Permiten manipular el ADN (Cortar, aislar, secuenciar, clonar y pegar) de un organismo donante para introducirlo en otro, utilizando un vector

Nathans D., Arber W., y Smith H. (premio Nobel de Fisiología y Medicina en 1978 por el descubrimiento de las enzimas de restricción y su aplicación en Genética Molecular)

ADN RECOMBINANATE (enzimas)Es cualquier moléculas de ADN formada por la unión de segmentos de ADN de origen diferente.

Enzima de restricción (o endonucleasas de Restricción) es una enzima, sintetizada por bacterias para proteger su ADN del ADN invasor, y que puede reconocer una secuencia característica de nucleótidos dentro de una molécula de ADN y cortar el ADN en ese punto.

Los fragmentos de ADN obtenidos de este modo pueden unirse por sus extremos por otras enzimas llamadas ligasas.

Molécula A Molécula B

Digestión de ambas moléculas con la misma enzima de restricción, BamHI

Mezclar

Tratar con ADN-ligasa

ADN recombinante

Extremos cohesivos

Análisis de fragmentos de ADNLa Electroforesis es una técnica analítica de separación de moléculas cargadas eléctricamente, debido a la diferente movilidad que presentan cuando son sometidas a un campo eléctrico. Se pueden separar fragmentos de ADN o ARN, en un gel de agarosa, obteniéndose un patrón de bandas dependiendo del tamaño de los distintos fragmentos.

Huella genéticaTécnica utilizada para distinguir entre los individuos de una misma especie. Se basa en se analizar zonas del ADN altamente variables o microsatélites (distinta repetición y con diferente grado de recombinación debido a la inestabilidad del locus).

Estas zonas se cortan en piezas de diferentes tamaños usando enzimas de restricción. Se obtienen un bandeado característico en la técnica de electroforesis. Estos fragmentos se pueden analizar al utilizar sondas genéticas.

Hibridación con sondas de ADNLa hibridación o renaturalización de ácidos nucleicos, es un proceso por el cuál se combinan una cadena sencilla con una secuencia de bases complementaria en una única molécula. Esto permite identificar la presencia de un gen que codifica una proteína específica.Sonda de ADN Es un fragmento artificial de ADN de cadena sencilla marcada con radiactividad o fluorescencia, y cuya secuencia de nucleótidos es complementaria a la secuencia del gen que se desea detectar. Biochips. Son láminas de vidrio donde se fija en cada una de sus celdillas una cantidad ínfima de fragmentos de ADN de cadena simple y que actúa como sonda para un gen determinado. Se utilizan para:

Detectar mutaciones (genes de enfermedades, etc.).Controlar la expresión de genes (líneas cancerosas)Diagnosticar enfermedades infecciosas.Personalizar el tratamiento con medicamentos.Sugerir nuevas técnicas diagnósticas o terapéuticas.

SONDA Y BIOCHIP

En el campo de la En el campo de la Ingeniería genéticaIngeniería genética consiste en aislar y multiplicar un gen, consiste en aislar y multiplicar un gen, o en general, un trozo de o en general, un trozo de ADNADN. . Utilizando un Utilizando un vector de clonaciónvector de clonación (plásmido, con un gen resistente a un (plásmido, con un gen resistente a un antibiótico) y su posterior inserción y antibiótico) y su posterior inserción y expresión en bacterias.expresión en bacterias.

En En Animales superiores Animales superiores consiste en consiste en obtener un individuo a partir de una obtener un individuo a partir de una célula o de un núcleo de otro individuo célula o de un núcleo de otro individuo

Obtención de organismos genéticamente idénticosObtención de organismos genéticamente idénticos

Plásmidos

1

Plásmidos

2

Extremos cohesivos

Plásmido

3

Molécula de ADN recombinante

gen de resistencia a la ampicilina

Plásmido

Virus

2

1

3

(f) (h)(g)Ciclo líticoCiclo lítico

Ciclo lisogénicoCiclo lisogénico

Genoma de hongos: 44 millones de pares de basesHuésped: Escherichia coliVector: Bacteriófagos capacidad: 20 mil pares de bases

Genoma humano: 3000 millones de pares de basesHuésped: Saccharomyces cerevisiaeVector: YAC (cromosoma artificial de levadura) MegaYAC (capacidad: 1 millón de pares de bases)

Es un proceso cíclico Es un proceso cíclico (cada ciclo consta de 3 pasos)(cada ciclo consta de 3 pasos)

94ºC desnaturalización (separación 94ºC desnaturalización (separación de las dos hebras de de las dos hebras de ADNADN))

50ºC Anillamiento de "cebadores"50ºC Anillamiento de "cebadores"

72ºC copia de cada una de las 72ºC copia de cada una de las hebras de hebras de ADNADN por la por la ADNADN polimerasapolimerasa

En 1983 Kary Mullis da a conocer esta técnica y en 1993 recibió el Premio Nobel de Química por este descubrimiento

35 ciclos 236= 68 billones de copias

ACTTTGTCCACGGCCTAAGCGTTTTTTGCCCAGTGACTTTGTCCAAC GTCCAACAGTTACCAAGTGACTTTGTCCAC TTTTGCCCAGTGACTTTGTCCA ACGGCCTAAGCGTTTTTTTT

ALINEAMIENTO DE TODAS LAS SECUENCIAS Y RECONSTRUCCIÓN DEL CROMOSOMA

Secuenciación de genomas

•Detección de mutacionesMétodo de diagnóstico rutinario (relación entre enfermedad y mutación puntual)

•Secuenciación de ADNs fósiles Posibilidad de aislar secuencias de ADN a partir de unas pocas copias (la mayoría están dañadas o degradadas)

•Diagnóstico de enfermedades genéticasDiagnóstico prenatal / Diagnóstico preimplantación de enfermedades hereditarias o determinación del sexo del feto previamente a su implantación en procesos defecundación in vitro

•Identificación de especies y control de cruces entre animales Para descubrir fraudes comerciales, tales como vender carne de una especie más barata a los precios de otra más cara, o el comercio ilegal de especies en peligro

•Secuenciación de genomas Conocimiento básico y aplicado de diferentes organismos (incluido el genoma humano)

TÉCNICAS DE INGENIERÍA GENÉTICA

• Son un conjunto de procedimientos que permiten la manipulación del ADN de un organismo para conseguir nuevas formas de vida con combinaciones únicas de genes adecuadas a las necesidades humanas.

• Mediante Ingeniería genética se puede transferir genes entre especies distintas, es decir de un organismo a cualquier otro. Con objeto de obtener organismos genéticamente modificados (OGM) o transgénicos, terapia génica, etc.

ORGANISMOS GENÉTICAMENTE MODIFICADOS

• Son organismos (bacterias, hongos, animales, plantas, etc., que contienen un gen procedente de otro organismo o transgen.

• Para introducir el transgen en un organismo determinado se utilizan vectores de expresión o vehículos de transporte, como virus o plásmidos bacterianos

Aplicaciones de los organismos genéticamente modificados

• Microorganismos: – Productos industriales farmacéuticos y médicos:

» Enzimas

» Antibióticos

» Proteínas humanas (insulina)

– Mejora del medio ambiente.» Biorremediación.

» Eliminación de metales pesados

» Producir bioconbustibles.

» Descomposición de plásticos biodegradables.

Obtención de proteínas de interés médico, comercial, etc...(insulina, hormona del crecimiento, factores de coagulación antes se obtenían a partir de los tejidos que las producen o fluidos corporales)

Obtención de vacunas recombinantes(aternativa al uso de organismos patógenos inactivos)

La levadura fabrica las proteínas víricas

con poder inmunológico

Inyección de proteínas víricas en un chimpancé

plásmido bacteriano

Integración del plásmido híbrido

en el núcleo de una célula de levaduraADN

Extracción del ADN del virus

Conocimiento previo de la secuencia de

ADN enfermo

Mediante ingeniería genética se construye

una sonda de ADN, marcada (marcaje

fluorescente), con la secuencia

complementaria del ADN enfermo

ADN enfermo

ADN sano

ADN complementario del

ADN enfermo

Diagnóstico de enfermedades de origen genético

ADN de la persona que se

quiere diagnosticar

¿Hibridación?¿No

hibridación?

Renaturalización del ADN con la sonda fluorescente

Desnaturalizació

n del ADN

Si aparecen bandas fluorescentes

demuestra que la persona presenta

la anomalíaBiochipMicroarrayDNAchip

DIAGNÓSTICO

Terapia génica, que tiene por objetivo tratar, curar y prevenir enfermedades producidas por un gen defectuoso introduciendo en el paciente un gen terapéutico o funcional.TIPOS.

Terapia génica somática, se utiliza un virus para introducir el gen terapéutico

Terapia génica de línea germinal. Consiste en introducir células transgénicas de un óvulo fecundado, con el gen terapéutico que trata de corregir defectos en el paciente como en las generaciones futuras.Problemas éticos y eugenesia

Ing. Genética. Aplicaciones médicas

Plantas transgénicas

• Para transducir nuevos genes se pueden utilizar diferentes procedimientos:– Microinyección de genes.– Pistola de genes.– Utilización de

Agrobacterium tumefaciens.

Aplicaciones:

• Aplicaciones:– Resistencia a las heladas, las

sequías, exceso de acidez o salinidad del suelo.

– Retrasar la maduración.– Mejorar el valore nutritivo – Producir plantas con interés

farmacológico– Resistencia a plagas o

herbicidas

Plantas transgénicas

tumores

célula vegetal

Proliferación de hormonas crecimiento. Se forman tumores en las zonas de la lesión

Plásmido Ti

núcleo

cromosoma

cromosoma

Agrobacterium

inductor de tumorescontiene oncogenes

(genes onc)

Ingeniero genético natural tras sutitución de genes onc por genes de interés

Transgénesis= introducción de ADN extraño en un genoma, de modo que se mantenga estable de forma hereditaria y afecte a todas las células en los organismos multicelulares.

Agrobacterium tumefaciens es patógena de plantas.Produce tumores

•Resistencia a herbicidas, insectos y enfermedades microbianas El maíz transgénico de Novartis es resistente al herbicida Basta y también es resistente al gusano barrenador europeo (contiene el Gen de resistencia a la toxina Bt de Bacillus thuringiensis) produce su propio insecticida

Problemas:La toxina Bt en las plantas transgénicas tiene propiedades sustancialmente diferentes a la toxina Bt en su forma natural.

La toxina puede ser transmitida a través de la cadena alimenticia, un efecto que nunca ha sido observado en la toxina Bt en su forma natural.Larvas de especies de insectos predadores benéficos (larvas verdes de crisopa) murieron cuando fueron alimentadas con el gusano barrenador europeo

Gold rice de Monsanto con color amarillo por los altos niveles de vitamina A

Mejora de la calidad de los productos agrícolas Producción de aceites modificados

•Síntesis de productos de interés comercialAnticuerpos animales, interferón, e incluso elementos de un poliéster destinado a la fabricación de plásticos biodegradables