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UNIVERSIDAD AUTONOMA DE BAJA CALIFORNIA SURAREA INTERDISCIPLINARIA DE CIENCIAS DEL MAR
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA MARINA
tiiog K
REACTIVOS DE ALTO VALOR AGREGADO EN CULTIVOSALTERNATIVOS DE LA MICROALGA Phaeodactylum
Ir˝cornutum BO H L˝ N sACILLARIOPHYCEAE BACILLARIOPHYTA
TESIS QUE COMO UNO DE LOS REQUISITOS PARA OBTENEREL TITULO DE
BIOLOGO MARINO
PRESENTA
Tania Ledesma Verdejo
la Paz Baja California Sur MØxico Octubre del 2000
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UNIVERSIDAD AUTÓNOMADE
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Ccp Intrcsado
Este trabajo esta dedicado a
LEONARDO
Mi mÆs grande motivo de alegría cuando estÆ contento y de tristezacuando se encuentra enfermo triste o ausente Almotor de mi vida que me
impulsa a vivirla ya ser tan feliz por quiØn he aprendido y aprenderØ paraØl
MamÆ
QuiØn gracias a ella estoy aquí en este escenario de la vida dondeella me cuidó y alimentó quiØn me ha dado su apoyo cuando mÆs lo henecesitado
PapÆQuiØn siempre medio sus consejos y su mano para ira la escuela A
mi hØroe cada vez que memetía en apuros pero sobre todo a mi mejoramigo
HermanasA Lizbeth por darme todo su apoyo y ejemplo para seguir adelante
que aligual que Karen formo parte de su felicidad y tristeza yes ellas a
quienes les debo mucho de lo que pude hacer aquí A Samara esperandoalgo de esto le sirva para formarparte del camino que emprenda
Ese ser inimaginableque me da la fortaleza interiorpara levantarme cada vez que tropiezo
que me hace sentir capaz de realizar todo cuanto quiera a ese Ser quelogra sentir en m amor a Ti quien quiera que seas
AýRAÞSC IMISNTOS
Mí fawíLía por bríl ctarwe su carílˆO tj apotjo íVvCOl ctícíolaL eltoctos Los aspectos
Revísoves cteL preselte trl1bcœoÞr Ml1rco AltOlío C l1ctev
l1 Rol1 M elC Ml1ríl1 AltOlíetl1 ýuzwIMuríLLo tj l1L Þr
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CONTENIDO
GLOSARIOa
LISTA DEFIGURAS
b
LISTA DETABLAS
c
RESUMEN d
ABSTRACT f
INTRODUCCIÓN 1 0
1 1 Generalidades osbre el cultivo de microalgasPrevención y control de enfermedades
1 2 PolisacÆridos sulfatados
1 3 Superóxido Dismutasa SOO14 Aspectos económicos
2 0ANTECEDENTES
62 1 Cultivo de microalgas
TØcnicas de cultivo
ParÆmetros de cultivo
Selección del medio de cultivo
Caracterización diagnóstica de la microalga Phaeodactylum tricornutum
2 2 PolisacÆridos sulfatados
2 3 Superóxido Dismutasa SOD
3 0JUSTIFiCACiÓN
16
4 0 OBJETIVOS
184 1 Objetivo General4 2 Objetivos Particulares
s O M ETODOLOGíA
195 1 Condiciones de cultivo para la microalga Phaeodactylum tricornutum
Acondicionamiento de la microalga Phaeodactylum tricornutum
Cultivos masivos de la microalga Phaeodactylum tricornutum en 15 1Evalœación del crecimiento
Cuenta celular
ParÆmetros de crecimientoAnÆlisis estadísticos
Crecimiento de la microalga Phaeodactylum tricornutum con respectoal medio fl2
Reactivos de alto valor agregado5 2 Cuantificación de polísacÆrido sulfatados
5 3 Determinación de la actividad SOD54 Evaluación de los costos de los medios de crecimiento
6 0RESULTADOS
23
6 1 Crecimiento de la microalga Phaeodactylum tricornutum en bolsas de 15 11AnÆlisis estadístico
ParÆmetros de crecimiento
6 2 Cuantificación de PolisacÆridos sulfatados
6 3 Determinación de la actividad SOD64 Evaluación económica de los medios considerados
7 0 DISCUSION 33
7 1 Crecimiento de la microalga Phaeodactylum tricornutum en bolsasde 151
Selección del medio de cultivo
ParÆmetros físico químicosParÆmetros de crecimiento
7 2 Cuantificación de polisacÆridos sulfatados7 3 Determinación de la actividad SOD74 Evaluación económica de los medios analizados
8 0 CONCLUSIONES 42
9 0 RECOM ENDACIONES 44
10 0BIBLIOGRAFíA
45
11 0ANEXOS
52
Glosario
GLOSARIO
ACTIVIDAD
ENZIM`TICA Capacidad de una enzima para transformar un substrato
AISLAMIENTO Obtención de cultivos monoalgales a partir de una muestra
agua
ANTIBiÓTICO Compuesto de bajo peso molecular que tiene la capacidad de
inhibir o suprimir el desarrollo o multiplicación bacteriana
ANTICUERPO Proteína producida a causa de la introducción de un antígeno y
que tiene la capacidad de combinarse con el antígeno queestimuló su producción
ANTíGENO Sustancia que reacciona con anticuerpos o receptores de cØlulasT
ASIMILACiÓN Proceso fisiológico en el cuÆl se metabolizan los nutrientes
empleando al oxígeno como el aceptor final de los electrones
CADENA TRÓFICA Sucesión de organismos en una comunidad ecológica que
constituye una continuación del flujo de energía alimenticia de un
organismo a otro
CARRAGENINA PolisacÆrido sulfatado aislado de algas rojas y que tiene la
propiedad de formar geles
CEPA
COLONIZACiÓN
Cultivo puro de un organismo de una determinada especie
Capacidad que tiene un microorganismo para establecerse en un
huØsped susceptible
CULTIVO MASIVO Aquellos cultivos de microalgas realizados en volœmenes mayoresde 10 litros
DEXTR`N SULFATO Derivado polianiónico de dextrÆn que es un polisacÆrido con
cadenas lineares de residuos de D glucopiranosa y con un pesomolecular aproximado de 500 000 Da
ENZIMAS Proteínas especializadas en la catÆlisis de las reacciones
biológicas
ESTER IL1ZACIÓN Destrucción total de todos los organismos que viven en un
volumen de agua
FOTOAUTÓTROFO Organismo capaz de sintetizar su propio alimento a partir desustancias inorgÆnicas usando la luz como fuente de energía
FOTosíNTESIS
FUCOIDAN
H IPOCOLESTEREM ICO
INOCULAR
METABOLISMO
METBOLlTO
MET`ST ASIS
MOL M
NUTRIENTE
POTENCIALDE HIDRÓGENO pH
RADICAL LIBRE
SOLUCiÓN STOCK
STOCK DE CULTIVO
SU BSTRATO
SULFATO DEHEPARINA
ÚLCERA G`STRICA
Glosario
Proceso de síntesis de carbohidratos a partir de bióxido de
carbono yagua utilizando energía radiante de la luz captada por laclorofila en las cØlulas vegetales
PolisacÆrido sulfatado aislado de algas cafØs
Niveles bajos de colesterol
Procedimiento de transferencia de microalgas en los diferentes
niveles de cultivo
Transformaciones que permiten la utilización de la materia y
energía por parte de un ser vivo
Producto intermedio del metabolismo
Desarrollo noeplÆsmico del estómago resultado de un daæo tisular
excesivo asociado a un proceso inflamatorio prolongado pordØcadas por infección con Helicobacter pylori
Cantidad de un compuesto químico cuya masa en gramos es
equivalente a su peso molecular la suma de los pesos atómicosde sus Ætomos constituyentes v gr NaN03 N 14 g 0 16g 3
NaN03 85 G
TØrmino genØrico para cualquier sustancia que pueda utilizarse en
los procesos meta bólicos de un ser vivo
Logaritmo negativo de la concentración del ion hidrógeno porvirtud de la cuÆl se expresa el grado de acidez o alcalinidad de un
líquido
`tomos o molØculas cuya œltima capa electrónica no se encuentra
apareada en su totalidad
Solución que mantiene el medio de un cultivo concentrado parasu fÆcil manejo
Cultivo madre inicial de microalgas
Sustancias nutritivas presentes en el medio
Proteoglicano sulfatado formado por una cadena polipeptídica y
con ramificaciones de polisacÆridos compuestas de unidades
repetitivas
Degeneración de la mucosa gÆstrica
Glosario
ÚLCERA PÉPTICA Perforaciones en Æreas de la mucosa gÆstrica causada por daæos
de Æcidos en Æreas debilitadas del estómago por inflamación
debida a infecciones producidas por Helicobacter pyori o bien
debido a otros agentes como drogas no esteroídeas o anti
inflamatorias incluyendo aspirinasUNIDADES DE
ACTIVI DAD
ENZIM`TICA Cantidad de enzima que origina la transformación de 1 0 mol
10 6 de substrato por minuto a 250C
Lista de figuras
Figura 1
Figura 2
Figura 3
Figura 4
Figura 5
Figura 6
Figura 7
Figura 8
Figura 9
LISTA DE FIGURAS
Curva representativa del crecimiento de un cultivo 8
estÆtico de microalgas
Phaeodactylum tricornutum microalga marina pertenecientea la Clase Bacillariophyceae 13
Esquema de acondicionamiento de la microalga Phaeodactylumtricornutum en los medios alternativos 20
Curva de crecimiento de la microalga Phaeodactylumtricornutum cultivada con el medio fl2 de
Guillard23
Curva de crecimiento de la microalga Phaeodactylumtricornutum cultivada con medios alternativos primer grupo 24
Curva de crecimiento de la microalga Phaeodactylumtricornutum cultivada con medios alternativos segundo grupo 25
Curva de crecimiento de la microalga Phaeodactylumtricornutum cultivada con medios alternativos tercer grupo 26
Contenido de polisacÆridos sulfatados durante el crecimiento de
Phaeodactylum tricornutum en los mediosexperimentales
28
Determinación de la actividad especifica de la SOD durante el crecimiento
de Phaeodactylum tricornutumen los medios experimentales 29
Lista de tablas
LISTA DE TABLAS
Tabla 11I ParÆmetros de crecimiento de la microalga Phaeodactylum 27
tricomutum obtenidos de los medios experimentales
Tabla IV Evaluación de costos de los medios decrecimiento
30
Tabla V Reseæa que muestra los costos de los medios de crecimiento
al día de mayor actividad de la SOD 37
Tabla VI Tabla que muestra la probabilidad de obtener polisacÆridossulfatados al día de mayor actividad de la SOD y el porcentajede costo en relación a los medios formulados 38
LISTA DE ANEXOS
ANEXO I Tabla 1 Formulación de medios de crecimieto para el cultivo de
Ph tricomutum y Tabla 11 Medio 16 f 2 de Guillard y Ryther 49
ANEXO 11 Estadísticos de prueba empleados para el crecimiento de
Ph tricomutum en 15 litros homocedasticidad de Barlett Xi2 yt de student 51
ANEXO IV TØcnica para la determinación de sulfatos en polisacÆridospor el mØtodo azul AlciÆn 53
ANEXO V TØcnica para determinar la actividad específica de la SODpor NBT 54
RESUMEN
En el presente trabajo se evaluó a nivel de laboratorio el costo y el efecto de 16
medios de cultivo en la microalga Phaeodactylum tricomutum para la optimización del
crecimiento y de reactivos de alto valor agregado polisacÆridos sulfatados y superóxidodismutasa La formulación de los medios se realizó con el medio f 2 de Guillard y Ryther
utilizado como testigo y los medios restantes con la combinación de fertilizantes agrícolasUrea nitrato de amonio y sulfato de amonio algunos fueron adicionados con fertilizante
foliar El tiempo de acondicionamiento fue de 14 días en cultivos estÆticos Se evaluó la
cinØtica de crecimiento de la microalga en volœmenes de 15 I durante 12 días de los
cuales sólo de 9 medios se calcularon los parÆmetros de crecimiento el contenido de
polisacÆridos y la actividad superóxido dismutasa Al analizar el crecimiento con todos los
medios existieron diferencias significativas en los medios 2 5 8 9 10 Y 15 En cuanto los
parÆmetros de crecimiento los mejores resultados de producción neta n tasa de
crecimiento k rendimiento r y tasa de duplicación td se observaron en el medio 13
formulado con nitrato de amonio ultrafos y N P K 13 2 44 el cuÆl resultó encontrarse
en forma mejor asimilable por Ph tricomutum que el medio f 2 El contenido de
polisacÆridos sulfatados se encontró alrededor de los 80 lg ml en la mayoría de los
cultivos con los medios experimentales manteniØndose a lo largo de la cinØtica de
crecimiento excepto en los medios 4 y 11 Los mÆximos valores de la actividad fueron
encontrados en los medios 3 4 6 9 Y 11 alcanzando en promedio 85 U mg en los días 6
y 7 Sin duda el f 2 resultó ser el medio con el mayor costo representado con un 55 del
total sin embargo fue el que menor contenido de enzima tuvo El medio 1 representa un
costo del 22 resultando ser uno de los mÆs completos en cuanto a la actividad y
polisacÆridos sulfatados al igual que el medio 6 aœn mÆs barato con el 8 del costo total
ABSTRAeT
In the present work to evaluate in laboratory conditions the cost and the effect of 16
culture medias altematíves to Guillard f2 on the growíng the content of sulfated
polysaccharides and the SOD activity The formulations of the medias were with 3
fertilizer ammonium sulfate ammonium nitrate and urea Some were enriehment with
toliar fertilizer The microalgae conditions in time was 14 days in batch eultures T he
growing kinetics was studied in 15 I volume cultures during 12 days Diary samples were
taeked to determine the content of sulfathed polysaccharides by aleian blue assay and the
SOD activity by NBT teehnique Significant differences were found in the kinetie growth
with culture medias 2 5 8 9 1 O and 15 The maximun microalgal growth was obtained in
the media 13 with a pn 18 and the minimal growth was for f 2 media with a pn 5 r
15166 k 0 11 Y td 2 8 The activity SOD maxim was found in the media 3 with 95 U Ilg
ot protein and the sulfated poliysaccharides content was similar in all cultures medias with
80 Ilg ml However for the obtention of polysaccharides and aetivity SOD at the same time
is recommendable to use the media culture 6 the which is cheaper than f 2 media
J
1 0lNTRODUCCIÓN
1 1 Generalidades sobre el cultivo de microalgas
La acuacultura se considera como una actividad dirigida a producir organismos en el
agua tendiente a racionalizar la explotación de los recursos acuÆticos y comercializarlos
proporcionando alimento reactivos biológicos y trabajo La contribución de la acuacultura a la
industria es y seguirÆ siendo limitada por las reservas naturales de manera que dentro de
sus principales alcances se encuentran a el conocimiento de la biología de las especies con
las que se cuenta b resolver los problemas de la alimentación c estudiar y conocer nuevas
sustancias de interØs comercial y d obtener el control del ambiente acuÆtico JuÆrez 1987
García y Cabrera 1985
Entre los organismos mÆs cultivados se encuentran las microalgas las cuÆles se
localizan en el medio marino dulceacuícola y en parte de los ecosistemas terrestres
existiendo en formas tanto unicelulares como multicelulares Son organismos microscópicos
con capacidad de realizar fotosíntesis y como tales son considerados como productores
primprios al constituir la base de las cadenas tróficas produciendo material orgÆnico a partir
de la energía solar bióxido de carbono yagua Raymont y Maxey 1994 Beneman 1992
Brown el al 1997 Se estima que existen aproximadamente 30 mil especies distintas de
microalgas consideradas responsables de la producción de materia orgÆnica encontrada en
los ecosistemas acuÆticos y casi del 60 de la fotosíntesis total del planeta Bold y Wynne
1985 Poseen clorofila a característica que comparten con varias plantas sin embargo la
mayor diferencia que podemos mencionar entre una microalga y una planta es su
reproducción En algas unicelulares la cØlula en su totalidad funciona como gameto no
siendo así en las plantas superiores donde es necesaria una estructura especializada para
ello AdemÆs tanto plantas como microalgas requieren de nutrientes para su crecimiento
Dawes 1981
Desde los aæos cincuentas las microalgas fueron consideradas por Jorgensen y Convit
1953 para ser incorporadas como parte de la dieta humana lo que dió como consecuencia
el desarrollo de manufacturas de los extractos obtenidos con distintas aplicaciones en la
industria alimenticia obteniØndose resultados no muy alentadores Por otra parte al hacer
un anÆlisis económico del cultivo de microalgas se puede hacer evidente que dicha actividad
se puede considerar rentable lo que ha permitido y alentado significativamente la producción
2
de microalgas en los aæos recientes llegÆndose a tener hasta 100 toneladas por hectÆrea de
Chlorella bajo condiciones de cultivo en campo Ben Amotz et aJ 1982 producción que es
comercializada tanto para biomasa como para forraje así como productos secundarios de un
alto valor agregado
Aunado a esto el cultivo de microalgas ofrece ciertas ventajas sobre otros tipos de
cultivo fÆcil asimilación y digestión alta tasa de crecimiento de tal forma que se han ido
desarrollando tØcnicas que permiten un incremento en su producción y comercialización para
la obtención de materia orgÆnica a partir de la energía luminosa Se han desarrollado cultivos
algales para la explotación comercial de compuestos tomo proteínas enzimas
carbohidratos Æcidos grasas colorantes agentes saborizantes y c1arificantes Aronson et
al 1980 Así mismo se pueden obtener una variedad de compuestos farmacológicamente
activos como los inhibidores de proteasas Canell et al 1988 Æcidos grasas
poliinsaturados Ahern et al 1983 Cohen et al 1988 Lee et al 1988 polisacÆridos
mucilaginosos compuestos metabólicos con actividad antibacteriana FÆbregas el al 1991
Prevención y control de enfermedades
Las enfermedades infecciosas en sistemas de cultivos son dramÆticas si se toma en
consideración los altos índices de mortalidad que se presentan en estos organismos En el
alto desarrollo de la industria del salmón anguila y trucha en zonas templadas se han
realizado estudios sobre la naturaleza de los agentes causales de dichas enfermedades y
ya desde la dØcada de los ochenta se hacía mención a las mÆs de veinte enfermedades
bacterianas cutÆneas y sistØmicas así como treinta enfermedades virales y mÆs de cien
parasitarias externas e internas de especies de interØs comercial sin embargo poco se ha
avanzado en lo referente a enfermedades de peces marinos de zonas tropicales y
subtropicales lo que se ha convertido en un verdadero reto el contar con alternativas
profilÆcticas y terapeœticas para contrarrestar infecciones mîcrobianas tanto en acuacultura
como en medicina veterinaria y humana
El costo para la prevención y control de enfermedades infecciosas en cultivo de peces
es difícil de estimar sin embargo se puede predecir el impacto económico de la disminución
en la producción debido a procesos infecciosos las pØrdidas pueden fluctuar en un rango
del 10 al 15 sobre el 30 del costo total JimØnez et al 1987
3
Dado que en ocasiones resulta difícil determinar los factores que alteran la calidad de
agua en el cultivo de organismos marinos se emplean terapias de antibióticos como
mecanismos de control de infecciones producidas por especies de la familia Vibronaceae
Sin embargo la quimioterapia en la acuacultura dependerÆ en gran medida de las
regulaciones sanitarias sobre el uso de antibióticos La razón de ello estriba en que Østos
organismos desarrollan rÆpidamente resistencia a antibióticos por lo que recientemente se
explora la posibilidad de establecer esquemas de vacunación como medida profilÆctica y
aunque existen en el mercado algunas vacunas comerciales Østas estÆn dirigidas
principalmente a problemas infecciosos de peces de agua dulce De aquí que se han
orientado estudios al conocimiento del uso de inmunoestimulantes que nos permitan
desarrollar procesos de rutina en la profilaxis lo que provocaría el desplazamiento paulatino
de un gran nœmero de fÆrmacos y por lo tanto la disminución de los efectos adversos que
estos compuestos pueden generar al incorporarse en la cadena trófica Heltnes y Roberts
1994 Por estÆ razón el empleo de inmunoestimulantes naturales representa una alternativa
atractiva para controlar y prevenir infecciones en organismos marinos cultivables
1 2 PolisacÆridos sulfatados
Se entiende por monosacÆrido un carbohidrato formado por una cadena de carbonos
un polisacÆrido es el anhidro resultante de la reacción de 30 ó mÆs monosacÆridos
polisacÆrido sulfatado porque en su estructura presenta un radical alfa ester sulfato COS03
Morrison 1990 En los aæos sesentas existieron reportes sobre la producción de
compuestos antibióticos en algas marinas Sierburth 1961 no es hasta los aæos setentas
que toman importancia los productos naturales marinos debido a la necesidad de encontrar
molØculas nuevas que tengan una aplicación en el tratamiento de enfermedades en el
humano y en veterinaria De esta forma se describe que polisacÆridos como el fucoidan que
se encuentran en la pared celular de ciertas algas marinas Larsen et al 1966 Kloareg y
Quatrano 1988 estÆn asociados a actividades biológicas como es el reconocimiento y la
adhesión celular así como la regulación de receptores de comunicación celular Cassaro y
Dietrich 1977 Hook et al 1984 tambiØn se han estudiado compuestos relacionados como
el sulfato de dextrÆn que tiene actividad anti adhesiva y anti inflamatoria Raepple et al
1976 Pangburn et al 1991 Así pues considerando la variedad de usos biomØdicos que se
4
han descrito sobre los polisacÆridos sulfatados aislados de algas marinas podemos
confirmar la importancia de estos compuestos en el tratamiento de una variedad de
enfermedades en el humano y en veterinaria Ehresmann et al 1979
Las ventajas que representaría el uso de microalgas para la obtención de reactivos
biológicos de alto valor agregado como alternativa al uso de productos provenientes de
macroalgas son atractivas como para pensar en el desarrollo de una industria
biotecnológica
1 3 Superóxido Dismutasa
Segœn Ramírez 1998 los organismos aeróbíos la mayor parte de su energía la
obtienen a travØs de la respiración oxidación de los compuestos orgÆnicos por el oxígeno
molecular durante este proceso aproximadamente el 5 de oxígeno consumido no es
reducido a agua dando lugar a radicales libres los cuales son molØculas o Ætomos que
contienen uno o mÆs electrones no apareados que generalmente afectan en mayor grado la
reactividad química del Ætomo o molØcula tal es el caso de los radicales libres tipo
superóxido 02 peróxido de hidrógeno H202 e hidroxilo OH cuyas reactividades son
variables
La forma protonada del radical superóxido radical perhidroxilo puede dar inicio y
propagar la peroxídación de Iípidos dando como resultado el estrØs oxidativo Para
contrarrestar el efecto de los radicales libres existen enzimas que secuestran catalíticamente
los intermediarios de la reducción del oxígeno Es así como el radical superóxido es
eliminado por la enzima superóxido dismutasa SOD quiØn lo convierte a peróxido de
hidrógeno mÆs oxígeno El peróxido de hidrógeno a su vez es removido por la catalasa
convirtiØndolo a agua mÆs oxígeno y por peroxidasas quienes lo reducen a agua mediante
reductores celulares En seguida se muestran tales reacciones
e02 02
O2 O2 2H
H202 2 H20 02
2 H202 RH2
e2H
H202 eH
HO H20e H
2H20
H202 02 Superóxido dismutasa
2H20 02 Catalasa
2H20 R Peroxidasa
5
Existen 4 tipos de enzimas superóxido dismutasa dependiendo del grupo prostØtico
CuZnSOO en citoplasma de plantas y eucariotas Extracelularmente en fluídos
corporales de mamíferos
Mn2 500 en matriz mitocondrial y citoplasma de bacterias y algas
FeSOO en espacio periplÆsmico de procariotes
NiSOO en citoplasma de levadura marina
1 4 Aspectos económicos
Debido a que generalmente hacen falta recursos econÆmicos para dar mÆs auge a la
investigación para la acuacultura la contribución de biotecnologías que incluyan aspectos
encaminados a la obtención de biomasa tØcnicas de cosecha y procesos tecnológicos a
corto plazo y económicos podrían ser mÆs atractivos para el sector productivo lo que
permitiría la vinculación con los centros institucionales de investigación Shelef et al 1978
Mohn 1978 En el caso del cultivo de microalgas segœn Buitrago y colaboradores 1989 el
control de la producción masiva tiene un precio muy elevado el suministro de luz control de
la temperatura el aire el bombeo de agua y los nutrientes resultan ser factores que elevan
en gran medida los costos de producción masiva por lo que dentro del objeto de reducir
costos se encuentra el aspecto de evaluar medios de crecimiento económicos que ofrezcan
buenos resultados respecto a los a los medios convencionales que ademÆ9 de representar
costos muy altos su manejo y preparación son complejos
6
2 0 ANTECEDENTES2 1 Cultivo de Microalgas
Desde la dØcada de los sesentas se implementaron tecnologías modulando las
características fisiológicas a partir de Dunaliela salina para la obtención de mayores
rendimientos de los productos de interØs y su aprovechamiento como fuente de alimento y
la obtención de productos de alto valor agregado como pigmentos y glicerol entre otros
Ben Amotz et al 1982
Se han realizado tambiØn varios estudios en los cuales se examina el crecimiento y
composición química de microalgas en diferentes medios de cultivo con el fin de reducir
costos y mejorar la producción GonzÆlez Rodríguez y Maestrini 1984 realizaron cultivos de
microalgas utilizando fertilizantes agrícolas como medio alterno para la producción masiva de
biomasa Newmark y colaboradores 1989 estandarizan el cultivo de seis cepas de
microalgas con cuatro medios de cultivo López Elías y colaboradores 1993 llevan a cabo
el cultivo de tres microalgas marinas con medios no tradicionales Existen tambiØn estudios
donde se detectan los cambios en las proteínas el tipo de carbohidratos y el grosor de la
membrana en la microalga marina Dunaiella tertiolecta bajo diferentes concentraciones de
nitrógeno como nitratos nitritos y urea FrÆbregas et al 1989 Fidalgo y colaboradores
1995 trabajaron con el cultivo de Phaeodactylum tricornutum con diferentes fuentes de
nitrógeno para estudiar su crecimiento conversión de nutrientes y composición bioquímica
La microalga Phaeodactylum tricornutum se encuentra ubicada dentro del grupo de
microalgas que responden a fertilizantes agrícolas segœn GonzÆlez y Maestrini 1984 López
Elías y Voltolina 1993 cultivaron cuatro microalgas entre ellas Phaeodactylum utilizando
los medios f 2 de Guillard y Ryther y un fertilizante para cítricos con tasas de dilución entre
75 y 15 segœn la especie y el medio de cultivo los resultados demostraron que la calidad
de la biomasa fue independiente del medio Así mismo FÆbregas y colaboradores 1989
cultivaron cuatro especies de microalgas Tetraselmis suecica Dunaliela tertiolecta Isocrysis
galbana y Phaedoctylum tricornutum en diferentes medios de cultivo Walne ES F 2 Y Algal
1 para obtener su biomasa y constituyentes químicos como proteínas carbohidratos y
7
lípidos a partir de Østos obteniendo diferencias significativas en cada una de las especies y
con cada uno de los medios FÆbregas y colaboradores 1996 realizaron un experimento
factorial compuesto de seis tipos de nutrientes y seis rangos de renovación para optimizar el
cultivo semicontínuo de Phaeodactylum tricomutum obteniendo una densidad mÆxima de
85x106cØlulas ml obteniendo 8 y 6 mmol de N por litro y una tasa de renovación del 10
donde lípidos y carbohidratos fueron almacenados como reservas energØticas
Para lograr la producción comercial del producto de interØs es necesario realizar
escalamientos experimentales en el laboratorio y definir las condiciones óptimas de cultivo
obteniendo así mejores rendimientos de biomasa y por lo tanto de metabolitos secundarios
de interØs particular Para ello las ventajas que el cultivo de microalgas ofrece son Juvera
1996 1 tiempo de duplicación cada 24 horas 2 elevada tasa de transformación de nitratos
a proteína 3 elevado contenido proteico 4 composición bioquímica dependiente de las
condiciones de cultivo 5 escalamiento de cultivo hasta nivel industrial 6 crecimiento
autotrófico heterotrófico mixotrófico y 7 producción de 20 veces mÆs biomasa que en los
cultivos agrícolas convencionales
TØcnicas de Cultivo
La forma en la cuÆl las microalgas son cultivadas varía ampliamente no sólo dependede la especie a cultivar sino tambiØn del objeto del uso que se le asigne al cultivo
Se han desarrollado diversas tØcnicas de producción dependiendo de los requerimientos
A En cuanto al espacio donde se realiza el cultivo se clasifican como
Cultivos Interiores cultivos realizados bajo condiciones controladas
Cultivos Exteriores cultivos realizados a la intemperie
B En cuanto a la continuidad del cultivo segœn Orebes 1972 estos pueden ser
Cultivos EstÆticos se caracterizan porque a partir de un inóculo viable se proporciona el
medio de cultivo a las microalgas por primera y œnica ocasión
Este sistema soporta la multiplicación celular por tiempo limitado presentando cambios en
la composición del medio y la intensidad de luz dentro del cultivo El desarrollo del cultivo se
realiza hasta la fase de crecimiento exponencial y se utiliza el volumen total del mismo El
uso de estos cultivos es para fines de bioensayo o bien de transferencia a volœmenes
mayores
8
t Estacionaria
Lag delnœmero decØlulas
I Muerte
Lentocrecimiento
Oecimiento
exponendal
AdaptaciónJ I
I Edad del cultivo
Figura 1 Curva representativa del crecimiento de un cultivo estÆtico de microalgas
Modificado de Fogg y Thake 1987
En la figura 1 se pueden apreciar la curva de crecimiento de cualquier especie de
microalga en un cultivo estÆtico la cuÆl consta de cuatro etapas bien definidas a travØs de
las cuales cambia la composición del medio y las propias cØlulas La curva de crecimiento en
sí es un registro para identificar la etapa de mayor densidad de las microalgas la cuÆl indica
el momento adecuado para cosechar es decir la transferencia a un volumen mayor de
medio las fases son las siguientes Berbnabe 1990
Fase de adaptación o retraso del crecimiento Al inocular a un medio nuevo a menudo
no se registra un crecimiento inmediato en el nœmero de cØlulas Esta fase se puede retardar
de 1 a 3 días dependiendo del tamaæo y del estado del inóculo
Fase exponencial Es cuando al adaptarse las microalgas al medio empiezan a aumentar
en forma geomØtrica o exponencial Se presenta del segundo al tercer día de inóculo y puede
durar hasta cuatro días mÆs dependiendo del tamaæo del inóculo y de la cantidad del medio
de cultivo
Fase de declinamiento Dura aproximadamente dos días y se empieza a manifestar un
decremento en la velocidad de reproducción de las cØlulas debido a las condiciones
desfavorables en el cultivo generadas por la fase anterior Al finalizar esta fase el cultivo
alanza su densidad mÆxima
9
Fase de muerte Se incrementa el nœmero de cØlulas muertas y prÆcticamente ya no se
presenta la división El nœmero celular decae exponencialmente debido a la conjunción de
factores adversos en el medio
Cultivos Semicontinuos Son cultivos que se diluyen a intervalos frecuentes La
concentración de biomasa es monitoreada para estimar la frecuencia exacta de dilución y
la propia dilución es decir una parte de cultivo se recoge para su utilización al final de la
fase exponencial y la cantidad que se retira es reemplazada con medio de cultivo fresco
Requiere menor mano de obra que el discontinuo A travØs de Øl se pueden mantener
sistemas interiores para la producción de microalgas durante varias semanas e implica
volœmenes grandes o cultivos masivos
Cultivos Continuos El suplemento de nutrientes frescos se da continuamente
adicionåndose la misma cantidad de medio que la cantidad de cultivo retirada
permaneciendo con un volumen constante por lo que la población es mantenida tambiØn
en su fase exponencial densidad del cultivo alta controlada y constante durante largos
períodos de tiempo Las condiciones de cultivo son controladas y el factor que controla el
crecimiento en este cultivo es la tasa a la que se aæade al medio fresco
ParÆmetros de Cultivo
Existen diversos factores que de forma individual o interactuando entre sí influyen de
manera importante en el desarrollo de cultivos de microalgas
A Luz Las microalgas son organismos fotoautótrofos encargados de convertir la energía
luminosa en energía metabólica por medio del proceso de la fotosíntesis la radiación
utilizada para realizarla se encuentra dentro del espectro de luz visible y deben tomarse en
cuenta 3 factores la intensidad la longitud de onda y el fotoperíodo Richmond 1986
B Temperatura La biomasa microalgal responde continuamente a la temperatura
ambiental Este factor afecta reacciones celulares metabolismo requerimientos nutricionales
y composición de la biomasa Se considera que la temperatura óptima de un cultivo de
microalgas se sitœa entre un rango de 150 a 220C por lo que los cultivos son realizados en
cÆmaras de temperatura controladas Abalde el al 1995
C Potencial de hidrógeno pH Debido a que la concentración de íones de H2 u OH intra y
extracelular no estÆn necesariamente bien equilibrados existe un gradiente de
10
concentración de hidrogeniones a travØs de las membranas lo que ocasiona una gran
dependencia de la algas respecto al pH del medio de cultivo respondiendo de diferente
manera segœn la especie el mÆs adecuado estÆ entre 7 y 8 Richmond 1986
D Agitación Se encarga de la distribución homogØnea de las cØlulas y los nutrientes dentro
del cultivo dejÆndolos disponibles para el mejor aprovechamiento La agitación mejora la
distribución de la luz a las cØlulas asegurando que permanezcan fotosintØticamente activas
evita la sedimentación y previene la estratificación tØrmica Richmond op cit
E Salinidad La concentración de sales inorgÆnicas disueltas puede potencialmente
afectar al crecimiento de las microalgas en función de su actividad osmótica Los niveles
óptimos de salinidad dependerÆ de cada especie ya que respecto a su adaptación a la
salinidad las algas pueden dividirse en halotolerantes y halofíticas Abalde op cit
F Nutrientes La suministración del medio de cultivo debe ser adecuada para lograr un
orecimiento óptimo este deberÆ ser formulado de acuerdo a los requerimientos de la especie
a cultivar LEntre los nutrìentes importantes se pueden mencionar el carbono el cual
constituye el 50 de la biomasa microlagal El bióxido de carbono es la fuente de carbono
celular durante el crecimiento fotoautotrÓfico característico de las microalgas y se suministra
generalmente mezclado con aire Kaplan et al 1986
El nitrógeno despuØs del carbono es el elemento mÆs importante que conforma la materia
orgÆnica de las cØlulas algales La fuente de nitrógeno utilizada suele ser inorgÆnica nitratos
nitritos y amonio aunque a veces se utiliza nitrógeno orgÆnico y en este caso el compuesto
mÆs comœnmente utilizado es la urea Kaplan op cit
El fósforo es otro de los nutrientes primordiales que requiere la microalga para poder
crecer estÆ involucrado en la mayoría de los procesos celulares como transferencia de
energía y síntesis de Æcidos nucleicos Como fuente de fósforo se utiliza fundamentalmente
fosfato inorgÆnico Kaplan op cit
Algunos nutrientes como los silicatos son para las diatomeas requerimientos
específicos debido a que son el mayor componente de su pared celular La incorporación de
estos por las microalgas se realiza durante la división celular Kaplan op cit
Existen otros tipos de nutrientes a los cuales se les denomina micronutrientes son una
mezcla de compuestos que se requieren en bajas concentraciones en el rango de micro a
miligramos por litro del medio de cultivo La efectividad de la mezcla de estos compuestos
11
requiere de un agente quelante como el EDTA Entre los micronutrientes necesarios se
encuentran
1 Hierro necesario para todas las especies de microalgas Es imprescindible para el
metabolismo del nitrógeno fotosíntesis y síntesis de citocromos Kaplan op cit
2 Azufre se utiliza como su fato inorgÆnico y es fundamental para la división celular
3 Calcio la cantidad de este nutriente varía mucho entre las especies y estÆ relacionado con
el tipo de pared celular
4 Sodio potasio y cloro son universalmente requeridos por las microalgas actuando los dos
primeros como activadores enzimÆticos mientras que el cloro es fundamental para la
fotosíntesis
5 Magnesia forma parte de la molØcula de clorofila y determina la agregación de ribosomas
Kaplan op cit
6 Manganeso y cobre forman parte de la cadena de transporte electrónico y son cofactores
de muchas enzimas
7 Molibdeno en necesario para la asimilación de nitrógeno
8 Cobalto en necesario en aquellas microalgas que sintetizan la vitamina 812 las que no lo
sintetizan no necesitan cobalto pero si la vitamina
9 Tiamina y biotina requeridas en bajas concentraciones
Selección del Medio de Cultivo
Dentro de los aspectos a considerar en el cultivo de microalgas es la selección del
medio de cultivo a utilizar El agua de mar es considerada como un medio ideal para el
desarrollo de las microalgas Sin embargo se hace necesario adicionar nutrientes para
enriquecerla Los medios de cultivo son muy diversos aunque todos coinciden en una fuente
principal de nitrógeno fósforo y una mezcla de metales traza con soluciones quelantes y
vitaminas Stein 1973 Es comœn que a partir de un medio formulado se realicen
modificaciones empíricas hasta que los requerimientos de la microalga en cuestión sean
satisfechos El medio de cultivo conocido como f 2 de Guillard es el utilizado comœnmente
con gran Øxito tanto en el laboratorio como en las granjas de cultivo donde se requieren
producciones a grandes escalas Treece y Fax 1993 Juvera 1996
La selección del medio de cultivo se basa inicialmente en los requerimientos de la
12
especie de microalga a cultivar Anteriormente se basaban en medios complejos desde el
punto de vista de sus componentes en la actualidad se pone Ønfasis en la necesidad de
utilizar fertilizantes de bajo costo pero que a la vez aseguren altas concentraciones de
cultivos Martínez 1988
GonzÆlez y Maestrini 1984 realizaron experimentos basando la formulación de los
medios de cultivo en la utilización de fertilizantes agrícolas comparando los resultados con el
medio Conway en el desarrollo de 16 especies de microalgas marinas Por otro lado
FÆbregas y colaboradores 1987 probaron la combinación de fertilizantes para jardín
extractos de suelo como fuentes de nitrógeno adicionando micronutrientes y vitaminas
Corsini y Karydis 1990 probaron cinco fertilizantes comerciales para el cultivo de
retrase mis suecica ajustando la razón de N P a la proporcionada por el medio f 2 de 24 1 y
su evaluación demostró que la composición bioquímica y el crecimiento del alga cultivada fue
similar a la del medio testigo f 2 de Guillard y Rhyter
En cuanto a la respuesta en la composición bioquímica de las microalgas cultivadas
con formulaciones simplificadas a base de fertilizantes aparentemente no se encuentran
diferencias significativas segœn lo mencionado por López Elías y colaboradores 1993
Características diagnósticas de la microalga Phaeodactylum tricornutum Bohlin
Phaeodactyllum tricornutum pertenece a la división Bacillariophyta Clase
Bacillariophyceae Orden Pennales A esta especie pertenecen organismos unicelulares con
un plÆstido existiendo en una de 3 formas Rangel 1985 triradial fusiforme y oval y se
consideran litoral marina planctónica y bentónica dependiendo de la forma La valva silícea o
naviculoide ocurre solamente en formas ovaladas y ocupa el volumen mÆs importante de la
cØlula presentÆndose ampliamente en las extremidades anterior y posterior En la estructura
detallada de la cØlula fusiforme la valva silícea sólo se encuentra de un lado y el otro se
encuentra formado por un valva orgÆnica la cuÆl ha sido examinada y se encuentran
compuestas de polímeros de xylosa manosa fucosa y galactosa Las formas fusiformes y
trirdiales son comunes cuando crecen en medio líquido y las formas ovales crecen en el
medio de agar Presenta diferentes actividades biológicas como la mayor productividad de
Æcido eicosapentanoico EPA C20 5 y del Æcido decosahexaenoico DHA C 22 6 Su
distribución es muy amplia y se ha aislado de Inglaterra Francia Finlandia Estados Unidos y
13
principalmente de Espaæa en Ríao de Arosa Sus dimensiones son de 24 29 Lm x 4 5 Lm
Round 1971
o
OL
Figura 2 Microalga marina Phaeodactylum tricornutum División BacìllariophytaClase Bacillariophyceae Orden Pennales Material torgado por Laboratorio de Zoología
Facultad de ciencias Universidad de Bretaæa Occidental Francia
2 3 PolisacÆridos Sulfatados
Los polisacÆridos sulfatados incluyendo el fucoidan y la carragenìna inhiben la
metÆstasis tumural Parish et al 1987 Commbe el aJ 1987 Parish y Snowden 1988 Noda
et al 1989 La carragenina interfiere directamente con la actividad proteolítica de la
pepsina teniendo una aplicación in vilro en el tratamiento de œlceras pØpticas Stancioff y
Renn 1975 Se ha reportado tambiØn que la carragenina prolonga la digestión gÆstrica de
caseína sin interferir con la subsecuente digestión entØrica Stanley 1982 El fucoidan un
polisacÆrido sulfatado que se encuentra en la pared celular de ciertas algas marinas
Springer el aJ 1957 Larsenn el al 1966 Kloareg y Quatrano 1988 es capaz de inhibir la
rep icación in vitro del virus HIV 1 por la supresión de la formación de cØlulas gigantes o por
la inhibición de la enzima trascriptasa Baba el aJ 1990 así mismo se ha descrito que tiene
actividad anticoagulante Abdel Fattahh el al 1974 Y una actividad antitrombótica directa
14
por la trombina 111 o en mayor manera por el cofactor 11 de heparina Colliee et al 1991 De
la misma forma se han estudiado compuestos relacionados como el sulfato de dextrÆn que
tiene actividad anti adhesiva y antiinflamatoria esta œltima mediada por la habilidad que
tienen dichos compuestos para interferir con el sistema de complemento Raepple et al
1976 Pangburnn et al 1991
Percival y Foyle 1978 han caracterizado y determinado el contenido de los
polisacÆridos de las macroalgas Porphyridium cruentum y Porphyridium aerugineum por su
importancia en la medicina Otha y colaboradores 1992 encontraron que estas especies
sometidas a un ciclo de luz noche día presentan una producción sustancial de Æcidos grasos
poliinsaturados Ehresman y Hatc 1979 descubrieron que propiedades de polisacÆridos
extraídos de algas inhibieron la destrucción celular en mamíferos causada principalmente por
la infección de Herpesvirus y Rhinovirus proponiendo a los polisacÆridos como agentes de
gran importancia en quimioterapias antivirales
Se ha descubierto que las microalgas representan una fuente explotable de recursos
farmacØuticos y compuestos biológicamente activos como son los polisacÆridos sulfatados
Borowitzka 1995
La heprina glucosaminoglucanos y polisacÆridos sulfatados funcionan como
mediadores en el mecanismo de adhesión de numerosas bacterias presentes en tejidos de
mamíferos las que incluyen a Staphy ococcus sp Yersina pathogenic Neisseria sp
conocida como Helicobacter pylori Duensing et al 1999
Recientemente se ha encontrado que polisacÆridos sulfatados como el sulfato dextrÆn
inhiben en gran medida la adhesión de Aeromonas veronni en cØlulas epiteliales de piel e
intestino de la cabrilla arenera Paralabrax macu atofasciatus GuzmÆn et al 2000
En el modelo experimental de adhesión de He ycobacter pylori a líneas celulares Hela
53 y kato 111 se determinó que polisacÆridos sulfatados bloquean efectivamente el proceso
de adhesión bacteriana GuzmÆn 1997 Una terapia a base de polisacÆridos sulfatados
aislados de Tetrasselmis sp y Phaeodactylum tricomutum bloquearían la adhesión de
Helycobacter pylori evitando el proceso inicial de colonización del huØsped considerado esto
como una medida profilÆctica en infecciones microbianas donde el proceso de citoadhesión
patógeno huØsped estÆ mediado por polisacÆridos Daytoc y Love 1993
15
2 4 Superóxido Oismutasa 500
Con los descubrimientos de la superóxido dismutasa por McCord y Fridoich 1969 se
han explorado los mecanismos fisiológicos por los cuales son generados los iones
superóxido y los daæos que estos ocasionan a los sistemas vivos entre los que destacan la
desnaturalización enzimÆtica despolimerización de polisacÆridos mutaciones genØticas
todo ello como resultado de la oxidación del Æcido desoxirribonucleico y la peroxidación de
las molØculas lipídicas que las hace mÆs susceptibles a la desintegración de las membranas
Halliwel et al 1982 Lunec et al 1984
En la medicina se ha usado a la SOD como tratamiento para varios de los desordenes
patológicos de diversos órganos como el hígado Fostermann et al 1991 la piel y el
cerebro Fridovich 1975 Las enzimas SOD cobre zinc tambiØn se han utilizado para
controlar las enfermedades inflamatorias y reumÆticas Oyanagui 1981
Las fuentes mÆs utilizadas para la extracción de este reactivo han sido eritrocitos
cerebro hígado corazón de humano bovino cerdo pollo rata bacterias algas y levaduras
Con el fin de conocer mÆs fuentes de extracción en el Ærea de Patología Marina del Centro
de Investigaciones Biológicas del Noroeste se ha aislado y caracterizado a la superóxido
dismutasa tipo cobre zinc de la levadura marina Debaryomices hansenii HernÆndez
Saavedra 1997 ademÆs de realizar estudios sobre la actividad superóxído dismutasa en la
cianobacteria Microcoleus chthonoplastes Ramírez op cit
16
3 0 JUSTIFICACiÓN
Dado que el cultivo de la microalga Ph tricornutum puede ser una alternativa para la
producción no sólo de alimento para organismos en cultivo principalmente de moluscos
Rangel op cit sino tambiØn de reactivos de alto valor agregado es importante determinar
medios de crecimiento que bajo condiciones de laboratorio nos permita utilizar el recurso a
un menor costo
Por otra parte se ha observado que las infecciones bacterianas de mayor incidencia
en organismos marinos son producidas por los gØneros Vibrio y Aeromonas siendo
microorganismos cosmopolitas que se encuentran a cualquier salinidad del mar
preferentemente en aguas estuarinas con un alto contenido de materia orgÆnica Estudios
recientes llevados a cabo en el laboratorio de patogØnesis microbiana del departamento de
patología marina del Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste CIBNOR se ha
observado que las especies Vibrio alginolyticus V anguillarum V ordaiii V salmonicida y V
vulnificus son patógenas para cabrilla arenera Paralabrax maculatofasciatus y se
encuentran asociadas con septicemias bacterianas o lesiones focales crónicas Hjeltness y
Roberts 1994 Teniendo en cuenta que estas bacterias tienen afinidad por residuos de
carbohidratos sulfatados expuestos en la superficie celular de los tejidos epiteliales de la
mucosa en peces se considera que la utilización de polisacÆridos sulfatados aislados de
microalgas marinas podrían ser una estrategia importante a incluir como parte de la terapiaanti adhesiva durante el tratamiento de un proceso infeccioso y reducir con ello tambiØn el
uso de antibióticos y evitar la subsecuente generación de cepas resistentes a estos
compuestos Razón por la cuÆl en estudios anteriores se han realizado una serie de
determinaciones para conocer la eficiencia de polisacÆiridos sulfatados en la anti adhesión
bacteriana a un grupo de 3 cepas de microalgas resulatando ser Ph tricornutum una
especie con mayor efecto de inhibición en la adherencia de algunas bacterias sobre
branquias sangre y tegumento de la cabrilla arenera Paralabrax maculatofasciatus GuzmÆn
op cit
Tomando en cuenta la importancia farmacológica y cosmetológica que tiene la enzima
superóxido dismutasa SOD como parte de sus productos es necesario contar con fuentes a
17
partir de las cuales se pueda aislar esta enzima El principal interØs radica en encontrar
especies potenciales al manejo para la obtención de este reactivo en lo que se refiere a la
rentabilidad manipulación abundancia y economía lo que hace atractivo abordar el estudio
para la determinación del contenido de la SOD en los cultivos de microalgas como una
posible nueva fuente de obtención
18
4 0 OBJETIVOS
4 1 Objetivo general
Determinar el contenido de reactivos de alto valor agregado polisacÆridos sulfatados
y enzima superóxido dismutasa SO O en Phaeodactylum tricornutum durante su cultivo con
medios alternativos
4 2 Objetivos Particulares
4 2 1 Evaluar medios alternativos de crecimiento para Phaeodactylum tricornutum a base
de fertilizantes agrícolas y los parÆmetros de crecimiento
4 2 2 Evaluar la producción de polisacÆridos sulfatados extracelulares de Phaeodactylum
tricornutum a lo largo de las fases de crecimiento cultivada en los medios alternativos
42 3 Determinar el contenido de superóxido dismutasa SOD a travØs de su actividad en
los cultivos de Phaeodactylum tricornutum con medios alternativos
4 24 Evaluar los costos de los medios de crecimiento y sugerir los mÆs convenientes para
la obtención de reactivos de alto valor agregado
19
5 0 METODOLOGíA
El presente trabajo se realizó en las instalaciones del Centro de Investigaciones
Biológicas del Noroeste CIBNOR ya que se cuenta con la infraestructura necesaria así
como el equipo bÆsico Se contó así mismo con el apoyo del laboratorio de microalgas de la
Div de Biología Experimental donde se proporcionó la cepa de Phaepdactylum tricornotum a
partir de un cultivo en gel y posteriormente se pasó a un medio líquido en tubo de ensaye
Se tuvo tambiØn la vinculación con el laboratorio experimental de acuacultura de la Unidad
de Pichilingue UABCS para el escalamiento de los cultivos algales
Medios de Cultivo
La microalga considerada en el presente trabajo fue cultivada en el medio f 2 y en los
medios de interØs preparados con las diferentes combinaciones y concentraciones de
fertilizantes anexo 1
Condiciones de Cultivo de Ph tricornutum
Antes de iniciar con los cultivos masivos la microalga se sometió a cultivo estÆtico
con luz sistema de lÆmparas cool and white de 40 watts y temperatura constante 20t20C
en medio f 2 de Guillard segœn sus requerimientos de preparación
El proceso de acondicionamiento de la microalga Ph tricornutum a los diferentes
medios fue el siguiente
A partir del cultivo flstock del laboratorio en dos tubos de ensayo se utilizó el medio
f 2 de Guillard y se inocularon por duplicado matraces de 125 mi de capacidad con un
volumen de 75 mi del mismo medio Estos se mantuvieron en condiciones de cultivo por 7
días
De los matraces de 125 mi considerados como stock se inocularon 15 matraces de
250 mi con 150 mi de cada uno de los medios alternativos y como testigo se empleó el f 2 de
Guillard Se mantuvieron creciendo en estos medios durante 7 días Posteriormente las
microalgas obtenidas en cada uno de los medios se volvieron a inocular en matraces de 1
20
litro con 500 mi de medio alternativo y su testigo las cuales se mantuvieron por otros 7 días
como se observa en la figura No 3
Temperatura
iTubo de ensayo CuItMStocK
constante 20t2C CambIo de medio fresco cada 2
luz indirecta semanas Medio f2de Guillard
Matraz Erlenmeyer 125 ml
Con 75 ml de medio de
QJltNo f2de Guillard
Tlempo 7 dras
Jl Jl giIì recta conn
Tiempo 7dtas
Matraces de bola con
fondo plano de 1000
mi con 500 mi demedio de OJItNo
alternativo 2O2OC
uz continuay directa
Matraces
Fembacn 28OOm1
con 1 500 mi de
mediO de cultNo
alternativo
20 20luz
continua
directa
Figura 3 Esquema del acondicionamiento de la microalga Phaeodacty um tricornutun
Tomado de Martínez 1998
A partir de los cultivos estÆticos se inocularon bolsas de polietileno con 15 litros de
cada uno de los medios de cultivo a evaluar y como medio testigo el f 2 de Guillard Los
cultivos de la microalga se mantuvieron en estas condiciones durante 12 días
21
Evaluación del crecimiento
Cuenta Celular
Para hacer la evaluación del crecimiento de la microalga estudiada se tomaron de las
bolsas de 15 litros muestras diarias de cada uno de los cultivos con los diferentes
tratamientos durante 12 días las cuales se fijaron 1 mi con 2 gotas de solución fijadOra ra
el cÆlculo de la densidad se realizaron conteos en una cÆmara de Newbauer mejorado el
cÆlculo del nœmero de cØlulas por mi se realizó de acuerdo a la siguiente fórmula
No de cØlulas mi x F O 1X104
Donde
X promedio del conteo de cada uno de los cuadros 5 de cada una de las
rejillas
F O es el factor de dilución utilizado para la muestra
1 x1 04 constante para convertir el conteo obtenido al equivalente del conteo en 1 mI
Los parÆmetros empleados para evaluar el crecimiento de la microalga fueron
Guillard 1973
Período de crecimiento mÆximo pcm nœmero de días requeridos para alcanzar la
mÆxima densidad celular
Producción neta pn diferencia entra la densidad alcanzada y la densidad inicial
Rendimiento diferencia entre la población final y la población inicial dividida entre el
nœmero de días transcurridos desde la siembra
Tasa de crecimiento k medición de las divisiones por día a partir de la ecuación
k 3 322 t2 t1 logN2 N1 donde N2 es el nœmero de cØlulas en el tiempo t2 y N2 es el
nœmero de cØlulas en el tiempo t1
Tiempo de duplicación td tiempo necesario días para que N cØlulas se transformen en
2N durante la fase exponencial de crecimiento Se calcula mediante la expresión td In 2 k
jf J c r
vóßø
22
AnÆlisis EstÆdistico
Crecimiento de la microalga Ph tricomutum
A los datos de crecimiento se les aplicó la prueba de Homocedasticidad de Barlett lo
que nos indicó emplear estadística paramØtrica Para determinar diferencias significativas en
el crecimiento entre los tratamientos se aplicó t de student como estadísticos de prueba
Sokal Rohlf 1981 Anexo 11
Reactivos de alto valor agregado
Se representó grÆficamente la desviación estÆndar para cada uno de los ensayos
realizados
5 2 Cuantificación del Contenido de 5ulfatos en PolisacÆridos
Para su determinación se uso el mØtodo del azul alciÆn Ramus 1977 Anexo IV
5 3 Determinación de la Actividad Superóxido Dismutasa 500
La tØcnica se basa en la reducción del cloruro de azul p nitrotetrazolio NBT ejercida
por la SOO reacción que es seguida por una determinación espectrofotomØtrica a 560 nm
Posteriormente fue necesario determinar el contenido de proteína de cada una de las
muestras a analizar por medio del reactivo de Bradford Bradford 1976 lo que se utilizó
como dato indispensable para el cÆlculo de la actividad enzimÆtica específica mediante un
lprograma de computación desarrollado para este fin VÆsquez JuÆrez et al 1993 Anexo
V
5 4 Evaluación económica de los medios de crecimiento
Se realizó en función al costo por gramo de fertilizante empleado para cada una de las
formulaciones utilizadas en los cultivos de 15 I Y lo en lo que saldría 1 m3 Øste se comparócon el costo del f 2 evaluado por Martínez 1998
23
6 0 RESULTADOS
6 1 Crecimiento de la microalga Phaeodactylum tricornutum
En la figura No 4 se presenta grÆficamente el comportamiento de crecimiento de la
microalga cultivada en el medio f 2 que en este experimento se consideró como testigo
Se observó que el cultivo no presentó una fase de adaptación o lag la fase
exponencial inició desde el primer día y terminó el día 10 a partir del cuÆl se inició la fase de
muerte del cultivo
CinØtica de crecimiento de Ph œicornutum
en medio f2 de Guillard
7 00E 05 l
E 6 00E 05I
G 5 00E 05CJ I
4 00E 05 1IV 3 OOE 05 J
ºæ 2 00E 05 J
ªi 1 00E 05
e O OOE OO I
123 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Tiempo díasmedio f 2
Figura 4 Curva de crecimiento poblacional de la microalga Phaeodactylum tricornutum
cultivada con el medio de cultivo f 2 de Guillard testigo en bolsas de 15 litros por un tiempo
de 12 días evaluando la densidad celular
Las microalgas en cultivo con los medios alternativos presentaron tres formas de
comportamiento segœn la presencia de las faces de crecimiento respecto la curva típica del
cultivo estÆtico y se agruparon de la siguiente forma
La figura No 5 nos muestra el crecimiento de la microalga cultivada con los
tratamientos 1 6 7 11 Y 12 comparÆndolos con el medio testigo En la grÆfica se puede
observar una proliferación celular superior a la que se presentó en el medio f 2 Así mismo el
24
desarrollo de las cØlulas en estos 5 medios nos mostró un comportamiento en el cual se
pueden diferenciar todas las fases de crecimiento
CinØtica de crecimiento de Ph tricornutum en medios
alternativos9 00E 05
8 00E 05
7 00E 05
6 00E 05u
5 00E 05a
4 00E 05
1i 3 00E 05cCI 2 00E 05e
1 00E 05
O OOE OO
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Tieß1o días 1
medio1 medio 6medio 7medio 11medio 12mediof 2Figura
5 Curva de crecimiento poblacional de la microalga Phaeodactylum tricornutum cultivada
en medios alternativos1 sulfato de amonio urea y ultrafos 6 urea N K P 7 sulfato
de amonio urea y N K P 11 sulfato de amonio urea y N P 12 61 12 sulfato de ramonio
ultrafosyP K Evaluando la densidad celularen bolsas de 15 litros por un tiempo de 112
días
25
Por otro lado la grÆfica No 6 del cultivo de la microalga en los medios 2 3 4 8 9 13
Y 14 nos muestra un crecimiento inferior excepto el medio 13 en comparación con el medio
f 2 sin embargo el perfil de desarrollo es similar ya que no presentan las fases de
crecimiento bien diferenciadas
CinØtica de creciniento de Ph tricornutum en medios
alternativos
9 00805
8 00805
¸ 7 00805
6 00805
5 00805C
4 00805
1e
3 00805
2 00805
1 00805
O OOEOO
JK
T1
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Tiempo dias
medio 2lIlmedio 13
medio 3medio 14
medio 4medio f 2
medio 8 nil n medo 9
Figura 6 Curva de crecimiento poblacional de la microalga Phaeodactylum tricomutum
cultivada en medios alternativos 2 sulfato de amonio urea y ultrafos 3 sulfato de amonio y
ultrafos 4 sulfato de amonio urea y N P 8 sulfato de amonio ultrafos y N P K 9 urea y
N P K 13 nitrato de amonio ultrafos y N P K 14 urea nitrato de calcio y N F Evaluando la
densidad celular en bolsas de 15 litros por un tiempo de 12 días
26
En la grÆfica de la figura No 7 se puede observar que al comparar el desarrollo de la
microalga en los medios alternativos 5 10 Y 15 con el medio f 2 se aprecia un bajo
desarrollo de la microalga y por lo tanto no demuestran las fases de crecimiento
CínØtica de crecimiento de Ph tricomutom en medio s
alternativos
8 OOE 05
7 OOE 05
6 OOE 05 J
E5 00E 05
4 OOE 05O
g 3 00E 05ïile 2 00E 05
1 OOE 05 j 6
O OOE OO i11
1 OOE 05 1 2 3 4 5
L
I
6 7 8 9 10 11 12
Tiempo
1 medio 5 medio 10 medo 15 medio U21
Figura 7 Curva de crecimiento poblacional de la microalga Phaeodactylum tricornutum
cultivada en medios alternativos 5 N K P 10 N K P 15 urea N K P y proroot Evaluando
la densidad celular en bolsas de 15 litros por un tiempo de 12 días
AnÆlisis estadístico
En base al estadístico de prueba utilizado se encontró que existe diferencia
ignificativa en el crecimiento con los medios 2 5 8 9 10 Y 15 respecto al f 2 en los
cuales se observa a simple vista que los medios experimentados muestran un crecimiento
inferior
Dada la deficiencia en el crecimiento con los medios 2 5 8 10 Y 15 œnicamente se
emplearon los medios restantes para el anÆlisis de datos Cabe mencionar que las cØlulas
contenidas en el medio 14 se encontraron aglomeradas por lo que no fue recomendable
aplicar anÆlisis en este tipo de circunstancias
27
Paråmetros de crecimiento
Segœn los resultados obtenidos en la tabla 111 se tiene que el cultivo con el medio 13
alcanza la producción neta mÆs alta del 18 sobre los demÆs cultivos y por lo tanto el
mÆximo rendimiento de 58791 cel ml y la segunda mayor tasa de crecimiento de 0 53 a lo
largo de la cinØtica de crecimiento durante los doce días en las bolsas de 15 1 Y por el
contrario el cultivo con el f 2 de Guillard obtuvo los valores mÆs bajos en todos los
parÆmetros pn 5 respecto a los demÆs cultivos r 15166 y k 0 11 respectivamente
ademÆs la tasa de duplicación requiere de 2 8 días para que las cØlulas n se transformen en
2n contra 1 3 días para el cultivo con medio 13 El cultivo con el medio 1 presenta tambiØn
una muy buena tasa de producción neta del 13 respecto a los demÆs cultivos que se ubica
en la segunda mÆs alta de los cultivos con los medios alternativos
Tabla 11I ParÆmetros de crecimiento presentados por Ph tricornutum cultivada con los
medios formulados Dónde pcm producción ælular mÆxima pn producción neta r
rendimiento K tasa de crecimiento y td tasa de duplicación
Medio pcm días pn celml r celmldía k divIdía td días1 8 486500 40541 0 30 1 83 10 261334 21777 045 144 9 367180 30598 049 146 9 241500 20125 0 17 247 8 428000 35666 0 19 2 39 9 269000 22416 020 2 2
11 8 549500 45791 1 3 1 2t 12 9 396500 33041 0 38 1 6
13 9 705500 58791 0 53 1 3F 2 10 182000 15166 0 11 2 8
6 2 Cuantificación de Polisacªridos Sulfatados
Referente a la producción de polisacÆridos sulfatados a lo largo del crecimiento de la
microalga Ph tricornutum no se observó gran diferencia entre los distintos medios de cultivo
i analizados conservando un contenido alrededor de 80 g ml Se puede decir que este
metabolito tuvo un comportamiento con asensos y desensos continuos como se puede ver
en la figura 8
28
Polisacåridos sulfatadoscontenidos durante el cultivo de
Ph tricornutum en medios alternativos
120
100
Π80al
6Oo
40e 20Q
e OoO 20
402 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Tiempo días
Id 1i melo
I
medio 3 medio 4 medio 6 medio 71
Polisacåridos sulfatados contenidos durante el cultivo de
Ph tricornutum en medios alternativos
150
E 100ài
v
o 502c L
Q
º Ooo 2 4 5 6 7 8 9 10 11 12
50
medio 9
medio 13
Tiempo días
medio 11mediofl2
medio 12
Figura 8 Concentración de polisacåridos sulfatados producidos por la microalgaJhaeodactylum
tricornutum a lo largo de su desarrollo en los medios de cultivo estudiados
29
6 3 Determinación de la actividad superóxido dismutasa 500
Si tomamos en cuenta los días de mayor actividad se observa que el medio 7 la
presenta el día 4 con 40 U mg de proteína el medio 12 el día 3 con 60 U mg de proteína en
seguida tenemos al medio 9 donde al quinto día presenta 85 U mg Los medios 3 4 6 y 11 a
partir del día 6 con 100 90 95 y 90 U mg de proteína respectivamente considerados estos
como los valores mÆs altos Y por œltimo tenemos al medio 1 y f 2 los cuÆles presentan su
mayor actividad a partir del día 8 de cultivo fig 9
Actividad de la SOD a lo largo de la cinØtica de crecimiento dePh tricomotum con medios altenativos
U mg
120
100 J
80
60 J
40 jI
20är
o
T
ii f t
2 3 4 5 6 7 8 9
Tiempo días
14 i O EjMØdì04 El Medio6 E3 t clActiv idad de la SOD a lo largo de la cinØtica de crecimiemto de
Ph tricornutum cultivada en medios alternativos
III 1o
o 13 4 5 6 7 8 9
tiempo días
Figura 9 Actividad específica de la superóxido dismutasa SO O obtenida a lo largodel crecimiento de la micoalga Ph tricomutum con medios alternativos
30
6 4 Evaluación económica de los medios de crecimiento
Tabla IV Evaluación de costos de los medios de crecimiento formulados para un volumen
de 15 I durante doce días
Medio Fertilizante Concentración gil Costo por Costo por m3 de agua demar TOTAL 1151
gramo
1 Sulfato de amonio 0 15 000176 0 264 1 1710 017
Urea 0 CXl75 001472 0 1106
Ultrafos 0 025 0 032 08
3 Sulfato de amonio 0 3 0 00176 0 528 2 1281 032
Ultrafos O es 0 032 1 6
4 Sulfato de Amonio 0 1 0 00176 0 176 0 491 00735
Urea 0 013 001472 0 191
N P 12 00 0 013 O rol56 0 124
6 Urea 0 013 00147 0 191 0 575110 0086
N P K 20 20 20 0 03 00128 0 384
7 Sulfato de amonio 0 15 0 00176 0264 0 7570 011
Urea O ro 00147 0 0736
N P K 20 310 0015 0028 042
9 Urea 0 1 00147 147 1 59810023
N P K 12 43 12 0 01 O 128 0 128
11 Sulfato de amonio 0 1 0 001 6 0 176 0 461 0069
Urea 0 01 00147 0 147
N P 12 61 0 015 O cm5 0 143
12 Sulfato de amonio 0 3 000176 0 528 2 1640032
Ultrafos O es 0032 1 6
P K 32 53 001 0 0036 0 036
13 Nitrato de Amonio 0 1 0 00265 026 0 5210 0078
Ultrafos O ro 0032 0 16
N P K 13 2 44 0 015 0 0072 0 100
F2 20 12510 30
31
7 0 DISCUSiÓN
7 1 Crecimiento de la microalga Ph tricornutum en volœmenes de 151
Selección del medio de cultivo
Las microalgas son capaces de asimilar del medio el Nitrógeno en sus distintas formas
de combinación tanto orgÆnica como inorgÆnica y la forma óptima de asimilación dependerÆ
de la especie observado esto en un incremento de la masa dado que hubo medios que
ayudaron a una proliferación mayor que el f 2 se puede considerar a la microalga Ph
tricornutum como una especie capaz de desarrollarse en medios de crecimiento formulados
con fertilizantes agrícolas lo que concuerda con GonzÆlez Rodríguez y Maestrini 1984
quienes mencionan que seis especies de microalgas requieren sólo de nitrógeno y fósforo
para su crecimiento tal es el caso de Dunaliella tertiolecta Nitzchia avicularis Ph
tricomutum Skeletonema costatum Tetraselmis streata y Thalassiosira pseudonana Asu
vez exponen que los fertilizantes agrícolas promueven el crecimiento en el agua marina
favoreciendo el costo de cualquier combinación Fidalgo y colaboradores 1995 exponen
que el uso de fertilizantes comerciales es muy prÆctico y eficaz pero hay que tener en
cuenta que el valor nutricional de las cØlulas algales dependen de las condiciones del medio
y de la fase de crecimiento en que se encuentra factores que se deben considerar para
lograr la utilización adecuada AdemÆs una gran ventaja que ofrecen los fertilizantes
agrícolas es que se requiere de un mínimo para su preparación
Dado el hecho de que las microalgas de algunos cultivos asimilaron los nutrientes de
los medíos formulados no quiere decir que todas se comportaron de igual forma como se
observa los cultivos presentan diferentes fases de crecimiento por ejemplo los cultivos con
los medio 1 2 3 Y 6 presentaron una larga fase de adaptación lo cual indica que aun no se
adaptaban del todo al nuevo medio Martínez op cit explica que al cambiar una microalgaa un medío diferente esta variarÆ su patrón de crecimiento el cual dependerÆ de la
composición química que provoquen los nutrientes en el medio Por otra parte segœn Fogg y
Thake 1967 mencionan que las microalgas presentan un patrón similar de crecimiento
independientemente del medio de cultivo empleado la diferencia que presentan se ve
32
reflejada en la duración de cada una de las etapas de crecimiento En este caso los cultivos
con los medios 1 6 7 Y 11 presentaron comportamiento similares en cuanto a las fases de
crecimiento coincidiendo con la adición de urea como fuente de nitrógeno a cada uno de los
medios así mismo Fidalgo y colaboradores ap cit mencionan que el crecimiento con urea
determina similitud en las fases de crecimiento pero el contenido de materia celular puede
llegar ser diferente
La curva del cultivo testigo f 2 no presentó las fases de crecimiento tan marcadas tal
vez por no haber sido sometido a una diferencia en la composición química del medio Sin
embargo un mayor crecimiento con el mismo comportamiento lo presenta el medio 11 el cuÆl
la cØlulas asimilaron rÆpidamente los nutrientes a pesar de ser diferentes lo que podría ser
explicado dado el grado de disponibilidad en que se encuentran ademÆs de la adición con el
fertilizante foliar ultrafos
Los medios 5 y 10 se formularon œnicamente con N P K en muy bajas
concentraciones reiterando que forzosamente las microalgas requieren del enriquecimiento
del medio lo que demuestra que Østas cantidades de nutrientes no fueron las suficientes por
encontrarse asimiladas
La presencia de la fase de muerte en los medios 1 4 6 7 11 12 Y f 2 se debe a que
esta especie por pertenecer al grupo de las diatomeas requiere de sílice para la
composición de su pared celular compuesto que se vuelve limitante en las poblaciones
construidas las cuales declinan rÆpidamente con la presencia de ciclos muy cortos Brown
et al 1997
ParÆmetros físicoquímicos
La influencia de los diversos factores físico químicos en un cultivo de fitoplancton
depende de la microalga a cultivar siendo los requerimientos de iluminación los que varían
ampliamente segœn la especie ademÆs de que influye en gran medida en el volumen y la
densidad del cultivo Fogg 1975 En este experimento se utilizaron lÆmparas Cool White
de 40 watts equivalentes a 3020 lux lo que afectó en la densidad esperada millones de
cØlulas por mi ya que para cultivos masivos de 10 I en adelante se requiere contar con
5 000 a 10 000 lux Por otra parte la longitud de onda es la que afecta marcadamente los
procesos químicos que se llevan acabo en el cultivo dado que esta fue la misma para todos
33
los medios de crecimiento los resultados no estuvieron directamente afectados en este
aspecto
Segœn Goldman 1977 la temperatura influye directamente en la tasa de crecimiento
en este caso Ph tricomutum es una especie aislada de Río de Arosa en Galicia Espaæa la
cuÆl se puede encontrar a una temperatura mínima de 120C y mÆxima de 21oC lo que nos
hace pensar que a 20 2oC ya se acerca al límite tolerable para esta especie ocasionando
que su tasa de crecimiento sea muy baja k 1 3 la mÆxima experimental comparada con
otras especies como Nannoc oris sp que por ser tropical alcanza hasta 3 divisiones por día
a 37 oC Martínei op cil Probablemente la tasa de crecimiento para nuestra diatomea
aumente a temperaturas de 16 y 17 oC
El pH observado durante los cultivos permaneció dentro del intervalo 7 1 9 8
considerado esto por Goldman y colaboradores 1982 como adecuado para cultivos
masivos
Paråmetros de crecimiento
A primera vista se puede considerar al medio 6 entre los que dieron mejores
resultados en cuanto densidad celular sin embargo junto con el medio 9 y f 2 representan los
menores porcentajes de producción neta pn con un 6 7 Y 5 respectivamente esto es
debido en gran parte a la diferencia que existe en la población inicial y la final en la que el
medio 6 comienza con un alto nœmero de cØlulas y presentar en menor grado la fase de
muerte por lo tanto resulta muy poca la diferencia a los 12 días
La diferencia en cuanto al nœmero de cØlulas en la población inicial esta dada
principalmente en el grado de disponibilidad de los nutrientes generalmente no existe una
relación que indique una mayor o menor concentración de nutrientes de acuerdo a un mayor
o menor grado de asimilación simplemente es la combinación de los nutrientes o su
concentración independiente la que nos indica un buen crecimiento Por ejemplo La mayor
concentración de nitrógeno se suministró al medio 3 sin embargo se encuentra en la
producción neta mas baja con el 7 en contraste con una de las mas bajas concentraciones
de nitrógeno suministradas para el medio 13 el cuÆl presentó el mejor crecimiento
El medio 13 alcanza la producción neta mas alta con el 18 del total presentando un
nœmero de población inicial muy bajo pero un crecimiento constante y rÆpido en seguida
tenemos el cultivo con el medio 1 alcanzando el 13 de la producción neta el cual tambiØn
34
presenta una población inicial muy baja recuperÆndose mÆs tarde y de forma rÆpida
asimilando tal vez el fertilizante foliar
Independientemente de la producción neta alcanzada es importante tomar en cuenta
la fase exponencial y el día de mayor densidad celular alcanzada ya que para la utilización
del recurso tanto para la extracción de metabolitos secundarios como para la utilización en la
alimentación de otros organismos en cultivo ya que se recomienda emplear a la microalga de
buena calidad y es en esta circunstancia como se puede lograr
En cuanto al rendimiento de Ph tricornutum en los medios alternativos el medio 13
presentó los mejores resultados el cual fue formulado con nitrato de sådio ultrafos y
N Pk 13 244 concentración asimilable observada en una de las mÆs altas tasas de
crecimiento K 0 53 divs día en el experimento y con un tiempo de duplicación de 1 3 días
lo que concuerda con FÆbregas y colaboradores 1991 Herrero y colaboradores 1991
quienes mencionan una tasa optima de duplicación de 1 2 para esta especie de 0 9 para T
suessíca de 1 5 para D tertíolecta y de 0 8 para l galvana experimentadas bajo medios
con fertilizantes agrícolas Lo que contrasta con el medio f 2 el cual presentó los valores de
parÆmetros mÆs bajos con una pn 5 una r15 000 celmldía una k 0 11 divs día y una
td 3 días Estos bajos resultados del medio f 2 los mencionan para Chlorella sp en
experimentación comparando fertilizantes agrícolas y medio f 2 como testigo Newmark et
al 1989 Cabe destacar que el medio 11 presentó la mejor tasa de crecimiento con 1 3
divs día considerado esto como la mas rÆpida en comparación con los demÆs medios
7 2 Cuantificación de polisacÆridos sulfatados
Los carbohidratos se ven influenciados por el crecimiento celular y representan la JL
mayor reserva de carbón en muchas diatomeas FÆbregas et l 1989 Fidalgo et al 1995 de
manera que cuando baja la disponibilidad de nitrógeno las microalgas se ven forzadas a
producir carbohìdratos para sobrevivir Esto puede ser observado en el comportamiento de
los polísacÆridos sulfatados ya que en el día en el que comienza el crecimiento y el día en el
que se alcanza la mayor densidad celular 3 y 7 ocurre un gran decremento seguido de su
recuperación inmediata esto tal vez debido al trabajo biosintØtico llevado a cabo por las
cØlulas Segœn Leninger 1975 la biosíntesis es un proceso genØticamente programado que
a partir de cØlulas muy simples conduce a la estructura misma de la cØlula viva en una
35
jerarquía de complejidad creciente no incluye sólo la formación de los componentes
químicos característicos de las cØlulas a partir de precursores simples si no tambiØn su
ensamblaje en estructuras tales como sistemas membranosos elementos contrÆctiles
mitocondrias nœcleos y ribosomas
MolØculas de unidadestructural
Precursores
simplesMacromolØculas
Acidos grasos
ONA Membranoso NucleoRNA Sistematico MitocondriaProteí na Enzimatico Reticulo
endoplasmicoPOLlSAC`RlDOS Ribosomas C oroplastos
C02 AminoacidosNH3 NucleotiodosH20 Monosacarido
Casi toda la energía metabólica de las cØlulas microalgales se emplean para producir
trabajo biosintØtico Como las microalgas ejercen poco control sobre el medio en el que se
encuentran y del cual no pueden evadirse su habilidad para multiplicarse rÆpidamente las
capacita para sobrevivir Es como muchos de los componentes químicos de las cØlulas vivas
experimentan un continuo recambio dinÆmico
Las proteínas Iípidos polisacÆridos y otros componentes son construidos y
descompuestos continuamente de tal modo que la velocidad de síntesis iguala la velocidad
de descomposición y esta varía de un componente químico a otro Por esta razón se explica
los descensos y ascensos continuos en el comportamiento de los polisacÆridos ademÆs que
experimentos anteriormente realizados indican una tendencia a la Iinearidad llevados a cabo
por el mØtodo de azul alciÆn Ramus op cit
7 3 Determinación de la actividad de la enzima Superóxido Dismutasa
Segœn Ramírez 1988 cuando disminuye la reproducción celular baja la producción de
todas las enzimas metabólicas incluyendo la SOO y es en este experimento que en los
medios 3 6 Y 13 donde se observa un decremento de la actividad acompaæado de una baja
densidad celular principalmente en los días 4 y 5 En el medio 9 la mayor actividad ocurre
durante la fase de adaptación en la cinØtica de crecimiento lo que quizÆ pueda deberse a la
composición química que el medio provoque Por ejemplo se ha visto que en el cultivo de la
levadura marina Debaryomyces hansenii el efecto del pH del medio de cultivo sobre la
36
actividad de la enzima SOD estimula su producción a valores de pH ligeramente Æcidos 5
67 Y a valores de pH 8 o superiores la actividad disminuye en gran medida al igual que a
valores inferiores a 5 Esto nos hace pensar que la urea contenida en mayor concentración
en el medio con un 90 sobre las demÆs formulaciones provocó desde el comienzo del
cultivo una mayor tendencia a la acidez en contraste con los medios 7 12 Y f 2 los cuales
presentaron valores de pH 9 6 8 5 Y 84 durante la cinØtica de crecimiento observÆndose
en ellos las menores actividades
Si bien es cierto que tambiØn la actividad de la enzima aumenta cuando se ve
favorecido el crecimiento se puede observar en los medios 1 3 4 11 Y 13 alrededor del día
7 se da un aumento en la actividad ya que al existir mayor nœmero celular la demanda de
O2 incrementa y por ende la producción de radicales libres
Los mÆximos valores de la actividad fueron encontrados en los medios 3 4 6 9 Y 11
alcanzando en promedio 85 U mg de proteína en los días 6 y 7 Dado este hecho Ph
tricomutum podría considerarse una especie que presenta rendimientos satisfactorios y
comparables a los valores encontrados en levaduras convencionales y la levadura marina
Deb hansenii en condiciones normales
7 4 Evaluación económica de los medios de crecimiento considerados
El empleo de fertilizantes agrícolas disminuye en gran medida los costos de
producción y son de gran practicidad por su rÆpida formulación a pesar de ello es difícil
inferir la fuente de nitrógeno que emplean para su fabricación y por lo cual en cuanto
resultados no se pueden esperar siempre los mismos ademÆs de que el valor nutricional de
las cØlulas algales depende de las condiciones del medio y de la fase de crecimiento en que
se encuentra Stein 1973
Entre los nutrientes que ofrecieron mejores rendimientos al adicionarse en los medios
de cultivo fue la urea Østa representa uno de los costos mÆs bajos para la obtención de
nitrógeno como recurso para el crecimiento ideal en cultivos masivos Fidalgo op cit
La tabla IV nos muestra que la mÆxima actividad de la SOO ocurre antes de los 12
días de cultivo en casi todos los medios de tal forma que si se cosecha el día de mayor
actividad diminuye el costo de producción Como se pudo observar los mÆs altos valores
de la actividad de la SOD se encontraron en el medio 3 con 100 U mg al sØptimo día lo que
37
reduciría el costo de 2 128 a 0 032 si llevÆramos el cultivo a 1m3 y 0 018 en bolsas de
15 litros Se formularon medios que no costaron mÆs de 0 05 al día de su mayor actividad
los cuales presentaron valores de 80 y 90 U mg excepto el medio 7 12 y f2 con actividades
menores de 56 U mg
Tabla IV Reseæa que nos muestra la producción neta alcanzada y el costo del medio
decrecimiento a la mÆxima actividad de la SOD
MEDIO Pn AMA PAM CPAM CPAMA DPAMA CT
o í U m 1 días 1 rn S 15 1 Celiml iS1 13 80 8 0 78 0 0117 8000 1 17
3 7 100 7 0 032 0 018 400000 2 128
4 9 90 7 0 0073 0 004 400000 0 49
6 6 95 8 0 38 0 0057 600 000 0 57
7 11 40 4 0 011 0 0036 400000 0 75
9 7 85 S 0 6625 0 009 200 000 1 59
11 14 90 7 0 0069 0 004 590 000 0 46
12 10 55 4 0 032 0 010 400000 2 16
13 18 70 7 0 008 0 0046 600 000 0 52
f2 5 65 12 0 31 0 03 200 000 20 1
PCM período de mÆximo crecimiento Pn producción neta CPCM costo al pcm AMA actMdad mÆxima alcanzada PAMA
período deama CPAMA costo de poma DPAMA densidad al poma Cl costototal a los doce días
Por otra parte si se requiere obtener del mismo cultivo tanto enzimas como
polisacÆridos sulfatados se debe escoger el medio que el día de mayor actividad no ocurra
en los días 3 y 7 ya que es justo en esos días donde el contenido de polisacÆridos
disminuye en gran medida debido a esto es recomendable el empleo del medio 9 ya que
sólo requiere de 5 días para alcanzar el período de actividad mÆxima sin salir afectada la
producción de polisacÆridos incluso representa uno de los menores costos ocupando el 2
con 0 009 para 15 I y 0 066 para 1 m3 Si ademÆs es necesario contar con una mayor
densidad celular los medios 1 y 6 son los recomendados con un costo de 0 08 y 0 0057
respectivamente al octavo día de cultivo y de 0 78 y 0 0117 para 1 m3
Cabe mencionar que en este experimento el medio f 2 ademÆs de tener un precio
excesivamente alto 53 del total comparado con el de los medios alternativos no tuvo
38
resultados muy notables sin embargo sí los suficientes a los doce días para obtener los
metabolitos buscados La elección del medio dependerÆ de los objetivos del investigador
considerando este trabajo como la primera aproximación para la obtención de reactivos de
alto valor agregado
Tabla VI Tabla que muestra la probabilidad de obtener mayor densidad celular y polisacÆridossulfatados al día de mayor actividad de la SOD y el porcentaje de costo en relación a los medios
formulados
Medio Densidad cel Activ SOD Polisac Sulf e asta al díade Dios de cultivoaet r 1
1 J 22 8
3 X X 6 7
4 X X 1 7
6 i 6 8
7 J X J 2 4
9 X 2 5
11 X X 1 7
12 J X J 6 4
13 J X 1 7
f 2 X X 53 12
39
8 0 CONCLUSIONES
1 La mayoría de las formulaciones a base de fertilizantes agrícolas como medios de
crecimiento resultaron ser asimilables para el desarrollo de Ph tricornutum
2 En cuanto a los parÆmetros físico químicos
La temperatura influyó en la tasa de crecimiento provocando bajos valores k 1 3 el
mÆs alto registrado en el medio 11
El pH influyó en la actividad enzimÆtica a acidez actividad
3 En cuanto los parÆmetros de crecimiento los mejores resultados de pn k r y td se
observaron en el medio 13 formulado con nitrato de amonio ultrafos y N P K 13 244 el
cuÆl resultó encontrarse en forma mejor asimilable por Ph tricornutum que el medio f 2
4 El contenido de polisacÆridos sulfatados se encontró alrededor de los 80 Jg ml en la
mayoría de los cultivos con los medios experimentales manteniØndose a lo largo de la
cinØtica de crecimiento
5 Los mÆximos valores de la actividad enzimÆtica de la superóxido dismutasa fueron
encontrados en los medios 3 4 6 9 Y 11 alcanzando en promedio 85 U mg de proteína en
los días 6 y 7 Dado este hecho Ph tricornutum podría considerarse una especie la cual
presenta rendimiento satisfactorios y comparables a los valores encontrados en levaduras
convencionales y la levadura marina Deb Hansenii
6 Sin duda el f 2 resultó ser el medio con el mayor costo representado con un 55 sobre
los demÆs sin embargo fue el que menor contenido de enzima tuvo El medio 1 representa
un costo del 22 al día de mayor actividad de la SOO resultando ser uno de los mÆs
completos en cuanto a actividad de la SOO y polisacÆridos sulfatados al igual que el medio 6
aœn mÆs barato con el 8 del costo total al día de mayor actividad enzimÆtica
40
7 La elección del medio dependerÆ de los objetivos del investigador considerando este
trabajo como la primera aproximación para la obtención de reactivos de alto valor agregado
9 0 RECOMENDACIONES
Estudiar mÆs afondo la biología de la especie para encontrar si existe diferenciación
taxonómica de acuerdo al tipo de forma
Inferir si las formas en las que se encuentra Ph tricomutum son cambiantes a causa de
factores ambientales y posible efecto químico que ejercen en el momento
Efectuar en una Øpoca del aæo diferente en la que se realizó el cultivo un segundo
experimento con los medios que mejor dieron resultados para encontrar si existen
diferencias en el comportamiento y la calidad celular debido a la variación en la calidad
del agua
Profundizar sobre requerimientos nutricionales con el fin de conocer los elementos que se
agotan mÆs rÆpido y cuales fueron los límites de crecimiento Conociendo los períodos en
los que permanece el alga sin disminuir su población se puede proceder a suministrar los
nutrientes requeridos y prolongar su fase de crecimiento
Experimentar durante el cultivo de la microalga condiciones físico químicas como la
inducción de oxígeno cambios de temperatura y pH para observar el comportamiento de
la actividad enzimÆtica
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ANEXO I
Tabla 1 Formulación de medios para el cultivo de Phaeodactylum tricomutum
MEDIO FERTILIZANtE mgn MEDIO FERTIUZANTE rngß
1 Sulfato de amonio 150 2 Suulfato de amonio 100
Urea 7 5 Urea 6
Ultrafos 16 60 25 Ultrafos 15
3 Sulfato de amonio 300 4 Sulfato de amonio 100
Ultrafos 50 Urea 13
N P 12 60 13
5 N Pk 19 19 19 14 6 Urea 13
N P K 20 20 20 30
7 Su fato de amonio 150 8 Sulfato de amonio 300
Urea 5 Ultratos 50
N P K 20 30 10 15 N P K 20 330 14
9 Urea 100 10 N Pk 13 244 20
N P K 12 43 12 10
15
11 Sulfato de amonio 100 12 Sulfato de amonio 300
Urea 10 Ultrafos 50
N P 12 61 15 N P 32 53 10
13 Nitrato de amonio 100 14 Urea 75
Ultrafos 5 Nitrato de calcio 150
N P K 15 N F 11 52 10
15 Urea 5
N P K 20 30 10 15
Proroot 50
50
Medio 16 F 2 Guillard and Ryther 1962
Agua de mar 1000ml Metales traza
NaN03 75 mg Agua destilada 1000 mi
Na2HP04 7H20 5 mg Na2 EDTA 4 36 9
NaSi03 9H20 30 mg FeCI3 6H20 3 15 9
Tiamina HCI100 9 MnC124H20 180 mg
Biotina0 5 9 CuS04 5H20 10 mg
Cobalamina0 5 9 ZnS04 7H20 22 mg
Metales traza1 0 mI CoC12 6H20 10 mg
pH del medio 7 5 NaMo04 2H20 6 mg
Esterilizar en autoclave a 15 Ib in2 1 1Kg cm2 1200C durante 15 minutos Dejar
enfriar Mantener en frasco Æmbar y en refrigeración Por separado se preparan las
vitaminas y los metales traza En 1000 mi de agua de mar se disuelven los nitratos
fosfatos y silicatos Se esterilizan en autoclave a 15 Iblln2 excepto las vitaminas que se
esterilizan por filtración en membrana de fibra de vidrio GF C previamente estØril Mantener
en refrigeración
51
ANEXO 11
1 Pruebas estadísticas empleadas para el experimento en bolsas de 15 I de la microalgaPh tricornutum
1 1 Prueba Homocedasticidad de Barlett
B 1495
Decisión Por medio de la distribución Xi2 al nivel de significancia 0 05 15 g 1 se acepta ra Ha
de que los datos provienen de una población con varianzas homogØneas
1 2 Pruebea t de student
MEDIO t calc t crit p
f 2 1 0 33 2 07 05f 2 2 3 16 2 07 05
f2 3 0 5 2 09 05f 24 1 14 2 12 05f 2 5 8 92 2 20 05f 26 023 2 07 05f 2 7 14 2 08 05f 28 3 3 2 1 05
f 2 9 2 4 2 07 05f 2 10 8 1 2 20 05f 2 11 0 35 2 2 05f 2 12 0 58 2 02 05
f 2 13 1 16 2 08 05f 2 14 1 6 2 07 05f 2 15 6 0 2 13 05
53
ANEXO IV
DETERMINACiÓN DEL CONTENIDO DE SULFATOS EN EXPOPOLlSAC`RIDOS Por el
mØtodo del azul alciån Ramus 1977
Se colocó en tubos 100 JlI del medio extracelular procedente de los diferentes cultivos
de microalgas se les aæadieron 400 JlI de Æcido acØtico 0 5 M pH 2 5 Y se agita en Vortex
Se agregaron 50 JlI del colorante Azul AlciÆn preparado a una concentración de 1
mg ml en Æcido acØtico 0 5 M pH 2 5 Y se agitó nuevamente en el Vortex Para una reacción
de precipitación completa se dejó en agitación tres horas
Se centrifugaron los tubos a 3000 rp m durante 30 min y el sobrenadante se separó y se
leyó a 610 nm La diferencia entre el blanco es proporcional a la concentración del polianión
Se hizo la curva estÆndar con Æcido algínico para la cuantificación
54
ANEXO V
RUPTURA CELULAR Y DETERMINACiÓN DE LA ACTIVIDAD 500
La enzima fue extraída mezclando 250 jJg de biomasa 250 jJg de perlas de vidrio y
500 IJI de buffer de fosfatos 50 mM pH 7 8 en un tubo eppendorf Se rompió en el vortex por
15 min descansando cada 30 segundos Fue necesario contar con un baæo de hielo para
dejarlos reposar Posteriormente se centrifugaron por 7 segundos en una microcentrifuga
Beckman y se tomó el sobrenadante para su cuantificación
Realización de curva estÆndar para cada una de las muestras
Tubo Mezcla ml Buffer fJl Muestra Id
1 2 100 O
2 2 90 10
3 2 75 25
4 2 50 50
5 2 25 75
La mezclase adicionó en condiciones de obscuridad en los tubos posteriormente se
expusieron a la luz los tubos y se leyeron en el espectro a una longitud de onda de 560 nm
deteniendo la reacción hasta que el tubo 1 dió una lectura entre 02 y 0 25
Se calculó la actividad enzimÆtica por medio de un programa de computadora con las
absorbancias obtenidas y la cantidad proteica de Østas
Cuantificación Proteica
Se prepararon los reactivos necesarios para obtener la solución Bradford
Reactivos
A 100 mg de azul de Coomassie G 250
B 50 mi de Etanol 95
e 100 mg de Æcido fosfórico al 85 w v
Q 850 mi de agua destilada
55
Procedimiento
Disolver el azul de Coomassie en el Etanol
Agregar el Æcido fosfórico
Aforar a 1 litro con el agua destilada
La concentración final obtenida en la mezcla fue azul de Coomassie 0 01 w v etanol
4 7 wN y Æcido fosfórico 8 5 w v
Fundamento
El azul de coomassie existe en forma de 2 colores rojo y azul Si la tinta se une a una
proteína cambiarÆ su color de rojo a azul El complejo tintura proteína tiende al azul El
complejo tintura proteína tiene una alta absorción lo cual permite una gran sensibilidad en la
medición de la proteína La unión de la tintura a la proteína es muy rÆpida aprox 2 min yes
estable aproximadamente 1 hora Su espectro mÆximo de absorción se define entre los 465
595 nm
Curva de calibración
La curva que se utilizó es una variación de la descrita por Bradford 1976
![New Insight into Phaeodactylum tricornutum Fatty Acid Metabolism… · acid metabolism of P. tricornutum were obtained from labeling experiments. Incubation of the diatom with [14C]acetate](https://img.pdfslide.net/doc/110x75/5e99fb3cf9afa538077bed2b/new-insight-into-phaeodactylum-tricornutum-fatty-acid-acid-metabolism-of-p-tricornutum.jpg)
