Expression of ESR1 gene in Raini Cashmere goat using Real Time PCR

Mohammadreza Mohammadabadi

Professor of Animal Science Department, Faculty of Agriculture, Shahid Bahonar University of

Kerman, Kerman, Iran. Email: mrm@uk.ac.ir

Abstract

Objective

The estrogen receptor (ER) is a transcription factor that mediates the function of the

hormone estrogen in many physiological and pathological processes. The expression of the

estrogen receptor (ESR1), which encodes the alpha estrogen receptor (ER-α), is tissue

specific. For example, the expression of ESR1 in the endometrium and mammary gland is

very high and low in the placenta and skin. The gene is located on human chromosome 6

and is also known as Era, ESRA, ESTRR, and NR3A1. Several studies have shown that

genetic variants in this gene are associated with breast cancer sensitivity. The aim of this study was to investigate ESR1gene expression in different tissues of Raini Cashmere goat

using Real Time PCR.

Materials and Methods

One male and one female goats were selected for tissue sampling. Samples were taken from

tissues of the heart, kidneys, brain, ovaries, uterus, breast and testicles (3 repetitions of each

tissue) during slaughter at the slaughterhouse. RNA was extracted and cDNA was

synthesized. Real Time PCR was performed using SYBR Green method to study relative

gene expression. GAPDH gene was used as housekeeping gene. Pfaffl method was used to

analyze achieved data.

Results

The study of ESR1 gene expression in the tissues of the heart, kidney, brain, ovary, uterus,

mammary gland and testis of goat using Real Time PCR showed that this gene is expressed

in all studied tissues. The highest levels of expression were observed in the kidney, ovary,

uterus and testis tissues, and the lowest levels of expression were observed in the brain and

heart tissues.

)١٣٩٩، بهار ١، شماره ١٢مجله بيوتكنولوژي كشاورزي (دوره

١٧٨ Agricultural Biotechnology Journal; Printing ISSN: 2228-6705, Electronic ISSN: 2228-6500

Conclusions

Based on the results of the present study and the results of other researchers, it can be

concluded that estrogen receptors play an important role in spermatogenesis and male

fertility, because in the present study it was found that ESR1 is much more expressed in

reproductive tissues than in non-reproductive tissues. Therefore, estrogen and its receptors

are likely to be essential for male fertility, and the results of this study provide a basis for

future research to describe the role of ESR1 gene as a candidate gene for better fertility and

natural physiology in domestic animals, especially goats.

Keywords: ESR1, gene expression, Raini Cashmere goat, reproductive tissues

Citation: Mohammadabadi MR (2020) Expression of ESR1 gene in Raini Cashmere goat using Real Time

PCR. Agricultural Biotechnology Journal 12(1), 177-192.

Agricultural Biotechnology Journal 12(1), 177-192.

DOI: 10.22103/jab.2020.15791.1229

Received: December 7, 2019; Accepted: February 26, 2020

©Faculty of Agriculture and Technology Institute of Plant Production, Shahid Bahonar University of

Kerman-Iranian Biotechnology Society

١٣٩٩، يمحمدآباد

١٧٩ Agricultural Biotechnology Journal; Printing ISSN: 2228-6705, Electronic ISSN: 2228-6500

Real Time PCRدر بز كركي رايني با استفاده از ESR1بيان ژن

محمدرضا محمدآبادي

.mrm@uk.ac.ir ، ايميل:استاد بخش علوم دامي، دانشكده كشاورزي، دانشگاه شهيد باهنر كرمان، كرمان، ايران*

٠٧/١٢/١٣٩٨، تاريخ پذيرش: ٠٩/١١/١٣٩٨تاريخ دريافت:

چكيده

يك فاكتور رونويسي است كه واسطه عملكرد هورمون استروژن در بسياري از فرآيندهاي فيزيولوژيكي )ERاستروژن (گيرنده :هدف

) را كد مي كند، مختص بافت است. به ER-αآلفا ( )، كه گيرنده استروژنESR1و آسيب شناختي است. بيان گيرنده استروژن (

٦اين ژن روي كروموزوم شماره .بسيار زياد است و در جفت و پوست كم است در آندومتر و غده پستاني ESR1 عنوان مثال، بيان

نيز معروف است. در چندين پژوهش نشان داده شده است كه NR3A1، و Era ،ESRA ،ESTRRهاي انسان قرار دارد و به نام

ESR1ژن بررسي ميزان بيان اين پژوهشهدف هاي ژنتيكي در اين ژن با حساسيت به سرطان پستان همبستگي دارند. واريانت

. بود Real Time PCRهاي مختلف بز كركي رايني با استفاده از در بافت

هاي قلب، از بافتها نمونهها انتخاب شدند. تعداد يك راس بز نر و يك راس بز ماده براي نمونه برداري از بافت ها:مواد و روش

cDNAكل استخراج و RNA شد. تكرار) در هنگام كشتار در كشتارگاه تهيه ٣بافت كليه، مغز، تخمدان، رحم، پستان و بيضه (از هر

استفاده شد. در اين SYBR Greenبه روش Real Time PCRساخته شد. براي برررسي ميزان نسبي بيان ژن ها از واكنش

از Real Time PCRهاي حاصل از براي تجزيه و تحليل داده. شدبه عنوان ژن كنترل داخلي استفاده GAPDH مطالعه از ژن

فافل استفاده شد.روش پي

هاي قلب، كليه، مغز، تخمدان، رحم، پستان و بيضه بز كركي رايني با استفاده از روش در بافت ESR1بيان ژن مطالعه نتايج:

PCR هاي كليه، سطح بيان در بافتبررسي شده بيان شده است. بيشترين ي هابافتدر زمان واقعي نشان داد كه اين ژن در تمامي

تخمدان، رحم و بيضه و كمترين سطح بيان در بافت مغز و قلب مشاهده شد

هاي استروژن نقش مهمي در توان نتيجه گرفت كه گيرندهبا توجه به نتايج پژوهش حاضر و نتايج ساير محققين مي گيري:نتيجه

هاي هاي توليدمثلي نسبت به بافتدر بافت ESR1ضر مشخص شد كه اسپرماتوژنز و باروري نرها دارند، چرا كه در پژوهش حا

هايش به احتمال زياد براي باروري نرها بسيار ضروري هستند و نتايج شود. لذا، استروژن و گيرندهتوليدمثلي بسيار بيشتر بيان ميغير

به عنوان يك ژن كانديدا براي باروري بهتر و ESR1هاي آينده جهت توصيف نقش ژن اين پژوهش اساسي را براي پژوهش

فيزيولوژي طبيعي در حيوانات اهلي، به ويژه بز فراهم كرده است.

ESR1، بز كركي رايني، بيان ژن، هاي توليدمثليبافت كلمات كليدي:

)١٣٩٩، بهار ١، شماره ١٢مجله بيوتكنولوژي كشاورزي (دوره

١٨٠ Agricultural Biotechnology Journal; Printing ISSN: 2228-6705, Electronic ISSN: 2228-6500

مقدمه

خصوص، ارند. بهمختلف دهاي كند كه نقش مهمي در رشد و عملكرد بافتهايي توليد ميسيستم غدد درون ريز هورمون

اكتور رونويسي وابسته به فدهند كه به عنوان هاي ناشناس خود انجام ميهاي استروئيدي عملكردهايي را از طريق گيرندههورمون

)، ERيب به گيرنده استروژن (كنند. استروژن، گلوكوكورتيكوئيد، مينرالوكورتيكوئيد، پروژسترون و آندروژن به ترتهورمون عمل مي

شوند) متصل ميARندروژن (آ)، و گيرنده PR)، گيرنده پروژسترون (MR)، گيرنده مينرالوكورتيكوئيد (GRگيرنده گلوكوكورتيكوئيد (

)Kazuhiro et al. 2015 .(ز ژن هاي هدف اهاي استروئيدي از طريق تنظيم رونويسي عملكردهاي فيزيولوژيكي اين هورمون

د نيز در حاالت هاي رونويسي مربوط به گيرنده هورمون استروئيشبكه. )Muramatsu and Inoue 2000( شوندميانجيگري مي

ن به احتمال بسيار قوي در عقيده بر اين است كه استروژ .مانند سرطان، پوكي استخوان و التهاب نقش دارند ،مختلف آسيب شناختي

هاي آن، لول به گيرندهال اين هورمون در سپس از اتصرد. نقش دااستروژن دهياز طريق سيگنالتوليد و تقويت سرطان پستان،

).١(شكل دهندافزايش ميو تكثير سلولي را DNA سنتزشوند و فعال مي هورمون هستندبه هايي كه پاسخ دهنده ژن

طور رونويسي بههاي تنظيم با تشريح آبشارهاي شبكه ١اي در مطالعات گسترده ژنومهاي هستهدهنده به گيرندههاي پاسخژن

اعمال ٢ER هاي تنظيمي با واسطه). وظايف و عملكردهاي استروژن از طريق شبكه٢شوند (شكل اي تجزيه و تحليل ميگسترده

ها به صورت شود. عالوه بر اين، شبكهها استفاده ميكننده رونويسي براي اين گيرندهها از فاكتورهاي تنظيمشوند. در اين شبكهمي

شوند. تجزيه و تحليل ژنوم گسترده با استفاده تعديل و تنظيم مي ٣با مسيرهاي انتقال سيگنال به روشي ويژه بافت/سلولعملكردي

عالوه، تجزيه و تحليل عملكردي و سازي شبكه رونويسي مفيد خواهد بود. بههاي پر توان براي توضيح دادن و شفافاز تكنيك

هاي تواند در توسعه دستگاهدهد، كه ميهاي مختلف را نشان مينقش ژن در عملكرد و بيماري پاتوفيزيولوژيكي هر ژن درگير در شبكه

).Kazuhiro et al. 2015جديد تشخيصي و درماني در پزشكي باليني اعمال شود (

رآيندهاي فيزيولوژيكي يك فاكتور رونويسي است كه واسطه عملكرد هورمون استروژن در بسياري از ف )ERگيرنده استروژن (

، مختص بافت است ) را كد مي كندER-αآلفا ( )، كه گيرنده استروژنESR1( ١و آسيب شناختي است. بيان گيرنده استروژن

)Maekawa et al. 2016به عنوان مثال، بيان .( ESR1 فت و پوست كم استدر آندومتر و غده پستاني بسيار زياد است و در ج.

. در چندين ستنيز معروف ا NR3A1، و Era ،ESRA ،ESTRRهاي انسان قرار دارد و به نام ٦اين ژن روي كروموزوم شماره

;Yu et al. 2011ند (همبستگي دار پستانژن با حساسيت به سرطان هاي ژنتيكي در اين پژوهش نشان داده شده است كه واريانت

Zhang et al. 2015; Li et al. 2016; Jahandoost et al. 2017.(

1 genome-wide studies 2 ER-mediated regulatory networks 3 tissue/cell-specific manner

١٣٩٩، يمحمدآباد

١٨١ Agricultural Biotechnology Journal; Printing ISSN: 2228-6705, Electronic ISSN: 2228-6500

هاي هورمون استروئيدي . اتصال گيرنده. مكانيسم تنظيم رونويسي گيرنده هاي هورمون استروئيدي١شكل

.)Lonard et al. 2012(در قسمت پايين شكل نشان داده شده است (HRE) عنصر پاسخ دهنده هورمونبه

Figure 1. Transcriptional regulation mechanism of steroid hormone receptors. Binding of

steroid hormone receptors to the hormone responsive element (HRE) is shown in the lower

panel (Lonard et al. 2012).

)١٣٩٩، بهار ١، شماره ١٢مجله بيوتكنولوژي كشاورزي (دوره

١٨٢ Agricultural Biotechnology Journal; Printing ISSN: 2228-6705, Electronic ISSN: 2228-6500

هاي ديگر هاي هورمون استروئيدي و اثر متقابل آن متقاطع با سيگنال. شبكه رونويسي گيرنده٢شكل

)Kazuhiro et al. 2015.(

Figure 2. Transcriptional network of steroid hormone receptors and crosstalk with other

signals (Kazuhiro et al. 2015).

عبارت بودند از پيشرفت هايپرينسولينمي، اختالل در (ER-α) مشاهدات باليني در يك مرد ناقص گيرنده استروژن آلفا

مطالعات روي جوندگان نشان داده ). .1994Smith et alو افزايش وزن بدن ( )IR (انسولين)، مقاومت به IGT( ١تحمل گلوكز

Jonesشود (كه حذف گيرنده استروژن آلفا در كل بدن باعث افزايش وزن بدن، مقاومت به انسولين و اختالل در تحمل گلوكز مي

et al., 2006 and 2007 .( در پژوهشيOgorevc and Dovc )2016 (١كمي گيرنده استروژن بيان (ESR1) و گيرنده

هاي در كشترا يهاي استروئيدگيرنده جايابي ) بر بيان ويكرشد (پايه و الكتوژن شرايطتاثير و ارزيابي چگونگي (PGR) پروژسترون

و تنظيم پايين ESR1هاي سلولي مختلف با تنظيم باالدستي متغير ها نشان دادند كه الينآن اند.انجام دادهسلولي اوليه پستان بز

به سطح پروتئين PGR و ESR1 رسد تغييرات در بياندهند. به نظر ميبه شرايط الكتوژنيك پاسخ مي PGRتر بيان دست ثابت

كند وميهدايت الين لوميني يرت سلولي را به سمت تمايز و تكثكه شرايط الكتوژنيك سرنوش دادندپيشنهاد ها آنشود. ترجمه مي

1 impaired glucose tolerance

١٣٩٩، يمحمدآباد

١٨٣ Agricultural Biotechnology Journal; Printing ISSN: 2228-6705, Electronic ISSN: 2228-6500

بنا بر نظر بعضي از دانشمندان در از سوي ديگر، .نقش داشته باشد يتواند در تمايز عملكردي سلولهاي لومينمي گيرنده استروژن آلفا

هزار سال ٩-١١ميان نشخواركنندگان بز اولين حيواني بوده است كه بشر به اهلي كردن آن پرداخته است، تاريخچه اهلي شدن بز به

هزار سال پيش است ٨-١٠گردد و گوسفند كمي بعد از بز مورد توجه قرار گرفته و تاريخچه اهلي شدن آن مربوط به پيش برمي

)Barazandeh et al. 2012; Mohammadabadi 2019 .(شناسي نشان داده است كه آثار اوليه مربوط به هاي باستانكاوش

دست آمده است اما بعضي از تحقيقات نشان سوئيس در اروپا و يا در اطراف رودخانه نيل در آفريقا به بز در اطراف مناطق كوهستاني

اند و آثار مربوطه مبين اين واقعيت است كه بز ابتدا درآسيا و در ها اولين قومي بودند كه به اهلي كردن بز پرداختهدهد كه آرياييمي

;Barazandeh et al. 2012(باشد، اهلي شده است كه امروزه قسمتي از كردستان ميويژه در سرزميني منطقه خاورميانه و به

Moghadaszadeh et al. 2015; Askari et al. 2011; Molaei Moghbeli et al. 2013.( بز راس ميليون ٣٠ حدود

شوندمي داده پرورش ايران در) جهان بزهاي درصد ٢٠(حدود هاآن از راس ميليون ٥ تا ٥/٤ كه دارد وجود جهان سراسر در كركي

)Baghizadeh et al., 2009.( ) بز كركي رايني يكي از مهمترين نژادهاي بز در ايران استAskari et al. 2008 و كرك با (

توانند ارزش)، لذا اين بزها ميMolaei Moghbeli et al. 2013كند (كيفيت باالبا رنگ هاي سفيد، سياه و يا زرد توليد مي

). تقريبا سه ميليون رأس از اين نژاد در استان كرمان Baghizadeh et al. 2009اقتصادي بااليي در بازار جهاني داشته باشند (

شوند و كمترين تعداد آنها رأس) از آنها را شامل مي ٦٥١٥٤٩درصد ( ٢٢وجود دارد كه اكثر جمعيت آنها در شهرستان بافت است و

بز كركي رايني در نواحي كوهستاني مرتفع و .)Baghizadeh et al. 2009يابند (رأس) پرورش مي ٦٥٩٨٥در شهرستان راور (

. اين )Baghizadeh et al. 2009(شود و به عنوان مهمترين نژاد بز كركي در ايران شناخته شده است سرد پرورش داده مي

نظر به اينكه وجود .)Moghadaszadeh et al. 2015( شوندحيوانات هم براي توليد گوشت و هم براي توليد كرك نگهداري مي

يك خزانه ژني بزرگ براي حفظ پتانسيل پرورش و اصالح نژاد در آينده براي توسعه و تكامل سيستم توليدات حيواني پايدار مهم

Askari et al. 2011; Molaeiهاي اخير براي مطالعه و حفاظت از تنوع ژنتيكي اين نژاد اقداماتي انجام شده است (است، در سال

Moghbeli et al. 2013( . با توجه به توليدات مهم و استراتژيك بز در دنيا، صنعت پرورش بز داراي اهميت است

)Shamsalddini et al. 2016شودطوري كه بخش اعظمي از توليدات گوشت قرمز، شير، كرك از اين صنعت تامين مي). به .

وليد گوشت كم چرب، نياز كم به جايگاه و تجهيزات، توليد مناسب شير، باال بودن نسبت دوقلوزايي، ي زياد، تبه سرمايه نيازعدم

شود. مصرف غذاي كم، سهل الهضم بودن شير بز، ايجاد اشتغال و كمك به اقتصاد خانواده از محاسن پرورش بز محسوب مي

درصد از كل عرضه ٦٩باشد و به هميت بيشتري برخوردار ميهمچنين در كشورهاي كمتر توسعه يافته شير بز از شير گوسفند از ا

تواند باشند و ميروز را دارا مي ٢٥٠روز در مقابل ٣٠٠تر از گوسفند، ي شيردهي طوالنيكند. عالوه بر اين بزها دورهجهان كمك مي

هاي به عمل آمده روشن نمود كه مكانيسمهاي ميالدي مطالعات و بررسي ٨٠از طرفي، در اواخر دهه تا سه برابر شير توليد كند.

ها) هستند ، رونويسي، ترجمه و حتي نحوه تنظيم ژنDNAترين فرايندهاي ژنتيكي (مشتمل بر همانندسازي مولكولي در زمره مهم

)١٣٩٩، بهار ١، شماره ١٢مجله بيوتكنولوژي كشاورزي (دوره

١٨٤ Agricultural Biotechnology Journal; Printing ISSN: 2228-6705, Electronic ISSN: 2228-6500

)Mohammadabadi and Tohidinejad, 2017 .(يك سلول داراي تعداد زيادي ژن مي باشد كه هيچ گاه به ١ماده ژنتيكي

شوند و در يك زمان خاص فقط تعداد كمي از آنها بيان شده و پروتئين يا آنزيم مورد نياز سلول را توليد همزمان بيان نمي طور

شود و در صورت كند كنترل مي). نياز به بيان ژن توسط محيطي كه در آن رشد ميTohidi nezhad et al. 2015نمايند (مي

E.coliورت خاموش و غيرفعال باقي خواهد ماند. ساز و كار بيان ژن اولين بار در باكتري عدم نياز به فرآورده ژن، آن ژن به ص

هاي يوكاريوتي تحت كنترل موقت و چندبعدي مي باشد. تنها يك مجموعه نسبتًا كوچك از تمام ژنوم در هر كشف شد. بيان ژن

ها براي هر بافت بيان ژن در يوكاريوت ،بستگي دارد. بنابراينها به مرحله نمو ها بيان مي شود و نيز بيان ژن يك از انواع بافت

ساخته شده ،سازندهايي كه آن محصول را مياختصاصي است. همچنين مقدار محصوالت ژن كه در همان بافت و نيز در ساير بافت

ها و ات اهلي مطالعه ژن). يكي از اقدامات اساسي در حيوانMohammadabadi et al. 2017شود (سبب تنظيم بيان آن ژن مي

هاي ). از اين ژنJafari et al. 2016هاي مرتبط با صفات اقتصادي و مطالعه آنها در سطح سلولي يا كروموزومي است (پروتئين

هاي اگر چه پژوهش اشاره كرد.هاي مختلف دارد كه نقش مهمي در بافت) ESR1( ١گيرنده استروژن كليدي ژنتوان به مهم مي

.Askari et al. 2008; Askari et al. 2009; Alinaghizadeh et alروي بزهاي كركي رايني انجام شده است (زيادي

; Mohammadabadi 2012; Askari et al. 2011Hassani et al. 2010; Askari et al. 2010; ; 2010

Moghadaszadeh et al. 2015; Shamsalddini et al. 2016(، ١گيرنده استروژن ولي تاكنون بيان ژن )ESR1 ( در اين

هاي مختلف بز كركي رايني با استفاده در بافت) ESR1( ١گيرنده استروژن هدف اين مطالعه بيان ژن ،لذا نژاد بررسي نشده است.

بود. Real Time PCRاز

هامواد و روش

هاي قلب، كليه، مغز، تخمدان، از بافت انتخاب شدند. هابز ماده براي نمونه برداري از بافتراس بز نر و يك راس يك تعداد

قطعات كوچكي از دام بالفاصله پس از كشتار شد. تكرار) در هنگام كشتار در كشتارگاه تهيه ٣(از هر بافت رحم، پستان و بيضه

سپس هر چند عدد . داده شدندقرار ميلي ليتري ٥/١ هاي هاي مورد نياز توسط تيغ استريل جدا گرديد و در داخل ميكروتيوب اندام

ها از انجماد سريع نمونه پس به داخل تانك ازت فرستاده شدند. و سريعاًشد ك فويل آلومينيومي قرار داده يها در داخل از ميكروتيوب

قبل از انجام استخراج . شود انجام RNase٢ ازي محيط عار در بايستي RNA استخراج. نددنگهداري ش -٨٠در داخل فريزر

RNAآب تمامي وسايل توسط DEPCسيناژن( ٣، MR8244( ازRNase استخراج شدند. ٤عاريRNA طبق از بافتكل

RNAكميت و كيفيت صورت گرفت.) بيوبيسيك كانادا (شركت One Step RNA Reagentدستورالعمل كيت استخراج

1 DNA 2RNase-free environment 3Di Etyhyl Pyro Carbonate water 4RNase-free

١٣٩٩، يمحمدآباد

١٨٥ Agricultural Biotechnology Journal; Printing ISSN: 2228-6705, Electronic ISSN: 2228-6500

استخراج شده تا انجام RNAمورد ارزيابي قرار گرفت. اسپكتروفتومتري UVو ژل آگارزروي با روش الكتروفورز استخراج شده

درجه سانتي گراد منتقل شد. -٨٠مراحل بعدي آزمايش به فريزر با دماي

RerertAidTM H Minus First Strand( شركت فرمنتاز استفاده شد cDNAاز كيت سنتز cDNA براي سنتز

cDNA Synthesis Kit #K1631.( اين منظور مقداربرايμg از ١RNA شد. ممكن است حين استخراج مقادير كل استفاده

ميكروگرم از ١از مقدار ، cDNAبه كار رفته در ساختRNA لذا جهت يكسان كردن ،از هر بافت به دست آيد RNA متفاوتي

RNAهاي واكنش اي انجاماستفاده شد. برRT-PCR نمونه بايد RNA به عاري از آلودگيDNA باشد، به اين منظورRNA

.ددرجه سانتي گراد نگهداري ش -٢٠محصول واكنش نسخه برداري معكوس در دماي . تيمار شد DNaseIاستفاده از با

'ACAGCATGAAGTGCAAGAACGTGG-3-'5عبارت بودند از: ESR1توالي آغازگرها براي تكثير ژن

-'5هم عبارت بودند از GAPDHو براي ژن 'TGCAAGGAATGCGATGAAGTGCAG-3 -'5 و

CATGTTTGTGATGGGCGTGAACCA-3' 5 و'- TAAGTCCCTCCACGATGCCAAAGT-3'

)Ogorevc and Dovc 2016( طول قطعه تكتيري براي دو ژن .ESR1 وGAPDH جفت باز ١٦٣به ترتيب عبارت بودند از

(كره جنوبي) ساخته شدند. Bioneerتكاپوزيست (ايران) توسط شركت شركتبا واسطه هاآغازگرجفت باز. ١٣٧و

ROXميكروليتر ٣/٠و SYBRPermixTaq IIميكروليتر ٥/٧ميكروليتر آب دو بار تقطير، ٧/٤جهت انجام واكنش،

با هم ٢/٠در ميكروتيوپ الگو cDNAميكروليتر ٥/١ميكروليتر آغازگر برگشت و مقدار ٥/٠ميكروليتر آغازگر رفت، ٥/٠به همراه

قرار ٣٠٠٠ها اسپين شدند تا همه مواد در يك نقطه جمع شوند و سپس با شرايط زير در دستگاه روتور ژن مخلوط شدند. ميكروتيوپ

سازي پليمراز و واسرشت (براي فعال دقيقه ١٠درجه سانتيگراد براي ٩٥، واسرشت اوليه GAPDHو ESR1 هايداده شد. براي ژن

انجام ٣و ٢سيكل تكرار مراحل ٤٠، دقيقه ١درجه سانتيگراد ٦٠ و سنتز ثانيه، اتصال ١٥درجه سانتيگراد ٩٥، واسرشت ثانويه اوليه)

درجه سانتيگراد تعيين ٩٥ثانيه در ١٥درجه سانتيگراد و ٥٨دقيقه براي ١درجه سانتيگراد، ٩٥ثانيه براي ١٥منحني ذوب در شد.

) استفاده شد. در اين روش براي Pfaffl et al. )2002از روش Real Time PCRو تحليل داده هاي حاصل از براي تجزيه شد.

راي ترسيم نمودار استاندارد شد. بترسيم GAPDHو ESR1هاي ابتدا نمودار استاندارد براي ژن PCRبررسي درصد بازده واكنش

و ESR1براي ژن هاي PCRاستفاده شد و بازده واكنش PCR) براي ٠٠١/٠، ٠١/٠، ١/٠، ١( cDNAهاي مختلف غلظت

GAPDH واكنش هاي هادرصد برآورد شد. در ادامه روي نمونه ٩٨PCR انجام شد و نتايج حاصله براي بررسي ميزان نسبي

) محاسبه گرديد.Pfaffl et al. )2002 تكثير بيان با فرمول

ratio =E

∆ ( )

(E )∆ ( )

)١٣٩٩، بهار ١، شماره ١٢مجله بيوتكنولوژي كشاورزي (دوره

١٨٦ Agricultural Biotechnology Journal; Printing ISSN: 2228-6705, Electronic ISSN: 2228-6500

حاصل CtΔباشند. ژن مورد مطالعه و ژن مرجع يا كنترل داخلي مي PCRبه ترتيب بازدهي refEو targetEدر اين رابطه

باشد. مي 1ESRژن Ct از GAPDH ژن(حد آستانه) Ct ١يقتفر

نتايج و بحث

بود كه بيانگر كيفيت ٩/١-٨/١بين A260/A280هاي استخراج شده در طول موج نتايج حاصل از اعداد جذب نمونه

و عدم RNAنشان دهنده سالم بودن RNAدر 28Sو 18Sهاي استخراج شده بود و وجود دو باند RNAمناسب و مطلوب

و كنترل )ESR1(). براي يافتن دماي اتصال مناسب آغازگرهاي ژن هدف ٣وجود باند اضافي نشان دهنده خلوص آن بود (شكل

)GAPDH(واكنش ، PCR ل آغازگرهاي اختصاصي (دماي انجام شد و مناسب ترين دما براي اتصا ٢شيب دماييC°انتخاب ٦٠ (

درصد) نشان داد كه ٢با استفاده از الكتروفورز روي ژل آگارز ( PCRو محصوالت Real Time PCRهاي نتايج منحني گرديد.

هاي مختلف در بافت ESR1براي براي ژن bp١٦٣هاي مختلف تكثير شده است. مشاهده تك باند در محدوده در بافت ESR1ژن

ها، بيانگر صحت انجام آزمايش و تكثير قطعه مورد نمونه در همه GAPDHبراي ژن bp١٣٧) و وجود باند در محدوده ٤(شكل

. نظر بود

بز كركي رايني روي ژل آگارز هاياستخراج شده از بافت RNAاز كيفيت اينمونه .٣شكل

Figure 3. Quality of RNA extracted from tissues of Raini Cashmere goat on agarose gel

1 Threshold cycle 2 Gradiant

١٣٩٩، يمحمدآباد

١٨٧ Agricultural Biotechnology Journal; Printing ISSN: 2228-6705, Electronic ISSN: 2228-6500

نشان يرتكث ينرا به صورت منح يكلنت در هر سسنور فلور ييراتتغ يزانم Real Time PCR دستگاه، انجام واكنش يط

ر آن شدت باشد كه د يم ييكلشد كه نشان دهنده س يفتعر ييحد آستانه در فاز نما ير همه نمونه ها، يكتكث يمنحني برا دهد.مي

يده است. واكنش به حد آستانه رستكثير ع شده از طفلورسنت سانور

در بز كركي رايني GAPDHو ESR1هاي مورد بررسي با استفاده از پرايمرهاي الكتروفورز نمونه .٤شكل

٨و ٧، ٦، ٥ هاينمونه جفت باز) و ١٣٧( GAPDHقطعات مربوط به ٤و ٣، ٢، ١ هاينمونه روي ژل آگارز.

ستا M50 استفاده شده و نشانگر اندازههستند جفت باز) ١٦٣( ESR1قطعات مربوط به

Figure 4. Electrophoresis of studied samples using ESR1and GAPDH primers in Raini Cashmere goat on agarose gel. 1, 2, 3 and 4 are GAPDH fragments (137 bp), 5, 6, 7 and 8 are ESR1 fragments (163 bp), and size marker is M50

بز كركي رايني با استفاده از روش هاي قلب، كليه، مغز، تخمدان، رحم، پستان و بيضه بافتدر ESR1بيان ژن مطالعه

PCR كليههاي بيشترين سطح بيان در بافت .بيان شده است بررسي شدهي هابافتدر زمان واقعي نشان داد كه اين ژن در تمامي ،

) Hutson et al. )2019اين نتايج با نتايج .)٥(شكل مشاهده شدو قلب مغزو كمترين سطح بيان در بافت تخمدان، رحم و بيضه

عروقي (قلب، آئورت، كليه و فوق كليه)، سه ناحيه از مغز -را در چهار بافت قلبي ESR1ها بيان ژن آنمطابقت دارد.

)somatosensory cortex ،hippocampus وprefrontal cortexها، غده پستاني، رحم و مثلي (تخمدانهاي توليد) و بافت

ان مربوط به كليه و گنادها و كمترين متعلق به مغز بود. ها بيشترين بيدر مطالعه آنهاي نر و ماده بالغ ارزيابي كردند. بيضه) از موش

هاي زيادي وجود دارد و بسيار متغير ها تفاوتهاي يك سيستم بيان اين ژن ثابت است اما بين سيستمها نتيجه گرفتند كه در بافتآن

بيان زياد نمونه،(به عنوان مختص بافت است ESR1 كه بيان) نشان دادند Maekawa et al. )2016در پژوهشي ديگر است.

(ناحيه T-DMR1١ در DNA متيالسيون بيشتر توسطبيان در جفت و پوست) و در آندومتر و غده پستاني و بيان كم يا بدون

1 tissue-dependent and differentially methylated region (T-DMR)

)١٣٩٩، بهار ١، شماره ١٢مجله بيوتكنولوژي كشاورزي (دوره

١٨٨ Agricultural Biotechnology Journal; Printing ISSN: 2228-6705, Electronic ISSN: 2228-6500

متيالسيون شود تا توسط(سايت آغاز نسخه برداري) فاصله دارد تنظيم مي TSS ١داراي متيالسيون افتراقي و وابسته به بافت)، كه از

DNA متيالسيون. در منطقه پروموتور DNA يT-DMR1 به شدت با پايين آمدن بيان ESR1 استهاي عادي همراه در بافت

T-DMR2ي DNAرسد كه متيالسيون عالوه بر اين، به نظر ميكند. ميرا در شرايط آزمايشگاهي سركوب ESR1 و رونويسي

-T هايپومتيله شده و C وقتي كه پروموتر mRNA واريانت شماره سه زيراكند، را تنظيم مي C رونويسي از باالدست اگزون

DMR2 ها نتوانستند به طور مستقيم نشان شود. اگر چه آنبيان نميمتيله شده در جفت و پوست به طور متوسط و به طور زيادي

ها نشان داد طور كلي نتايج آنبه دهد.را كاهش مي باالدست C رونويسي از اگزون T-DMR2 در DNA متيالسيوندهند كه

هاي در بافت DNA مختص بافت را از طريق متيالسيون ESR1 ها بيان T-DMRهايي است و T-DMRs داراي ESR1 كه

مربوط به خود است كه رونويسي را از T-DMR ها همچنين دريافتند كه هر اگزون باالدست داراي يككنند. آنطبيعي تنظيم مي

تهيه پستان اي از اوليهسلولي هايكشتمحيط ) Ogorevc and Dovc )2016اي در مطالعهكند. تنظيم مياگزون باالدست

هاي پوششي اوليه (سلول pgMECs ٢ دررا PGRو 1ESR كميت بيان را نيز اجرا كردند تا كيفيت و qPCR-RTو كردند

هاي سلولي مشتق شده از بزهاي ارزيابي كنند. الينها در طول رشد و عملكرد غده پستان و نقش احتمالي آنپستان بز) تعيين كنند

ها نشان آن. باالتري را نشان دادند PGRو ESR1بيان نسبي هاي مشتق شده از بافت بزهاي شيرده در مقايسه با سلولنوجوان،

به شرايط الكتوژنيك PGRتر بيان نظيم پايين دست ثابتو ت ESR1هاي سلولي مختلف با تنظيم باالدستي متغير دادند كه الين

ها پيشنهاد دادند كه شرايط شود. آنبه سطح پروتئين ترجمه مي PGR و ESR1 رسد تغييرات در بياندهند. به نظر ميپاسخ مي

تواند در تمايز عملكردي مي آلفاگيرنده استروژن كند وهدايت مي الين لوميني الكتوژنيك سرنوشت سلولي را به سمت تمايز و تكثير

خصوص هاي توليد مثلي نر، بههاي موجود در بافتنشان داده شده كه استروژن به پروتئين سلولهاي لوميني نقش داشته باشد.

هاي خاص هاي خاص بيضه، مجاري وابران و اپيديديم با ويژگيدر سلول ESR2و ESR1هاي اپيديديم متصل مي شود و ژن

در سرتاسر سيستم توليد مثلي نرها ESR2همچنين ثابت شده است كه ). Carreau and Hess 2010اند (متمركز شدهاي گونه

شبكه هاي اليديگ بيضه و اپيتليوم مجاري وابران، محل اتصال اي است و در سلولداراي اختصاصيت گونه ESR1شود، اما بيان مي

و ESR1 هاي بياندر بيضه، گزارش ).Hess et al. 2002; Saraswat et al. 2015شود (بيضه به سر اپيديديم بيان مي

ESR2 با توجه به نتايج پژوهش حاضر و نتايج ساير محققين .ها و همچنين بين افراد درون يك گونه بسيار متغير استدر بين گونه

هاي استروژن نقش مهمي در اسپرماتوژنز و باروري نرها دارند، چرا كه در پژوهش حاضر مشخص توان نتيجه گرفت كه گيرندهمي

هايش به استروژن و گيرنده شود. لذا،توليدمثلي بسيار بيشتر بيان ميهاي غيرهاي توليدمثلي نسبت به بافتدر بافت ESR1شد كه

هاي آينده جهت توصيف نقش ژن اين پژوهش اساسي را براي پژوهش احتمال زياد براي باروري نرها بسيار ضروري هستند و نتايج

ESR1 .به عنوان يك ژن كانديدا براي باروري بهتر و فيزيولوژي طبيعي در حيوانات اهلي، به ويژه بز فراهم كرده است

1 transcription start site 2 primary goat mammary epithelial cells

١٣٩٩، يمحمدآباد

١٨٩ Agricultural Biotechnology Journal; Printing ISSN: 2228-6705, Electronic ISSN: 2228-6500

و )U(، رحم )O( تخمدان)، M( پستان)، B( مغز)، H( قلب)، K( كليه هايدر بافت ESR1. بيان ژن ٥شكل

) بز كركي رايني. T( بيضه

Figure 5. Expression of ESR1 gene in kidney (K), heart (H), brain (B), mammary gland (M), ovary (O), uterus (U) and testis (T) of Raini Cashmere goat.

منابع

ضا ،توحيدي نژاد فاطمه شكوئيه علي ،محمدآبادي محمدر سمعيلي زاده ك سطوح مختلف بيان ) ١٣٩٣( نجمي نوري عذرا ،ا سه مقاي

. ٣٥-٥٠)، ٤(٦. مجله بيوتكنولوژي كشاورزي در بافت هاي مختلف بز كركي رايني Rhebژن

ــكوئيه علي، رياحي مدوار علي ( ــمعيلي زاده كش ــا، اس ــين، محمدآبادي محمدرض ــي بيان ژن ١٣٩٥جعفري دره در امير حس ) بررس

CIB4 ــتفاده از هاي مختلف در بافت ــفند كرماني با اس ــخواركنندگان مجله .Real Time qPCRگوس پژوهش در نش

١١٩-١٣٢)، ٤(٤.

) آناليز ژنتيكي صفات رشد در بز ١٣٨٩حسني محمدنبي، اسدي فوزي مسعود، اسمعيلي زاده كشكوئيه علي، محمدآبادي محمدرضا (

.٣٢٣-٣٢٩، ٤١دامي ايران كركي رايني با استفاده از مدل حيواني چند متغيره. مجله علوم

)١٣٩٩، بهار ١، شماره ١٢مجله بيوتكنولوژي كشاورزي (دوره

١٩٠ Agricultural Biotechnology Journal; Printing ISSN: 2228-6705, Electronic ISSN: 2228-6500

). مطالعه تنوع ژنتيكي در چهار جمعيت بز كركي رايني با استفاده از ١٣٨٩عسكري ناهيد، باقي زاده امين، محمدآبادي محمدرضا (

. ٤٩-٥٦، ٥. مجله ژنتيك نوين ISSRنشانگرهاي

عه تنوع ژنتيكي بز كركي رايني با استفاده ). مطال١٣٧٨عسكري ناهيد، محمدآبادي محمدرضا، بيگي نصيري محمدتقي و همكاران (

.١٥٥-١٦١، ١٨از نشانگرهاي ربزماهواره. مجله دانش كشاورزي

مجله. بارز جبال در بز قرمز BMP15 ژن ٢ چند شكلي اگزون) ١٣٨٩(سونيا زادهزكي محمدرضا، محمدآبادي اهللا،زاده روحعلينقي

.٦٩-٨٠)،١(٢كشاورزي بيوتكنولوژي

ضا ( شكلي ژن ١٣٩٠محمدآبادي محمدر صفات كرك در بز كركي رايني. مجله ژنتيك نوين IGFBP-3) ارتباط چند -١٢٠، ٧با

١١٥ .

بيوتكنولوژي . مجلهReal Time PCRبيان ژن كالپاســتاتين در بز كركي رايني با اســتفاده از ) ١٣٩٨محمدآبادي محمدرضــا (

.٢١٩-٢٣٤)،٤(١١كشاورزي

References

Alinaghizadeh R, Mohammadabadi MR, Zakizadeh S (2010) Exon 2 of BMP15 gene

polymorphismin Jabal Barez Red Goat. Agric Biotechnol J, 2, 69-80 (In Persian).

Askari N, Baghizadeh A, Mohammadabadi MR (2008) Analysis of the genetic structure of Iranian

indigenous Raeni Cashmere goat populations using microsatellite markers. Biotechnol 2,

1-4.

Askari N, Baghizadeh A, Mohammadabadi MR (2010) Study of genetic diversity in four

populations of Raeini Cashmere goat using ISSR markers. Modern Genet J 5, 49-56 (In

Persian).

Askari N, Mohammadabadi MR, Baghizadeh A (2011) ISSR markers for assessing DNA

polymorphism and genetic characterization of cattle, goat and sheep populations. Iran J

Biotechnol 9, 222-229.

Askari N, Mohammadabadi MR, Beygi Nassiry MT et al. (2009) Study of Genetic Diversity of

Raeini Cashmere Goat Based on Microsatellite Markers. Journal of Agricultural Science

18, 155-161 (In Persian).

Baghizadeh A, Bahaaddini M, Mohamadabadi MR, Askari N (2009) Allelic Variations in Exon

2 of Caprine MHC Class II DRB3 Gene in Raeini Cashmere Goat. Am-Eurasian J Agric

Environment Sci 6, 454-459.

Barazandeh A, Moghbeli SM, Vatankhah M, Mohammadabadi MR (2012) Estimating non-

genetic and genetic parameters of pre-weaning growth traits in Raini Cashmere goat. Trop

١٣٩٩، يمحمدآباد

١٩١ Agricultural Biotechnology Journal; Printing ISSN: 2228-6705, Electronic ISSN: 2228-6500

Anim Health Prod 44, 811-817.

Carreau S, Hess RA (2010) Oestrogens and spermatogenesis. Phil Trans R Soc B 365, 1517-1535.

Hassani MN, Asadi Fozi M, Esmailizadeh AK, Mohammadabadi MR (2010). A genetic analysis

of growth traits in Raieni Cashmere goat using multivariate animal model. Iran J Anim Sci

41, 323-329 (In Persian).

Hess RA, Zhou Q, Nie R (2002) The role of estrogens in the endocrine and paracrine regulation

of the efferent ductules, epididymis and vas deferens. Pp. 317-338 in the Epididymis: From

Molecules to Clinical Practice. B. Robaire and B.T. Hin-ton, Eds. Kluwer

Academic/Plenum Press, New York.

Hutson DD, Gurrala R, Ogola BO et al. (2019) Estrogen receptor profiles across tissues from

male and female Rattus norvegicus. Biol Sex Differ 10, e4.

Jafari Darehdor AH, Mohammadabadi MR, Esmailizadeh AK, Riahi Madvar A (2016)

Investigating expression of CIB4 gene in different tissues of Kermani Sheep using Real

Time qPCR. J Rumin Res 4, 119-132 (In Persian).

Jahandoost S, Farhanghian P, Abbasi S (2017) The effects of sex protein receptors and sex steroid

hormone gene polymorphisms on breast cancer Risk. J Natl Med Assoc 109, 126–38.

Jones ME, Boon WC, McInnes K et al. (2007) Recognizing rare disorders: aromatase deficiency.

Nat Clin Pract Endoc Metab 3, 414–421.

Jones ME, Boon WC, Proietto J, Simpson ER (2006) Of mice and men: the evolving phenotype

of aromatase deficiency. Trends Endocrinol Met 17, 55–64.

Kazuhiro I, Kuniko H I, Satoshi I (2015) Identification of estrogen-responsive genes based on the

DNA binding properties of estrogen receptors using high-throughput sequencing

technology. Acta Pharmacologica Sinica 36, 24–31.

Li T, Zhao J, Yang J et al. (2016) A meta-analysis of the association between ESR1 genetic

variants and the risk of breast cancer. PLoS ONE 11, e0153314.

Lonard DM, O'Malley BW (2012) Nuclear receptor coregulators: modulators of pathology and

therapeutic targets. Nat Rev Endocrinol 8, 598–604.

Maekawa R, Sato S, Okada M et al. (2016) Tissue-Specific Expression of Estrogen Receptor 1 Is

Regulated by DNA Methylation in a T-DMR. Mol Endocrinol 30, 335–347.

Moghadaszadeh M, Mohammadabadi MR, Esmailizadeh Koshkoieh A (2015) Association of

Exon 2 of BMP15 Gene with the Litter Size in the Raini Cashmere Goat. Genet the 3rd

Millennium 13, 4062-4067.

Mohammadabadi MR (2012) Relationships of IGFBP-3 gene polymorphism with cashmere traits

in Raini Cashmere goat. Modern Genet J 7, 115-120 (In Persian).

)١٣٩٩، بهار ١، شماره ١٢مجله بيوتكنولوژي كشاورزي (دوره

١٩٢ Agricultural Biotechnology Journal; Printing ISSN: 2228-6705, Electronic ISSN: 2228-6500

Mohammadabadi MR (2019) Expression of calpastatin gene in Raini Cashmere goat using Real

Time PCR. Agricultural Biotechnology Journal 11 (4), 219-235 (In Persian).

Mohammadabadi MR, Jafari AHD, Bordbar F (2017) Molecular analysis of CIB4 gene and

protein in Kermani sheep. Brazil J Medic Biol Res 5, e6177.

Mohammadabadi MR, Tohidinejad F (2017) Charachteristics determination of Rheb gene and

protein in Raini Cashmere goat. Iran J Appl Anim Sci 7, 289-295.

Molaei Moghbeli S, Barazandeh A, Vatankhah M, Mohammadabadi MR (2013) Genetics and

non-genetics Parameters of body Weight for Post WEANING Traits in Raini Cashmere

goats. Trop Anim Health Prod 45, 1519-24.

Muramatsu M, Inoue S (2000) Estrogen receptors: how do they control reproductive and

nonreproductive functions? Biochem Biophys Res Commun 270, 1–10.

Ogorevc J, Dovc P (2016) Expression of estrogen receptor 1 and progesterone receptor in primary

goat mammary epithelial cells. Anim Sci J 7, 1464-1471.

Pfaffl MW, Horgan GW, Dempfle L (2002) Relative expression software tool (REST©) for

group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in real-time

PCR. Nucleic Acids Res 30, e36.

Saraswat S, Rout PK, Kharche SD et al. (2015). Estrogen receptor gene 1 expression in male goat.

Iranian J Vet Res 17, 56-58.

Shamsalddini S, Mohammadabadi MR, Esmailizadeh AK (2016) Polymorphism of the prolactin

gene and its effect on fiber traits in goat. Russ J Genet 52, 461–465.

Smith EP, Boyd J, Frank GR et al. (1994) Estrogen resistance caused by a mutation in the

estrogen-receptor gene in a man. N Engl J Med 331, 1056–1061.

Tohidi nezhad F, Mohammadabadi MR, Esmailizadeh AK, Najmi Noori A (2015) Comparison

of different levels of Rheb gene expression in different tissues of Raini Cashmir goat. Agric

Biotechnol J 6, 35-50 (In Persian). Yu KD, Rao NY, Chen AX et al. (2011) A systematic review of the relationship between

polymorphic sites in the estrogen receptorbeta (ESR2) gene and breast cancer risk. Breast

Cancer Res Treat 126, 37–45.

Zhang Y, Zhang M, Yuan X, et al. (2015) Association between ESR1 PvuII, XbaI, and P325P

polymorphisms and breast cancer susceptibility: a meta-analysis. Med Sci Monit 21, 2986–

2996.