PEMBAHASANPada praktikum kali ini digunakan instrument HPLC dengan prinsip pemisahan komponen-komponen sampel dengan cara melewatkan sampel pada suatu kolom, yang selanjutnya dilakukan pengukuran kadar masing-masing komponen-komponen tersebut dengan suatu detektor. Pada dasarnya detektor membandingkan respon dari komponen sampel dengan respon dari larutan standar. Prosedur yang dilakukan adalah sampel yang ingin diidentifikasi capsaicin baik secara kualitatif maupun kuantitatif disiapkan terlebih dahulu, sampel yang digunakan adalah macaroni pedas, lanting dan keripik pedas. Sampel terlebih dahulu digerus dalam mortar hingga cukup halus, hal ini bertujuan agar memudahkan saat ekstraksi. Setelah itu ditimbang dengan timbangan digital masing-masing 2 gr, lalu dimasukkan ke dalam tabung sentrifuga. Sampel diekstraksi dengan metode ekstraksi cair-cair. Masing-masing sampel dilarutkan dengan klorofom hingga sampel terendam, lalu divortex selama 3-4 menit. Ekstraksi adalah proses pemisahan satu atau lebih komponen dari suatu campuran homogen menggunakan pelarut cair (solven) sebagai separating agent. Sedangkan ekstraksi cair-cair (liquid extraction, solvent extraction) adalah suatu metode dimana solut dipisahkan dari cairan pembawa (diluen) menggunakan solven cair. Campuran diluen dan solven ini adalah heterogen ( immiscible, tidak saling campur), jika dipisahkan terdapat 2 fase, yaitu fase rafinat dan fase ekstrak. Perbedaan konsentrasi solut di dalam suatu fasa dengan konsentrasi pada keadaan setimbang merupakan pendorong terjadinya pelarutan (pelepasan) solut dari larutan yang ada. Sehingga akan terbentuk 2 fase, dimana fase atas (rafinat) mengandung residu sedangkan fase bawah (ekstrak) mengandung solven (kloroform) dan solute (capsaicin). Mesin Vortex digunakan untuk mencampurkan suatu bahan yang sudah dihancurkan dan dilarutkan dengan larutan buffer, atau hanya untuk mencampurkan beberapa jenis larutan agar homogen (rata) dalam falcon tube. Setalah di vortex, dilakukan sentrifugasi selama 5 menit pada 3000 rpm. Sentrifugasi yaitu metode yang digunakan dalam untuk mempercepat proses pengendapan dengan memberikan gaya sentrifugasi pada partikel-partikelnya. Pemisahan sentrifuga menggunakan prinsip dimana objek diputar secara horizontal pada jarak tertentu. Apabila objek berotasi di dalam tabung atau silinder yang berisi campuran cairan dan partikel, maka campuran tersebut dapat bergerak menuju pusat rotasi, namun hal tersebut tidak terjadi karena adanya gaya yang berlawanan yang menuju kearah dinding luar silinder atau tabung, gaya tersebut adalah gaya sentrifugasi. Gaya inilah yang menyebabkan partikel-partikel menuju bagian dasar tabung dan terakumulasi membentuk endapan. Kemudian disaring menggunakan kertas saring dan corong gelas. Hasil saringan (supernatant) dimasukkan dalam vial.Setelah sampel diekstraksi, sampel dianalisis menggunakan HPLC (High Performance Liquid Chromatography) untuk melihat kandungan capsaicin dalam sampel. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) dikenal juga dengan istilah High Performance Liquid Chromatography (HPLC). KCKT merupakan perangkat peralatan yang penting dalam perkembangan analisis bahan baku maupun kontaminan. Fungsi utama KCKT pada dasarnya adalah kemampuan dalam memisahkan berbagai komponen penyusun dalam suatu sampel. KCKT digunakan secara luas dalam pemisahan dan pemurnian berbagai sampel dalam berbagai bidang seperti farmasi, lingkungan, industri makanan dan minuman, industri polimer dan berbagai bahan baku. KCKT lebih banyak digunakan untuk keperluan identifikasi (analisis kualitatif), kecuali jika KCKT ini dihubungkan dengan sebuah spektrometri massa (Mass Spectrometer (MS), maka penggunaan akan lebih memungkinkan dalam analisis kuantitatif. Prinsip kerja HPLC yaitu dengan bantuan pompa fasa gerak cair dialirkan melalui kolom ke detektor. Sampel dimasukkan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen campuran. Karena perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih dulu. Sebaliknya, solut-solut yang kuat berinteraksi dengan fasa diam maka solut-solut tersebut akan keluar kolom dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk kromatogram kromatografi gas. Seperti pada kromatografi gas, jumlah peak menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran. Pada proses ini, langkah yang dilakukan adalah sampel dimasukkan ke dalam wadah fase gerak. Wadah fase gerak yang digunakan harus bersih dan inert. Fase gerak yang digunakan adalah methanol dan air dengan perbandingan 70:30. Fase gerak ini sebelumnya harus dilakukan digessing (penghilang gas) yang ada untuk menghindari kekacauan analisis. Selain itu adanya pengotor dalam solven juga menyebabkan gangguan pada sistem. Oleh karena itu, pada fase gerak ini harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari partikel-partikel kecil. Kemudian kolom dipasangkan pada alat instrument yang akan membawa hasil pemisahan ke detektor. Kolom yang digunakan adalah kolom fase balik C18 dimana fused silica yang bersifat polar dilapisi dengan Oktadesil Silika (ODS atau C18) yang bersifat nonpolar. R adalah gugus alkil rantai lurus dan R biasanya adalah n-oktadesil (C-18). Hasil reaksi yang diperoleh disebut dengan silica fase terikat yang stabil terhadap hidrolisis serta mempunyai karakteristik kromatografik dan selektifitas yang berbeda jika dibandingkan dengan silika yang tidak dimodifikasi). Setelah semua sudah disiapkan maka HPLC siap bekerja yaitu mula-mula solven diambil melalui pompa. Kemudian solven masuk ke dalam katup injeksi berputar, yang dipasang tepat pada sampel loop. Dengan mikro syringe, sampel dimasukan ke dalam sampel loop yang kemudian bersama-sama dengan solven masuk ke dalam kolom. Setelah itu, hasil pemisahan dideteksi oleh detektor, yang penampakannya ditunjukan oleh perekam berupa grafik. Elusi yang digunakan adalah elusi isokratik dimana fase gerak dari awal sampai akhir memiliki perbandingan komposisi yang tetap. Dalam proses menganalisis suatu sampel, HPLC menggunakan dua parameter analisis, yaitu waktu retensi dan luas area. Waktu retensi adalah waktu yang dibutuhkan sampel dalam proses analisis sampai terdeteksi oleh detektor. Sedangkan luas area adalah luas hasil analisis dalam bentuk grafik yang digunakan dalam penentuan jumlah kadar dari suatu komponen. Waktu retensi digunakan dalam analisis yang bersifat kualitatif, sedangkan luas area digunakan dalam analisis yang bersifat kuantitatif.Metode HPLC dapat digunakan untuk analisa kuantitatif dan sekaligus kualitatif. Untuk analisa kualitatif dengan membandingkan kromatogram sampel dengan kromatogram baku pembanding berdasarkan waktu retensinya.Sedangkan untuk analisa kuatitatif dapat digunakan dengan persamaan :Cx = Ax / Ap X CpKeterangan :A = Peak area = Luas puncakC= KonsentrasiX = sampelP = pembandingAtau jika ingin mendapatkan data yang lebih valid dapat pula ditentukan dengan menggunakan kurva kalibrasi larutan standar.Dengan menggunakan HPLC, dapat dilakukan analisis kualitatif dan kuantitatif terhadap suatu analit dalam sampel. Analisis kualitatif bertujuan untuk mengetahui apakah terdapat senyawa capsaicin dalam sampel sedangkan dari analisis kuantitatif dapat ditentukan kadar dari capsaicin dalam sampel. Pada kromatogram, terdapat sumbu Y yang menyatakan AUC (Area Under Curve) dan sumbu X yang menyatakan waktu retensi. Kecepatan migrasi solut dipengarui oleh perbandingan distribusinya (Kd atau kadang disebut D) yang ditentukan oleh afinitas relatif solut pada fase diam dibanding fase gerak:Kd = Dari persamaan tersebut dapat ditarik kesimpulan jika semakin besar harga Kd suatu senyawa maka waktu retensinya (tR) akan semakin besar karena interaksi dengan fase diam besar dan migrasinya semakin lambat.Sampel dianalisis pada panjang gelombang 268 nm, dari hasil analisis didapatkan data kromatogram dari ketiga sampel yaitu sampel pertama lanting, sampel kedua makaroni dan sampel ketiga slondok didapatkan pada sampel pertama terdapat 11 peak ( puncak) dimana puncak tertinggi dicapai pada waktu retensi 8.242 dengan luas area 141286 sedangkan pada sampel kedua terdapat 7 peak dengan puncak tertinggi didapat pada waktu retensi 1.875 dengan luas area 124224. Pada sampel ketiga terdapat 17 peak dengan puncak tertinggi didapat pada waktu retensi 12.625 dengan luas area 1145461. KESIMPULAN 1. Cara Kerja Instrumen HPLC untuk analisis kuantitatif dapat dipahami dimana pertama fase gerak dialirkan melalui kolom ke detektor dengan pompa.kemudian sampel dimasukan ke dalam aliran fase gerak dengan cara penyuntikan.didalam kolom terjadi pemisahan komponen komponen campuran, setiap komponen campuran yang keluar dari kolom akan dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk kromatogram.2. Preparasi dapat dilakukan dengan tepat dan akurat serta mengikuti manual pengoperasian HPLC. Dimana preparasi yang dilakukan meliputi preparasi fase gerak, preparasi sampel dimana sampel terlebih dahulu dihaluskan kemudian disentrifugasi dan di ambil supernatannya untuk dianalisis dan preparasi instrument HPLC.3. Dapat diketahui penerapan HPLC dalam analisis senyawa capsaicin pada cemilan pedas dengan membandingkan waktu retensi sampel yang dapat dibandingkan dengan waktu retensi pada larutan standar capsaicin sehingga ada atau tidknya capsaicin dalam sampel dapat diketahui.