7

Pemotongan Molekul DNA Menggunakan Enzim RestriksiPosted on 22 November 2010 (http://belalangtue.wordpress.com/2010/11/22/pemotongan-molekul-dna-menggunakan-enzim-restriksi/)

Pemotongan Molekul DNA Menggunakan Enzim RestriksiEndonuklease dan Pengukuran Besarnya Pasangan Basa dari Fragmen

yang Terpotong

Teknik manipulasi DNA melibatkan beberapa enzim, diantaranya DNA olimerase, ligase, enzim yang memodifikasi ujung akhir nukleotida dan nuklease. Nuklease merupakan enzim yang memotong molekul DNA dengan memutuskan ikatan fosfodiester antara nukleotida satu dengan nukleotida berikutnya. Jenis  nuklease ada dua yaitu eksonuklease dan endonuklease. Endonuklease merupakan nuklease yang memotong bagian internal DNA tepat pada ikatan fosfodiester. Hasil pemotongan molekul DNA oleh enzim restriksi endonuklease tepat pada urutan  tertentu dan menghasilkan sekuens yang double-stranded, dengan demikian sekuens yang akan dipotong dapat diprediksi urutan basa nitrogennya.

Ada tiga tipe enzim restriksi endonuklease yaitu tipe I, II dan III. Enzim restriksi endonuklease tipe I dan III jarang digunakan, karena hasil pemotongannya tidak tepat pada sekuens yang diinginkan, sedangkan enzim restriksi endonuklease tipe II dapat memotong tepat atau dekat dengan sekuens yang diinginkan (gambar 1). Berikut adalah Gambar 1. Pemotongan molekul DNA dengan enzim restriksi endonuklease tipe I, II, dan III

Gambar 1. Pemotongan molekul DNA dengan enzim restriksi endonuklease tipe I, II, dan III

Contoh enzim restriksi endonuklease tipe II adalah EcoRI. Enzim EcoRI diisolasi dari E. coli dan memotong molekul DNA pada urutan heksanukleotida 5’- GAATTC-3’. Selain EcoRI, enzim restriksi endonuklease lainnya dapat dilihat pada  tabel di bawah ini.

Hasil pemotongan enzim restriksi endonuklease ada dua macam yaitu unjung blunt atau flush dan ujung sticky atau cohesive (gambar 2).

Gambar 2. Hasil pemotongan molekul DNA dengan enzim restriksi endonuklease berbeda. (A) ujung blunt dan ujung sticky. (B) Tipe ujung sticky berbeda. (C) Tipe ujung sticky sama dihasilkan oleh dua enzim restriksi endonuklease berbeda.

Ujung blunt atau flush menghasilkan fragmen yang double-stranded sedangkan ujung sticky atau cohesive menunjukkan enzim restriksi endonuklease pada posisi yang berbeda dari dua untai DNA yang komplementer. Beberapa pemotong  ujung sticky menghasilkan ujung 5’ atau ujung 3’ yang menggantung.

Fragmen DNA yang dipotong dengan enzim restriksi endonuklease dapat ditentukan berapa besar ukurannya dengan menggunakan teknik elektroforesis gel agarosa. Teknik ini tergantung oleh konsentrasi agarosa dalam gel. Fragmen yang berukuran kurang dari 150 pasang basa dapat dipisahkan dengan cara elektroforesis yang konsentrasi agarosanya 4% atau 5%.

Apabila ukuran dari sekuens DNA tidak diketahui maka fragmen yang mengandung gen atau segmen DNA tersebut dapat diidentifikasi dengan Southern hybridization. Adapun tahapannya yaitu:

1. Mentransfer fragmen restriksi dari gel agarosa ke nitroselulosa atau membran nilon.2. Menyediakan hybrization probe. Sekuens molekul DNA yang komplementer dengan

DNA target dilabeli. Pelabelan ini dapat menggunakan oligonukleotida sintetik. Pelabelan kemudian dideteksi dengan menggunakan autoradiography.

4

Biologi oleh Neil A, Campbell, Jane B, Reece, Lawrence G, Mitchell .Jakarta , Erlangga

2002 ( halaman 390)

Enzim Restriksi digunakan untuk membuat DNA rekombinan

Pengklonan gen dan rekayasa genetik telah digunakan oleh penemuan enzim yang

bisa memotong molekul DNA pada lokasi-lokasi spesifik yang jumlahnya terbatas. Enzim

ini, disebut enzim restriksi ditemukan dalam bakteri pada akhir tahun 1960-an. Di dalam,

enzim ini melindungi bakteri terhadap DNA yang menyelinap dari organisme lain, seperti

virus atau sel bakteri lain. Enzim-enzim ini bekerja dengan memotong-motong DNA

asing,suatu proses yang disebut restriksi.Sebagian besar enzim restriksi ini sangat spesifik,

mengenali urutan nukleotida pendek dalam molekul DNA dan memotong pada titik tertentu

di dalam urutan. Sel bakteri ini melindungi DNA-nya sendiri dari restriksi dengan

menambahkan gugus metil (-CH3) pada adenin atau sitosin di dalam urutan yang dikenal oleh

enzim restriksi tersebut. Ratusan enzim telah diidentifikasi dan diisolasi , dan banyak yang

telah teersedia secara komersial.

2

http://sciencebiotech.net/tag/genetic-engineering/

Kita harus berterima kasih kepada para bakteri dan archaea karena umumnya mereka memiliki ‘gunting’ berupa enzim yang dapat memotong-motong DNA secara spesifik. Enzim ini berguna sebagai bentuk pertahanan bakteri terhadap DNA-DNA asing yang masuk ke dalam sel bakteri. DNA asing ini akan dipotong-potong agar tidak akan membahayakan

bakteri lagi oleh enzim yang disebut ‘Restriction Endonuclease‘ (sering disebut enzim restriksi). DNA si bakteri sendiri sudah terlindungi dengan mekanisme tertentu (metilasi) sehingga akan terhindar dari pemotongan. Suatu sistem pertahanan yang sangat cerdas untuk makhluk sekelas bakteri.

Sedangkan ‘lem’ DNA secara alami terdapat baik pada eukaryota maupun prokaryota. Secara komersial, enzim ini diperoleh dari virus tertentu seperti bakteriofage T4 yang memiliki enzim ligase yang dapat menyambungkan gugus -OH pada suatu utas DNA dengan gugus -PO4 pada utas lainnya membentuk ikatan phosphodiester. Enzim ini pada dasarnya berfungsi untuk memperbaiki kerusakan-kerusakan pada kromosom.

Nah, para ilmuwan rekayasa genetika telah berhasil mengisolasi ratusan jenis ‘gunting’ untuk memotong-motong DNA dan ‘lem’ DNA untuk menyambungkan kembali hasil potongan tersebut sehingga diperoleh DNA dengan susunan tertentu.

Restriction Endonuclease

DNA tersusun atas empat basa nukleotoda yaitu A (adenine), G (guanine), C (cytosine) dan T (thymine). –Lihat kembali artikel tentang DNA . Enzim restriksi (dalam hal ini adalah Restriction Endonuclease Type II) alias ‘gunting’ DNA hanya akan memotong DNA pada tempat tertentu saja, yaitu jika ia menemukan susunan palindrom, urutan basa yang jika dibaca dari kedua utas DNA akan tetap sama. Perhatikan contoh sekuen berikut ini:

5'-GATATC-3' ::::::3'-CTATAG-5'

Baik di utas atas maupun bawah memiliki sekuen yang sama bukan (dibaca dari 5′ ke 3′)? Nah, di sekuen palindrom seperti itulah enzim restriksi akan bekerja.

Setiap enzim restriksi hanya dapat memotong pada susunan palindrom tertentu. Misalnya enzim EcoRI akan bekerja jika menemukan urutan GAATTC, enzim SmaI pada urutan CCCGGG, enzim AluI pada urutan AGCT, dan seterusnya.

Cara pemotongan DNA pun tidak sembarangan, masing-masing enzim punya titik pemotongan tertentu yang khas. Misalnya BamHI yang mengenali situ GGATCC akan memotong pada posisi antara dua G membentuk fragmen yang ujungnya ada yang tidak berpasangan (cohesive atau sticky ends).

5'-G GATCC-3' : :3'-CCTAG G-5'

Sedangkan enzim PovII yang mengenali situs CAGCTG akan memotong di tengah situs pemotongan membentuk fragment yang semua ujungnya berpasangan (blunt ends):

5'-GGA TCC-3' ::: :::3'-CCT AGG-5'

Ada sekitar 600 enzim restriksi yang tersedia secara komersial saat ini. Berikut ini beberapa contoh enzim restriksi beserta situs pemotongannya.

List of Restriction Enzyme (Image from ncbi.nlm.nih.gov)

Situs Pengenalan dan Pemotongan Enzim Restriksi (Image from ncbi.nlm.nih.gov)

Penamaan enzim restriksi

Huruf pertama adalah singkatan nama genus bakteri pemilik enzim tersebut Huruf kedua dan ketiga adalah singkatan nama spesies bakteri. Huruf keempat adalah dingkatan nama Strain. Huruf kelima adalah urutan penemuan enzim tersebut.

Misalnya EcoRI berasal dari Escherichia coli strain RY13 yang pertama kali diidentifikasi, HindIII dari Haemophilus influenzae, dan lain-lain.

Beberapa Sifat Khusus Enzim Restriksi

Isochizomer

Isochizomer adalah enzim-enzim restriksi yang memiliki situs pengenalan yang sama. Hasil pemotongannya bisa sama dan bisa juga berbeda. Misalnya HpaII (situs pengenalan: C↓CGG) dan MspI (situs pengenalan: C↓CGG) adalah isoschizomer, begitu pula AatI (AGG↓CCT) dan StuI (AGG↓CCT).

Neoschizomer

Neoschizomer adalah bagian dari isoschizomer, memiliki situs pengenalan yang sama tetapi memotong pada tempat yang berbeda sehingga hasil pemotongannya pun berbeda. Misalnya AatII (situs pengenalan: GACGT↓C) dan ZraI (situs pengenalan: GAC↓GTC).

Tabel yang berisi daftar isoschizomer dan neoschizomer dapat ditemukan di situs NEB (New England Biolabs).

Kompatibilitas Ujung Overhang

Ada beberapa enzim restriksi yang memiliki situs pengenalan berbeda tetapi hasil pemotongannya memiliki ujung overhang yang sama. Misalnya AccIII (T↓CCGGA) dengan AgeI (A↓CCGGT) yang menghasilkan ujung overhang CCGG.

Sifat ini sangat penting dalam aspek rekayasa genetika, terutama bila fragmen DNA yang akan kita klon memiliki situs pengenalan enzim restriksi yang berbeda dengan vektornya. Asalkan hasil pemotongan memiliki ujung overhang yang sama maka proses ligasi dapat dilakukan kemudian.

3

Bikomia kedokteran dasar

Joko suyono, vivi sadikin, lydia I, mandera , penerbit EGC jakarta tahun 2000 cetakan 1 hal 237-240

Teknik DNA rekombinan

Untuk memahami mengapa gen dari satu individu berbeda dari individu lain bagaimana

memanfaatkan perbedaan ini untuk mendiagnosis penyakit paling sedikit diperlukan pemahaman

dasar mengenai teknik DNA rekombinan.

Strategi unutk memperoleh salinan Gen atau Fragmen DNA

Fragmen Restriksi

Enzim yang disebut sebagai endonuklease restriksi (restriction endonucleases)

memungkinkanpara ahli biologi molekular memutuskan segmen DNA dari genom berbagai jenis se

atau untuk memperoleh fragmen DNA yang berasal dari sumber lain. Enzim restriksi adalah suatu

endonuklease yang mengenali uutan pendek DNA, biasanya panjangnya 4-6 pb (pasanagn basa), dan

memutuskan kedua untai DNA di urutan tersebut. Sifat utama enzim restriksi adalah spesifitasnya,

enzim ini selalu memutuskan urutan DNA yang sama dan hanya memutuskan di urutan tertentu.

Sebagian besar urutan DNA yang dikenali oleh enzim restriksi adalah palindrom yaitu kedua untai

DNA memiliki urutan basa yang sama apabila dibaca dalam arah 5’ ke 3’. Potongan yang dibuat oleh

enzim ini mungkin tumpul/blunt (sehingga produk yang dibentuk beruntaidanda diujungnya) atau

lengket/sticky (sehingga produk yang dihasilkan beruntai tunggal diujungnya) .

Fragmen resttriksi DNA yang dapat membentuk pasangan basa satu sama lain apabila fragmen

tersebut memiliki ujung lengket yang bersifat komplementer. Oleh karena itu, dua frgamen DNA

yang tidak berhubungan dapat membentuk pasangan basa satu sama lain apabila keduanya

diputuskan oleh enzim restriksi yang sama. Setelah fragmen-fragmen tersebut membentuk pasangan

basa, ujung-ujungnya digabungkan secara kovalen oleh kerja DNA ligase. Oleh karena itu

penggunaan enzim restriksi bersamaan dengan DNA ligase dapat menghasilkan DNA rekombinan

atau kimerik ( chimeric) yaitu molekul DNA yang direkombinasikan in vitro ( dalam kaca, yaitu dalam

tabung reaksi)

Teknik untuk mengindetifikasi urutan DNA

1. Probe

Probe adalah DNA untai tunggal yang dapat membentuk pasangan basa dengan urutan

komplementer pada polinukleotida untai tunggal lain yang tersusun dari DNA atau RNA. Proses ini

dikenal sebagai penyatuan kembali (reannealing) atau hibridasi. Untuk mengidentifikasi urutan

sasaran , probe harus membawa suatu label. Apabila probe membawa label radioaktif misalnya 32P,

probe dapat dideteksi dengan autoradiografi. Dibuat autoradiogram dengan membungkus bahan

yang mengandung probe dengan selembar film sinar X, elektron yang dipancarkan akibat

kehancuran (disintegrasi) atom radioaktif menyebabkan film terpajan tepat diatas probe.

Probe dapat terdiri dari cDNA (dihasilkan dari mRNA oleh reverse transcriptase) fragmen DNA

genom (diputuskan dari genom oleh enzim restriksi) oligonium kleotida yang disintesis secara

kimiawi atau kadang-kadang , RNA. Terdapat sejumlah teknik untuk memasukan label kedalam

probe tersebut. Tidak semua probe diberi label radioaktif. Sebagian adalah produk kimia tambahan

(adduct) senyawa yang berikatan secara kovalen dengan DNA yang dapat diidentifikasi misalnya

dengan fluoresens.

2. Elektroforesis gel

Gel elektroforesis adalah suatu teknik yang menggunakan medan listrik untuk memisahkan

molekul berdasarkan ukuran, karena mengandung gugus fosfat yang bermuatan negatif,

didalam medan listrik DNA akan bergerak menuju elektroda positif. Molekul yang lebih

pendek bermigrasi lebih cepat melalui pori-pori gel daripada molekul yang lebih panjang,

sehingga pemisahan didasarkan pada panjang. Gel yang tersusun dari poliakrilamid dapat

memisahkan molekul-molekul DNA yang perbedaan panjangnya hanya satu nukleotida dan

digunakan unutk memisahkan fragmen DNA yang memiliki perbedaan ukuran lebih besar.

Pita DNA pada gel dapat dilihat dengan berbagai teknik, pemberian zat warna misalnya

etidium bromida menungkinkan visualisasi langsung semua pita DNA di bawah sinar ultra

violet. Urutan spesifik biasanya dideteksi dengan probe berlabel.

3. Deteksi urutan DNA spesifik

Unutk mendeteksi urutan spesifik , DNA biasaanya dipindahkan ke suatu peyokong yang

padat, misalnya selembar kertas nitroselulosa apabila bakteri ditumbuhkan pada suatu

lempeng agar, sel dari masing-masing koloni akan melekat ke lembar kertas nitroselulosa

yang ditekankan ke agar tersebut. Teknik yang serupa digunakan untuk memindahkan pita

DNA dari gel elktroforetik ke lembrat nitroselulosa. Setelah koloni dipindahkan ke selembar

nitroselulosa,kertas diberikan larutan basa, dalam hal ini dimana DNA dipisahkan sari gel

agarosa, gel juga diberi suatu larutan basa. Larutan basa menyebabkan denaturasi DNA yaitu

pemisahan kedua untai dari masing-masing heliks ganda. DNA untai tunggal dapat di

hibridasikan dengan suatu probe dan dapat dilakukan identifikasi terhadap bagian-bagian

pada kertas nitroselulosa yang mengandung DNA yang membentuk pasangan basa dengan

probe.

6

Genetika , 2007 erlangga, schaum’s outlines Elord SL . Stansfield WD. Jakarta halmn 274

Nuklease adalah enzim-enzim yang menghidrolisis atau mematahkan ikatan-ikatan

fosfodiester yang menggabungkan nukleotida-nukleotida. Nuklease yang menyingkirkan

nukleotida-nukleotida terminal satu demi satu disebut eksonuklease : yang mematahkan tulang

punggung gula fosfat pada situs-situs nonterminal disebut endonuklease. Fdeiksiribonuklease

(Dnase) menyerang molekul-nolekul DNA , ribonuklease (RNase) mendegradasi molekul-molekul

RNA terutama di daerah-daerah beruntai tunggal. Sejumlah endonuklease bekerja secara spesifik ,

memotong ikatan-ikatan fosfodiester pada sekuens-sekuens nukleotida berbeda secara acak.

Endonuklease lain misalnya restriksi endonuklease mematahkan ikatan-ikatan hanya pada

sekuens DNA spesifik, yang disebut situs pengenalan. Ada tiga kelas restriksi endonuklease : Tipe I,

Tipe II, Tipe III.

Tipe I dan Tipe III tidak memiliki sifat-sifat yang berguna bagi teknologi DNA rekombinan , enzim Tipe

II mengenali dan berikatan ke sekuens DNA beruntai ganda yang spesifik. Bekitu terikata, enzim

memotong tulang punggung fosfodiester pada masing-masing untai situs tersebut. Situs pengenalan

enzim tersebut bersifat simetris dan umumnya terdiri dari 4-8 pasangan basa yang bbisa tidak

terputus ( misalnya GAATTC ) ataupun terinterupsi (misalnya CANTG ,dimana N adalah basa

apapun). Simetri itu terjadi disekitar titik tengah atau sumbu simetri, sehingga menbentuk untaian-

untaian DNA bderlawanan dengan sekuens basa terbalik disebut palindrom. Enzim itu terdapat

secara alamiah di dalam bakteri, dan ratusan enzim telah diisolasi dan dikarakterisasi serta tersedia

untuk digunakan oleh para perekayasa genetik. Dengan demikian ,

enzim tipe II adalah yang paling umum digunakan dalam teknologi DNA rekombinan saat ini.

Di alam enzim restriksi berperan dalam melindungi bakteri dari serangan asam-asam nukleat asing,

misalnya virus. Sistem enzim restriksi sel bakteri inang bisa mengenali DNA penyerang sebagai benda

asing dan meghancurkannya, DNA inang dilindungi oleh modifikasi-modifikasi pasangan basa spesifik

yang dilakukan oleh enzim-enzim metilase spesifik inang. Dengan demikian enzim restriksi bekerja

sama dengan enzim pemodifikasi dan sistemnya disebut sistem restriksi modifikasi.