-
Amplificacin de DNA in vitro:PCR (Polymerase Chain Reaction)
Laboratorio de GenticaBIOL 3300L
-
ObjetivosConocer:
Los fundamentos de la tcnica de amplificacin de DNA por PCR
Usos y aplicaciones del PCR
Ventajas y desventajas del PCR
Mtodos de secuenciacin de DNA
-
PCR Polymerase Chain Reaction Es la amplificacin de DNA in vitro
por medio de la polimerizacin en cadena de DNA utilizando un
termociclador.
El propsito del PCR es hacer muchas copias de un fragmento de
DNA.
Se realiza la amplificacin de un segmento especfico de DNA,
teniendo poco material disponible.
-
Polimerasa Chain Reaction: Reaccin en Cadena de la
Polimerasa
Fue diseada por el Dr. Kary Mullis en 1987.
Gan el premio Nbel de Qumica en 1993 por su invento.
Utilizo el PCR para amplificacin del gen de -hemoglobina humana,
y el diagnostico prenatal de anemia falciforme.
-
TermocicladorLa PCR se realiza en un Thermo Cycler
Termociclador.
Es una mquina que calienta y enfra la reaccin en periodos cortos
de tiempo.
-
1. Desnaturalizacin: Consiste en separar la doble hebra de DNA y
convertirla en hebra sencilla. -Tpicamente se usa una temperatura
de 95C - 97C, por 15 a 40 segundos el tiempo depende del tamao del
genoma-
El proceso de PCR incluye 3 pasos bsicos que se repiten 25 veces
o ms:
-
2. Apareamiento o anneling:Los cebadores primers previamente
diseados, reaccionan con la hebra sencilla de DNA y se pegan en
lugares especficos por complementariedad de bases. Para esto, se
baja la temperatura -ej: 55C por 30 segundos-. La temperatura y el
tiempo puede variar entre cebadores segn sea el caso.
-
3. Polimerizacin o Extensin. Una Polimerasa de DNA extiende los
primers, en el espacio comprendido entre ambos primers, y coloca
dinucleotidos trifosfatados (dNTPs) de 5a 3 leyendo el DNA de 3a 5.
De estas forma sintetiza la secuencia complementaria de las hebras
de DNA molde
Se efecta a 70C por 1 minutos (puede variar segn sea
necesario)Los pasos 1, 2 y 3 se repiten cuantas veces sea
necesario.
-
En el PCR hay una amplificacin exponencial
-
Reactivos necesarios para PCR:Amortiguador (Buffer): 50mM KCl,
10mM Tris. Cl (pH 8.3 a temperatura ambiente) y 1.5 mM MgCl2.MgCl2:
Puede estar en forma de MgCl2, MgSO4. Se usa 25mM -Es un cofactor
para la funcin de la polimerasa-dNTPs (Dinucleotidos
trifosfatados): dATP, dGTP, dCTP, dTTP.-La concentracin de dNTPS,
es proporcional al tamao del fragmento que se desea amplificar. Ej:
Si vamos a amplificar un fragmento de 500pb vs uno de 5500 pb,
necesitamos ms concentracin de dNTPS para el de
5500pb.-Generalmente, se usa una concentracin de 200M de cada
uno.
-
Reactivos necesarios para PCR:Cebadores primers: Son secuencias
cortas de nucletidos 20-24 nucletidos de longitud, complementarias
a una regin del DNA que se quiere amplificar. -Se usa a
concentracin de 1M-DNA molde: El DNA a amplificar puede tener desde
50 a 2,000 nucletidos de longitud.El mnimo va de 10-100 ng. y el
mximo entre 400-500 ng. Polimerasa: Generalmente se usa 2 unidades
por reaccin.
-
ADYUVANTES DE LA PCR
Son elementos que mejoran el rendimiento y la especificidad de
la PCR.
Se usa DMSO, glicerol o BSA.
El adyuvante ms utilizado es el BSA. A concentraciones por
encima de 0.8 g/l el BSA incrementa la eficiencia de la PCR ya acta
como una protena captadora de iones que pueden ser inhibidores de
la Taq polimerasa
-
En un principio, la polimerasa de DNA que se utilizaba era de la
bacteria E. coli, pero esta es sensitiva a alta temperatura, por lo
que haba que aadir enzima fresca al comenzar el tercer ciclo.
Se reemplazo la enzima por la de la bacteria Thermus aquaticus
conocida como Taq polPolimerasa
-
Anlisis de la MuestraLa deteccin del producto de la PCR se
realiza normalmente mediante corrido electrofortico.
Dependiendo del tamao de la amplificacin y la resolucin que
deseemos utilizaremos diferentes medios (agarosa, poliacrilamida) a
distintas concentraciones.
-
Anlisis de la Muestra La posterior visualizacin se puede
realizar con bromuro de etidio (lmpara de luz UV), tincin de plata,
fluorescencia, radioactividad Ladder: pesos conocidos1: Fragmento a
1857 pb2 y 4: Fragmento a 800 pb3: No hay producto 5: Multiples
bandas (primers inespecficos se pegan a varios sitios)
-
Anlisis de la Muestra En algunos casos, los productos
amplificados poseen secuencias que son reconocidas por
endonucleasasHibridacin, Southern Blot
-
Aplicaciones Se puede amplificar directamente de:ADN genmicocDNA
(RT-PCR)Deteccin de agentes infecciosos como: hepatitis B y C,
papiloma virus, HIV, entre otros Anlisis de DNA de cualquier
organismo vivo o muerto, anlisis de fsilesMutagnesis dirigida
(cambios en la informacin contenida a travs de primers con
mutaciones)Investigacin forensePruebas de paternidad
-
Aplicaciones
Ejemplo de un caso de criminalstica resuelto utilizando
electroforesis en gel vertical de acrilamida.
Si se observan los patrones bandas podr comprobarse como los
perfiles obtenidos en las manchas de sangre encontradas en el
sombrero (Hat) y pantaln (Jeans) del sospechoso (S) coinciden con
el perfil gentico de la vctima (V) Criminalstica
-
Utilidad del PCR
-
Ventajas del PCRA partir de una muestra pequea de ADN se puede
obtener una cantidad considerable para el estudio que se vaya a
realizar.El producto se puede utilizar para clonar, secuenciar y
anlisis.Se puede amplificar ADN de cualquier organismo vivo o
muerto.Sus aplicaciones son mltiples: medicina forense,
diagnsticos, anlisis prenatales, etc.
-
Desventajas del PCRSe puede reproducir solamente partes del
genoma en donde se conoce por lo menos una mnima secuencia de 20 40
pb.Se necesitan primers especficos que sean complementarios al
fragmento que se desea sintetizar.La polimerizacin puede tener
errores al sintetizar el ADNPuede contaminarse con otro ADN (puede
ser del mismo investigador o de cualquier otro)
-
Materiales Para PCRTermociclador Thermo
cyclerMicrocentrfugaMicropipetas de 2, 20 y 200 ulMicrotubos para
PCR, estrilesPuntas estrilesAgua destilada, desionizada y estrilADN
molde (ADN en estudio)Primer Forward y ReversedNTPs (dATP, dTTP,
dCTP, dGTP de [25 M] c/u)10X buffer para PCR (Solucin amortiguadora
para PCR)MgCl2 (25 mM)BSAPolimerasa Taq
-
Fenotipo Puertorriqueo
-
Herencia del DNA mitocondrialAmplificaremos una region
hipervariable. Genoma de 16571 pares de bases: Hebra pesada (H),
Hebra liviana (L). Primer Directo H34, primer reverso L15829
-
Procedimiento para extraccin del DNA genmico (previamente
realizado)Se realiz un frotis bucal El contenido del hisopo swab se
resuspende en 1000ul de NaCl 0.9%Centrifugar por 5 minutos a
7KDescarta sobrenadanteResuspender el precipitado pellet en 500ul
de chelex al 10%Incubar a 100C por 20 minutosCentrifugar por 5
minutos a 7KTomar el sobrenadante ( DNA en solucin)Dejar la muestra
a -20 grados hasta cuando se va a trabajar con ellaNota: El chelex
acta como agente desestabilizador de membranas y quelante.
-
Diagrama de la extraccin del DNA genmico (previamente
realizado)
-
Procedimiento para amplificar el DNA (PCR)Aada los siguientes
reactivos en el orden indicado:
Mix 117.3Mix 22.7Total: 25 ul
-
Condiciones para reaccin en el termociclador:1 ciclo : 94C por
2.5 minutos.32 ciclos: 94 C por 30 segundos 54 C por 1 minutos 72 C
por 70 segundos1 ciclo: 72 C por 10 minutos Lleve a reaccionar en
el termociclador.
-
Secuenciacin de DNAMtodo enzimtico de terminacin de cadena
(mtodo dideoxi de Sanger)Polimerizacin interrumpida de ADNSe lleva
a cado polimerizacin de ADN en presencia de derivados dideoxi que
detienen la polimerizacin en diferente momento, obtenindose
fragmentos de diferente tamao.Se examinan en electroforesis, se lee
secuencia directamente del gel
-
Mtodo dideoxi de Sanger
-
Mtodo dideoxi de Sanger (2)
-
Mtodo dideoxi de Sanger (3)
-
Mtodo secuenciacin automtica
-
Electroferograma de la secuenciacin automtica
-
Geles de secuenciaSecuencia automticaSecuencia Manual
-
Direcciones de animacionesDireccin
PCRhttp://www.sumanasinc.com/webcontent/anisamples/molecularbiology/pcr.htmlDireccin
de
secuenciacinhttp://smcg.cifn.unam.mx/enp-unam/03-EstructuraDelGenoma/animaciones/secuencia.swf
