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Terapia gênica
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Uso de Linfcitos B em Terapia Gnica Contra TumoresPs-Graduao em Imunologia Bsica e Aplicada
M.Sc. William Roberto SchluchtingProf. Dra Arlete A.M. Coelho-CasteloFaculdade de Medicina de Ribeiro Preto FMRP - USP
O QUE TERAPIA GNICA?Transferncia de genes nas clulas do paciente:Recuperar a funo;Atribuir uma nova atividade gnica;Aumentar a atividade de genes ativos.
Doenas genticas ou adquiridas.
COMO FUNCIONA A TERAPIA GNICA?Genes introduzidos nas clulas;Sistema independente de expresso;Recuperar a funo gnica;
Histrico da Terapia Gnica- Pr-Terapia Gnica Clnica
1970 Stanfield Rogers: vrus Shope papilloma - Crianas com arginemia;
1983 1989 Inicio da era de pesquisa clnica da TG Vetores retrovirais;
1989 W.F. Anderson, M. Blease, S. Rosenberg: 1 transferncia gnica p/ Humanos gene neoR em TIL (Tumor Inflitrating Lymphocytes)Gene arginase ArgininaMorales M.M. TERAPIAS-AVANADAS: CLULAS-TRONCO, TERAPIA GNICA E NANOTECNOLOGIA APLICADA SADE. 2007
Ps-Terapia Gnica
1990 W.F. Anderson: 1 estudo clnico de TG criana com imunodeficincia grave combinada (SCID Severe Combined Immunodeficiency) Introduzido gene da adenosina deaminase (ADA) resultado publicado em 1995;
1992 James Wilson: 1 experimento de TG para rgo interno, hepatcitos modificados com vetor retroviral com o gene do receptor LDL;
1993 Ronald Crystal: 1 TG em Fibrose Cstica usando adenovirus ;
1996 Inicio da ASGT: American Society of Gene Therapy;
2003 China: 1 droga de TG Adenovirus/p53 para tratamento de cancer;
2006: + de mil protocolos clnicos aprovados , envolvendo cerca de 5000 paciente em todo o mundo.
Morales M.M. TERAPIAS-AVANADAS: CLULAS-TRONCO, TERAPIA GNICA E NANOTECNOLOGIA APLICADA SADE. 2007
1997 - UNESCO adopts Universal Declaration on the Human Genome and Human Rights, prohibiting germline interventions. http://portal.unesco.org/shs/en/ev.php-URL_ID=1881 &URL_DO=DO_TOPIC&URL_SECTION=201.html
Biotecnologia _ CiasRegulamentao AmericanaRegulamentao EuropiaW.F. AndersonUso Material Gentico
Terapia Gnica x Sistema Imune
Terapia Gnica no BrasilEm 2004 foi criada a Rede de Terapia Gnica
27 institutos ou Departamentos de 6 estados (Rio de Janeiro, So Paulo e Rio Grande do Sul), financiados pelo Institutos do Milnio do CNPq/MCT.
Pesquisas: introduo de genes com efeito teraputicoQual o alvo do Brasil?- terapia gnica em cncer- doenas graves do metabolismo- doenas degenerativas e cardiovasculares- vacinas de DNA profilticas para doenas infecciosas e vacinas de DNA teraputicas para HPV
Terapia Gnica no BrasilRede composta por:Rio de Janeiro: o Instituto de Biofsica da UFRJ, o Instituto Oswaldo Cruz e o Instituto Nacional do Cncer (INCA);
So Paulo: os Departamentos de Microbiologia e Biologia Celular e Desenvolvimento da USP, o CINTERGEN da UNIFESP, o InCor e o Instituto Butant;
Rio Grande do Sul: os Departamentos de Gentica e de Biofsica e o Hospital de Clnicas da UFRGS, bem como o Instituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul.
Terapia Gnica no Brasil1o. Estudo Clnico em pacientes cardacos (isquemia) fases 1 e 2 (segurana e eficcia)Coordenado pelo Dr. Renato Karan Kalil Inst. Cardiologia do Rio Grande do Sul
Grupo de 10 pacientes tratados com injeo de DNA (plasmdeo c/gene VEGF-165) diretamente no corao estimula angiognese
8 pacientes apresentaram bons resultados:-aumento na capacidade de bombear sangue-desempenho em testes de esforo fsico
Freqncia dos Vetores Utilizados na Terapia Gnica
1. Insero de um gene em um vetor 2. Contato Vetor / Clula 3. Entrada e transporte do gene at o ncleo da clula 4. Transcrio do RNAm a partir do gene 5. Traduo do RNAm em protena 6. Secreo, fixao na membrana ou expresso citoplasmtica da protena
Terapia gnica germinativa
Terapia gnica somtica
FORMAS POTENCIAIS DE TERAPIA GNICA
Terapia gnica para a mutao little(lit): hormnio do crescimentoRegulador-Promotor da Metalotionena: remover metais pesados
VIAS DE TERAPIA GNICA Terapia Gnica in vivo
Terapia Gnica ex vivo
TERAPIA GNICA DE CLULAS SOMTICASTerapia ex vivo: as clulas do paciente so retiradas e manipuladas fora do corpoTerapia in vivo: as clulas so tratadas dentro do corpo
http://www.smartplanet.es/articulos.php?pageNum_ctapag=6&totalRows_ctapag=11&id=9-4-3Terapia gnica in vivo
Terapia Gnica in vivoIsquemiaDoenas vasculares cardacas ou de membros- Genes que promovem a angiognese
Vacinao GnicaGenes que codificam antgenos Induo RI- Adenovirus, Vaccinia e plasmdeoInjeo direta, eletroporao ou gene gun
Vacinas de DNA Tang et al., 1992 Nature 356, 1992
Fynan et al., 1993 PNAS 90, 1993
Ulmer et al., 1993. Science 259, 1993 Gene = vacinaExpresso protena heterloga in vivoInduo RI }Anticorpos
Fcil produo escala industrial e estocagem
Baixo custo produo
RI
Ledwith, B et al., 2000; Manam S., et al., 2000Pizetsky DS, 2000; Prudhomme, GJ et al., 2001Vantagens das Vacinas de DNA
Endocitose/receptor ?MicroambienteEndossomo-lisossomo
DNAsespHAdenovrus 2 e 5integrinaHNcleoTrfego dos vetores in vivoMecanismos desconhecidos
MicroesferasLipossomasGene gun
TERAPIA GNICA NO VACINAL1- REINTRODUO ex vivo gene transfectado in vitro
2- TRANSFECO CLULA ALVO in vivo
2.1 Sistmica
2.2 LocalTransferncia dos genes mediada por vetor
Terapia Gnica ex vivoCultura de clulas;Transferncia Gnica;Seleo de clulas modificadas.
Terapia gnica ex vivo
Clulas transfectadas- Queratincitos;- Clulas musculares;- Clulas dendrticas e macrfagos alvo tumoral
- So utilizadas no mtodo ex vivo, clulas do organismo so retiradas e tratadas com o vetor; Novas alternativas Terapia Gnica
Reintroduo da clula modificadaAlgumas circunstncias : Reinfuso Local
Vantagem: Procedimento nico
DesvantagensProcesso caro e trabalhosoManuteno in vitro das clulas alteraesComplexidade da terapia ex vivo
Diferentes abordagens Terapia Gnica
Uso de Linfcitos B em Terapia GnicaLinfcitos B, clulas classicamente envolvida RI humoral,
1- Maquinaria de produo proteica altamente eficiente promotor para produo IgPor que usar linfcito B? Favorecer expresso heterlogaBaixo custo X CD
Uso de Linfcitos B em Terapia Gnica2- Transfeco Intra-esplnica de camundongos sucesso!
- Invasivo, direto bao (Zanetti M, et al. Int. Rev. Immunol. 2006)
3- Clulas B capturam plasmideo in vivo, aps Imunizao IM e Expressa protena heterloga.(Coelho-Castelo, et al. Human gene Therapy 2003)
CD11b FITC
CD19 - FITCDeteco Plasmdeo em CD11b e CD19Coelho-Castelo et al.,2003ConfocalpcDNA-3hsp65Alexa-fluor 594Uso de Linfcitos B em Terapia Gnica
Clulas B Capturam Plasmdeo e ExpressamProtena Recombinante Coelho-Castelo et al., Human gene Therapy, 2003
Analisar o papel de linfcitos B na produo de protenas heterlogas aps transfeco in vitro, in vivo e ex vivo usando plasmdio codificando para GFP e IL-12.
Determinar a cintica de produo da protena ex vivo e in vitro;Avaliar possveis alteraes fenotpicas nos linfcitos B aps a eletroporao; Avaliar a eficincia do uso de linfcitos B-transfectados com IL-12, em imunoterapia gnica usando modelo de melanoma experimental.
OBJETIVOS
Resultados 12Kb
A B C DA: Padro 1KbB: pIRES vetor +/- 4,7KbC: pIRES-IL12 +/- 5,2KbD: pEGFP-C2 +/- 4,7Kb5,2 Kb4,7 Kb
Delineamento Experimental in vitro
Expresso GFP In vitro
Delineamento Experimental ex vivoAnimais BKO
Expresso de GFP in vivo
Delineamento Experimental in vitro
Expresso in vitro IL-12
Delineamento Experimental in vitro
Expresso de IL-12 em Linfcitos B in vitro
Delineamento Experimental in vitro GFPIL12KO
Expresso de GFP em Linfcitos B de IL-12KO in vitro
Avaliao do processo de transfeco no fentipo ou atividade de linfcitos B/GFP - Transferncia Adotiva
Sete Dias Aps a Transferncia Adotiva
Quinze Dias Aps a Transferncia Adotiva
Deteco de plasmdeo em outras subpopulaes de clulas aps a transferncia adotiva.DNA marcado com Alexa 488
Deteco de plasmdeo em outras subpopulaes de clulas aps a transferncia adotiva.
Avaliao da eficincia dos linfcitos B transfectados em terapia gnica
Sobrevida
Massa Tumoral
Bao
Histologia do Melanoma B16F10A: WT 400xB: WT 200xC: IL12KO 200xD: IL12KO Trat. 200xE: IL12KO Trat. 400x
Concluses Foram capazes de levar a produo in vivo e in vitro de uma protena heterloga tanto GFP como interleucina 12;
A transferncia adotiva de Linfcitos B para animais WT, ou IL-12 KO diminuiu a massa tumoral, aumentou a sobrevida e aumentou recrutamento de linfcitos intra-tumorais do tipo CD4, CD8 e NK.
Linfcitos B transfectados podem leva a produo in vivo de protenas heterlogas biologicamente ativas, podendo ser uma nova ferramenta em Terapia Gnica.
OBRIGADO!