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Presentación de las generalidades, tipos y formas de detección de esta tecnica
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La PCR en tiempo real es una variante de la PCR donde que se emplea para la cuantificación de muestras de
ADN
En esta técnica se usan sondas que son oligonucleótidos que presentan fluorocromos en ambos extremos y tienen una secuencia complementaria a parte del
fragmento de ADN que se quiere amplificar.
Que es PCR La PCR (polimerase chain reaction) es una técnica con la que se pueden producir varias copias de un fragmento de ADN especifico millones de estas incluso en la presencia de otras células,los únicos requerimientos es que este la materia prima para fabricar el ADN y una pequeña cadena de ADN que se pueda unir a la cadena que vamos a copiar la cual se llama primer o cebadora.
Es una técnica se fundamenta en la propiedad natural de las ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual emplea ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que vuelvan a unirse las polimerasas para que vuelvan a duplicarlas.
Aplicaciones Cuantificación viral
Control de eficacia de fármacos
Detección de patógenos
Diagnostico de tumores
Cuantificación de expresión génica
Reactivos necesarios 4 desoxirribonucleósidos-trifosfato (dNTP), sustratos para polimerizar nuevo ADN.
2 cebadores o primers que delimitan la zona de ADN a amplificar
ADN molde donde se contiene la región de ADN que se va a amplificar
1 iones monovalente
1 iones divalentes
Sistemas de detección usados en pcr en tiempo real
Sist. de Detección
Colorantes de unión al ADN
Oligonucleótidos específicos
Sondas fluorescentes
Primers fluorescentes
Las tecnologías fluorecentes usadas incluyen
Colorantes de unión al ADN
Sondas que fluorecen luego de su hidrolisis (sondas taqman)
Sondas de hibridación
SYBER Green Con sucesivos ciclos se va acumulando el producto de la reacción ,en el cual se intercala el colorante aumentando la fluorescencia emitida en cada ciclo
Ventajas • el mismo colorante puede usarse
en diferentes blancos de amplificación
• Relativamente económico• Fácil optimización de las
condiciones de reacción
Desventajas • La presencia de de dímeros de
primers y de amplificaciones inespecíficas generan falsos positivos
• Es necesaria una curva de disociación
• No permite realizar PCR multiplex
PCR en tiempo real: Detección mediante sondas de hibridación
El método utiliza dos primers (F y R) y dos sondas marcadas con fluorocromos, las cuales hibridan adyacentemente
Ventajas y desventajas Son sondas marcadas con dos tipos de fluorocromos, un donador y un aceptor. El proceso se basa en la transferencia de energía fluorescente mediante resonancia (FRET) entre las dos moléculas.
PCR en tiempo real: detección mediante sondas de hidrolisis
Se lleva a cabo mediante la hibridación con una sonda complementaria a una región interna de la secuencia blanco, previamente a la amplificación. Tm sonda debe ser 10ºC > que el de los cebadores, de modo que hibride antes que los mismos.
Ventajas y desventajas
ventajas• Incremento en la especificad de la
reacción• Permite la realización de PCR
multiplex• Permite realizar discriminación
alélica mediante uso de sondas ASO
desventajas
• Debe diseñarse una sonda diferente para cada blanco a estudiar
• Relativamente mas costosa
Sondas beacon Estas son similares a las sondas de hidrolisis, tienen una molécula donadora en el extremo 5’ y una aceptora en el extremo 3’ pero, además, presentan una estructura secundaria en forma de asa, en la que reside la secuencia de unión específica con el ADN diana.