7.2.1. Equipos




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• Incubadora a 37°C+/-1°C • Incubadora a 41,5 +/- 1°C • Refrigerador a 4 +/- 2°C 7.2.2. Reactivos

• Agua peptona tamponada • Caldo Rappaport – Vassiliadis con soya (caldo RVS) • Caldo Muller – Kauffmann Tetrationato con novobiocina (MKTn) • Agar Hektoen • Agar XLD • Agar TSAYE • Agar Sulfito Bismuto según Blair (Opcionales) • Agar Verde Brillante lactosa – sacarosa con novobiocina (BPLS) (Opcionales) • Kit comercial para identificación Bioquímica de bacterias entéricas.

7.2.3. Cepas de Referencia • Salmonella typhimurium ATCC 14028 • Escherichia coli ATCC 25922 7.3. PROCEDIMIENTO 7.3.1. CONDICIONES AMBIENTALES Y MANEJO DE EQUIPOS

• El acondicionamento y manejo de equipos se realiza según hoja de vida (F-SA-18) de los

mismos. • El método no establece condiciones ambientales de temperatura y humedad

específicas.

• La muestra se debe analizar en cuarto de siembra y cabina de bioseguridad.

7.3.2. CONDICIONES GENERALES

Las condiciones generales y preparación de la muestra se realizaran conforme al P-SA-83 Procedimientos generales de los Análisis Microbiológicos de muestras de alimentos para consumo humano.

7.4. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO La detección de Salmonella spp incluye 5 etapas.

a. Pre Enriquecimiento en medio líquido No Selectivo




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Pesar en la bolsa para homogenización de muestras previamente tarada 25g ó ml representativos de la muestra total (tomando de la superficie como de su interior) la preparación de la muestra se realizara conforme al P-SA-83 Procedimientos generales de los Análisis Microbiológicos de muestras de alimentos para consumo humano.

Adicionar en caso general 225ml de Agua Tamponada a temperatura ambiente (medio pre enriquecimiento no selectivo).

Nota: para ciertos comestibles es necesarios de otros procedimientos de pre enriquecimiento. “ver preparaciones específicas”.

Incubar a 37°C ± 1°C X 18 ± 2 horas.

Preparaciones específicas para ciertos alimentos:

Cacao y productos que contienen cacao: (ejemplo más del 20%) añadir a 225ml de agua peptonada tamponada 22,5g de Skin Milk estéril y después de 2 horas de incubación agregar, 0.004g de Verde Brillante, pues es probable, que el producto alimenticio este muy contaminado con flora Gram – Positiva, precalentar el diluyente a 40°C. Pesar y agregar la muestra a la mezcla al diluyente. Dejar la mezcla a temperatura ambiente por 20 a 30 minutos hasta que se licue. Mezclar usando el homogenizador. Productos alimenticios Ácidos y Acidificantes: Emplear agua Peptonada Tamponada doble concentración para mayor estabilidad del pH. En los productos alimenticios ácidos y acidificantes. Aves: ISO 6887-1 Agregar 500ml de Agua Peptonada Tamponada por 30 segundos para hacer el lavado sacar el diluyentes y colocarlos en bolsa estéril.

b. Enriquecimiento Selectivo

Transferir 0.1ml de cultivo obtenido en el preenriquecimiento a un tubo que contenga 10ml de caldo RVS. Mezclar con vortex. Incubar a 42°C x 24 h ± 3 h Transferir 1 ml de cultivo obtenido en el preenriquecimiento a un tubo que contenga 10ml de caldo MKTTn. Mezclar con vortex. Incubar a 37°C ± 1°C x 24 h ± 3 h

c. Siembra en placa con medio selectivos y diferenciales:




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Se debe utilizar mínimo dos medios selectivos por cada caldo de enriquecimiento no selectivo y selectivo, para el aislamiento del microorganismo. El primer medio de cultivo recomendado debe ser agar XLD, y el segundo medio puede ser escogido por el laboratorio como: Agar Hektoen, agar Sulfito Bismuto. Aislar por agotamiento el cultivo obtenido en caldo RVS utilizando dos placas pequeñas (90mm a 100mm) de XLD. Use la misma asada para sembrar las dos cajas una después de la otra, de modo que se obtengan las colonias bien aisladas. Repetir el procedimiento con el segundo medio selectivo.

Aislar por agotamiento el cultivo obtenido en el caldo MKTTn y repetir el procedimiento descrito en el punto 1, con los dos medios selectivos en placa.

Incubar a 37°C ± 1°C: XLD 24 h ± 3 h

HECTOEN 18 – 24 h Después de la incubación, examinar las placas para ver la presencia de colonias típicas y atípicas de Salmonella (ver nota). Marcar la posición en el fondo de la placa.

NOTA: las colonias típicas de Salmonella crecen en agar XLD con el centro negro y una zona ligeramente transparente de color rojizo debido al cambio de color del indicador. Las colonias atípicas de Salmonella (lactosa – positivas) crecen en agar XLD amarillas con ó sin ennegrecimiento.

• Selección de colonias para confirmación, se toma de cada placa de cada medio

selectivo por lo menos una colonia que sea considerada típica o sospechosa y cuatro colonias más, si las primeras son negativas.

• Sembrar las colonias aisladas y purificadas en placas de agar TSAYE.

• Incubar las placas inoculadas a 37°C ± 1°C: x 24 h ± 3 h

• Proceder a su identificación. Utilizando cepas puras para la confirmación bioquímica.

d. Identificación de Salmonella spp.

La identificación de cultivos sospechosos de pertenecer al género Salmonella spp incluye las siguientes etapas: Mediante uso de kits comerciales. Se recomienda el uso de aquellos que hayan sido aprobados y validados por AOAC u otro organismo internacional reconocido y que garantice la validez de los resultados. Usar los kits de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

e. La identificación definitiva de Salmonella, como perteneciente a un determinado

serotipo, requiere el envío de las cepas al Laboratorio de Microbiología de Alimentos del INVIMA para que sea serotipificada.




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7.5. CÁLCULOS Y/O VALORES DE REFERENCIA

El método no requiriere cálculos para la expresión de resultado y el valor de referencia para los alimentos debe ser NEGATIVO.

7.5.1. Obtención de resultados

De acuerdo con la interpretación de los resultados, indicar la presencia o ausencia de Salmonella x 25g o ml, como POSITIVO ó NEGATIVO. El resultado del análisis se registra en el resultado microbiológico de alimentos F-SA-75

8. VERIFICACIONES

8.1. ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD DE LOS RESULTADOS

Para comprobar la capacidad del laboratorio de detectar Salmonellas con el método y los medios descritos en este procedimiento se cuenta con control positivo y control negativo, los cuales se procesan como una muestra normal: Para cada cepa bacteriana (Empleada como control), tome una colonia con una asa de siembra desechable estéril se inocula directamente al vial que contiene el reactivo y se procesa como una muestra (actividad 7.5).

8.1.1. Control de Calidad Interno En un (1) caldo de pre enriquecimiento inocular cepas de referencia ATCC 25922 de E. coli (control negativo) En un (1) caldo de pre enriquecimiento inocular cepas de referencia ATCC 14028 Salmonella typhimurium (Control positivo)

Medio de Cultivo Cepa de Referencia

Imagen

Agar Xilosa Lisina

Desoxicolato - XLD E. coli ATCC

25922

Las colonias E. coli son grandes, amarillas con o sin precipitado de bilis.




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Salmonella typhimurium ATCC 14028

Las colonias típicas de la Salmonella son de color rojo con el centro negro debido a la producción de H2S.

Agar Hektoen

E. coli ATCC 25922

Colonias grandes, color entre amarillo y salmón. Algunas especies pueden ser inhibidas

Salmonella typhimurium ATCC 14028

Colonias con centro negro y regulares

Registrar en los formatos

• F-SA-75 Resultados Microbiológicos de Alimentos • F-SA-64 Identificación de Sustancias Químicas • F-SA-18 Hoja de Vida de Equipos • F-SA-34 Control Interno de Equipos • F-SA-46 Control De Temperatura, Limpieza y Desinfección de Equipos. • F-SA-101 Control de calidad análisis microbiológico

Criterios Para Aprobación O Rechazo

CRITERIO LECTURA ACCION POR

INCUMPLIMIENTO DE CRITERIOS

Esterilidad del Medio de Cultivo

La prueba de esterilidad de los medios utilizados, no debe presentar crecimiento de ningún tipo.

Repetir Análisis Verificar proceso de preparación de medios de cultivo de nuevo lote.

Control Negativo E. coli ATCC 25922

No debe presentar crecimiento. Las colonias no deben poder diferenciarse claramente si los medios utilizados son selectivos.

Repetir siembra de cepas ATCC y repetir el Análisis

Control Positivo Salmonella typhimurium ATCC 14028

Observando que el crecimiento sea adecuado y las colonias características.

Repetir siembra de cepas ATCC y repetir el Análisis

Reactivos vigentes Vigencia del reactivo dentro de la fecha

Descartar Reactivos y adquirir y procesar con reactivos en fechas vigentes




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Temperaturas de Incubadoras

Temperatura ajusta a 37°C ± 1°C; 42°C.

Ajustar control de Temperatura y tomar nuevamente hasta obtener temperatura deseada.

Mantenimiento de equipos

Calibración, verificación y mantenimiento vigente

Solicitar y ejecutar los mantenimientos o verificaciones pendientes para realizar análisis con equipos idóneos

Control de Esterilización de Material

Verificar la fecha de esterilización de Material que no supere 8 días, verificar la cinta indicadora de esterilización su viraje.

Descartar el Material y realizar el proceso con material que cumpla la fecha y el viraje de la cinta.

Los resultados de los controles se registran en el Control De Calidad Análisis Microbiológico F-SA-101

8.1.2. Control de Calidad Externo El laboratorio participa en programas de evaluación externa como API para alimentos. Los resultados de los controles se registran en el análisis de resultados de control de calidad externo F-SA-109 9. REGISTROS

Registro Responsable Como conservarlo Donde conservarlo Tiempo de

conservación Disposición final

F-SA-18 Hoja de Vida de

Equipos

Profesional

Universitario o Profesional del

Laboratorio

Físico y/o Electrónico

Según F-MC-04 Listado Maestro de documentos, Según F-MC-03 -Listado maestro de registros y/o

tabla de retención documental





F-SA-34 Control Interno

de Equipos.

Auxiliar de

Laboratorio, Profesional


Laboratorio

Físico










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Registro Responsable Como

conservarlo Donde conservarlo Tiempo de conservación Disposición final

F-SA-46 Control De

Temperatura, Limpieza y

Desinfección de Equipos

Auxiliar de



Laboratorio

Físico







F-SA-64 Identificación de Sustancias

Químicas

Auxiliar de



Laboratorio

Físico







F-SA-75 Resultados Microbiológicos de Alimentos

Profesional Universitario o Profesional del Laboratorio

Físico

Según F-MC-04 Listado Maestro de documentos, Según F-MC-03 -Listado maestro de registros y/o tabla de retención documental



F-SA-101 Control de calidad análisis microbiológico

Profesional del Laboratorio





F-SA-109 Análisis de resultados

de control de calidad externo

Profesional Universitario / Profesional de

Laboratorio











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10. ANEXOS

11. HISTORIAL

VERSIÓN VIGENCIA IDENTIFICACIÓN DE LOS CAMBIOS

1 27/10/2015 Versión inicial.




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Documents

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