PUSTAKA
B.R. Glick & J.J. Pasternak.2003. Molecular Biotechnology:
Principles and Applications of Recombinant DNA 3RD Edition, ASM
Press.5/6/12
Brown,T.A.1995.Gene Cloning: An Introduction. Chapman Hall,
London.
Bollag, D.M.1996.Protein Methods.John Willey&Sons, New
York.
O.Kayser, R.H. Muller. 2003. Phamaceutical Biotechnology: Drug
Discovery and Clinical
Vektor (kloning, ekspresi, shuttle)Click Indrayati Ana to edit
Master subtitle style
5/6/12
Vektor kloning
Molekul DNA, berfungsi sebagai kendaraan untuk membawa fragmen
DNA ke dalam sel inang5/6/12
Mendapatkan DNA Macam-macam vektor kloning:
BAKTERI: plasmid, bakteriofaga, kosmid, fasmid
YEAST: YAC (yeast artificial chromosome)
Plasmid sebagai vektor kloning
DNA untai ganda berbentuk sirkuler Ukuran relatif kecil mudah
masuk ke dalam sel Gen marker: sekurang kurangnya mempunyai dua gen
marker (plasmid, gen sisipan)5/6/12
MCS: tempat pengenalan enzim restriksi untuk menyisipkan DNA
Ori: titik awak replikasi sehingga plasmid dapat bereplikasi di
dalam sel inang
a. b. c.
Berbentuk linier Overhang T Produk PCR dengan enzim Tag
polimerase-ujung A
5/6/12
Seleksi biru putih
Mengetahui apakah DNA sisipan ada di dalam5/6/12
plasmid-sudah menyisip dengan benar
MCS terdapat gen lacZ yang mengkode enzim beta galaktosidase
Beta galaktosidase memecah laktosa (X-gal) menjadi glukosa dan
galaktosa dihasilkan warna biru Jika DNA sisipan ada maka akan
merusak gen lacZ sehingga beta galaktosidase tidak dihasilkan
X-gal tidak diuraikan- dihasilkan warna putih
Beberapa contoh vektor kloningNama pBR322 Tipe Plasmid Sel inang
E. coli Keterangan
pUC8
Plasmid
E. coli
Resistensi terhadap ampisilin, skrining lac. Vektor untuk tujuan
umum Resistensi terhadap ampisilin, skrining lac. Kloning cDNA
Resistensi ampisilin. Vektor ragi shuttle
pBluescript gt10 YEp24
Plasmid Bakteriofaga Plasmid
E. coli E. coli E. coli/ragi
5/6/12
Resistensi terhadap ampisilin, tetrasiklin. Vektor untuk tujuan
umum
Vektor ekspresi
Mendapatkan5/6/12
protein
Kaset ekspresi
Komponen transkripsi: promotor, terminator
Komponen translasi: RBS, kodon start, kodon stop
Vektor shuttle5/6/12
Mempunyai dua ori sehingga dapat bereplikasi di dalam dua sel
inang yang berbeda
Pengaturan ekspresi genClick to edit Master subtitle style Ana
Indrayati
5/6/12
Komponen transkripsi5/6/12
Produk ekspresi gen:
tRNA, rRNA, mRNA Protein ( ribosom, RNA polimerase, enzim)
Mengapa ekspresi gen harus diatur?
Penggunaan energi efektif dan efisien Ekspresi gen dapat diatur,
dihidupkan atau dimatikan-aliran listrik (turn on/turn off)
Transkripsi (prokariot) , prosesing RNA, tranlasi
5/6/12
Konstitutif vs indusibel
Enzim konstitutif:
Selalu diproduksi oleh sel tidak bergantung dengan kondisi
lingkungan sekitar atau media dimana sel tersebut ditumbuhkan
Enzim glikolisis dan siklus TCA
Enzim indusible: dapat diinduksi dan diproduksi di dalam sel
sebagai respon terhadap lingkungan sekitar, diproduksi hanya ketika
diperlukan, waktu dan dalam sel tertentu
Beta galaktosidase
5/6/12
Induksi dan represi pada E. coli
Glukosa (monosakarida) sumber karbon utama: enzim5/6/12
konstitutif
Gen-gen yang mengkode enzim pemecah laktosa turn off
Laktosa (disakarida): enzim-enzim pemecah laktosa
diekspresikan
Gen-gen yang mengkode enzim pemecah laktosa turn on
INDUKSI: Ekspresi gen terjadi karena faktor lingkungan
a.
Fase eksponensial pertumbuhan 1: glukosa digunakan sebagai
sumber karbonSETELAH GLUKOSA HABIS Laktosa digunakan pada fase
eksponensial pertumbuhan 2
b.
5/6/12
Induksi dan represi pada Salmonella typhimurium
Gen-gen yang mengkode enzim untuk biosintesis5/6/12
triptofan
Medium tidak terdapat triptofan-turn on Medium terdapat
triptofan-turn off
REPRESI: ekspresi gen tidak terjadi (turn off) karena respon
terhadap lingkungan
KOREPRESOR: zat yang menyebabkan terjadinya represi
Triptofan sebagai KOREPRESOR
Mekanisme induksi dan represi
Model operon : F. Jacob dan J. Monod (1961) Operon: sekumpulan
gen yang terletak antara promotor dan terminator5/6/12
Gen-gen pada satu operon akan diekspresikan secara bersamaan-
Promotor dan terminator sama
5/6/12
Gen regulator vs gen struktural
Gen regulator: gen yang produk ekspresinya mengatur ekspresi gen
yang lain
gen lac-I: berhubungan dengan keberadaan laktosa gen crp:
berhubungan dengan keberadaan glukosa
Gen struktural: gen yang ekspresinya diatur gen regulator
Operon Laktosa: gen lac Z, Lac Y, dan Lac A
5/6/12
Operon Lac5/6/12
5/6/12
5/6/12
5/6/12
Penjelasan operon Lac1.
Keadaan tidak ada Laktosa dalam sela.
Protein repressor (Protein I) tidak ada yang mengblok sisi
aktifnya
b. c.
Protein represor berikatan dengan operator ( Lac O ) Gen Lac Z,
Lac Y dan Lac A tidak dapat diekspresikan menjadi protein
2.
Bila di dalam sel dijumpai laktosa,a.
Sisi aktif protein represor diisi oleh laktosa sehingga struktur
protein represor berubah dan tidak cocok dengan operator Protein
repressor menjadi inaktif
5/6/12
5/6/12
5/6/12
Regulasi operon Lac-Represi katabolit
Glukosa berlebih maka -galaktosidase dihentikan5/6/12
sintesisnya
3 komponen: glukosa, cAMP (cyclic AMP), dan CAP (protein
aktivator/ represor yang dikode oleh gen crp)
Glukosa menghambat sintesis cAMP melalui penghambatan aktivitas
adenylate cyclase (AC)
Kompleks cAMP -CAP berperan sebagai aktivator untuk RNAp
sehingga RNAp dapar berikatan pada promotorTRANSKRIPSI ON
Kuantitas cAMP di dalam sel berbanding terbalik
5/6/12
5/6/12
Komponen operon triptofan (trp)
O: Urutan nukleotida untuk operator- tempat5/6/12
represor berikatan
P: Urutan nukleotida untuk promotor- tempat RNA polimerase
berikatan untuk menginisiasi transkripsi
Trp A, B,C, D, E: Gen-gen struktural enzim yang terlibat pada
biosintesis triptofan
Trp: Produk akhir dari biosintesis triptofan Ketika
dikombinasikan dengan protein represor
Penjelasan operon Trp
Tidak ada trp
represor menjadi tidak aktif dan tidak dapat berikatan dengan
operator trp untuk menghambat transkripsi
Sel dapat mensintesis asam amino.
Ada trp
Represor menjadi aktif dan berikatan dengan operator dan
mencegah pengikatn RNA
5/6/12
5/6/12
Terima kasihClick to edit Master subtitle style
5/6/12
