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Im Rahmen der Immunantwort gegen Krebs sind an der inhibitorischen Co-Stimulation verschiedene Moleküle und Rezeptoren auf T-Zellen, Antigen-präsentierenden Zellen und teilweise auch den Tumorzellen betei-ligt, beispielsweise PD1* und seine Liganden PD-L1* und PD-L2*. Somit können Tumor-zellen selbst oder via tumor-assoziierter Makrophagen diesen Immun-Checkpoint zur Induktion einer T-Zell-Anergie „miss-brauchen“. Auf diese Weise entgehen sie der Zerstörung durch das Immunsystem. Die Expression von PD-L1 kann dabei adap-tiv bei T-Zell-Aktivierung via Interferon auf Immun- und Tumorzellen hochregu-liert werden oder das Potenzial liegt in den Tumorzellen konstitutiv vor.

Eine PD-L1-Expression ließ sich bereits in diversen Tumorentitäten nachweisen (Tab.  1).1 Allerdings wurden in diesen Untersuchungen verschiedene diagnosti-sche Antikörper, Detektionssysteme/IHC-Plattformen und Cut-off-Werte verwendet

und auch der PD-L1-exprimierende Zelltyp (Tumor- oder Immunzellen) ist nicht immer angegeben. Dies macht die Vergleichbarkeit der Daten schwierig und führt zu teilweise recht unterschiedlichen Positivitätsraten. Besonders häufig exprimieren „immuno-gene“ Tumorentitäten das PD-L1, wie z. B. maligne Melanome, nicht-kleinzellige Lun-gen-, Urothel- und Nierenzellkarzinome.2–11

ImmuntherapieImmun-Checkpoints sind ideale Ansatz-punkte für zielgerichtete Therapien: Mono-klonale Antikörper, gerichtet gegen Mole-küle eines Immun-Checkpoints, blockieren die Tumor- und/oder Immunzell-induzierte T-Zell-Inaktivierung. Diese „Checkpoint-Inhibitoren“ (z. B. Anti-CTLA4, Anti-PD1 und Anti-PD-L1) stellen eine völlig neue Therapieform für verschiedene Malignome dar. Sie können zu starken und dauerhaf-ten anti-tumoralen Immunantworten füh-ren - auch bei Tumorentitäten, mit bislang geringen Ansprechraten auf konventionelle Chemotherapien (z. B. malignes Melanom, Nierenzell-, Urothelkarzinom).

Mittlerweile sind verschiedene Check-point-Inhibitoren klinisch zugelassen, meist in der Zweitliniensituation (Nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom/NSCLC, Malignes Melanom, Nierenzellkarzinom) und ohne obligate Begleitdiagnostik. Bei neueren Checkpoint-Inhibitoren oder der Anwendung in der Erstlinien-/Kombina-tionstherapie belegen Studiendaten aber den klinischen Nutzen einer prädiktiven Biomarker-Diagnostik.3,12

Erkennung, Angriff und Zerstörung von Krebszellen durch das Immunsystem ist ein mehrstufiger Prozess. Eine entscheidende Rolle dabei spielen co-stimulatorische und co-inhibitorische Moleküle, die die Aktivität zytotoxischer T-Lymphozyten regulieren. Nach erfolgter T-Zell-Stimulation verhindert eine inhibitorische Co-Stimulation am soge-nannten Immun-Checkpoint eine überschie-ßende Immunantwort bzw. Autoimmunität. Tumorzellen können diesen physiologisch ausbalancierten Regelkreis „missbrauchen“ und so der Eliminierung durch das Immun-system entgehen. Dem gegenüber ist die gezielte Blockade von Immun-Checkpoints Ansatzpunkt für neue Behandlungskonzepte bei Krebspatienten (Immuntherapien). Bio-marker wie das PD-L1 scheinen im Rahmen einer Anti-PD-L1-Therapie für die Prädik-tion des Therapie-Ansprechens hilfreich. Aufgrund der bisher heterogenen Studien-designs laufen Harmonisierungsstudien, um die Vergleichbarkeit diverser Testsituationen zu überprüfen.

PD-L1 als neuer BiomarkerProf. Dr. Gustavo Baretton, Institut für Pathologie, Universitätsklinikum Dresden

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Medizin | PD-L1 als neuer Biomarker | Diagnostik im Dialog • Ausgabe 51 • 12/2016

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Diagnostik im Dialog • Ausgabe 51 • 12/2016 | PD-L1 als neuer Biomarker | Medizin

Prädiktive Biomarker Wie bei allen zielgerichteten Therapien stellt sich auch bei den Immun-Check-point-Inhibitoren die Frage nach geeig-neten Biomarkern, die das Therapie-Ansprechen voraussagen (prädiktive Diagnostik). Dabei unterscheidet man die sogenannte „Companion“-Diagnostik, als eine für die Stratifizierung obligate, von den Zulassungsbehörden vorgeschrie-bene Testung und die fakultative, soge-nannte „Complementary“-Diagnostik, die bei Behandlungsintention zur Entschei- dungsfindung beiträgt.

Der höchste prädiktive Stellenwert sowohl bei Anti-PD1- als auch Anti-PD-L1-The-rapien wird derzeit dem immunhistologi-schen Nachweis der PD-L1-Expression der Tumorzellen zugeschrieben. Die Bedeu-tung einer PD-L1-Expression auf tumo-rassoziierten Immunzellen (Makrophagen und Lymphozyten) muss im Kontext mit dem verwendeten Assay (s.  u.) und der jeweiligen Tumorentität beurteilt werden. Die IHC-Bestimmung des PD1-Rezeptors dagegen ist für die prädiktive Diagnostik nicht relevant.

Im Gegensatz zu anderen Biomarkern, z. B. dem EGFR-Genstatus, bei dem der Nach-weis eines Wildtyps das Ansprechen auf eine EGFR-Inhibition praktisch ausschließt, ist der prädiktive Wert des „PD-L1-Status“ lediglich als Wahrscheinlichkeitsangabe zu werten: Je höher die PD-L1-Expression, desto wahrscheinlicher das Ansprechen auf die Checkpoint-Inhibition.

Als weitere potenzielle prädiktive Biomarker werden diskutiert: O die IHC-Bestimmung des PD-L2-Status

(allerdings ist derzeit kein valider PD-L2-Assay verfügbar)13

O der MSI-Status** der Tumorzellen14

O die Quantifizierung tumorinfiltrierender Lymphozyten (bislang nicht ausreichend standardisiert/reproduzierbar)15

O als nicht-histologischer Marker die soge-nannte Mutationslast („mutational bur-den“), entsprechend der Gesamtmenge an kodierenden Mutationen in der Tumor-DNA bei Exom-Sequenzierung (aufwändig, teuer).16,17

PD-L1-Assays Unabhängig vom verwendeten Testsystem wird für die PD-L1-Expression (Abb.  1) nur eine membranöse Anfärbung unabhän-gig von der Färbeintensität gewertet. Somit muss die Auswertung bei hoher Vergröße-rung erfolgen, um auch eine schwache Aus-prägung zu erfassen. Eine zytoplasmatische Färbung ist ohne Bedeutung, gleiches gilt für abgeschilferte Tumorzellen und Ne- kroseareale. Das Ergebnis lautet „% PD-L1 positive Tumorzellen/TC“ und entspricht dem „PD-L1-Status“.

Immunzellen müssen getrennt evaluiert werden, falls der Checkpoint-Inhibitor auch für dieses Kriterium zugelassen ist (Abb. 1).

Aufgrund des Begriffes „PD-L1-Status“ erscheint das aus verschiedenen Untersu-chungen gewonnene Biomarkerbild homo-gen, ist es aber in der Realität nicht. Die Zulassungsstudien weisen erhebliche Vari-anzen auf (Tab. 2):O unterschiedliche AntikörperO unterschiedliche Auswerte-AlgorithmenO verschiedenen Auswerter (meist spe-

zifisch ausgewiesene „zentrale“ Diag-nostikprovider – i. d. R. nicht durch die Firmen selbst)

O retrospektive (z. B. Merck und BMS) bzw. prospektive (Roche) Testung (Tab. 2).

Tab. 1: Prävalenz der PD-L1-Expression in verschiedenen Tumorentitäten (Quelle: Roche)NSCLC: Nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom; RCC: Nierenzellkarzinom; HNSCC: Kopf- und Halskrebs; CRC: Kolorektales Karzinom. Die Expression von PD-L1 wurde mit dem von Genentech/Roche entwi-ckelten IHC-Reagenz bestimmt. *PD-L1+ ist definiert als Patienten mit ≥ 5 % tumorinfiltrierenden Immunzellen, die positiv für PD-L1 sind. ‡Chirurgische Tumorproben; §PD-L1-positiv ist definiert als Patienten mit ≥ 5 % tumorinfiltrierenden Immunzellen, die positiv für PD1 sind (Quellen: ROCHE6).

Tumortyp Nichtklinische Studie *‡(Immunzelle), ≈%§

Phase-I-Studie

Immunzelle* Tumorzelle‡

NSCLC 45 % 26 % 24 %

RCC 20 % 25 % 10 %

Melanom 40 % 36 % 5 %

Harnblase N/A 27 % 11 %

HNSCC 33 % 28 % 19 %

Magenkarzinom N/A 18 % 5 %

CRC 45 % 35 % 1 %

Pankreaskarzinom N/A 12 % 4 %

Mammakarzinom N/A 27 % 12 %

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T-Zell-Aktivierung: vielstufiger, ausbalancierter Prozess zwischen Abwehr- reaktion und Autoimmunität.

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Überdies sind die Färbeprotokolle häufig unbe-kannt und/oder manche der verwendeten diag-nostischen Antikörper nicht frei erhältlich.

Fazit: Es herrscht ein ziemliches Durchei-nander mit teilweise divergenten Ergebnis-sen. Dies haben verschiedene Studien beim NSCLC gezeigt – der Entität, für die derzeit die meisten Erfahrungen mit verschiedenen PD-L1-Assays vorliegen: O Beim Plattenepithelkarzinom ergab sich

kein prädiktiver Wert der PD-L1-IHC (28-8-Assay).18

O Beim pulmonalen Adenokarzinom und NSCLC ohne Subtypisierung ließ sich dagegen für unterschiedliche Immun-Checkpoint-Inhibitoren ein potenzieller prädiktiver Wert der PD-L1-IHC bezogen auf Tumorzellen nachweisen (Assays 28-8, 22C3).3,9,10,19

O In einer Studie mit dem PD-L1-Inhibitor Atezolizumab fand sich außer für die PD-L1-Expression in Tumorzellen auch ein unabhängiger prädiktiver Wert in den Tumor-assoziierten Immunzellen (SP142 Assay).4

HarmonisierungsstudienVor dem Hintergrund der beschriebenen heterogenen Testsituation in den Studien starteten Initiativen, um zu einer Vergleich-barkeit der Daten zu gelangen: O In den USA untersuchte die „Blueprint-

working group“ drei Assays an 39 NSCLC-Fällen.20

O In Deutschland kamen im Rahmen der

„Harmonisierungsstudie“ vier verschie-dene, in Studien verwendete PD-L1-As-says zum Einsatz. Präparate wurden von Referenzlaboren vorgefärbt und durch neun Pathologen ausgewertet.21,22

In der deutschen Studie zeigte sich bei Ver-wendung des sogenannten „Cologne-Scores“ (sechsstufiger Proportionsscore von 0–5; Tab.  2) eine moderate Konkordanz in der Beurteilung der PD-L1-gefärbten Tumor-zellen. Es traten keine signifikanten Unter-schiede zwischen den Beurteilern auf. Somit scheint eine reproduzierbare Tumorzellen-Bewertung für diese vier Assays möglich – vergleichbar mit den bislang publizier-ten Ergebnissen der „Blueprint-working group“.20

Bei der Beurteilung der PD-L1-gefärbten Immunzellen bestand demgegenüber nur eine geringe Interobserver-Konkordanz. Zum einen liegt offenbar in der Anfär-bung der Immunzellen der größte Unter-schied zwischen den verschiedenen Assays (SP142  >>  übrige), zum anderen besteht weiterer Lern- und Schulungsbedarf, um zu einer besseren Übereinstimmung der Immunzell-Ergebnisse zu kommen.

BefunderstellungAus der deutschen Harmonisierungsstu-die21,22 leitet sich eine Empfehlung zur Befunderstellung bei der immunhistoche-mischen PD-L1-Testung ab.O Obligate Informationen: Da derzeit

die Rate membranös PD-L1-gefärbter Tumorzellen diagnostisch relevant ist, soll dieser Wert als Prozent („x % pos. TC“) und/oder in Form eines Propor-tionsscores wie dem „Cologne-Score“ (0–5) mitgeteilt werden (Tab. 2). Nach deutschem Expertenkonsensus sind ≥ 100 beurteilbare Tumorzellen aus Biopsien oder Resektaten notwendig (an zytologischen Präparaten ist PD-L1 nicht validiert). Überdies ist die Angabe des verwendeten Antikörpers und der einge-setzten Färbeplattform essenziell.

O Optionale Informationen: Bisher war noch für keine Wirkstoffzulassung die Immunzell-Positivität relevant, was sich aber in Zukunft ändern könnte (z. B. für Atezolizumab beim muskelinvasiven Urothelkarzinom der Harnblase und für NSCLC).4,11 Überdies unterscheiden sich wohl die prädiktiven Werte der Immun- und der Tumorzellen-Positivität. Daher ist die Angabe der Immunzell-Positivität noch optional und kann beispielsweise berichtet werden als „Nachweis PD-L1- positiver Immunzellen, deren Flächenan-teil x % beträgt“ bzw. „tumor-assoziierte IC, die PD-L1-negativ sind (Flächenan-teil < 1 %)“.

FazitDie immunhistochemische PD-L1-Bestim-mung ermöglicht bei verschiedenen Tumo-rentitäten die Selektion von Patienten, die eine erhöhte Response-Wahrscheinlichkeit für eine Immun-Checkpoint-Inhibition

Abb. 1: Beispiel für PD-L1-Expression in einem mikrosatelliten-instabilen sporadischen Kolo-rektalkarzinom (MSI-H) (SP-142, Obj.-verg. 5fach) (Pathologie Dresden)Stern: PD-L1-positive Immunzellen; Pfeilspitze: PD-L1-positive Tumorzellen

Medizin | PD-L1 als neuer Biomarker | Diagnostik im Dialog • Ausgabe 51 • 12/2016

Der immunhistochemische Nachweis einer PD-L1- Expression von Tumorzellen hat vermutlich prädiktives Potenzial für ein Ansprechen auf Anti-PD-L1-Therapie.

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Immun-Checkpoint-Inhibitoren können auch bei Tumorentitäten mit geringem Ansprechen auf konventionelle Chemotherapie zu anti-tumoralen Immunantworten führen.

gegen PD1 bzw. PD-L1 haben. Die verfüg-baren Assays sind heterogen in Bezug auf verwendete Antikörper, Testplattformen und Cut-off-Werte. Erste Harmonisie-rungsstudien versuchen eine Vergleich-barkeit herzustellen, was zumindest für die Positivitätsrate von Tumorzellen mög-lich scheint. Im Hinblick auf die prädik-tive Bedeutung der PD-L1-Expression auf Tumor- und/oder Immunzellen muss die

Literatur 1 Borghaei H et al: N Engl J Med (2015); 373: 1627-1639 2 Brahmer J et al: N Engl J Med (2015); 373: 123-135 3 Fehrenbacher L et al: Lancet (2016); 387: 1837-1846 4 Garon EB et al: N Engl J Med (2015); 372: 2018-2028 5 Gettinger SN et al: J Clin Oncol (2015); 33: 2004-2012 6 Herbst RS et al: Nature (2014); 515: 563-567 7 Herbst RS et al: Lancet (2016); 387: 1540-1550 8 Hirsch F et al: Proceedings of the 107th annual meeting

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Tab. 2: PD-L1-IHC-Assays in klinischen Studien zum NSCLC18 A: Ausgewählte monoklonale Antikörper gegen PD1 und PD-L1, die sich in fortgeschrittenen klini-schen Studien befinden und für die ein PD-L1-Immunhistochemie (IHC) -Assay als prädiktiver Bio- marker getestet wird. Angaben zu ausgewertetem Zelltyp sowie den Auswertekriterien: Es wird jeweils die Proportion der PD-L1- positiven Tumorzellen bzw. Immunzellen bestimmt, wobei unterschiedliche Kategorien getestet werden.B: Zusammenfassung der aktuell bekannten Grenzwerte in einen 6-stufigen Score („Cologne-Score“ zur Kategorisierung der Rate PD-L1-positiver Zellen).18

A Assay, Antiköper

Zelltyp Negativ Low/Weak Medium High/Strong

Nivolumab (α-PD1; BMS)

Dako 28-8 Tumor 0-1 % 1–5 % 5–10 % ≥ 10 %

Pembrolizumab (α-PD1; MSD)

Dako 22C3 Tumor 0-1 % 1–50 % ≥ 50 %

Atezolizumab (α-PD-L1; Roche)

Ventana SP142

Tumor 0-1 % 1–5 % 5–50 % ≥ 50 %

Immun 0-1 % 1–5 % 5–10 % ≥ 10 %

Durvalumab (α-PD-L1; AstraZeneca)

Ventana SP263

Tumor 1–25 % ≥ 25 %

Avelumab (α-PD1-L1; Pfizer + Merck)

Dako … Tumor 0–1 % ?

PD-L1-Ausprägung für jede Tumorentität individuell evaluiert werden.

* PD1: Programmed Death 1-Receptor, auch CD279 oder PDCD1) PD-L1: PD1-Ligand, auch CD274 oder PDCD1LG1 PD-L2: PD1-Ligand, auch PDCD1LG2 oder B7-DC

** MSI: Mikrosatelliteninstabilität; Längen-veränderungen innerhalb kurzer, repetitiver DNA-Sequenzen als Folge defekter DNA-Reparaturproteine

B Negativ Positiv

Proportion-Score("Cologne Score")

Kategorie: 0 1 2 3 4 5

Cut-Off: < 1 % ≥ 1 % ≥ 5 % ≥ 10 % ≥ 25 % ≥ 50 %

Intervall: 0-1 % ≥ 1 bis< 5 %

≥ 5 bis< 10 %

≥ 10 bis< 25 %

≥ 25 bis< 50 %

≥ 50 bis< 75 %

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Korrespondenzadresse

Prof. Dr. med. Gustavo Baretton Direktor des Instituts für Pathologie Universitätsklinikum Carl Gustav Carus Technische Universität Dresden Fetscherstraße 74 01307 Dresden Gustavo.Baretton@Uniklinikum-Dresden.de www.pathologie-universitaetsmedizin-dresden.de