PCR (polymerase chain reaction) - Bioinformatics Graz · pcr cycle number amount of dna 1 10 100 1000 10000 100000 1000000 10000000 100000000 1000000000 10000000000 0 5 10 15 20 25

Molekulare Diagnostik

1Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr.Andreas Prokesch

PCR(polymerase chain reaction)

Definition:Ist ein in vitro Verfahren zur selektiven Anreicherung von Nukleinsäure-Bereichen definierter Länge und definierter Sequenz aus einem Gemisch von Nukleinsäure-Molekülen



PCR-History• Erfunden 1983 von Dr. Kary Mullis• Er erhielt 10 Jahre später den Nobelpreis für

Chemie• Seit 1992 tausende Zitate in Publikationen • PCR hat extrem viele Anwendungsgebiete

(Vaterschaftstest, Gerichtsmedizin, Krankheitsnachweise, Sequenzierung…..)



Prinzip PCR• Welche Nukleinsäuresequenz soll

amplifiziert werden?• Welche DNA wird als Vorlage-Template

verwendet (Genomische, cDNA…)

• Primer setzen und suchen (Kriterien)• Temperaturprogramm wählen• DNA aus PCR Gemisch isolieren• Weiterverwendung der isolierten DNA



Primer setzen und suchen

• Primer im Randbereich der zu amplifizierenden Sequenz setzen (5´- 3´Amplifikation)

• Komplementär zu je einem Strang• Parameter:

– Primerlänge– Ampliconlänge– Schmelztemperatur (Verhältnis G:C zu A:T beachten!!)– 3‘ clamp– Primerdimere vermeiden



PCR-Gemisch

• Template DNA (100 ng cDNA, 500 ng genomische DNA)

• Primer (10 µmolar)• DNA-Polymerase Taq (Bakt Thermus aquaticus)• dNTPs (Nukleosidtriphosphate)• PCR-Puffer• dd H2O• Optionale Zusätze: MgCl2, DMSO



Temperatur- und Zeitprogramm• Denaturieren zum Einzelstrang (94°C, 30 sec)• Anhybridisieren der Primer (Annealing, 30 sec)

kommt auf die Schmelztemperatur der Primer an:je höher die Temperatur umso spezifischer das PCR-Produkt

• Amplifizieren mittels DNA-Polymersase (72°C, 2-4 min)kommt auf Größe des Produkts an!!mittels hitzestabiler Taq-Polymerase(proof reading oder nicht?)





Kontrolle und Isolierung der DNA aus PCR Gemisch

• Gelelektrophorese:– Wie groß ist das erwartete PCR-Produkt?– Welches Agarosegel verwendet man (meist 0,7-2%)?– Ist nur ein Produkt sichtbar oder mehrere?

bei vielen Banden unspezifische PCR– Ausschneiden der spezifischen DNA-Bande aus dem

Gel– Isolieren der DNA aus dem Gelstückchen (Kit)– Sequenzierung



Laufrichtung DNA auf Agarosegel



Agarosegel zur Auftrennung des PCR-Gemisches



Agarosegel zur Auftrennung des PCR-Gemisches



Einsatzmöglichkeiten der PCR• Amplifikation von DNA Bereichen• cDNA-Klonierung und cDNA-Genbanken• Herstellung von cDNA-chips • DNA-Foot- & Fingerprinting• DNA und RNA (cDNA)-Sequenzierung• Isolierung, Markierung und Mutagenisierung von DNA-

Fragmenten• Diagnostik:

– Gen-Diagnostik (genetische Erkrankungen)– Krebsdiagnostik: genomische Translokationen– Diagnostik infektiöser Krankheiten



REAL TIME PCR(= quantitative PCR (qPCR))

• Real time PCR systems• Fluorescence chemistry• Analysis



Real-time PCR for gene expression analysis

2a. excitation filters

2b. emission filters

1. halogen tungsten lamp

4. sample plate

3. intensifier

5. CCD chip

Allows real time monitoring of PCR amplification products by use of fluorescenceFirst step: Reverse transcription of RNA into complementary DNA (cDNA)Mainly semi-quantitative measurement (qPCR)Highly sensitiveUsed in research lab and clinical diagnostic labs

Real time-PCR systems















Importance of primers in PCR

• specific• high efficiency• no primer-dimers• Ideally should not give a DNA signal

– cross exon/exon boundary

EXON 1 EXON 2INTRON 2 DNA

EXON 1 EXON 2 RNA

Real time-PCR chemistries



Fluorescence chemistry for real-time PCRSybrGreen intercalating dye:TaqManTM probe uses FRET

(Flueorescent resonance energy transfer):




TaqManBiomaterials

21Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Andreas Prokesch













Fluorescence resonance energy transfer











Passive dye

TaqMan reporter

TaqMan reporter

TaqMan quencher












Real time-PCR analysis



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400000000

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800000000

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PCR CYCLE NUMBERA

MO

UN

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1001000

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10000000000

0 5 10 15 20 25 30 35

PCR CYCLE NUMBER

AM

OU

NT

OF

DN

A

CYCLE NUMBER AMOUNT OF DNA0 11 22 43 84 165 326 647 1288 2569 512

10 1,02411 2,04812 4,09613 8,19214 16,38415 32,76816 65,53617 131,07218 262,14419 524,28820 1,048,57621 2,097,15222 4,194,30423 8,388,60824 16,777,21625 33,554,43226 67,108,86427 134,217,72828 268,435,45629 536,870,91230 1,073,741,82431 1,400,000,00032 1,500,000,00033 1,550,000,00034 1,580,000,000

Plotting PCR in real-time




34

Reference genes

• same copy number in all cells• expressed in all cells• medium copy number advantageous

– correction more accurate• reasonably large intron• no pseudogene• no alternate splicing in region you want

to PCR



Importance of controls

• negative control (no DNA)– checks reagents for contamination

• no reverse transcriptase control– detects if signal from contaminating DNA

• positive control– checks that reagents and primers work– especially importance if trying to show

absence of expression of a gene



Amplification curve to determine realtive expression values

Output: relative fold-change(for semiquantitative qPCR)




Melting curve as quality control for SybrGreen assays




Diagnostic use of real-time PCR

• Quantitatively measurment of Human Immunodeficiency Virus (HIV)• Detection of Thalassemia, hemophilia, sickle cell anemia & favism by

real time PCR• Cystic fibrosis• Phenyl ketonuria• Use in forensic medicine• Noninvasive Prenatal Diagnosis by Analysis of Fetal DNA in Maternal

Plasma• Detection and Quantitation of Circulating Plasmodium falciparum DNA• Effect of antimicrobial peptides on host cells• …



Pros and cons of real-time PCR

• Pros– Simple– Low cost– Good sensitivity– High dynamic range

• Cons– Big reaction volumina– Dependence on reference genes– Limited specificity (especially with

SybrGreen)– No absolute quantification!!!

Limited use for detection of allelic imbalances, Limited use for detection of allelic imbalances, exact copy number variations and rare mutationsexact copy number variations and rare mutations



Digital PCR

Emulsion Array Chip



Digital PCR - Principle

•Sample partitioning via limited dilution•Detection via fluorescent probes•Read out: positive or negative reaction (0 or 1)•Absolute quantification by counting of positive reactions



Emulsion-based system(QX100 Droplet Digital PCR, Biorad)

http://www.youtube.com/watch?v=Qwma-1Ek-Y4



http://www.youtube.com/watch?v=1ltLsAosmY0

Array-based system(OpenArray Digital PCR, Life Technologies)



Array-based Capillary System(Biomark DigitalArray, Fluidigm)

http://vimeo.com/14655746



dPCR facilitates detection and dPCR facilitates detection and quantification of...quantification of...

•• Rare mutationsRare mutations•• Copy number variationsCopy number variations•• Karyotypic events (cytogenetics)Karyotypic events (cytogenetics)•• LowLow--level pathogenslevel pathogens•• Gene expression in single cellsGene expression in single cells•• Clonal amplification of nucleic acidsClonal amplification of nucleic acids



The PCR songhttp://www.youtube.com/watch?v=_zxr-52KwKo&feature=related

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