Klinisehe 730 FRANZ SCHLEYEI%: Papierelektrophoretisehe Untersnehungen fiber Blutgruppen-AntikSrper. Woehensehrif*

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PAPIERELEKTROPHORETISCHE UNTERSUCHUNGEN UBER BLUTGRUPPEN-ANTIKORPER IN S E R U M E I W E I S SFRAKTIONEN.

Volt

Fl~ANZ SCttLEYER,

Aus den Institut fiir Gerichtliche Medizin der Universitgt Bonn (Direktor: Prof. Dr. It. EnBEI 0.

~ b e r die Zuordnung der An t ikSrpe r gegm~ Blut - gruppen- und B h t f a k t o r a n t i g e n e zu b e s t i m m t e n F r a k - t ionen des SerumeiweiBspektruras l iegen eine Reihe yon Untersuehungsergebnissen vor, die gl lerdings - - wahr- scheinlieh infolge der Versehiedenhei t de r M e t h o d e n -

Tabelle 1. Beziehungen zwischen Anti~6rpern gegen Blutgruppen und ./aktorrece T. toren und menschlichen. Serumeiwei/3/raktionen, Angaben der Literatur ( Reihen/olge

chronologisch ).

Vorkommen in Plasma- oder Untersucher und 1Kethodik Antik6rper gegen SerumeiweiBfraktion

BOYD (Ammonsulfat- und

Xthanolfallung)

(JOHN (ebenso)

WITEBSKY (Dialyse gegen Wasser)

DEUTSCH (Xthanolfiitlung)

HILL (FMlung n~ch REID-JoNEs)

STi)RMER ( Papierelektrophorese

n~eh PL~)GKTUHN)

CANN (TISELIUS}

SCHnHES (1) (Dialyse gegen Wasser)

JANKOVId ( Papierelektrophorese

nach FLYNN und DE MAYO

DACIE

TEWES (Papierelektrophorese

n a e h GRASSMANN und H~NmG)

A- und B- Isoreeeptoren

ebenso

ebenso Rh-Reeeptoren (Konglutinine)

ebenso (Agglutinine)

B-Receptor (0- und A-Serum)

Rh-Receptoren (Agglutinine)

ebenso (WtENERS ,,blocking

antibody" und ,,Kryptagglutinoide")

A-Receptor (Immun-AK) Rh-geceptor I)

(Titer 1:5000 kongl.)

Rh-Receptoren (bloekierende und durch

Coo~ss-Test nachweisbare) ~

A-Receptor (Immun-AK)

I~h-Reeeptoren (alle Arten)

eigene BlutkSrperchen in der Wgrme

(hgmolytische Angmie)

A-Receptor (Immun-AK) Rh-Receptoren

I I und I I I (Plasma)

III,1 (fi- und y-, zum Teil aueh sc-Globulin)

Albumin Albumin ] Uberstand

Globulin (Prgcipitat)

Y

n n d (haupts~ehtieh) fl

Y keine Ausprggung

Globuline, insbeson- dere c~- und y-Fraktion

Albumin und Globulin

kein sicheres Ergebnis keine sichere

Verstgrkung des y

n ieh t e inhei t l ieh sind. Die Angaben der L i t e r a tu r s ind in Tabel le 1 zusamraenges te l l t .

Erg~nzend zu der Tabelle ist zu bemerken, dab aueh Kglteagglutinine yon STA~S (zit. nach Bran) und neuerdings (papierelektrophoretisch) yon SPAs.T und KINSELL in die y-Fraktion lokalisiert werden, w~hrend Bin sog. ,,normales" (Pan-) Autokalte-Agglutinir~ in der c~- nnd fl-Fraktion erschien; ferner dab die yon WITEBSKY a]s,,Albumin" (Oberstand) bzw. ,,Globulin" (Prgcipitat) bezeichneten Fraktionen der Serum-

diMyse gegen Wasser papieretektrophoretisch Ms solche be- stgtigt wurden (ALLEI~T).

Wir sind der Frage an Hand der Papierelektro- phorese naeh GRASS~IANN und H A ~ I G fiir verschie- dene menschl iehe Iso- und I m m u n s e r u m a n t i k S r p e r

gegen Blu tg ruppen- und -faktor- r eeep to ren naehgegangen, nnd zwar wurden die Seren jeweils ira Na t iv - zus tand n n d naeh En t f e rnnng des Ant ikSrpers durch Blu tkSrperchen- sediment, der E lek t rophorese unter - worfen.

TISELIUS und KABaT erzielten durch Absorptio~ n i t den Antigen eine be- tr~chtliche nnd quantitativ entspre- ehende Erniedrigung der (stark erhShten) y-Zacke in Antieieratbumin- und Anti- pneumokokkenserum (yon Kaninohen und Allen), eine zwischen der # - u n d der y-Fraktion der TIssLIUsschen Dar- stellungsmethodik neu aufgetretene Kom- ponente in einem Pferde-Antipneumo- kokkenserum versehwand ngeh Absorp- tion mit dem Antigen. - - ST/3~,'~E~ U.a. fanden ~-Immun.antik6rper im Eluat der y-Fraktion der Papierelektrophorese.

Sys temat i sche Versucl~e zum p~pie re lek t rophore t i schen Nachweis von Agglnt in i lmn ersehienen somi t der M tihe wert .

Technik und Versuchsmaterial. Die Method ik der E lek t rophorese und die Auswer tung der S t re i len war die gleiche wie in f r i iheren Un te r suchungen [ S c ~ E Y E ~ (2) ]. I n j edem Einze lversuch wurden 4 Strei- fen beschickt und pho tomet r i sch ausgewer te t , die GAussschen Kur - yen wurden p lan ime t r i e r t , die 4 W e r t e jeder F r a k t i o n wurden

7 gemi t t e l t ; urn. die Sehwankungs- bre i te de r Ergebnisse darzuste l len , wnrde zusgtzl ich der mi t t l e re Feh- ler bereehnet .

U n t e r s u c h t wurden 2 isoagglu- t i n inha l t i ge und 5 imraunan t ikSr - perhMtige Seren, im e inzelnen:

1. B-NormMserum, Titer in NaC1-LSsung gegen 2% A 1- Blkp.-Aufschwemmung im t~6hrchen 1:8, naeh Absgttigung n i t 1/~ Vol. gewaschenem Al-Blkp.-Sediment ffir 1 Std bei Zimmertemperatur 1:0.

2. O-Normalserum, Titer gegen A1B-Blk p. in NaCLLS- smlg 1:512(~) , naeh Absgttigung n i t P/~Vo1. A1B-Sedi- ment 1 : 0.

3. O-Immunserum, Titer gegerl A~-BIkp. nach 1 Std bei 20 ° in NaCI-LSsung 1 : 204K in 6 % GelatinelSsung 1 : 32 000 mit je 2 tt~molysestufen. Der Serumspender war 11/2 Jahre vorher

Jg. 3"2, Kef~ 3t /a2 ~l~a.wz ScI~LZ¥m~: Papierelektrophoretische Untersuchungen fiber Blutgruppen-Antik5rper. 73i 15. August 1954

mfl, A-Btutgruppensubstanz immunisiert worden, der hiehste yea uns bestimmte Tiger war 1 : 32 × 10 ~ im Pr/~cipitat des dialysiertert Immunserums gewesen [ScHL~¥~ (1)]. Tiger nach Abs/~tigung mig 1~/~ Vol. A~-Sediment 1:2 und 1:8, der Abgug war etwas hamolytiseh (Wirkung der Immunhamo- lysine auf das Antigen).

4. A~ ede/ede-Immunserum, Tiger gegen OD-Blkp. naeh t Std bei 370 in NaC1-Lisung 1 : 8000 (gihrehen), m AB-Serum t :4000 (es handelte sieh um das vo~ P~o~:o~, besehriebene, einziga.rtig starke Anti-D-Serum; der Konglutitfintiter der 1 Jahr alten Charge hatte dureh die Konservierung etwas ab- genommen). Tiger naeh Absiittigung mit 1~/~ Vol. B CDe/CDe-Sediment 1:4 in der Antikirper. NaCLLisung, 1:4 (:L) in AB-Serum. Eine andere Charge des Serums mi~ den Titern 1:4000 bzw. 1:I28000 war bereits yon TEW~:S papierelektrophore- tisch analysierg, eine elekgrophoregisehe Priifung des Serums war aueh yon Swii~- ~i~a u. a. vorgenommen worden (vgl. Tabelle I).

5. Axede/cde-Immunserum, Tiger ge- gen A~ CDe/cde-Blkp. (Tech~ik wie bei Nr. 4) in NaC1- und Gelatinelisung 1 : 32 und 1 : 4000. Die Spe~derin (VIII.-para) hatte 2 Menage vorher ein Kind mig Icterus gravis geboren, das Serum ent- hielt vermutlich aul3erdem ein Anti-C. Tiger linch zweimMiger Absattigung mig P/~Voh BC De/CDe-Sediment 1:0 in beiden Medien.

6. A~ ede/cde-Immunserum, Tiger ge- gert OE-Blkp. (Teehnik wie bei Nr. 5) 1 : 64 und 1:256. Das Strum stammte yon einer III.-para, das 4 Nonage vet der Blutentnahme geborene Kind hatte at,_ einer hamolytischen Fetose gelitten. Tiger nach zweimaliger Absa.ttigung mit 1~/~ Vol. BE-Sedimen~ 1:0 und 1:4 (4-).

7. A~ ede/ede-Immunserum, Tiger ge- gen A~DE-Blkp. in NaC1-Lisung 1 : 128, in AB-Serum 1:512. Das Serum hatte Immunangikirper gegen die Ar~tigene D, E und M enthalten (P~oxos und VoLn- a~ga~D). Tiger nach Abs/~ttigung mit P/e Vol. B eDE/ede lvI-Sediment 1:2 und 1:4 (4-).

Tabelle 2 zeigt die Erge~nisse. Eine Gr iBengnderung der phero- graphiseh meBbaren EiweiBfrak- tiorten naeh Absorp t ion der Iso- oder I m m u n a n t i k i r p e r war in kei- nero Fal le vorhanden , bier u n d da anf t re tende geringfiigige Verminde- r u n g e n nach der Absg t t igung lagen innerha lb der Fehlerbrei te , dig MeB- werte der Frak~ionsantei le s ind prakt iseh iiberatl identiseh.

Versuch 3 isg allerdings nieht mitzuzghlen, da bier die dutch die Immunh~imolysine des Serums bewirkte Hgmolyse des antigengragenden Blutsedimertts die Kurve grob verzerrte; es maehte sieh hier die anderwgrts yon uns beschriebene kx,- reichcrung des fl- und y-Areals auf Kosten der ~-Areale dureh Hgmoglohinbeimisehung geltend (vgI. aueh Fa,mlCKS).

Beim Ant.i-E-Serum (Versuch 6) liel? sioh die c%-Zaeke des absorbierten Strums niehg vom fl trermen, die beiden Fraktio- hen wurdert als Summenareal ausgemessen, das aber der Summe der Einzelwerte des Nativscrums entspraeh. Auch beim Anti-D-Serum des Versuehs5 mugger~ die ~=- und fl-Kurvenz/ige durehweg zusammen ausgemessen werden.

Das Anti-D-E-M-Serum (Versueh 7) zeigte in alIer~ 8 Strei- fe~z einheiglieh ein extrem kleines e~ und eine Superposition der (iibrigens recht grogen)/~- und y-Zacken, die ebenfMls als Summenwerte berechnet wurden.

Aus den Ergebnissen ist zu ersehen, dab selbst ein s tarker Ant ik i rpergehal~ einer Globulinirakt iort sieh

bei der papierelekgrophoretisehen Trermung der Serum- eiweige r6cht auspr~gt. Da jedoeh der Antikirper in einer Globul in i rak t ion en tha t t en sein muff u n d naeh der Abs~tttigung aus dem Serum ent fe rn t ist, mug gefolgert werden, dab die Papierelektrophorese zur Lokalisie- rung yon S e r u m a n t i k i r p e r n n ieht geeignet ist. Selbst eine groge Anhg,ufung yon Agglu t in inen im Serum be-

Tabelle 2. Prozentanteile der Serumeiwei[3/raktionen. Oberer Teil: Normalwerte der Papierelektrophorese nach GgASSMA~I~ und

H~,~IG. Unterer Teil: Wel*e der untersuehten Seren vor und nach Absatgigung

G~ASS~A~" und ]~[AN~IG 25 Normalseren, mehrfache Einzelbestimmungen) . .

]~EWES (4 NoI'malseren, Doppelbestimmungen) . .

ALLEI~T (t Normalsermn, Doppelbestimmung, zehn- fache Auswertung) . . .

FI~ElalCKS (10 Normalseren, tfache Einzelbesfimmung)

Normalserum t3 c~ a.) unabgesf~ttigt . . . b) abges~t~igg . . . .

Normalserum 0 ~ fl a) unabges~gtigt . . . b) abges~ttigt . . . .

~-Immunserum 0 a) unabgesagtigt . . .

b) abges/ittigg . . . .

Immunserum Auti-D T~w~s . . . . . .

a) unabges~ttigg . . . b) abges~ttigt . . . .

Immunserum Anfi-D a) unabges~gtigt . . . b) ~bges/~ttig~ . . . .

Immunserum Anti-E a) unabgesiittigg . . .

Albumin

61,34-1,2

57,34-4,6

61,04-4,4

56,54-5,o

59,54-7,8 58,64-5,7

49,34-3,8 51,3=t=2,8

50,0 ± 1,4

51,0±5,7

62,24-1,7 55,04-2,8 52,0±3,3

50,64-0,6 51,14-2,0

55,14-3,2

53,04-2,8

55,54-0,6 55,74-2,8

b) abges/~tgigt . . . .

Immunserum Anti-D-E-M a) unabgesgttigg . . . b) abges/ittigt . . . .

Globuline

4,14-0,6 8,14-0,7

5,84-2,1 7,34-1,5

5,4=[=0,8 I 6,94-1,3

4,7~1.1 7,34-1, 8

4,6+2,2 7,04-2,5 3,4~0,8 7,34-1,6

6,54-1,6 7,64-1,1 4,94-1,8 6,84-0,0

6,54-0,4 8,44-1,2 . . . . . .

4,24-1,5

2,4~0,8 3,5~1,2 4,34-0,6

4,84-0,6 504-1,o

4,74-0,7

4,64-1,4

<1,0 <0,6

3,6+0,6 6,4~1,1 7,34-0,5

11,04-0,7 15,54-1,2

11,54-1,7 18,14-2,2

10,0±1,7 16,64-2,5

10,74-2,0 20,64-3,7

6,741,8 22,04-1,8 7,41t,2 20,14-2,5

12,44-1,2 24,24-1,7 14,64-1,6 22,04-1,1

14,24-1,5 20,94-0~6

~,84-4,6

12,74-2,5 14,0± 1,3 13,2±2,5

22,84-0,9 22,24-1,1

20,5 21,14-1,3

7,34-0,5 7,44-1,1

19,1±2,2 21,14-1,6 23,1±4,0

21,84-1,2 21,8=t=2,9

19,64-0,9

19,14-0,7

37,04-0,5 36,54-1,3

d ing t also keine quantitativ me[3bare Vermehrung einer Globulirffrak~ion.

Zusammen/assung. Zwei isoaggtutininhalt ige Nor- ma]seren n n d 5 immnn~n t ik i rpe rha l t i ge Seren mi t hohem Tiger wurden vor und nach E n t f e r n u n g der Ant ik6rper papierelektrophoret isch untersucht . E in qu&nti tat iver Untersckied der F r a k t i o n e n zwischen na- t ivem u n d absorbier tem Serum war n ich t festzustellen.

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INTRACELLUL~C[RE YERTEILUNG VON CHORIONGONADOTROPIN IN DER PLACENTA DES MENSCHES~.

Von

G. SIEBElt, T u n d G. STARK. Aus dem Physiotogisch~Chemischen Ins~itut (Direktor: Prof. Dr. Dr. K. LA~) and der Frauenklinik (Direktor: :Prof. Dr. K. SCltWAt~)

der Johannes Gutenberg-Universit~t YXainz).

Einleitung. Die Placenta ist der Bfldungsort yon Chorion-

gonadotropin, wie in zahlreichen Arbeiten gezeigt worden ist ~; mit groGer Wahrscheinlichkeit erfo]gt diese ]![ormonbildung in den LA~G~A~ssehen Zellen 2. Wo innerhatb der einzelnen Zelle abet die Hormon- synthese geschieht, ist unbekannt, weil bis vor kurzer Zeit noch keine Verfahren zur Verffigung standen, die einzelnen morphologischen Zellelemente (Zellkerne, Mitochondrien usw.) in genfigender Rein- heir und Menge some ohne wesentliche Beeintr~chti- gang ihrer biologischen Funktion zu gewinnen. Mit der Untersuchung dieser ~rage befaBt sich diese Mitteilung.

Die vor]iegende Arbeit enthi~It Daten fiber die prozentuale Verteilung yon Choriongonadotropin in der Placentazelle, d .h . fiber die Konzentrat ion des Hormons in den einzelnen Zelliraktionen. Ein ge- danklich scheinbar einfacher, hiiufig in der Praxis aber schwieriger Schritt ist der Schlu~, der Ort der hSchsten Konzentrat ion in der Zelle sei zngleich die Bildungsst~tte. Choriongonadotropin hat m m in der Placenta selbst keine Funktion, fibt vielmehr seine Wirkungen augerhalb dieses Organs an den Sexual- organea aus, zu denen es auf dem Blutwege trans- portier~ wird. Daher scheint im spezieHen Fall des Choriongonadotropin der SchlnB bereehtigt, dab der Ort in der Plaeentazelle, an dem das meiste Chorion- gonadotropin gefunden wird, etwas mit der Bfldung oder Abg~be des Hormons zu tun hat. AnIaB, an der Placenta z~dschen eigentlicher Synthese des ~ ' r k - stoffes und seiner Sekretion zu unterscheiden (wie es z .B . yon H o ~ a ffir das Pankreas gezeigt wurde), besteht unseres Erachtens nicht. Daher dfirfen ~dr aus der Anreicherung des Hormons an einer bestimm- ten Zellfraktion ant deren Mitwirkung bei der Hor- monsynthese sch]iegen.

Choriongonadotropin ist ein kohlenhydra£haltiges Protein biochemisch handelt es sich daher um Fragen der LokMisation der Eiweig- und Kohlenhydratsyn- these in der Zel]e, und um den Oft der Znsammen- ffigung der niedermolekularen Einzelbausteine zum physiologisch wirksamen M&kromolekfil. Es liegt ant der Hand, dM~ eine Untersuchung dieser Fragen zugleich auch einiges Licht au~ ganz grundlegende Fragesteltungen bioehemischer Art werfen wird: Fragen nach Art and Ort des Stoffaufbaues hmer- halb der Zelle. Imruer, wenn die entstandene Sub- stanz sehon in kleinsten Mengen an Hand einer spezffischen Wirkung nachweisbar ist, Me bei Fer- menten nnd Hormonen, sind Antworten auf diese Fragen am ehesten zu erwarten. Diese ~dberlegungen waren ffir uns mit der Anlag, Best immungen des Ge-

haltes der einzelnen Plaeentafraktionen an Chorion- gonadotropin durehzuffihren.

Wahrend fiber die intracellulare Verteilung yon Enzymen schon ein sehr umfangreiehes Material vor- liegt (Ubersicht bei4), ist fiber die Aufteilung von Hormonen auf die einzelnen Zellfraktionen bisher nur sehr wenig bekannt. In der Hypophyse normaler und kastrierter Tiere fand sich die hSchste Gonado- tropinaktivit~tt tells in den Mikrosomen 5, tells in den Mitoehondrien s. Angaben fiber einige weitere Hor- mone s. bei ~.

Methodil~. Fiir die Versuehe wurden ganz frische Placenten,

die am Ende normaler Schwangersehaften anfielen, verwendet; nach oberfli~ehlicher t~einigung yon an- haftendem Blur wurde das Gewebe durchgekfihlt und durch die Nabelschnurgef~6e mit 10%iger Rohr- zuekerlSsung blutfrei gespfilt; bei f lottem Arbeiten gelang dies stets leicht. Die anschlieBende Ge- winnung der Zellkerne erfolgte nach LA~G und SIE- B ~ T 7. Nach den dort beschriebenen Verfahren war- dan die Zeltkerne zu Acetontrockenpulver verarbeitet ~md so bis zur Austestung aufbewahrt. Auf Grund der verh~tltnism~gig weichen Konsistenz und des ge- ringen GehMtes an Bindegewebe lassen sich voll- kommen reine Zellkerne (Kontrolle ira mikroskopi- schen Ausstrich) aus der Placenta mit der gleichen Leichtigkeit gewinnen, wie z .B. aus Schweineniere, Rattenleber oder l~inderpankreas.

Die fiberstehende LSsung nach Sedimentierung der Zellkerne wurde 10 rain bei etwa 1000 × g zentri- fugiert und so eine Meine Menge Zellkerne, die mit einzelnen grofien Mitochondrien verunreinigt war, abgetrennt; ansehlieBend wurde durch 20 rain Zentri- fugieren bei 16000 × g in der Kiilte die Mitoehondrien- fraktion gewonnen; diese wurde ebenso wie die fiber- stehende, Mikrosomen und 15sliehes Cytoplasma ent- haltende Fraktion, zu Aeetontrockenpulver ver- arbeitet.

Die Auswertung der Choriongonadotropinaktivit~t geschah mittels AuslSsung der Spermatorrhoe an der KrSte n~ch den Angaben yon GALLI-MAININIS; zum Vergleich mit den Plaeentafraktionen und zur Eichung diente Prolan der Bayer-Werke Leverkusen, das nach internationalen Einheiten standardisiert ist.

Die Bestimmung Yon Gesamtstickstoff wurde nach dem Mikro-Kjeldahl-Verfahren vorgenommen, yon Gesamtphosphor nach LOHMAN~ und JES- DI~ASSIK 9, Y o n Eohrzncker nach H A G E D O E N - J E N s E N

(naeh Hydrolysel°), yon EiweiB mit der Biuret- reaktion n. Die Eichknrve zur Biuretreaktion wurde mit~verdfinntem Serum gewonnen,~dessen Eiweig- gehalt nach K J E L D ~ n ermittelt worden war.