Pathog nies et m thodes diagnostiques - SP²A °°° La … et Poumon: Pathog énie et m éthodes diagnostiques Dr Laurence Delhaes Service de Parasitologie-Mycologie Département

Aspergillus et Poumon:Aspergillus et Poumon:PathogPathog éénie et mnie et m ééthodes thodes

diagnostiquesdiagnostiques

Dr Laurence Delhaes

Service de Parasitologie-Mycologie Département de Microbiologie - EA3609

CHRU de Lille

5ème Congrès Francophone Pédiatrique de Pneumologie et d ’Allergologie 5-7 /11/2009

Fusarium (Fusarium (wikipedia)wikipedia)

C. AlbicansC. Albicans (ANOFEL)(ANOFEL)

A. fumigatusA. fumigatus (ANOFEL)(ANOFEL)

A. flavusA. flavus ((wikipedia))

ZygomycoseZygomycose (ANOFEL)(ANOFEL)

ScedosporiumScedosporium

Aspergillus et Poumon: PathogAspergillus et Poumon: Pathog éénienie

- Micromycètes = pathogènes opportunistes très répandus dans l’environnement

-Aspergillus +++ ((998%: Garcia8%: Garcia--VidalVidal, 2008, 2008))>300 espèces pathogènesA. fumigatus (80%),A. flavus (15%), A. terreus, A. nidulans, A.niger (<5%)

- Scedosporium S. apiospermum,S. aurantiacum, S. prolificans

-- Mode de contaminationMode de contaminationInhalation de spores+++ (2-4µ)

aaéériensriens

Champignons Champignons opportunistesopportunistes

�� CorrCorr éélation travaux/AIlation travaux/AI((Etancelin 2009; Pini, 2008; Alberti 2001)Etancelin 2009; Pini, 2008; Alberti 2001)

�� Surveillance environnementale +++Surveillance environnementale +++

Inhalation des conidies (2-3 µm)

Alvéoles pulmonaires

1) Défense mécanique : Tapis mucociliaire

2) Défense innéeCellules épithéliales

Cellules phagocytaires (MA, PN)

Cellules dendritiques

Aspergillus et Poumon: PathogAspergillus et Poumon: Pathog éénienie

3) Défense adaptative

Latgé, 2007

www.pathguy.com/lectures/infect.htm

Renforcement de la réponse anti-aspergillaire

ééquilibre Th1 quilibre Th1 / Th2 / Th2 ≠≠ APIAPI(d(d’’apraprèès Balloy , 2009; Segal, 2009)s Balloy , 2009; Segal, 2009)

Traduction cliniqueTraduction clinique

Expression clinique f°: - Exposition aspergillaire ( quantité + virulence)- Qualité de la réponse locale, innée- Qualité de la RI adaptative

Formes localiséesColonisation bronchiqueBronchite aspergillaire

Aspergillome

BPCOEmphysème,…

Tuberculose, sarcoïdose

Réaction d’hypersensibilitéABPA

Asthme aspergillaireSinusite allergique asp

AAE

2% asthme , 5-15% mucoviscidose

20% asthme

MP (poivre, malt)

Formes invasivesTrachéobronchite nécrosante

Aspergillose pulmonaire chronique nécrosante (APCN)

API

Immunodépression Transplantation pulmonaire 4%

Immunodépression (corticoïde)Pathologie pulmonaire chronique

Immunodépression sévèreNeutropénie profonde, prolongée

Non neutropénique

(Denning 2003; Blandin 2008; Gangneux 2008)(Denning 2003; Blandin 2008; Gangneux 2008)

Hôte susceptible=

� Immunodéprimé• D’Hématologie 3% – 14% >> allo-SCT

(Crassard; Burgos; Castagnola 2008; Leeflang 2008)(Crassard; Burgos; Castagnola 2008; Leeflang 2008)

• Greffes d’organe solide: Transplantés pulmonaires+++: 6% AI, >> colonisation aspergillaire; incidence >> chez les patients atteints de mucoviscidose (Iversen 2008)(Iversen 2008)

� Non neutropénique ↑↑↑↑• Corticothérapie (Lewis 2008; Castagnola 2008)(Lewis 2008; Castagnola 2008)

• Biothérapie+++((Stankovic K,Stankovic K, 2006)2006)

Relation Hôte/ParasiteRelation Hôte/Parasite

aaéériensriens


Mycoses invasives = Pronostic pMycoses invasives = Pronostic pééjoratifjoratif�� Diagnostic difficile, tardifDiagnostic difficile, tardif�� Prise en charge thPrise en charge théérapeutique complexerapeutique complexe

= Crit= Crit èères 2008 res 2008 ((De PauwDe Pauw; Walsh 2008); Walsh 2008)

aaéériensriens


Diagnostic BiologiqueDiagnostic Biologique

Prise en Charge ThPrise en Charge Th éérapeutiquerapeutique

Populations à risque- Bilan clinique

- Bilan radiologique (≠ adulte Burgos 2008Burgos 2008)

Micromycètes

- ED + Culture

- Ag de paroi

- ADN/ARN fongique

aaéériensriens



Prise en Charge ThPrise en Charge Théérapeutiquerapeutique

Diagnostic Biologique: MDiagnostic Biologique: M ééthodes thodes conventionnellesconventionnelles

ED + Culture : ED + Culture : Faible sensibilité dans AI/MI (même si Calcofluor)

Intérêts = Diagnostic de certitude Isolement du micromycète

www.doctorfungus.org Filaments non-septés

www.reviberoammicol.com/.../www.reviberoammicol.com/.../

Candida/albicansCandida/albicans /

EA3609

Représentation schématique de la paroi d’A. fumigatus (Latgé 2003)

Diagnostic Biologique: Ag de Paroi fongiqueDiagnostic Biologique: Ag de Paroi fongique

Diagnostic AI : GM

Diagnostic des Mycoses invasives

Galactomannane (GM) Galactomannane (GM) ββ11--33--D Glucane (BG) D Glucane (BG) � ELISA: Platelia Ag® ++/ Pastorex® Fungitell ® (Wako, CapeCOD…)

� Dans le sérum : 0.5 ng/ml2-3 fois/semaine (Oncohématologie)1 fois/semaine (greffe)

� Seuil sérique Non défini60-80 pg/ml

�� 1 GM+ dans s1 GM+ dans séérum ou LBArum ou LBA , LCR, LCR �� 1 BG + dans le s1 BG + dans le séérumrum

= Crit= Crit èère mycologique dre mycologique d ’’AI AI (De Pauw 2008; Walsh 2008)(De Pauw 2008; Walsh 2008)

� AI (Aspergillus) � MI panfongique (Candida, P. jirovecii,Fusarium SAUF Cryptococcus et zygomycètes,Odabasi 2004, Persat 2008, Odabasi 2004, Persat 2008, Wheat L 2009 ) Wheat L 2009 )

� Sensibilité de 78-93% ; Spécificité77-92% au seuil de 80 pg/ml Pas/Peu réactions croisées avec ATB (Pickering 2005; Persat 2008; Arendrup 2009)(Pickering 2005; Persat 2008; Arendrup 2009)

Ag circulantAg circulant

� Sensibilité 78%, Spécificité 81%,

Spécificité 87% (Steinbach 2007) (Steinbach 2007)

VPN>90% (Cochrane DB(Cochrane DB-- Leeflang 2008) Leeflang 2008)

∆ f°population à risque (Pfeiffer 2006)(Pfeiffer 2006)

� Faux + : BG d’origine environnementale (cellulose) → Hémodialyse, Chirurgie, Ig+++ (Hope 2005; Marty 2008, Persat 2008), (Hope 2005; Marty 2008, Persat 2008), infections bactériennes (Pickering 2005)(Pickering 2005)Faux+ très fréquents (Racil, 2009)Racil, 2009)

� Faux - : rapporté sous échinocandine (Persat, 2008), Persat, 2008), certaines espèces de candida(Ostrosky(Ostrosky--Zeichner 2005)Zeichner 2005)

�Place du test :1 GM>0.5 ng/ml (sérum + LBA, LCR) 1 BG + (sérum)

= Critère mycologique d’AI probable

� Coût++ (± 4€ / test) <<<< Coût ++++ (± 7€ / test)

(De Pauw 2008; Walsh 2008)(De Pauw 2008; Walsh 2008)

� Faux + : GM alimentaire, ATB fabriquées àbase de Pénicillium (PIP, TAZ, AMCL = Pénicilline semi-synthétique Znadijk 2008Znadijk 2008)Bifidobacterium colonisation (Arendrup 2009)(Arendrup 2009)

� Faux - : rapporté, spécifique de souche, sous ATF

� GM = famille de molécules d’expression variable +++ (Morelle 2005)(Morelle 2005)

Galactomannane (GM) Galactomannane (GM) ββ11--33--D Glucane (BG) D Glucane (BG)

Levure d’après http://www.didier-pol.net/03s11-6.gif

Eucaryotes

Noyau entouré d’une membrane

Mitochondrie, RE

Membrane+++ (lipides dont stérols)Paroi+++ (chitine, mannanes & glucanes, protéines, phospholipides)

Morphologie de la cellule fongique

ADN +++, +/ADN +++, +/-- ARNARN

Outils moléculaires:� +/-ARN (NASBA, cDNA et microarray (puce panfongique) cDNA et microarray (puce panfongique)

((Spiess 2007; Yoo 2005; Loeffler 2001 Spiess 2007; Yoo 2005; Loeffler 2001 )

� PCR (ADN)

Diagnostic Biologique: Outils MolDiagnostic Biologique: Outils Mol ééculairesculaires

PCR (ADN)PCR (ADN)

Validation de la PCR aspergillaire→ Sensibilité analytique: 1-10 fg ADN fongique (Costa 2002; Hope 2005; Khot 2008)(Costa 2002; Hope 2005; Khot 2008)

→Sensibilité (60%-80%) / spécificité cliniques variables, < GM mais VPN très bonne Sensibilité 88-63%, VPN 75%-95% en pédiatrie (El(El--Mahallawy2006; Cesaro 2008)Mahallawy2006; Cesaro 2008)

Absence de Standardisation

Autres approches moléculaires (MI)→ PCR panfongique ou multiplex (Faber 2008; Hope 2005)(Faber 2008; Hope 2005)

Cassaing 2009 : Cassaing 2009 : PCR en temps réel ciblant le gène ITS2 des champignons avec séquençage des amplicons

→ Diagnostic de sepsis: SeptiFast (Kit Roche) ADN microbien(Mancini 2008; von Lilienfeld(Mancini 2008; von Lilienfeld--Toal 2009; STIC+++) Toal 2009; STIC+++)

→→ Non inclus Non inclus comme comme CritCritèère dre d’’AI AI en 2008 De Pauw; Walshen 2008 De Pauw; Walsh

Populations à risque- Bilan clinique

- Bilan radiologique (≠ adulte Burgos 2008Burgos 2008)

Micromycètes

- ED + Culture

- Ag de paroi

- ADN/ARN fongique

aaéériensriens



Prise en Charge ThPrise en Charge Th éérapeutiquerapeutique

SensibilitSensibilit éé in vitro aux antifongiques: in vitro aux antifongiques: Antifongigramme Antifongigramme (CMI, CME (CMI, CME µµg/ml g/ml -- mmééthode des Ethode des E --TEST)TEST)

Valeurs seuils des CMI admises (ITC, VRC, POS, CAS, AMB)

- Résistance ≥ 4µg/ml - sensibilité dose dépendante = 2µg/ml - Sensibilité ≤ 1µg/ml Espinel-Ingroff, 2008 (méthode des disques)

Emergence of Azole Resistance in A. fumigatus and Spread of a Single Resistance Mechanism Snelders E, PLoSMed 2008Snelders E, PLoSMed 2008Harrison E, ICAAC 2009Harrison E, ICAAC 2009

A. fumigatusA. fumigatus (ANOFEL)(ANOFEL)

ITRITR

10% 10% 20082008

Homogénéité des isolats ROrigine environnementale ?Rôle des fongicides, pesticides ?

RRéésistance aux Azolsistance aux Azol éés : Epids : Epid éémiologiemiologie

�Mode d’Action des Azolés:- Inhibition spécifique de 14-α lanostérol déméthylases = Enzyme de la superfamille du CytP450

- C. albicans : gènes Erg 11; A. fumigatus : 2 gènes Cyp51 A&B

AzolAzol éés: Ms: M éécanisme dcanisme d ’’Action, de RAction, de R éésistancesistance

�Mécanismes de Résistance:- Modification des enzymes cibles CYP/ERG11 :

- Mutations ponctuelles des gènes CYP51A-B / ERG11 - Surexpression de l’enzyme cible (C. albicans et S. cerevisiae)

- Capacité de certains isolats à importer du cholestérol

(Mellado et al. 2001; Chamilos & Kontoyiannis. 2005; Howard 2006; Mellado et al. 2007; Rodrigues-Tudela 2008; Garcia-Effron 2008 Alanio et al. ICAAC 2008; Harrison et al. ICAAC 2009; Howard et al. ICAAC 2009; Howard et al. 2009)

Chez A. fumigatus ,Les mutations de Cyp51A constituent à ce jour le seul mécanisme de résistance aux azolés in vitro associé à une résistance in vivo (AI + ABPA).

G54G54

MVFHWMVFHW MEQKKMEQKK WDPHRW WDPHRW

R-ITCR-ITC / POS

PAN-AZOLE R

L98HL98H

G138G138 M220M220 Y431Y431 G448G448

TR X 2

PAN-AZOLE R

R-ITC

G432G432 G434G434

RRéésistance aux Azolsistance aux Azol éés : Donns : Donn éées moles mol ééculairesculaires

Chez Chez A. fumigatusA. fumigatus, Mutations de Cyp51A oui MAIS, Mutations de Cyp51A oui MAIS……

Harrison et al, ICAAC 2009Harrison et al, ICAAC 2009

RRéésistance aux Azolsistance aux Azol éés : Epids : Epid éémiologiemiologie

→→ Risque de rRisque de r éésistance croissistance crois éée e (Harrison, Howard, 2009)(Harrison, Howard, 2009)

→→ Tenir compte des traitements antTenir compte des traitements ant éérieurs rieurs (De Pauw; Walsh 2008)(De Pauw; Walsh 2008)

STP = Mesure de C°du médicamentAjuster la posologie en f°efficacité / toxicité

- Diminuer les échecs thérapeutiques (dose insuffisante ou mauvaise observance)

- Diminuer la fréquence des effets toxiques

RecommandRecommand éé par confpar conf éérences de consensus VRC et POS rences de consensus VRC et POS

Suivi ThSuivi Th éérapeutique Pharmacologique : Actualitrapeutique Pharmacologique : Actualit ééss

Suivi ThSuivi Th éérapeutique Pharmacologique : En rrapeutique Pharmacologique : En r éésumsum éé

- Valeur résiduelle du STP:

- Prophylaxie > 0.5 µg/ml VRC, POS, ITC

- Curatif 1-6 µg/ml VRC>1 µg/ml POS0.5-1.5 µg/ml ITC

(Arendrup, 2009)(Arendrup, 2009)

�� Voriconazole : Voriconazole : Biodisponibilité <<< 96% adulte (à distance repas) T½ = 6hElimination hépatique (CYP+++)Cinétique linéaire chez l’enfant (4-8 mg/kg 2x/j, iv ou po)

(Kohli 2008; Blyth 2009)(Kohli 2008; Blyth 2009)

�� Dosage sDosage s éérique (HPLC)rique (HPLC)– En résiduel : 1- 5.5 mg/L , à J2-5 post-TTT– Pb d’observance (per os) à faire tous 14 j– Toxicité hépatique et hallucination = dose dépendante

Pascual A 2008Pascual A 2008


TDM voriconazole recommandé chez:• Insuffisant hépatique• Sous dialyse rénale• Co-administration médi affectant le métabolisme (Im )• Si apparition d’E.I.

TDM voriconazole car:• PK non linéaire

Ex: dose orale 200 mg à 300mg ⇒⇒⇒⇒ AUC X 2,5dose IV 3mg/kg à 4mg/kg ⇒⇒⇒⇒ AUC X 2,3

• Métabolisme hépatique +++ sous dép. de P450 polymorphes (CYP2C19>2C9>3A4)• E.I. sérieux possibles si [vori] > 6µg/mL

• [vori] minimale efficace = 0,5µg/mL

• Voie orale: [vori] ss pic 2,1 - 4,8 µg/mLcreux 1,4 – 1,8 µg/mL

CYP2C19:• ML 3 - 5% caucasiens

20% japonais• MUR 3 – 7% caucasiensPolymorphisme gPolymorphisme g éénnéétique +++ tique +++

GGéénotypage du CYP2C19 notypage du CYP2C19 recommandrecommand éé par la FDApar la FDA(D. Allorge; CHU de Lille)(D. Allorge; CHU de Lille)


�� Posaconazole : Posaconazole : Biodisponibilité f°d’absorption


StratStrat éégies pour optimiser lgies pour optimiser l ’’absorption du posaconazoleabsorption du posaconazole

Prendre avec ou après un repas riche en graisse

Prendre avec un repas

Prendre avec un supplément nutritionnel

Prendre avec une boisson à faible pH

Fractionner la dose

Dans les cas d’absorption diminuée, penser à éviter les IPPKrishna et al. AKrishna et al. AAC. 2009 AC. 2009

X 3-4 ASCCmax


�� Posaconazole : Posaconazole : Biodisponibilité ~ adulteT½ = 25-30hElimination = forme inchangée 66%; Pgp

�� Dosage sDosage s éérique (HPLC)rique (HPLC)– C°résiduelle à J3-J5– Efficacité: Pas de fenêtre établie mais

une valeur cible > 0,7 mg/L(Muller 2006; Walsh 2007)(Muller 2006; Walsh 2007)


Perspectives: Perspectives: √√ Isoler (obtenir la souche !)√ Identifier l’espèce (niveau moléculaire)√ Recherche d’Ag (GM, BG)√ Recherche d’ADN aspergillaire√ Mesurer les CMI

√ Dosages sériques, STP+++ √ Documenter une résistance, Génotypage√ Mesurer l’impact clinique

CoCoûût: t:

< 20€

~ 5-10€~ 120€~ 30€

~ 40€ / 2C19 ~ 80€~ 150€

Coût moyen de ttt d’une AI = 32 00032 000 €€(Jansen et al. 2006(Jansen et al. 2006--2005)2005)

ConclusionConclusion

Aspergillus et Poumon, Aspergillus et Poumon, L Delhaes: 06/11/2009L Delhaes: 06/11/2009

Dunkerque, le 22 Juin 2009

�Évaluation et prise en charge du risque fongique chez les patients atteints de mucoviscidose en France PHRC1902 :

Analyse des résultats mycologiques en fonction des données bio-cliniques des patientsEn collaboration avec les Services de Biostatistiques et d’Épidémiologie du CHRU de Lille

File active ≈ 900 patients atteints de mucoviscidose

Bilan systématique Bilan face à une dégradation de la fonction pulmonaire

NEGATIF

≈ 700 patients

Cahier d’observation

Sérum Expectoration

Recherche d’Ac vis à vis d’Af

Techniques sérologiques

complémentairesCHU d’Angers, de

Lille, de Grenoble,

de Rouen &

de Bordeaux

Identification Mycologiqueaprès examen direct et culture

Identification Moléculaire CHU d’Angers,

de Lille, & de

Bordeaux

Séro-immunologie

Critère d’inclusion =

Génotypage CHU d’Angers,

de Lille,

& de Bordeaux

POSITIF

≈ 200 patients

Tous le

s CRCM

Tous le

s Labora

toires d

e M

ycologie

Centra

lisés d

ans

certa

ins labora

toires

de M

ycologie

Labora

toires d

e

Mycologie

& CRCM

Bilan mycologique

Phénotypage : chimiosensibilité

Phénotypage: Étude de la

thermotolérance& l’activité

protéolytiqueCHU de Grenoble

& de Lille

Niche écologiqueCH de Dunkerque,

CHU d’Angers, de Lille,

& de Bordeaux

Circulation du matériel biologique grâce aux mycothèques, sérothèques, & DNAthèques

Mise en place de contrôles de qualité inter-laboratoire pour limiter l’effet centre

••Objectif principal :Objectif principal : DDééterminer les terminer les espespèèces fongiques (filamenteux) ces fongiques (filamenteux) prpréésentes dans lsentes dans l’’expectorationexpectoration

••Objectifs secondaires :Objectifs secondaires : DDééterminer les terminer les facteurs associfacteurs associéés s àà leur prleur préésence sence

-- EnvironnementauxEnvironnementaux-- PathologiquesPathologiques-- ThThéérapeutiquesrapeutiques

Chez A. fumigatus , Relation (3D) : - Types d’azolés (Xiao et al. 2004) (Xiao et al. 2004) - Mécanisme d’action

- Localisation des mutations de Cyp51A

RRéésistance aux Azolsistance aux Azol éés : Donns : Donn éées moles mol ééculairesculaires

(Krishna G 2009; Lipp H 2008; Pascual A (Krishna G 2009; Lipp H 2008; Pascual A 2008; Sansone2008; Sansone--Parsons 2007; Padouin C Parsons 2007; Padouin C

2006; Muller 2006)2006; Muller 2006)

Fluconazole Itraconazole Voriconazole Posaconazole

Métabolisation 10-25% 95% 95% 1010--20%20%

1er passage hépatique 0 +++ HIZ+++ HIZ + 0

% liaison aux protéines 10-15 99 ~50 98

T1/2 (h) 30-35 34-72 6 25-31

Délai d’équilibration (j) 6-10 14-15 1-5 7-10

Concentration résiduelle « cible » (mg/L)

Pas de TDM 0.5 1- 5.5 0.7

CYP Inhibiteur

Substrat

2C19 + 2C9 ++ 3A4 ++

/

-2C9 +

3A4 +++

3A4+++

2C19 ++2C19 ++2C9 ++2C9 ++3A4 ++3A4 ++

2C19 +++2C9 +

3A4 ++

--

3A4 +++

3A4 ?Pgp +++

IAM: ITZ>VRZ>PSZ>FCZ Rifabutine>tacrolimus>ciclosporine, …

AzolAzoléés : Caracts : Caractééristiques pharmacologiquesristiques pharmacologiques

Delhaes et al., SFMM 2008

�� Identification molIdentification molééculaire culaire →→ Notion dNotion d’’espespèèce / section ce / section Ne pas confondre A. lentulus avec A. fumigatus (isolats multirésistants azolées + AMB + CAS)Balajee S, JCM 2009 – 2008Sections Fumigati, Flavi, Nidulantes

→→ CaractCaractéérisation molrisation molééculaireculaireColonisation chroniqueColonisation chronique(mucoviscidose)

� MMéécanisme de chimiorcanisme de chimioréésistance sistance GGéénotypage notypage →→ mutations de gmutations de gèènes ? nes ?

Diagnostic Biologique: Outils molDiagnostic Biologique: Outils mol ééculairesculaires

ActualitActualitéés en Mycologie: Conclusions en Mycologie: Conclusion

Test/Outil Intérêt Localement

DIAGNOSTIC

Surveillance environnementale Valider bionettoyage OUI

GM >0.5 ng/ml Critère mycologique d’AI OUI

BG En screening de MI ? 2008-09

Af-PCR Critère d’AI ? sur LBA: Déc 08 sur sérum: en 2009

SUIVI THERAPEUTIQUE

ATFgrammeAdaptation thérapeutique ?

2008

Recherche de mutations Cyp51A mi 2009

Typage moléculaire d’isolat A. lentulus ≠ fumigatus 2008

Dosages sériques ITC/PSC/VRC Monitoring Début 2009

Polymorphisme génétique Phénotype prédictif ? ?

Dérivés oxygénésHOClO2

?-

Anti-protéases :SLPI

Trappine 2

ProtéasesCathepsine G

Elatase

Cellules épithéliales

Macrophages alvéolaires

Polynucléaires neutrophiles

Chélateurs du ferLactoferrine

UnbiquicidineChitinase

Polynucléaires neutrophiles

Elastase

Importance de lImportance de l ’’ immunitimmunit éé inninn ééee

Pneumocytes de type II: SP-A, SP-D

CEMAPN

CE ?MAPN

PN

Cellules dendritiques

RI acquise : Renforcement de la réponse anti-aspergillaire

ééquilibre Th1 quilibre Th1 / Th2 / Th2 ≠≠ APIAPI(d(d’’apraprèès Balloy , 2009; Segal, 2009)s Balloy , 2009; Segal, 2009)

SPSP--A, SPA, SP--DD

* ** ** ** *

DCDC--SIGN ?SIGN ?

* *

* * DCDC--SIGN ?SIGN ?

Dectin Dectin --11

* *

* * * *

ββββββββ1,31,3--glucaneglucane

Dectin Dectin --11

TLR2TLR2TLR4TLR4TLR9 , MyD88, CD14 ?TLR9 , MyD88, CD14 ?

TLR2TLR2TLR4TLR4TLR9, MyD88, CD14 ?TLR9, MyD88, CD14 ?

* * * *

* * * *

* * * *

ChitineChitine

TNF-α

G-CSFGM-CSF

IL-10

IL-8

BiothBioth éérapierapie

corticothcorticothéérapierapie

NeutropNeutrop éénienie

corticothcorticoth éérapierapie

Granulomatose septique Granulomatose septique chroniquechronique

Polymorphisme Polymorphisme ggéénnéétique du tique du

promoteurpromoteurTh2Th2↑↑ = Allergie (ABPA)= Allergie (ABPA)

SSéérodiagnosticrodiagnostic

Récepteurs cellulaires(MA, CE)

TLR rôle important (cf transplantation)

Récepteurs solubles

B H. Segal, 2009B H. Segal, 2009..

ββββ-glucaneADN

PNN activés

API

APBA

Maintien de l’équi-libre entre contrôle de la charge fongique et allergie

PNN (≠ filaments)

Tolérance (≠ ABPA)

Mécanismes cellulaires et moléculaires des mycoses

Inhalation des conidies (2-3 µm)

2) Défense cellulaire : 1 ère ligne = Macrophages alvéolaires ≠ Spores non germées

Alvéoles pulmonaires

1) Défense mécanique : Barrière mucociliaire

3) 2ème ligne = Polynucléaires neutrophiles ≠ Spores pré-

germées et filaments mycéliensCellules phagocytaires (PN, M) Cellules phagocytaires (PN, M)

= D= Dééfenses innfenses inn éées es

EspEsp èèces Activces Activ éées des d ’’OO22

←→←→←→←→←→←→←→←→ Choc oxydantChoc oxydant

�� Germination in situ Germination in situ et contact avec cellules et contact avec cellules

éépithpith éélialesliales

+ mauvais drainage + mauvais drainage des spores des spores

enserrenserr éés dans s dans mucusmucus

Stimulation lymphocytaire Stimulation lymphocytaire ⇔⇔⇔⇔⇔⇔⇔⇔SSéécrcr éétion IgG et IgE tion IgG et IgE

spsp éécifiquescifiques

MucoviscidoseMucoviscidose

DissDiss ééminationmination

Latgé, 2007

Base du mBase du méécanisme de dosage des BG canisme de dosage des BG (d(d’’apraprèès Fungitell s Fungitell –– Cape Code) Cape Code)

Signes cliniques Pas de symptômes

Pas de symptômes

FièvreNeutropénie

Signes compatibles

avec infection

Signes cliniques/Radio

Signes mycologiques - GM+ - -GM+

Histologie

ED/Culture

TTT type Prophylaxie Préemptive Empirique Préemptive Dirigée

Efficacité TTT Oui ? Oui ? Oui

Définition EORTC No infection ? ? AI possible AI probable

AI prouvée

++++++++ TTT précoce ++++++++

R. Herbrecht 14/11/2008R. Herbrecht 14/11/2008

Approches thérapeutiques

11èère ligne thre ligne th éérapeutique des AI: rapeutique des AI: RecommandationsRecommandations

• ECIL 2007:– Voriconazole A1 (Walsh 2002)(Walsh 2002)

– Ambisome B1– Association Non recommandée

• IDSA 2008:– Voriconazole A1– Ambisome A1– Association Non recommandée (B2)Pas de recommandation spPas de recommandation sp éécifique en Pcifique en P éédiatriediatrie

Ttt de AI chez lTtt de AI chez l ’’enfant VIH+enfant VIH+A2A2B3 B3 (Mogenson 2009)(Mogenson 2009)

Aspergillose TrachAspergillose Trach ééoo--bronchique: Recommandationsbronchique: Recommandations• IDSA 2008:

– Voriconazole B2– Ambisome B2– D-AmB, LFAB aérosol C3

– Même CAT face à colonisation à A. fumigatus en pré-greffe

ABPA: RecommandationABPA: Recommandation• IDSA 2008:

– Itraconazole + corticosteroïde A1

Pas de recommandation spPas de recommandation sp éécifique en Pcifique en P éédiatriediatrie

Liaison avec l’ergostérol de la membrane cytoplasmique↑ perméabilité mais affinité au cholesterol des cellules

Inhibition de la synthèse de la C14-α d methylase↓ Ergosterol stérols toxiques

Inhibe la synthèse du β 1,3 D glucane� rupture de la paroi� instabilité osmotique et lyse cellulaire

Captée par la cytosine perméaseTransformée en 5 FU (cytosine désaminase)Altération de l’ARN

Thomson et al. 2009

SensibilitSensibilitéé in vitro in vitro aux ATFaux ATF

JRIH 15 /10/09 ; Schering-PloughEchec des azolEchec des azoléés : Actualits : Actualitéé

SensibilitSensibilitéé de ED/culture, GM etde ED/culture, GM etPCR en temps rPCR en temps rééel dans le LBAel dans le LBA

25%

69% 75%

25%66%

41%

GM : sensibilité la plus élevée = 66%mais spécificité +/- � réactions croisées

IntIntéérêt de la PCR rêt de la PCR en temps ren temps rééelel

Sensibilitécumulée des 3 tests = 75%

Contribution de la PCR en temps rContribution de la PCR en temps rééel auel au diagnostic ddiagnostic d’’API API : : ÉÉtude sur 32 LBA provenant de 25 patients de MDS, tude sur 32 LBA provenant de 25 patients de MDS,

atteints datteints d’’API prouvAPI prouvéée (5) ou probable (20) e (5) ou probable (20)

BETA-GLOBINE :Différence significative pour ED/culture et GM

Influence de la qualitInfluence de la qualitéé du du LBA LBA

sur lsur l’’interprinterpréétation des teststation des tests

� intérêt d’un seuil de béta-globine pour

l’interprétation de la PCR ?

Suivi

22/11/06 03/01/07 17/01/07 07/03/07 30/03/07 13/06/07 12/07/07 16/08/07 26/10/07 30/10/07 18/12/07 28/12/07

Sérologie Candida (ELISA)

Eos inophylie (109/ml)

Sérologie aspergillaire (arcs)

Antigénemie aspergillaire (GM-ELISA)

Posaconazole27/07/07

Évolution défavorable sous VFend + Caspo ⇒

ECBC: -

+ + +

P. aeruginosa + + + +

A. Fumigatus + + -

Itraconazole >32 R R R R RVoriconazole 2 S R II II IIPosaconazole 0.5 S S S S S

Illustration des rIllustration des réésistancessistances

A. fumigatus : Souche de référence (CBS 144.89)

Isolats d’A. F

umigatus de S

M

13/06/2007

12/07/2007

26/10/2007

30/10/2007

18/12/2007

Antifongigramme (CMI µg/ml):

AmphotécineB 0.38 SItraconazole >32 RVoriconazole 4 ICaspofongine 0.094 SPosaconazole 0.75 S

AmphotécineB 0.19 SItraconazole 0.5 S Voriconazole 0.19 SCaspofongine 0.32 SPosaconazole 0.094 S

AmphotécineB 0.094 SItraconazole >32 RVoriconazole 6 RCaspofongine 0.125 SPosaconazole 0.5 S


AmphotécineB 0.094 SItraconazole >32 RVoriconazole 2 SCaspofongine 0.064 SPosaconazole 0.5 S

Mutation du gène Cyp51A

Gly 54(Type sauvage)

Tous les isolats : N

on mutés en position 54


PCR finger-printingCBS144.89

Fig1: (GACA)4

Fig2: M13

18/12/07

30/10/07

26/10/07

12/07/07

13/06/07Met 220(mutation)

Isolats mutés en position 220

Rappel mycologique: Classification Dr L. Delhaes

Thalle unicellulaire (blastospores), Reproduction par bourgeonnement

Levures, genres: - Candida- Cryptococcus- Malassezia- Trichosporon

www.asm.org/Division/cphoto/calb1.jpg

www.higiene.edu.uy/.../parasito/Cryptococcus.jpg

www.doctorfungus.org/thefungi/img/geo2_l.jpg

Thalle : hyphes +/- ramifiés = mycélium

Biotope = sol & air

Exigences nutritives

Dermatophytes Kératine+++- Micropsorum- Epidermophyton- Trichophyton

Moisissures

Hyphe septé : Moisissures dématiées (noirs) ou hyalines(Asp, Scedo, Fus…)

Hyphe coenocytique(non septé) : Zygomycètes

www.cytology-asc.com/.../images/resp83li.jp

www.tolweb.org/tree/ToLimages/5.gif

Dimorphiques : Mycoses exotiques,

Histoplasma

pathmicro.med.sc.edu/mycology/hist11.jpg

Place du sérodiagnostic Dr L. Delhaes

Mise en Mise en éévidence des Acvidence des Ac

AspergillosesAspergilloses

Ac antiAc anti--aspergillaire : grande valeur diagnostic dans ABPA, aspergillaire : grande valeur diagnostic dans ABPA, AAE, aspergillome, AAE, aspergillome,

endocardite aspergillaire, endocardite aspergillaire, suivi des mucoviscidoses greffsuivi des mucoviscidoses grefféés pulmonaires pulmonaire

ELISA, Immunodiffusion Ouchterlony (+ ELISA, Immunodiffusion Ouchterlony (+ ≥≥ 3 arcs) reste un 3 arcs) reste un argumentargument

CandidosesCandidoses

ELISA, dELISA, d’’interprinterpréétation dtation déélicate licate des Ac antides Ac anti--candida (Ac anticandida (Ac anti--mananne)mananne)

car colonisation +++car colonisation ++++/+/-- couplcoupléée e àà AgAg

HistoplasmosesHistoplasmoses

Ag totaux pour immunodiffusionAg totaux pour immunodiffusionIDR IDR àà ll’’histoplasmine (+papule > 6mm histoplasmine (+papule > 6mm àà 48h) en 48h) en

zone dzone d’’endendéémie : intmie : intéérêt rêt éépidpidéémiologiquemiologique

AlvAlvééolites allergiques extrinsolites allergiques extrinsèèquesques

--Poumon de Fermier: actinomycPoumon de Fermier: actinomycèètes thermolabiles tes thermolabiles ((Micropolyspora faeniMicropolyspora faeni))

-- Poumon des Poumon des ééleveurs dleveurs d’’oiseaux: Protoiseaux: Protééines sines séériques ou riques ou fféécales dcales d’’oiseaux (pigeon, perruche)oiseaux (pigeon, perruche)

-- Poumon des endiviers: Poumon des endiviers:

PrPréésence de prsence de préécipitines scipitines séériques riques A CONFRONTER A CONFRONTER

au tableau au tableau éépidpidéémiomio--cliniqueclinique

Aspergillus fumigatus : deutéromycète (champignon imparfait)

Haploide (n)

Légende

Hétérocaryotique(noyaux non fusionnésdes différents parents)

Diploide (2n)

PLASMOGAMIE(fusion des cytoplasmes)

Stade héterocaryotique

CARYOGAMIE(fusion des noyaux)

Mycelium

REPRODUCTIONSEXUEE

Stade téléomorphe

Zygote

Spores

GERMINATION

MEIOSES

Asques

REPRODUCTION ASEXUEE

Stade anamorphe

Spores

GERMINATION

Tête aspergillaire

Conidies

Ascospore

SSéérodiagnosticrodiagnostic

ABPA = - Diagnostic difficile- Combinaison de critères

• cliniques, • radiologiques et • mycologiques

- Aspergillus fumigatus dans ECBC- IgE totale > 500 UI/ml- IgE anti-A. fumigatus (RAST3)- IgG anti-A. fumigatus (ELISA; Précipitines ≥ 3 arcs)

Electrosynérèse de Stéphanie M. du 29/05/2007Présence de 4 -5 arcs de précipitine spécifiques d’ A . fumigatusActivité chymotrypsique +

Sérumdu patient

Extraits totaux d’ Agd’ A. fumigatusd’ A. flavus

ActualitActualit éés sur les IgE sps sur les IgE sp éécifiquescifiques

• Allergènes « recombinants » : nombreuses protéines identifiées et clonées

• Aspergillus fumigatus : r Asp f 1,2,3,4,6

• Profil IgEs rAspf 1 et 3 ⇔⇔⇔⇔ sujet sensibilisé , allergie ou ABPA, non discriminatif

• rAsp f 2,4 et/ou 6 ⇔⇔⇔⇔ plus discriminatif de l’ ABPA ?

• Cinétique au cours ABPA ? Persistance IgE rAspf3 ?ENCORE BEAUCOUP DE QUESTIONS SANS RENCORE BEAUCOUP DE QUESTIONS SANS R ÉÉPONSE ?PONSE ?

C. Thumerelle et L. Delhaes 2008C. Thumerelle et L. Delhaes 2008

ActualitActualit éés sur les IgE sps sur les IgE sp éécifiquescifiques• Aujourd’hui :

IgE anti- rAsp f 2 et 4 ⇔⇔⇔⇔ plus discriminatif de l’ABPAIgE anti- rAsp f 6 (MnSOD)?

Knutsen 2004 : Knutsen 2004 : IgE anti- rAsp f 3 et 4

Casulta 2005 : Casulta 2005 : IgE totale > 1000 UI/ml, IgE anti- rAsp f 4 et 6 ↑: sensibilité de 64%, spécificité de 100%, VPP 100% et VPN 94%taux éleves de rAspf 4 et 6 après 12 mois d’évolution

Kurup, 2006 : Kurup, 2006 : rAspf4 dans diagnostic d’ABPAKraemer 2006: Kraemer 2006: rAspf4 et 6 dans ABPA / rAspf1 et 3 dans sensibilisation

ISHAM Juin 2009 : ISHAM Juin 2009 : 2 travaux (équipes de Grenoble + Brésil) en faveur de l’intérêt des rAspf en particulier 4 et 6

rAspf4 rAspf4 ↑↑Latzin 2008 : Latzin 2008 : TARC dans diagnostic d’ABPA ?

Mise en évidence du

micromycète (ED, Culture, PCR)

Détection d’Ag

circulants (GM)

Détection d’Ac circulants

(Précipitines ou IgG)

ABPA +/-

(Filaments mycéliens)

+++

AAE - +++

Aspergilloses immunoallergiques

Asthme -

- Pas d’Ac précipitants

Aspergillome ++

(Tête aspergillaire)

++ Activité catalasique

Activité chymotrypsique Aspergillose localisée +

(Tête aspergillaire) +

Aspergillose invasive +++

(Filaments mycéliens) (LBA, biopsie)

++++ -

ActualitActualit éé en Microbiologieen Microbiologie

PCR (ADN)PCR (ADN)

Standardisation→ Pb de support : - Quelle fraction de sang ? Sang Total / sérum ?

- LBA +++ (Fr(Frééalle, Khot 2008)alle, Khot 2008), biopsie, coupe fixée

→ Pb de méthodologie: - Extraction (automatisable Francesconi 2008Francesconi 2008); - Contrôle interne / Gène humain (ratio)- Gène cible (ADNr, gènes mitochondriaux); - PCR en temps réel +++ (quantification : qPCR)

Validation→ Sensibilité analytique: 1-10 fg ADN fongique (Costa 2002; Hope 2005; Khot 2008)(Costa 2002; Hope 2005; Khot 2008)

→ Sensibilité (60%-80%) / spécificité cliniques variables, < GM mais VPN très bonne (95%, Cesaro 2008Cesaro 2008)

→→ Non inclus Non inclus comme comme CritCritèère dre d’’AI / MI AI / MI en 2008 De Pauw; Walsh)en 2008 De Pauw; Walsh)

•• Saprophytes Saprophytes : baisse de fongicidie des défenses immunitaire +/- séquelles d’une pathologie pulmonaire ancienne � persistance locale d’A. fumigatus :

aspergillome (1 / 6000 hospitalisations), colonisation bronchique, bronchiteaspergillaire.

•• Immuno allergiques Immuno allergiques : Réaction immunitaire exagérée au contact d’A. fumigatus(patient généralement atopique) :

aspergillose broncho-pulmonaire allergique (ABPA) (incidences : 5 à 15% si mucoviscidose et 2% si asthme), asthme aspergillaire, sinusite allergique aspergillaire, alvéolite allergique extrinsèque.

•• InvasivesInvasives : immunodépression intense (neutropénie +++) +/- autre pathologie pulmonaire � dissémination d’A. fumigatus vers un ou plusieurs organes :

aspergillose pulmonaire invasive (API) (incidences : 5 à 11% en hématologie, 2 à 6% si transplantation, 5% si VIH ; BPCO associée dans 2% des décès d’API), aspergillose trachéobronchique nécrosante, aspergillose pulmonaire chronique nécrosante (APCN).

Les aspergillosesLes aspergilloses

� Mortalité 70 à 90% (Balloy , 2009)

Examen direct et cultureExamen direct et culture(expectoration, aspiration

bronchique, biopsies)++++

(LBA, biopsie pulmonaire)++++++

Aspergillome, ABPA, APCN, aspergillose trachéobronchique

nécrosante

SSéérologierologie

+/+/-- àà ++++++

+/+/--

Outils conventionnels Outils non conventionnels

API

Recherche dRecherche d’’ADNADN

(sang, LBA, biopsies)++

Recherche dRecherche d’’AntigAntigèènene

(sang, LBA)++++++

Diagnostic mycologique des aspergillosesDiagnostic mycologique des aspergilloses

PCR (ADN)PCR (ADN)

PCR aspergillaire dans le sang/serum(Cuenca(Cuenca--Estrella; TMM3 octobre 2009)Estrella; TMM3 octobre 2009)

→ Pas de kit commercialisé

→ Nécessité de standardiser→ Pour un screening: Sensibilité élevé + VPN excellente→ Pour le diagnostic: Sensibilité élevé + VPP excellente → En combinaison avec les autres tests (GM, BG)→ Pour un diagnostic précoce (ttt)

Continuer à travailler !

TDM posaconazole car:• PK linéaire mais pb absorption

• Pas de Métabolisme hépatique maisgrande variabilité individuelle

• Puissant inhibiteur du 3A4, IAM++• ASC(24h) / CMI = 200, bon

paramètre de prédiction de l’évolution

• [pos] minimale efficace = 0,7µg/mL

• Voie orale: [vori]ss pic 2,1 - 4,8 µg/mLcreux 1,4 – 1,8 µg/mL

FIG. 2. Effects of C3435T polymorphism on the pharmacokinetics of posaconazole. SansoneSansone--Parsons et al. AAC 2007; Parsons et al. AAC 2007; Walsh et al. CID 2007Walsh et al. CID 2007

Polymorphisme gPolymorphisme g éénnéétique ? tique ? GGéénotypage du mdr1 ? notypage du mdr1 ? Relation non dRelation non d éémontrmontr éée e àà ce jource jour


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Pathog nies et m thodes diagnostiques - SP²A °°° La … et Poumon: Pathog énie et m éthodes diagnostiques Dr Laurence Delhaes Service de Parasitologie-Mycologie Département