REAKSI UJI PROTEIN

I. Tujuan Percobaan

Percobaan ini bertujuan untuk mempelajari beberapa reaksi uji terhadap protein.

Memahami metode identifikasi protein dengan uji biuret.

Memahami metode identifikasi protein dengan pengedapan oleh logam.

Memahami metode identifikasi protein dengan pengendapan oleh garam.

Memahami metode identifikasi protein dengan pengendapan oleh alkohol.

Memahami metode identifikasi protein dengan uji koagulasi.

Memahami metode identifikasi protein dengan denaturasi protein.

II. Teori Dasar

Protein merupakan biopolimer polipeptida yang tersusun dari sejumlah asam

amino yang dihubungkan oleh ikatan peptida. Protein merupakan biopolimer yang

multifungsi, yaitu sebagai struktural pada sel maupun jaringan dan organ, sebagai

enzim suatu biokatalis, sebagai pengemban atau pembawa senyawa atau zat ketika

melalui biomembran sel dan sebagai zat pengatur.

protein merupakan suatu zat makanan yang sangat penting bagi tubuh karena

zat ini berfungsi sebagai sumber energi dalam tubuh serta sebagai zat pembangun dn

pengatur. Protein adalah polimer dari asam amino yang dihubungkan dengan ikatan

peptida. Molekul protein mengandung unsur-umsur C, H, O, N, P, S, dan terkadang

mengandung unsur logam seperti besi dan tembaga (Winarno, 1992).

Protein merupakan suatu polipeptida dengan BM yang sangat bervariasi dari

5000 samapi lebih dari satu juta karena molekul protein yang besar, protein sangat

mudah mengalami perubahan fisis dan aktivitas biologisnya. Banyak agensia yang

menyebabkan perubahan sifat alamiah dari protein seperti panas, asam, basa, solven

organik, garam, logam berat, radiasi sinar radioaktif (Sudarmadji, 1996).

Selain itu protein juga merupakan makromolekul yang paling berlimpah di

dalam sel dan menyusun lebih dari setengah berat kering pada hampir semua

organisme. Protein merupakan instrumen yang mengekspresikan informasi genetik

Protein mempunyai fungsi unik bagi tubuh, antara lain menyediakan bahan-

bahan yang penting peranannya untuk pertumbuhan dan memelihara jaringan tubuh,

mengatur kelangsungan proses di dalam tubuh, dan memberi tenaga jika keperluannya

tidak dapat dipenuhi oleh karbohidrat dan lemak.

Struktur asam amino digambarkan sebagai berikut:

(Lehninger, 1995).

Struktur protein tidak stabil karena mudah mengalami denaturasi yaitu

keadaan dimana protein terurai menjadi struktur primernya, baik reversibel maupun

ireversibel. Faktor-faktor yang menyebabkan denaturasi adalah pH, panas, pelarut,

kekuatan ion, terlarut, dan radiasi. Denaturasi yang berbahaya yaitu raksa (Hg) untuk

pemurnian emas seperti yang terjadi di Minamata, Jepang. Protein ada yang reaktif

karena asam amino penyusunnya mengandung gugus fungsi yang reaktif, seperti SH,

-OH, NH2, dan –COOH. Contoh protein aktif adalah enzim, hormon, antibodi, dan

protein transport. Reaksi protein aktif bersifat selektif dan spesifik, gugus sampingnya

yang selektif dan susunan khas makromolekulnya.

Ciri- Ciri Protein yaitu :

1. Susunan kimia yang khas

Setiap protein individual merupakan senyawa murni

2. Bobot molecular yang khas

Semua molekul dalam suatu contoh tertentu dari protein murni mempunyai bobot

molecular yang sama. Karena molekulnya yang besar maka protein mudah sekali

mengalami perubahan fisik atau aktivitas biologisnya.

3. Urutan asam amino yang khas

Urutan asam amino dari protein tertentu adalah terinci secara genetic. Akan tetapi,

perubahan-perubahan kecil dalam urutan asam amino dari protein tertentu.

( Page,D.S. 1997 ).

Jenis- jenis protein

a. Kolagen, protein struktur yang diperlukan untuk membentuk kulit, tulang,

dan ikatan tisu.

b. Antibodi, protein system pertahanan yang melindungi badan dari pada

serangan penyakit.

c. Dismutase superoxide, protein yang membersihkan darah kita.

d. Ovulbumin, protein simpanan yang memelihara badan.

e. Hemoglobin, protein yang berfungsi membawa sebagai pembawa oksigen.

f. Toksin, protein racun yang digunakan untuk membunuh kuman.

g. Insulin, protein hormone yang mengawal arah glukosa dalam darah.

h. Tripsin, protein yang mencernakan makanan protein.

Penggolongan protein berdasarkan Struktur molekulnya :

1. Struktur Primer ( struktur utama)

Struktur ini terdiri dari asam-asam amino yang dihubungkan satu

sama lain secara kovalen melalui ikatan peptida.

2. Struktur sekunder

Protein sudah mengalami interaksi intermolekul, melalui rantai

samping asam amino. Ikatan yang membentuk struktur ini, didominasi

oleh ikatan hidrogen antar rantai samping yang membentuk pola

tertentu bergantung pada orientasi ikatan hidrogennya. Ada dua jenis

struktur sekunder, yaitu: -heliks dan -sheet.

3. Struktur Tersier

Terbentuk karena adanya pelipatan membentuk struktur yang

kompleks. Pelipatan distabilkan oleh ikatan hidrogen, ikatan disulfida,

interaksi ionik, ikatan hidrofobik, ikatan hidrofilik.

4. Struktur Kuartener

Terbentuk dari beberapa bentuk tersier, dengan kata lain multi sub

unit. Interaksi intermolekul antar sub unit protein ini membentuk

struktur keempat/kuartener

Fungsi dan Peranan Protein

Protein memegang peranan penting dalam berbagai proses biologi. Peran-

peran tersebut antara lain:

1. Katalisis enzimatik

Hampir semua reaksi kimia dalam sistem biologi dikatalisis oleh enzim dan

hampir semua enzim adalah protein.

2. Transportasi dan penyimpanan

Berbagai molekul kecil dan ion-ion ditansport oleh protein spesifik. Misalnya

transportasi oksigen di dalam eritrosit oleh hemoglobin dan transportasi

oksigen di dalam otot oleh mioglobin.

3. Koordinasi gerak

Kontraksi otot dapat terjadi karena pergeseran dua filamen protein. Contoh

lainnya adalah pergerakan kromosom saat proses mitosis dan pergerakan

sperma oleh flagela.

4. Penunjang mekanis

Ketegangan kulit dan tulang disebabkan oleh kolagen yang merupakan protein

fibrosa.

5. Proteksi imun

Antibodi merupakan protein yang sangat spesifik dan dapat mengenal serta

berkombinasi dengan benda asing seperti virus, bakteri dan sel dari organisma

lain.

6. Membangkitkan dan menghantarkan impuls saraf

Respon sel saraf terhadap rangsang spesifik diperantarai oleh oleh protein

reseptor. Misalnya rodopsin adalah protein yang sensitif terhadap cahaya

ditemukan pada sel batang retina. Contoh lainnya adalah protein reseptor pada

sinapsis.

7. Pengaturan pertumbuhan dan diferensiasi

Pada organisme tingkat tinggi, pertumbuhan dan diferensiasi diatur faktor

pertumbuhan. Misalnya faktor pertumbuhan saraf mengendalikan

pertumbuhan jaringan saraf. Selain itu, banyak hormon merupakan protein

(Santoso, H. 2008)

Ada berbagai cara dalam pengujian terhadap protein yaitu dengan reaksi uji

asam amino dan reaksi uji protein. Reaksi uji asam amino sendiri terdiri dari 6 macam

uji yaitu: uji millon, uji hopkins cole, uji belerang, uji xantroproteat, dan uji biuret.

Sedangkan untuk uji protein, berdasarkan pada uji biuret, pengendapan oleh garam,

pengendapan oleh logam dan alkohol. Serta uji koagulasi dan denaturasi protein

A. Uji Biuret

Larutan protein dibuat alkalis dengan NaOH kemudian ditambahkan larutan CuSo4

encer. Uji ini untuk menunjukkan adanya senyawa-senyawa yang mengandung gugus

amida asam yang berada bersama gugus amida yang lain. Uji ini memberikan rekasi

positif yaitu ditandai dengan timbulnya warna merah violet atau biru violet.

B. Uji Xantroprotein

Larutan asam nitrat pekat ditambahkan dengan hati-hati ke dalam larutan protein.

Setelah dicampur terjadi endapan putih yang dapat berubah menjadi kuning apabila

dipanaskan. Reaksi yang terjadi ialah nitrasi pada inti benzena yang terdapat pada

molekul protein. Reaksi ini positif untuk protein yang mengandung tirosin, fenilalanin

dan triptofan.

C. Uji Hopkins-Cole

Larutan protein yang mengandung triptofan dapat direaksikan dengan pereaksi

Hopkins-Cole yang mengandung asam glioksilat. Pereaksi ini dibuat dari asam

oksalat dengan serbuk magnesium dalam air. Setelah dicampur dengan pereaksi

Hopkins-Cole, asam sulfat dituangkan perlahan-lahan sehingga membentuk lapisan di

bawah larutan protein. Beberapa saat kemudian akan terjadi cincin ungu pada batas

antara kedua lapisan tersebut.

D. Uji Millon

Pereaksi Millon adalah larutan merkuro dan merkuri nitrat dalam asam nitrat. Apabila

pereaksi ini ditambahkan pada larutan protein, akan menghasilkan endapan putih yang

dapat berubah menjadi merah oleh pemanasan. Pada dasarnya reaksi ini positif untuk

fenol-fenol, karena terbentuknya senyawa merkuri dengan gugus hidroksifenil yang

berwarna.

E. Uji denaturasi

Denaturasi protein dapat diartikan suatu perubahan atau modifikasi terhadap struktur

sekunder, tertier dan kuartener molekul protein tanpa terjadinya pemecahan ikatan-ikatan

kovelen. Karena itu, denaturasi dapat diartikan suatu proses terpecahnya ikatan hydrogen,

interaksi hidrofobik, ikatan garam dan aterbukanya lipatan atau wiru molekul protein

(Winarno, 1992).

III. Alat dan Bahan

Bahan Alat

Pereaksi Molisch Tabung reaksi

Reagent Benedict Pipet tetes

Reagent Barfoed Gelas ukur

Pereaksi Seliwanoff Erlenmeyer

Larutan Iodium Penangas air

Larutan Asam Sulfat Pekat

9 Jenis Larutan Karbohirat :

- Larutan 0,1 M Glukosa

- Larutan 0,1 M Fruktosa

- Larutan 0,1 M Galaktosa

- Larutan 0,1 M Arabinosa

- Larutan 0,1 M Sukrosa

- Larutan 0,1 M Maltosa

- Larutan 0,1 M Laktosa

- Larutan 1℅ pati/amilum

- Suspensi selulosa (kapas) dalam air

HCl 6 N

NaOH 6 N

Air

IV. Prosedur Percobaan Uji Biuret

Dalam tabung reaksi dimasukan 3 ml larutan protein (gelatin dan albumin).

Lalu ditambahkan 1 ml NaOH 2,5 N, aduk. Ditambahkan pula setetes larutan CuSO 4

0,01 M, aduk. Bila tidak timbul warna, tambahkan lagi setetes atau 2 tetes larutan

CuSO4.

Pengendapan Dengan Logam

Dalam tabung reaksi dimasukan 3 ml larutan protein (gelatin dan albumin).

Lalu ditambahkan 5 tetes HgCl2 0,2 M. Ulangi percobaan dengan menggunakan Pb

asatat 0,2 M.

Pengendapan Dengan Garam

Larutan protein (gelatin dan albumin) sebanyak 5 ml dijenuhkan dengan

ammonium sulfat. Untuk pekerjaan ini: Pertama ditambahkan sedikit garam tersebut

kedalam larutan protein (gelatin dan albumin), aduk hingga melarut. Lalu

ditambahkan lagi sedikit ammonium sulfat dan aduk lagi, lakukan sehingga sedikit

garam tertinggal tidak terlarut. Setelah larutan jenuh, lalu disaring. Uji kelarutan

endapan di dalam air. Uji pula endapan dengan reagen Millon dan filtrat dengan uji

biuret.

Pengendapan Dengan Alkohol

Disiapkan 3 tabung reaksi:

Tabung 1: Dimasukan larutan albumin sebanyak 5 ml, buffer asetat pH 4,7 (1M)

sebanyak 1 ml dan etil alkohol 95% sebanyak 6 ml.

Tabung 2: Dimasukan larutan albumin sebanyak 5 ml, HCl 0,1 M sebanyak 1 ml dan

etil alkohol 95% sebanyak 6 ml.

Tabung 3: Dimasukan larutan albumin sebanyak 5 ml, NaOH 0,1 M sebanyak 1 ml

dan etil alkohol 95% sebanyak 6 ml.

Uji Koagulasi

Dalam tabung reaksi dimasukan 5 ml larutan protein, lalu ditambahkan 2 tetes

CH3COOH 1M. Tabung kemudian diletakan dalam air mendidih selama 5 menit. Lalu

endapan diambil dengan batang pengaduk. Uji kelarutan endapan di dalam air, uji

pula endapan dengan reagen Millon.

Denaturasi Protein

Disiapkan 3 tabung reaksi:

Tabung 1: Dimasukan larutan albumin sebanyak 9 ml dan HCl 0,1 M sebanyak 1 ml

Tabung 2: Dimasukan larutan albumin sebanyak 9 ml dan NaOH 0,1 M sebanyak 1

ml

Tabung 3: Dimasukan larutan albumin sebanyak 9 ml dan buffer asetat pH 4,7 (1M)

sebanyak 1 ml.

Lalu ketiga tabung tersebut ditempatkan didalam air mendidih selama 15 menit dan

dinginkan pada temperatur kamar. Pada tabung 1 dan 2 ditambahkan 10 ml buffer

asetat pH 4,7 lalu ditulis hasilnya.

V. Data Pengamatan

Tabel 1. Uji Biuret

Prosedur Hasil Reaksi Keterangan Gambar 3 ml larutan gelatin + 1

ml NaOH 2,5 N → diaduk → ditambah 6 tetes CuSO4 0,01 M → diaduk

Larutan gelatin yang berwarna kuning bening menjadi berwarna agak bening setelah ditambah NaOH 2,5 N. Setelah ditambah 6 tetes CuSO4,

Permukaan larutan berwarna ungu

3 ml larutan albumin + 1 ml NaOH 2,5 N → diaduk → ditambah 6 tetes CuSO4 0,01 M → diaduk

Larutan albumin yang berwarna putih keruh menjadi berwarna bening setelah ditambah NaOH 2,5 N. Setelah ditambah 6 tetes CuSO4,

Permukaan larutan berwarna ungu lebih tua

Tabel 2. Uji Pengendapan dengan Logam

Prosedur Hasil Reaksi Keterangan Gambar 3 ml larutan gelatin + 5

tetes HgCl2 0,2 M Larutan berwarna kuning

pudar dan keruh Tidak terbentuk endapan

(-)

3 ml larutan gelatin + 5 tetes Pb asetat 0,2 M

Larutan berwarna kuning pudar dan keruh

Tidak terbentuk endapan (-)

3 ml larutan albumin + 5 tetes HgCl2 0,2 M

Larutan berwarna putih susu

Terbentuk endapan berwarna putih di bagian bawah larutan lebih banyak (++) dari endapan oleh Pb asetat

HgCl2 → Hg2+ + 2 Cl-

3 ml larutan albumin + 5 tetes Pb asetat 0,2 M

Larutan berwarna putih susu

Terbentuk endapan (+) di bagian bawah berwarna putih

Pb(COOH)2 → Pb2+ + 2 COOH-

Tabel 3. Uji Pengendapan dengan Garam

Prosedur Hasil Reaksi Keterangan Gambar 5 ml gelatin + 10

tetes (NH4)2SO4

hingga terjadi pengendapan

↓Menyaring endapan

↓Menguji kelarutan endapan di dalam air

↓Menguji endapan dengan reagent Millon

↓Menguji filtrat dengan uji Biuret

Terbentuk endapan (+) warna putih

Endapan yang dihasilkan larut dalam air

Endapan yang diuji dengan reagent millon memberikan warna kuning muda

Filtrat yang diuji dengan reagent biuret menjadikan permukaan larutan filtrat berwarna ungu

Terbentuk endapan gelatin

Filtrat gelatin dengan uji biuret

5 ml albumin + 10 tetes (NH4)2SO4

hingga terjadi pengendapan

↓

Terbentuk endapan warna putih yang lebih banyak (++) daripada endapan yang dihasilkan

Menyaring endapan↓

Menguji kelarutan endapan di dalam air

↓Menguji endapan dengan reagent Millon

↓Menguji filtrat dengan uji Biuret

reaksi gelatin dengan (NH4)2SO4

Endapan yang dihasilkan larut dalam air

Endapan yang diuji dengan reagent millon memberikan warna kuning kemerah-merahan

Filtrat yang diuji dengan reagent biuret menjadikan permukaan larutan filtrat berwarna ungu Albumin Millon (merah bata) dan

Gelatin Millon (kuning)

Filtrat albumin dengan uji biuret

Tabel 4. Uji Pengendapan dengan alkohol

Prosedur Hasil Reaksi Keterangan Gambar 5 ml larutan albumin + 1

ml buffer asetat pH 4,7 (1 M) + 6 ml etil alkohol 95 %

Terjadi dua fase warna pada larutan. - Di bagian atas terbentuk

endapan (+++) berwarna putih

- Di bagian bawah berwarna keruh

Ketiga larutan sebelum ditambahkan alkohol 95%Tabung dari kiri ke kanan-Tabung 1 albumin+buffer-Tabung 2 albumin+HCl-Tabung 3 albumin+NaOH

Ketiga larutan setelah ditambahkan alkohol 95%Tabung dari kiri ke kanan-Tabung 1 albumin+buffer+alkohol 95%-Tabung 2 albumin+HCl+alkohol 95%-Tabung 3 albumin+NaOH+alkohol 95%

5 ml larutan albumin + 1 ml HCl 0,1 M + 6 ml etil alkohol 95 %

Terjadi dua fase warna pada larutan. - Di bagian atas terbentuk

endapan (++) berwarna putih

- Di bagian bawah berwarna keruh

5 ml larutan albumin + 1 ml NaOH 0,1 M + 6 ml etil alkohol 95 %

Larutan berwarna bening dan tidak terjadi endapan (-)

Tabel 5. Uji Koagulasi

Prosedur Hasil Reaksi Keterangan Gambar 5 ml larutan gelatin + 2

tetes asam asetat 1 M → diletakkan dalam air mendidih selama 5 menit → ambil endapan dengan spatula

↓Menguji kelarutan endapan di dalam air

↓Menguji endapan dengan reagent Millon

Warna larutan gelatin yang ditambahkan 2 tetes asam asetat 0,1 M tetap berwarna kuning, begitu pula setelah dipanaskan selama 5 menit, larutan tidak membentuk endapan

Karena tidak terbentuk endapan, maka tidak dilakukan uji kelarutan endapan dalam air maupun uji endapan dengan reagen Millon

Gelatin Setelah dipanaskan selama 5 menit

5 ml larutan albumin + 2 tetes asam asetat 1 M → diletakkan dalam air mendidih selama 5 menit → ambil endapan dengan spatula

↓Menguji kelarutan endapan di dalam air

↓Menguji endapan dengan reagent Millon

Warna larutan albumin yang ditambahkan 2 tetes asam asetat 0,1 M tetap berwarna putih keruh, dan setelah dipanaskan selama 5 menit, larutan membentuk endapan (gumpalan) berwarna putih

Endapan albumin yang diuji kelarutannya dalam air memberikan hasil bahwa endapan albumin tidak larut dalam air

Endapan albumin yang diuji dengan regent Millon memberikan warna merah bata

Albumin Setelah dipanaskan selama 5 menit

Uji kelarutan endapan dalam air

Uji endapan Millon

Tabel 6. Uji Denaturasi Protein

Prosedur Hasil Reaksi Keterangan Gambar 9 ml larutan albumin + 1

ml HCl 0,1 M → menempatkan dalam air mendidih selama 15 menit → mendinginkan pada temperatur kamar → melihat ada atau tidak adanya endapan→ ditambahkan 10 ml buffer asetat pH 4,7

Larutan albumin yang ditambahkan HCl 0,1 M, setelah dipanaskan selama 15 menit terjadi warna putih susu dan terbentuk endapan.

Setelah ditambahkan buffer asetat pH 4,7, warna larutan tetap berwarna putih susu

Gambar setelah ditambahkan 10 ml buffer asetat pH 4,7

9 ml larutan albumin + 1 ml NaOH 0,1 M → menempatkan dalam air mendidih selama 15 menit → mendinginkan pada temperatur kamar → melihat ada atau tidak adanya endapan→ ditambahkan 10 ml buffer asetat pH 4,7

Larutan albumin yang ditambahkan NaOH 0,1 M, setelah dipanaskan selama 15 menit terjadi warna kuning bening dan tidak terbentuk endapan.

Setelah ditambahkan buffer asetat pH 4,7 warna larutan menjadi warna putih susu dan terbentuk sedikit endapan

Gambar setelah ditambahkan 10 ml buffer asetat pH 4,7

9 ml larutan albumin + 1 ml buffer asetat pH 4,7 → menempatkan dalam air mendidih selama 15 menit → mendinginkan pada temperatur kamar → melihat ada atau tidak adanya endapan ditambahkan 10 ml buffer asetat pH 4,7

Larutan albumin yang ditambahkan 1 ml buffer asetat pH 4,7, setelah dipanaskan selama 15 menit terjadi gumpalan berwarna putih susu

Ketiga larutan sebelum dipanaskan

Tabung 1 albumin+HCl+ dipanaskan selama 15 menit (sebelum ditambah buffer asetat)

Tabung 2 albumin+NaOH+ dipanaskan selama 15 menit (sebelum ditambah buffer asetat)

Tabung 3 albumin+buffer asetat pH 4,7+dipanaskan selama 15 menit

VI. Pembahasan

Pada berbagai uji kualitatif yang dilakukan terhadap beberapa macam protein,

semuanya mengacu pada reaksi yang terjadi antara pereaksi dan komponen protein,

yaitu asam amino. Gugus amino dan gugus karboksil yang ada pada asam amino akan

menunjukkan sifat-sifat spesifiknya pada reaksi kimia yang dilakukan. Asam amino

juga bersifat amfoter, yaitu dapat bersifat sebagai asam dan memberikan proton

kepada basa kuat, atau dapat bersifat sebagai basa dan menerima proton dari asam

kuat. Semua asam amino yang ditemukan pada protein mempunyai ciri yang sama,

yaitu gugus karboksil dan amino diikat pada atom karbon yang sama. Masing-masing

berbeda satu dengan yang lain pada gugus R-nya, yang bervariasi dalam struktur,

ukuran, muatan listrik, dan kelarutan dalam air. Beberapa asam amino mempunyai

reaksi yang spesifik pada gugus R-nya, sehingga dari reaksi tersebut dapat diketahui

komponen asam amino suatu protein. Pada praktikum Biokimia “ Reaksi Uji Protein”

ini akan dipelajari cara identifikasi protein dengan memanfaatkan ikatan yang khas

pada protein, yaitu ikatan peptida dan juga akan diamati pengaruh perubahan fisik

seperti suhu, pH, dan zat-zat kimia terhadap struktur protein. Adapun larutan protein

yang kami uji adalah larutan gelatin dan larutan albumin.

1. Uji Biuret

Pada uji biuret, baik pada larutan protein gelatin dan albumin yang diujikan

memberikan hasil positif, ditandai dengan terbentuknya warna ungu pada permukaan

larutan setelah ditambah NaOH dan CuSO4. Uji biuret hanya akan memberikan hasil

positif pada protein yang memiliki ikatan peptida, artinya jika hanya terdiri dari satu

asam amino saja (contoh: Glisin, alanin, valin), uji biuret akan memberikan hasil

negatif. Larutan Gelatin dan albumin memiliki rumus bangunan yang kompleks dan

mengikat dua atau lebih asam amino esensial, sehingga terbentuk ikatan peptida.

Gelatin termasuk pada protein fiber yang terdiri atas beberapa rantai polipeptida yang

memanjang dan dihubungkan satu dengan lain oleh beberapa ikatan silang hingga

merupakan bentuk serat atau serabut yang stabil. Sementara itu, albumin merupakan

protein globular yang terdiri atas rantai polipeptida yang berlipat (Poedjiadi, 1994).

Jadi, dengan adanya ikatan peptida (polipeptida) inilah, hasil uji biuret pada gelatin

dan albumin positif. Pada uji Biuret, maksud ditambahkannya NaOH dalam larutan

uji adalah untuk mengkondisikan suasana basa, sehingga Cu dapat bereaksi dengan

larutan protein. NaOH mencegah endapan Cu(OH)2, memecah ikatan protein sehingga

terbentuk urea, sbg katalisator

Reaksi menghasilkan warna violet pada permukaan larutan protein yang

menandakan terbentuknya senyawa kompleks Cu dengan gugus -CO dan -NH pada

asam amino dalam protein. Biuret merupakan senyawa dengan dua ikatan peptida yang

terbentuk pada pemanasan dua molekul urea dan mempunyai struktur mirip dengan struktur

peptida dari protein (Routh, 1969), sehingga ion Cu2+ dari pereaksi biuret dalam suasana basa

akan bereaksi dengan polipeptida atau ikatan-ikatan peptida yang menyusun protein

membentuk senyawa kompleks berwarna ungu

2. Uji Pengendapan dengan Logam

Pada uji protein pengendapan dengan logam, kami menguji larutan protein

(gelatin dan albumin) dengan larutan HgCl2 0,2 M dan Pb asetat 0,2 M. HgCl2 dan Pb

asetat merupakan garam logam berat yang dapat mendenaturasi protein sama dengan

halnya asam dan basa. Reaksi yang terjadi antara garam logam berat akan

mengakibatkan terbentuknya garam protein-logam yang tidak larut. Garam logam

berat seperti Pb dan Hg akan membentuk endapan logam proteinat. Ikatan yang

terbentuk amat kuat dan akan memutuskan jembatan garam, sehingga protein

mengalami denaturasi. Secara bersama, gugus –COOH dan gugus –NH2 yang terdapat

dalam protein dapat bereaksi dengan ion logam berat Hg dan Pb membentuk senyawa

kelat. Selain gugus –COOH dan gugus –NH2, gugus –R pada molekul asam amino

tertentu dapat pula mengadakan reaksi dengan ion atau senyawa lain. Gugus

sulfihidril (-SH) pada molekul sistein akan bereaksi dengan ion Ag+ atau Hg++

(Poedjiadi, 1994).

Dari hasil percobaan kami, diketahui bahwa reaksi antara logam berat Hg dan

Pb dengan albumin menghasilkan endapan berwarna putih susu, sedangkan reaksi

pada gelatin dengan logam Hg dan Pb tidak membentuk endapan. Tidak terbentuknya

endapan oleh logam Hg dan Pb pada gelatin mungkin disebabkan konsentrasi gelatin

yang rendah, sehingga kalaupun ada endapan jumlahnya sangat sedikit, sehingga

hampir tidak ada endapan. Albumin merupakan protein yang jauh lebih kompleks

daripada gelatin karena albumin lebih banyak tersusun atas asam amino. Hal ini juga

mempengaruhi sifat albumin yang lebih cepat membentuk endapan dengan logam

daripada gelatin. Pada albumin, endapan yang paling banyak dihasilkan adalah dari

reaksi albumin dengan HgCl2 daripada dengan Pb asetat. Hal ini karena tetapan

disosiasi Hg lebih tinggi daripada Pb, sehingga lebih banyak ion Hg2+ yang berada

dalam bentuk bebas yang bereaksi dengan protein membentuk endapan. Sistein dan

Metionin merupakan asam amino yang mengandung atom S pada molekulnya. Reaksi

Pb-asetat dengan protein tersebut akan membentuk endapan berwarna putih

kekuningan, yaitu garam PbS. Dari hasil terbentuknya endapan albumin yang

berwarna putih oleh Pb asetat, yakni endapan PbS, sehingga dapat disimpulkan

albumin mengandung Sistein ataupun Metionin.

3. Uji Pengendapan dengan Garam

Kelarutan protein akan berkurang bila ke dalam larutan protein ditambahkan

garam-garam anorganik, akibatnya protein akan terpisah sebagai endapan. Pada

percobaan yang kami lakukan, terjadi pengendapan pada masing-masing 5ml larutan

protein albumin dan gelatin dengan penambahan garam amonium sulfat hingga jenuh,

yaitu sebanyak 10 tetes, peristiwa pemisahan protein ini disebut salting out

(penurunan kelarutan). Menurut literatur, bila garam anorganik yang ditambahkan

berkonsentrasi tinggi, maka protein akan mengendap, pengendapan terus terjadi

karena kemampuan ion garam untuk menghidrasi, sehingga terjadi kompetisi antara

garam anorganik dengan molekul protein untuk mengikat air. Karena garam

anorganik lebih menarik air, maka jumlah air yang tersedia untuk molekul protein

akan berkurang (Winarno, 2002). Pada larutan albumin yang memiliki struktur lebih

komplek daripada gelatin, maka endapan yang terbentuk lebih banyak. Setelah larutan

albumin dan gelatin dijenuhkan dengan (NH4)2SO4 dan terjadi pengendapan,

selanjutnya dilakukan uji kelarutan endapan dalam air, uji endapan dengan reagent

Millon, dan uji filtrat dengan reagent biuret.

Pada endapan albumin, uji kelarutan endapan yang terjadi dengan air

menunjukkan hasil positif (endapan larut membentuk butiran). Kemudian butiran

endapan direaksikan dengan pereaksi Millon, untuk mengetahui ada tidaknya

kandungan tirosin pada albumin. Prinsip dari uji Millon adalah pembentukan garam

merkuri dari tirosin yang ternitrasi. Tirosin merupakan asam amino yang mempunyai

molekul fenol pada gugus R-nya, yang akan membentuk garam merkuri dengan

pereaksi millon. Dari hasil percobaan, diketahui bahwa protein albumin mengandung

tirosin sebagai salah satu asam amino penyusunnya, karena hasil reaksinya positif,

ditandai endapan berwarna kuning kemerahan. Uji filtrat albumin dengan pereaksi

biuret juga menunjukkan hasil positif yang ditandai larutan berwarna ungu violet,

pengujian filtrat dengan pereaksi biuret bertujuan untuk mengetahui ada tidaknya

gugus amida pada filtrat yang dihasilkan. Hasil positif uji filtrat albumin dengan

reagent biuret ini menunjukkan bahwa masih ada protein yang belum terendapkan

oleh garam amonium sulfat, sehingga masih ada protein yang memiliki ikatan peptida.

Pada endapan gelatin, uji kelarutan endapan yang terjadi dengan air

menunjukkan hasil positif (endapan larut membentuk butiran). Kemudian butiran

endapan direaksikan dengan pereaksi Millon, untuk mengetahui ada tidaknya

kandungan tirosin pada gelatin. Dari hasil percobaan, diketahui bahwa protein gelatin

tidak mengandung tirosin pada asam amino penyusunnya, karena hasil reaksinya

dengan reagent Millon negatif, ditandai endapan berwarna kuning. Pada Uji filtrat

gelatin dengan pereaksi biuret menunjukkan hasil positif yang ditandai larutan

berwarna ungu violet. Hasil positif uji filtrat gelatin dengan reagent biuret ini

menunjukkan bahwa masih ada protein yang belum terendapkan oleh garam amonium

sulfat, sehingga masih ada protein yang memiliki ikatan peptida.

4.Uji Pengendapan dengan Alkohol

Protein dapat diendapkan dengan penambahan alkohol. Alkohol merupakan

pelarut organik yang akan mengubah (mengurangi) konstanta dielektrika dari air,

sehingga terjadi daya tarik-menarik yang terjadi lebih besar antar molekul. Adanya

alkohol memaksa gugus positif pada protein berikatan dengan ion positif lain pada

larutan, sehingga kelarutan protein berkurang dan terjadi pengendapan. Pada uji

pengendapan protein oleh alkohol pada tabung 1 (larutan albumin+Baffer asetat pH

4,7+etil alkohol 95%), endapan yang dihasilkan paling banyak dibandingkan tabung

lainnya, karena buffer asetat memiliki pH 4,7 yang sama dengan pH isolistrik albumin

(4,55-4,90). Pada titik isoelektrik, protein akan membentuk zwittterion sehingga dapat

mengendap. Pada uji pengendapan protein oleh alkohol pada tabung 2 (larutan

albumin+HCl 0,1 M+etil alkohol 95%), juga terbentuk endapan protein, hal ini karena

HCl mempunyai muatan positif yang dapat berikatan dengan protein yang

dikondisikan oleh alkohol untuk mengendap. Pada uji pengendapan protein oleh

alkohol pada tabung 3 (larutan albumin+NaOH 0,1 M+etil alkohol 95%), tidak

terbentuk endapan protein, karena NaOH tidak mempunyai muatan positif, sehingga

tidak terjadi pengendapan dengan alkohol.

5. Uji Koagulasi

Prinsip kerja koagulasi yaitu merusak ikatan peptida atau memutus ikatan

protein menjadi asam amino dan merupakan suatu sistem irrevesible yang tidak dapat

kembali ke bentuk semula. Protein akan mengalami koagulasi apabila dipanaskan

pada suhu 50oC atau lebih. Koagulasi ini hanya terjadi bila larutan protein berada titik

isolistriknya (Poedjiadi, 1994). PH isoelektrik adalah pH larutan tertentu di mana

protein mempunyai muatan positif dan negatif sama, sehingga saling menetralkan.

Pada pH isoelektrik, kelarutan protein sangat menurun atau mengendap. PH isolistrik

albumin adalah 4,55-4,90 sedangkan pH isoelektrik 4,80-4,85. Pada pH isoelektrik,

kelarutan protein sangat menurun atau mengendap. Pada temperatur diatas 60oC

kelarutan protein akan berkurang (koagulasi) karena pada temperatur yang tinggi

energi kinetik molekul protein meningkat sehingga terjadi getaran yang cukup kuat

untuk merusak ikatan atau struktur sekunder, tertier dan kuartener yang menyebabkan

koagulasi (Blogspot, 2007). Pada uji koagulasi, penambahan asam asetat bertujuan

agar larutan protein mencapai pH isolistriknya sehingga bisa terkoagulasi. asam asetat

berfungsi untuk mengkondisikan atau merusak protein dan memberikan hasil positif

ketika direaksikan dengan pereaksi millon. Pada larutan albumin, setelah penambahan

asam asetat dan dididihkan dalam air mendidih selama 5 menit, terbentuk gumpalan

berwarna putih yang menunjukkan albumin terkoogulasi, sedangkan pada gelatin

setelah penambahan asam asetat dan dididihkan dalam air mendidih selama 5 menit,

tidak terbentuk endapan sama sekali, yang menunjukkan gelatin tidak terkoogulasi.

Tidak terjadinya koagulasi pada gelatin mungkin disebabkan belum tercapainya pH

isoelektrik gelatin yang cukup tinggi.

Pada endapan albumin yang terbentuk dilakukan uji endapan dalam air dan uji

endapan dengan reagent Millon. Untuk uji kelarutan endapan dengan air

menunjukkan hasil negatif, sedangkan endapan yang direaksikan dengan pereaksi

millon memberikan hasil positif, ditandai dengan warna endapan berubah menjadi

merah bata yang artinya ada kandungan tirosin. Pada uji koagulasi, endapan albumin

yang terjadi setelah penambahan asam asetat dan dipanaskan, menunjukkan bahwa

endapan tersebut masih bersifat sebagai protein, hanya saja telah terjadi perubahan

struktur tersier ataupun kwartener sehingga protein tersebut mengendap. Perubahan

struktur tersier albumin ini tidak dapat diubah kembali ke bentuk semula, ini bisa

dilihat dari tidak larutnya endapan albumin itu dalam air.

6. Uji Denaturasi protein

Protein akan terdenaturasi atau mengendap bila berada pada titik

isoelektriknya, yaitu pH dimana jumlah muatan positif sama dengan jumlah muatan

negatifnya. Pemanasan yang berlangsung selama 15 menit, pada ketiga tabung yang masing-

masing berisi albumin dan pereaksinya berguna untuk mengacaukan ikatan hidrogen dan

interaksi hidrofobik non polar, hal ini terjadi karena suhu tinggi dapat meningkatkan energi

kinetik dan menyebabkan molekul penyusun protein bergerak sangat cepat sehingga

mengacaukan ikatan molekul tersebut.

Pada uji denaturasi, protein yang dilarutkan dalam buffer asetat pH 4,7 (tabung

3) dan dipanaskan selama 15 menit menunjukkan adanya banyak endapan. Protein

yang ditambahkan HCl 0,1 M (tabung 1) dan dipanaskan selama 15 menit, masih

menghasilkan endapan karena dengan penambahan HCl 0,1 M larutan jadi memiliki

pH 1, masih mendekati titik isoelektrik albumin, sehingga albumin dapat mengendap

atau terdenaturasi. Protein yang ditambahkan NaOH 0,1 M (tabung 2) dan dipanaskan

selama 15 menit, tidak menghasilkan endapan karena pada penambahan NaOH 0,1 M,

pH larutan jadi memiliki pH 13, sangat jauh dari titik isoelektrik albumin, sehingga

albumin tidak mengendap. Setelah ditambahkan buffer asetat pH 4,7 dengan volume

berlebih pada tabung 1 dan 2, terjadi perubahan. Endapan yang terdapat pada tabung

yang 1 menjadi lebih banyak berisi endapan, sedangkan pada tabung 2 yang semula

tidak ada endapan, dengan penambahan buffer asetat ini protein pun mengendap.

Penambahan buffer asetat dengan volume yang berlebih akan membentuk dan merubah

albumin kepada titik isoelektriknya yaitu pH 4,7, hal ini menunjukkan bahwa protein

albumin mengendap pada titik isoelektriknya, yaitu sekitar pH 4,7.

VII. Kesimpulan

Pada uji biuret, pada larutan gelatin dan larutan albumin sama-sama menunjukkan

hasil positif, ditandai dengan terbentuknya warna ungu pada permukaan larutan

setelah ditambahkan NaOH dan CuSO4

Pada uji Biuret, maksud ditambahkannya NaOH dalam larutan uji adalah untuk

mengkondisikan suasana basa, sehingga Cu dapat bereaksi dengan larutan protein.

Reaksi menghasilkan warna violet pada permukaan larutan protein yang

menandakan terbentuknya senyawa kompleks Cu dengan gugus -CO dan -NH pada

asam amino dalam protein.

reaksi antara logam berat Hg dan Pb dengan albumin menghasilkan endapan

berwarna putih susu, sedangkan reaksi pada gelatin dengan logam Hg dan Pb tidak

membentuk endapan. Tidak terbentuknya endapan oleh logam Hg dan Pb pada

gelatin mungkin disebabkan konsentrasi gelatin yang rendah, sehingga kalaupun

ada endapan jumlahnya sangat sedikit, sehingga hampir tidak ada endapan

Pada albumin, endapan yang lebih banyak dihasilkan adalah dari reaksi albumin

dengan HgCl2 daripada dengan Pb asetat. Hal ini karena tetapan disosiasi Hg lebih

tinggi daripada Pb, sehingga lebih banyak ion Hg2+ yang berada dalam bentuk

bebas yang bereaksi dengan protein membentuk endapan

Pada larutan albumin yang memiliki struktur lebih komplek daripada gelatin, maka

pada saat uji pengendapan dengan garam amonium sulfat, endapan yang terbentuk

lebih banyak.

protein albumin mengandung tirosin sebagai salah satu asam amino penyusunnya,

karena hasil reaksinya dengan reagent Millon positif, ditandai endapan berwarna

kuning kemerahan

Hasil positif uji filtrat albumin dan gelatin dengan reagent biuret menunjukkan

bahwa masih ada protein yang belum terendapkan oleh garam amonium sulfat,

sehingga masih ada protein yang memiliki ikatan peptida

Alkohol merupakan pelarut organik yang akan mengubah (mengurangi) konstanta

dielektrika dari air, sehingga terjadi daya tarik-menarik yang terjadi lebih besar

antar molekul. Adanya alkohol memaksa gugus positif pada protein berikatan

dengan ion positif lain pada larutan, sehingga kelarutan protein berkurang dan

terjadi pengendapan

Pada denaturasi, yang dirusak adalah ikatan hidrogen dan ikatan tiol, proses

denaturasi ini kadang-kadang dapat berlangsung secara reversibel, kadang-kadang

tidak

Pada koagulasi, yang dirusak adalah ikatan peptida, dan perubahan protein

irreversibel akibat dari pengaruh pemanasan. Jika suatu enzim terkoagulasi, maka

enzim tersebut tidak dapat berfungsi lagi

VIII. Daftar Pustaka

Poedjiadi, Anna. 1994. Dasar-dasar Biokimia. Jakarta: UI Press.

Winarno, F. G., 2002. Kimia Pangan dan Gizi. Gramedia: Jakarta.

Girindra, A. 1986. Biokimia I. Gramedia, Jakarta.

Lehninger, A. 1988. Dasar-dasar Biokimia. Terjemahan Maggy

Thenawidjaya. Erlangga, Jakarta