Бактериофагиphages-research.ru/part_2.pdf · 2013. 7. 18. · Бактериофаги в медицине и ветеринарии 5 УДК 619:616-07 ПЕРСПЕКТИВЫ

«Бактериофаги: Теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии

и пищевой промышленности»

Ульяновск - 2013

Том II

Материалы международной научно-практической конференции

Материалы международной научно-практической конференции «Бактериофаги: Тео-ретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой про-мышленности» / - Ульяновск:, ГСХА им. П.А. Столыпина, 2013, т. II - 182 с.

Технический редактор Д.Н. Хлынов

Авторы опубликованных статей несут ответственность за достоверность и точность приведенных фактов, цитат, экономико-статистических данных, собственных имен, гео-графических названий и прочих сведений, а также за разглашение данных, не подлежа-щих открытой публикации.

© ФГБОУ ВПО «УЛЬЯНОВСКАЯ ГСХА им. П.А. СТОЛЫПИНА», 2013

Бактериофаги в медицине и ветеринарии

3

УДК 619:616-07

ВЫДЕЛЕНИЕ БАКТЕРИОФАГОВ AEROMONAS SALMONICIDA

Горшков И.Г., научный сотрудник, [email protected]Куклина Н.Г., научный сотрудник, [email protected] Викторов Д.А., кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, тел. 9084775573, [email protected]Насибуллин И.Р., соискатель, тел. 9053484611, [email protected]Васильев Д.А., доктор биологических наук, профессортел. 8(8422) 55-95-47, [email protected]Золотухин С.Н., доктор биологических наук, профессортел. 9272703480, [email protected]ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина»

Ключевые слова: Aeromonas salmonicida, аэромонозы рыб, бактериофаги, выделение, фаготерапия, фагоиндикация.

В результате проведённых исследований было выделено 4 изолята бактериофагов, активных в отношении Aeromonas sa�mon��a. �олу�енные бактериофаги перспективно ис-sa�mon��a. �олу�енные бактериофаги перспективно ис-. �олу�енные бактериофаги перспективно ис-пользовать для фаготерапии, а также для постановки реакции нарастания титра фага, �то позволит проводить диагностику аэромонозов рыб за сроки до 24 �асов.

Актуальность исследования.Необходимость разработки быстрого и точного метода диагностики аэромонозов рыб,

обусловленных Aeromonas salmonicida, в последнее время приобретает всё большую актуаль-ность, на что указывают данные многих авторов [1]. В этой связи группой авторов предлагает-ся применение метода реакции нарастания титра фага для индикации патогенных аэромонад в пищевой рыбной продукции, прудовой воде и патологическом материале, полученном от больной рыбы. Метод РНФ имеет ряд существенных преимуществ [2,3,7], однако для его про-ведения необходимо иметь в распоряжении индикаторные бактериофаги, обладающие опреде-лёнными свойствами (строгой специфичностью, широким спектром литической активности, максимальной урожайностью и подходящей морфологией негативных колоний).

Целью исследований являлось выделение и отбор наиболее активных культур бакте-риофагов бактерии Aeromonas salmonicida для дальнейшей разработки на их основе диагно-стического биопрепарата.

Ход исследования.Для выделения фагов бактерии Aeromonas salmonicida исследовано более 20 проб

сточной и речной воды. Исследуемую воду в количестве 50 мл заливали в колбы со 100 мл стерильного концен-



4

трированного мясопептонного бульона. Концентрированный мясопептонный бульон готовили с таким расчётом, чтобы после смешивания с исследуемой водой получить обычную по соста-ву среду [7]. В те же колбы добавляли по 3 мл 24-часовых индикаторных культур различных выделенных нами ранее из патологического материала рыб «полевых» штаммов Aeromonas salmonicida. После 48-часового культивирования в термостате при 25 ºС полученную взвесь в количестве 5 мл перемещали в стерильные пробирки и центрифугировали 20 минут при 700 g. Наличие бактериофагов в надосадочной жидкости устанавливали с помощью спот-теста. Для этого на чашки Петри с мясопептонным агаром, подсушенным в течение суток, проводили по-сев 24-часовой индикаторной культуры сплошным газоном. После подсыхания газона на его поверхность наносили каплю исследуемой надосадочной жидкости [7]. Одновременно с этим для проверки на отсутствие жизнеспособных бактериальных клеток в надосадочной жидко-сти, делали посев фаголизата на мясопептонный агар. Чашки ставили в термостат при 25 ºС. Посевы периодически просматривали через 18, 24 и 36 ч. Наличие лизиса бактериального га-зона в виде полосы чистого агара или отдельных негативных колоний по ходу стекания капли указывает на наличие в исследуемом материале соответствующего бактериофага.

Результаты исследования и выводы.Таким образом, нами были получены 4 штамма бактериофагов, вызывающих стойкий

лизис индикаторных бактериальных штаммов Aeromonas salmonicida. Дальнейшие исследова-ния направлены на изучение биологических свойств и селекцию полученных бактериофагов с целью последующей разработки на их основе диагностических тест-систем для проведения реакции нарастания титра фага.

Библиографический список1. Блинов А.И., Глушанова Н.А. // Аэромонады: выделение, идентификация и диффе-

ренциация, учебно-методические рекомендации, Новокузнецк, 19972. Викторов Д.А. Усовершенствование методов выделения, идентификации и индика-

ции бактерий Pseu�omonas put��a // Автореф. дис. … канд. биол. наук. – 2011. – 22 с.3. Гольдфарб Д.М. Бактериофагия. М., Государственное издательство медицинской

литературы медгиз, 19614. Инструкция о мероприятиях по борьбе с аэромонозом карповых рыб, 1998 г.5. Инструкция по борьбе с фурункулезом лососевых рыб, 1997 г.,6. Методические указания по санитарно - бактериологической оценке рыбохозяйствен-

ных водоемов. Указание министерство Здравоохранения РФ. 27 сентября 1999г. № 13-4-2/1742.7. Ревенко И.П. Бактериофаги и их использование в ветеринарной практике. К., «Уро-

жай», 1978.

PROSPECTS OF APPLICATION OF BACTERIOPHAGES FOR THE DISPLAY OF THE PATHOGENIC AEROMONADS

Gorshkov I.G., Кuklina N.G., Viktorov D.А., Nasibullin I.R., Vasilev D.А., Zolotukhin S.N.

Keywords: Aeromonas sa�mon��a, aeromonos�s fish ba�ter�ophage se�e�t�on phagotherapy, fago�n��kats�ya.

The stu��es were a��o�ate� 4 �so�ate ba�ter�ophage a�t�ve aga�nst Aeromonas sa�mon��a. Phages obta�ne� prospe�t�ve�y use� for phage therapy, an� for the assay of the phage t�ter r�se, wh��h w�� agnose aeromonos�s fish for up to 24 hours.


5

УДК 619:616-07

ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ БАКТЕРИОФАГОВ ДЛЯ ИНДИКАЦИИ ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ РОДА AEROMONAS

Горшков И.Г., научный сотрудник, [email protected]Куклина Н.Г., научный сотрудник,Викторов Д.А., кандидат биологических наук, тел. 9084775573, [email protected]Насибуллин И.Р., соискатель,Васильев Д.А., доктор биологических наук, профессортел. 8(8422) 55-95-47, [email protected] Золотухин С.Н., доктор биологических наук, профессортел. 9272703480, [email protected] ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина»

Ключевые слова: Бактериофаги, аэромонозы рыб, биотехнология, микробиолгия, диагностика.

В работе рассмотрен обзор современных литературных данных по тематике аэро-монозов рыб, применяемые в настоящее время методы ле�ения рыб и профилактики аэро-монозов, а также обоснованию применения в ка�естве средства диагностики и ле�ения био-препаратов на основе бактериофагов.

Аэромонозы рыб – это опасное заболевание, нередко встречающееся на рыбоводче-ских хозяйствах. Аэромоноз протекает молниеносно, остро, подостро и хронически. Рыбы становятся вялыми, держатся у поверхности воды вдоль берега, корм не принимают. Кожный покров иногда приобретает темную окраску. Острое течение проявляется септицемией и рас-стройством пищеварения, сопровождающимся выделением экскрементов с примесью крови. На кожных покровах и жабрах, а также у основания грудных плавников появляются пятнистые кровоизлияния. В таком состоянии больные рыбы или погибают (в течение 1-3 дней), или заболевание принимает подострое течение. При подостром течении на воспаленных участ-ках кожи образуются фурункулы, глубоко проникающие в мышечный слой, мягкие на ощупь. При вскрытии фурункулов во внешнюю среду изливается экссудат, а на их месте образуются красноватые язвы. У больных рыб отмечается бледность жабр и пучеглазие. Подострое тече-ние продолжается 3-7 дней, вызывая значительную гибель рыб. При хроническом течении на теле рыб появляются обширные участки сапролегниоза, чаще расположенные на пораженных участках кожи и прилегающих зонах. Кроме того, отмечают потерю чешуи, разрушение плав-ников, темную окраску тела, общее истощение рыб. У некоторых особей на поверхности тела и головы заметны заживающие язвы, рубцы, иногда абсцессы, после вскрытия которых об-нажается мускулатура и выделение кровянистой жидкости. Из ануса выделяется кровянисто-гнойный экссудат. Жабры бледные с чередованием мраморных участков. Эта стадия болезни протекает умеренно и продолжается до нескольких недель и даже месяцев. У переболевших рыб-микробоносителей нет никаких клинических признаков, так как инфекция принимает ла-тентное течение. Обнаружение в водоеме рыб с зарубцевавшимися поражениями, без плав-ников служит подтверждением перенесенного аэромоноза [1]. В этом случае переболевшая рыба теряет вес и товарные качества. Всё это наносит колоссальный экономический ущерб рыбоводческим хозяйствам.

Возбудителями аэромоноза рыб является целый ряд патогенных штаммов бактерий


6

рода Aeromonas. У рыб чаще встречаются виды: Aeromonas hy�roph��a, Aeromonas salmonicida, Aeromonas sobr�a, Aeromonas �av�ae, Aeromonas s�hubert��, Aeromonas eu�renoph��a, Aermonas me��a, Aeromonas veron��. Такое обилие видов бактерий, способных вызывать аэромонозы рыб, обуславливает существенные трудности при назначении правильного лечения.

Современные доступные для рыбоводческих хозяйств методы диагностики далеко не совершенны. Диагноз на аэромоноз ставят на основании эпизоотических данных, клинических признаков, патологоанатомических изменений, результатов бактериологического исследова-ния и положительной биопробы. Типирование до вида при этом в основном не производится, так как существующие методы бактериологической диагностики требуют значительных затрат времени и материалов, а современные методики, такие как полимеразная цепная реакция или иммуно-ферментный анализ, требуют дорогостоящего оборудования, материалов и высоко-квалифицированных специалистов, что зачастую недоступно для рыбоводческих хозяйств [6].

Поскольку существующие методы диагностики не предусматривают типирование возбудителей аэромонозов до вида, лечение заболевания заключается в применении антибио-тиков широкого спектра, высокомолекулярных соединений, содержащих йод, а также форма-лина. [4,5] Как известно, такие препараты пагубно влияют на рост и развитие сразу нескольких видов и даже родов бактерий. В результате их применения погибают не только патогенные бактерии, вызывающие заболевание, но и естественная сапрофитная микрофлора, играющая существенную роль в функционировании биоценозов, круговороте азота и других веществ, разложении органических остатков. Кроме того, антибиотики «заодно» убивают и полезную микрофлору желудочно-кишечного тракта, вызывая дисбактериоз кишечника, токсическое по-ражение печени, почек и других органов, проявляются нарушения иммунитета. В результате организм поражает секундарная (то есть вторичная) инфекция. При длительном применении антибиотиков бактерии адаптируются к их действию, что вызывает появление мутантных ан-тибиотикоустойчивых форм микробов. Всё это указывает на несостоятельность современных методов диагностики и лечения аэромонозов рыб.

Применение биопрепаратов на основе бактериофагов для диагностики, лечения и про-филактики основано на использовании гомологичных бактериофагов бактерий рода Aeromo-nas. Применение данного биопрепарата в целях диагностики, лечения и профилактики аэро-моноза рыб имеет ряд преимуществ перед существующими методиками:

- типирование возбудителя осуществляется до вида,- время постановки диагноза сокращается до 18 часов,- не требуется наличие дорогостоящего оборудования и материалов,- не требуется высококвалифицированного труда специалистов,- биопрепарат для лечения активен только в отношении конкретного вида возбудителя,- применение биопрепарата для лечения не вызывает нежелательных последствий (та-

ких как ухудшение иммунитета животного, дисбактериоз, адаптация бактерий к антибиотикам и появление мутантных антибиотикоустойчивых форм бактерий) [2].

Таким образом, в целях диагностики, лечения и профилактики аэромонозов рыб, наи-более приемлемыми являются методы, основанные на использовании бактериофагов. В насто-ящее время коллективом авторов проводятся работы по выделению, изучению биологических свойств и селекции бактериофагов, активных в отношении бактерий рода Aeromonas, в частно-сти Aeromonas salmonicida, Aeromonas sobr�a, Aeromonas veron��, Aeromonas �aveae, Aeromonas hy�roph��a для дальнейшей разработки на их основе диагностических и лечебно-профилакти-ческих биопрепаратов.


7

Библиографический список1. Блинов А.И., Глушанова Н.А. // Аэромонады: выделение, идентификация и диффе-

ренциация, учебно-методические рекомендации, Новокузнецк, 1997.2. Васильев, Д.А. Выделение бактериофагов бактерий Pseu�omonas put��a и их селек-

ция в целях создания биопрепарата для диагностики псевдомоноза рыб / Д.А. Васильев, Д.А. Викторов, И.И. Богданов // Естественные и технические науки. – 2011. – №2(52). – С. 79-82.

3. Гольдфарб Д.М. Бактериофагия. М., Государственное издательство медицинской литературы медгиз, 1961.

4. Инструкция о мероприятиях по борьбе с аэромонозом карповых рыб, 1998 г.5. Инструкция по борьбе с фурункулезом лососевых рыб, 1997 г.,6. Методические указания по санитарно - бактериологической оценке рыбохозяйствен-

ных водоемов. Указание министерство Здравоохранения РФ. 27 сентября 1999г. № 13-4-2/1742.7. Ревенко И.П. Бактериофаги и их использование в ветеринарной практике. К., «Уро-

жай», 1978.

PROSPECTS OF APPLICATION OF BACTERIOPHAGES FOR THE DISPLAY OF THE PATHOGENIC AEROMONADS

Gorshkov I.G., Кuklina N.G., Viktorov D.А., Nasibullin I.R., Vasilev D.А., Zolotukhin S.N.

Keywor�s: Ba�ter�ophages aeromonos�s fish, b�ote�hno�ogy, m�krob�o�g�ya, ��agnost��s.In work there �s the rev�ew of the mo�ern ��terature on the subje�ts of �nfe�t�ous as��tes

of fish, the �urrent�y app��e� metho�s of treatment of fish an� prevent�on of �nfe�t�ous as��tes, as we�� as the substant�at�on of the app��at�on as a means of ��agnost��s an� treatment of b�o�og��a� preparat�ons on the bas�s of ba�ter�ophages.

УДК 619:579

ОПТИМИЗАЦИЯ СХЕМЫ ВЫДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИОФАГОВ PSEUDOMONAS CHLORORAPHIS

Гринева Т.А., соискатель,тел. 9033201410, e-mail: [email protected]Викторов Д.А., кандидат биологических наук,старший научный сотрудник, тел. 9084775573, [email protected]Васильев Д.А., доктор биологических наук, профессорТел. 8(8422) 55-95-47, [email protected]ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина»

Ключевые слова: �севдомонады, Pseu�omonas �h�ororaph�s, псевдомонозы рыб, бак- �h�ororaph�s, псевдомонозы рыб, бак-�h�ororaph�s, псевдомонозы рыб, бак-, псевдомонозы рыб, бак-териофаги, схема выделения.

В результате проведённых исследований была оптимизирована схема выделения бак-териофагов Pseu�omonas �h�ororaph�s. С использованием разработанной методики из водных объектов выделено 2 изолята бактериофагов, активных в отношении названого вида бакте-


8

рий.

Интенсивный рост аквакультуры обуславливает повышенный интерес к бактериаль-ным заболеваниям пресноводных рыб.

Патогенные штаммы флюоресцирующих видов бактерий рода псевдомонад (Pseu-�omonas put��a, Pseu�omonas �ypr�n�sept��um, Pseu�omonas � uores�ens, Pseu�omonas aureofa- put��a, Pseu�omonas �ypr�n�sept��um, Pseu�omonas � uores�ens, Pseu�omonas aureofa-put��a, Pseu�omonas �ypr�n�sept��um, Pseu�omonas � uores�ens, Pseu�omonas aureofa-, Pseu�omonas �ypr�n�sept��um, Pseu�omonas � uores�ens, Pseu�omonas aureofa-Pseu�omonas �ypr�n�sept��um, Pseu�omonas � uores�ens, Pseu�omonas aureofa- �ypr�n�sept��um, Pseu�omonas � uores�ens, Pseu�omonas aureofa-�ypr�n�sept��um, Pseu�omonas � uores�ens, Pseu�omonas aureofa-, Pseu�omonas � uores�ens, Pseu�omonas aureofa-Pseu�omonas � uores�ens, Pseu�omonas aureofa- � uores�ens, Pseu�omonas aureofa-�uores�ens, Pseu�omonas aureofa-, Pseu�omonas aureofa-Pseu�omonas aureofa- aureofa-aureofa-��ens, Pseu�omonas �h�ororaph�s, Pseu�omonas �ermoa�ba, Pseu�omonas �ntest�na��s) способны вызывать псевдомонозы карповых рыб [2].

P. сh�ororaph�s является нормальным обитателем дистальных отделов кишечника рыб, но способна вызывать заболевания, когда концентрация бактерий в водоемах превышает есте-ственный фон. В тоже время, бактерии P. сh�ororaph�s могут быть использованы в качестве по-тенциальных пробиотиков в борьбе с бактериальными заболеваниями пресноводных рыб [3].

Бактериологические методы диагностики, используемые в настоящее время, являют-ся трудоемкими и продолжительными.

Нами оптимизирована схема получения бактериофагов P. сh�ororaph�s для их даль-нейшей селекции и разработки тест-систем для видового типирования P. сh�ororaph�s.

Цель исследования: оптимизация схемы выделения бактериофагов P. сh�ororaph�s из объектов окружающей среды.

Материалы и методы: Для выделения бактериофагов P. сh�ororaph�s исследовано 18 проб из водных источ-

ников Ульяновской области. Индикаторными культурами служили 5 полевых штаммов, вы-деленных ранее из сточных вод, образцов почвы и прудовой воды. Исследование проводили по схеме, предложенной Викторовым Д.А., для выделения фагов [1]. Температурный режим и продолжительность культивирования были модифицированы с учетом биологических особен-ностей объекта исследования.

В колбы с 50 мл концентрированного мясопептонного бульона добавляли исследуе-мую воду в количестве 50 мл, таким образом доводя концентрацию среды до обычной, и по 1 мл 18-часовой бульонной индикаторной культуры. После 48 часов культивирования при 28 ºС полученную взвесь в количестве 5 мл переносили в стерильные пробирки и центрифугировали 20 минут при 3000 об/мин. Супернатант фильтровали через бактериальные фильтры с диа-метром пор 0,2 мкм. Наличие бактериофагов в фильтрате определяли с помощью спот-теста. На чашки Петри с мясопептонным агаром проводили посев 18-часовой бульонной культуры индикаторных штаммов сплошным газоном. После подсыхания газона на поверхность агара наносили 1 каплю исследуемого фильтрата. Контроль бактериального загрязнения фильтрата проводили на чашках Петри со стерильным мясопептонным агаром. Посевы просматривали через 24, 36, 48 часов. Присутствие в исследуемом материале бактериофагов определяли по наличию зон лизиса бактериального газона или отдельных негативных колоний.

В результате исследования были выделены 2 культуры бактериофагов P. сh�ororaph�s. В дальнейшем они были протестированы на референс-штамме P. сh�ororaph�s В-1246, полу-ченном во Всероссийской коллекции микроорганизмов (г. Пущино). Результаты тестирования положительные.

Вывод: Таким образом, нами были выделены 2 культуры бактериофагов бактерии P. сh�ororaph�s.

Библиографический список1. Викторов, Д.А. Выделение и изучение биологических свойств бактериофагов Pseu-

�omonas �uores�ens / Д.А. Викторов, А.М. Артамонов, Д.А. Васильев // Ветеринария и корм-


9

ление. – Москва: «ВЕТКОРМ», 2012. – №5. – С. 8-9.2. Методические указания по лабораторной диагностике псевдомонозов рыб, Мин-

сельхозпрод России, Департамент ветеринарии, 1998.3. Goldschmidt-Clermont, E., Wahli, T., Frey, J. & Burr, S. E. (2008).Identification of bac-

teria from the normal flora of perch, Per�a �uv�at��s L., and evaluation of their inhibitory potential towards Aeromonas species. J F�sh D�s 31, 353–359.

OPTIMIZATION OF THE SCHEME OF ALLOCATION OF BACTERIOPHAGES PSEUDOMONAS CHLORORAPHIS

Grineva Т.А., Viktorov D.А., Vasilev D.А.

Key words: Pseu�omonas, Pseu�omonas �h�ororaph�s, pseu�omonos�s fish, ba�ter�ophages, the ��r�u�t se�e�t�on.

As a resu�t of the �on�u�te� resear�h, the s�heme of a��o�at�on of ba�ter�ophages Pseu�omonas �h�ororaph�s has been opt�m�ze�. Us�ng the �eve�ope� metho�o�ogy, 2 �so�ates of ba�ter�ophages a�t�ve �n respe�t of the above type of ba�ter�a were a��o�ate� from water obje�ts.

УДК 619:616.98:579.842

ВЛИЯНИЕ БАКТЕРИОФАГОВ НА МИКРОФЛОРУ ТОЛСТОЙ КИШКИ

Затевалов А.М., кандидат химических наук, [email protected]Киселева И.А., (495)452-18-16, [email protected]Копанев Ю.А., кандидат медицинских наук, [email protected]Алешкин А.В., доктор биологических наук, [email protected]Афанасьев С.С., доктор медицинских наук, профессор, Селькова Е.П.ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора

Ключевые слова: функциональная активность микрофлоры кише�ника, лету�ие жирные кислоты, фаго�увствительность и фагорезистентность, препараты бактериофа-гов.

Выявление критериев оценки и эффективности применения бактериофагов для кор-рекции и нормализации кише�ного микробиоценоза остается важной зада�ей, которая мо-жет быть решена с помощью сравнения параметров функциональной активности и фено-типи�еских свойств микрофлоры кише�ника, а так же путем определения избирательности действия препаратов бактериофагов на нормальную и условно-патогенную микрофлору ки-ше�ника �n v�tro и �n v�vo.

Введение. В микробном сообществе нормальной микрофлоры человека эволюцион-но сформировались межклеточные сети, которые представляют собой систему трофических и энергетических взаимосвязей внутри кишечного микробиоценоза[1].

Представление о микробиоте кишечника, как об отдельном органе человеческого ор-


10

ганизма не противоречит исторически сложившемуся определению органа, как части орга-низма, представляющей собой эволюционно сложившийся комплекс тканей, объединенный общей функцией, структурной организацией и развитием [2].

Методы клинической биохимии – определение концентраций ЛЖК газо-жидкостной хроматографией дают важные критерии функциональной активности микробиоты кишечника, а именно концентрацию масляной кислоты, соотношение уксусной, пропионовой и масляной кислот, суммарную концентрацию ЛЖК, структурный индекс и индекс изокислот. На основа-нии этих критериев можно сделать вывод о типе и степени нарушения функциональной актив-ности микробиоценоза кишечника [3].

Не теряет своей актуальности микробиологический анализ кала, несмотря на неболь-шой процент высеваемости представителей нормобиоценоза и непропорциональное соотно-шение микроорганизмов в кишечнике и в кале. Такие свойства микроорганизмов, как чув-ствительность к антибиотикам, чувствительность к бактериофагам коррелируют с некоторыми показателями функциональной активности микрофлоры кишечника и могут характеризовать состояние микробиоценоза кишечника[3].

Материалы и методы исследований. Исследование корреляции средней антибиоти-ко- (САЧ) и фагочувствительности (СФЧ) выделенной микрофлоры со структурным индексом (СИ), индексом изокислот (ИИ), а так же других показателей ЛЖК [3], проведенное на 3000 пациентов консультативно-диагностического центра МНИИЭМ Габричевского, проводилось по результатам комплексного анализа микрофлоры кишечника, включающего биохимический, копрологический, и микробиологический анализ кала.

Влияние интести-бактериофага (производство ФГУП «НПО Микроген») in vivo на уровень бифидобактерий и лактобацилл в толстой кишке у 30-ти пациентов проводилось пу-тем сравнения содержания этих бактерий до и спустя неделю после курсового приема препа-рата. Нормофлору определяли с помощью микробиологического исследования кала, используя жидкие селективные агаризованные среды MRS и Блаурокк.

Также проводили исследования влияния интести-бактериофага на нормальную микро-флору, полученную от 63 пациентов КДЦ ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского», in vitro. Сравнивали титры бифидобактерий и лактобацилл, исходно содержавшиеся в кале пациентов, с их количеством, определяемым на тех же средах при добавлении бактериофага.

Влияние интести-бактериофага на нормальную E.coli и условно-патогенную микро-флору (гемолизирующую E.coli и S.aureus) определялось spot-тестом, заключающимся в оцен-

y = 0,0616x + 0,5467R² = 0,727

0,00,10,20,30,40,50,60,70,80,9

0 1 2 3 4 5Средняя чувствительность к антибиотикам, отн. ед. (0 - 4)

Структурный индекс

y = 0,4683x + 3,7653R² = 0,841

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

0 1 2 3 4 5Средняя антибиотикочувствительность

Протеолитический индекс

а) б)Рис. 1. Зависимость структурного индекса а) и индекса изокислот б) от средней антибиотикочувсвительности на большой выборке пациентов КДЦ МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского.


11

ке зоны лизиса на газоне исследуемых культур, посеянных на плотных селективных агаризо-ванных средах, после нанесения на него капли интести-бактериофага.

Результаты исследований и их обсуждение. В ходе проведения 3000 комплексных ис-следований микрофлоры кишечника получена корреляция СИ и ИИ с САЧ. Результаты пред-ставлены на рисунке 1.

Известно, что продуцентами уксусной кислоты могут быть как аэробная, так и ана-эробная микрофлора. Продуценты пропионовой, масляной и далее по гомологическом ряду кислот являются анаэробные бактерии. Снижение СИ – доли анаэробных кислот указывает на сокращение численности анаэробных бактерий, снижению толщины защитной биопленки и о большей уязвимости стенок кишечника.

Известно, что при взаимоотношениях макроорганизма и микробиоты, макроорганизм управляет своей микробиотой, используя разные механизмы, в том числе и селективное пода-вление различных групп микроорганизмов секрецией антибактериальных агентов (лизоцима и т.д.). Микрофлора, имеющая высокую антибиотикорезистентность, способна к самоорганиза-ции микробного сообщества переориентированного на иные метаболические пути переработ-ки субстрата и нарушению функциональной активности.

Положительная корреляция СИ и САЧ (рис. 1) свидетельствует о взаимосвязи струк-туры функциональной активности микробиоты кишечника с ее управляемостью. При увели-чении антибиотикорезистентности микробиоценоза увеличивается концентрация уксусной кислоты и снижается продукция анаэробных кислот.

Выявлена так же корреляция САЧ с индексом изокислот (ИИ), который рассчитывает-ся как отношение суммы изоформ к сумме линейных форм масляной, валериановой и капроно-вой кислот. ИИ характеризует протеолитическую активность микрофлоры, так как изоформы ЛЖК образуются при гидролизе белков. Увеличение индекса изокислот свидетельствует о по-вышении протеолитической активности микрофлоры.

Положительная корреляция ИИ и САЧ (рис. 1) указывает на взаимосвязь между уве-личением доли сахаролитической микрофлоры в «неуправляемых микробных сообществах» и общей антибиотикорезистентностью микробного сообщества.

По аналогии с САЧ был предложен критерий средней фагочувствительности (СФЧ). Средняя чувствительность к фагам – это величина, полученная усреднением всех значений чувствительности к фагам (нормированных в баллы для унификации использования) по набо-ру фагов (интести-бактериофаг, пиобактериофаг комплексный) и микроорганизмов, выделен-

y = -8,0934x + 100,84R² = 0,7596

0

20

40

60

80

100

120

0 1 2 3 4 5

Концентрация, ммоль/г

Средняя фагочувствительность

Суммарная концентрация ЛЖК

а) б)Рис.2. Зависимость а) суммарной концентрации ЛЖК и б) индекса изокислотот средней антибиотикочувсвительности на большой выборке пациентов КДЦ МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского.


12

ных из биоматериала пациента.Предложенный критерий был исследован на предмет корреляции с показателями

функциональной активности микрофлоры кишечника, в том числе со структурным индексом и индексом изокислот на 3000 пациентах КДЦ МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского. Отрицатель-ная корреляционная зависимость была найдена между СФЧ и суммарной концентрацией (СК) ЛЖК.

На рисунке 2 видно, что с увеличением устойчивости микробиоценоза к фагам уве-личивается СК ЛЖК в кале и растет индекс изокислот. Снижение ИИ и СК при увеличении фагочувствительности можно объяснить спецификой подбора фагов для комплексного анализа микрофлоры кишечника. В связи с тем, что практикующих врачей интересует чувствитель-ность к фагам условно-патогенной, протеолитической микрофлоры, был задействован соот-ветствующий набор фагов (интести-бактериофаг, пиобактериофаг комплексный). Таким об-разом, можно отметить, что такие свойства микробиоценоза как фагочувствительность (рези-стентность) и функциональная активность связаны между собой.

Для определения влияния интести-бактериофага на симбиотическую микрофлору толстой кишки (бифидобактерии и лактобациллы) было обследовано 30 человек. Сравнивали частоту встречаемости бифидобактерий и лактобацилл в кале пациентов в титрах их средних (медианных) значений в пределах доверительного интервала (р=95%) для бифидобактерий до 109 (107-109), после фаготерапии 108 (108-108); для лактобацилл до 106 (105-107), после фаготе-рапии 106 (105 - 106). Результат представлен на рисунке 3.

73% 73%

43%

67%

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Бифидобактерии Лактобациллы

Встречаемость, % До фаготерапииПосле фаготерапии

7,9 7,9 5,9 5,8

P(Хи2)=0,78P(Хи2)=0,96

Интенсивность, ср. лог. КОЕ

Рис.3. Встречаемость бифидо- и лактофлоры до и после приема интести-бактериофага пациентами.

Из рисунка 3 видно, что встречаемость лактобацилл и бифидобактерий достоверно не изменилась, интенсивность роста так же осталась прежней, а коэффициенты корреляции бифидобактерий (r=-0,080) и лактобацилл (r=-0,070) до и после принятия фагов показывают отсутствие тенденций к увеличению или снижению интенсивности роста определяемой микрофлоры. Таким образом, очевидно, что применение интести-бактериофага не влияет на рост симбиотической нормальной микрофлоры толстого кишечника.

Влияние интести-бактериофага на рост бифидобактерий, лактобациллы было исследовано методом серийных разведений in vitro на средах MRS и Блаурокк с добавлением и без добавления в среду этого фага. Проведенная работа показала, что большая часть штаммов нормофлоры является устойчивой к действию данного фага (таблица 1).


13

Таблица 1. Частота выявления штаммов нормальной микрофлоры кишечника, чувствительных к интести-бактериофагу.

Микроорганизмы, (количество исследованных штаммов)

Частота выявления штаммов нормофлоры, чувствительных к исследуемому фагу, в % +m

Bifidobacterium, (63) 19,0 + 5,1Lactobacillus, (63) 23,2 + 5,3E.coli (hem-), (34) 29,4 + 4,1

Однако, некоторые штаммы (20 - 30%) оказались лизированными, что на наш взгляд, может свидетельствовать о проявлении этим коктейлем фагов неспецифической литической активности. Но, вопрос остается открытым и требует дальнейшего изучения.

Влияние этого бактериофага на рост E.coli (hem-) (табл. 1), E. coli (hem+) и S.aureus исследовали в spot-тесте. Определяли частоту выявления штаммов, устойчивых и чувствительных к этому бактериофагу. Результаты показаны в таблице 2:

Таблица 2. Частота выявления фагорезистентных штаммов, % +m.Микроорганизмы, (количество

исследованных штаммов)Частота выявления фагорезистентных штаммов в %

+mE.coli (hem+), (69) 20,3 + 2,3S.aureus, (48) 18,8 + 3,7

Наши данные по нормальной микрофлоре совпадают с данными, представленными в литературе [4], но для условно-патогенных микроорганизмов значения частоты выявления фагорезистентных штаммов имеют большие значения. Это может быть связано как с изменчивостью представителей нормальной и условно-патогенной микрофлоры в составе микробиоценоза кишечника и особенностями данных микробиоценозов, отличающихся высо-, отличающихся высо-кой степенью биоразнообразия системы в условиях дисбиотических изменений микрофлоры кишечника, так и с неспецифичной активностью штаммов бактериофагов в отношении бифидобактерий, лактобацилл и нормальной кишечной палочки.

Заключение. Избирательность действия бактериофагов зависит от индивидуальности микробиоценоза, от изменения фенотипических и эпигенетических свойств отдельных микроорганизмов. В связи с этим, необходим постоянный мониторинг чувствительности бактерий различных биотопов к существующим фаговым препаратам, с целью повышения их эффективности по отношению к патогенной микрофлоре и снижению побочного действия на нормофлору за счет обновления банка штаммов бактериофагов.

Библиографический список1. Бондаренко В. Микрофлора человека: норма и патология. Наука в России, №1, 2007.2. QinJ., LiR., RaesJ., ArumugamM. etal. A human gut microbial gene catalogue established

by metagenomicsequencing.MetaHITConsortium // Nature. 2010. Vol. 464 (7285). P. 59–65.3. Затевалов А.М., Алешкин А.В., Селькова Е.П., Гусарова М.П., Затевалова Е.А.

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ПОДХОД К ОЦЕНКЕ МИКРОБИОТЫ КИШЕЧНИКА // Международная научная конференция «Достижения и перспективы развития биотехнологии», Сборник тезисов с. 137.

4. Бочков И.А., Лавренов Э.С., Юрко Л.П. Влияние лечебных бактериофагов на


14

условнопатогенную и симбиотическую микрофлору толстой кишки // Эпидемиология и инфекционные болезни, «2, 2009

THE INFLUENCE OF BACTERIOPHAGE ON THE GUT MICROFLORA

Zatevalov A.M., Kopanev J.A., Aleshkin A.V., Afanasiev S.S.

Key words: fun�t�ona� a�t�v�ty of �ntest�na� m��ro� ora, vo�at��e fatty a��s, an� fago�huvs-fun�t�ona� a�t�v�ty of �ntest�na� m��ro�ora, vo�at��e fatty a��s, an� fago�huvs-tv�te�nost fagorez�stentnost, preparat�ons of ba�ter�ophages.

I�ent�fi�at�on of eva�uat�on �r�ter�a an� effe�t�veness of ba�ter�ophages for �orre�t�on an� norma��zat�on of the �ntest�na� m��rob�ota �s the �mportant a�m wh��h �an be so�ve� by �ompar�ng the parameters of fun�t�ona� a�t�v�ty an� phenotyp�� propert�es of the �ntest�na� m��ro�ora, as we�� as by �eterm�n�ng se�e�t�v�ty of ba�ter�ophage preparat�ons for a norma� an� �on��t�ona��y pathogen�� ntest�na� m��ro�ora �n v�tro an� �n v�vo.

УДК 619:579.852.13

ЗНАЧЕНИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ФАГОВ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ BACILLUS ANTHRACIS

Капустин А. В., кандидат ветеринарных наук, доцент, [email protected]Моторыгин А. В. кандидат ветеринарных наук, [email protected]ФГБУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов»

Ключевые слова: сельскохозяйственные животные, бациллы, сибирская язва, вакци-нация, патологи�еский материал, фагодиагностика.

В работе приведены данные по изу�ению диагности�еских свойств бактериофагов и их применение для идентификации возбудителя сибирской язвы. �о результатам проведенных исследований установлено, �то исследуемые культуры Ba��us anthra��s обладали высокой �увствительностью к бактериофагу, �то позволило дифференцировать возбудителя сибир-ской язвы от других видов Ba��us.

Введение. Сибирская язва – острое инфекционное заболевание из группы зоонозов, отнесенное к списку наиболее опасных карантинных инфекций. Болезнь главным образом травоядных животных, при этом смертность может достигать 80%. В последние годы в РФ ежегодно регистрируется от 3 до 11 вспышек сибирской язвы [5]. Этиологическим агентом является спорообразующие, грамположительные, палочки Bacillus anthracis, единственный об-лигатный патоген из рода Bacillus. Большинство других видов Bacillus являются повсемест-но распространенными обитающими в окружающей среде сапрофитами, некоторые из них, а именно Bacillus cereus, Bacillus licheniformis и Bacillus subtilis, могут ассоциироваться с пище-выми отравлениями у людей и с другими клиническими проявлениями, как у людей, так и у животных [1-3,8].

На встрече Экспертного комитета по биологической стандартизации в 1998 году были проанализированы имеющиеся международные стандарты и список используемых биологиче-


15

ских препаратов ветеринарного назначения для диагностики и профилактики сибирской язвы и в результате были предложены новые методики и составлен актуальный список препаратов. Однако эти меры не позволяют отказаться от используемых в настоящее время методов диа-гностики и профилактики, в частности, ветеринарных вакцин против сибирской язвы, разра-ботанных ещё в 60-х и 70-х годах. В некоторых странах для диагностики сибирской язвы в разложившихся тушах или продуктах животного происхождения до сих пор используют тер-мопреципитиновый тест, описанный А. Асколи в 1910 г.

Основные трудности лабораторной диагностики сибирской язвы заключаются в том, что при естественном разложении туши животного большинство вегетативных организмов уничтожается под действием гнилостных бактерий. В жарком климате это может происхо-дить в течение одного или двух дней, если туша остается нетронутой. В мазках из образцов крови, отобранных после этого, капсулированные бациллы обнаружить достаточно сложно, хотя культура может сохраняться в крови более 1-2 суток [6,9]. В жидкостях, вытекающих из естественных отверстий, может наблюдаться споруляция, и множество спор контаминируют окружающую среду, особенно когда туша вскрыта животными-падальщиками. В случае силь-ного разложения туш, культивирование образцов почвы контаминированной выделениями, яв-ляется основным способом подтверждения диагноза.

В качестве дополнительных лабораторных исследований помимо микроскопии мазков и термопреципитиновой кольцевой пробы, так же используют тесты: определение подвиж-ности, чувствительность к пенициллину и специфическому диагностическому бактериофагу.

Цель и задачи исследования. В этой связи, из-за трудностей диагностики сибирской язвы, возникающих при проведении анализов почвы, шкур и разложившихся трупов живот-ных, использование бактериофагов для идентификации возбудителя сибирской язвы является на сегодняшний день актуальной задачей.

Материалы и методы исследований.Работа проведена в лаборатории качества и стандартизации лекарственных средств

против бактерийных болезней животных ФГБУ «Всероссийский государственный Центр ка-чества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов». Для проведения исследований использовали вакцинные штаммы: Ba��us anthra��s 55-ВНИИВВиМ, Ba��us anthra��s М71, Ba��us �ereus, Ba��us subt��s. Исследования проводили в соответствии с «Ме-тодическими указаниями по лабораторной диагностике и обнаружению возбудителя сибир-ской язвы [4].

Чувствительность бактерий Ba��us anthra��s к бактериофагам была впервые описана Brown и Cherry в 1955 [7]. Бактериофаги различных производителей находятся в националь-ных центральных ветеринарных лабораториях и других справочных лабораториях по сибир-ской язве («Гамма», «К», Fah-ВНИИВВиМ и др.). В связи с тем, что стандартизированных тре-Fah-ВНИИВВиМ и др.). В связи с тем, что стандартизированных тре--ВНИИВВиМ и др.). В связи с тем, что стандартизированных тре-бований к диагностическим биологическим препаратам не существует – используемый нами в работе бактериофаг был получен по следующей схеме: аттенуированная культура Ba��us anthra��s на чашках Петри с агаром Mueller-Hinton + 5% овечьей кровью � инкубация в тече-inton + 5% овечьей кровью � инкубация в тече-nton + 5% овечьей кровью � инкубация в тече-ние 4-6 часов при 37оС � засевание культуры фагом (при наличии интенсивного и видимого невооруженным глазом роста) � посев ≈ 2 мл исходного гамма бактериофага каплями наносят на всю поверхность культуры � 37 оС, 12-14 ч � помещают чашки в морозильник при -20оС на 12-14 ч � 18-20 оС, 2 ч � отбор и фильтрация жидкости через фильтровальную бумагу � повторное стерильное фильтрование (фильтр 0,22мк) проверка эффективности фага и провер-ка чувствительности к культуре Ba��us anthra��s (в разведениях 1/1, 1/10 до 1/10 000). Полу-ченный бактериофаг хранили при 2-8 ос.


16

Результаты исследований и обсуждение. Бактерии Bacillus anthracis без труда поддаются выделению из крови и тканей живот-

ных, недавно павших от сибирской язвы, и в чистой культуре на стандартных питательных средах, при 37оС, наиболее оптимальной средой является 10% кровяной агар. Но в то же время при разложении туши, особенно в теплом климате, бактерии, вызывающие гниение, оказыва-ются вне конкуренции и, в конечном счете, они уничтожают инфицирующий организм в туше. Подтверждение наличия сибирской язвы в таких случаях может зависеть от результатов вы-деления возбудителя из почвы, контаминированной предсмертными выделениями.

Принцип реакции основан на свойствах бактерий Bacillus anthracis лизироватся си-биреязвенными фагами. Для проведения реакции чашки с агаром Mueller-Hinton перед поста-inton перед поста-nton перед поста-новкой пробы размечали на квадратные сектора со стороной 2 см. На каждый сектор нано сили каплю 5—6-часовой бульонной культуры Bacillus anthracis. Чашку подсушивали в течение 30 мин в термо стате, после чего в центр подсохшей капли наносят петлей каплю (10-15 мкл) си-биреязвенного бактериофага, в качестве дополнительного теста на другую сторону помещали диск с пенициллином (10 ед). Учет результатов проводили через 12—24 ч инкубации чашек при 37оС. В случае положительно го результата на участке из-за лизиса наблюдали зоны про-светления и отсутствие бактериального роста, вокруг пенициллинового диска наблюдалась чистая просветленная зона.

Заключение.В результате проведенных исследований было установлено, что штаммы Ba��us

anthra��s 55-ВНИИВВиМ и Ba��us anthra��s М71 были высокочувствительны к бактериофагу и пенициллину, и образовывали характерные зоны просветления диаметром от 30-50 мм; у штаммов Ba��us �ereus, Ba��us subt��s задержки роста на месте нанесения сибиреязвенного бактериофага не наблюдалось, культура Ba��us subt��s была резистентна к антибиотику. Со-гласно полученным результатам, использование бактериофагов является и легко выполнимым и высокочувствительным методом, позволяющим идентифицировать Ba��us anthra��s от дру-гих видов Bacillus.

Библиографический список1. Бакулов, И.А. Сибирская язва (антракс): новые страницы в изучении «старой» бо-

лезни / И.А. Бакулов, В.А. Гаврилов, В.В. Селиверстов. -Владимир: «Посад», 2001. 218 с. 2. Ипатенко Н.Г., Гаврилов В.А. и др. Сибирская язва. - М.: Колос, 1996.3. Лобанова Т.П., Кихтенко Н. В. Сибирская язва. Монография. М., 2003. - 45 с.4. МУК 4.2.2413-08 «Лабораторная диагностика и обнаружение возбудителя сибир-

ской язвы. Методические указания». 5. Онищенко Г.Г. Сибирская язва: актуальные аспекты микробиологии, эпидемиоло-

гии, клиники, диагностики, лечения и профилактики /Г.Г. Онищенко и др, М.: ВУНМЦ МЗ РФ, 1999. - 448 с.

6. Рязанова, А.Г. Характеристика биологических свойств атипичных штаммов сиби-реязвенного микроба, усовершенствование методов их индентификации и дифференцирова-ния от близкородственных бацилл: Автореф. дис. . канд. мед. наук: (03.00.07)/ А.Г. Рязанова. Ростов-на-Дону, 2006. - 23 с.

7.Brown E.R. & Cherry W.B. Specific «Identification of Bacillus anthracis by meen of a variant bacteriphage. J. Infect. Dis., 96, - P. 34-39.

8. Dieter, C., Dagmar F. II Bacillus Ed. C. R. Harwood. New York, London. Plenum Press. 1989. - P. 5-26.

9. Fellows, P.F. A survey of worldwide strains of Bacillus anthracis / P.F. Fellows // Proc.


17

Inter. Workshop on anthrax. Winchester, England. September 19-21. 1996. -N 87. - P. 33.

VALUE OF DIAGNOSTIC PHAGES FOR BACILLUS ANTRACIS IDENTIFICATION

Kapustin A. V., Motorygin A. V.

Keywords: agr��u�tura� an�ma�s, ba��, ma��gnant anthrax, ba�ter�nat�on, patho�og��a� mater�a�, phage��agnos�s.

Data on stu�y�ng of ��agnost�� propert�es of ba�ter�ophages an� the�r app��at�on are prov��e� �n work for ��ent�fi�at�on of the or�g�nator of a ma��gnant anthrax. By resu�ts of the �on�u�te� resear�hes �t �s estab��she� that stu��e� �u�tures of Ba��us anthra��s possesse� h�gh sens�t�v�ty to s�a�e to a ba�ter�ophage that a��owe� to ��fferent�ate the or�g�nator of a ma��gnant anthrax from other types of Ba��us.

УДК 602.3:579.8

ОЦЕНКА ЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ НЕКОТОРЫХ БАКТЕРИОФАГОВ

Катаева Л. В., кандидат медицинских наук, ведущий научный сотрудник, тел. 8(3452) 29-99-90, [email protected]Вакарина А. А., младший научный сотрудникНижегородцева Н. Ф., младший научный сотрудник ФБУН ТНИИКИП Роспотребнадзора

Ключевые слова: Бактериофаги, �увствительность, устой�ивость, штаммы бак-терий, метод определения.

Работа посвящена определению �увствительности/устой�ивости некоторых ус-ловно-патогенных бактерий к бактериофагам разли�ными методами (на плотной и в жид-кой питательной среде). �ри проведении исследования установлено, �то �увствительность штаммов бактерий к разли�ным бактериофагам не одинакова, поэтому необходимо назна-�ать фаготерапию после исследования фаголити�еской активности. Кроме того, существу-ющая методика определения и оценки активности фагов субъективна.

Введение. Современная ситуация снижения эффективности антибиотикотерапии очень сложна вследствие повышения устойчивости патогенных и условно-патогенных бакте-рий к антибактериальным препаратам. Хорошие перспективы в качестве антимикробной тера-пии имеют бактериофаги, которые эффективны в отношении как чувствительных, так и устой-чивых к антибиотикам бактерий. Бактериофаги обладают рядом преимуществ: специфичность действия, отсутствие угнетения нормальной микрофлоры и аллергической реакции, стимуля-ция факторов специфического и неспецифического иммунитета [1], применение бактериофа-гов вместе с антибиотиками и иммунопрепаратами [2, 3]. Кроме того, весомым аргументом в пользу целесообразности клинического применения бактериофагов является практически пол-ное отсутствие побочных эффектов, а следовательно, и противопоказаний [4].


18

Чувствительность к бактериофагам бактерий, выделенных из стационаров различного профиля несколько варьирует. Так, литическая активность стафилококкового бактериофага и пиобактериофага к стафилококкам, выделенным из очагов гнойной инфекции, составляет 72 – 88 %, стрептококковый фаг лизировал 60 – 82 % штаммов стрептококков [5, 3]. Вместе с тем, результаты исследований чувствительности штаммов Staphylococcus aureus и Streptococcus pneumonia, выделенных от больных гастроэнтерологического отделения показали, что стафи-лококковый фаг лизировал 37,1 % штаммов, стрептококковый фаг – 12 – 21 % стрептококков [6]. Клебсиеллы сохраняли чувствительность как к клебсиеллезному, так и к пиобактериофагу в 87 % случаев. При сравнении литической активности монофагов и ассоциированных под-черкивают, что у монофагов она более выражена [6, 3].

Таким образом, существенное различие данных о литической активности бактерио-фагов условно-патогенных микроорганизмов, тем более, если речь идет о применении фагов в лечебных целях, свидетельствует о том, что в каждом конкретном случае необходимо пред-варительное определение чувствительности конкретных микроорганизмов к бактериофагам определенных производителей [7].

Целью исследования явилось сравнение литической активности монофагов и ассо-циированных фагов к штаммам Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumonia и Klebsiella pneumonia, а также характеристика эффективности методов определения чувствительности к фагам на плотной и в жидкой питательных средах.

Материалы и методы исследований. Чувствительность исследуемых штаммов определялась к следующим бактериофа-

гам: стафилококковый бактериофаг, пиобактериофаг поливалентный очищенный и бактерио-фаг клебсиелл поливалентный (ФГУП НПО «Микроген» МЗ РФ, г. Уфа), интестибактериофаг (ФГУП НПО «Микроген» МЗ РФ, г. Нижний Новгород), пиокомбинированный, фаг клебсиелл пневмонии очищенный (ФГУП НПО «Микроген» МЗ РФ, г. Пермь).

Действие монофагов и комбинированных бактериофагов было изучено на 159 культу-рах Staphylococcus aureus и 62 штаммах бактерий Klebsiella pneumoniae, выделенных от боль-ных с дисбиозами и здоровых новорожденных детей при еженедельном мониторировании родильного дома № 2 г. Тюмени. Фаголитическую активность стафилококкового, пиобакте-риофага поливалентного, интестибактериофага и пиокомбинированного фага исследовали со штаммами Staphylococcus aureus на плотной (1,5 % мясопептонный агар - МПА) и в жидкой (мясопептонный бульон - МПБ) питательных средах.

Фаголитическую активность бактериофага клебсиелл пневмонии, клебсиеллезного поливалентного бактериофага и пиобактериофага поливалентного исследовали со штаммами Klebsiella pneumoniae.

Бактериальную суспензию суточной агаровой культуры (5 ед по ОСО 42-28-85-01 п) исследуемого штамма равномерно наносили на поверхность чашки Петри с хорошо подсу-шенной питательной средой. На поверхность агара с впитавшейся культурой наносили одну каплю бактериофага. После подсыхания капли фага, чашки инкубировали в термостате при 370С в течение 18-20 ч. Степень лизиса культуры оценивали по схеме: полный лизис – «++++»/ «+++», свидетельствует о чувствительности изучаемого штамма к бактериофагу; не полный лизис и отсутствие лизиса – « - », указывает на устойчивость штамма.

Применяли также вариант метода, при котором бактериофаги (5 капель) добавляли пастеровской пипеткой в 5 мл МПБ, в который вносили петлю суточной агаровой исследуемой культуры. Термостатировали 18-24 часа при 370С.

Статистическая обработка выполнена лицензионным программным обеспечением SPSS версия 14.0, предназначенным для научных исследований, отвечающих требованиям


19

клинической эпидемиологии. В исследовании использовались дискретные данные (типа Да/Нет – устойчивые/чув-

ствительные). Дискретные данные анализировались таблицами сопряженности, которые при-менялись для расчета отношения шансов встречаемости исследуемых явлений в анализируе-мых группах. Гипотеза о равенстве шансов встречаемости отвергалась, когда величина соот-ветствующего критерия не равна 1, а его 95% доверительные интервалы не включали в себя 1.

Результаты исследований и их обсуждение. Итоги изучения сравнительных характеристик методов определения фаголитической

активности монофагов и ассоциированных бактериофагов на плотной и в жидкой питатель-ной среде показали следующие результаты. Литическая активность фагов: стафилококкового, интестибактериофага и пиокомбинированного к бактериям S. aureus на МПА, практически не отличаются, различия статистически не значимы. Исключение составляет пиобактериофаг поливалентный, устойчивость к которому оказалась выше, чем у стафилококкового и инте-стибактериофага, разница статистически достоверна, о чем свидетельствует критерий оценки статистической значимости, таблица 1.

Аналогичные исследования фаголитической активности в МПБ показали, что более высокая устойчивость стафилококков выявлена к стафилококковому и пиокомбинированному фагам, по сравнению с интестифагом и пиобактериофагом поливалентным, разница статисти-чески достоверна, что подтверждают показатели таблицы 2.

При сравнении показателей устойчивости золотистого стафилококка к исследуемым бактериофагам на плотной и жидкой питательной среде с помощью расчета отношения шан-сов различие установлено только по пиобактериофагу поливалентному (46,5 % и 24,3% соот-ветственно).

Таблица 1 - Устойчивость бактерий S. aureus к бактериофагам при определении на МПА

БактериофагКоличе-

ство куль-тур

Устойчи-вость

штаммов к фагам

(%)

95 % доверительный интервал

T критерий оценки статисти- критерий оценки статисти-ческой значимости различий

среднихНижняя граница

Верхняя граница 1 2 3 4

1.Стафилокок-ковый 159 27,7 20,60 34,80 - 3,06 0,16 1,41

2.Пиобактери-офаг поли-валентный

99 46,5 36,47 56,53 3,06 - 3,19 1,01

3.Интестибактериофаг 156 26,9 19,80 34,00 0,16 3,19 - 1,52

4.Пиокомби-нированный 55 38,2 25,10 51,30 1,41 1,01 1,52 -

При использовании МПА для определения устойчивости к указанному фагу шансы литической способности оказались в 2,7 раза меньше, чем при использовании МПБ, а с учетом 95 % доверительного интервала величина этого показателя колебалась в пределах от 1,5 до 4,9 раз. Так как нижний доверительный интервал оказался более единицы, имеющееся различие шансов статистически значимо.

По результатам наших исследований не представляется возможным утверждать, что литическая активность монофага стафилококкового к штаммам S.aureus выше, чем у ассоци-S.aureus выше, чем у ассоци-.aureus выше, чем у ассоци-aureus выше, чем у ассоци- выше, чем у ассоци-


20

ированных фагов. Показатели свидетельствуют о значимых различиях при определении чув-ствительности бактерий к пиобактериофагу поливалентному на плотной и жидкой питатель-ных средах. Аналогичные результаты получены и при сравнении литической активности моно и ассоциированных бактериофагов к штаммам K. pneumoniae.

Исследование литической активности фагов по отношению к штаммам K. pneumoniae при использовании МПА показало наиболее высокую устойчивость их к пиополивалентному фагу. Критерий оценки статистической значимости различий средних свидетельствует о до-стоверности различий, таблица 3.

Таблица 3 - Устойчивость бактерий K.��eu�o��ae к бактериофагам при опреде-K.��eu�o��ae к бактериофагам при опреде-.��eu�o��ae к бактериофагам при опреде-��eu�o��ae к бактериофагам при опреде- к бактериофагам при опреде-лении на МПА

БактериофагКоли-чество культур

Устойчивость штаммов к фа-

гам(%)


T критерий оценки ста- критерий оценки ста-тистической значимости

различий среднихНижняя граница

Верхняя граница 1 2 3

1. Клебсиелла пневмония 62 67,7 55,82 79,58 - 1,06 2,01

2. Клебсиелла поливалентный 59 76,3 65,23 87,37 1,06 - 0,97

3 . П и о б а к т е -. П и о б а к т е -рио-фаг полива-лентный

49 83,7 73,15 94,25 2,01 0,97 -

Устойчивость к фагам бактерий K.pneumoniae в жидкой питательной среде оказалась наиболее высокой у бактериофага клебсиелл пневмонии, таблица 4.

Расчет отношения шансов частоты обнаружения устойчивых штаммов K.pneumoniae к бактериофагу клебсиелл пневмонии на плотной питательной среде с учетом 95 % доверитель-ного интервала был от 3,0 до 14,5 раз выше, чем в жидкой питательной среде. Вместе с тем, указанные показатели устойчивости этих штаммов к бактериофагу клебсиелл поливалентному и пиополивалентному составил от 7,0 до 45,0 и от 7,7 до 60,0 соответственно.

Таблица 2 - Устойчивость бактерий S. aureus к бактериофагам при определении на МПБ

БактериофагКоличе-

ство куль-тур

Устой-чивость

штаммов к фагам

(%)


T критерий оценки статисти- критерий оценки статисти-ческой значимости различий

среднихНижняя граница

Верхняя граница 1 2 3 4

1.Стафилокок-ковый 165 37,6 30,66 45,14 - 2,35 1,76 0,37

2.Пиобактери-офаг полива-лентный

103 24,3 15,85 32,75 2,35 - 0,76 2,13

3.Интестибак-териофаг 165 28,5 21,47 35,53 1,76 0,76 - 1,65

4.Пиокомби-нированный 62 40,3 27,84 52,76 0,37 2,13 1,65 -


21

Таблица 4 - Устойчивость бактерий K.��eu�o��ae к бактериофагам при опреде-K.��eu�o��ae к бактериофагам при опреде-.��eu�o��ae к бактериофагам при опреде-��eu�o��ae к бактериофагам при опреде- к бактериофагам при опреде-лении на МПБ

БактериофагКоли-чество культур

Устойчивость штаммов к

фагам(%)


T критерий оценки ста- критерий оценки ста-тистической значимо-сти различий средних

Нижняя граница

Верхняя граница 1 2 3

1. Клебсиелл пневмонии 62 24,2 13,32 35,08 - 2,01 0,65

2. Клебсиелл по-ливалентный 59 15,3 5,93 24,67 2,01 - 0,54

3.Пиобактерио-фаг поливалент-ный

52 19,2 8,28 30,12 0,65 0,54 -

Заключение. Сравнительная характеристика литической активности монофага ста-филококкового и ассоциированных фагов (пиобактериофаг поливалентный, интестибактери-офаг и пиокомбинированный), к золотистому стафилококку показала, что статистически до-стоверные отличия отмечены только с пиобактериофагом поливалентным при исследовании на плотной питательной среде. При аналогичном исследовании в жидкой питательной среде результаты получаются противоположными. Штаммы клебсиелл пневмонии также были бо-лее устойчивы к пиобактериофагу поливалентному при определении на плотной питательной среде и более чувствительны при исследовании в жидкой питательной среде, хотя различия статистически не достоверные. На наш взгляд, этот факт свидетельствует о несовершенстве существующих методик определения чувствительности бактерий к фагам.

Указанные методы определения устойчивости к фагам, применяемые в настоящее вре-мя бактериологическими лабораториями в практическом здравоохранении не позволяют объ-ективно оценить литические свойства бактериофагов, так как результаты оцениваются очень субъективно - в «крестах». Кроме того, широкое применение фаготерапии в лечении и про-филактике бактериальных инфекций требует определения чувствительности к определенным бактериофагам конкретных производителей. Это выдвигает приоритетную задачу разработки методики, позволяющей количественно определять и оценивать чувствительность бактерий к бактериофагам.

Библиографический список1. Майская Л. М., Дарбеева О. С., Парфенюк Р. Л. и др. Методика определения фаго-

чувствительности штаммов, выделенных от больных, к препаратам бактериофагов. //Научно-практический журнал «БИО препараты». – 2003. - № 2. – С. 22-23.

2. Лазарева Е. Б. бактериофаги для лечения и профилактики инфекционных заболева-ний. //Антибиотики и химиотерапия . – 2003. – 48. - № 1. –С.36-40.

3. Лазарева Е. Б., Спиридонова Т. Г., Киселевская-Бабина И. В. И др. Эффективность бактериофагов при лечении внутрибольничных инфекций у больных ожогами. //Стерилизация и госпитальные инфекции. – 2007. - № 2. – С. 48-50.

4. Дроздова О. М., Брусина Е. Б. Применение бактериофагов в эпидемиологичкой практике: взгляд через столетие. //Эпидемиология и инфекционные болезни. – 2010. - № 5. – С. 20 – 24.

5. Меньшиков Д. Д., Янискер Г. Я., Савельева Г. Ф. и др. Чувствительность возбудите-лей гнойно-воспалительных заболеваний к лечебным бактериофагам. //Антибиотики. – 1980.


22

- № 5. – С. 356-359.6. Веселов А. Я., Карманова С. Ю. Литическая активность и специфичность коммер-

ческих бактериофагов. //Клиническая лабораторная диагностика. -1992. - № 9. – С.55-57.7. Зуева В. С., Дмитриенко О. А., Клицунова Н. В. Роль профагов в формировании

антибиотикоустойчивых популяций стафилококков в процессе трансформации, трансдукции и коньюгации. //Антибиотики и химиотерапия. – 1996. – 41. - № 10. – С.35-42.

EVALUATION OF LYTIC ACTIVITY OF SOME BACTERIOPHAGES

Kataevа L. V., Vakarina A. A., Nizhegorodtseva N. F.

Key words: Ba�ter�ophages, sens�t�v�ty, stab��ty, stra�ns of ba�ter�a, the metho� �efin�t�on.Sens�t�v�ty / res�stan�e of some opportun�st�� ba�ter�a to ba�ter�ophages were �nvest�gate�

by var�ous metho�s (for so�� an� ��qu�� me��um). It was foun� that ba�ter�a� stra�ns sens�t�v�ty of to severa� ba�ter�ophages are ��fferent, so you must ass�gn phage therapy on�y after stu�y fago��t�� a�t�v�ty. Furthermore, the �urrent metho� of �eterm�n�ng an� assess�ng the phage a�t�v�ty �s subje�t�ve.

УДК 579.843:578.1:616-092:612.015.2

БАКТЕРИОФАГИ ПАТОГЕННЫХ ДЛЯ ЧЕЛОВЕКА ВИБРИОНОВ

Кудрякова Т.А., доктор медицинских наук, Тел.8(863) 240-27-03, e-mail: [email protected]Македонова Л.Д., кандидат медицинских наук, Гаевская Н.Е., Качкина Г.В., ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт» Роспотребнадзора

Ключевые слова: бактериофаги V�br�o �ho�erae O1, O139, не О1/не О139 серогрупп, V.a�bens�s, V.parahaemo�yt��us, V.a�g�no�yt��us, V. m�m��us, V.mets�hn�kov��, биологи�еская харак-.a�bens�s, V.parahaemo�yt��us, V.a�g�no�yt��us, V. m�m��us, V.mets�hn�kov��, биологи�еская харак-a�bens�s, V.parahaemo�yt��us, V.a�g�no�yt��us, V. m�m��us, V.mets�hn�kov��, биологи�еская харак-, V.parahaemo�yt��us, V.a�g�no�yt��us, V. m�m��us, V.mets�hn�kov��, биологи�еская харак-V.parahaemo�yt��us, V.a�g�no�yt��us, V. m�m��us, V.mets�hn�kov��, биологи�еская харак-.parahaemo�yt��us, V.a�g�no�yt��us, V. m�m��us, V.mets�hn�kov��, биологи�еская харак-parahaemo�yt��us, V.a�g�no�yt��us, V. m�m��us, V.mets�hn�kov��, биологи�еская харак-, V.a�g�no�yt��us, V. m�m��us, V.mets�hn�kov��, биологи�еская харак-V.a�g�no�yt��us, V. m�m��us, V.mets�hn�kov��, биологи�еская харак-.a�g�no�yt��us, V. m�m��us, V.mets�hn�kov��, биологи�еская харак-a�g�no�yt��us, V. m�m��us, V.mets�hn�kov��, биологи�еская харак-, V. m�m��us, V.mets�hn�kov��, биологи�еская харак-V. m�m��us, V.mets�hn�kov��, биологи�еская харак-. m�m��us, V.mets�hn�kov��, биологи�еская харак-m�m��us, V.mets�hn�kov��, биологи�еская харак-, V.mets�hn�kov��, биологи�еская харак-V.mets�hn�kov��, биологи�еская харак-.mets�hn�kov��, биологи�еская харак-mets�hn�kov��, биологи�еская харак-, биологи�еская харак-теристика, применение.

Работа посвящена изу�ению свойств новых и имеющихся в коллекции фагов пато-генных вибрионов. �оказана принадлежность бактериофагов V�br�o �ho�erae �1 к пяти мор-V�br�o �ho�erae �1 к пяти мор- �ho�erae �1 к пяти мор-�ho�erae �1 к пяти мор- �1 к пяти мор-�1 к пяти мор-1 к пяти мор-фологи�еским типам, V.a�bens�s и V.parahaemo�yt��us – к �етырем, V. m�m��us – к одному и V.mets�hn�kov�� – к одному. Охарактеризованы серологи�еские свойства и установлены раз-.mets�hn�kov�� – к одному. Охарактеризованы серологи�еские свойства и установлены раз-mets�hn�kov�� – к одному. Охарактеризованы серологи�еские свойства и установлены раз- – к одному. Охарактеризованы серологи�еские свойства и установлены раз-ли�ия и сходства в антигенном строении. Специфи�ность лити�еской активности бактери-офагов использована в лабораторной диагностике патогенных вибрионов.

Введение. Большой фактический материал, накопленный в последние три десяти-летия, свидетельствует о широком распространении патогенных вибрионов, для большой группы которых бактериофаги неизвестны. Показано, что на территории России и некоторых зарубежных государств возможно обнаружение бактериофагов холерных и парагемолитиче-ских вибрионов, V�br�o �uv�a��s, V�br�o vu�n�fi�us [1, 2, 3, 4]. В центре патогенных вибрионов Ростовского-на-Дону противочумного института были идентифицированы представители де-сяти видов патогенных вибрионов, коллекция культур которых нуждается в дополнении соот-ветствующими бактериофагами и разработке методов фагодиагностики. Детальное изучение взаимоотношения бактериофагов с клеткой хозяина имеет не только теоретическое, но и важ-


23

ное практическое значение в диагностике заболеваний, вызываемых патогенными для челове-ка вибрионами.

Целью работы явилось сравнительное изучение свойств свежевыделенных и име-ющихся в коллекции рас бактериофагов V�br�o �ho�erae O1, O139, не О1/не О139 серогрупп, V.a�bens�s, V.parahaemo�yt��us, V.a�g�no�yt��us, V. m�m��us, V.mets�hn�kov�� для их дифференциа-ции и применения.

Материалы и методы исследований. В работе использовали 301 фаг патогенных для человека вибрионов, выделенных из лизогенных штаммов и объектов внешней среды (та-блица 1). Титры бактериофагов составляли 108-109 БОЕ/мл. В качестве индикаторных штам-мов использовали V. �ho�erae �ho�erae 145, V. �ho�erae e�tor 75, КМ-199, V. �ho�erae О139-КМ 152, V. �ho�erae не О1 – 16 штаммов, V.parahaemo�yt��us КМ-97, КМ- 184, V.a�bens�s-КМ 41, V.mets�hn�kov�� КМ 185, V. �ho�erae О37 серовара 1322-69.

При выращивании вибрионов применяли 0,7% и 1,5% агар и бульон Мартена (рН 7,6-7,8), для галофильных вибрионов V.parahaemo�yt��us, V.a�g�no�yt��us использовали те же сре-ды с 3% NaCl. Результаты учитывали через 18-20 часов инкубации при 370С. биологические свойства фагов изучали классическими методами [5]. Строение корпускул исследовали в элек-тронном микроскопе Gem-100B [6, 7]. Антифаговые сыворотки получали путем внутривенной иммунизации кроликов по методу Марьиной Ю.Н. [8]. Специфичность фагов испытывали на 135 штаммах микроорганизмов родственных видов, родов и семейств (V�br�ona�eae, Pseu�o-, Pseu�o-Pseu�o-mona�a�eae, Enteroba�ter�a�eae).

В работе применяли препараты диагностических холерных бактериофагов производ-ства ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб»: классический, эльтор, ДДФ, ctx+ и ctx-.

Результаты исследований и их обсуждение. Материалы исследования показали, что бактериофаги патогенных вибрионов представляют собой неоднородную по свойствам группу. В таблице 1 суммированы основные морфологические типы [6] изученных 301 ДНК-содержащих бактериофагов патогенных вибрионов. Впервые охарактеризованы новые фаги V.mets�hn�kov�� и V. m�m��us, выделенные нами из лизогенных штаммов (патент № 2375437). Установлено, что бактериофаги объединены у V. �ho�erae O1 и не О1/не О139 – пятью морфо-группами, у V. �ho�erae О139 – двумя, V.a�bens�s и V.parahaemo�yt��us – четырьмя, у V. m�m��us – 1, V.mets�hn�kov�� – 1 по классификации А.С.Тихоненко [6]. У бактериофагов отмечены три типа негативных колоний: 1 - мелкие с ободком по периферии; 2 - мутные; 3 - прозрачные, от 0,5 до 2мм в диаметре.

При анализе антигенных свойств бактериофагов выявлено большое разнообразие се-рологических типов: 12 – у холерных фагов, 18 – у неагглютинирующихся О-сывороткой и О-139 сывороткой вибрионов, 11 – у парагемолитических и 4 – у алгинолитических вибрио-нов. Наряду с высокой специфичностью антифаговых сывороток представленных рас фагов, установлено сходство антигенного строения у фагов V. �ho�erae O1 и О139 серогрупп (фаги II и XII серотипов), а также фагов V. m�m��us с холерными (XII серотип), дающими перекрестные реакции нейтрализации.

Для дифференциации бактериофагов I морфотипа от остальных (III –V) использова-I морфотипа от остальных (III –V) использова- морфотипа от остальных (III –V) использова-III –V) использова- –V) использова-V) использова-) использова-ли действие инактивирующих агентов – хлороформа и прогревание при температуре 650С. Установлена чувствительность к химическому агенту филаментозных фагов и устойчивость к прогреванию. Специфичность литического действия фагов патогенных вибрионов, проверен-ная на 135 штаммах различных видов бактерий, соответствовала таксономическим группам, и их активность не распространялась на представителей семейств V�br�ona�eae, Pseu�omona�a-, Pseu�omona�a-Pseu�omona�a-�eae, Enteroba�ter�a�eae. Для идентификации фагов V. m�m��us от серологически родственных холерных, присутствие которых возможно в пробах речной воды при мониторинге объектов


24

окружающей среды на наличие вибриофлоры, нами предложен фагочувствительный к ним штамм V. �ho�erae О37 серогруппы, устойчивый к холерным фагам [9].

Данные ретроспективного анализа более 700 штаммов вибрионов, выделенных в последние 20 лет в разных эпидемиологических ситуациях, свидетельствовали о различии лизогенных систем вибрионов, циркулировавших на контролируемых территориях в пери-од седьмой пандемии холеры. Нами создана система из восьми тест-культур, позволяющая идентифицировать обнаруживаемые умеренные фаги, из которых V. �ho�erae КМ 199, КМ 152; V.parahaemo�yt��us КМ 184, КМ 97; V.mets�hn�kov�� КМ 185 – депонированы в ГКПБ «Микроб». Холерные вибрионы О139 серогруппы проявили лизогенные свойства на индикаторных штам-мах холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп. Эти биологические особенности были исполь-зованы для внутривидовой дифференциации вибрионов «Бенгал» [10].

Бактериофаги применяются в диагностике некоторых видов патогенных вибрионов: в идентификации холерных вибрионов О1 и не О1/не О139 серогрупп используется фаг ДДФ, в индикации биовара – классические и эльтор фаги, проводится определение фаготипа, диффе-ренциация штаммов на серовары и внутривидовая дифференциация с помощью метода пря-мого фаготипирования.

По результатам фаготипирования холерных вибрионов, изолированных из объектов окружающей среды на территории Российской Федерации, была установлена принадлежность штаммов к различным фаготипам (ф/т) в период с 2007 по 2011 годы: к трем – в 2007 году (13, 14, 19 ф/т), четырем – в 2010 (13, 14, 16, 19 ф/т) и в 2011 году – (5, 13, 15, 17 ф/т). Токсигенные холерные штаммы при использовании фагов ctx+ и ctx- в комплексе с гемолитической активно-стью по Грейгу были идентифицированы в 94%. Фаготипирование более 200 штаммов параге-молитических вибрионов с помощью авторского набора бактериофагов позволило определить принадлежность штаммов к одиннадцати фаготипам.

Заключение. Анализ полученных данных о свойствах большой группы бактериофа-гов различных видов патогенных вибрионов позволяет установить не только их общность как представителей вирусов бактерий, но и различия признаков. По данным детекции и иденти-фикации бактериофагов V. �ho�erae, V.parahaemo�yt��us, V.a�bens�s, V. m�m��us, V.mets�hn�kov�� определены серологические свойства и морфология фагов. При сравнительном изучении

Таблица 1. Особенности структурной организации бактериофагов патогенных для человека вибрионов

Вид микробаЧисло

изученных фагов

Семейство фагов

Myoviridae Siphoviridae PodoviridaeIno-viri-dae

А1 А2 А3 В1 В2 В3 С1 С2 С3 F1V.�ho�erae �1 207 141 - - 1 - - 21 - - 44V.�ho�erae �139 8 7 - - - - - - - - 1V.�ho�erae не О1/не О139 28 15 - - 2 - 5 3 2 - 1

V.a�bens�s 17 - - - 2 - - 2 - - 13V.parahaemo�yt��us 32 7 - - 9 2 - 8 - - 6V.a�g�no�yt��us 4 1 - - 1 - - 1 - - 1V.mets�hn�kov�� 3 - - - 3 - - - - - -V. m�m��us 2 - - - - - - - - - 2

Всего 301 171 - - 18 2 5 35 2 - 68


25

бактериофагов обнаружены особенности по чувствительности к химическому агенту (хлоро-форму) и устойчивости к повышенной температуре. Специфичность литического действия бактериофагов использована для тестирования на соответствующих видах микроорганизмов. Создана База данных «Коллекция бактериофагов и тест-штаммов патогенных для человека вибрионов» (Свидетельство о гос.регистрации базы данных № 2010620549 от 24.09.2010 г.), расширяющая возможность использования в научно-практических исследованиях по пробле-ме «Холера и патогенные вибрионы». По мере накопления новых данных о фагах патогенных вибрионов, выяснение особенностей и специфичности лизогенных тест-систем может быть полезным в решении вопросов об эволюционных взаимоотношениях в пределах вида и между видами.

Библиографический список1. Кудрякова Т.А. Лизогения холерных и парагемолитических вибрионов и её практи-

ческое значение. //Автореф.дисс….д-ра мед.наук.-Ростов – на – Дону, 1996.-42с.2. Chen K, Lin Y, Chen G. Studies on diagnostic bacteriophage of Vibrio fluvialis. // Chung-

Hua Yu Fang i Hsuch Tsa chih (chinex Yornal of Preventive Medicine), 1995, 29 (3): 138-140.3. Pelon W, Siebeling K.I., Simonson I, Liftig R.B. Isolation of bacteriophage infection for

Vibrio vulnificus. // Current Microbiology, 1995, 30 (6): 331-336.4. Остроумова Н.М., Агапова З.М., Мороз В.П. и др. Лизогения у НАГ - вибрионов

О-41 серотипа. //Генетика и биохимия особо опасных инфекций. Саратов, 1980. с.56-61.5. Адамс М. Бактериофаги: Пер.с англ.-М., 1961,-527с.6. Тихоненко А.С. Ультраструктура вирусов бактерий. - М., 1968, 89с.7. Ackerman H.W. Bacteriophage taxonomy in 1987. // Microbiol. Sci.-1987.-Vol.4, № 7.-

Р.214-218.8. Марьина Ю.Н. Получение антифаговой сыворотки и изучение антигенной структу-

ры фага.//Тр.Рост.н/Д противочум. ин-та.-1941.-Т.2.-с.3-7.9. Кудрякова Т.А., Македонова Л.Д., Качкина Г.В., Авдеева Е.П., Саямов С.Р. Патент

РФ на изобретение № 2375437 – Способ выделения и дифференциации фага Vibrio mimicus. //Бюллетень № 34 от 10.12.2009г.

10. Кудрякова Т.А., Гаевская Н.Е., Македонова Л.Д., Качкина Г.В. Патент РФ на изо-бретение № 2268942 – Способ внутривидовой дифференциации Vibrio cholerae �139. //Бюлле-Vibrio cholerae �139. //Бюлле- cholerae �139. //Бюлле-cholerae �139. //Бюлле- �139. //Бюлле-�139. //Бюлле-139. //Бюлле-тень № 03 от 27.01.2006г.

BACTERIOPHAGES OF PATHOGENIC VIBRIOES FOR THE PERSON

Kudryakova T.A., Makedonskaya L.D, Gaevskaya N.E. Kachkina G.V.

Key words: ba�ter�ophages V�br�o �ho�erae �1, �139, ne�ther �1/nor �139 serogroups, V.a�bens�s, V.parahaemo�yt��us, V.a�g�no�yt��us, V.m�m��us, V.mets�hn�kov��, b�o�og��a� propert�es, app��at�on.

Th�s art��e �s �evote� to the �earn�ng of propert�es of phages of pathogen�� v�br�oes new an� ava��ab�e �n a �o��e�t�on.The be�ong�ng of ba�ter�ophages of V�br�o �ho�erae �1 to five morpho�og�-�a� types �s state�, V.a�bens�s и V.parahaemo�yt��us – to four, V.m�m��us – to one an� V.mets�hn�kov�� –to one. The sero�og��a� properfies are �hara�ter�ze� an� ��st�n�t�ons an� s�m��ar�t�es �n an ant�-gene stru�ture are state�. Spe��fi�at�on of �yt�� a�t�v�ty of ba�ter�ophages �s use� �n �aboratory ��agnost��s of pathogen�� v�br�oes.


26

УДК 619:616.98:579.842

БАКТЕРИОФАГИ ПРИ САЛЬМОНЕЛЛЕЗЕ КУР

Ленев С.В., кандидат биологических наук, ФГБУ Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (ФГБУ «ВГНКИ»), г. Москва, Тел. (8 495) 982 50 83 , [email protected]

Ключевые слова: сальмонеллез, бактериофаги, антибиотики, куры, профилактика, ле�ение

�риведены результаты изу�ения биологи�еских свойств бактериофагов S. Enter�t��s, S. Typh�mur�um и S. Ga��narum, а также сравнения лити�еского действия фагов и антибио-тиков на сальмонеллы.

Введение. В России, как и во многих странах мира, среди пищевых зоонозов с уста-новленным бактериальным агентом, сальмонеллез имеет наибольшую эпидемиологическую значимость. Показатель заболеваемости сальмонеллезом в РФ составил в 2011году 35,89 на сто тысяч населения, его доля составляла 17,9% от всех этиологически расшифрованных ки-шечных инфекций (1).

Ситуация по сальмонеллезу в настоящее время не может считаться благополучной, что делает необходимым применение в практике ветеринарии и здравоохранения эффектив-ных мер борьбы с заболеванием.

Установлено, что интенсивность циркуляции сальмонелл в природе во многом связана с интенсификацией процессов выращивания и переработки птицы. При этом, продукция пти-цеводства рассматривается как главный путь передачи возбудителя человеку.

Проблема поиска эффективной альтернативы антибиотикам, а также ограничения по химической обработке птицы (использование хлорированной воды при убое) возродила инте-рес к использованию бактериофагов в качестве средства профилактики зоонозных заболева-ний, в том числе и сальмонеллеза птиц (2).

Концепция, по обеспечению безопасной продукции животного происхождения, в том числе и птицеводства, рекомендованная МЭБ и ФАО ВОЗ, направлена на предотвращения рас-пространения сальмонелл вдоль всей пищевой цепи (по принципу - «от фермы до стола»).

В этой связи препараты бактериофагов обладают уникальными возможностями, так как могут быть эффективно использованы на разных стадиях пищевой цепи. Бактериофаги для контроля пищевых патогенов предлагается использовать в первичной звене для санации возбу-дителя при выращивании птицы, обработке тушек и оборудования при убое, а также обработке продукции готовой для употребления (3).

Основными сероварами сальмонелл инфицирующими кур в Российской Федерации являются: S. Enteritidis, S. Gallinarum и S. Typhimurium, составляющие вместе около 95% саль-монелл циркулирующих в птицеводческих хозяйствах. Этиологическая структура сальмонел-леза птиц за последние 15 лет существенно не изменилась. В этот период возросла этиологи-ческая значимость серовара S. enteritidis и уменьшилась серовара S. Gallinarum.

В данной работе приведены результаты изучения биологических свойств бактерио-фагов S. Enteritidis, S. Typhimurium и S. Gallinarum, а также сравнения литического действия фагов и антибиотиков на сальмонеллы.

Материалы и методы исследований. Выделение изолятов фагов проводили из сточ-ных вод птицефабрик, неблагополучных по сальмонеллезу кур. Для повышения вероятности


27

обнаружения фагов использовали метод обогащения, описанный М. Адамсом (4). Чистые ли-нии фагов получали последовательным клонированием морфологически однотипных негатив-ных колоний. Сравнительную оценку морфологии негативных колоний различных фагов про-водили, используя одну партию питательной среды и одинаковые условия культивирования.

Электронограммы вирионов бактериофагов выполняли на электронном микроскопе JEM-100-CX, при ускоряющем напряжении 80 киловольт, с использованием метода негатив-ного контрастирования фосфорно-вольфрамовой кислотой по А.С. Тихоненко (5). В качестве модельного тест объекта использовали бактериофаг Т2.

Активность бактериофагов определяли общепринятыми способами – по количеству жизнеспособных фаговых частиц методом Грациа, и по литической активности фагов методом Аппельмана.

Чувствительность сальмонелл к 8 антибиотикам определяли диско-диффузионным методом, в соответствии с рекомендациями Института клинических и лабораторных стандар-тов (CLSI), США.

Для изучения антибиотикорезистентности использовали 308 штаммов сальмонелл. 200 из них, представляли собой штаммы, собранные в коллекции микроорганизмов ВГНКИ в период 1948 по 2009 годы, а 108 - были изолятами сальмонелл, выделенными из пищевых про-дуктов, кормов и биоматериалов от животных в различных регионах РФ в 2010 - 2012 годах.

Штаммы сальмонелл, относящиеся к основным сероварам сальмонелл инфицирую-щих кур - S. Enteritidis, S. Typhimurium и S. Gallinarum, были испытаны на чувствительность к бактериофагам.

Для оценки эффективности лечебного и профилактического эффекта от применения фагов при сальмонеллезе на лабораторных животных использовали белых беспородных мы-шей массой от 8-10г до 14-16 грамм, а также цыплят и кур различного возраста кроссов «Смена - 4», «Хайсекс коричневый» и «Иза-Браун». Профилактические свойства экспериментальных препаратов бактериофагов изучали, вводя перорально белым мышам по 106 и цыплятам по 108 фаговых частиц, с последующим заражением через 2 часа опытных и контрольных животных 5LD50 вирулентного штамма сальмонелл. Лечебные свойства фагов проверяли, вводя их ана-логично, и в тех же дозах, через трое суток после инфицирования вирулентными штаммами сальмонелл.

Результаты исследований и их обсуждение. Из проб сточных вод птицеводческих хозяйств выделено 27 изолятов бактериофагов S. Enteritidis, 14 - S. Typhimurium и 10 фагов S.Gallinarum. Состав популяций выделенных фагов был гетерогенным и был представлен не-сколькими типами негативных колоний. После их клонирования и проведения пяти последова-тельных пассажей на штаммах бактерий -хозяинах, из выделенных фагов отобраны наиболее активные. В их фаголизатах в течение 3-5 часов культивирования в стационарных условиях на-капливалось от 8,4х109 до 2,0х1011 жизнеспособных фаговых частиц. Среди этих штаммов фа-гов в свою очередь отобраны фаги, обладающие наименьшим периодом латентным периодом развития, высокой адсорбционной способностью и максимальной урожайностью. Установле-но, что диапазон специфичности выделенных фагов ограничен пределами рода Salmonella.

Электронно-микроскопические исследования вирионов селекционированных фагов показали, что все они обладают бинальным типом симметрии, состоят из равносторонней го-ловки в виде изометрического многогранника в форме икосаэдра с диаметром от 50 до 70 нм, длинного несокращающегося отростка с поперечной исчерченностью длиной 105 -150 нм, имеют базальную пластинку и короткие фибриллы (рис.1). Фаги данного типа входят в семей-ство Siphoviridae, относятся к морфотипу В1 по классификации H.W. Ackermann, M.S. Dubow (6).


28

Рис. 1 Морфология вирионов бактериофага F-6 S.e�ter�t�d�s

Таблица 1 - Сравнение чувствительности коллекционных штаммов к антибио-тикам и изолятов сальмонелл поступивших в лабораторию в 2010-2012 гг.

устойчивые промежуточно устой-чивые чувствительные

коллекция изоляты коллекция изоляты коллекция изолятыАмпициллин 2,8% 5,6% 6,2% 0 90,9% 94,4%Цефтазидим 1,4% 1,8% 12,2% 7,41% 86,4% 90,1%Цефтриаксон 0,9% 0 9,9% 8,3% 89,1% 91,7%Доксициклин 11,9% 21,3% 22,2% 23,2% 65,8% 51,6%

Ципрофлоксацин 0 0 2,6% 10,2% 97,4% 89,8%Гентамицин 0,8% 0,9% 0 1,9% 99,1% 97,2%

Норфлоксацин 0 0,9% 0,5% 2,8% 99,5% 96,3%Стрептомицин 3,7% 6,5% 10,7% 9,3% 85,6% 84,3%

Как следует из представленных данных, изученные штаммы сальмонелл в основном были чувствительны ко всем использованным в работе антибиотикам, за исключением докси-циклина. Следует отметить, что среди изолятов, выделенных в 2010-2012гг., в 2 раза возросла частота обнаружения сальмонелл, устойчивых к ампициллину и доксициллину, в 1,8 раза - к стрептомицину (рис.2).

Рис 2. Штаммы и изоляты сальмонелл, устойчивые к антибиотикам


29

Также у сальмонелл, выделенных в этот период, значительно возросло количество изолятов имеющих промежуточную устойчивость к ципрофлоксацину (в 3,9 раза) и норфлок-сацину – в 5,6 раза (рис.3).

Рис. 3. Штаммы и изоляты сальмонелл промежуточно-устойчивые к антибио-тикам

Таким образом, проведенный ретроспективный анализ чувствительности к антибио-тикам штаммов сальмонелл, собранных в коллекции микроорганизмов ВГНКИ в период с 1948 по 2009 годы, а также изолятов сальмонелл поступивших в институт в 2010-2012 годах, свидетельствует о возрастающей тенденции распространения штаммов возбудителей сальмо-неллеза антибиотирезистентных к тетрациклинам, аминогликозидам и фторхинолонам.

При испытании сальмонелл на чувствительность к селекционированным бактериофа-гам, установлено, что фаги S. Enteritidis способны лизировать 75 из 78 музейных и 101 из 104 штаммов гомологичного серовара. Фаги S. Typhimurium – 35 из 37 музейных и 23 из 24 изоля-тов сальмонелл этого серовара. Среди изученных штаммов сальмонелл серовара S.Gallinarum к фагам были чувствительны 51 из 53 музейных штаммов и 42 из 42 изолятов. Фагорезистенные штаммы сальмонелл имели «R» и « S-�» форму колоний и, по всей видимости, представляли собой мутанты адсорбционного типа. Наличие устойчивых к фагам штаммов сальмонелл не было связано с давностью и источником их выделения. В целом, изученные музейные штаммы и «полевые» изоляты сальмонелл обладали очень высокой чувствительностью к селекциони-рованным бактериофагам.

При оценке профилактического и лечебного эффекта бактериофагов введенных лабо-раторным животным, установлено, что бактериофаги предохраняли от заболевания и гибели 90-100% белых мышей и 95-100% цыплят и оказывали лечебный эффект в 80-96% случаев, при гибели 80-100 животных в контрольной группе.

Заключение.Селекционированные штаммы бактериофагов S. Enteritidis, S. Gallinarum и S.Typhimurium используется в качестве производственных при изготовления фагового ком-понента Сальмофага, единственного в настоящий момент, лечебно - профилактического пре-парата содержащего фаги, зарегистрованного в РФ. Сальмофаг состоит из двух компонентов – сухой живой вакцины из фагоустойчивого аттенуированного штамма сальмонелл и бактери-офага. Лечебный эффект препарата создается за счет высокоактивных бактериофагов широко-го спектра действия. Фагоустойчивый вакцинный штамм обеспечивают формирование имму-нитета к возбудителям после санации организма птиц бактериофагом.

Контролируемые опыты по применению промышленных серий препаратов сальмофа-


30

га содержащих бактериофаги S. Enteritidis, S. Gallinarum и S. Typhimurium в птицеводческих хозяйствах различных регионов страны, неблагополучных по сальмонеллезу, показали их вы-сокую лечебно-профилактическую эффективность.

Библиографический список1. Информационный бюллетень Референс – центра по мониторингу за сальмонеллеза-

ми №24, - М., 2012.- 66с.2. R. J. Atterbury, M. A. P. Van Bergen, F. �rtiz, M. A. Lovell, J. A. Harris et al., Bacteriophage

Therapy To Reduce Sa�mone��a Colonization of Broiler Chickens // Appl Environ Microbiol. 2007 July; 73(14), 4543–4549.

3. S. Hagens, M. J. Loessner Bacteriophage for Biocontrol of Foodborne Pathogens: Calculations and Considerations// Current Pharmaceutical Biotechnology, 2010, 11, 58-68

4. Адамс М. Бактериофаги. – М.: Изд.ин. литературы,1961. – 527с.5. Тихоненко А.С. Ультраструктура вирусов бактерий. – М.: Наука, 1968. – 89с.6. Ackermann H.W., Dubow M.S. Viruses of prokaryotes. V.1. General properties of

bacteriophages. CRC Press, Boca Raton, FL., 1987. - p. 96.

BACTERIOPHAGES IN SALMONELLOSIS CHICKENS

Lenev S.V.

Key words: sa�mone��os�s, ba�ter�ophages, ant�b�ot��s, �h��kens, prevent�on, treatmentG�ven the resu�ts of the stu�y of b�o�og��a� propert�es of ba�ter�ophages S. Enter�t��s, S.

Typh�mur�um an� S. Ga��narum, as we�� as the �ompar�son of the ��t��a� a�t�ons of phages an� ant�b�ot��s for Sa�mone��a.

ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКИЕ ПРЕПАРАТЫ БАКТЕРИОФАГОВ: КРАТКИЙ ОБЗОР

Лыско К.А., Игнатьев Г.М., Отрашевская Е.В.ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России, г. Москва

Ключевые слова: антибактериальные препараты, антибиотики, антибиотикорези-стентность, бактериофаги, бактериальные инфекции, производство, фаготерапия.

В обзорной статье приведены основные �ерты, характеризующие современное со-стояние производства и применения ле�ебно-профилакти�еских препаратов бактериофа-гов в России и за рубежом. �редставлен пере�ень выпускаемых препаратов бактериофагов, о�ер�ена область применения, приведены конкретные примеры использования препаратов в клини�еской практике и в комплексе противоэпидеми�еских мероприятий. Также сформу-лированы основные преимущества препаратов бактериофагов в сравнении с препаратами антибиотиков.

В ноябре 2009 года в Москве в рамках круглого стола «Эра антибиотиков заканчивает-


31

ся: альтернативные возможности в антибактериальной терапии» представителем объединен-ной рабочей группы ECDC и EMEA был особо отмечен тот факт, что в период с 70-х по 90-е годы прошлого века не было открыто ни одного нового класса антибиотиков. Лишь в 2000-х годах появились препараты класса циклических липопептидов и оксазолидинонов. Например, линезолид был допущен в медицинскую практику в США в апреле 2000 года. Но мутанты, устойчивые к данному препарату, стали выявляться в клиниках меньше, чем через год [1]. Экономический ущерб, наносимый возникновением антибиотикорезистентных форм бакте-рий, исчисляется десятками и сотнями миллионов долларов [2]. В сложившейся ситуации до-стойную альтернативу антибиотикам в терапии множества заболеваний бактериального проис-хождения способны составить бактериофаги (фаги), которые уже имеют историю успешного применения в мировом масштабе.

Бактериофаги широко применялись для лечения различных заболеваний с 20-х годов ХХ века как в СССР, так и за рубежом: в США, Канаде, в странах Западной и Восточной Евро-пы, странах Ближнего Востока и Африки. Даже не смотря на начало «эры антибиотиков» в 50-60-ых годах производство нескольких фаговых препаратов для медицинского использования продолжилось в Западной Европе, США, Африке.

Сегодня промышленное производство лечебно-профилактических препаратов осу-ществляется в Российской Федерации и Грузии. В польском центре препараты бактериофагов нарабатываются в ограниченном количестве для экспериментальной терапии. В 2010 – 2011 го-дах начато производство бактериофагов на Украине. Компанией Intralytix Inc. в 2008 году была завершена фаза I клинических испытаний препарата бактериофагов, содержащего восемь фа-I клинических испытаний препарата бактериофагов, содержащего восемь фа- клинических испытаний препарата бактериофагов, содержащего восемь фа-гов, специфически лизирующих P. aerug�nosa, S. aureus и E. coli. Показана безопасность пре-парата при лечении венозных язв. В 2007 году специалисты Novolytics Limited начали работы по созданию интраназальных мази и капель для профилактики и лечения внутригоспитальных инфекций, вызываемых метициллин-резистентными S. aureus (MRSA). Проведение клиниче-MRSA). Проведение клиниче-). Проведение клиниче-ских исследований данных препаратов планировалось в 2009 году, но на сегодняшний день более подробная информация отсутствует. В 2008 году была завершена фаза II клинических исследований поливалентного препарата бактериофагов BioРhage-PA, показавшая его эффек-тивность и безопасность. Препарат предназначен для терапии хронических отитов, вызывае-мых антибиотикорезистентными штаммами P. aerug�nosa. В марте 2009 компания получила разрешение на проведение фазы III клинических исследований. [3-8].

В последнее время и в России набирают обороты исследования в области бактерио-фагов [9, 10]. Так, НПЦ «МикроМир» разработан лечебно-профилактический препарат бак-териофагов для профилактики и лечения гингвита и пародонтита «Фагодент». Информации о составе препарата в открытых источниках нами не обнаружено. Так же отсутствуют сведения о данном препарате в Государственном реестре лекарственных средств. В начале 2013 года ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора получено свидетельство о госу-дарственной регистрации специализированного пищевого продукта для диетического (профи-лактического) питания «Фудфаг». В гигиенической характеристике указано, что БАД обладает специфической литической активностью в отношении 5 видов бактерий. На конференции до-кладывалось, что разработанная БАД показана для профилактического применения декрети-рованному контингенту, занятому на пищевых производствах и предприятиях общественного питания.

Т.о., единственным производителем лечебно-профилактических препаратов бактери-офагов на территории России является ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России. На про-изводственных площадках в городах Уфа, Пермь и Нижний Новгород лечебно-профилактиче-ские препараты бактериофагов производятся с 40-х годов прошлого века по сей день.


32

Производство лекарственных средств осуществляется под контролем государствен-ных органов, что гарантирует качество, безопасность и эффективность препаратов бактери-офагов. Кроме того, коллекция производственных штаммов бактерий ежегодно обновляется, т.е. препараты бактериофагов регулярно адаптируются к актуальным циркулирующим бакте-риальным возбудителям.

В России и странах СНГ препараты бактериофагов применяют для профилактики и лечения широкого спектра заболеваний (таблица 1).

Таблица 1 - Лечебно-профилактические бактериофаги

Наименование пре-парата

Спектр антибактериаль-ной активности Область применения

Бактериофаг дизен-терийный полива-лентный

Sh�ge��a sonnae, �exner� 1,2,3,4,6 serotypes

Лечение больных дизентерией и профи-лактика данного заболевания. Санация реконвалесцентов.

Бактериофаг саль-монеллезный гр. ABCDE

Sa�mone��a Serogroups A,В,С,D,E. Лечение и профилактика сальмонеллезов.

Бактериофаг стафи-лококковый

Stapy��o�o��us aureus и ряд других видов коагулазоо-трицательных стафило-кокков

Лечение и профилактика гнойных инфек-ций кожи, слизистых, вызванных стафи-лококками, а также при дисбактериозах. Применяется для лечения циститов, холе-циститов, острых тонзиллитов, энтероко-литов и др.

Бактериофаг стреп-тококковый Strepto�o��us, Entero�o��us

Лечение и профилактика гнойно-воспа-лительных и энтеральных заболеваний, а также дисбактериозов. Обработка после-операционных и свежеинфицированных ран (в т.ч. с профилактической целью).

Бактериофаг протей-ный Proteus vu�gar�s, m�rab��s

Лечение и профилактика гнойных инфек-ций, вызванных протейными бактериями, а также при дисбактериозах. Применяет-ся для лечения абсцессов, гнойно-ослож-ненных ран, циститов и др.

Бактериофаг коли Энтеропатогенная E�h-E�h-er��h�a coli

Лечение и профилактика инфекций кожи и внутренних органов: гнойно-осложнен-ные раны, ожоги, абсцессы, плевриты. Применяется для лечения циститов, энте-роколитов, токсикоинфекций, а также для профилактики колиинфекций.

Бактериофаг синег-нойный Pseu�omonas aerug�nosa

Лечение заболеваний различных органов и гнойных инфекций кожи. Применяется для лечения абсцессов, хирургических инфекций, гнойно-осложненных ран, ци-ститов и др.


33

Бактериофаг клебси-елл пневмонии очи- пневмонии очи-пневмонии очи- очи-очи-щенный

K�ebs�e��a pneumon�ae

Лечение хирургических инфекций, забо-леваний урогенитальной сферы и желу-дочно-кишечного тракта, гнойно-воспа-лительных заболеваний уха, горла и носа, а также при сепсисе. Применяется также для селективной деконтаминации кишеч-ника.

Бактериофаг клебси-елл поливалентный очищенный

K�ebs�e��a rh�nos��eromat�s, pneumon�ae, ozaenae

Лечение озены, риносклеромы и гной-но-воспалительных заболеваний. Приме-няется для лечения отитов, воспалений пазух носа и для других гнойно-воспали-тельных заболеваний уха, горла и носа.

Бактериофаг коли-протейный

Энтеропатогенная E. coli, P. vu�gar�s, m�rab��s

Лечение и профилактика энтероколитов и лечение кольпитов колипротейной эти-ологии.

Пиобактериофаг по-ливалентный

P. aerug�nosa, P. m�rab��s, vu�gar�s, K. pneumon�ae, Staphy�o�o��us, Entero�o�-�us, энтеропатогенная E. coli

Лечение и профилактика различных форм гнойно-воспалительных и энте-ральных заболеваний. Применяется для лечения хирургических инфекций, ожо-гов, гнойных поражений кожи, циститов и пиелонефритов, гастроэнтероколитов, холециститов, дисбактериоза кишечника.Пиобактериофаг

комплексный (Сек-стафаг)

P.aerug�nosa, P. m�rab��s, vu�gar�s, K. pneumon�ae, Staphy�o�o��us, Entero�o�-, Entero�o�-Entero�o�-�us, энтеропатогенная E. coli, K. oxyto�a

Интести-бактериофаг

S. sonnae, �exner� 1,2,3,4,6, Sa�mone��a AB�DE, эн- AB�DE, эн-AB�DE, эн-, эн-теропатогенная E. coli, P.vu�gar�s, m�rab��s, S. au-.vu�gar�s, m�rab��s, S. au-vu�gar�s, m�rab��s, S. au-, m�rab��s, S. au-m�rab��s, S. au-, S. au-S. au-. au-au-reus, P. aerug�nosa, Entero-, P. aerug�nosa, Entero-P. aerug�nosa, Entero-. aerug�nosa, Entero-aerug�nosa, Entero-, Entero-Entero-�o��us.

Лечение острых и хронических заболева-ний: дизентерии, сальмонеллеза, диспеп-сии, колита, энтероколита.

Препараты бактериофагов используются в клинической практике наряду с антибио-тиками. Интересен тот факт, что в некоторых случаях фаговые препараты превосходят другие антибактериальные препараты по активности в отношении антибиотикорезистентных возбу-дителей. Бактериофаги не вызывают побочных токсических и аллергических реакций и не имеют противопоказаний. Кроме того, они применяются при лечении ряда заболеваний бере-менных женщин в сочетании с другими лечебными препаратами [1, 11 - 15].

Использование препаратов бактериофагов стимулирует активизацию факторов специ-фического и неспецифического иммунитета [16-18, 1]. Поэтому фаготерапия особенно эффек-тивна при лечении хронических воспалительных заболеваний на фоне иммунодепрессивных состояний. Бактериофаги не препятствуют реализации лечебного действия других препаратов (антибиотики, пробиотики, синбиотики) и не чувствительны к их воздействию [19, 17].

Бактерии родов K�ebs�e��а, E�her��h�a, Proteus, Pseu�omonas, Staphy�o�o��us,


34

Strepto�o��us относятся к разряду внутригоспитальных и являются причиной хирургических и кишечных инфекций, урогенитальной патологии, гнойно-септических и энтеральных забо-леваний. Летальность при этих инфекциях достигает 30-60%. Вместе с тем лечение данных заболеваний затруднено высокой частотой (50-95%) антибиотикорезистентности, проявлени-ем токсических и многочисленных аллергических реакций, а также осложнениями в виде яв-лений дисбактериоза [19-21]. В то же время многолетняя клиническая практика применения препаратов бактериофагов при данных инфекционных заболеваниях свидетельствует об их эффективности в 77 – 93% случаев [21-23].

В августе 2009 года корпорацией Nestlé Nutrition были инициированы клинические исследования по изучению безопасности и эффективности применения бактериофага E. coli в терапии кишечных инфекций детей в возрасте от 6 до 60 месяцев. [24, 25]. Вследствие без-вредности и ареактогенности препаратов бактериофагов возможно их применение в педиатри-ческой практике, в т.ч. и у новорожденных детей [22, 26].

Широкое распространение фагов в природе значительно упрощает (как по трудоемко-сти, так и по срокам и стоимости) процесс создания новых лекарственных препаратов к раз-личным патогенам. Т.о., фаговая терапия может рассматриваться как перспективное направле-ние современной медицины.

Библиографический список1. Катер Э., Сулаквелидзе А. Бактериофаги: биология и практическое применение –

М.: Научный мир, 2012. – 640 с.2. European Centre for Disease Prevention and Control [Electronic resource]-Mode acess:

http://www.ecdc.europa.eu/en/publications/Publications/ 0909_TER_The_Bacterial_Challenge_Time_to_React.pdf.

3. A. Sulakvelidze et al. Bacteriophage Therapy. // Antimicrobal Agents and Chemotherapy – 2001. – Vol. 45, №3. – P. 649 – 659.

4. A. Wright, C.H. Hawkins et al. A controlled clinical trial of a therapeutic bacteriophage preparation in chronic otitis due to antibiotic-resistant Pseudomonas aeruginosa; a preliminary report of efficacy. // Clinical �tolaryngology - 2009. – Vol. 34 Issue 4. - Р. 349 – 357.

5. A service of the U.S. National Institutes of Health [Electronic resource]. – Mode acess:http://www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00945087?term=bacteriophage+preparation&rank=1.

6. Intralytix Inc. [Electronic resource].–Mode acess: http://www.intralytix.com/Intral_Prod-ucts_ListShield.htm

7. Novolytics Limited [Electronic resource].–Mode acess: http://www.novolytics.co.uk/technology.html

8. U.S. Food and Drug Administration [Electronic resource]. – Mode acess: http://www.fda.gov/Food/FoodIngredientsPackaging/GenerallyRecognizedasSafeGRAS/GRASListings/ucm154675.htm

9. Зурабов А.Ю. Создание отечественной коллекции бактериофагов и принципы раз-работки лечебно-профилактических фаговых препаратов / Зурабов А.Ю. и др. // Биомедицина. – март 2012. - №1. - с. 134 – 138.

10. Алешкин А.В. Бактериофаги в качестве нового класса консервантов и биологиче-ски активных добавок к пище в профилактике инфекционных заболеваний / Алешкин А.В. и др. //Материалы IV Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням, Мо-IV Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням, Мо- Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням, Мо-сква, 26-28 марта 2012 г. – Москва. 2012. – с. 16.

11. Захарова Ю.А. Использование бактериофагов у беременных с пиелонефритом: ав-тореф. дис. … канд. мед. наук / Захарова Юлия Александровна. - Пермь, 2004. – 19 с.


35

12. Кисина В.И. и др. Фаготерапия воспалительных урогенитальных заболеваний у женщин // Вестник дерматологии и венерологии. – 1996. - № 5. – С. 45-48.

13. Падруль М.М., и др. Микробиологическая диагностика инфекций мочевых путей у женщин при беременности и использование препаратов бактериофагов при данной патологии. Методические рекомендации. Пермь, 2007. – с. 29.

14. Трушков А.Г. Фагопрофилактика как метод предупреждения инфекционно-воспа-лительных осложнений при абдоминальном родоразрешении: автореф. дис. … канд. мед. Наук / Трушков Андрей Геннадьевич. – Пермь, 2003. – 21 с.

15. Акимкин В.Г. и др. Клинико-эпидемиологические особенности нозокомиального сальмоннелеза у больных с хирургической патологией. – Магнитогорск: ООО «АС», 2008. – 172 с.

16. Биопрепараты и ведущие направления их лечебно-профилактического примене-ния: монография / Алсынбаев М.М. и др. – Уфа: РИО филиала «Иммунопрепарат» ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ, 2008. – 100 с.

17. Султанов Н.М. Антибактериальная активность и клиническая эффективность пре-парата пиобактериофага поливалентного очищенного при лечении хронического гнойного риносинусита: дис. … канд. мед. Наук / Султанов Назиф Мударисович; науч. рук. Н.Н. Воро-шилова, Н.А. Арефьева Н.А.; ГОУВПО «Башкирский государственный медицинский универ-ситет». - Уфа, 2007. – 113 с.

18. B. Weber-Dabrowska, M. Zimecki, M. Kruzel et al. Alternative therapies in antibiotic-resistant infection. // Advances in Medical Sciences – 2006. – Vol. 51. – P. 242 – 244.

19. Ворошилова Н.Н. Изучение клинической эффективности препаратов бактериофа-гов при лечении энтеральных и гнойно-воспалительных заболеваний. / Н.Н. Ворошилова и др. // Актуальные вопросы разработки и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов: материалы всероссийской конф. - Уфа. 2000. - с.87-94.

20. Карабелеш Е.Е., Ткаченко С.А., Панкратов С.М., Демедюк О.И. Применение бакте-риофагов, как концепция лечебного и профилактического направления в медицине // Актуаль-ные проблемы транспортной медицины. – 2008. - № 1 (11). – С. 135-139.

21. Парфенюк Р.Л. Микробиологические основы пероральной фаготерапии гнойно-воспалительных заболеваний: автореф. дис. … канд. биол. наук / Парфенюк Римма Леонтьев-на. - Москва, 2004. – 24 с.

22. Сенцова Т.Б., Сергеева Т.В., Яцык С.П. и др. Алгоритм диагностики и лечения ин-фекции мочевой системы у детей. Методические рекомендации (№ 41). Москва, 2003. – 21 с.

23. Перепанова Т.С., Дарбеева О.С., Майская Л.М. и др. Бактериофаготерапия уроло-гических инфекций. Методические рекомендации. Москва, 2007. – с. 9.

24. A service of the U.S. National Institutes of Health [Electronic resource] – Modeacess:http://www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00663091?term=bacteriophage&rank=2.

25. A service of the U.S. National Institutes of Health [Electronic resource]– Mode acess:http://www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00937274?term=nestle+phage&rank=1.

26. Воротынцева Н.В. и др. Фаготерапия и фагопрофилактика острых кишечных ин-фекций у детей. Методические рекомендации. Москва, 1991. – с. 11.

THERAPEUTIC AND PROPHYLACTIC DRUGS BACTERIOPHAGES: AN OVERVIEW

Lysko K.A., Ignatieff G.M., Otrashevskaya E.V.


36

Keywords: ant�b�ot��s, ant�b�ot��s, ant�b�ot�� res�stan�e, ba�ter�ophages, ba�ter�a� �nfe�t�ons, pro�u�t�on, ba�ter�ophage treatment.

In a rev�ew art��e presents the ma�n features that �hara�ter�ze the �urrent state of the pro�u�t�on an� use of hea�th �are pro�u�ts ba�ter�ophages �n Russ�a an� abroa�. Presents manufa�ture� �rugs ba�ter�ophages �e��neate� s�ope, spe��fi� examp�es of the use of �rugs �n ��n��a� pra�t��e an� �n the �omp�ex ep��em�o�og��a� measures. A�so state the ma�n a�vantages of ba�ter�ophages �rugs versus ant�b�ot�� rug.

УДК 619:579

ИНДИКАЦИЯ БАКТЕРИЙ РОДА KLEBIELLA,С ПОМОЩЬЮ СПЕЦИФИЧЕСКИХ БАКТЕРИОФАГОВ, В ОБЪЕКТАХ

ВЕТЕРИНАРНОГО НАДЗОРА

Ляшенко Е.А., кандидат биологических наук, доцент, [email protected]Васильев Д.А., доктор биологических наук, профессор, [email protected]Золотухин С.Н., доктор биологических наук, профессор,8(8422) 55-95-47, [email protected]ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина»

Ключевые слова: бактериофаги, индикация, клебсиелла, бактерии.

Работа основывается на изу�ении использования РНФ с индикаторными бактерио-фагами для обнаружения бактерий рода K�ebs�e��a.

В результате проведенных исследований, можно утверждать об успешном применении метода – РНФ с индикаторными бактериофагами К - 10 УГСХА и К - 81 УГСХА диагности�еская �увствительность которого позволяет обнаруживать бактерии рода K�ebs�e��a в минимальной концентрации 103 – 104м.к./мл за 18 – 22 �аса.

Введение. Этиологическая роль клебсиелл известна при маститах, септицемиях коров, свиней, лошадей, обезьян, инфекционной диареи молодняка животных [2, 6].Альтернативой су-ществующим методам лабораторной диагностики, которые либо не позволяют быстро идентифи-цировать бактерии, либо пока недоступны для большинства лабораторий, являются специфиче-ские бактериофаги [2, 3, 4, 5].

По литературным данным об использовании специфических бактериофагов для индика-ции бактерий сообщают ряд исследователей [2, 3, 4, 5]. Учитывая выраженную специфичность индикаторных бактериофагов и простоту количественного учета фага, был предложен метод опре-деления патогенных бактерий из исследуемого материала без выделения чистой культуры – реак-ция нарастания титра фага (РНФ) [1]. Сущность РНФ в том, что если в материале присутствует искомый возбудитель, то добавленный в исследуемый материал гомологичный фаг, вступив во взаимодействие с ним, размножится и дальнейшее увеличение свободного фага укажет на нали-чие возбудителя. Цель исследования: изучение возможности использования РНФ с индикатор-ными бактериофагами для обнаружения бактерий рода K�ebs�e��a.

Материалы и методы исследования. Исследованию подвергались пробы комбикорма, воды, фекалий, мяса. В качестве индикаторных бактериофагов использовали штаммы К - 10 и


37

К - 81 серии УГСХА. Индикацию бактерий рода K�ebs�e��a в объектах ветеринарного надзора проводили с помощью реакции нарастания титра фага по методике описанной В.Д. Тимаковым, Д.М. Гольдфарбом (1961), В.Я. Ганюшкиным (1988). Одновременно исследования проводили бакте-риологическим методом, в соответствии с правилами, представленными в «Методических указаниях по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вы-зываемой патогенными энтеробактериями». Полученный в исследованиях цифровой материал обрабатывали с использованием стандартных программ статистического анализа «STATISTIKA».

Результаты исследований и их обсуждения. Пробы водопроводной воды, комбикорма, мяса и фекалий в количестве 5 мл(г) вносили в колбы и контаминировали бактериями рода K�ebs�e��a в концентрации 105, 104, 103, 102, 101м.к./мл, заливали МПБ из расчета 10 мл бульона на 1 мл воды и ставили контроль – колбу с пробой (воды, комбикорма, мяса и фекалий) не контаминированной бак-териями рода K�ebs�e��a.Результат реакции учитывали по количеству образовавшихся негативных колоний фага в опытных и контрольных чашках.

Положительная реакция характеризовалась увеличением количества корпускул фага по сравнению с контролем в 5 и более раз.

Увеличение количества фагов в искусственно инфицированной водопроводной воде, представлена в табл. 1.

Таблица 1 – Увеличение количества фагов в искусственно инфицированной штаммами бактерий рода K�ebs�e��a водопроводной воде

Концентрация индикаторных

штаммов бактерий

Бактериофаги К - 10 УГСХА К - 81 УГСХА

Количество колоний фага (М

± m)

Увеличение кол-ва фага (раз)


± m)


105 лизис > 10 лизис > 10104 лизис > 10 лизис > 10103 420 ± 3,21 5,9 350 ± 3,05 5102 160 ± 3,05 2,2 142 ± 3,05 2101 77 ± 2,08 1 80 ± 3,78 1

Контрольная проба 71 ± 2,64 0 70 ± 1,15 0

Контроль «дикого» фага 0 0 0 0

По результатам проведенных исследований водопроводной воды установлено, что увели-чение титра фагов К - 10 УГСХА и К - 81 УГСХА более чем в 5 раз произошло при концентрации бактерий рода K�ebs�e��a 103 микробных клеток в 1 мл водопроводной воды.

Увеличение количества фага в искусственно инфицированном комбикорме, показано в табл. 2.


38

Таблица 2 – Увеличение количества фагов в искусственно инфицированном штаммами бактерий рода K�ebs�e��a комбикорме





± m)



± m)


105 лизис > 10 лизис > 10104 лизис > 10 лизис > 10103 630 ± 3,46 8,6 437 ± 9,60 5,5102 212 ± 1,52 2,9 201 ± 5,13 2,5101 75 ± 2,64 1 77 ± 3,51 0



В результате проведенного опыта, увеличение титра фагов К - 10 УГСХА и К - 81 УГСХА более чем в 5 раз произошло при концентрации бактерий рода K�ebs�e��a 103м.к./г комбикорма, при наличии посторонней микрофлоры.

Увеличение титра фагов К - 10 УГСХА и К - 81 УГСХА более чем в 5 раз произошло при концентрации бактерий рода K�ebs�e��a 103м.к./г мяса (табл. 3).

Таблица 3 – Увеличение количества фага в искусственно инфицированном штам-мами бактерий рода K�ebs�e��a мясе





± m)



± m)


105 лизис > 10 лизис > 10104 лизис > 10 лизис > 10103 690 ± 3,21 10 770 ± 2,88 10,2102 164 ± 2,08 2,3 159 ± 2,08 2,1101 70 ± 5,68 1 68 ± 3,51 0




39

Таблица 4 – Увеличение количества фага в искусственно инфицированных штаммами бактерий рода K�ebs�e��a фекалиях





± m)



± m)


105 565 ± 11,23 7,8 803 ± 4,58 10104 369 ± 7,81 5,1 401 ± 3,51 5103 70 ± 4,04 0 85 ± 6,02 1102 73 ± 3,21 1 82 ± 3,60 1101 70 ± 3,60 0 68 ± 4,35 0



Из результатов опыта видно, что увеличение титра фагов К - 10 УГСХА и К - 81 УГСХА бо-лее чем в 5 раза произошло при концентрации бактерий рода K�ebs�e��a 104 микробных клеток в 1 г фекалий. Такое снижение чувствительности связано с высокой обсемененностью данного объекта посторонней микрофлорой. С увеличением инкубации бактериофагов с материалом до 10 часов диагностическая чувствительность повышалась и позволяла обнаруживать указанные бактерии в концентрации 103м.к./г за 22 часа.

Полученные данные при исследовании воды, комбикорма и мяса подтверждают увели-чение титра фагов более чем в 5 раз при минимальной концентрации бактерий рода K�ebs�e��a 103м.к./мл. При исследовании фекалий бактерии рода K�ebs�e��a обнаруживались в концентра-ции 104м.к./г, а с увеличением инкубации бактериофагов с материалом до 10 часов обнаруживали данные бактерии в концентрации 103м.к./г за 22 часа.

Бактериологическим методом в исследованных пробах воды, комбикорма, мяса и фекалий бактерии рода K�ebs�e��a обнаруживались в концентрации 104м.к./мл за 96 часов.

Заключение. В результате проведенных исследований по обнаружению бактерий рода K�ebs�e��a в контаминированных указанными микроорганизмами объектах ветеринарного надзора, можно утверждать об успешном применении метода – РНФ с индикаторными бактериофагами К - 10 УГСХА и К - 81 УГСХА диагностическая чувствительность которого позволяет обнаруживать бактерии рода K�ebs�e��a в минимальной концентрации 103 – 104м.к./мл за 18 – 22 часа. Из чего сле-дует, что РНФ является высокочувствительным методом, позволяющим обнаружить бактерии рода K�ebs�e��a даже в случаях, когда выделение культуры в чистом виде практически невоз-можно из-за наличия большого количества посторонней микрофлоры.

Библиографический список1. Ганюшкин В.Я. Бактериофаги сальмонелл и их применение в ветеринарии. – Улья-

новск, 1988. – 45 с.2. Золотухин С.Н. Создание и разработка схем применения диагностических биопре-

паратов на основе выделенных и изученных бактериофагов энтеробактерий: Автореф. дис. … до-ра биол. наук. – Ульяновск, 2007. – 39 с.

3. Тимаков В.Д., ГольдфарбД.М. Реакция нарастания титра фага (РНФ).– М., 1962.– 32 с.


40

4. Молофеева Н.И. Выделение и изучение основных биологических свойств бактери-офагов E. сoli 0157 и их применение в диагностике: Автореф. дис. … канд. биол. наук. – Сара-тов, 2004. – 20 с.

5. Пульчеровская Л.П. Выделение и изучение основных биологических свойств бак-териофагов ��troba�ter и их применение в диагностике: Автореф. дис. … канд. биол. наук. – Саратов, 2004. – 21 с.

6. Семенцов В.И., и др. Клебсиеллез поросят. / В.И. Семенцов, И.А. Болоцкий, О.П. Ольховик и др.// Ветеринария Кубани. – 2009. - № 6. - С. 15-17.

DISPLAY TYPE BACTERIA KLEBIELLA, WITH SPECIFIC BACTERIOPHAGE, IN VETERINARY SURVEILLANCE OBJECTS

Liashenko E.A., Vasilyev D.A., Zolotukhin S.N.

Keywords: ba�ter�ophage ��sp�ay, K�ebs�e��a, ba�ter�a.The work �s base� on a stu�y of RNF w�th �n��ator ba�ter�ophages to �ete�t ba�ter�a of the

genus K�ebs�e��a.As a resu�t of the resear�h, �t �an be argue� on the su��essfu� use of the metho� - RNF w�th

�n��ator ba�ter�ophages to - 10 UGSKHA an� K - 81 UGSKHA ��agnost�� sens�t�v�ty that �an �ete�t ba�ter�a of the genus K�ebs�e��a at a m�n�mum �on�entrat�on of 103 - 104m.k./m� for 18 - 22 hours.

УДК: 679.61

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ БАКТЕРИОФАГОВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ С ИНФЕКЦИОННЫМИ

ОСЛОЖНЕНИЯМИ В КЛИНИКЕ ТРАВМАТОЛОГИИ И ОРТОПЕДИИ

Мидленко В.И.*, доктор медицинских наук, профессорЗолотухин С.Н.**, доктор биологических наук, профессортел. 8(8422) 55-95-47, [email protected]Шевалаев Г.А. *, кандидат медицинских наук, доцент, [email protected]Ефремов И.М.*, ассистент кафедры госпитальной хирургии [email protected]Пичугин Ю.В., врач рентгенолог, [email protected]*ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный университет»**ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина»

Ключевые слова: бактериофаги, хрони�еский остеомиелит, инфекция области хи-рурги�еского вмешательства

Анализ этиологи�еской структуры возбудителей гнойных послеоперационных ослож-нений показал ведущую роль стафилококков в развитии этих процессов у травматологи�е-ских больных, при хирурги�еском вмешательстве в 83% и при хрони�еском остеомиелите в 70% слу�аев.

�оливалентный пиобактериофаг лизировал 78% грамположительных бактерий, в том �исле полирезистентных к антибиотикам штаммов St. aureus.


41

Введение. Лечение инфекционных осложнений у больных в клинике травматологии и ортопедии вызывает большие трудности. Увеличение числа антибиотикорезистентных штам-мов микроорганизмов способствует увеличению количества отрицательных клинических ре-зультатов лечения данной группы больных [1,2].

Анализ литературных данных показывает, что основными возбудителями инфекцион-ных осложнений у больных травматолого-ортопедического профиля являются: грамположи-тельные кокки - St.aureus и St.epidermidis; неферментирующие грамотрицательные палочки - Ps. aeruginosa и бактерии рода Acinetobacter spp.; энтеробактерии - Proteus spp., Enterobacter spp., Klebsiella spp., E.coli и т.д. [3].

В комплексе лечебных мероприятий, наряду с хирургическим вмешательством, одним из важных методов лечения инфекционных осложнений служит воздействие на этиологиче-ского агента гнойных осложнений. В практической медицине это осуществляется применени-ем различных антибактериальных химиопрепаратов и антисептиков [4-6].

Однако применение антибиотиков не всегда возможно и оправдано, ввиду наличия по-бочных действий лекарственных препаратов, антибиотикорезистентности возбудителей болез-ни, ограничений применения в детском возрасте, наличия тяжелых сопутствующих соматиче-ских заболеваний, являющихся противопоказанием для антибактериальной терапии, высокая стоимость лекарственных препаратов.

Для лечения больных с инфекцией области хирургического вмешательства (ИОХВ) и хроническим остеомиелитом (ХО) антибиотики с успехом применяются местно в комбинации с носителем: полиметилметакрилат [8,9], ГАП-материалы [10], биодеградируемые композиции [11] и т.д.

Лечебно-профилактические бактериофаги являются одной из альтернатив антибакте-риальной химиотерапии [12-14]. Кроме того, имеются сообщения о более эффективном воз-действии бактериофагов в комплексе с антибактериальной терапией [15], а также с озонотера-пией [16].

Материалы и методы. Нами проведено изучение этиологической структуры возбудителей гнойных инфек-

ций, выделенных из содержимого воспалительных процессов от 35 больных с послеопераци-онными инфекционными осложнениями, проходивших стационарное лечение во 2-ом, 3-ем и 4-ом травматологических отделениях ГУЗ «Ульяновский областной клинический центр специ-ализированных видов медицинской помощи» в 2012 году.

Среди исследуемых больных у 30 инфекционные осложнения возникли после опе-ративного лечения закрытых переломов длинных трубчатых костей, у 2-х после операций на мягких тканях, у 2-х после оперативного лечения деформирующего коксартроза (тотального эндопротезирования тазобедренного сустава). Из них, у 12 больных после операций накостно-го остеосинтеза пластинами различной конструкции, 10 после блокируемого интрамедулляр-ного остеосинтеза, 4 после фасцикулярного остеосинтеза и остеосинтеза аппаратами внешней фиксации, 6 больных после тотального эндопротезирования тазобедренного сустава (цемент-ное – 4, бесцементное – 2). У одного больного консервативное лечение переломов лодыжек осложнилось развитием гнойного остеоартрита голеностопного сустава и остеомиелитом ко-стей, формирующих голеностопный сустав.

Помимо этого, проведен ретроспективный анализ микрофлоры, выделенной у 50 боль-ных ХО костей конечностей. Из них у 18 больных - хронический посттравматический остео-миелит, у одной больной - первично-хронический остеомиелит Гарре, у 31 больного - хрони-ческий послеоперационный остеомиелит. Послеоперационный остеомиелит у 9 больных явил-ся осложнением операций накостного остеосинтеза, у 11 интрамедуллярного остеосинтеза, у


42

двух фасцикулярного остеосинтеза, у 6 остеосинтеза аппаратами внешней фиксации, удвух операций на мягких тканях.

Для изучения фагочувствительности возбудителей инфекционных осложнений у больных травматолого-ортопедического профиля, проанализированы результаты бактерио-логического исследования (in vitro) посевов из свищей и гнойно-некротических ран у 30-ти госпитальных больных, проходивших стационарное лечение в клинике травматологии и орто-педии ГУЗ «УОКЦ СВМП» в 2012 году.

Из них, у 21-го больного диагностирован ХО, у 3-х ранняя ИОХВ после металлоо-стеосинтеза закрытого перелома, у одного ранняя ИОХВ после операции на мягких тканях, у одного ранняя глубокая ИОХВ после эндопротезирования тазобедренного сустава, у 4-х от-крытые переломы длинных трубчатых костей нижних конечностей, осложненные инфекци-онно-воспалительным процессом. Свищи – у 13-ти больных, гнойно-некротические раны - у 17-ти больных.

Посев материала производился на стандартные питательные среды. Далее определя-ли родовую и видовую принадлежность микроорганизмов после выделения чистых культур возбудителей по совокупности тинкториально-морфологических, культуральных и фермента-тивных свойств с последующим исследованием антибиотикочувствительности выделенных штаммов диско-диффузионным методом в соответствии с методическими указаниями МУК 4.2.1980-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препа-ратам».

Фагочувствительность 38-ми выделенных штаммов микроорганизмов определяли в отношении поливалентного пиобактериофага «Секстафаг», из них у 32 грамположительных штаммов и у 6 грамотрицательных бактерий. Чувствительность к препарату определяли на плотных питательных средах методом «стекающая капля».

Результаты исследований. При анализе полученных данных нами установлено, что основными возбудителями ранних и поздних послеоперационных инфекционных осложнений у больных в клинике травматологии и ортопедии являются стафилококки - 83% (рис. 1).

Рисунок 1. Микробный пейзаж у больных с послеоперационными инфекционны-ми осложнениями в клинике травматологии и ортопедии

73% штаммов стафилококков нами были отнесены к виду St.aureus, остальные 27% штаммов были коагулазонегативные и принадлежали к видам St.epidermidis, St.saprophyticus, St.hominis, St.capitis. Из всех St.aureus и St.epidermidis - 28% штаммы MRSA и MRSE. Из гра-.hominis, St.capitis. Из всех St.aureus и St.epidermidis - 28% штаммы MRSA и MRSE. Из гра-hominis, St.capitis. Из всех St.aureus и St.epidermidis - 28% штаммы MRSA и MRSE. Из гра-, St.capitis. Из всех St.aureus и St.epidermidis - 28% штаммы MRSA и MRSE. Из гра-St.capitis. Из всех St.aureus и St.epidermidis - 28% штаммы MRSA и MRSE. Из гра-.capitis. Из всех St.aureus и St.epidermidis - 28% штаммы MRSA и MRSE. Из гра-capitis. Из всех St.aureus и St.epidermidis - 28% штаммы MRSA и MRSE. Из гра-. Из всех St.aureus и St.epidermidis - 28% штаммы MRSA и MRSE. Из гра-St.aureus и St.epidermidis - 28% штаммы MRSA и MRSE. Из гра-.aureus и St.epidermidis - 28% штаммы MRSA и MRSE. Из гра-aureus и St.epidermidis - 28% штаммы MRSA и MRSE. Из гра- и St.epidermidis - 28% штаммы MRSA и MRSE. Из гра-St.epidermidis - 28% штаммы MRSA и MRSE. Из гра-.epidermidis - 28% штаммы MRSA и MRSE. Из гра-epidermidis - 28% штаммы MRSA и MRSE. Из гра- - 28% штаммы MRSA и MRSE. Из гра-MRSA и MRSE. Из гра- и MRSE. Из гра-MRSE. Из гра-. Из гра-мотрицательных неферментирующих палочек 75% были бактериями рода Acinetobacter spp.


43

Рисунок 2. Микробный пейзаж у больных хроническим остеомиелитом

При анализе результатов изучения этиологической структуры возбудителей гнойных осложнений у больных ХО (рис. 2) установлено, что основной причиной воспалительных про-цессов являются также стафилококки, которые составляют 70% от общего количества выде-ленных штаммов бактерий. Из них 72% принадлежали к виду St.aureus, 14% - к St.epidermidis, и 14%, такие как, St.saprophyticus, St.hominis, St.capitis, St.haemolyticus, были идентифициро-St.saprophyticus, St.hominis, St.capitis, St.haemolyticus, были идентифициро-.saprophyticus, St.hominis, St.capitis, St.haemolyticus, были идентифициро-saprophyticus, St.hominis, St.capitis, St.haemolyticus, были идентифициро-, St.hominis, St.capitis, St.haemolyticus, были идентифициро-St.hominis, St.capitis, St.haemolyticus, были идентифициро-.hominis, St.capitis, St.haemolyticus, были идентифициро-hominis, St.capitis, St.haemolyticus, были идентифициро-, St.capitis, St.haemolyticus, были идентифициро-St.capitis, St.haemolyticus, были идентифициро-.capitis, St.haemolyticus, были идентифициро-capitis, St.haemolyticus, были идентифициро-, St.haemolyticus, были идентифициро-St.haemolyticus, были идентифициро-.haemolyticus, были идентифициро-haemolyticus, были идентифициро-, были идентифициро-ваны как КОС.

11% штаммов St.aureus и 29% штаммов St.epidermidis были отнесены нами к MRSE.На втором месте были грамотрицательные неферментирующие палочки. Среди них

57% бактерии вида Ps.aeruginosa, 43% принадлежали к роду Acinetobacter spp. Третье место в этиологической структуре составили энтеробактерии: три штамма

принадлжали к виду E.coli, по одному штамму Proteus vulgaris, En. Cloacae и Kl. pneumoniae. Энтерококки выявлены в 6% случаев и были представлены видом Enterococcus feaca-Enterococcus feaca- feaca-feaca-

lis. Кроме того, выделен один штамм Streptococcus piogenes. Коринебактерии составили один процент от общего количества выделенных микро-

бов. Грибы рода Candida выделены только у одного больного (один штамм). По результатам исследований 78% штаммов грамположительных бактерий были чув-

ствительны к поливалентному пиобактериофагу. Наибольшая чувствительность была отме-чена у St.aureus (95% изучаемых штаммов). Меньшую чувствительность проявили КОС, что составило составила 29% от общего количества выделенных штаммов этих микроорганизмов.

Все штаммы MRSA были чувствительны к поливалентному пиобактериофагу. Три штамма стафилококков обладали устойчивостью к изучаемому препарату.

75% бактерий рода Enterococcus spp. были чувствительны к изучаемому фаговому препарату.

50% штаммов бактерий синегнойной палочки лизировались поливалентным пиобак-териофагом.

Остальные штаммы синегнойной палочки, оказались устойчивыми к поливалентному пиобактериофагу и специфическому синегнойному бактериофагу.

Чувствительность к поливалентному пиобактериофагу проявили по одому штамму Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae и Streptococcus piogenes.

Выводы. 1. Основным возбудителем послеоперационных и посттравматических ин-фекционных осложнений у больных в клинике травматологии и ортопедии является St.aureus, обнаруженные в 73% случаев при ИОХВ, и 72% - при ХО.

2. Поливалентный пиобактериофаг – «Секстафаг» лизировал 95% бактерий St.aureus,


44

29% КОС, 75% бактерий рода Enterococcus spp. и 50% бактерий Ps. aeruginosae.

Библиографический список1. Афиногенова, А.Г. Микробные биопленки ран: состояние вопроса / А.Г. Афиногено-

ва, Е.Н. Даровская // Травматология и ортопедия России. – 2011. – №3. – С. 119-125.2. Гостев, В.В. Антибиотикорезистентность микрофлоры ран открытых переломов (II

сообщение) / В.В. Гостев, З.С. Науменков, И.И. Мартель // Травматология и ортопедия России. – 2010. – №1. – С. 33-37.

3. Гординская, Н.А. Резистентность основных возбудителей инфекции в отделении гнойной остеологии / Н.А. Гординская, Е.В. Сабирова, Н.В. Абрамова, Е.В. Дударева, В.Н. Митрофанов // Вопросы травматологии и ортопедии. – 2012. – №2. – С. 14-17.

4. Божкова, С.А. Современные принципы диагностики и антибактериальной терапии инфекции протезированных суставов (обзор литературы) / С.А. Божкова // Травматология и ортопедия России. – 2011. – №3. – С. 126-136.

5. Кузнецов, Н.А. Современные антисептические препараты в лечении параэндопро-тезной инфекции / Н.А. Кузнецов, В.Г. Никитин, Е.Б. Телешова, А.А. Мильчаков // Инфекции в хирургии. – 2009. – №4. – С. 46-50.

6. Савельев, В.С. Хирургические инфекции кожи и мягких тканей. Российские нацио-нальные рекомендации / В.С. Савельев [и др.]. – 2009. – С. 90.

7. Федянин, С.Д. Рациональная антибиотикотерапия у пациентов с гематогенным и посттравматическим остеомиелитом / С.Д. Федянин // Вестник ВГМУ. – 2004. – №2. – С. 61-68.

9. Куропаткин, Г.В. Костный цемент в травматологии и ортопедии / Г.В. Куропаткин. – Самара: «Издательство Самара», «БМВ и К», 2006г. – 48с.: ил.

10. Уразгильдиев, З.И. Применение коллапана для пластики остеомиелитических де-фектов костей / З.И. Уразгильдиев, О.М. Бушуев, Г.Н. Берченко // Вестник травматологии и ортопедии им. Н.Н. Приорова. – 1998. – №2. – С. 31-34.

11. Афиногенов, Г.Е. Антимикробная биодеградируемая композиция на основе высо-комолекулярного поливинилпирролидона для профилактики экспериментального остеомиели-та / Г.Е. Афиногенов, Р.М. Тихилов, А.Г. Афиногенова, Т.Я. Богданова, М.В. Краснова, И.В. Козлов, Е.Н. Даровская, Л.О. Анисимова, И.К. Лебедева, Т.М. Петрова // Травматология и ор-топедия России. – 2010. – №3. – С. 47-54.

12. Асланов, Б.И. Бактериофаги как факторы формирования госпитальных штаммов и средства борьбы с внутрибольничными инфекциями / Б.И. Асланов, Л.П. Зуева, В.Ю. Хоро-шилов // Инфекции в хирургии. – 2009. – №1. – С. 25-29.

13. Габриэлян, Н.И. Исследование антибиотико- и фагочувствительности нозокоми-альных штаммов микробов, выделенных от пациентов трансплантологической клиники / Н.И. Габриэлян, Е.М. Горская, Т.С. Спирина, С.А. Прудникова, Л.Ю. Ромашкина // вестник транс-плантологии и искусственных органов. – 2011. – №3. – С. 26-32.

14. Красильников, И.В. Применение бактериофагов: краткий обзор современного со-стояния и перспектив развития / И.В. Красильников, К.А. Лыско, А.К. Лобастова // Сибирский медицинский журнал. – 2011. – №2. – С. 33-37.

15. Курбангалеев, С.М. Гнойная инфекция в хирургии / С.М. Курбангалеев // – М.: «Медицина», 1985. – С. 272.

16. Чандра-Д,Мелло, Р. Методика комбинированного использования озоно- и бактери-офаготерапии в комплексном лечении хронических аднекситов / Р. Чандра-Д,Мелло, Г.О. Греч-канев, Н.Н. Никишин, Н.С. Перетягина // Медицинский альманах. – 2009. – №4. – С. 140-142.


45

MICROBIOLOGICAL SUBSTANTIATION OF BACTERIOPHAGE’S TO TREATMENT OF PATIENTS WITH INFECTIOUS COMPLICATIONS

IN TRAUMATOLOGY AND ORTHOPAEDICS

Midlenko V.I., Zolotukhin S.N., Shevalaev G.A., Efremov I.M., Pichugin U.V. Key words: ba�ter�ophages, �hron�� osteomye��t�s, �nfe�t�on of the surg��a� �ntervent�on Ana�ys�s of the m��rob�a� �an�s�ape showe� that staphy�o�o��us o��up�e� a �ea��ng ro�e �n

the �eve�opment of �nfe�t�on of the surg��a� �ntervent�on �n traumato�og��a� pat�ents. Staphy�o�o��us was obta�ne� �n 83% of t of reg�on of s surg��a� �ntervent�on an� �n 70%of �hron�� osteomye��t�s.

Po�yva�ent p�obakter�ofag �yse� 78% of gram-pos�t�ve ba�ter�a, �n��u��ng mu�t��rug-res�s-tant stra�ns of St. aureus.

УДК 619:578

ИССЛЕДОВАНИЕ ЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ БАКТЕРИОФАГОВ AEROMONAS HYDROPHILA

Насибуллин И.Р., соискатель, [email protected]Куклина Н.Г., научный сотрудник, [email protected] Горшков И.Г., научный сотрудник, [email protected]Викторов Д.А., кандидат биологических наук,старший научный сотрудник, тел. 9084775573, [email protected]Васильев Д.А., доктор биологических наук, профессор, [email protected]Нафеев А.А., доктор медицинских наук, [email protected]ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина»

Ключевые слова: Aeromonas hy�roph��a, бактериофаги, диагностика, изолят фагов, лити�еская активность.

Статья посвящена методам изу�ения лити�еской активности бактериофагов бак-терий Aeromonas hy�roph��a, выделенных из окружающей среды в Ульяновской области. Вы-Aeromonas hy�roph��a, выделенных из окружающей среды в Ульяновской области. Вы- hy�roph��a, выделенных из окружающей среды в Ульяновской области. Вы-hy�roph��a, выделенных из окружающей среды в Ульяновской области. Вы-, выделенных из окружающей среды в Ульяновской области. Вы-деленные бактериофаги проявили разли�ную лити�ескую активность, варьирующуюся в ши-роких пределах.

Введение. Литическая активность является одним из биологических свойств бакте-риофагов, оцениваемых при их селекции для создания диагностических биопрепаратов [1, 4, 5]. Литическая активность бактериофага оценивается по его способности вызывать лизис бактериальной культуры в жидких или плотных средах и выражают это тем максимальным разведением, в котором испытуемый бактериофаг проявил свое литическое действие. Более точным методом оценки активности бактериофага является определение количества активных корпускул фага в единице объема. Активность бактериофага определяется в конкретных, стан-дартных условиях. Бактериофаг по отношению к одной и той же культуре, но в разных средах, так же как и при испытании его в одной среде на разных штаммах одного и того же вида бак-терий, может проявлять разную литическую активность и формировать неодинаковое число


46

колоний на плотной среде [2, 3]. Важными условиями при изучении литического действия бактериофагов является: состав питательной среды, особенно наличие в ней ионов кальция и магния, органических кофакторов лизиса типа триптофана, концентрация агара и толщина его слоев, возраст и количество добавляемой тест-культуры, температура инкубации посевов, ее продолжительность [5].

Материалы и методы исследований. В работе были использованы: 1 референс-штамм, полученный из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветери-нарно-санитарной экспертизы УГСХА, 14 «полевых» штаммов, выделенных нами из объектов окружающей среды, 5 штаммов бактериофагов, выделенных нами из озер и рек Ульяновской области. Культуры бактерий Aeromonas hy�roph��a для определения литической активности бактериофагов выращивали на стандартном мясо-пептоном бульоне в течение 18-24 часов. Ли-тическую активность селекционированных бактериофагов определяли по методу Аппельмана и Грациа [1, 2, 3, 4, 5].

Метод Аппельмана. В ряд пробирок из нейтрального стекла одинакового диаметра наливали по 4,5 мл бу-

льона. В первую пробирку вносили 0,5 мл исследуемого бактериофага. Затем делали последо-вательные разведения, перенося отдельными стерильными пипетками из пробирки в пробирку по 0,5 мл бактериофага. Использовали 10 пробирок. Из последней пробирки 0,5 мл выливали в дезраствор, затем во все пробирки вносили по 0,2 мл 18-часовой бульонной индикаторной культуры. 11-я и 12-я пробирки являются контрольными, в первой из них находится бульон и культура (без фага), во второй - бульон с бактериофагом (контроль на стерильность). Все 12 пробирок помещали в термостат при 30 ºС на 18 часов. Титр фага устанавливали по последней прозрачной пробирке ряда и выражали разведением фага [2, 4]. Результаты исследований пред-ставлены в таблице № 1.

Метод агаровых слоев по Грациа. Мясо-пептонный агар 1,5 % концентрации с ген-цианвиолетом накануне опыта разливают по чашкам Петри в количестве 25-30 мл. Чашки, прикрытые стерильной бумагой, подсушивают в термостате или под бактерицидной лампой в течении нескольких часов. Это необходимо для абсолютной сухости чашек, так малейшее их увлажнение может исказить результаты количественного изучения фага. Затем 0,7 % агар в количестве 2,5 мл, предварительно разлитый в стерильные пробирки, расплавляют и остужа-ют до 46-47 ºС. Исследуемый фаг в количестве 1,0 мл помещают в 2,5 мл 0,7 % агара, туда же помещают 0,2 мл суточной индикаторной культуры, все быстро и тщательно перемешивают вращением пробирки в ладонях и выливают на поверхность 1,5 % агара. Смесь осторожными движениями распределяют по поверхности агара, чашки для затвердения оставляют на гори-зонтальной поверхности на 30-40 минут, затем инкубируют в термостате в перевернутом виде в течение 18-20 часов при 30 ºС. После инкубации в термостате подсчитывают количество не-гативных колоний и умножают полученное число на степень разведения [2, 3, 4, 5]. Результаты исследований в таблице 1.

Таблица 1 - Литической активности бактериофагов Aeromonas hy�roph��a№ Название фага Титр по Аппельману Титр по Грациа 1 Фаг 43-УГСХА 10-8 2 х 108

2 Фаг 1п-УГСХА 10-5 4 х 106

3 Фаг 43г-УГСХА 10-7 3 х 107

4 Фаг 13а-УГСХА 10-5 5 х 105

5 Фаг Ahd-УГСХА 10-7 1 х 108


47

Заключение. Из данных таблицы следует, что литическая активность бактериофагов бактерий вида Aeromonas hy�roph��a по Аппельману находится в пределах от 10-5 до 10-8, а по Грациа от 5 х 105 до 2 х 108 фаговых корпускул в 1 мл. Максимальный титр у бактериофага 43-УГСХА: по Аппельману 10-8, по Грациа 2 х 108. Необходимо дальнейшее изучение этого бактериофага для создания биопрепарата на его основе.

Библиографический список1. Викторов Д.А. Усовершенствование методов выделения, идентификации и индика-

ции бактерий Pseu�omonas put��a // Автореф. дис. … канд. биол. наук. – 2011. – 22 с.2. Ганюшкин В. Я. Бактериофаги сальмонелл и их применение в ветеринарии. Учеб-

ное пособие. – Ульяновск. 1988. – С. 12-16.3. Гольдфарб Д. М. Бактериофагия. – М.: Медгиз, 1961. – С. 14-17.4. Золотухин С. Н. Бактериофаги М. morganii и их применение при желудочно-кишеч-morganii и их применение при желудочно-кишеч- и их применение при желудочно-кишеч-

ных заболеваниях поросят // Автореферат дис. канд. вет. наук.- Ульяновск, 1994.5. Ревенко И. П. Бактериофаги и их использование в ветеринарной практике. – Киев:

Урожай, 1978. – С. 18-21.

RESEARCH OF LYTIC ACTIVITY OF BACTERIOPHAGES AEROMONAS HYDROPHILA

Nasibullin I.R., Кuklina N.G., Gorshkov I.G., Viktorov D.А., Vasilev D.А., Nafeev А.N.

Key words: ba�ter�a Aeromonas hy�roph��a, ba�ter�ophages, ��agnos�s, �so�ate phage �yt�� a�t�v�ty.

The art��e �s �evote� to the metho�s of the stu�y of �yt�� a�t�v�ty of ba�ter�ophages of ba�ter�a Aeromonas hy�roph��a, a��o�ate� from the env�ronment �n U�yanovsk reg�on. Se�e�te� ba�ter�ophages have shown vary�ng �yt�� a�t�v�ty that ranges w��e�y.

УДК 619:579

О ПЕРСПЕКТИВАХ ФАГОДИАГНОСТИКИ ФЛАВОБАКТЕРИОЗОВ РЫБ

Парамонова Н.А., аспират, [email protected]Викторов Д.А., кандидат биологических наук,старший научный сотрудник, тел. 9084775573, [email protected]Васильев Д.А., доктор биологических наук, профессор, [email protected]Золотухин С.Н., доктор биологических наук, профессортел. 9272703480, [email protected]ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина»

Ключевые слова: F�avoba�ter�um psy�hroph��um, бактериальная холодноводная бо-лезнь рыб, диагностика, ле�ение, профилактика, бактериофаги.

В работе приведён обзор литературных данных оте�ественных и зарубежных авто-


48

ров, рассматривается проблема диагностики, ле�ения и профилактики бактериальной хо-лодноводной болезни рыб, обусловленной F�avoba�ter�um psy�hroph��um. �роведённый анализ указывает на актуальность разработки методов фагодиагностики и фаготерапии для на-званного заболевания рыб.

Среди многочисленных бактерий, ежегодно заражающих рыб, F�avoba�ter�um psy�hroph��um за последние годы вызывает большой интерес, как в экономической, так и в экологической сфере [20].

F. psy�hroph��um – тонкие, нитевидные грамотрицательные бактерии длиной 2-5 мкм, в диаметре 0,3-0,5 мкм. Образуют слизистые, блестящие, круглые, выпуклые, желтые колонии. Для клеток характерны скользящие движения. Этот возбудитель вызывает холодноводную бак-териальную болезнь (bacterial coldwater disease (BCWD)), которую впервые описал Борг в 1948 году [6]. В Европе данное заболевание называют «обжаренный синдром радужной форели» (rainbow trout fry syndrome (RTFS)) [7].

Бактериальная холодноводная болезнь (cold-water disease, или RTSF - Rainbow trout fry syndrome), вызванная F�avoba�ter�um psy�hroph��um, встречается во всем мире [8]. Инфекции вызванные F. psy�hroph��um были обнаружены по всей Северной Америке [9], почти в каждой стране Европы [21], Австралии [23], Чили [26], Перу [15], Японии [10], Корее [13], и Турции [12]. F. psy�hroph��um имеет по крайней мере три основных серотипа [16].

F. psy�hroph��um удавалось выделить из патологического материала лососевых, сомо-вых, карпа, карася [14] и некоторых аквариумных рыб при температуре воды 4-10 0С.

Вирулентные формы условно-патогенных бактерий рода F.psy�hroph��um вызывают эпизоотии и массовую гибель при неблагоприятных или стрессовых для рыб условиях, спо-собствующих повышению восприимчивости гидробионтов к инфекциям и усиливающих при-способляемость бактерий [4].

Смертность может составлять 90% [21], а также может быть очень низкой (1%) и не-прерывной [22].

При холодноводной болезни у личинок происходит коагуляция желтка, эрозия кожных покровов и желточного мешка. Гибель личинок может достигать 50 %. У мальков отмечают потемнение окраски тела, появление характерных поражений в виде белых пятен. У сеголет-ков отмечают эрозию спинного и хвостового плавников, гиперемию в области анального от-верстия, некроз спинного плавника, хвостового стебля с оголением скелета, нижней челюсти. У годовиков выявляют разрушение кожи с оголением мышц на голове, челюстях, на разных участках тела, анемию и геморрагии жабр. Больные рыбы отказываются от корма. Гибель мальков, сеголетков и годовиков достигает 10-20 %. У форели первым поражается жировой плавник, который постепенно обесцвечивается к основанию. Хвостовой плавник рыбы при-обретает грязно-белый цвет. Иногда разрушение хвостового плавника развивается до такой степени, что обнажаются мышцы и позвоночник. У балтийского лосося поражения кожи могут начаться на спине. У кижуча часто поражаются голова, рот и почки. Повышение температуры воды до 15—16 °С ведет к прекращению заболевания.

F.psy�hroph��um способны к образованию желтого пигмента, а также протеолитиче-ских ферментов, которые вызывают прямое повреждение тканей и расширение зоны пора-жения, что является одним из предлагаемых факторов вирулентности бактерии [18], а также выделяет эндотоксин.

При исследование пораженной кожи рыб F. psychrophilum выявились только на микро-травмах, причем интактные участки кожи оставались неинфицированными. Бактерии имеют сродство к коллагену, благодаря чему при попадании на кожу мигрируют в миосепты через


49

соединительную ткань. Впоследствии поражениераспространяется на основную мускулатуру, что приводит к развитию некротического миозита и формированию открытых язв [19].

Установлено, что бактерии могут передаваться от родителей потомству через инфи-цированное внутреннее содержимое икринки – так называемая вертикальная передача – и вы-живать даже после ее дезинфекции [10, 19], так и горизонтальным путем [17].

Имеются данные об изоляции микроорганизмов F. psy�hroph��um из внутреннего со-держимого оплодотворенной икринки, а также из внутренних органов и половых продуктов рыб-производителей. Поэтому очень важно проведение бактериологического обследования производителей перед закладкой икры на инкубацию [3].

Подавляющее большинство изолированных штаммов бактерий F. psy�hroph��um чув-ствительны к эритромицину и тетрациклину – 83,3 и 80,0 % соответственно. Рост половины изолятов подавляла оксолиновая кислота. Более слабую чувствительность отмечали в отноше-нии стрептомицина и гентамицина. Все выделенные штаммы F. psy�hroph��um были устойчи-вы к канамицину. Устойчивость к антибиотикам бактерий F. psy�hroph��um в настоящее время является серьезной проблемой [4].

Способность возбудителя холодноводной болезни образовывать оболочку, устойчи-вую к антибиотикам, вероятно, приводит к быстрому развитию резистентности к лечебным препаратам, а также к рецидивирующим инфекциям [24]. В настоящее время контролирование инфекций, вызванных F. psy�hroph��um, антибиотиками является малоэффективным методом [5].

Вышеперечисленное обуславливает научный и практический интерес к бактериям F. psy�hroph��um. В значительной степени это связано с недостаточно разработанными методами индикации и идентификации данного микроорганизма при выделении из объектов внешней среды [1]. С середины прошлого столетия бактериофаги широко используются для диагности-ки различных бактериальных инфекций [2]. Вместе с тем, использование реакции нарастания титра фага, как быстрого и точного метода индикации бактерий, для F. psy�hroph��um ранее не изучалось.

В связи с этим для усовершенствования методов диагностики флавобактериозов рыб, в настоящее время коллективом авторов проводится выделение бактериофагов F. psy�hroph�-. psy�hroph�-psy�hroph�-�um для их дальнейшей селекции и конструирования на их основе биопрепарата для индика-ции данных бактерий методом реакции нарастания титра фага.

Библиографический список1. Васильев Д.А. Учебно-методическое пособие по методам общей бактериологии /

Д.А. Васильев, С.Н. Золотухин, Н.М. Никишина – Ульяновск, 1998. – 151 с.2. Гольдфарб Д.М. Бактериофагия / Д.М. Гольдфарб // М.: Медгиз. – 1961. – 225 с.3. Дзюба Е.В. Апробация системы высокочувствительной детекции патогенных ми-

кроорганизмов в аквакультуре обыкновенного карпа cyprinus carpio linnaeus, 1758 / Е.В. Дзю-cyprinus carpio linnaeus, 1758 / Е.В. Дзю- carpio linnaeus, 1758 / Е.В. Дзю-carpio linnaeus, 1758 / Е.В. Дзю- linnaeus, 1758 / Е.В. Дзю-linnaeus, 1758 / Е.В. Дзю-, 1758 / Е.В. Дзю-ба [и др.]//Известия Самарского научного центра Российской академии наук - 2012. - том 14, №1(8). – С. 1883-1886

4. Устименко Е. А. Бактериальные инфекции у тихоокеанских лососей при искусствен-ном воспроизводстве на камчатке // Автореф. дис. …канд. биол. Наук. – 2012. -22 с.

5. Barnes M.E. A Review of F�avoba�ter�um psy�hroph��um Biology, Clinical Signs, and Bacterial Cold Water Disease Prevention and Treatment /, M.E. Barnes, M.L. Brown//The �pen Fish Science Journal - 2011, 4 –P.1-9

6. Cipriano RC, Holt RA: F�avoba�ter�um psy�hroph��um, cause of Bacterial Cold-Water Disease and Rainbow Trout Fry Syndrome. Fish Disease Leaflet No. 86. United States Dept. of the


50

Interior, U.S. Geological Service, National Fish Health Research Laboratory, Kearneysville, WV 2005, 1-44

7. Ekman E. Natural and experimental infections with F�avoba�ter�um psy�hroph��um in salmonid fish. Ph.D. Thesis. Swedish University of Agricultural Sciences, Uppsala 2008

8. Groff JM, LaPatra SE. In: Lim CE, Webster CD. Nutrition and Fish Health New York: Haworth Press 2001; pp. 11-78

9. Hesami S, Allen KJ, Metcalf D, �stland VE, Maclnnes JI, Lumsden JS. Phenotypic and genotypic analysis of F�avoba�ter�um psy�hroph��um isolates from �ntario salmonids with bacterial coldwater disease. Can J Microbiol 2008; 54: 619-29.

10. Iida Y, Mizokami A. �utbreaks of coldwater disease in wild ayu and pale chub. Fish Pathol 1996; 31: 157-64.

11. Kumagai A. Bacterial coldwater disease in coho salmon. Journal of the Japanese Society of Fisheries Science 2005; 71: 645-649

12. Kum C, Kirkan S, Sekkin S, Akar F, Boyacioglu M. Comparison of in vitro antimicrobial susceptibility in F�avoba�ter�um psy�hroph��um isolated from rainbow trout fry. J Aquat Anim Health 2008; 20: 245-51.

13. Lee KB, Heo GJ. First isolation and identification of �ytophaga psy�hroph��a from cul-tured ayu Korea. Fish Pathol 1998; 33: 37-8.

14. Lehmann J., Mock D., Sturenberg F.J. & Bernardet J.F. (1991) First isolation of Cytophaga psychrophila from a systemic disease in eel and cyprinids. Diseases of Aquatic �rganisms 10, 217-220

15. León J, Ávalos R, Ponce M. F�avoba�ter�um psy�hroph��um and its pathology of alevins from the El Ingenio fish farm, Huancayo. Rev Peru Biol 2009; 15: 117-24.

16. Lorenzen E, �lesen NJ. Characterization of isolates of F�avoba�ter�um psy�hroph��um associated with coldwater disease or rainbow trout fry syndrome II: serological studies. Dis Aquat �rgan 1997; 31: 209-20.

17. Madetoja J., Nyman P. & Wiklund T. (2000) F�avoba�ter�um psy�hroph��um, invasion into and shedding by rainbow trout �ncorhynchus mykiss. Diseases of Aquatic �rganisms 43, 27-38

18. Madsen, L. Comparative studies of Danish F�avoba�ter�um psy�hroph��um isolates: ribotypes, plasmid profiles, serotypes and virulence / L. Madsen, I. Dalsgaard// J. Fish Dis. 2000. Vol. 23. P. 211-218

19. Miwa, S. Pathogenesis of experimentally induced bacterial cold water disease in ayu Plecoglossus altivelis /S. Miwa, C. Nakayasu // Dis. Aquat. �rg. 2005. Vol.67. P. 93-104

20. Nicolas P, Mondot S, Achaz G, Bouchenot C,Bernardet J-F, Duchaud E: Population structure of the fish-pathogenic bacterium F�avoba�ter�um psy�hroph��um. Appl Env Microbiol 2008, 74: 3702. PMID: 18424537

21. Nilsen H, �lsen AB, Vaagnes �, et al. Systemic F�avoba�ter�um psy�hroph��um infec-tion in rainbow trout �ncorhynchus mykiss (Walbaum) farmed in fresh and brackish water in Nor-way. J Fish Dis 2011; 34: 403-8.

22. Post GP. Textbook of fish health. New Jersey; T.F.H. Publications 198723. Schmidtke LM, Carson J. Characteristic of F�ex�ba�ter psy�hroph��us isolated from

Atlantic salmon in Australia. Dis Aquat �rgan 1995; 21: 157-6124. Sundell, K., and T. Wiklund. Effect of biofilm formation on antimicrobial tolerance of

F�avoba�ter�um psy�hroph��um. J Fish Dis 2011: 34: 373-8325. Taylor PW. Detection of F�avoba�ter�um psy�hroph��um in eggs and sexual fluids of

pacific salmonids by a polymerase chain reaction assay: implications for vertical transmission of bacterial coldwater disease. J Aquat Anim Health 2004; 16: 104-8.


51

26. Wakabayashi H, Toyama T, Iida T. A study on serotyping of �ytophaga psy�hroph��a isolated from fishes in Japan. Fish Pathol 1994; 29: 101-4.

ABOUT THE PROSPECTS OF PHAGES-DIAGNOSTICS OF FLAVOBACTERIOSIS OF FISH

Paramonova N.А., Viktorov D.А., Vasilev D.А., Zolotukhin S.N.

Key words: F�avoba�ter�um psy�hroph��um, ba�ter�a� �o��-water fish ��sease, ��agnos�s, treatment, prevent�on, ba�ter�ophages.

The paper prov��es a rev�ew of the pub��she� �ata of nat�ona� an� fore�gn authors, the prob�em of ��agnost��s, treatment an� prevent�on of ba�ter�a� �o��-water fish ��sease �ause� by F�avoba�ter�um psy�hroph��um �s �ons��ere�. The ana�ys�s po�nts to the urgen�y of the �eve�opment of metho�s phages-��agnost��s an� phagotherapy for the ment�one� ��seases of fish.

УДК 619:616.98:579.842.14

БАКТЕРИОФАГИ В БОРЬБЕ С САЛЬМОНЕЛЛЕЗОМ ПТИЦ

Пименов Н.В., доктор биологических наук, доцент,ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И.Скрябина», тел. 8(495)3778567, [email protected]

Ключевые слова: Бактериофаги, сальмонеллез птиц, ле�ение, оздоровление, препа-рат

В работе изложены результаты исследований по выделению активных бактериофа-гов и созданию препарата против сальмонеллеза птиц. Создание бивалентного бактериофага на основе Phagum Sa�mone��a typh�mur�um и Phagum Sa�mone��a enter�t��s, разработка техно-Phagum Sa�mone��a typh�mur�um и Phagum Sa�mone��a enter�t��s, разработка техно- Sa�mone��a typh�mur�um и Phagum Sa�mone��a enter�t��s, разработка техно-Sa�mone��a typh�mur�um и Phagum Sa�mone��a enter�t��s, разработка техно- typh�mur�um и Phagum Sa�mone��a enter�t��s, разработка техно-typh�mur�um и Phagum Sa�mone��a enter�t��s, разработка техно- и Phagum Sa�mone��a enter�t��s, разработка техно-Phagum Sa�mone��a enter�t��s, разработка техно- Sa�mone��a enter�t��s, разработка техно-Sa�mone��a enter�t��s, разработка техно- enter�t��s, разработка техно-enter�t��s, разработка техно-, разработка техно-логии его биологи�еского производства и успешная апробация фагового препарата открыва-ют новые перспективы в противоэпизооти�еской борьбе с сальмонеллезом.

Введение. Сальмонеллез птиц продолжает оставаться острой проблемой для ветери-нарной и гуманитарной медицины. По заключению экспертов Всемирной организации здраво-охранения сальмонеллез, как зоонозная инфекция, не имеет себе равных по сложности эпизо-отологии, эпидемиологии и трудностям борьбы с ней. В последние годы произошел серьезный дрейф в сторону развития у полевых штаммов сальмонелл множественной резистентности к антибиотикам. Латентно больные птицы (например, дикие и домашние голуби) могут являться причиной распространения опасного возбудителя и расширения границ эпизоотического оча-га, что в серьезной степени увеличивает социальную опасность [1].

Проблема антибиотикорезистентности актуализирует проблему переориентирования медикаментозных подходов при лечении сальмонеллеза от использования химиотерапевтиче-ских групп препаратов к применению других эффективных и менее опасных групп. Такими являются препараты, приготовленные на основе бактериофагов [2].


52

Материалы и методы, результаты исследований и их обсуждение. Для создания препарата бактериофагов против сальмонеллеза птиц нами по методу обогащения из сточных вод птицефабрик, пометных вод голубятен и зоопарков были выделены 39 изолятов Phagum Salmonella typhimurium. Изучили их происхождение, морфологию вирионов, морфологию ко- typhimurium. Изучили их происхождение, морфологию вирионов, морфологию ко-typhimurium. Изучили их происхождение, морфологию вирионов, морфологию ко-. Изучили их происхождение, морфологию вирионов, морфологию ко-лоний, активность, диапазон специфичности, спектр литической активности, что позволило отобрать, паспортизировать и депонировать производственные штаммы. Три наиболее актив-ных штамма – Ph. S. typhimurium №5 ТЗ, 8 МЕ, 9 ММ отличались высокими литическими каче-Ph. S. typhimurium №5 ТЗ, 8 МЕ, 9 ММ отличались высокими литическими каче-. S. typhimurium №5 ТЗ, 8 МЕ, 9 ММ отличались высокими литическими каче-S. typhimurium №5 ТЗ, 8 МЕ, 9 ММ отличались высокими литическими каче-. typhimurium №5 ТЗ, 8 МЕ, 9 ММ отличались высокими литическими каче-typhimurium №5 ТЗ, 8 МЕ, 9 ММ отличались высокими литическими каче- №5 ТЗ, 8 МЕ, 9 ММ отличались высокими литическими каче-ствами. Их литическая активность составляла 10-8-10-10 по методу Аппельмана и превосходила 107 по методу Грациа. При последующих исследованиях еще 15 бактериофагов тифимуриум паспортизированы в качестве резервных для препарата. У всех фагов отмечен максимальный спектр литического действия при специфичности литической активности к бактериям вида Salmonella enterica.

По морфологической структуре выделенные и селекционированные бактериофаги от-несены к 4 классификационной группе по Тихоненко, В1 морфотипу и семейству Siphoviridae.

Фаги 5 ТЗ и 8 МЕ обладали выраженным лизинообразованием. Кроме того, депони-рованные фаги обладали выраженными свойствами адсорбции на клетках хозяев. При этом наибольшие показатели скорости адсорбции – (4,96±0,05)х10-9 см3мин-1 и количества адсор-бировавшихся фаговых частиц – 91,7±0,25%, отмечены у бактериофага Ph. S. typhimurium №8 МЕ -ДЕП, который также наиболее интенсивно формировал литический фермент.

Проведение опытов одиночного цикла развития осуществляли в трех аналоговых по-вторностях согласно описанному методу Эллипса и Дельбрюкка на бульонных культурах де-понированных штаммов сальмонелл. Учет результатов проводили после инкубации по иссле-дованию посевов методом агаровых слоев, произведенных с интервалом в 2 минуты в течение 1 часа.

Отмечено, что среднее число негативных колоний в разведении 1:40 составляет 30-32 на протяжении 22 минут (фаг 5 ТЗ), с 26 минуты отмечается выраженный рост, на 28 минуте появляются негативные колонии в чашках, засеянных из разведения 1:100, и на 30 минуте про-является полный лизис колоний в посевах из второго разведения (1:40). Таким образом, конец латентного периода начинает проявляться на 24-25 минутах и стабилизируется за 8 минут. Т.е. у селекционированных фагов выявлен минимальный латентный период внутриклеточного раз-вития. Среднее число негативных колоний, полученных из разведения фага 1:100 – 132, значит, по окончании лизиса бактерий количество фаговых частиц составило 13200 в 0,1 мл материа-ла. Средняя урожайность фагов на одну бактериальную клетку также отмечена на достаточно высоком уровне для производственных штаммов – 185-206 фаговых частиц. Таким образом, проведенные исследования определили характеристики полученным нами сальмонеллезным фагам тифимуриум, которые удовлетворяют требованиям к производственным штаммам для создания лечебно-профилактических препаратов.

Для определения степени антигенного родства производственных штаммов мы прово-дили исследования серологических свойств фагов, получая к ним антисыворотки методом им-мунизации кроликов. Через 7-10 дней после последнего введения антигена у кроликов брали кровь из краевой вены уха и испытывали нейтрализующую активность антисывороток в разве-дениях 1:25-1:800. Если антисыворотка вызывала нейтрализацию свыше 90 % фаговых частиц при пятиминутном контакте, то ее активность считали приемлемой для дальнейшей работы.

Полученные гипериммунные сыворотки на производственные штаммы бактериофа-гов проявляли нейтрализующую активность в разведениях 1:50-1:400. Константы скорости нейтрализации фагов с гомологичными антисыворотками составили 240,21-270,26 мин-1, с ге-терологичными антисыворотками – 124,42-163,67 мин-1. Т.о. было установлено, что штаммы


53

Ph. S. typhimurium №5 ТЗ, 8 МЕ, 9 ММ являются родственными и обладают выраженной им-муногенностью.

Принимая во внимание этиологическую структуру возбудителей сальмонеллеза для разных видов птиц, было отмечено, что S. enteritidis – доминирующий этиотропный серова-риант для кур, второй из значимых (хотя и в принципиально меньшем соотношении) возбуди-телей сальмонеллеза голубей, некоторых декоративных и водоплавающих птиц. Кроме того, серовариант S. enteritidis является основным возбудителем пищевых токсикоинфекций у чело-века [3]. Сальмонеллоносительство у водоплавающих, синантропных, вольерных птиц с уча-стием S. enteritidis довольно широко распространено, что отмечено нашими наблюдениями и исследовательскими данными [4].

Для создания бивалентного бактериофага против сальмонеллеза птиц были исполь-зованы фаги к S. enteritidis, выделенные нами при исследовании по методу обогащения 52 проб птицефабрик и депонированные нами совместно с С.В. Леневым и Ю.А. Малаховым в качестве производственных – Ph. S. enteritidis А-1, ЮН-1, ЮН-2. Их характеризует литическая активность к эталонному штамму S. enteritidis №3-2 ВГНКИ по методу Аппельмана 10-9-10-10, специфичность и широкий спектр литического действия.

Бивалентный бактериофаг против сальмонеллеза птиц готовили, производя высев в разные емкости с предварительно нагретым до 37 °С разведенным 1:5 МПБ суспензий 6-ча-совой культуры штамма Salmonella typhimurium М-2ф t-ДЕП и фильтрата каждого из бакте-риофагов: Ph. S. typhimurium №5 ТЗ, 8 МЕ, 9 ММ, а также суспензий 6-часовой культуры S. enteritidis 25 Яв e-ДЕП и фильтрата каждого из бактериофагов Ph. S. enteritidis А-1, ЮН-1, ЮН-2.

Фаговый препарат готовили поэтапно. Культивирование фагов на молодых культурах сальмонелл проводили 18 часов, после чего осуществляли очистку биологического препарата бактериофагов от биологической массы сальмонелл, остатков клеток и компонентов питатель-ной среды.

Следующим этапом осуществляли центрифугирование при 6000 об./мин. в течение 30 минут, фильтрацию через системы бактериальных фильтров Шамберленда и приготовле-ние концентрированной суспензии бактериофагов. В качестве контроля служили отсутствие роста при посеве суспензии бактериофагов в разведенный МПБ и рост сальмонеллы без фагов по выраженной мутности питательной среды. Концентрированную суспензию бактериофагов контролировали по методу Аппельмана, доводя концентрацию до уровня 108 фаговых частиц в 1 см3 среды.

В качестве консерванта приготовленной суспензии фагов применяли раствор хинозо-ла до его конечной концентрации в фаголизате – 0,01%. Готовый препарат формировали сме-шиванием консервированных суспензий бактериофагов в соотношении 1:1:1:1:1:1, после чего проводили расфасовку, упаковку, маркировку и контроль препарата бивалентный бактериофаг против сальмонеллеза птиц.

Контроль экспериментальных серий препарата на стерильность осуществляли высе-вом на МПА, в МПБ, среды Китта-Тароцци и Сабуро.

Отмечены высокие результаты при постановке контролей на активность бивалентного бактериофага, осуществленных на белых мышах и голубях при подкожном инфицировании, для чего лабораторным объектам внутримышечно вводили культуры S. typhimurium M-2ф t -ДЕП (1 группа), S. enteritidis 25 Яв e -ДЕП (2 группа) в дозах по 5 LD50 и смесь культур по 2,5 LD50 (3 группа), а спустя 20 минут – препарат. Наблюдение и учет заболевших и павших голу-бей с бактериологическим исследованием проводили в течение 14 дней.

Результаты исследования активности бивалентного бактериофага против сальмонел-


54

леза птиц в остром лабораторном опыте на мышах и голубях показали их сохранность 90-100 % при сохранности в контрольных группах без фагообработки – 0-10 %. При этом единичные летальные случаи в опытных группах могли быть спровоцированы высокой дозой экзо- и эн-дотоксинов введенных сальмонелл, т.к. гибель по 1 голубю отмечали в первые 1-2 суток после начала эксперимента при введении S. enteritidis или смеси с ее присутствием. Причем от по-S. enteritidis или смеси с ее присутствием. Причем от по-. enteritidis или смеси с ее присутствием. Причем от по-enteritidis или смеси с ее присутствием. Причем от по- или смеси с ее присутствием. Причем от по-гибших голубей в опытных группах сальмонеллу не выделяли, при этом в контроле ее выделя-ли из материала, как от трупов, так и от клинически здоровых голубей.

Препараты сальмонеллезных фагов: как в моноисполнении, так и в виде бивалентно-го бактериофага против сальмонеллеза птиц, способы их производства и применения были успешно апробированы в условиях птицеферм, голубятен, зоопарков, частных подворий и во-льеров для содержания птиц различных видов, неблагополучных по сальмонеллезу.

Основываясь на представленных материалах, Бактериофаг тифимуриум против саль-монеллеза голубей, бивалентный бактериофаг против сальмонеллеза птиц и способ лечения сальмонеллеза птиц при помощи этих препаратов были внедрены в практику и рекомендова-ны ветеринарным специалистам. Препарат против сальмонеллеза голубей и способ лечения сальмонеллеза голубей запатентованы. Фаговые препараты рекомендованы для борьбы с саль-монеллезом птиц, что нашло отражение в одобренных Департаментом ветеринарии МСХ РФ «Рекомендациях по диагностике, профилактике и ликвидации сальмонеллеза кур» [5], «Реко-мендациях по диагностике, профилактике и ликвидации сальмонеллеза голубей» [6].

Заключение. Резюмируя вышеизложенное необходимо отметить, что возвращение препаратов на основе активных бактериофагов в практику ветеринарной медицины при борьбе с сальмонеллезом птиц является перспективным направлением противоэпизоотической рабо-ты, особенно в условиях множественной антибиотикорезистентности возбудителя и ограничи-тельных требований по применению химиотерапевтических препаратов для профилактики и лечения болезней в птицеводстве.

Библиографический список1. Данилевская В.Н., Пименов Н.В. Проблема антибиотикорезистентности на примере

лечения сальмонеллеза у домашних голубей//Российский ветеринарный журнал, 2005, №4, с. 21-24.

2. Ленев С.В. Сальмофаг энтеритидис//Состояние, проблемы и перспективыразвития ветеринарной науки в России: Сб. мат-лов науч. сессии РАСХН/ Под ред. А.М. Смирнова. – М.: РАСХН, 1992, с. 258-259.

3. Михаэль А. Сальмонеллез – вопросы и ответы?//Сб. докладов VI Междунар. вет. конгресса по птицеводству, 26-29 апреля 2010, М., 2010, с . 114-121.

4. Кузьмин В.А. Сальмонеллезная инфекция в условиях птицефабрик, методы профи-лактики и оздоровления: Автореф… дис. докт. вет. наук. – СПб: СПбГАВМ, 1995, 16 с.

5. Куриленко А.Н., Пименов Н.В., Ленев С.В., Малахов Ю.А., Яковлев С.С. Рекоменда-ции по диагностике, профилактике и ликвидации сальмонеллеза кур. – М.: МСХ-МГАВМиБ, 2002, 34 с.

6. Пименов Н.В., Куриленко А.Н., Чиркова И.В., Яковлев С.С. Рекомендации по диа-гностике, профилактике и ликвидации сальмонеллеза голубей. – М.: МСХ; «МегАрт», 2008, 43 с.


55

BACTERIOPHAGES AGAINST AVIAN SALMONELLOSIS

Pimenov N.V.

Key words: ba�ter�ophages, sa�mone��a b�r�s, treatment, rehab��tat�on, me��ne

The art��e presents the resu�ts of resear�h on the re�ease of the a�t�ve ba�ter�ophages an� the �reat�on of me��ne aga�nst sa�mone��a b�r�s. �reat�ng a b�va�ent ba�ter�ophage base� on Ph. S. typh�mur�um an� Ph. S. enter�t��s, the �eve�opment te�hno�ogy of �t’s b�o�og��a� pro�u�t�on an� su��essfu� test�ng of phage preparat�ons open new prospe�ts �n ant�ep�zoot�� aga�nst sa�mone��a.

УДК 576.9+579.842./4.598.2/.9

ИССЛЕДОВАНИЕ ФАРМАКОКИНЕТИКИ САЛЬМОНЕЛЛЁЗНЫХ БАКТЕРИОФАГОВ В ОРГАНИЗМЕ ЦЫПЛЯТ КРОССА ИЗА

Пугачев В.Г., заведующий сектором; Тотменина О.Д., научный сотрудник; Тимакова О.И., инженер; Агиенко А.И., студентка ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», р.п. Кольцово, Новосибирской областител. 8(383)363-47-79, [email protected]Юшков Ю.Г., кандидат ветеринарных наук; Леонов С.В., научный сотрудник; Селиверстова Н.А., младший научный сотрудникГНУ ИЭВСиДВ Россельхозакадемии, п. Краснообск, Новосибирской областител. 8(383)348-39-31, [email protected]

Ключевые слова: бактериофаг, сальмонелла, птицеводство, фаготерапия.В работе исследовали распределение бактериофагов по органам и тканям цыпленка

при выпаивании суспензии бактериофага здоровым птицам и инфицированным сальмонеллой. Результаты исследования показали, �то фаги быстро распространяются по органам цы-плёнка при оральном введении и постепенно выводятся в отсутствие бактерий для размно-жения. Через 20 �асов фаговые �астицы остаются только в кише�нике. В слу�ае заражения сальмонеллой бактериофаги концентрируются и размножаются в тканях пе�ени, в селезенке и в кише�нике. Зна�ительное увели�ение концентрации бактериофага к 20 �асам показывает, �то в органах идет размножение на специфи�ных бактериях патогена.

В настоящее время бактериофаги находят широкое применение в медицине, ветерина-рии и биотехнологии. Узкая специфичность действия на бактериальную микрофлору, способ-ность избирательно воздействовать на патогенные микроорганизмы, позволяет использовать их для диагностики, профилактики и лечения человека, животных и птиц.

Возникновение антибиотикорезистентных штаммов микроорганизмов предполагает поиск новых препаратов для борьбы с ними. Современные лечебно-профилактические препа-раты бактериофагов составлены из вирулентных фагов широкого диапазона действия, актив-ных и в отношении бактерий, устойчивых к антибиотикам.

Спектр негативного влияния применения антибиотиков в сельском хозяйстве настоль-ко широк (аллергенность, токсичность, селекция антибиотикорезистентных штаммов), что


56

правительства ряда стран с 1998г проводят политику, направленную на максимальное ограни-чение, а в перспективе – и на полный запрет применения антибиотиков в сельском хозяйстве. [1]

Появление антибиотикорезистентных штаммов микроорганизмов привело к неэф-фективности лечения бактериальных болезней у животных, к увеличению заболеваемости и смертности и, как следствие, к продолжительному бактерионосительству. Антибиотикорези-стентность появляется у многих видов возбудителей, в том числе таких как Escherichia coli, Salmonella, Staphylococcus.[2] В связи с ограничениями, вводимыми на применение антибио-тических препаратов, еще более актуальным является вопрос о включении бактериофагов в противоэпизоотические мероприятия в промышленном птицеводстве. Поэтому в ветеринар-ной практике все более широкое применение находят экологически безопасные методы ле-чения, которые в комплексе с другими лечебными мероприятиями часто дают более высокий терапевтический эффект. К последним относят и бактериофаготерапию.[3]

Значительная доля всех инфекционных болезней в птицеводстве приходится на болез-ни бактериальной этиологии. На первом месте стоит колибактериоз (49%), а затем микоплаз-моз, сальмонеллез (25%), пастереллез.[4, 5, 7].

Целью настоящей работы явилось изучение распределения бактериофагов по органам и тканям цыпленка при выпаивании суспензии бактериофага здоровым птицам и инфициро-ванным сальмонеллой.

Материалы и методы. В работе использовали бактериофаги – Ps-1 и Ps-2, выделен-Ps-1 и Ps-2, выделен--1 и Ps-2, выделен-Ps-2, выделен--2, выделен-ные из стоков и напольной подстилки птицефабрики и селектированные на штаммах №465 и №105.[6,8] Штаммы сальмонелл - Salmone��a enter�t��s - №465 и Salmone��a ga��narum - №105 – выделены и охарактеризованы в лаборатории болезней птиц ГНУ ИЭВСиДВ.

Бактериофаги Ps-1 и Ps-2 размножали на специфичных штаммах №465 и №105, лиза-Ps-1 и Ps-2 размножали на специфичных штаммах №465 и №105, лиза--1 и Ps-2 размножали на специфичных штаммах №465 и №105, лиза-Ps-2 размножали на специфичных штаммах №465 и №105, лиза--2 размножали на специфичных штаммах №465 и №105, лиза-ты были очищены фильтрованием. Литическую активность проверяли на ряде коллекционных штаммов.

Суспензию бактериофагов с концентрацией 108б.о.е./мл выпаивали 3-х суточным цы-плятам в количестве 2-3 × 108б.о.е. В контрольную партию входили здоровые цыплята, а опыт-ная партия состояла из цыплят, предварительно инфицированных штаммами сальмонелл.

Органы забирали через 2, 4, 6, 8 и 20 часов после выпаивания суспензии фагов. Далее ткани взвешивали, гомогенизировали и суспендировали в физиологическом растворе. Полу-ченную суспензию высевали на агаризованные питательные среды для проверки на наличие сальмонелл, к оставшейся суспензии добавляли хлороформ (2%), осветляли центрифугирова-нием и аликвоты раскапывали на агар из чувствительной культуры. Чашки инкубировали при 370С, 20 часов.

Таблица 1 - Специфичность выделенных фагов к коллекционным и лаборатор-ным штаммам микроорганизмов.

Штаммы микроорганизмов БактериофагиPs-1 Ps-2

Sa�mone��a typh�mur�um B-581 лизис лизисSa�mone��a enter�t��s DS – 1 лизис нетSa�mone��a enter�t��s DS – 3 лизис нетSa�mone��a 1 №105 лизис лизисSa�mone��a ga��narum №465 лизис нетSh�ge��a B - 582 лизис лизисEs�her��h�a �o�� AB - 259 нет нетEs�her��h�a �o�� B - 34 нет нет


57

Результаты. В процессе работы были выделены два бактериофага, специфичных штаммам сальмонелл №465 и №105. Литическая активность бактериофагов проверяли на кол-лекционных штаммах. В таблице 1 показано, что бактериофаги Ps-1 и Ps-2 имеют достаточно узкую специфичность.

Штаммы сальмонелл №465 и №105 проверили на чувствительность к антибиотикам. Результаты представлены в таблице 2.

Исследование органов цыплят контрольной группы показало, что уже через 2 часа фа-говые частицы распределяются по тканям печени, селезенки и кишечника. В пробах, отобран-ных через 4, 6 и 8 часов, также найдены фаговые частицы в кишечнике и печени, к 20 часам фаг остается только в кишечнике и обнаружен лишь у одной особи из двух.

При исследовании органов цыплят экспериментально инфицированных штаммами сальмонелл и пропоенных суспензией бактериофага мы наблюдали несколько иную картину. В первых пробах (2 часа и 4 часа) при использовании 1 модели: штамм №105 – РS-2 – фага не обнаружено, а в модели 2: штамм №465 – РS-1 – количество фага в органах значительно меньше по сравнению с контрольными образцами. Однако к 20 часам картина кардинально меняется: в модели 1 наблюдается накопление фаговых частиц во всех исследуемых органах до концентрации 5-7 × 104 б.о.е./г ткани, а в модели 2 - найдены во всех исследуемых органах,

Таблица 2 - Чувствительность выделенных штаммов к антибиотикам.

Наименование препаратов №105 (мм) №465 (мм)

Гентамицин (10мкг) 22 25Канамицин (30мкг) 20 17Спектиномицин (100мкг) - 16Амоксициллин (20мкг) 21 24Норфлоксацин (10мкг) 22 26Энрофлоксацин (5 мкг) - 21Офлоксацин (5мкг) 18 22Ципрофлоксацин (5мкг) - -Флорфеникол (30мкг) - 22Линкомицин(15мкг) - -Левомицетин (30мкг) 21 22Полимиксин (300ЕД) 18 17

Таблица 3 - Распределение бактериофагов по органам цыплят.Органы

цыплёнкаКол-во бактерифагов в органах (б.о.е./г)

2 часа 4 часа 6 часов 8 часов 20 часовКонтрольная группа птиц

кишечник 103 103 7,0 × 103 103 4,0 × 102

печень 102 53 10 10 -селезёнка 102 - - - -

Группа птиц предварительно инфицированная РS-2 (модель1)кишечник - - 3,0 × 102 4,0 × 103 6,2× 104

печень - - - 103 2,0 × 104

селезёнка - - - 102 2,6 × 103

Группа птиц предварительно инфицированная РS-1 (модель2)кишечник 102 102 102 3,6 × 102 2,0 × 104

печень - - 102 3,0 × 102 3,0× 103

селезёнка - - - 40 80


58

но с меньшей концентрацией - до 1-3 × 104 б.о.е./г. Результаты представлены в таблице 3.Заключение. При введении препарата бактериофага цыплятам методом выпаивания

бактериофаг обнаруживается в органах цыплёнка через 2 часа, постепенно выводится из тка-ней органов и через 20 часов остаётся только в кишечнике. При заражении птицы сальмо-неллой бактериофаги концентрируются и размножаются в тканях печени, в селезенке и в ки-шечнике. Значительное увеличение концентрации бактериофага к 20 часам показывает, что в органах идет размножение на специфичных бактериях патогена.

Библиографический список1. Скобликов Н.Э. КубГАУ, №78(04), 2012г.2. Антибиотикорезистентность сальмонелл, выделенных у домашних голубей / Н.В.

Пименов, Н.В. Данилевская. - // Ветеринария. - 2006. - № 9. - С.20-24.3. Бактериофаги: биология и практическое применение / под ред. Э. Каттер, А. Сулак-

велидзе. – М.: Научный мир, 2012. –640 с.4. Бобылева Г.А. Состояние и перспективы развития отрасли птицеводства// VI Межд.

ветер. конгр. по птицев.(апрель 2010 г., М.).-М., 2010.- С.7-14.5. Мельникова А.А. III Межд. Ветер. Конгр. по птицев, (апрель 2007г), Москва.6. Методики клинических лабораторных исследований: Справочное пособие. Том 3.

Клиническая микробиология / под ред. В.В. Меньшикова. – М.: Лабора, 2009. – 880 с.7. Эпидемиологический надзор за сальмонеллезной инфекцией. Методические реко-

мендации (Рачковская Ю.К., и др.) – Л., 1987.- 26 с.8. Цыганова C.B. Выделение бактериофагов против возбудителей бактериальных бо-

лезней птиц и изучение их биологических свойств: авт. дисс. канд. вет наук.- СПб, 2009. - 23 с.

PHARMACOKINETIC STUDIES OF SALMONELLA PHAGES IN CHICKEN CROSS AZI

Pugachev V.G., Totmenina O.D., Timakova O.I., Agienko A.I., Leonov S.V., Seliverstova N.A., Yushkov Yu.G.

Key words: ba�ter�ophage, Sa�mone��a, pou�try, phagotherapyThe stu�y �nvest�gate� the ��str�but�on of phages to organs an� t�ssues of a �h��ken

after un�nfe�te� an� �nfe�te� w�th Sa�mone��a b�r�s were fe� w�th a suspens�on of ba�ter�ophage. The resu�ts showe� that the phages �an qu��k�y sprea� to organs of �h��ken w�th the ora� way of �ntro�u�t�on an� gra�ua��y ��sappear �n the absen�e of ba�ter�a to mu�t�p�y. After 20 hours phage part��es rema�n on�y �n the �ntest�nes. In the �ase of �nfe�t�on w�th Sa�mone��a ba�ter�ophages are �on�entrate� an� mu�t�p�y �n the t�ssues of the ��ver, the sp�een, an� �n the �ntest�nes. A s�gn�fi�ant �n�rease �n the �on�entrat�on of ba�ter�ophage to 20 hour shows that mu�t�p��at�on of phages �n the spe��fi� pathogen ba�ter�a w�th�n the organs of �nfe�te� �h��kens �s o��urre�.


59

CREATING A WWWW COLLECTION OF THERAPEUTIC BACTERIOPHAGES ACTIVE AGAINST GLOBAL

BACTERIAL INFECTIONS

Rakin A., Max von Pettenkofer-Insititut, LMU, Munich, Germany

Bacteriophages are natural predators of bacteria also those pathogenic to humans. Phages outnumber bacteria at least tenfold and are the most abundant life form on the Earth. Typically phages are highly specific and demonstrate narrow host ranges oftheir lytic activity restricted to single bacterial clones. Phages together with the sensitive bacteria form predator-prey pairsinevolutionary arms racethat tends to keep the populations of both species in unbalanced equilibrium. Thus phages and bacteria must have a history of previous contacts and interactions and physically close to each other. Accordinglyphages isolated in certainplaces may not be active against bacterial strains isolated from the other locations simply due to the fact that they do nothave such a history of previous interactions. �n the other hand, if bacteria from one part of the globe are successfully attacked by the phages isolated from the other part, this meanseither a global dissemination of the bacterial-phage pair or an extremely wide phage host range due to commonly used receptors.

We have tested the sensitivity of 65 clinical bacterial pathogens including MRSA, multiple resistant Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumanii and Klebsiella pneumoniae, carbapenem resistant Escherichia coli and Enterobacter cloacae, as well as vancomycin resistant Enterococcus faecium isolated in Singapore hospitals against a collection of the corresponding resident bacteriophages isolated from the waste waters of Munich. Although some specieslike MRSA and Pseudomonas demonstrated 80% and 90% sensitivity to the locally isolated phage preparations, respectively; 80% Kl. pneumonia and 80% E. coli were resistant to the corresponding phages. Moreover all tested Acinetobacter and E. cloacae strains were resistant to the phages previously isolated in Germany.

We have used different water samples from Munich waste water collectors to isolate phages active against the phage-resistant bacteria isolated in Singapore. We have successfully isolated lytic phages to the representatives of each group of the pathogenic bacteria. The phages demonstrated different host ranges and activities. The DNAs of the collected lytic bacteriophages were NG sequenced, their genomes assembled and compared to the phage DNAs presented in the available public databases. Such detailed characterization of the therapeutic bacteriophages allow us covering both potential threats present in the phage genomes and epidemiological and evolutionary linkages of these abundant life forms.

Thus, Munich waste waters already contain phages active against bacterial cultures isolated in Singapore hospitals that make it possible to establish a representative well characterized “world-wide” collection of therapeutic bacteriophages active against both locally and globally disseminated pathogenic microorganisms.


60

УДК 579.842.23:578.1:575.25

МОЛЕКУЛЯРНОЕ ТИПИРОВАНИЕ (RAPD-АНАЛИЗ) ДНК-СОДЕРЖАЩИХ БАКТЕРИОФАГОВ ПАТОГЕННЫХ ИЕРСИНИЙ

Романова Л.В., доктор биологических наук, с.н.с., [email protected]Мишанькин Б.Н., доктор медицинских наук, вед.н.с.Кудрякова Т.А., доктор медицинских наук, вед.н.с., Бородина Т.Н., Македонова Л.Д., Гаевская Н.Е., Качкина Г.В.ФКУЗ Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора

Ключевые слова: ДНК-содержащие бактериофаги, универсальные праймеры, одно-праймерная �ЦР (RAPD-анализ), генотипи�еская характеристика бактериофагов иерсиний

�оказана возможность применения метода О�-�ЦР (RAPD-анализ), для генотипи-�еской характеристики ДНК-содержащих бактериофагов патогенных иерсиний. �одбор оп-тимального набора праймеров будет способствовать углубленному анализу фагов на межви-довом и внутривидовом уровнях.

Введение. Одной из основных проблем медицинской микробиологии, имеющей те-оретическое и практическое значение, является разработка новых методов диагностики и дифференциации возбудителей бактериальных и вирусных инфекций, которые позволили бы установить источник инфекции, изучить механизмы и пути передачи возбудителя, резервуары и ареалы его распространения. Использование в эпидемиологическом анализе рутинных ме-тодов диагностики и типирования возбудителей, основанных на выявлении фенотипических признаков, часто неэффективно. Тогда как молекуляро-биологические методики позволяют надежно устанавливать степень гомологии или, наоборот, расхождения между отдельными микроорганизмами. Открытие ПЦР [1], ее внедрение в практику микробиологических и осо-бенно эпидемиологических исследований внесли огромный вклад информации в этой области. Обычно классический метод ПЦР предусматривает амплификацию ДНК с использованием 2 специфических олигонуклеотидных праймеров. Однако, существует и другой способ ампли-фикации ДНК в ПЦР, это так называемая однопраймерная ПЦР (ОП-ПЦР) с использованием универсальных, или случайных (random), праймеров. В зарубежной литературе этот способ амплификации обозначают - RAPD (random amplified polymorphic DNA) [2,3,4,5,6]. Каждые из выбранных праймеров или их комбинация дают возможность обнаружить специфические микролокусы в геноме изолята, которым свойственна различная степень нуклеотидной измен-чивости на внутри - и межвидовом уровне.

Классификация бактериофагов на данном этапе является сложным и одним из наибо-лее трудных разделов современной биологии, так как бактериальные вирусы имеют эволюци-онно выработанные, присущие им структурные и биологические особенности. Современный этап развития систематики бактериофагов характеризуется расширением круга таксономиче-ских подходов, созданием системы, основанной на данных молекулярной биологии. Поэтому для повышения достоверности при выявлении тонких внутривидовых различий между фагами может оказаться полезным использование новых молекулярно-биологических методических приемов.

Материалы и методы исследований. В своих исследованиях по генотипированию возбудителей особо опасных заболеваний и их бактериофагов мы использовали преимуще-ственно однопраймерный вариант ПЦР и следующий набор универсальных праймеров: Ap7


61

– GTG GAT GCG A [7], 45 – TGA CCG GCA GCA AAA TG [3], 2 –ATT GCG TCC A [8], pUC/M13 [9].

Исследовали ДНК следующих бактериофагов: 1030, 1055 (выделены из Y.pestis), 12253, 10623, 2339 (выделены изY.pseudotuberculosis), 5531, 43, 12374, 826, 1998, 5423, 19 (вы-Y.pseudotuberculosis), 5531, 43, 12374, 826, 1998, 5423, 19 (вы-.pseudotuberculosis), 5531, 43, 12374, 826, 1998, 5423, 19 (вы-pseudotuberculosis), 5531, 43, 12374, 826, 1998, 5423, 19 (вы-), 5531, 43, 12374, 826, 1998, 5423, 19 (вы-делены изY.enterocolitica). ДНК фагов изолировали, как описано [10]. Качество нативной ДНК и резуль таты ПЦР контролировали электрофорезом в 5 %-ном полиакриламидном геле в ап-парате для элект рофореза типа «Midget» (Hoefer Scientific Instrument, США) в присутствии маркеров, представляющих собой смесь MspI-гидролизата плазмидной ДНК pUC19 и PstI-гидролизата ДНК фага l.

Амплификацию проводили на амлификаторе «Терцик» производства «ДНК-Технология» (Москва) в следующем режиме: 940С (денатурация) - 15 сек; 420С (отжиг) – 20 сек; 720С (синтез) – 15 сек (всего 40 циклов). Инкубационная смесь (15мкл) для ПЦР содержа-ла 20 mM трис-HCl, рН 8,6; 7mM MgCl2; 10 mM (NH4)2S�4; 0,5mM EDTA; 100 мкг/мл бычьего сывороточного альбуми на, по 250 мкМ каждого из дезоксинуклеозидтрифосфатов (Serva), 0,1-1 мкМ соответ ствующего праймера, 2 ед. Taq-полимеразы и 1-10 нг ДНК исследуемого фага.

Результаты исследований и их обсуждение. Исследования показали, что использо-ванные праймеры оказались способны амплифицировать последовательности хромосомной ДНК исследуемых бактериофагов и образовывать ПЦР - профили в виде фрагментов ДНК количеством от 15 до 2 и размером от 1650 до 170 п.н. (Рис.1,2).

При использовании праймера АР7 (Рис.1) наблюдали следующее: картины распреде-ления фрагментов ДНК чумных и псевдотуберкулезных фагов очень похожи как по их числу (примерно 11-12, в диапазоне 1650-100 п.н.), так и по интенсивности свечения полос. Имеются небольшие различия в картине амплификации ДНК псевдотуберкулезных фагов – у фага 10623 нет одной из сдвоенных полос в районе 690 п.н., присутствующей у фагов 12253 и 2339. Что касается амплификации ДНК фагов Y.enterocolitica, то для каждого вида наблюдали свою ему присущую картину распределения фрагментов. Диапазон полос распределялся от 1450 до 186 п. н. с различной интенсивностью свечения.

1 2 3 М1 4 5 М 1 6 7 8 9 10 11 12

Рис. 1. Амплификация ДНК бактериофагов патогенных видов иерсиний с прай-мером АР7: М –маркер молекулярных весов (М1 – Bg� I-гидролизат ДНК фага λ); дорожка 1 –ДНК фага12253; 2 -10623; 3 -2339 (выделены из Y.pseu�otuber�u�os�s); 4 - 1030; 5 -1055 (выделены из Y.pest�s); 6-5531; 7-43; 8-12374; 9-826; 10-1998; 11-5423; 12- 19 (выделены изY.entero�o��t��a).


62

При использовании в амплификации праймера 45 (Рис.2) ДНК псвдотуберкулезных фагов давала большее количество ампликонов, чем в случае Ар7 – их было 14-15. Картина ам-плификации у трех изученных видов почти одинаковая с небольшими различиями по минор-ным полосам, кроме того у фага 10623 наблюдали сдвоенную интенсивно светящуюся полосу в районе 500 – 400 п.н. Картина распределения ампликонов чумных фагов резко отличалась от таковой как для псевдотуберкулезных фагов, так и внутри вида. Ампликон фага 1030 отличал-ся от ампликона фага 1055 по следующим признакам – у 1055 наблюдаются мощные полосы в районе 780 и 404 п.н., у 1030 присутствует фрагмент размером 1140 п.н., которого нет у 1055, также у 1030 имеются минорные полосы в районе 210 и 186 п.н., которых нет у ДНК фага 1055. Амликоны ДНК фагов выделенных от Y.enterocolitica сильно отличаются от амликонов чумных и псевдотуберкулезных фагов (как по картине распределения фрагментов, так и по ин-тенсивности свечения полос). Каждый фаг внутри вида имеет свою индивидуальную картину распределения полос. Например, у фага 5429 наблюдали только одну мощную полосу в районе 1140 п.н., а у фага 19 фрагментов было 10 в диапазоне 1250-210 п.н.

1 2 3 4 5 6 7 М1 8 9 10 М 11 12 М2

Рис. 2. Амплификация ДНК бактериофагов патогенных видов иерсиний с прай-мером 45: М –маркер молекулярных весов (М1 – Bg� I-гидролизат ДНК фага λ, М2- H�n�III- ги-H�n�III- ги-- ги-дролизат ДНК фага λ); дорожка 1-5531; 2-43; 3-12374; 4-826; 5-1998; 6-5423; 7- 19 (выделены изY.entero�o��t��a); 8–ДНК фага12253; 9 -10623; 10 -2339 (выделены из Y.pseu�otuber�u�os�s); 11 - 1030; 12 -1055 (выделены из Y.pest�s).

Амплификация с праймером 2 и pUC/M13 (данные не представлены) выявила та-pUC/M13 (данные не представлены) выявила та-/M13 (данные не представлены) выявила та-M13 (данные не представлены) выявила та-13 (данные не представлены) выявила та-кие же различия между чумными, псевдотуберкулезными фагами и фагами, выделенными из Y.enterocolitica. Чумные и псевдотуберкулезные фаги сильно отличаются по числу амплифи-.enterocolitica. Чумные и псевдотуберкулезные фаги сильно отличаются по числу амплифи-enterocolitica. Чумные и псевдотуберкулезные фаги сильно отличаются по числу амплифи-. Чумные и псевдотуберкулезные фаги сильно отличаются по числу амплифи-цированных фрагментов (у первых их много меньше -4-5 к 10-11). Кроме того, псевдотуберку-лезные фаги 12253 и 10625 отличаются от фага 2339 по числу ампликонов – у последнего их больше -11.

Заключение. Таким образом, проведена генотипическая характеристика (паспорти-зация) каждого из изученных изолятов и выявлены различия на видовом и внутривидовом уровнях, которая проявляется в различной картине ПЦР ампликонов. Исследование показа-ло возможность применения ОП-ПЦР для углубленной генотипической характеристики ДНК бакте риофагов различных видов патогенных иерсиний, что, возможно, позволит уточнить так сономию ряда новых фагов, имеющих сходный цикл развития, морфоло гию и антигенную структуру, и предложить новый подход к их класси фикации и идентификации. Дальнейшие исследования по генотипированию фагов с использованием праймеров различной длины будут


63

способствовать подбору оптимальных вариантов набора праймеров для проведения углублен-ного анализа фагов на межвидовом и внутривидовом уровнях.

Библиографический список1. Mullis K.B., Faloona F.A. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed

chain reaction // Methods Enzymol. - 1987. - Vol.155. - P. 335-350.2. Williams J.G.K., Kubelik A.R., Livak K.J. et al. DNA polymorphisms amplified by arbi-

trary primers are useful as genetic markers // Nucl. Acids Res. - 1990. - Vol.18. - P. 6531-6535.3. Булат С.А., Кабоев О.К., Мироненко Н.В. Полимеразная цепная реакция с универ-

сальными праймерами для изучения геномов // Генетика. - 1992. -Т. 28, №5. - С. 19-28.4. Lin M., Payhe D.A., Schwaez J.R. Intraspecific divercity of Vibrio vulnificus in Galveston

Bay wate and �uster as determined by randomly amplified polymorphic DNA PCR // Appl. Environ. Microbiol. - 2003. - Vol.69, N.6. - P. 3170-3175.

5. Лукин Е.П., Воробьев А.А., Малеев В.В., Быков А.С.Лукин, Е.П. Молекулярно-ге-нетическое разнообразие риккетсий // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 2006. - №1. - С. 92-99.

6. Викторов Д.В., Захарова И.Б., Меринова Л.К., Алексеев В.В. Молекулярное типи-рование штаммов Burkholderia pseudomallei с различной чувствительностью к антибиотикам // Мол. генет., микробиол. и вирусол. - 2006. -№1. - С. 7-11.

7. Marticocian G., van Belkum W., van Lecuwen А. et al. PCR ribotyping and arbitrarily primed PCR for the comparison of enterotoxigenic Bacteroides fragilis strains from two Polish uni-versity hospital // Clinic.Microbiol. Infect.- 1997.- Vol.3.- N.1.- P.102-106.

8. Berche P., Poyart C., Abachin E. et al. The novel epidemic strain �139 is closely related to the pandemic strain �1 of Vibrio cholerae // J. Infect. Dis. -1994. - Vol.170. - N.3. - P. 701-704.

9. Валидов Ш.З., Панькова Н.В., Козлова Е.В. и др. Схема быстрого выделения и идентификации Lactobacillus plantarum с использованием НП-ПЦР// Микробиология.-1998.-Т.67,№3.-С.384-390.

10. 10. Yamamoto K.R., Alberts B.M., Berzinger R., Lawhorne L., Treiber G. Rapid bacte-10. Yamamoto K.R., Alberts B.M., Berzinger R., Lawhorne L., Treiber G. Rapid bacte-riophage sedimentation in the presence of polyethylene glycol and its application to large-scale virus purification // Virology. - 1970. - Vol.40, N.3. -P. 734-744.

MOLECULAR TYPING (RAPD-ANALISIS) OF PATOGENIC YERSINIA DNA-CONTAININGE BACTERIOPHAGES

Romanova L.V., Mishankin B.N., Kudriakova T.A., Borodina T.N., Makedonova L.D., Gaevskaya N.E., Kachkina G.V.

Key words: DNA-�onta�n�ng ba�ter�ophages, ran�om pr�mers, one-pramer P�R (RAPD - ana��s�s), genotype �hara�ter�st�� of yers�n�a ba�ter�ophages

A �ompar�son ana�ys�s of the genomes of DNA-�onta�n�ng yers�n�a ba�ter�ophages has been �arr�e� out us�ng one-pr�mer P�R (RAPD - ana��s�s). It was shown that one-pr�mer P�R �an be use� for the genotype �hara�ter�st��s of the DNA-�onta�n�ng ba�ter�ophages. The se�e�t�on of the opt�mum pr�mer set wou�� prov��e the progress �n the �nterspe��es an� �ntraspe��es stu�y of the phages.

Rostov-on-Don P�ague �ontro� Resear�h Inst�tute, Rostov-on-Don, 344002, M. Gorkogo , 117/40.


64

УДК 619:9

ОПЫТ ПРИМЕНЕНИЯ НЕТРАНСДУЦИРУЮЩИХ БАКТЕРИОФАГОВ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ТЕРАПИИ

КИШЕЧНОГО ЭШЕРИХИОЗА СВИНЕЙ

Скобликов Н.Э., кандидат медицинских наукГНУ Северо-Кавказский научно-исследовательский институт животноводства Россельхозакадемии (СКНИИЖ) тел. 8(918)4989891, [email protected]Зимин А.А., кандидат биологических наукФГБУН Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им.Г.К.Скрябина РАН (ИБФМ РАН)8(4967)730479, [email protected]

Ключевые слова: бактериофаги, трансдукция, колибактериоз, свиньи, биобезопас-ность, фаготерапия,фагопрофилактика

�роведено сравнительное исследование разли�ных схем применения нетрансдуциру-ющих фагов для поросят с пост-отъёмным синдромом в целях повышения сохранности по-головья, сокращения продолжительности протекания пост-отъёмной диареи, улу�шения по-казателей динамики коли-титра. Установлено, �то оптимальной схемой является их трёх-кратное (с интервалом в три дня) применение в дозировке 1,0×1010 БОЕ на голову животным 28-дневного возраста.

Введение. Начиная с первой работы по изучению эффективности применения бакте-риофагов в лечении эшерихиозной диареи свиней [1], опубликовано значительное количество исследований, посвящённых исследованиям фаготерапии инфекций, вызванных представите-лями семейства Enteroba�ter�a�eae и вида Es�her��h�a coli в частности [2]. Несмотря на вы-сокую эффективность бактериофагов в отношении данной группы возбудителей [3], на пути широкого распространения бактериофагов возникает ряд проблем, среди которых одной из самых серьёзных является их способность к трансдукции и изменению генетических свойств в сторону расширения арсенала факторов патогенности [4].

В медицине важность определения трансдуцирующего потенциала фагов [5] призна-на одним из критериев отбора эффективных и безопасных бактериофагов [6], в то время как важность этого признака в аналогичных работах исследователей в области ветеринарии до по-следнего времени обходили вниманием. Тем более, отсутствуют данные по изучению эффек-тивности нетрансдуцирующих бактериофагов на моделях инфекций сельскохозяйственных животных.

Материалы и методы исследований. Получение препаративных количеств нетранс-дуцирующих фагов, отобранных из обширной рабочей коллекции в ходе предыдущих работ, реализовывали с помощью методов биотехнологии. Всего было отобрано пять фагов. Для под-бора оптимальной схемы применения �n v�vo был взят один фаг (условный лабораторный № 3), выделенный из одного из природных водоёмов Приморского края, идентифицированный как фаг T4-типа семейства Myov�r��ae, отрицательный по наличию гена ho� (гена, кодирующего иммуноглобулиноподобный белок капсида).

После инкубации на культуре E.�o�� B, фаг был сконцентрирован методом центифу-гирования, в результате чего была получена опытная партия экспериментального фагово-го препарата в виде взвеси фаговых частиц. Титр фага определяли методом агаровых слоёв


65

контрольным высевом на культуру чувствительного штамма E.coli, измеряя его в количестве бляшкообразующих единиц (БОЕ) на мл взвеси. Концентрация фага в полученных таким об-разом экспериментальных препаратах колебалась в пределах от 1,0×109 до 1,4×1010 БОЕ/мл.

Опыт �n v�vo был проведён на поросятах породы СМ-1. Были сформированы 7 групп животных (по 30 голов в каждой группе), отличающиеся по возрасту первого приёма экспе-риментального фагового препарата: группы №№ 1-2 – на 28-й день, группы №№ 3-4 – на 19-й день, группы №№ 5-6 – на 10-й день. В состав группы № 7 (контрольной) входили гнёзда с поросятами всех возрастов. Животным групп №№ 1-6 вводился экспериментальный фаговый препарат per os из расчёта 1,0×1010 БОЕ (группы №1, №3, №5) на голову и 1,0×109 БОЕ (груп-БОЕ (груп-пы №2, №4, №6) на голову с периодичностью 1 раз в трое суток в течение 7 дней (всего по 3 введения на голову) (таблица 1).

Таблица 1 - Схема опыта по выяснению оптимальной схемы применения экспе- 1 - Схема опыта по выяснению оптимальной схемы применения экспе-1 - Схема опыта по выяснению оптимальной схемы применения экспе-риментальных коли-фаговых препаратов для профилактики пост-отъёмного синдрома поросят (�=30)

№ группы

Дозировка препарата (БОЕ/гол)

Возраст первого приёма препарата

Дни приёма препарата

1 1,0×1010 28 дней 28 31 342 1,0×109 28 дней 28 31 343 1,0×1010 19 дней 19 22 254 1,0×109 19 дней 19 22 255 1,0×1010 10 дней 10 13 166 1,0×109 10 дней 10 13 167 0 ― ― ― ―

Препарат вводили с помощью аппарата Шилова утром, вскоре после кормления (900 – 1000). Общий период наблюдения за животными составил 10 дней. В течение всего периода эффективность фагового препарата оценивалась по сохранности поголовья в гнёздах, клини-ческому состоянию поросят (сроку продолжительности диареи после отъёма) и лабораторным данным титра энтеробактерий в фекалиях поросят.

Результаты исследований и их обсуждение. При подборе оптимальных доз препа-рата опирались на полученные ранее в предварительных опытах in v�vo на мышах данные, согласно которым применение бактериофагов в титре не менее 105 на 1 грамм массы живот- грамм массы живот-грамм массы живот-ного приводит к эффективной элиминации эшерихий из кишечника. При учёте того, что сред-ний вес поросят-отъёмышей составил около 25 кг, необходимая доза препарата составила бы 2,5×109 БОЕ на голову.

По результатам исследования по подбору оптимальной схемы введения (дозировка, возраст первого применения) экспериментального фагового препарата, выяснилось, что при-менение фагов в возрасте 28-34 дней обеспечило 100-процентную сохранность в группах не-зависимо от дозировки фага. В то же время, в группах, получавших фаг в возрасте 19-25 дней, сохранность (96,2 % и 96,8 %) не превышала контрольный показатель (96,0 %) (таблица 2).


66

Таблица 2 - Результаты опыта по выяснению оптимальной схемы применения экспериментальных коли-фагов (� = 30)

№ группы

Контролируемые параметры

сохранность

(% выживших)

дни* с диареей

коли-титр (lg КОЕ/г) в возрасте 31

днейв возрасте 34

днейв возрасте 37

дней1 100,0 4,0 6,25±0,16 6,15±0,15 6,29±0,142 100,0 3,0 6,43±0,33 5,89±0,52 6,13±0,523 96,2 5,3 6,08±0,26 5,39±0,09 7,69±0,184 96,8 5,7 6,43±0,13 5,94±0,21 6,82±0,665 96,6 5,3 6,90±0,55 5,48±0,68 7,15±0,376 100,0 6,3 6,94±0,03 6,33±0,43 7,53±0,347 96,0 6,0 6,27±0,41 6,43±0,43 7,27±0,52

* – Коли�ество суток со дня отъёма (32-й день), в те�ение которых в группах наблю-далась диарея

Также выяснилось, что продолжительность периода диареи у животных почти у всех опытных групп сократилась по сравнению с контрольной группой (6 сут.). Наименьшей (3 – 4 сут.) она оказалась у животных, получавших фаг в возрасте 28-34 дней. При этом стоит под-черкнуть, что полностью избежать явления диареи не удалось ни в одной из опытных групп.

Что касается динамики коли-титра, то у всех групп, получавших фаг, отмечалось сни-жение содержания E. �o�� после отъёма (к 34-ому дню) с последующим ростом к 37-му дню, а у животных контрольной группы в периоде отъёма не отмечалось снижения содержания E. �o�� на 34-й день.

Интересно, что динамика коли-титра животных опытных групп отличалась своеобра-зием в зависимости от возраста первого применения фага. Так, у животных, получавших фаг в возрасте 10-16 и 19-25 дней, содержание E. �o�� к 31-му дню более, чем на 0,5 порядка пре-вышало этот показатель у других групп (включая контрольную). Эти же группы отличались значительным разбросом показателя коли-титра в течение периода наблюдения: значительным (до 5,39 lg КОЕ/г) снижением в возрасте 34-х дней и значительным (до 7,69 lg КОЕ/г) повы-lg КОЕ/г) снижением в возрасте 34-х дней и значительным (до 7,69 lg КОЕ/г) повы-КОЕ/г) снижением в возрасте 34-х дней и значительным (до 7,69 lg КОЕ/г) повы-lg КОЕ/г) повы-КОЕ/г) повы-шением к 37-ому дню. Животные групп, получавших фаг в возрасте 28-34 дней, характеризо-вались наименьшими (в пределах 0,10 – 0,54 lg КОЕ/г) колебаниями содержания E. �o�� за весь период наблюдения. У животных этих же групп отмечались наименьшие показатели коли-ти-тра к 37-му дню: более, чем на 0,69 lg КОЕ/г по сравнению с животными 3-й – 6-й опытных групп и на 0,84 – 0,98 lg КОЕ/г по сравнению животными контрольной группы. При этом раз-lg КОЕ/г по сравнению животными контрольной группы. При этом раз-КОЕ/г по сравнению животными контрольной группы. При этом раз-личия показателей коли-титра на 37-й день у животных 1-й и 2-й групп были недостоверны.

Таким образом, оптимальной схемой применения фаговых препаратов являлось их трёхкратное (с интервалом в три дня) применение в дозировке 1,0×109 БОЕ на голову жи-БОЕ на голову жи-вотным 28-дневного возраста. Применение фага в большей концентрации (1,0×1010 БОЕ на голову) оказывает менее выраженный эффект как на продолжительность протекания пост-отъёмной диареи, так и на показатели динамики коли-титра. Применение фага в более ранние сроки также характеризуется меньшей эффективностью как по клинической картине, так и по лабораторно контролируемым параметрам.

Проведённое исследование позволяет сделать следующие выводы:1. Оптимальной схемой применения нетрансдуцирующих фагов являлось их трёх-

кратное (с интервалом в три дня) применение в дозировке 1,0×109 БОЕ на голову животным


67

28-дневного возраста.2. Применение разрабатываемых нетрансдуцирующих фагов в большей концентрации

(1,0×1010 БОЕ на голову) или в более ранние сроки оказывает менее выраженный эффект как на продолжительность протекания пост-отъёмной диареи, так и на показатели динамики коли-титра.

3. В кишечнике поросят в пост-отъёмном периоде наблюдается нарастание титра E. coli в течение 5 дней после отъёма c 6,27 lg КОЕ/г до 7,27 lg КОЕ/г; при этом на 8-й день отъёма может наблюдаться ауто-коррекция коли-титра до 6,85 lg КОЕ/г.

4. В кишечнике поросят в пост-отъёмном периоде наблюдается снижение содержания коли-фагов в течение 8 дней после отъёма c 5,53-6,08 lg БОЕ/г до 3,74-3,78 lg БОЕ/г.

Библиографический список1. Zhang X., McDaniel A. D., Wolf L. E. et al. Quinolone antibiotics induce Shiga toxin-

encoding bacteriophages, toxin production, and death in mice // J Infect Dis. 2000;181:664–670.2. Johnson J R. Shigella and Escherichia coli at the crossroads: machiavellian masquerades

or taxonomic treachery? J Med Microbiol. 2000; 49 :583–585.3. Huff W. E., Huff G. R., Rath N. C. et al. Bacteriophage Treatment of a Severe Escherichia

coli Respiratory Infection in Broiler Chickens // Avian Diseases, 2003, Vol. 47, No. 4 , pp. 1399-1405;4. Johnson J R. Shigella and Escherichia coli at the crossroads: machiavellian masquerades

or taxonomic treachery? J Med Microbiol. 2000; 49 :583–585.5. Saunders J. R., Allison H., James C. E. et al. Phage-mediated transfer of virulence genes

// J. Chem. Technol. Biotechnol. 2001. 76:662–666;6. Masatoshi Yoichi, Masatomo Morita, Katsunori Mizoguchi et al. The criterion for selecting

effective phage for Escherichia coli �157:H7 control // Biochem. Engineering J. 2004. Vol. №19, pp. 221-227.

EXPERIENCE OF APPLICATION OF NON TRANSDUCING BACTERIOPHAGES FOR PROPHYLAXY AND THERAPY

OF INTESTINAL COLIBACTERIOSIS OF PIGS

Skoblikow N.E., Zimin A.A.

Key words: ba�ter�ophages, trans�u�t�on, �o��ba�ter�os�s, p�gs, b�ose�ur�ty, phage therapy, phage prophy�axy

Rea��ze� the �omparat�ve stu�y of var�ous s�hemes of us�ng the non-trans�u��ng E. �o�� ba�ter�ophages for p�gs w�th post-wean�ng ��arrhea. It �s estab��she� that the opt�ma� s�heme �s to tr�p�e (at �nterva�s of three �ays) at a �osage of app��at�on 1,0 × 1010 PFU /hea� from the 28 �ays of age.


68

УДК 578.81:579.67

ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ БАКТЕРИОФАГОВ В ПРОФИЛАКТИКЕ И ЛЕЧЕНИИ НОЗОКОМИАЛЬНЫХ

ОСЛОЖНЕНИЙ В ХИРУРГИИ

Слободенюк В.В.*, кандидат биологических наук, [email protected]Воропаева Е.А.*, кандидат биологических наук, , [email protected]Алешкин В.А.*, доктор биологических наук, профессор, (495)452-18-16, Афанасьев С.С.*, доктор медицинских наук, профессор,Караулов А.В.**, член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор, , (903) 572-60-26, [email protected]Афанасьев М.С.**, доктор медицинских наук, (916) 685-52-38*ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора** ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России

Ключевые слова: перитонит, бактериофаги, микрофлора, антибиотики.�еритонит, его классификация, оценка тяжести, ле�ение - одни из самых насущных во-

просов современной хирургии. Осуществлен поиск и применение бактериофагов, активных про-тив бактерий, выделенных из перитонеального экссудата пациентов с перитонитами. Изу�ена возможность применения комбинированного фагового препарата для профилактики и ле�ения «нозокомиальных» перитонитов.

Введение. В подавляющем большинстве случаев перитонит является полимикроб-ным заболеванием. При первичном перитоните, если источником перитонита является тол-стая кишка, то, более чем в 90% случаев определяется аэробно-анаэробная ассоциация микро-организмов; если источником инфицирования является желудок или тонкая кишка, то такая ассоциация встречается значительно реже. Степень обсемененности брюшной полости четко коррелирует с длительностью течения перитонита. Исходный спектр микрофлоры перитоне-ального экссудата при вторичном перитоните, характеризуется стабильным единообразием и преобладанием высоковирулентных грамотрицательных микроорганизмов. Нерациональное применение антибактериальных препаратов приводит к существенному изменению видового состава возбудителей перитонита. При отсутствии положительной динамики в течение пери-тонита на протяжении 3-4 суток в ходе программируемых хирургических санаций брюшной полости практически у всех пациентов отмечалось увеличение удельного веса госпитальной микрофлоры, крайне высоко устойчивой к антибиотикам резерва. Каждый конкретный стаци-онар характеризуется своим микробным пейзажем, однако, в последнее десятилетие многие авторы указывают на преобладание неферментирующих микроорганизмов среди госпиталь-ных штаммов (ацинетобактеров и псевдомонад). За ними следуют клебсиеллы, эшерихии, эн-терококки и бактероиды. Практически все нозокомиальные штаммы входят в состав нормаль-ной микрофлоры кишечника человека.

Материалы и методы исследований. В проспективное исследование было включено 40 (21 мужчина и 19 женщин) пациентов с распространенным гнойным перитонитом, у кото-рых в процессе лечения использовалась лапаростома. Основным критерием отбора больных было лечение путем наложения лапаростомы и проведение этапных санаций общим количе-ством не менее 5. У всех пациентов Мангеймский индекс перитонита составил 25 баллов и более (31,6±3,7). Общая тяжесть состояния пациентов, оцениваемая по шкале SAPS II, была не менее 35 баллов (43,3±6,8). Выделение и идентификацию микроорганизмов проводили с при-


69

менением стандартных бактериологических методик. Чувствительность к антибиотикам опре-деляли диско-диффузионным методом. Определяли чувствительность выделенных микро-организмов к следующим фагам: Стафилококковый бактериофаг, Бактериофаг синегнойный жидкий, Коли-протейный бактериофаг, Интести-бактериофаг жидкий раствор, Пио-бактери-офаг поливалентный, Клебсиллезный бактериофаг (ФГУП «НПО «Микроген» Минздравсоц-развития России). Выявление «островков патогенности», как дополнительного критерия оцен-ки вирулентности, выделенных микроорганизмов проводили методом ПЦР. Выбор «островков патогенности» для исследования был связан с основными этапами инфекционного процесса: адгезия – гены, контролирующие синтез фимбрий Р типа (рарС и рарН), S типа (sfaA и sfaG), 1 типа (fimA) и бактериального адгезина интимина (еаеА ген), а также капсулообразование (kps); размножение в тканях – �rp2 ген, контролирующий синтез сидерофора, участвующего в транспорте железа внутрь клетки; продукция токсических веществ: toxAgene (LTh) - термола-LTh) - термола-) - термола-бильный энтеротоксин, estIa gene (ST-IA/ST-P) - термостабильный энтеротоксин, a-гемолизин (h�yВ ген) и энтерогемолизин (ehx ген), цитотоксический некротизирующий фактор 1 (�nf1 ген) и шигаподобные токсины 1 и 2 типа (stx1 и stx2 гены); наличие генов устойчивости к анти-биотикам: qnrB, qnrS, qnrA – фторхинолоны; TEM (b�a TEM), CTX (b�a�TX-M), SHV (b�aSHV) – бета-лактамы.

Результаты исследований и их обсуждение. В процессе микробиологических иссле-дований перитонеального экссудата и биопсийного материала указанных пациентов (сальник, брюшина), было выделено 15 чистых культур 7 видов микроорганизмов, в 95,3% случаев вы-зывающих нозокомиальный перитонит. К ним относились, 2 штамма A��netoba�ter bauman-nii, 1 штамм A��netoba�ter haemo�yt��us, 1 штамм Entero�o��us bov�s, 2 штамма Entero�o��us fae�a��s, 4 штамма Entero�o��us fae��um, 2 штамма Es�her��h�a coli, 3 штамма Pseu�omonas aerug�nosa (рис. 1).

0

5

10

15

20

25

30

35%Pseudomonas aeruginosa

Acinetobacter baumannii

Acinetobacter haemolyticus

Enterococcus faecalic

Enterococcus faecium

Enterococcus bovis

Escherichia coli

Другие

Рисунок 1. Частота встречаемости нозокомиальных штаммов.

У большинства микроорганизмов выявлена высокая устойчивость к антибиотикам (табл. 1), в том числе и антибиотикам последних поколений (цефалоспоринам III, IV поко-III, IV поко-, IV поко-IV поко- поко-лений, фторхинолонам, карбопенемам). Кроме того, 2 штамма Pseu�omonas aerug�nosa и 1 штамм A��netoba�ter baumann�� были устойчивы к 0,5% водному раствору хлоргексидина, ча-сто используемого для санации брюшной полости, а один штамм Pseu�omonas aerug�nosa и 2 штамма Entero�o��us fae��um, проявляли устойчивость к гипохлориту натрия.


70

Таблица 1. Чувствительность госпитальных штаммов микроорганизмов к анти-биотикам.

Штаммы микроорганиз-мов

Антибиотики

Цеф

тази

дим

Цеф

опер

азон

Цеф

епим

Офл

окса

цин

Цип

рофл

окса

цин

Лев

офло

ксац

ин

Ими

пене

м

Мер

опен

ем

Ван

коми

цин

Pseudomonas aeruginosa 41/1 - - - ++ ++ ++++ - ++ -

Pseudomonas aeruginosa P15 - - ++ - - ++ +++ +++ -

Pseudomonas aeruginosa 5/3 + + +++ - - - + + -Acinetobacter baumannii Б1 - - ++ +++ ++ +++ ++++ ++++ -Acinetobacter baumannii 7/1 - + +++ - - - ++ +++ -Acinetobacter haemolyticus 6/3 ++++ +++ ++ - - - +++ +++ -

Enterococcus faecalis 18/3 - - ++ + + ++ - - ++++Enterococcus faecalis 21/3 - - - ++ ++ ++ +++ +++ ++++Enterococcus faecium Б/3 - - - - + +++ + + -Enterococcus faecium 26/2 - - - +++ +++ +++ - - +++Enterococcus faecium 10/1 +++ +++ +++ - - - +++ +++ +Enterococcus faecium 37/2 - - - ++ ++ +++ - - -Enterococcus bovis 15/1 - - +++ + + +++ +++ +++ ++++Escherichia coli 1 ++ ++ ++++ ++ ++ +++ ++++ ++++ -Escherichia coli 2 - - +++ - - - ++++ ++++ -

�риме�ания:- - устой�ив; +- слабо �увствителен; ++- умеренная �увствительность; +++- �увствителен; ++++- высоко �увствителен.

У исследуемых нозокомиальных штаммов наблюдалось выявление островков пато-генности, отвечающих как за адгезию бактериальной клетки на тканях макроорганизма, обе-спечивающих размножение, антибиотикорезистентность, так и повышающих патогенность бактерий за счёт придания им дополнительной токсичности в разнообразных сочетаниях. Вы-явление островков патогенности антибиотикорезистентности при определении устойчивости к фторхинолонам у 75% исследованных штаммов совпадало с результатами, полученными диско-диффузионным методом. В отношении бета-лактамных антибиотиков процент совпаде-ний генотипической и фенотипической устойчивости составляло 62,5%.

При определении чувствительности этих штаммов к применяемым в России коммер-ческим бактериофагам установили, что Pseu�omonas aerug�nosa, Entero�o��us fae��um, Es�he-r��h�a coli, Entero�o��us bov�s чувствительны к «Интести-бактериофаг жидкий раствор», «Бак-териофаг синегнойный жидкий» и «Коли-протейный бактериофаг» (ФГУП «НПО Микроген») в высокой степени.

Не выявлено чувствительности A��netoba�ter baumann��, A��netoba�ter haemo�yt��us и Entero�o��us fae�a��s к указанным и другим, разрешенным к применению бактериофагам (табл. 2).


71

Таблица 2. Чувствительность нозокомиальных штаммов к бактериофагам.

Микроорганизм

Бактериофаги

Стаф

илок

окко

вый

бакт

ерио

фаг

Бакт

ерио

фаг

сине

гной

ный

жид

кий

Коли

-про

тейн

ый

бакт

ерио

фаг

Инт

ести

-бак

тери

офаг

жид

кий

раст

вор

Пио

-бак

тери

офаг

пол

ивал

ент-

ный

Кле

бсил

лезн

ый

бакт

ерио

фаг

Pseudomonas aeruginosa 41/1 - +++ - - - -Pseudomonas aeruginosa P15 - ++ - - - -Pseudomonas aeruginosa 5/3 - ++ - - - -Acinetobacter baumannii Б1 - - - - - -Acinetobacter baumannii 7/1 - - - - - -Acinetobacter haemolyticus 6/3 - - - - - -Enterococcus faecalis 18/3 - - ++ + + -Enterococcus faecalis 21/3 - - - - - -Enterococcus faecium Б/3 - - - +++ - -Enterococcus faecium 26/2 - - ++ - +++ -Enterococcus faecium 10/1 + - + ++ + -Enterococcus faecium 37/2 - - - ++ ++ -Enterococcus bovis 15/1 + - - + +++ -Escherichia coli 1 + - +++ + ++ -Escherichia coli 2 ++ - ++ - - -

�риме�ания:- - устой�ив; +- слабо �увствителен; ++- умеренная �увствительность; +++- �увствителен; ++++- высоко �увствителен.

В связи с полученными результатами, у 16 пациентов с распространенным гнойным перитонитом с профилактической целью был применён комбинированный препарат из ком-мерческих бактериофагов, проявивших активное действие в отношении выявленных нозоко-миальных штаммов. Целесообразность применения комбинированного препарата обусловлена тем, что фаги обеспечивают профилактическую защиту реинфицирования брюшной полости нозокомиальными штаммами. Это предотвращает как развитие нозокомиального перитонита, так и смену нозокомиального возбудителя в брюшной полости в случаях послеоперационного перитонита во время многократных этапных са-наций.

В случае послеоперационного перитонита, где уже имеется какой-либо из перечислен-ных нозокомиальных штаммов, комбинированный препарат поз-воляет бороться с уже при-сутствующей инфекцией и предупреждать смену до-минирующего возбудителя, так как один из 3-х компонентов комбинирован-ного фагового лечебного препарата играет роль основного лечебного агента, а другие предотвращают смену возбудителя.

После каждой санации в брюшную полость вводили по 200,0 мл раствора комбини-рованного препарата бактериофага, а также 2 раза в сутки с момента наложения и до момента


72

закрытия лапаростомы указанный препарат вводили в желудочно-кишечный тракт через же-лудочный зонд или клизму. При использовании бактериофагов, ни в одном случае не отмече-но присоединения внутрибольничной флоры из группы Pseu�omonas aerug�nosa, Entero�o��us fae��um, Entero�o��us bov�s и Es�her��h�a coli.

Кроме того, в одном случае послеоперационного перитонита в перитонеальном экссу-дате при первом посеве выявлен нозокомиальный штамм Pseu�omonas aerug�nosa 106 lg КОЕ/г и у другого пациента с послеоперационным перитонитом наличие нозокомиального штамма Entero�o��us fae��um 107 lg КОЕ/г. Примечательно, что после применения комбинированного бактериофагового препарата к моменту второй санации оба штамма определялись в титре 103 lg КОЕ/г, а после третьей и последующих санаций внутрибольничная флора в посевах из пе- КОЕ/г, а после третьей и последующих санаций внутрибольничная флора в посевах из пе-ритонеального экссудата не высеивалась. Необходимо отметить, что указанные микроорганиз-мы характеризовались отсутствием чувствительности к использованным антибактериальным препаратам, применённых у пациентов до получения данных микробиологического исследо-вания. Следовательно, положительная динамика в виду ликвидации нозокомиальной флоры из перитонеального экссудата ко 2 и 3 санациям брюшной полости у данной группы больных была достигнута благодаря раннему применению фаговых препаратов.

В 2-х случаях при многократных санациях брюшной полости отмечено присоедине-ние A��netoba�ter baumann�� (при третьей и четвертой санации) и по одному случаю - присо-единение A��netoba�ter haemo�yt��us (вторая санация) и Entero�o��us fae�a��s (с первой санации послеоперационного перитонита). Среди пациентов с летальным исходом нозокомиальная флора из групп Pseu�omonas aerug�nosa, Entero�o��us fae��um, Entero�o��us bov�s и Es�her��h�a coli не высевалась.

Таким образом, развитие «нозокомиального» перитонита при многократных санациях брюшной полости на фоне проведения фаготерапии составило 30,77%, что более чем в 3 раза ниже, по сравнению с группой пациентов, где в случаях длительного использования лапаро-стомы и без проведения фаготерапии процент развития нозокомиального перитонита после 5-ой санации близок к 100%.

По данным как отечественных, так и зарубежных авторов, эффективность фагов зави-сит от степени их адаптированности к регионарным вариантам (расам) бактерий. Чувствитель-ность возбудителей госпитальных инфекций к адаптированным бактериофагам значительно выше, чем к коммерческим (72- 94% и 9-47%, соответственно). В первую очередь, это отно-сится к синегнойной палочке, протею, энтерококкам и клебсиеллам. В связи с отсутствием в продаже адекватного фагового препарата, в отношении трех выделенных нами видов микроор-ганизмов - возбудителей нозокомиального перитонита (A��netoba�ter baumann��, A��netoba�ter haemo�yt��us и Entero�o��us fae�a��s), Государственным научным центром прикладной микро-биологии (ГНЦ ПМ) оказана консультативная помощь в выделении, идентификации и опреде-лении биологических свойств новых бактериальных вирусов. Полученные фаги исследованы в тестах in vitro на литическую активность к патогенам, выделенных от пациентов с распро-in vitro на литическую активность к патогенам, выделенных от пациентов с распро- vitro на литическую активность к патогенам, выделенных от пациентов с распро-vitro на литическую активность к патогенам, выделенных от пациентов с распро- на литическую активность к патогенам, выделенных от пациентов с распро-страненным гнойным перитонитом. Результаты исследований, показали 100% литическую ак-тивность нового фагового препарата в отношении A��netoba�ter baumann��, A��netoba�ter hae-mo�yt��us и Entero�o��us fae�a��s. Чувствительность указанных штаммов микроорганизмов к полученным фагам на питательных средах превосходила чувствительность к антибиотикам, в той или иной степени сохранивших свое действие на данную микрофлору. Кроме того, был произведен поиск адекватных фаговых препаратов из коллекции института, активных в отно-шении всех выделенных нозокомиальных штаммов микроорганизмов. Такие бактериальные вирусы найдены, и активность их на питательных средах при определении чувствительно-сти несколько превосходила чувствительность к антибиотикам, сохранивших свое действие


73

на данные микроорганизмы. Никакой корреляции между антибиотикоустойчивостью и фаго-устойчивостью не существует, так как эти признаки имеют разные генетические структуры и механизмы фенотипической экспрессии.

Заключение. Применение адаптированных бактериофагов в лечении вторичного и нозокомиального распространенного гнойного перитонита заметно повышает эффективность проводимой терапии и предотвращает летальный исход.

PROSPECTS OF THE APPLICATION OF BACTERIOPHAGES IN THE PREVENTION AND TREATMENT OF NOSOCOMIAL

COMPLICATIONS IN SURGERY

Slobodenyuk V.V., Voropaeva E.A., Aleshkin V.A., Afanas’ev S.S., Karaulov A.V., Afanas’ev M.S.

Key words: per�ton�t�s, ba�ter�ophages, m��ro�ora, ant�b�ot��.

Per�ton�t�s, ��ass�fi�at�on, assessment of sever�ty, treatment �s one of the most press�ng �ssues of mo�ern surgery. �on�u�te� the se�e�t�on an� use of ba�ter�ophages, wh��h have a�t�ve aga�nst ba�ter�a �so�ate� from per�tonea� exu�ate of pat�ents w�th per�ton�t�s. Stu��e� the poss�b��ty of the �omb�nat�on ��ffrent ba�ter�ophages for the prevent�on an� treatment «noso�om�a�» per�ton�t�s.

УДК 619:616.98:576.8:636.5

ФАГОТЕРАПИЯ САЛЬМОНЕЛЛЁЗА КУР С УЧЕТОМ ОСОБЕННОСТЕЙ ТЕХНОЛОГИИ ВЫРАЩИВАНИЯ ПТИЦЫ

Плешакова В.И., доктор ветеринарных наук, профессорТел. (3812)25-05-19, 89136259160, [email protected]Степанов Д.Н., аспирант, тел. 89081082017, [email protected]ФГБОУ ВПО «ИВМиБ ОмГАУ им. П.А. Столыпина»

Ключевые слова: Цыплята-бройлеры, сальмонеллёз, бактериофаги, микрофлора, производственные показатели

Работа посвящена фаготерапии сальмонеллёза цыплят-бройлеров с у�етом особен-ностей технологии выращивания птицы. Авторами установлено, �то использование саль-монеллёзного бактериофага обеспе�ивает отсутствие сальмонелл в продукции и повышает производственные показатели сохранности птицы, среднесуто�ного привеса, индекса про-дуктивности.

Введение. Среди болезней птицы в последние годы более 60% составляют инфекции бактериальной этиологии, при этом отмечается возрастание роли микроорганизмов, являю-щихся возбудителями проблемных для птицехозяйств болезней: колибактериоза, сальмонел-леза, стафилококкоза и др. [1]. Сальмонеллёз птиц независимо от сероварианта возбудителя, вызвавшего его, причиняет значительный социально-экономический ущерб [2]. Важным мо-ментом в организации борьбы с сальмонеллёзной инфекцией на птицеводческом предприятии


74

является систематический мониторинг бактериальных патогенов среди больной и павшей пти-цы, который позволяет регистрировать заражение птицы и определять средства специфиче-ской профилактики [3,4,5].

Сальмонеллы обладают значительной лекарственной устойчивостью ко многим анти-биотикам, которые ВОЗ не рекомендует широко использовать в борьбе с инфекцией, в связи с тем, что применение препаратов зачастую приводит к дисбактериозам и снижению естествен-ной резистентности организма птицы. Перспективным направлением в борьбе с сальмонел-лёзом птиц могут служить бактериофаги, которые лишены вышеперечисленных недостатков. Вместе с тем, до настоящего времени вопросы противосальмонеллёзной терапии с использо-ванием специфических фагов разработаны слабо и не нашли широкого практического приме-нения в промышленном птицеводстве.

Цель исследования. Разработать схему фаготерапии сальмонеллёза кур с учетом осо-бенностей технологии выращивания птицы.

Материалы и методы исследования. Научный эксперимент по разработке схемы фа-готерапии сальмонеллеза кур проведен на птицефабрике производственной мощностью более 2 млн. гол. Бактериологические исследования проб патологического материала проводили в отделе болезней птиц БУ Омской области «ООВЛ», анализ и обобщение полученных резуль-татов на кафедре ветеринарной микробиологии, вирусологии и иммунологии ИВМиБ ОмГАУ им. П.А. Столыпина. Объектом исследования служили цыплята-бройлеры, кросса RossЕ308, мясного направления. Эксперимент по применению сальмонеллёзного бактериофага был про-веден с использованием 34000 гол. птицы. Контролем был зал с таким же количеством пти-цы. Для выделенных из патологического материала культур сальмонелл подобраны специфи-ческие бактериофаги и разработано временное наставление по их применению на цыплятах бройлерах. Сальмонеллёзные бактериофаги были выделены из патматериала, на базе ФБУ на-уки ГНЦ ВБ «Вектор» (г. Новосибирск) там же был приготовлен лизат бактериофага с титром 1,25х109 БОЕ/мл. Период эксперимента составил 40 сут., с момента рождения птицы и до убоя, связанного с технологией выращивания. Ежедневно проводили клинический осмотр птицы (поведение, внешний вид), учитывали сохранность и потребление корма. Живую массу цыплят определяли при взвешивании раз в неделю. На протяжении всего эксперимента проводили па-тологоанатомическое вскрытие павшей птицы с целью регистрации патоморфологических из-менений и взятия материала для бактериологических исследований (сердце, печень и костный мозг). Патологоанатомическое вскрытие проводили согласно существующих методик. Всего был исследован материал от 789 трупов цыплят.

В соответствии с временным наставлением по применению сальмонеллезного бак-териофага, обработку суточных цыплят осуществляли методом аэрозольного распыления в спрей кабинете «Desvak». Бактериофагом обработано 34000 гол. птиц, при этом доза на одну гол. составила 0,01 мл препарата.

На 8-е сут. лизат бактериофага цыплята получали методом выпаивания, для обеспе-чения полного потребления бактериофага их предварительно выдержали без питьевой воды в течение 40 мин., затем в теплую водопроводную воду (5л) внесли 400 мл лизата бактериофага (1,25х109 БОЕ/мл), и смесь подали в систему поения. Время потребления птицей данного объ-ема препарата составило 1час 40 мин.

На 22-е сут. лизат бактериофага задавали так же методом выпаивания, при этом без-питьевой период составил 50 мин, а объем воды с лизатом бактериофага увеличен до 7 литров с учетом веса птицы. Период выпаивания так же составил 1час 40 мин.

На 29-е сут. жизни цыплят было проведено четвертое выпаивание, но объем воды с лизатом бактериофага составил 10 литров. Период выпаивания бактериофага тот же - 1час 40


75

мин.На 32-е сут. лизат бактериофага цыплята получили тем же способом. Экспозиция на-

хождения птицы без воды составила 60 мин, а объем воды, в который добавили лизат бактери-офага, составил 13 литров. Время выпойки осталось то же.

Заключительное применение бактериофага проведено на 36е сут. по той же схеме как на 32е сут.

Результаты исследований. В течение первой недели эксперимента, как в опытной, так и в контрольной группах наблюдали гибель птенцов. Падеж в опытной и контрольной группах составил 229 гол.(0,7%) и 324 гол. (1%) соответственно. Основными причинами гибе-ли цыплят в этот период являлись: желточный перитонит, плохое заживление пуповины (ом-фалит), мочекислый диатез (подагра), кутикулит и гепатит. В дальнейшем отход птицы в кон-троле превысил показатели опытной группы (таблица 1).

Больные птенцы до двухнедельного возраста вели себя заторможено, наблюдалась сла-бость лапок, отсутствие аппетита, медленный рост, вокруг клоаки налипали каловые массы.

При вскрытии погибших птенцов регистрировали - катаральное воспаление слизи-стой оболочки кишечника, утолщение ее стенки, увеличение фолликулов. В печени, сердечной мышце, лёгких, селезёнке - кровоизлияния, очаги некроза. При бактериологическом исследо-вании проб патологического материала (сердце, печень и костный мозг) были выделены Strep-Strep-tococcus sp. (6,7%) и Salmonella enteritidis (1,4%).

Таблица 1 - Количество павшей птицы за период эксперимента.

Группа Падеж,гол.7сут. 22сут. 29сут. 32сут. 40сут. Итого

Опытная(n=34000)

299 577 132 47 192 1247(3,7 %)

Контрольная(n=34000)

324 593 158 60 244 1379(4,05%)

В контрольной группе, к 22 суткам падеж составил 593 гол., к 29 сут. он значитель-но сократился (158 гол.), затем (32 сут.) снизился на 62%, и к завершению эксперимента (40 сут.) составил 244 гол., что на 21,3% больше чем в опытной группе. Значительный падеж к 22 суткам в обеих группах был обусловлен увеличением количества птицы больной колибакте-риозом, что было подтверждено результатами бактериологических исследований. Так были выделены патогенные культуры Escherichia coli (31%).

За весь период эксперимента проведено 789 бактериологических исследований проб патологического материала от павшей птицы, в результате выделены следующие изоляты микроорганизмов (n=451): Streptococcus sp. - 53 культуры (6,7% ), Salmonella enteritidis – 11 (1,4%), Staphylococcus aureus - 43 (5,4%), Escherichia coli группа 1серотип О2 - 242 (31%), Pseu-Staphylococcus aureus - 43 (5,4%), Escherichia coli группа 1серотип О2 - 242 (31%), Pseu- aureus - 43 (5,4%), Escherichia coli группа 1серотип О2 - 242 (31%), Pseu-aureus - 43 (5,4%), Escherichia coli группа 1серотип О2 - 242 (31%), Pseu- - 43 (5,4%), Escherichia coli группа 1серотип О2 - 242 (31%), Pseu-Escherichia coli группа 1серотип О2 - 242 (31%), Pseu- coli группа 1серотип О2 - 242 (31%), Pseu-coli группа 1серотип О2 - 242 (31%), Pseu- группа 1серотип О2 - 242 (31%), Pseu-Pseu-domonas aeruginosa – 31 (3,9%), Proteus vulgaris – 8 (1%), Mycoplasma sp. - 63 (8%). Из них в опытной группе Streptococcus sp. – 29 культур, Salmonella enteritidis – 3, Staphylococcus aureus – 21, Escherichia coli группа 1серотип О2 – 119, Pseudomonas aeruginosa – 16, Proteus vulgaris – 4, Mycoplasma sp. – 29.

После первого применения бактериофага, на 8-е сутки в опыте было выделено две культуры сальмонеллы (Salmonella enteritidis), после второго, (22-е сутки) одна культура. На 29-е сутки в пробах из патологического материала (сердце, печень и костный мозг) цыплят опытной группы выделение сальмонелл не регистрировали. Тогда как в контроле Salmonella


76

enteritidis выделяли в период до 32 суток эксперимента. В целом общий микробный фон из проб патологического материала трупов в опытной и контрольной группах значительно не от-личался.

В результате применения бактериофага показатели среднесуточного привеса птицы в опытной группе превышали данные контроля на 0,7 г/гол. сут.

Сохранность птицы в опытной группе составила 96,33%, в контроле 95,94%. Количе-ство выбракованной птицы в опыте составило 1,6%, в контроле 1,9%. Живая масса при убое в опытной группе на фоне применения бактериофага была выше на 5,45 ц. чем в контроле. Ин-декс продуктивности птицы в опыте превысил аналогичный показатель в контрольной группе на 9,4.

Выводы. Применение сальмонеллёзного бактериофага обеспечивает отсутствие саль-монелл в готовой продукции, увеличивает сохранность птицы на 0,39%, среднесуточный при-вес, живой вес при убое и индекс продуктивности.

Библиографический список1. Венгеренко Л.А. Ветеринарно-санитарное обеспечение эпизоотического благопо-

лучия в птицехозяйствах Российской Федерации/Л.А. Венгеренко //Ветеринария, 2009.-№8.-С.З-6.

2. Кафтырева Л.А. Сальмонеллезы на территории Северо-Западного Федерального Округа РФ. Аналитический обзор/Л.А. Кафтырева, З.Н.Матвеева, A.B. Забровская, С.А. Его-рова, М.А. Макарова.- С-Пб, 2008.- 41с.

3. Гусев В. Мониторинг возбудителей бактериальных инфекций/ В. Гусев, Э. Светоч, Н. Глазков, М. Теймуразов, С.Приходько, С.Павлов // Птице-водство.-2003.- №2.-С.8-9.

4. Афонюшкин В., Дудаева Е., Малахеева Л., Фролова О., Шкред О., Филиппенко М. Современные методы контроля сальмонеллеза //Птицеводство.-2008.-№9.-С.43-44.

5. Рождественская Т.Н. Специфическая профилактика инфекции Salmonella enteritidis у птицы/ Т.Н.Рождественская// Российский вет. журн. С.-х. животные.-2009.-№Г.-С.46-48.

SALMONELLA BACTERIOPHAGE TREATMENT OF CHICKENS WITH THE FEATURES OF THE TECHNOLOGY OF POULTRY BREEDING

Pleshakova V.I., Stepanov D.N.

Key words: Bro��er �h��kens, sa�mone��a, ba�ter�ophages, m��ro�ora, pro�u�t�on �n��es

Th�s art��e �s �evote� to sa�mone��a phage therapy of bro��er �h��kens w�th the pe�u��ar�t�es of the te�hno�ogy of pou�try bree��ng. The authors have foun� that the use of Sa�mone��a phage ensures no sa�mone��a �n pro�u�ts an� �n�reases the safety pro�u�t�on �n��es of b�r�s, average �a��y ga�n, pro�u�t�v�ty �n�ex.


77

УДК 579.61/62; 575.852:577.2

АНТИБИОТИКОУСТОЙЧИВОСТЬ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПАТОГЕНОВ: ЭВОЛЮЦИОННЫЕ МЕХАНИЗМЫ И КЛИНИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Фурсова Н.К.*, кандидат биологических наук, [email protected];Карцев Н.Н.*, тел. 8(4967) 36-00-79, [email protected];Ивашов С.В.**, тел. 8(4967) 31-07-98, [email protected];Светоч Э.А., доктор ветеринарных наук, профессор, [email protected]*ФБУН «ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии» **МЛПУ Протвинская городская больница, Московская обл.,

Ключевые слова: устой�ивость к антибактериальным препаратам, горизонталь-ный перенос генов, эволюция резистентности

Работа посвящена обзору данных литературы и представлению результатов соб-ственных исследований по распространенности устой�ивости к антимикробным препара-там у бактериальных патогенов �еловека, по эволюции молекулярных механизмов и клини�е-ской зна�имости данного явления. Рассматривается роль бактериофагов в горизонтальном и вертикальном переносе генети�еских детерминант резистентности и патогенности.

Уровень инфекционной заболеваемости населения является одним из компонентов оценки “индекса здоровья” нации. За всю историю человечества именно инфекции внесли по-давляющий вклад (почти 90%) в показатель смертности. В настоящее время инфекционные за-болевания в мировом масштабе являются главным «убийцей» людей детского и молодежного возраста – 13 млн. смертей в год. В развивающемся мире это – каждая вторая смерть. Каждые 3 секунды в мире умирает ребенок – в большинстве случаев от инфекции. Инфекции стали быстрее распространяться в новые регионы благодаря массовым перемещениям популяций в последние десятилетия (начиная с 1996 г. около 50 млн. людей - 1% мировой популяции – ми-грировали). Усугубляющими факторами также являются: рост плотности населения в городах; недостаточно чистая питьевая вода; низкий уровень санитарии; нищета; наличие соматиче-ских заболеваний, ослабляющих иммунитет [1].

Основным средством борьбы с серьезными инфекциями являются антибиотики. В свое время, в середине XX в., они сыграли революционную роль, снизив смертность от бак-XX в., они сыграли революционную роль, снизив смертность от бак- в., они сыграли революционную роль, снизив смертность от бак-териальных инфекций; и до сих пор многие методы современной медицины немыслимы без применения антибиотиков: трансплантация, химиотерапия рака, ортопедическая хирургия и другие. Однако в последние десятилетия арсенал доступных для лечения инфекций лекарств повсеместно стремительно уменьшается из-за прогрессивного увеличения резистентности возбудителей к применяемым лекарствам и недостаточно быстрого появления новых антибак-териальных препаратов [2]. Врачи всего мира сталкиваются с ситуациями, когда инфицирован-ному больному не может быть назначена адекватная терапия из-за устойчивости инфекционно-го агента ко всем имеющимся антибиотикам. Таким образом, назрел кризис здравоохранения, осложняющийся большим количеством возбудителей инфекционных заболеваний человека, в значительной степени отличающихся по своим свойствам, набору факторов патогенности, механизмам резистентности, а также возможным путям преодоления сформировавшейся ле-карственной резистентности.

Всемирная организация здравоохранения (WH�) рекомендует в первую очередь со-WH�) рекомендует в первую очередь со-) рекомендует в первую очередь со-средоточить усилия исследователей на направлениях, представляющих наибольшую опас-ность для здравоохранения многих стран мира - шести смертельных инфекциях, являющихся


78

причиной 50 % от всех преждевременных смертей в мире (пневмония, туберкулез, кишечные заболевания, малярия, корь и синдром иммунодефицита СПИД/ВИЧ) [3].

Резистентность возбудителей к применяемым антибактериальным препаратам значи-тельно усложнила борьбу с первыми пятью из шести перечисленных смертельных болезней. У многих опасных возбудителей (Staphy�o�o��us aureus, Entero�o��us spp., Enteroba�ter�a�eae, Pseu�omonas aerug�nosa, A��netoba�ter spp., My�oba�ter�um tuber�u�os�s) отмечается «эскала-ция» развития резистентности: множественно-резистентные изоляты бактерий (multi drug resistance, MDR) нечувствительны по крайней мере к одному из применяемых для лечения данной инфекции антибиотику из трех функциональных классов; экстремально-резистентные изоляты бактерий (extreme drug resistance, XDR) - по крайней мере к одному антибиотику из всех функциональных классов, кроме одного или двух; пан-резистентные изоляты бактерий (pan drug resistance, PDR) – ко всем антибиотикам из всех функциональных классов [4, 5]. Яркими примерами инфекций, вызванных резистентными возбудителями в последние годы, явились: вспышка кишечного заболевания в Европе, вызванная MDR-E. �o�� 104:H4 [6] и появление в Индии, с последующим распространением в Европе, PDR-бактерий семейства Enteroba�ter�a�eae, несущих New Delhi металло-бета-лактамазу-1 (NDM-1) [7].

С точки зрения эпидемиологии инфекции подразделяются на две большие группы: внутрибольничные (госпитальные или нозокомиальные) и внебольничные инфекции, часть из которых расценивается как социально-значимые. В настоящее время доля устойчивых к лекарственным препаратам нозокомиальных штаммов в разных странах составляет от 5 % до 60-80 %, зачастую такие инфекции заканчиваются летально (19 тыс. случаев ежегодно в США, столько же – в Европе) [3]. Резистентные формы возбудителей все чаще выделяются от амбу-латорных пациентов, от домашних и сельскохозяйственных животных, а также из объектов окружающей среды. Доказано, что бактерии активно обмениваются генетическими детерми-нантами резистентности, сформирована концепция о наборах факторов резистентности, при-сущих конкретным сообществам бактерий (резистом) [8], в том числе – микробному сообще-ству организма человека (микробиом) [9].

Основные генетические механизмы, определяющие лекарственную устойчивость у бактерий, относящихся к разным таксономическим группам, значительно отличаются. Так, у метициллин-устойчивых Staphy�o�o��us aureus (MRSA) важную роль играет стафилококковая хромосомная кассета SCCme�; у Pseu�omonas aerug�nosa – гены нескольких типов эффлюкс-ных насосов, у A��netoba�ter baumann�� – специфичные мобильные транспозоны Aba; у энте-робактерий – гены бета-лактамаз расширенного спектра (БЛРС); у My�oba�ter�um tuber�u�os�s – точечные мутации в генах, кодирующих ферменты, модифицирующие молекулы лекарства. Свой вклад в резистомы отдельных видов бактерий вносят также и универсальные механиз-мы устойчивости к некоторым классам лекарств: так, устойчивость к хинолонам формируется благодаря наличию точечных мутаций в генах, кодирующих ферменты ДНК-гиразу и топои-зомеразу IV. Большую роль в формировании и распространении наиболее «успешных» меха-IV. Большую роль в формировании и распространении наиболее «успешных» меха-. Большую роль в формировании и распространении наиболее «успешных» меха-низмов резистентности играют мобильные генетические элементы (транспозоны, интегроны, IS-элементы, плазмиды) и универсальные процессы обмена генетической информацией (конъ--элементы, плазмиды) и универсальные процессы обмена генетической информацией (конъ-югация, трансформация, трансдукция, рекомбинация). [10].

Наблюдаемая драматическая картина нарастающей резистентности возбудителей инфекционных болезней человека сложилась в результате совокупного действия нескольких факторов: неадекватного использования антибиотиков - выбора препарата, схемы лечения и/или дозировки (так, в Канаде и США 50 %, а во Вьетнаме - 70% назначений антибиотиков амбулаторным больным признано неоправданным [3]); использования антибиотиков в пище-вом производстве (50 % производимых антибиотиков используется в животноводстве, расте- % производимых антибиотиков используется в животноводстве, расте-% производимых антибиотиков используется в животноводстве, расте-


79

ниеводстве и садоводстве); активации эволюционных механизмов у госпитальных сообществ микроорганизмов (мутации, горизонтальный перенос генов, мобильные генетические элемен-ты [11]).

В Российской Федерации, как и во всем мире, происходят процессы эволюционной адаптации возбудителей инфекционных заболеваний к применяемым антибактериальным пре-паратам, проблема резистентности стоит очень остро [12-14]. В нашей лаборатории проводят-ся работы по изучению молекулярных механизмов множественной устойчивости у бактери-альных патогенов, показана важная роль мобильных генетических элементов в распростране-нии генов эпидемических бета-лактамаз CTX-M типа, а также интегронов - в формировании фенотипов множественной устойчивости у энтеробактерий [15, 16].

Горизонтальному переносу генов (HGT) противостоит специфический механизм за-щиты генома бактерий от чужеродной информации - система CRISPR (короткие палиндром-ные повторы, регулярно расположенные группами), препятствующая поглощению клеткой чужеродной ДНК и являющаяся аналогом иммунной системы у высших организмов [17]. Дан-ная система состоит из коротких нуклеотидных последовательностей (спейсеров), имеющих вирусное, плазмидное или хромосомное происхождение, а иммунность обеспечивается бла-годаря синтезируемым на их основе коротким интерферирующим последовательностям РНК (crRNAs), которые узнают соответствующую последовательность инородной ДНК. CRISPR система играет важную роль в эволюции патогенеза бактерий и влияет на фитнес бактериаль-ных клеток [18]. Показано, что глобальное использование антибиотиков приводит к уменьше-нию количества CRISPR в бактериальных популяциях, что повышает уровень мобилизации ДНК механизмами HGT, поэтому в популяции бактерий отмечается обратная зависимость между содержанием CRISPR и уровнем множественной устойчивости к антибиотикам [19]. Интересно, что бактериофаги находятся в состоянии ступенчатой взаимной эволюции с бак-териями-хозяевами: фаги способны преодолевать CRISPR систему хозяина за счет новых му-таций своего генома в области прото-спейсерного мотива (PAM), а хозяин генерирует новые спейсеры в CRISPR [20].

Возможность передачи генетических детерминант резистентности к антибактериаль-ным препаратам посредством бактериофагов показана в ряде исследований. В эксперименте чувствительный штамм Sa�mone��a Typhimurium. приобретал устойчивость к бета-лактамам и тетрациклину в результате независимой трансдукции фагами, захватывающими из генома устойчивого штамма Sa�mone��a enter��a серовара Heidelberg гены резистентности b�aCMY-2, tetA и tetB [21]. Бактериофаг AP-151, выделенный из нозокомиального MDR штамма P. aerug�nosa, трансдуцировал генетические детерминанты устойчивости к цефалоспоринам и карбапене-мам в реципиентный штамм P. aerug�nosa [22]. Метагеномный анализ вирома мокроты боль-ных кистозным фиброзом на присутствие генов резистентности выявил гены эффлюксных на-сосов, детерминанты устойчивости к фторхинолонам и бета-лактамам, что позволило авторам выявить резервуар способных к мобилизации генов резистентности, которые могут быстро распространяться среди бактерий в данной специфичной нише [23]. Гены устойчивости к ан-тибактериальным препаратам (b�aTEM, b�aCTX-M (clusters 1 and 9) и me�A) были обнаружены с помощью количественной ПЦР в ДНК бактериофагов, выделенных от сельскохозяйственных животных (свиней, крупного рогатого скота и птицы), что позволило сделать вывод о том, что бактериофаги являются векторами для горизонтального переноса генов резистентности между бактериальными патогенами животных [24]. Лизогенный перенос ex v�vo генов устойчивости к эритромицину (mefA) и тетрациклину (tet�) наблюдали между штаммами стрептококков груп-пы А [25].

Таким образом, явление устойчивости патогенных бактерий к антибактериальным


80

препаратам – природный эволюционный феномен, который невозможно остановить. Поэтому для решения проблемы терапии инфекционных заболеваний могут быть использованы такие подходы как возврат к открытым ранее антибиотикам и отвергнутым по разным причи-нам (даптомицин, открытый в 1980 г, был выведен на фармацевтический рынок в 2003 г., по-сле подбора используемых в терапии дозировок препарата); комбинация антибиотиков друг с другом или с другими классами лекарств для повышения эффективности (ко-тримоксазол, имипенем с природными добавками); комбинация антибиотиков с ингибиторами механиз-мов резистентности (ампициллин с клавулановой кислотой; ингибиторы эффлюксных насо-сов); использование альтернативных (ортогональных) стратегий (вакцинация против воз-будителей инфекционных болезней [26]; лечение бактериофагами; использование энхансеров врожденного иммунитера – таких как катионные антимикробные пептиды или бактериоцины [27]); комбинация антибиотиков с бактериофагами (эфффект предсказать трудно, т.к. он за-висит от условий воздействия антибиотиком и от скорости мутирования) [28].

Современное состояние проблемы резистентности возбудителей инфекционных бо-лезней говорит о том, что эта проблема не может быть решена усилиями только клинической микробиологии, как это было на заре эры антибиотиков. Она требует концентрации объеди-ненных усилий микробиологов, экологов, специалистов здравоохранения, образования, поли-тических деятелей, сотрудников сельского хозяйства и фармацевтической промышленности.

Библиографический список1. WH� Annual Report, 2012. http://www.who.int/gho/publications/2. Aminov RI. A brief history of the antibiotic era: lessons learned and challenges for the

future. // Front. Microbiol. 2010. – Vol. 1. – P. 134.3. European Centre for Disease Prevention and Control. Annual Epidemiological Report

2011. / Reporting on 2009 surveillance data and 2010 epidemic intelligence data. Stockholm: ECDC; 2011.

4. Paterson DL, Doi Y. A step closer to extreme drug resistance (XDR) in gram-negative bacilli. // Clin. Infect. Dis. – 2007. – Vol. 45. – No. 9. – P. 1179-1181.

5. Magiorakos A.-P., Srinivasan A., Carey R. B., Carmeli Y., Falagas M.E., Giske C.G., Har-Magiorakos A.-P., Srinivasan A., Carey R. B., Carmeli Y., Falagas M.E., Giske C.G., Har-barth S., Hindler J.F., Kahlmeter G., �lsson-Liljequist B., Paterson D.L., Rice L.B., Stelling J., Stru-elens M.J., Vatopoulos A., Weber J.T., Monnet D.L. Multidrug-resistant, extensively drug-resistant and pandrug-resistant bacteria: an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance. // Clin. Microbiol. Infect. – 2012. – Vol. 18. – P. 268–281.

6. Menne J., Nitschke M., Stingele R., et al. Validation of treatment strategies for entero-Menne J., Nitschke M., Stingele R., et al. Validation of treatment strategies for entero-Nitschke M., Stingele R., et al. Validation of treatment strategies for entero-Validation of treatment strategies for entero-haemorrhagic Es�her��h�a �o�� 104:H4 induced haemolytic uraemic syndrome: case-control study. // BMJ. – 2012. – Vol. 345. - e4565.

7. Rolain J.M., Parola P., Cornaglia G. New Delhi metallo-beta-lactamase (NDM-1): to-Rolain J.M., Parola P., Cornaglia G. New Delhi metallo-beta-lactamase (NDM-1): to-wards a new pandemia? // Clin. Microbiol. Inf. – 2010. – Vol.16. - N 12. – P. 1699-1701.

8. Wright G.D. Antibiotic resistance in the environment: a link to the clinic? // Curr. �pin. Microbiol. - 2010. – Vol. 13. – P. 589–594.

9. Sommer M.�.A., Dantas G., Church G.M. Functional Characterization of the Antibiotic Resistance Reservoir in the Human. // Microflora Sci. – 2009. – Vol. 325. – P. 1128-1131.

10. Wright G.D. Q&A: Antibiotic resistance: where does it come from and what can we do about it? // BMC Biol. - 2010 – Vol. 8. - P. 123.

11. Stokes H.W., Gillings M.R. Gene flow, mobile genetic elements and the recruitment of antibiotic resistance genes into Gram-negative pathogens. // FEMS Microbiol. Rev. – 2011. – Vol. 35. – No 5. – P. 790-819.


81

12. Письмо Роспотребнадзора от 02.10.2007 № 0100/9938 07 32 “О заболеваемости ВБИ в Российской Федерации” // Главная медицинская сестра. - 2007. - № 12. - С. 103–108.

13. Edelstein M., Pimkin M., Palagin I., Edelstein I., and Stratchounski L. Prevalence and Molecular Epidemiology of CTX-M Extended-Spectrum β-Lactamase-Producing Es�her��h�a �o�� and K�ebs�e��a pneumon�ae in Russian Hospitals. // Antimicrob Agents Chemoter. – 2003. – Vol. 47. – P. 3724–3732.

14. Сидоренко С.В., Березин А.Г., Иванов Д.В. Молекулярные механизмы устойчиво-сти грамотрицательных бактерий семейства Enteroba�ter�a�eae к цефалоспориновым антибио-тикам. // Антибиотики и химиотер. – 2004. – Т. 49. – N 3. – C. 3-13.

15. Фурсова Н.К., Прямчук С.Д., Абаев И.В., Ковалев Ю.Н., Шишкова Н.А., Печерских Э.И., Коробова О.В., Асташкин Е.И., Пачкунов Д.М., Светоч Э.А., Сидоренко С.В. Генетиче-ское окружение генов b�aCTX-M, локализованных на конъюгативных плазмидах нозокомиальных изолятов Enteroba�ter�a�eae, выделенных в России в 2003-2007 гг. // Антибиотики и химиотер. – 2010. - Т. 55. - № 11-12. – С. 3-10.

16. Fursova N., Pryamchuk S., Kruglov A., Abaev I., Pecherskikh E., Kartsev N., Svetoch E., Dyatlov I. The Novel CTX-M-116 beta-Lactamase Gene Discovered in Proteus m�rab��s Is Com-posed of Parts of the CTX-M-22 and CTX-M-23 Genes. // Antimicrob. Agents Chemother. – 2013. – Vol. 57. – No. 3. – P. 1552-1555.

17. van der �ost J., Jore M.M., Westra E.R., Lundgren M., Brouns S.J. CRISPR-based adap-van der �ost J., Jore M.M., Westra E.R., Lundgren M., Brouns S.J. CRISPR-based adap-tive and heritable immunity in prokaryotes. // Trends Biochem. Sci. – 2009. – Vol. 34. – No. 8. – P. 401-407.

18. Marraffini L.A. Impact of CRIPSR immunity on the emergence of bacterial pathogens. // Future Microbiol. – 2010. – Vol. 5. – No. 5. – P. 693-695.

19. Palmer K.L., Gilmore M.S. Multidrug-resistant enterococci lack CRISPR-cas. // MBio. – 2010. – Vol. 1. – No. 4. pii: e00227-10.

20. Sun C.L., Barrangou R., Thomas B.C., Horvath P., Fremaux C., Banfi eld J.F. Phage mu-Sun C.L., Barrangou R., Thomas B.C., Horvath P., Fremaux C., Banfield J.F. Phage mu-tations in response to CRISPR diversification in a bacterial population. // Environ. Microbiol. – 2013. - Vol. 15. – No 2. – P. 463-470.

21. Zhang Y., LeJeune J.T. Transduction of b�a(�MY-2), tet(A), and tet(B) from Sa�mone��a enter��a subspecies enterica serovar Heidelberg to S. Typh�mur�um. // Vet. Microbiol. – 2008. – Vol. 129. – No. 3-4. – P. 418-425.

22. Blahov� J., Kr�likov� K , Krcméry V , Jezek P. Low-Frequency transduction of imipe-Blahov� J., Kr�likov� K , Krcméry V , Jezek P. Low-Frequency transduction of imipe-nem resistance and high-frequency transduction of ceftazidime and aztreonam resistance by the bac-teriophage AP-151 isolated from a Pseu�omonas aerug�nosa strain. // J. Chemother. – 2000. – Vol. 12. – No. 6. – P. 482-486.

23. Fancello L., Desnues C., Raoult D., Rolain J.M. Bacteriophages and diffusion of genes encoding antimicrobial resistance in cystic fibrosis sputum microbiota. // J. Antimicrob. Chemother. – 2011. – Vol. 66. – No. 11. – P. 2448-2454.

24. Colomer-Lluch M., Imamovic L., Jofre J., Muniesa M. Bacteriophages carrying antibi-Colomer-Lluch M., Imamovic L., Jofre J., Muniesa M. Bacteriophages carrying antibi-otic resistance genes in fecal waste from cattle, pigs, and poultry. // Antimicrob. Agents. Chemother. – 2011. – Vol. 55. – No. 10. – P. 4908-4911.

25. Di Luca M.C., D�Ercole S., Petrelli D., Prenna M., Ripa S., Vitali L.A. Lysogenic trans-Di Luca M.C., D�Ercole S., Petrelli D., Prenna M., Ripa S., Vitali L.A. Lysogenic trans-fer of mef(A) and tet(�) genes carried by Phim46.1 among group A streptococci. // Antimicrob. Agents Chemother. – 2010. – Vol. 54. – No. 10. – P. 4464-4466.

26. Finch, R. and Hunter, P.A. Antibiotic resistance--action to promote new technologies: report of an EU Intergovernmental Conference held in Birmingham, UK, 12-13 December 2005. // J Antimicrob Chemother. - 2006. -Spl 1. - i3-i22.


82

27. Hassan M., Kjos M., Nes I.F., Diep D.B., Lotfipour F. Natural antimicrobial peptides from bacteria: characteristics and potential applications to fight against antibiotic resistance. // The Authors Journal of Applied Microbiology. - 2012. – Vol. 113. – No. 4. – P. 723-736.

28. Escobar-P�ramo P, Gougat-Barbera C, Hochberg ME. Evolutionary dynamics of sepa-Escobar-P�ramo P, Gougat-Barbera C, Hochberg ME. Evolutionary dynamics of sepa-rate and combined exposure of Pseudomonas fluorescens SBW25 to antibiotics and bacteriophage. // Evol Appl. 2012 Sep;5(6):583-92

ANTIBACTERIAL RESISTANS OF THE BACTERIAL PATHOGENS: EVOLUTION MECHANISMS AND CLINICAL IMPORTANCE

Fursova N.K., Kartsev N.N., Ivashov S.V., Svetoch E.A.

Key words: ant�ba�ter�a� res�stan�e, hor�zonta� gene transfer, evo�ut�on of the res�stan�e

The stu�y presents the rev�ew of the pub��at�ons an� the exper�menta� �ata �on�ern�ng preva�en�e of the ant�ba�ter�a� res�stan�e among human ba�ter�a� pathogens, evo�ut�on of the�r mo�e�u�ar me�han�sms, an� ��n��a� �mportan�e of the phenomena. Impa�t of ba�ter�ophages �nto the pro�ess of hor�zonta� gene transfer between ba�ter�a �s ��s�usse�.

УДК 619:616.98:579.842.14

ИЗУЧЕНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ БАКТЕРИОФАГОВ ДЛЯ ОБРАБОТКИ ПТИЦЫ ЗАРАЖЕННОЙ САЛЬМОНЕЛЛЕЗОМ

Храмов М. В.*, кандидат медицинских наук, Костенко Ю. Г.**, доктор ветеринарных наук, профессор,Воложанцев Н.В., кандидат биологических наук, Перелыгин В.В., кандидат биологических наук, Веревкин В.Н., кандидат биологических наук,Светоч Э.А. доктор ветеринарных наук, профессор *ФБУН «ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора** ГНУ ВНИИМП им. В. М. Горбатова РАСХН

Ключевые слова: Сальмонеллез, бактериофаги, мясо птицы, фаговый препаратРабота посвящена проблеме пищевого сальмонеллеза и деконтаминации мяса птицы

от сальмонелл.

Сальмонеллез является одной из опасных инфекций пищевого происхождения и ши-роко распространен практически во всех регионах земного шара. [1,2] Ежегодно 1,4 млн че-ловек заболевает сальмонеллезом в США, регистрируется и подтверждается порядка 40000 случаев заражения, а умирает 380-400 человек в год. [2]

В России согласно официально опубликованным данным, в 2009 г. заболеваемость сальмонеллезом составила 35,2 человека на 100 тыс. населения. В частности, в Кемеровской области в 2010 г. этот показатель был намного выше - 67,2 человека на 100 тысяч населения.


83

[3].Экономический ущерб от сальмонеллеза среди людей весьма значителен. По некото-

рым расчетам, в США общие расходы на борьбу с данным заболеванием ежегодно составляют порядка 3 млрд. долларов.

Связь между домашней (и промышленного производства) птицей и сальмонеллезом имеет длительную историю. Более 50 лет назад, пуллороз и птичий тиф были основной при-чиной падежа домашней птицы (кур и индеек), что сдерживало развитие птицеводства. [4]. Впоследствии возникла другая проблема, связанная с увеличением выделения из продуктов и мяса домашней птицы неспецифичных к ней сероваров сальмонелл, которые вызвали заболе-вание человека.

В Израиле, где количество сальмонеллеза человека резко снизилось с 1995, (особенно вызываемого Enter�t��s и Typh�mur�um), появился новый клон S. Infant�s, который выделятся от человека и птицы. [1]

Люди заболевают в основном при употреблении пищевых продуктов. Согласно по-следним данным, в 2009 г. в странах Европы причиной заболеваний людей были в основном одни и те же сероварианты сальмонелл: S. enteritidis, S. typhimurium, S. virchov, S. Infantis. [2].

В России при заболевании сальмонеллезом доминировал серовариант S. enteritidis, но в последние годы появились сведения о возрастающей роли сальмонелл группы D, в част-ности, S. infantis. В Кемеровской области в 2010 г. основным возбудителем сальмонеллеза у

Таблица 1 - Выявление сальмонелл в охлажденном мясе и фарше (пробы образ-цов из торговой сети Германии)

Объекты исследованийКоличество исследо-

ванийВыявлено сальмонелл

Кол-во случаев %Говядина, телятина 322 4 1,2

Свинина 385 13 3,4Фарш из говядины 283 4 1,4Фарш из свинины 340 13 3,8

Таблица 2 - Выявление сальмонелл в мясной продукции РФ в 2010-2011 гг.Наименование продукции Количество исследований Выявлено сальмонелл, %Мясо охлажденное в отрубах 350 2Полуфабрикаты мясные бескостныекрупнокусковые 550 1мелкокусковые 400 3Полуфабрикаты мясные рубленные 500 3

Таблица 3 - Выявление сальмонелл в мясе птицы в 2010-2011 гг.Регионы взятия проб Кол-во исследований Выявлено сальмонелл, %Китай 1152 38,9-65,3Вьетнам 494 47,8Колумбия 1003 26,7РоссияМосква, Сергиев-Посад, Дубна, Тула, Тверь, Рязань, Владимир

237 30

С.-Петербург, Тихвин, Псков, Новго-род

176 39,2

Краснодар, Сочи, Ейск, Тимашевск 42 23,8


84

людей была S. enteritidis, на которую пришлось 95,7% общей заболеваемости. [3]. Результаты исследований по выявлению сальмонелл в мясе и мясных продуктах, проведенных в некото-рых странах, представлены в таблицах 1, 2 и 3. [5, 6, 7,8].

В мясе птицы сальмонеллы выявляются значительно чаще по сравнению с «красным» мясом. В таблице 3. представлены результаты исследований мяса птицы на наличие сальмо-нелл в ряде стран и разных регионах России.

Исходя из потребительских качеств пищевой продукции сальмонеллез представляет большую опасность для здоровья населения. При этом необходимо иметь достоверные све-дения об устойчивости возбудителя к воздействию факторов внешней среды в процессе из-готовления и хранения мясной продукции. Существуют различные профилактические и кон-трольные меры в отношении сальмонеллезной инфекции однако ощущается явный дефицит информации об их эффективности, особенно в сфере здравоохранения. (15, 70, 133, 134). Так в замороженном мясе сальмонеллы сохраняют свою жизнеспособность месяцами, и только через 3-4 месяца хранения при -18 -20°С их количество начинает интенсивно снижаться, од-нако полной потери жизнеспособности не отмечается даже через 12 месяцев хранения. [9, 10]. Ионизирующее облучение дозой до 10 кГр подавляет рост сальмонелл, не изменяя качество продукта. Ультрафиолетовые лучи действуют бактерицидно в пределах длины волны от 200 до 313 нм, вызывая фотохимические изменения внутриклеточных структур бактерий. Бакте-рицидный эффект постоянного УФ-облучения с интенсивностью потока 0,0159 Вт/см2 при длине волны 254 нм и расстоянии 30-40 см от облучателя по отношению к сальмонеллам, со-держащимся на гладкой по верхности, достигается при экспозиции 20-25 мин (19,00-23,85 Вт с/см2). [9].

Требованиями ИСО 6579:2002 (ГОСТ Р 52814), СанПин 2.3.2 1078-01 не допускается наличие сальмонелл в 25 г мяса и других видов мясного сырья (в том числе мяса птицы и мяса механической обвалки), а также прочей мясной продукции.

B настоящее время, в связи со значительной частотой выявления сальмонелл в мясе, возникает острая необходимость разработки современных методов, обеспечивающих резкое снижение опасности заражения мясного сырья и изготовленной из него продукции.

В середине прошлого века в мире было широко распространено при менение кормо-вых антибиотиков для снижения риска заболеваний животных и птицы, в том числе и саль-монеллезом, однако в настоящее время их использование запрещено. Широкое применение в процессе переработки мяса, особенно тушек птицы для деконтаминации в отношении сальмо-нелл, нашли различные химические средства. Например, хлорирование воды, используемой для промывания и охлаждения тушек. С января 2010 г. в России (а в ряде европейских стран еще раньше) было запрещено использование хлора для этих целей.

Несмотря на то, что в мировой практике для обработки поверхности мяса животных и особенно тушек птицы используется множество антимикробных препаратов, в том числе на основе органических кислот, уровень выявления сальмонелл в мясном сырье остается высо-ким даже в развитых странах. Такое положение указывает на то, что даже при соблюдении на предприятиях санитарно-гигиенических требований обработка поверхности тушек птицы в процессе переработки является малоэффективной и необходимы новые подходы к решению этой проблемы.

Так, в Дании уже около 10 лет реализуется комплексная программа, охва тывающая все аспекты производства мяса птицы, начиная с контроля яйца при закладке в инкубатор, выращивания и откорма птицы и завершая ее пе реработкой. Реализация мероприятий, пред-усмотренных программой, позволила за 10 лет снизить выявление сальмонелл с 12 до l%.[8].

Имеются и другие, менее затратные, пути решения проблемы саль монеллеза, одним


85

из которых, по-нашему мнению, является использование бактериофагов.Поисковые исследования, проведенные в ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора, по из-

учению возможности применения бактериофагов для обработки птицы перед ее отправкой на перерабатывающее предприятие показали эффективность и перспективность такого подхода.

В ФБУН ГНЦ ПМБ созданы лабораторные образцы композиций сальмонеллезных бактериофагов и рецептурные формы препаратов на их основе, которые являются активными против Salmonella Enter�t��s.

В состав препаратов включены литические для S. Enter�t��s бактериофаги, выделен-ные из образцов сточных вод и фекальных масс птицефабрик. Препараты бактериофагов не токсичны для лабораторных животных, что проверено путем подкожного и внутрибрюшинно-го введения их беспородным белым мышам и цыплятам.

Разработан рецептурный состав препарата бактериофагов для применения в произ-водстве цыплят бройлеров, предполагающий высокий уровень сохранения биологических свойств бактериофагов на стадиях приготовления препарата, а также в процессе его хранения и применения. Рецептурная форма препарата состоит из частиц стандартного коммерческого комбикорма, которые содержат на своей поверхности инкапсулированные в полимерной ма-трице бактериофаги.

Эффективность фагового препарата была продемонстрирована на модели экспери-ментального сальмонеллеза у бройлерных цыплят. В экспериментах использовали две группы суточных цыплят по 30 голов в каждой. Одна группа – экспериментальная: цыплята имели сво-бодный доступ к кормовым гранулам, содержащим 2´108 бляшко-образующих единиц (БОЕ) на 1 г, в течение 25 дней, начиная с первого дня жизни. Вторая группа – контрольная: цыплята получали обычный корм, не содержащий бактериофаги. На 2-е сутки цыплят обоих групп за-ражали культурой штамма S.Enteritidis (6,9´107 КОЕ, per os через специальную иглу-канюлю). За цыплятами наблюдали в течение 25 суток.

Таблица 4 - Эффективность комплексного фагового препарата в составе корма при экспериментальной сальмонеллезной инфекции у бройлерных цыплят.

Группа цыплят Кол-во голов

Вес цыплятОбнаружение S. Enter�t��s в органах цыплят (кол-во

голов) 1-й день 25-й день Селезенка Печень

1. Опыт (фаговый препарат в составе корма 2´108 БОЕ/г в

теченте 25 дней)30 45 г 745 г 2 1

2. Контроль 30 45 г 779 г 29 18

Из данных, представленных в табл. 4, следует, что в контрольной группе цыплят, не получавших фаговый препарат, инфицированность сальмонеллами составляет 96,7 % (у 29 из 30 цыплят из внутренних органов выделяется культура S.Enter�t��s). В то же время, в экс-периментальной группе цыплят, получавших комплексный фаговый препарат в составе корма, культура S.Enter�t��s выделена только у двух особей. В этом случае процент инфицирования сальмонеллезом составляет 6,7 %. Полученные результаты свидетельствуют об эффектив-ном действии комплексного фагового препарата в составе корма для элиминации Sa�mone��a Enter�t��s у цыплят.

Таким образом, композиция нетоксичных, литических бактериофагов активных про-


86

тив сальмонелл серотипа Enteritidis, используемая в качестве кормовой добавки, может быть эффективным средством для борьбы с носительством Sa�mone��a Enter�t��s у промышленной птицы.

Библиографический список1. Anon. 2009. Sa�mone��a Infantis – Israel: relative increased morbidity. Israel Ministry of

Health, Department of Epidemiology circular, January 2009 (in Hebrew). English translation and edited at www.promedmail.org Archive Number 20090310.0987

2. WH� Global Foodborne Infections Network Country Datbank – A resource to link Hou-man and non-houman sources of Salmonella. Reference: Vleira AR et all 2009, ISVEE Conference, Durban, Sout Africa.

3. Обеспечение биологической безопасности пищевых продуктов, острые кишечные инфекции. Государственный доклад «О санитарно-эпидемиологической обстановке в Россий-ской Федерации в 2009 году», с. 138-145, 153-155, 309-313, 18. rospotrebnadzor.ru, 2010 г.

4. Poppe, C. 2000. Sa�mone��a infections in the domestic fowl. pp. 107 – 132. In C. Wray and A. Wray (eds). Sa�mone��a in Domestic Animals. CABI Publishing, Wallingford, �xford, U.K.

5. Schmidt U. Vorkomen und Verhalten von Salmonellen in Hackfleisch von Schwein. Fleischwirtschaft, 1988, 68 (1), s. 43-46.

6. Джеймс М. Джей, Мартин Дж., Лёсснер, Дэвид А. Гольден. Современная пищевая микробиология. М., Бином. Лаборатория знаний, 2011, с. 481.

7. Pointon A. Свод правил по гигиене мяса и мясной продукции. Доклад на междуна-Pointon A. Свод правил по гигиене мяса и мясной продукции. Доклад на междуна- A. Свод правил по гигиене мяса и мясной продукции. Доклад на междуна-A. Свод правил по гигиене мяса и мясной продукции. Доклад на междуна-. Свод правил по гигиене мяса и мясной продукции. Доклад на междуна-родном семинаре. М., ГНУ ВНИИМП им. В. М. Горбатова, 2011 г.

8. Walid Alaliю Распространение сальмонелл в мясе птицы в странах открытого рынка. Международная научно-практическая конференция «Балтийский форум ветеринарной меди-цины 2011», Санкт-Петербург, 2011 г.

9. Bolder, N.M. 2007. Microbial challenges of poultry meat production. Wor��’s Pou�t. S��. J. 63:401-422.

10. FA�/WH� (Food and Agriculture �rganization of the United Nations / World Health �rganization). 2009. Sa�mone��a and �ampy�oba�ter in chicken meat. Meeting Report. Microbiologi-cal Risk Assessment Series 19. http://www.who.int/foodsafety/publications/micro/mra19/en/index.html

11. NACMCF (National Advisory Committee on Microbiological Criteria for Foods). 1997. Generic HACCP application in broiler slaughter and processing. J. Foo� Prot. 60:579-604.

12. National Chicken Council. 1992. Good Manufacturing Practices. Fresh Broiler Prod-12. National Chicken Council. 1992. Good Manufacturing Practices. Fresh Broiler Prod-ucts. NCC, Washington, DC.

13. Костенко Ю. Г., Бутко М. П., Ковбаенко В. М., Выпегжанин А. Ф. с соавт. Руковод-Костенко Ю. Г., Бутко М. П., Ковбаенко В. М., Выпегжанин А. Ф. с соавт. Руковод- Ю. Г., Бутко М. П., Ковбаенко В. М., Выпегжанин А. Ф. с соавт. Руковод-Ю. Г., Бутко М. П., Ковбаенко В. М., Выпегжанин А. Ф. с соавт. Руковод-. Г., Бутко М. П., Ковбаенко В. М., Выпегжанин А. Ф. с соавт. Руковод-Г., Бутко М. П., Ковбаенко В. М., Выпегжанин А. Ф. с соавт. Руковод-., Бутко М. П., Ковбаенко В. М., Выпегжанин А. Ф. с соавт. Руковод-Бутко М. П., Ковбаенко В. М., Выпегжанин А. Ф. с соавт. Руковод- М. П., Ковбаенко В. М., Выпегжанин А. Ф. с соавт. Руковод-М. П., Ковбаенко В. М., Выпегжанин А. Ф. с соавт. Руковод-. П., Ковбаенко В. М., Выпегжанин А. Ф. с соавт. Руковод-П., Ковбаенко В. М., Выпегжанин А. Ф. с соавт. Руковод-., Ковбаенко В. М., Выпегжанин А. Ф. с соавт. Руковод-Ковбаенко В. М., Выпегжанин А. Ф. с соавт. Руковод- В. М., Выпегжанин А. Ф. с соавт. Руковод-В. М., Выпегжанин А. Ф. с соавт. Руковод-. М., Выпегжанин А. Ф. с соавт. Руковод-М., Выпегжанин А. Ф. с соавт. Руковод-., Выпегжанин А. Ф. с соавт. Руковод-Выпегжанин А. Ф. с соавт. Руковод- А. Ф. с соавт. Руковод-А. Ф. с соавт. Руковод-. Ф. с соавт. Руковод-Ф. с соавт. Руковод-. с соавт. Руковод-с соавт. Руковод- соавт. Руковод-соавт. Руковод-. Руковод-Руковод-ство по ветеринарно-санитарной экспертизе и гигиене производства мяса и мясных продуктов. М., 1994, РИФ «Антика», 607 с.

14. Костенко Ю. Г., Батаева Д. С., Краснова М. А., Храмов М.В. Проблема сальмонел-леза при производстве мясной продукции и пути ее решения. Все о мясе, 2011, № 5, с. 50-51

Бактериофаги в Биотехнологии и пищевой промышленности

87

Бактериофаги в Биотехнологии и пищевой промышленности

UD� 577.27

BACTERIOPHAGE TRANSDUCTION OF MOBILE GENETIC ELEMENTS IN METHICILLIN-RESISTANT STAPHYLOCOCCUS AUREUS

Doskar J., Doctor of Molecular Biology and Genetics, ProfessorMasaryk University, Brno, Czech Republic, [email protected] Varga M., Doctor of Molecular Biology and GeneticsMasaryk University, Brno, Czech Republic, [email protected] Maslanova I., Doctor of Molecular and Cell BiologyMasaryk University, Brno, Czech Republic, [email protected] Pantucek R., Doctor of Molecular and Cell Biology, Associate ProfessorMasaryk University, Brno, Czech Republic, [email protected] Mosa M., Doctor of ChemistryIMUNA s.r.o., Praha, Czech Republic, [email protected]

Key words: ba�ter�ophage, trans�u�t�on, hor�zonta� gene transfer, MRSA, mob��e genet�� e�ements, ant�b�ot�� res�stan�e, �ysogeny.

Th�s resear�h was a�me� at �hara�ter�z�ng trans�u�t�on of mob��e genet�� e�ements �n meth-��n-res�stant stra�ns of Staphy�o�o��us aureus. In th�s work �t has been prove� that ba�ter�ophages effi��ent�y transferre� ant�b�ot�� res�stan�e an� v�ru�en�e genes between ��n��a� S. aureus stra�ns. Furthermore, su��essfu� trans�u�t�on was performe� us�ng prophages of �ysogen�� aboratory an� ��n��a� stra�ns.

I�troduct�o�. Staphy�o�o��us aureus is an important bacterial pathogen constituting a serious problem for human health. �ne of the most noticeable features of this species is the rapid evolution leading to substantial strain variability and appearance of novel and dangerous antibiotic-resistant clones [1]. This evolution is pushed forward by horizontal transfer of mobile genetic elements (MGE), such as plasmids, transposons, cassette chromosomes, pathogenicity islands and genomic islands, carrying antibiotic resistance genes and virulence factors, which provide the host bacterium with a selective advantage. The most common mechanism of horizontal gene transfer in S. aureus is apparently transduction, because there is a little evidence that transformation occurs and conjugative plasmids or transposons are not widespread in S. aureus [2]. Many transduction experiments have been conducted intending to prove the mobility of variable genetic elements with genes coding for antibiotic resistance or toxins [3, 4, 5]. Ability of bacteriophages to transduce plasmid-borne and chromosomal genes has been well documented in most staphylococcal bacteriophages of serological group B, such as φ11, φ80 and φ80α [6, 7]. An important role in transferring MGE play also prophages.


88

As the majority of clinical S. aureus strains harbour one or more prophages [8], efficient transduction can follow after prophage induction from the host strain, which was recently demonstrated in S. aureus USA300 clone [9].

Mater�als a�d Methods. Five clinical S. aureus strains (Jevons B, 07/759, 08/019, 08/629 and 08/986) were chosen as donors of plasmids (4.4kb pT181 tetracycline resistance plasmid and 28kb penicillinase plasmid of Jevons B strain, 27kb pUSA300-H�UMR-like penicillinase plasmids of 08/019, 08/629, and 08/986 strains and 31kb pUSA300-H�UMR-like penicillinase plasmid of 07/759 strain). For transduction purposes with induced phage lysate, the lysogen 07/759 (φJB+) was constructed by inserting φJB into its chromosome as previously reported [10]. Three laboratory strains SA113, NCTC 8325-4, and RN4220 and two clinical strains 07/235 and 07/759 were used as recipients. Clinical genome-sequenced strain C�L was used for propagation of transducing bacteriophages followed by detection and quantification of MGE in phage particles. Induction of prophages by UV light and transduction experiments were performed as described previously [9].

The plasmid DNA from donors and transductants was isolated using the High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) according to the manufacturer�s protocol with following modifications of cell lysis. Eight ml of overnight culture was washed twice in phosphate buffered saline and resuspended in 235 µl of Suspension Buffer with RNase A + 15 µl of lysostaphin (Dr. Petry Genmedics, Reutlingen, Germany) (0.5 mg/ml). Then,

it was left incubating at 37 °C for 15 min. After the treatment, 250 µl of lysis buffer was added.

Bacteriophage integrase types and morphogenesis gene types corresponding to serological groups of prophages in the chromosomes of the strains were identified by multiplex PCR assay as previously reported [11].

Detection and quantification of different MGE types directly inside phage particles was performed by quantitative real-time PCR (qPCR) as described previously [12].

Results a�d D�scuss�o�. For the transduction experiments, well-characterized methicillin-resistant S. aureus strains containing different types of plasmids were used as donors for transferring these plasmids to recipient strains.

Preliminary experiments resulted in successful transfer of 4.4kb pT181 tetracycline resistance plasmid and 28kb penicillinase plasmid from methicillin-resistant donor Jevons B to laboratory recipient strains SA113, NCTC 8325-4 and RN4220. The transfer was mediated by prophage φJB induced by UV light from the chromosome of Jevons B strain to titre of 109 PFU/ml without the need of further propagation.

Afterwards, we focused on transferring the penicillinase and tetracycline resistance plasmids by bacteriophages φ80α and φJB between clinical isolates belonging to the USA300 clone. Phages were propagated on four donor strains 07/759, 08/019, 08/629, 08/986 possessing 27kb (31kb in case of 07/759) pUSA300-H�UMR-like penicillinase plasmids, which were successfully transferred to clinical recipient strain 07/235. As none of the USA300 donors naturally contain any tetracycline resistance plasmid, the pT181 plasmid was transduced from the Jevons B strain by means of φ80α to the strain 08/019. Subsequently, transductions of pT181 from such prepared strain were performed using φ80α and φJB into other strains of the USA300 clone.

In further experiments, 31kb penicillinase plasmid of lysogen 07/759 (φJB+) was transferred into the strain 07/235 by prophage φJB. Another donor strain used was the lysogenic transductant 07/235, pUSA300-H�UMR-like (φ80α+) containing the φ80α prophage and 27 kb penicillinase plasmid of the 08/986 strain. The UV-induced φ80α successfully transduced the plasmid into RN4220 strain. This shows that if the transductant is lysogenized, the plasmid can be very effectively mobilized.

The transductants obtained were tested for the presence of transferred plasmid and their


89

genetic background was characterized in detail. In all experiments, high transduction frequencies (10–5–10–6 CFU/PFU) were observed (Table 1) using phages propagated on donor strains as well as prophages induced from donors by UV light.

QPCR was employed to detect penicillinase plasmids in transducing phage particles and determine the ratio of transducing particles in phage lysates to infectious phage particles (determined as approximately 1 : 1700).

Further, phages φ11, φ80, φ80α and φ81 were propagated on S. aureus C�L strain and afterwards different types of MGE were detected inside their capsids using qPCR. These were parts of SCCme� (me�A and ��rA1 genes), parts of SaPIs (Sa1�nt and seb genes), parts of genomic islands (set5 and �ukD-�ukE genes) and genes clfB, sspA and nu� localized on bacterial chromosome. Total amount of bacterial DNA in phage capsids quantified by qPCR was described as log10 of mean gene copies per 1 ng phage DNA and frequencies of phage transducing particles carrying the targeted genes were finally calculated.

Table 1. - Tra�sduct�o� freque�c�es obta��ed w�th �hages �ro�agated o� do�or stra��s (f80a) as well as �ro�hages ��duced fro� do�ors by UV l�ght (fJB).

Do�or stra�� Tra�sduc��g bacter�o�hage

Tra�sduced �las��d

(s�ze; ge�es)Rec��e�t stra��

Tra�sduct�o� freque�cy (CFU/

PFU)

07/759 f80a 31kb; b�aZ, �a�D 07/235 1.5 × 10-5

08/019 f80a 27kb; b�aZ, �a�D 07/235 9.2 × 10-6

08/629 f80a 27kb; b�aZ, �a�D 07/235 1.1 × 10-5

08/986 f80a 27kb; b�aZ, �a�D 07/235 7.9 × 10-6

08/019, pT181

f80a 4.4kb; tetK 07/759 4.6 × 10-6

07/759 fJB 31kb; b�aZ, �a�D 07/235 5.0 × 10-6

08/019 fJB 27kb; b�aZ, �a�D 07/235 1.1 × 10-6

08/629 fJB 27kb; b�aZ, �a�D 07/235 2.7 × 10-6

08/986 fJB 27kb; b�aZ, �a�D 07/235 9.0 × 10-7

08/019, pT181

07/759 (φJB+)

07/235 (φ80α+)

fJB

φJB

φ80α

4.4kb; tetK

31kb; b�aZ, �a�D

27kb; b�aZ, �a�D

07/759

07/235

RN4220

2.8 × 10-6

2.3 × 10-6

3.1 × 10-6

Co�clus�o�. The outstanding transduction abilities of serological group B phages φ80α and φJB have been proved by aforementioned experiments. Moreover, the efficient transfer of antibiotic resistance plasmids within methicillin-resistant S. aureus USA300 clone shows that such plasmids can be easily disseminated in bacterial populations by transducing bacteriophages. In addition to plasmids, also other types of MGE were detected inside transducing phage particles using qPCR, such as SCCme�, SaPIs and genomic islands. These findings indicate that bacteriophages play an important role in spreading the virulence and resistance determinants among bacterial strains and contribute to their evolution.


90

Ack�owledge�e�t. Supported by the Technology Agency of the Czech Republic (TA01010405), by the Program TIP of MP� of the Czech Republic (FR-TI4/417) and by the Internal Grant Agency (IGA) of the Ministry of Health of the Czech Republic (NT/12395-5/2011).

References1. Harris S.R., Feil E.J., Holden M.T., Quail M.A., Nickerson E.K., Chantratita N., et a�.

Evolution of MRSA during hospital transmission and intercontinental spread. // Science. – Vol. 327. –2010.– P. 469–474.

2. Lindsay J.A. S. aureus evolution: lineages and mobile genetic elements. // Staphy�o�o��us Molecular Genetics (Lindsay J.A., ed) – Caister Academic Press, Norfolk –2008.– P. 45–69.

3. Cohen S. and Sweeney H.M. Transduction of methicillin resistance in Staphy�o�o��us aureus dependent on an unusual specificity of the recipient strain. // J. Bacteriol. – Vol. 104. –1970.– P. 1158–1167.

4. Nakaminami H., Noguchi N., Nishijima S., Kurokawa I., So H. and Sasatsu M. Transduction of the plasmid encoding antiseptic resistance gene qacB in Staphy�o�o��us aureus. // Biol. Pharm. Bull. – Vol. 30. –2007.– P. 1412–1415.

5. Chen J. and Novick R.P. Phage-mediated intergeneric transfer of toxin genes. // Science. – Vol. 323. –2009.– P. 139–141.

6. Dowell C.E. and Rosenblum E.D. Serology and transduction in staphylococcal phage. // J. Bacteriol. – Vol. 84. –1962.– P. 1071–1075.

7. Novick R. Properties of a cryptic high-frequency transducing phage in Staphy�o�o��us aureus. // Virology. – Vol. 33. –1967.– P. 155–166.

8. Goerke C., Pantucek R., Holtfreter S., Schulte B., Zink M., Grumann D., Broker B.M., Doskar J. and Wolz C. Diversity of prophages in dominant Staphy�o�o��us aureus clonal lineages. // J. Bacteriol. – Vol. 191. –2009.– P. 3462–3468.

9. Varga M., Kuntova L., Pantucek R., Maslanova I., Ruzickova V. and Doskar J. Efficient transfer of antibiotic resistance plasmids by transduction within methicillin-resistant Staphy�o�o��us aureus USA300 clone. // FEMS. Microbiol. Lett. – Vol. 332. –2012.– P. 146–152.

10. Borecka P., Rosypal S., Pantucek R. and Doskar J. Localization of prophages of serological group B and F on restriction fragments defined in the restriction map of Staphy�o�o��us aureus NCTC 8325. // FEMS. Microbiol. Lett. – Vol. 143. –1996.– P. 203–210.

11. Kahankova J., Pantucek R., Goerke C., Ruzickova V., Holochova P. and Doskar J. Multilocus PCR typing strategy for differentiation of Staphy�o�o��us aureus siphoviruses reflecting their modular genome structure. // Environ. Microbiol. – Vol. 12. –2010.– P. 2527–2538.

12. Maslanova I., Doskar J., Varga M., Kuntova L., Muzik J., Maluskova D., Ruzickova V. and Pantucek R. Bacteriophages of Staphy�o�o��us aureus efficiently package various bacterial genes and mobile genetic elements including SCCme� with different frequencies. // Environ. Microbiol. Reports. – Vol. 5. –2013.– P. 66–73. doi: 10.1111/j.1758-2229.2012.00378.x.


91

UD� 577.27

COMPARISON OF IN VITRO LYTIC ACTIVITIES OF THREE BACTERIOPHAGE PREPARATIONS STAFAL®, STAPHYLON®

AND PYOBACTERIOPHAGUM LIQUIDUM AGAINST METHICILLIN RESISTANT STAPHYLOCOCCUS AUREUS

Pantucek R., Doctor of Molecular Biology, Associate ProfessorMasaryk University, Brno, Czech Republic, [email protected] Petras P., Doctor of Chemistry National Institute of Public Health, Praha, Czech Republic, [email protected] J., Doctor of Molecular Biology, ProfessorMasaryk University, Brno, Czech Republic, [email protected] Ruzickova V., Doctor of Microbiology, Associate ProfessorMasaryk University, Brno, Czech Republic, [email protected] Bostik J., Doctor of BiologyIMUNA s.r.o., Praha, Czech Republic, [email protected] Mosa M., Doctor of ChemistryIMUNA s.r.o., Praha, Czech Republic, [email protected]

Key words: Staphy�o�o��us aureus, MRSA, ba�ter�ophage therapy, Myov�r��ae, mu�t��o�us sequen�e typ�ng, phage typ�ng, STAFAL®.

In th�s work we summar�ze the resu�ts of �n v�tro sus�ept�b��ty test�ng of meth��n-res�stant S. aureus stra�ns to ba�ter�ophage preparat�on STAFAL® �ompare� w�th stra�n sus�ept�b��t�es to Pyo Ba�ter�ophagum ��qu��um, Intest� Ba�ter�ophagum ��qu��um an� STAPHYL�N® pro�u�e� by E��ava B�opreparet�ons an� E��ava Phages �n Georg�a.

I�troduct�o�. Staphy�o�o��us aureus is one of the most common gram-positive opportunistic pathogens in humans causing from minor skin to severe systemic infections. The newly acquired genes responsible for virulence and resistance to antibiotics are rapidly disseminated in the staphylococcal population and multiple-resistant S. aureus strains represent a significant medical problem. Bacteriophages with a broad host range are suitable for fighting these pathogenic bacteria as an alternative to antibiotic therapy.

STAFAL® is an antistaphylococcal phage lysate for topical application, containing highly effective virulent phage particles of Twortlikevirus genus of family Myov�r��ae [1] with a strong and rapid lytic and polyvalent effect produced under GMP by IMUNA s.r.o. in the Czech Republic. The preparation is standardized in its efficacy according to the concentration not less than 1 x 107 of specific phage particles per 1.0 ml. STAFAL® is designed exclusively for topical application in infections caused by staphylococcal strains. It can be used both in human as well as in veterinary medicine in all forms of staphylococcal infections. It is used for the destruction of staphylococcal cells in the site of progressing infection. The preparation is administered mainly for the elimination of causative agents of staphylococcal infection in the foci of infections (e.g. purulent processes of the skin, subcutis and in skin adnex) as well as in potential reservoirs (particularly in nasopharinx, intestinal and urinary tract). STAFAL® presents a significant therapeutical agent in the complex treatment of chronic form of staphylococcal infections (purulent affections, abcesses, fistulae, infections affecting deeply located soft tissues). STAFAL® is also an important part of preventive measures in pre-operation preparation with the aim of preventing the occurrence of superponed pyogenic complications after operation


92

interventions.Mater�als a�d Methods. Set of 120 MRSA strains was collected from hospital microbiology

departments of the Czech Republic in 1999 – 2011. The MRSA strains were classified by MLST [2], spa typing [3] and SCCme� typing [4] to 50 different genotypes. In addition to the commercial bacteriophage preparations, following polyvalent bacteriophages were used for susceptibility testing (their propagating strains are bracketed): K (S. aureus RN4220) [5], 812 (S. aureus CCM 4028) [6], 131 (S. aureus SA 6409) [7], U16 (S. ep��erm��s V505) [8] and SK311 (S. �arnosus TM 300) [9].

Individual phage lysates were adjusted to the titer 2-3 x 107 PFU ml-1. For estimating the susceptibility of staphylococcal strains to the phages under study, the spot test on nutrient agar plates containing calcium chloride was used. The strain tested was considered to be susceptible to a given phage if confluent or semiconfluent lysis and/or plaques were observed in the spot area, and resistant if no lysis in the spot area (no zone) was detected. If a phage tested formed a turbid spot area (turbid zone), the test was repeated three times. If at least one of these repeated tests gave confluent or semiconfluent lysis in the spot area, the tested strain was considered to be susceptible to the given phage or phage mixture.

Results a�d D�scuss�o�. The estimated susceptibilities of the 120 MRSA strains to bacteriophage medications and individual phages are given in Table 1. Twelve strains were completely resistant to both the preparation and all the phages tested. These resistant strains fell to sequence types ST 45, ST 80 and ST 239 whereas the susceptible strains belonged to ST 1, ST 5, ST 8, ST 20, ST 22, ST 30, ST 36, ST 111, ST 225, ST 228 and ST 247. STAFAL® exhibited �n v�tro about 10% broader host-range than Pyo-Bacteriophagum liquidum or Intesti- Bacteriophagum liquidum. Interestingly STAPHYL�N® had very limited host-range and only MRSA isolates belonging to Brazilian MRSA clone (ST239/spa-type t030/SCCme� III) were susceptible to this medication. �n the other hand this MRSA clone was resistant to STAFAL® and Pyo-Bacteriophagum liquidum.

Table 1. - Per ce�t of MRSA stra��s (�=120) wh�ch are susce�t�ble to �hage �re�arat�o�s a�d refere�ce �hages.

Phage STA-FAL®

PY� BAC-TERI�PH-

AGUM

INTESTI BACTE-RI�PH-AGUM

K 812 131 U16 SK311

Per cent of sus-ceptible strains 83 73 72 60 63 69 65 52

Different restriction-modification systems in the strains of distinct ST types indicate that the insensitivity of particular strains could be caused by restriction of phage DNA. Nevertheless, in the set of strains belonging to ST 5 and ST 8 that are generally susceptible to polyvalent phages, some isolates exhibited resistance to all polyvalent phages tested. In these cases, the insensitivity may be caused by a prophage which interferes with reproduction of polyvalent phages. This phenomenon was observed after laboratory lysogenization of some strains with temperate phages of the serogroup B.

Co�clus�o�. Ninety per cent of MRSA strains tested were susceptible to at least one preparation or polyvalent phages. Broad host-range of the preparation STAFAL® (83%) indicates that its use for treatment of MRSA infections seems promising however, the clinical efficacy must be further proved. MRSA strains resistant to all Myov�r��ae phages tested belonged to ST 45, ST 80 and ST 239.

Ack�owledge�e�t. Supported by the Technology Agency of the Czech Republic (TA01010405), by the Program TIP of MP� of the Czech Republic (FR-TI4/417) and by the Internal


93

Grant Agency (IGA) of the Ministry of Health of the Czech Republic (NT/12395-5/2011).

References1. Klumpp J., Lavigne R., Loessner M.J., Ackermann H.W. The SP�1-related bacteriophag-related bacteriophag-

es. // Arch. Virol. – Vol. 155. – 2010. – P. 1547–1561.2. Enright M.C., Day N.P., Davies C.E., Peacock S.J., Spratt B.G. Multilocus sequence typ-

ing for characterization of methicillin-resistant and methicillin-susceptible clones of Staphy�o�o��us aureus. // J. Clin. Microbiol. – Vol. 38. –2000. – P. 1008–1015.

3. Shopsin B., Gomez M., Montgomery S.�., Smith D.H., Waddington M., Dodge D.E., Bost D.A., Riehman M., Naidich S., Kreiswirth B.N. Evaluation of protein A gene polymorphic region DNA sequencing for typing of Staphy�o�o��us aureus strains. // J. Clin. Microbiol. – Vol. 37. – 1999. – P. 3559–3563.

4. Milheiriço C., �liveira D.C., de Lencastre H. Update to the multiplex PCR strategy for assignment of mec element types in Staphy�o�o��us aureus. // Antimicrob. Agents Chemother. – Vol. 51. – 2007. – P. 3374–7337.

5. ��Flaherty S., Coffey A., Edwards R., Meaney W., Fitzgerald G.F., Ross R.P. Genome of staphylococcal phage K: a new lineage of Myov�r��ae infecting gram-positive bacteria with a low G+C content. // J. Bacteriol. – Vol. 186. – 2004. – P. 2862–2871.

6. Pantucek R., Rosypalova A., Doskar J., Kailerova J., Ruzickova V., Borecka P., Snopkova S., Horvath R., Götz F., Rosypal S. The polyvalent staphylococcal phage phi 812: its host-range mu-tants and related phages. // Virology – Vol. 246. – 1998. – P. 241–252.

7. Pulverer G., Pillich J., Kocur M. Two new bacteriophages active against pathogenic staph-ylococci. // Zentralbl. Bakteriol. Parasit. Infekt. Hyg. I. �rig. – Vol. 201– 1966. – P. 321-325.

8. Schumacher-Perdreau F., Pulverer G., Schleifer K.H. The phage adsorption test: a simple method for differentiation between staphylococci and micrococci. // J. Infect. Dis. – Vol. 138. – 1978. – P. 392-395.

9. Götz F., Popp F., Schleifer K.H. Isolation and characterization of a virulent bacteriophage from Staphy�o�o��us �arnosus. // FEMS Microbiol. Lett. – Vol. 23. – 1984. – P. 303-307.

УДК 578.81:579.67

СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫЙ ПРОДУКТ ПИТАНИЯ «ФУДФАГ» В ПРОФИЛАКТИКЕ ПИЩЕВЫХ ИНФЕКЦИЙ

Алешкин А.В.*, доктор биологических наук, , (495)452-18-16, [email protected]Воложанцев Н.В.**, кандидат биологических наук, [email protected]Светоч Э.А.**, доктор ветеринарных наук, профессор, Афанасьев С.С.*, доктор медицинских наук, профессор, [email protected]Веревкин В.В.**, кандидат биологических наук, [email protected]Васильев Д.А.***, доктор биологических наук, профессор, [email protected]Золотухин С.Н.***, доктор биологических наук, профессор, Киселева И.А.*, [email protected]*ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора**ФБУН «ГНЦ ПМБ» Роспотребнадзора,*** ФГБОУ ВПО «УГСХА им. П.А. Столыпина»


94

Ключевые слова: бактериофаги, пищевые инфекции, фагосодержащие пробиоти�е-ские пищевые добавки.

Опасность инфицирования людей пищевой продукцией, контаминированной сальмонел-лами, шигеллами, эшерихиями, листериями, стафилококками и другими патогенными микроор-ганизмами, остается �резвы�айно высокой, особенно при употреблении продуктов быстрого приготовления. Осуществлен поиск и выделение бактериофагов, активных против данных бак-терий, изу�ены их фенотипи�еские и молекулярно-генети�еские свойства, проведена оценка без-опасности и эффективности применения у лабораторных животных и �еловека.

Введение. Микробиологическая безопасность пищи в ХХI веке остается ведущей проблемой гигиены питания. Появление новых технологий хранения на холоду, упаковки в пленку, минимальной переработки охлажденного сырья, длительная транспортировка, а также не соблюдение элементарной гигиены работниками пищеблоков, увеличивают возможность накопления в пище возбудителей пищевых инфекций из ряда сальмонелл, эшерихий, шигелл, кампилобактера, листерий, стафилококка и т.д. Применение антибиотиков в пищевой отрасли не решает эту проблему, снижая уровень экологической чистоты продукции и провоцируя по-явление новой категории патогенов – штаммов условно-патогенных бактерий, резистентных к антибиотикам.

Используя накопленный мировой опыт, данные отечественных микробиологов, успеш-но трудившихся в направлении изучения бактериофагов, а также действуя в рамках решения Ученого Совета Роспотребнадзора от 21 июня 2011 года, логично предложить бактериофаги для создания нового для России класса специализированных пищевых продуктов диетическо-го (профилактического) питания, использование которых позволит снизить риск возникнове-ния спорадических случаев и эпидемических вспышек пищевых инфекций.

Материалы и методы исследований. Используя коллекцию патогенных микроор-ганизмов, а также штаммы бактерий, выделенные от пациентов КДЦ, отобраны 7 производ-ственно-перспективных бактериофагов. С помощью микробиологических, биохимических, биотехнологических и молекулярно-генетических методов исследованы их биологические свойства, отработана технология культивирования, подтверждена безопасность и эффектив-ность полученного специализированного продукта диетического (профилактического) пита-ния (СП «ФУДФАГ») на лабораторных животных и в программе медицинской реабилитации лиц с хроническими заболеваниями органов пищеварения (Рис. 1).

Результаты исследований и их обсуждение. В ходе исследований нами были вы-делены из разных источников, изучены и отобраны 7 бактериофагов, активных в отношении S.aureus, E.coli 0157:H7, E.coli О104:H4, S.enteritidis, S.typhimurium, S.infantis, L. monocyto-.aureus, E.coli 0157:H7, E.coli О104:H4, S.enteritidis, S.typhimurium, S.infantis, L. monocyto-aureus, E.coli 0157:H7, E.coli О104:H4, S.enteritidis, S.typhimurium, S.infantis, L. monocyto-, E.coli 0157:H7, E.coli О104:H4, S.enteritidis, S.typhimurium, S.infantis, L. monocyto-E.coli 0157:H7, E.coli О104:H4, S.enteritidis, S.typhimurium, S.infantis, L. monocyto-.coli 0157:H7, E.coli О104:H4, S.enteritidis, S.typhimurium, S.infantis, L. monocyto-coli 0157:H7, E.coli О104:H4, S.enteritidis, S.typhimurium, S.infantis, L. monocyto- 0157:H7, E.coli О104:H4, S.enteritidis, S.typhimurium, S.infantis, L. monocyto-H7, E.coli О104:H4, S.enteritidis, S.typhimurium, S.infantis, L. monocyto-7, E.coli О104:H4, S.enteritidis, S.typhimurium, S.infantis, L. monocyto-E.coli О104:H4, S.enteritidis, S.typhimurium, S.infantis, L. monocyto-.coli О104:H4, S.enteritidis, S.typhimurium, S.infantis, L. monocyto-coli О104:H4, S.enteritidis, S.typhimurium, S.infantis, L. monocyto- О104:H4, S.enteritidis, S.typhimurium, S.infantis, L. monocyto-H4, S.enteritidis, S.typhimurium, S.infantis, L. monocyto-4, S.enteritidis, S.typhimurium, S.infantis, L. monocyto-S.enteritidis, S.typhimurium, S.infantis, L. monocyto-.enteritidis, S.typhimurium, S.infantis, L. monocyto-enteritidis, S.typhimurium, S.infantis, L. monocyto-, S.typhimurium, S.infantis, L. monocyto-S.typhimurium, S.infantis, L. monocyto-.typhimurium, S.infantis, L. monocyto-typhimurium, S.infantis, L. monocyto-, S.infantis, L. monocyto-S.infantis, L. monocyto-.infantis, L. monocyto-infantis, L. monocyto-, L. monocyto-L. monocyto-. monocyto-monocyto-genes, которые и составили основу СП «ФУДФАГ». Вирулентные фаги отбирались на основа-, которые и составили основу СП «ФУДФАГ». Вирулентные фаги отбирались на основа-нии их биологических, биохимических и молекулярно-генетических свойств. Индикаторные штаммы бактерий, на которых культивировались бактериофаги, проверялись на отсутствие профага индукцией митомицином С. Штаммы бактериофагов в титре от 1010 до 1013 БОЭ/мл получали выращиванием на плотных питательных средах в матрасах с последующей стери-лизующей фильтрацией и освобождением от эндотоксина на хромотографической колонке. В таблице 1 представлена полная характеристика отобранных штаммов.

Выделение и селекция 7 вирулентных штаммов бактериофагов по спектру их специфиче-ской литической активности против S.aureus, E.coli 0157:H7, E.coli 0104:H4, S.enteritidis,

S.typhimurium, S.infantis, L. monocytogenes


95

Подтверждение отсутствия умеренных фагов, интегрированных в бактериальные клетки, на которых культивируются отобранные штаммы бактериофагов, с помощью теста с митоми-

цином С

Получение бактериофагов на плотной питательной среде, стерилизующая фильтрация и уда-ление эндотоксина из полученных фаголизатов методом аффинной хроматографии

Подтверждение отсутствия генов, кодирующих токсины и других нежелательных генов в геноме отобранных фагов (с помощью ПЦР со специфическими праймерами), ПДРФ анализ для определения приблизительного размера геномов и последующего полногеномного сик-

венса фаговых ДНК

Подтверждение отсутствия стафилококковых, листериозных и шига-подобных токсинов (ИФА) в полученных фаголизатах

Проверка стабильности бактериофагов при 4±2 оС в течение года

Создание готовой формы – специализированного пищевого продукта диетического

(профилактического) питания

Оценка безопасности и эффективности конечного продукта на животных (острая токсич-ность, хроническая токсичность, фармакокинетика, специфическая эффективность)

Оценка безопасности и эффективности специализированного пищевого продукта диетиче-ского (профилактического) питания в рамках программы медицинской реабилитации лиц с

хроническими заболеваниями органов пищеварения

Процедура регистрации специализированного пищевого продукта диетического

(профилактического) питанияРисунок 1. План исследований (создания фагового коктейля).

Все штаммы бактериофагов специфичны, т.е. лизируют исключительно культуры па-тогенных энтеробактерий, не подавляют рост производственных пробиотических штаммов бифидобактерий, лактобацилл, E.coli M-17 и нормальной микрофлоры, выделенной от 100 па-E.coli M-17 и нормальной микрофлоры, выделенной от 100 па-.coli M-17 и нормальной микрофлоры, выделенной от 100 па-coli M-17 и нормальной микрофлоры, выделенной от 100 па- M-17 и нормальной микрофлоры, выделенной от 100 па-M-17 и нормальной микрофлоры, выделенной от 100 па--17 и нормальной микрофлоры, выделенной от 100 па-циентов КДЦ ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского».

В ходе работы был проведен ПДРФ анализ всех 7 штаммов. Это позволило нам полу-чить ориентировочный размер фагового генома каждого штамма и процентное содержание нуклеотидов в составе ДНК как подготовительный этап для дальнейшего полногеномного сек-венирования (рис.2).

С помощью ИФА тест-систем подтверждено отсутствие экзотоксинов в коктейле стерильных фаголизатов. Соответствие нашего продукта стандартам Европейской комиссии, контролирующей безопасность пищевых продуктов (EFSA), по содержанию эндотоксина под-тверждено ЛАЛ-тестом.

Оценку безопасности продукта проводили в опытах по изучению острой и хрониче-ской токсичности на лабораторных животных. В результате проведенных экспериментов было показано, что при всех возможных способах введения исследуемого продукта признаков ин-


96

токсикации у мышей и морских свинок не наблюдалось. Также на модели лабораторных животных были проведены фармакокинетические ис-

следования фагосодержащего продукта. Мы определяли количество вирусных частиц в фе-калиях животных в различные промежутки времени после однократного внутрижедудочного введения

коктейля бактериофагов. Через 9 часов после введения продукта сальмонеллезные фаги обнаруживаются в экскрементах мышей в наибольшей концентрации. В меньшем коли-честве в мышиных экскрементах определялись листериозный, эшерихиозный (EcD7) и стафи-лококковый фаги. В дальнейшем, количество специфических вирусных частиц снижалось и к 48 часам в мышиных фекалиях оставались только незначительные количества сальмонеллез-ных фагов (табл. 2).

Для исключения вероятности возникновения побочных эффектов по влиянию бакте-риофагов на нормальную микрофлору кишечника in vivo (на модели беспородных белых мы-in vivo (на модели беспородных белых мы- vivo (на модели беспородных белых мы-vivo (на модели беспородных белых мы- (на модели беспородных белых мы-шей) определяли изменение количества основных представителей микробиоценоза толстого кишечника на фоне 10 дневного внутрижелодучного введения фагового коктейля. Разработан-ная рецептура не влияет на нормальную микрофлору кишечника мышей.

Изучение специфической антибактериальной эффективности фагового продукта про-

Таблица 1. - Характеристика штаммов бактериофагов, входящих в СП «ФУД-ФАГ».

Наименова-ние фага СH1 ECD7 V32 SE40 ST11 SI3 Lm1

Бактериаль-ный штамм-хозяин

S. aureus E. coli�104:H4

E. coli�157:H7

S. enteri-tidis

S. typhimu-rium S. infantis L. monocy-

togenes

Источник выделения фага

Клини-ческий материал, Челябинск

Фекалии кур, Мо-сковская область

Сточные воды ко-ровника, Москов-ская об-ласть

Окружаю-щая среда, Москов-ская об-ласть

Фекалии кур, Ка-лужская область

Фекалии крупного рогатого скота, Мо-сковская область

Фекалии овец, Астрахан-ская об-ласть

Спектр ли-тической ак-тивности(% лизиса/ штамм бак-терий)

92/MRSA

100/ E. coli�104:H4�104:H4�157:H7и др.,70/Sh. sonnei и flexneri

E. coli�157:H7�157:H-

85/ S. ente-ritidis

100/S. typhimu-rium

64/ S. in-fantis

92/ L. mo-nocy-togenes

ПЦР-типирование известных токсин-ко-дирующих генов

Нет α-токсина

Нет rfb, stx1, stx2, eae и fliC

Нет rfb, stx1, stx2, eae и fliC

Нет stxA Нет stxA Нет stxA Нет LL�-токсина

Максималь-ный титр на штамме-хо-зяине (БОЕ/мл)

1010 1010 1010 1013 1010 1012 1010


97

водили на модели экспериментальной сальмонеллёзной инфекций у беспородных белых мы-шей, которых заражали штаммом S.enteritidis 92 Rifr. Оценивали как профилактическую, так и лечебную схемы введения коктейля бактериофагов. Введение препарата через 48 часов после заражения животных в течение 5 дней в дозе 0,5 мл/сут. продливало их жизнь до 9,6 дня, про-тив 8 в контрольной группе. При профилактическом режиме использования фагового коктейля (введение за 24 часа до заражения и далее в течение 5 дней в дозе 0,5 мл/сут.) выжило 30 % мышей, средний срок гибели павших мышей составил 11,4 дня. Бактериологический анализ органов и фекалий выживших животных на 14 сутки после окончания терапии подтвердил 100 % санацию.

Рисунок 2. Рестрикционный анализ ДНК штаммов бактериофагов, входящих в СП «ФУДФАГ».


98

Оценку специфической антибактериальной эффективности специализированного пи-щевого продукта диетического (профилактического) питания на основе бактериофагов про-водили также в рамках программы медицинской реабилитации у лиц с хроническими забо-леваниями органов пищеварения. Типовая программа реабилитации включала: дието-, фито-, бальнео-, кинезотерапию, тренинги, гастрошколы и т.д. При бактериологическом исследова-нии фекалий у пациентов были выявлены Staphylococcus aureus, энтеропатогенная Escherichia coli, грибы рода Candida и другие представители условно-патогенной микрофлоры, типичные для дисбиотического состояния кишечника. 30 пациентам основной группы дополнительно к типовой программе реабилитации был назначен фаговый коктейль по 50 мл 3 раза в день во время еды, курсом 10 дней. 16 пациентам группы сравнения реабилитация осуществлялась в рамках типовой программы. Включение в программу медицинской реабилитации фагового коктейля позволило на 33% снизить количество пациентов с дисбактериозом кишечника вто-рой и третьей степени, а у 37% пациентов основной группы добиться полной нормализации показателей микробиоценоза за счет элиминации Staphylococcus aureus и энтеропатогенной Escherichia coli (рис. 3).

Таблица 2. - Динамика персистенции фагов в кишечнике мышей после однократ-ного внутрижелудочного введения фагового коктейля (lg БОЭ/г).

Название фага

Титр фага в препарате, БОЭ/мл

Титр фагов в экскрементах, lg (БОЭ/г) Сmax,

БОЭ/гTmax,

чТ0, ч0 3 ч 6 ч 9 ч

12 ч

24 ч

48 ч

Lm1 0,5×106 0 0 4,0 4,5 3,8 0 0 4,5 9 < 24ЕсD7 1,1×106 0 1,6 5,7 5,9 5,3 3,0 0 5,9 9 < 48SI3 0,3×106 0 2,9 7,7 8,1 6,2 4,1 2,3 8,1 9 > 48ST� 1,0×106 0 2,9 7,2 8,0 6,4 5,3 2,8 8,0 9 > 48SE40 9,6×106 0 0 2,8 7,6 7,1 5,0 3,1 7,6 9 > 48V32 1,0×106 0 0 3,7 4,1 3,0 1,6 0 4,1 9 > 24СH1 1,3×106 0 н.д. 5,8 5,6 5,1 0 0 5,8 6 < 24

Рисунок 3. Динамика микробиологических показателей содержимого толстой кишки у пациентов с синдромом раздраженного кишечника и запором на фоне медицин-ской программы реабилитации.


99

В настоящее время нормативно-техническая документация на разработанный коктейль бактериофагов в форме специализированного пищевого продукта диетического (профилакти-ческого) питания успешно прошла санитарно-эпидемиологическую экспертизу в НИИ пита-ния РАМН. Федеральной службой Роспотребнадзора выдано свидетельство о государственной регистрации на СП «ФУДФАГ» № RU.77.77.19.004.Е.001234.02.13 от 20.02.2013 года.

Заключение. Сконструированный специализированный пищевой продукт диетиче-ского (профилактического) питания на основе бактериофагов безопасен для человека и жи-вотных и может применяться в качестве средства профилактического фагирования декретиро-ванных контингентов работников предприятий различных отраслей с целью снижения риска развития спорадических случаев и вспышек пищевых инфекций.

PROBIOTIC DIETARY SUPPLIMENT «FOODPHAGE» IN PROPHYLAXIS AGAINST FOOD-BORNE INFECTION

Aleshkin A.V., Volozhantsev N.V., Svetoch E.A., Afanas’ev S.S., Verevkin V.V., Vasil’ev D.A. , Zolotukhin S.N., Kiseleva I.A.

Key words: ba�ter�ophages, foo�-borne �nfe�t�ons, phage-base� prob�ot�� etary supp�ement.

The r�sk of �nfe�t�on �ause� by the foo� pro�u�ts �ontam�nate� w�th Sa�mone��a, Sh�ge��a, Es�her��h�a, L�ster�a, Staphy�o�o�� s very h�gh. Ba�ter�ophages, a�t�ve aga�nst the above ment�one� ba�ter�a, were sought an� s�ng�e� out. The�r phenotyp�� an� mo�e�u�ar genet�� features were stu��e� as we�� as safety an� effi��en�y for �ab an�ma�s an� humans.

УДК 619:616 -07

ТЕХНОЛОГИЯ КОНСТРУИРОВАНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКОГО БИОПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ БАКТЕРИОФАГОВ BORDETELLA

BRONCHISEPTICA И ПЕРСПЕРТИВЫ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ

Васильева Ю.Б., кандидат ветеринарных наук, доцент, [email protected]Васильев Д.А., доктор биологических наук, профессор, [email protected]Семанина Е.Н., научный сотрудник НИИЦМиБ ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина»

Ключевые слова: диагностика бордетеллёза, РНФ, Bor�ete��a bron�h�sept��a, фаговые биопрепараты.

В статье приводятся данные по разработке схемы индикации Bor�ete��a bron�h�sep-Bor�ete��a bron�h�sep- bron�h�sep-bron�h�sep-t��a в объектах ветеринарного надзора при помощи реакции нарастания титра фага с ис- в объектах ветеринарного надзора при помощи реакции нарастания титра фага с ис-пользованием нового диагности�еского биопрепарата. �редставлены результаты разработ-ки технологи�еских параметров изготовления активного и специфи�еского биопрепарата на основе бордетеллёзных фагов.


100

В настоящее время бордетеллез является широко распространенным заболеванием животных во многих странах мира [5].

В нашей стране статистические данные по распространению, методам выявления и ликвидации данной инфекции у животных крайне недостаточны.

Bor�ete��a bron�h�sept��a является возбудителем хронических и асимптоматических инфекций респираторного тракта (трахеобронхита) животных. Бордетеллёзом болеют соба-ки, лошади, свиньи, обезьяны, козы, лисы, кролики, кошки, хорьки, хомяки, крысы, морские свинки, птицы в любом возрасте, но наиболее тяжелые последствия развиваются у молодых особей. [7].

Инфекционный агент долго сохраняется в окружающей среде, поэтому чаще всего его обнаруживают в местах скученности животных (питомники, фермы, частные хозяйства). Возможность трансмиссии возбудителя из природных эпизоотических очагов к животным, со-держащимся в фермерских хозяйствах, и, как следствие, значительных экономических потерь в малом и среднем сельскохозяйственном бизнесе вследствие гибели или снижения продук-тивности животных, обусловливают необходимость выявления B. bron�h�sept��a и проведение противоэпизоотических мероприятий. В связи с этим актуальным является разработка мето-дов индикации и идентификации B. Bron�h�sept��a. Особо актуализирует поиск и разработку современных экспрессных высокочувствительных и специфичных средств и методов диагно-стики тот факт, что В. bron�h�sept��a может вызывать патологию дыхательных путей у человека [6].

Отсутствие недорогих высокоточных методов диагностики бордетеллёза значительно затрудняет получение исчерпывающей эпизоотологической и эпидемиологической информа-ции.

В отечественной ветеринарной практике фагодиагностика бордетеллёза не изучена и, несомненно, представляет научный и практический интерес.

Вследствие этого целью нашей работы явилась разработка диагностического биопре-парата для индикации и идентификации возбудителя бордетеллёза.

Для достижения поставленной цели мы поставили перед собой следующие задачи: 1. Подобрать оптимальный набор бактериофагов и сконструировать на их основе но-

вый биопрепарат для диагностики бордетеллёза.2. Разработать схему идентификации B. bron�h�sept��a с помощью бактериофагов. 3. Разработать биотехнологические параметры изготовления диагностического био-

препарата.4. Разработать схему ускоренной индикации B. bron�h�sept��a в объектах ветеринарно-

го надзора с помощью РНФ с использованием созданного биопрепарата.Материалы и методы исследований. Объектами исследований явились 5 референс-

штаммов B. bron�h�sept��a № 1, № 7, № 214, № 22067, № 8344; 48 штаммов B. bron�h�sep-. bron�h�sep-bron�h�sep-t��a, выделенных от животных с клиническими проявлениями респираторных заболеваний; 8 штаммов фагов B. bron�h�sept��a.

В работе использовали мясопептонный бульон, мясопептонный агар, среда Эндо, ка-зеиново-угольный агар, бордетелл-агар, кровяной агар, среда Борде-Жангу, среды Гисса, био-химические тест-системы для ускоренной идентификации микроорганизмов, агар-агар, на-трий хлорид, мочевина, перекись водорода, желатин, среда УГСХА BBR 57.

Работу проводили согласно общепринятым микробиологическим методам выделения и идентификации бактерий и фагов. Постановку РНФ для индикации B. bron�h�sept��a в объ-ектах внешней среды проводили по методикам, предложенным В.Д. Тимаковым, Д.М. Голь-дфарбом [1,2,3,4,8].


101

Результаты исследований и их обсуждение. На первом этапе работы по подбору фа-гов для диагностического биопрепарата нами была разработана схема выделения профагов из культуры B. Bron�h�sept��a методом облучения УФЛ. Выделенные по данной схеме восемь фагов пассировали для повышения их литической активности и в дальнейшем проводили се-лекцию по морфологическим признакам.

Проведённая селекция выделенных фагов позволила отобрать для дальнейшего ис-пользования в разработке биопрепарата бактериофаги B.br. – 1 УГСХА и B.br. – 7 УГСХА, лизирующие 92,5% изученных культур, обладающие высокой литической активностью по Ап-пельману 10-7 – 10-8 , по Грациа 3,1 х 108 – 4,3 х 109 активных корпускул в 1 мл.

Далее приступили к разработке технологических параметров изготовления и контроля диагностического фагового биопрепарата. Бордетеллёзные индикаторные бактериофаги полу-чали путем культивирования в мясопептонном бульоне с B. bron�h�sept��a. В качестве индика-торной культуры использовали штамм B. bron�h�sept��a № 8344, обладающий характерными для своего вида морфологическими, биохимическими и культуральными свойствами.

Для повышения активности бактериофагов проводили пассажи. Опытным путем опре-деляли оптимальное соотношение времени пассажа по литической активности фагов.

Установлено, что оптимальное время контакта культуры с фагами B.br. – 1 УГСХА и B.br. – 7 УГСХА составляет 7 часов. Этот режим мы использовали в дальнейших исследова-.br. – 7 УГСХА составляет 7 часов. Этот режим мы использовали в дальнейших исследова-br. – 7 УГСХА составляет 7 часов. Этот режим мы использовали в дальнейших исследова-. – 7 УГСХА составляет 7 часов. Этот режим мы использовали в дальнейших исследова-ниях.

Далее определили оптимальные количественные параметры соотношения фаговых корпускул и клеток бактерий B. Bron�h�sept��a. Результаты проведенных исследований показа-ли, что литическая активность бордетеллёзных фагов при разных соотношениях индикаторной культуры и фага была одинаково высокая и соответствовала 1,3 х 107 – 3,1 х 108 фаговых корпу-скул в 1,0 см3. Оптимальное соотношение количества фагов B.br. – 7 УГСХА, B.br. – 1 УГСХА и культуры составляет 1:2, литическая активность фагов при этом составляет 2,1 х 108, 4,3 х 109

активных корпускул в 1 мл соответственно.Затем подобрали оптимальный температурный режим культивирования бактериофа-

гов B. Bron�h�sept��a. Литическая активность фага B.br. – 1 УГСХА по методу Аппельмана при температуре 25 ˚С, 37 ˚С и 42 ˚С составила 10-6,10-7 и 10-6; по методу Грациа – 1,3 х 107, 3,1 х 108 и 1,1 х 107, соответственно. Титр фага B.br. – 7 УГСХА составил по методу Аппельмана 10-7, 10 -8 и 10-7– при 25 ˚С, 37 ˚С и 42 ˚С; по методу Грациа 1,4 х 108, 4,3 х 109 и 2,6 х 108 активных корпускул в 1 мл соответственно.

На основании полученных данных можно сделать вывод: оптимальным для культиви-рования фагов B. bron�h�sept��a является температура 37 ˚С.

Мы также изучили вопрос изменения литической активности бактериофагов с истече-нием времени для изыскания оптимальных условий хранения и кратности пересева производ-ственных штаммов, установления срока годности фаговых препаратов. Селекционированные бактериофаги B.br. – 1 УГСХА и B.br. – 7 УГСХА хранились во флаконах, при температуре 4˚С в виде лизатов бульонных культур, без консерванта. Литическую активность определяли по истечении 3, 6, 9 и 12 месяцев. Анализируя результаты проведенных исследований, можно сделать вывод, что по истечении 12 месяцев бактериофаги B.br. – 1 УГСХА и B.br. – 7 УГСХА не изменили своей литической активности и могут использоваться в качестве диагностическо-го биопрепарата в течении данного срока.

Мы провели контроль бактериофагов. Из полученного объема отбирали пробу каждо-го фага по 50 мл для определения чистоты физических свойств, титра фага по отношению к индикаторной культуре, спектра литической активности и специфичности.

Индикаторные фаги B.br. – 1 УГСХА и B.br. – 7 УГСХА не содержали посторонних


102

примесей, фаголизаты были прозрачными, светло-желтого цвета, на питательных средах с по-севами рост бактериальной микрофлоры и грибов отсутствовал, литическую активность инди-каторных бактериофагов B.br. – 7 УГСХА и B.br. – 1 УГСХА определяли методами Аппельма-B.br. – 7 УГСХА и B.br. – 1 УГСХА определяли методами Аппельма-.br. – 7 УГСХА и B.br. – 1 УГСХА определяли методами Аппельма-br. – 7 УГСХА и B.br. – 1 УГСХА определяли методами Аппельма-. – 7 УГСХА и B.br. – 1 УГСХА определяли методами Аппельма-B.br. – 1 УГСХА определяли методами Аппельма-.br. – 1 УГСХА определяли методами Аппельма-br. – 1 УГСХА определяли методами Аппельма-. – 1 УГСХА определяли методами Аппельма-на и Грациа (литическая активность индикаторных фагов составила от 10-7 по методу Аппель-мана и от 3,1 х 108 до 4,3 х 109 по Грациа), спектр литического действия фага B.br. – 7 УГСХА составил 81,1%, фага B.br. – 1 УГСХА – 47,2% из числа изучаемых штаммов, совместный спектр лизиса гомологичных бактерий составил 92,5%. По результатам изучения специфично-сти установлено, что индикаторные бордетеллёзные фаги являются неактивными в отношении штаммов других видов, родов.

Получив положительные результаты контроля, фаголизаты B.br. – 1 УГСХА и B.br. – 7 УГСХА разлили по 5,0 мл в стерильные флаконы и герметично закрыли. На флаконы наклеили этикетки с указанием наименования фага, его литической активности и даты упаковки.

Следующим этапом научной работы явилась разработка оптимальных условий по-становки реакции нарастания титра фага. Первоначально мы определили количественный показатель РНФ. Установили, что результат реакции является положительным (увеличение количества корпускул фагов B.br. – 1 УГСХА и B.br. 7 УГСХА более чем в 5 раз) в пробах при контаминации мясопептонного бульона бактериями B. bron�h�sept��a в концентрации 103 микробных клеток в 1 мл.

Затем определили оптимальное время постановки РНФ. В исследованиях использова-ли воду, смывы с глотки, фекалии, контаминированные бактериями B. bron�h�sept��a в концен-трации 105, 104, 103, 102, 101 м.к. в 1 мл.

Опыты по изучению чувствительности реакции в зависимости от времени контакта исследуемого материала с фагом показали, что РНФ с 7-часовой экспозицией материала с фа-гами B.br. – 1 УГСХА и B.br. – 7 УГСХА позволяет провести индикацию бактерий вида B. bron�h�sept��a в концентрации 104 м.к./мл за 19 часов.

В результате исследований установлено, что метод РНФ с предварительным подращи-ванием исследуемого материала в течение 7 часов позволяет обнаружить бактерии B. bron�h�-. bron�h�-bron�h�-sept��a в количестве 103 м.к./мл, время проведения исследований составляет 26 часов.

Далее изучили возможность использования РНФ для выявления B. bron�h�sept��a у до-машних животных и в объектах внешней среды.

Пробы физиологического раствора в объеме 5 мл вносили в колбы, содержащие по 50 мл МПБ, и контаминировали B. bron�h�sept��a в концентрации от 101 до 105 м.к./мл.

По результатам проведенных исследований нами установлено, что увеличение титра фагов B.br. – 1 УГСХА и B.br. – 7 УГСХА более чем в 5 раз произошло при концентрации 103 микробных клеток бордетелл в 1 мл физиологического раствора. Время исследований соста-вило 26 часов.

У собак и кошек брали смыв физиологическим раствором с глотки, в объеме 5 мл. Вносили в колбы, содержащие по 50 мл МПБ и контаминировали B. bron�h�sept��a в концен-трации от 101 до 105 м.к./мл.

По результатам проведенных исследований установлено, что увеличение титра фагов B.br. – 1 УГСХА и B.br. – 7 УГСХА более чем в 5 раз произошло при концентрации 103 микроб-ных клеток бордетелл в 1 мл исследуемых смывов с глотки собак и кошек. Исследование со-ставило 26 часов.

Пробы фекалий весом 5 г вносили в стерильные колбы, содержащие по 50 мл МПБ и контаминировали B. bron�h�sept��a в концентрации от 101 до 105 м.к./мл.

По результатам проведенных исследований установлено, что увеличение титра фагов B.br. – 1 УГСХА и B.br. – 7 УГСХА более чем в 5 раз произошло при концентрации 104 микроб-


103

ных клеток бордетелл в 1 г фекалий. Чувствительность реакции снизилась до этого уровня из-за обильного обсеменения фекалий посторонней микрофлорой, что повлияло на условия оптимального взаимодействия фагов B.br. – 1 УГСХА и B.br. – 7 УГСХА с B. bron�h�sept��a.

Мы провели повторное исследование исходных проб фекалий с увеличением времени экспозиции материала с фагом до 16 часов, это позволило повысить чувствительность РНФ до 103 м.к./мл, без выделения чистой культуры, при наличии посторонней микрофлоры.

Заключение. Таким образом, нами разработаны технологические параметры изготов-ления и контроля диагностического биопрепарата «B.br. – 11 УГСХА» на основе выделенных и изученных фагов B.br. – 1 УГСХА и B.br. – 7 УГСХА и параметры постановки реакции на-B.br. – 1 УГСХА и B.br. – 7 УГСХА и параметры постановки реакции на-.br. – 1 УГСХА и B.br. – 7 УГСХА и параметры постановки реакции на-br. – 1 УГСХА и B.br. – 7 УГСХА и параметры постановки реакции на-. – 1 УГСХА и B.br. – 7 УГСХА и параметры постановки реакции на-B.br. – 7 УГСХА и параметры постановки реакции на-.br. – 7 УГСХА и параметры постановки реакции на-br. – 7 УГСХА и параметры постановки реакции на-. – 7 УГСХА и параметры постановки реакции на-растания титра фага для ускоренной индикации B. bron�h�sept��a в объектах внешней среды. Метод РНФ с использованием биопрепарата «B.br. – 11 УГСХА» позволяет обнаружить ука-B.br. – 11 УГСХА» позволяет обнаружить ука-.br. – 11 УГСХА» позволяет обнаружить ука-br. – 11 УГСХА» позволяет обнаружить ука-. – 11 УГСХА» позволяет обнаружить ука-занные бактерии в концентрации от 103 м.к. в 1 мл исследуемого материала за 26 часов.

Разработанный нами диагностический биопрепарат «B.br. – 11 УГСХА» рекомендует-B.br. – 11 УГСХА» рекомендует-.br. – 11 УГСХА» рекомендует-br. – 11 УГСХА» рекомендует-. – 11 УГСХА» рекомендует-ся для индикации и идентификации В. bron�h�sept��a.

Библиографический список1. Адамс М. Бактериофаги / М. Адамс // М.: Медгиз, 1961. – 521 с.2. Васильев Д.А., Золотухин С.Н., Никишина Н.М. Учебно-методическое пособие по

методам общей бактериологии. -Ульяновск, 1998. – 151 с.3. Габрилович И.М. Общая характеристика бактериофагов / И.М. Габрилович //

Основы бактериофагии. – Минск. – 1973. – С. 5-24.4. Тимаков В.Д. Реакция нарастания титра фага (РНФ) / В.Д. Тимаков, Д.М. Гольдфарб

// М., 1962. – С. 65-71.5. Baker D.G. Natural pathogens of laboratory animals: their effects on research / D.G.

Baker // ASM Press, Washington, D.C. - 2003.6. Bjornstad �.N. Evolution and emergence of Bordetella in humans / �.N. Bjornstad, E.T.

Harvill // Trends Microbiol. – 2005. – N 13. – Р. 355-359. 7. Yuk M.H. Modulation of host immune responses, induction of apoptosis and inhibition of

NF-кВ activation by the Bor�ete��a type III secretion system / M.H. Yuk, E.Т. Harvill, P.A. Cotter, J.F. Miller // Mol. Micmbiol. – 2000. - №35. – Р.991-1004.

8. Разработка параметров постановки реакции нарастания титра фага для индикации бактерий Bacillus mesentericus в объектах санитарного надзора/ Д.А. Васильев [и др.] // Вест-Bacillus mesentericus в объектах санитарного надзора/ Д.А. Васильев [и др.] // Вест- mesentericus в объектах санитарного надзора/ Д.А. Васильев [и др.] // Вест-mesentericus в объектах санитарного надзора/ Д.А. Васильев [и др.] // Вест- в объектах санитарного надзора/ Д.А. Васильев [и др.] // Вест-ник УГСХА. – 2012. - №3(19) – С. 69-73

THE TECHNOLOGY OF CONSTRUCTION OF DIAGNOSTIC BIOLOGICAL PREPARATION ON THE BASIS OF BACTERIOPHAGES BORDETELLA BRONCHISEPTICA AND THE PROSPECTS FOR ITS USE

Vasileva Y.B., Vasilev D.А., Semanina Е.N.

Кey words: ��agnost��s of bor�ete��os�s, Bor�ete��a bron�h�sept��a, phage b�opreparat�ons.

The art��e presents the �ata on the e�aborat�on of the s�heme �n��at�ng Bor�ete��a bron�h�-sept��a �n the obje�ts of veter�nary surve��an�e w�th the he�p of rea�t�on of r�se of t�tre of the phage w�th the use of new ��agnost�� preparat�on. The resu�ts of �eve�opment of te�hno�og��a� parameters of manufa�ture of a�t�ve an� spe��fi� b�o�og��a� preparat�on on the bas�s of bor�ete��os�s phages are presente�.


104

ГИГИЕНИЧЕСКИЕ ТРЕБОВАНИЯ К РАЗМЕЩЕНИЮ, УСТРОЙСТВУ, ОБОРУДОВАНИЮ, КОНТРОЛЮ И ЭКСПЛУАТАЦИИ АСЕПТИЧЕСКИХ

И КОНТРОЛИРУЕМЫХ ОБЪЕКТОВ .В.Т.Ч. И ПРИ РАБОТАХ С БАКТЕРИОФАГАМИ.

Григорьев В.В., Афанасьев С.С., Алешкин А.В., Селькова Е.П.ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского

-Практическое отсутствие надлежащих нормативно правовых актов по размещению, устройству, оборудованию, контролю и эксплуатации асептических и контролируемых объ-ектов (далее по тексту – АКО), в том числе и группы риска Г II для работ с бактериофагами.

- В России не существует аттестованных согласно утвержденному «Положению 2003) лабораторных животных, питомников и экспериментально-биологических клиник (вивариев)

- Высоко эффективные фильтры (Н14) Шкафы-боксы биологической безопасности с ламинарным потоком не проходят ежегодный контроль своей защитной эффективности, в. т.ч. отсутствуют требования к помещениям, в которых установлены выше указанные шкафы-бок-сы.

- Высоко эффективные фильтры, установленные вентиляционных системах, обслу-живающие асептические и контролируемые (группа риска Г II), в лучшем случае, проходят упрощённый контроль на их целостность по заниженной концентрации исходного фонового тестового аэрозоля(5х106 ач0,3). Защитная эффективность указанных фильтров не проводится,

из-за отсутствия нормативных требований, т.е. 0,5х109ач0,3) - Не проводится аттестация рабочих мест помещений АКО по времени деконтамина-

ции их воздушной среды и определению застойных (невентилируемых) зон.- Существующей нормативной документации не предусмотрен контроль воздуха про-

ницания ограждающих строительных конструкций (далее по тексту – ОСК) помещений АКО и расчёт их прочности при возникновении нештатной ситуации на одной из вентиляционных систем, обслуживающих помещения АКО.

- Отсутствие мониторингового экспресс контроля микробиологической контаминации воздушной среды помещений АКО приводит к непредсказуемым последствиям в фармацевти-ческом производстве, в родовспомогательных и операционных боксах и.т.д.

В настоящее время специалистами МНИИЭМ им.Г.Н. Габричевского Роспотребнадзо-ра разработаны и направлены на утверждение Главному Врачу России ряд нормативно право-вых актов санитарно- гигиенических требований, обеспечивающих решение перечисленных выше проблем.

До утверждения выше указанных актов, согласно Федеральному закону от 27 декабря 2002 г. №184-ФЗ «О техническом регулировании» и Уставу Института МИИИЭМ им, Г.Н. Га-бричевского Роспотребнадзора специалистами Института разработаны и размещены в Интер-нет следующие стандарты организации добровольного применения:

1. СТОР 2.2.1.0001-11 «Гигиенические требования к размещению, устройству, обору-дованию, контролю и эксплуатации асептических и контролируемых объектов.

2. МУ СТОР 2.2.1.0002-11 «Контроль защитной эффективности шкафов-боксов с ла-минарным потоком воздуха ΙΙ класса биологической безопасности и их боксовых помещений»

3. МУ СТОР 2.2.1.0003-11 «Контроль защитной эффективности высоко эффективных фильтров, установленных вентиляционных системах, обслуживающих помещения АКО.

4. МУ СТОР 2.2.1.0004-11


105

5. МУ СТОР 2.2.1.0005-116. МУ СТОР 2.2.1.0006-117. МУ СТОР 2.2.1.0007-11Уровень выше указанных разработок и методик подтвержден в настоящее время ря-

дом публикаций в ФИПС РОСПАТЕНТА и защищён его патентами.

УДК 577.27

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КОМБИНАТОРНЫХ ФАГОВЫХ БИБЛИОТЕК ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИТЕЛ К ЦЕЛЫМ КЛЕТКАМ

Дыкман Л.А., доктор биологических наук, с.н.с., [email protected]Староверов С.А., доктор биологических наук, [email protected]Щеголев C.Ю., доктор химических наук, профессор, [email protected]Богатырев В.А., доктор биологических наук, с.н.с., [email protected]Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН

Ключевые слова: фаговый дисплей, биопаннинг, биоимиджинг, Azosp�r��um bras��ense

�редставлены данные об использовании фагового дисплея для полу�ения антител к целым клеткам и применении фаговых мини-антител для детекции клеток.

Введение. Традиционно биологическими компонентами, используемыми для спец-ифической детекции клеток, являются поликлональные и моноклональные антитела (АТ), ко-торые широко применяются в производстве диагностических тест-систем. В последнее время для решения подобных задач в молекулярной биологии стали использоваться генно-инженер-ные технологии клонирования узнающих фрагментов – гипервариабельных участков имму-ноглобулинов, которые являются более дешевыми и могут конкурировать по селективности с гибридомными технологиям. К такому методу относится технология фагового дисплея, соз-данная Джорджем Смитом [1]. Впервые возможность получения одноцепочечных последова-тельностей, составленных из вариабельных доменов АТ, в составе гибридного белка оболочки фага, была продемонстрирована Мак Кафферти с соавт. [2]. В дальнейшем были сконструи-рованы библиотеки, в которых комбинации легких и тяжелых цепей АТ продуцировались в составе фагового белка в виде мини-АТ – одноцепочечных АТ, гетеродимеров или отдельных растворимых молекул.

В настоящее время в литературе встречается достаточное количество данных о при-менении АТ, полученных методом фагового дисплея. В основном они используются в иммуно-анализе и иммунотерапии, например, для выявления и лечения гепатоклеточной карциномы, лимфатической лейкемии, меланомы и рака груди. Фрагменты scFv являются ценным инстру-scFv являются ценным инстру- являются ценным инстру-ментом в иммунотерапии рака и могут быть использованы как «внутриклеточные АТ», из-за уменьшения их размера по сравнению с Fab фрагментами. С помощью техники фагового дисплея могут быть получены разнообразные производные для векторной генной терапии, а также для создания специфически-направленных лекарственных средств. Помимо этого воз-можно применение мини-АТ в протеомике, в технологиях создания биосенсоров [3].

Кроме того, АТ, полученные с помощью технологии фагового дисплея, успешно ис-


106

пользуются для идентификации бактерий [4]. При этом чаще всего, для получения АТ исполь-зуют изолированные бактериальные антигены (АГ). Имеются лишь отдельные работы, кото-рые описывают получение АТ к целым бактериальным клеткам, в частности, стрептококкам [5]. На наш взгляд, изучение возможности получения мини-АТ на целые клетки (животные и бактериальные) представляет значительный интерес. Этому вопросу посвящено наше иссле-дование.

Материалы и методы исследований. В распоряжении Лаборатории иммунохимии ИБФРМ РАН имеются две библиотеки АТ: овечья комбинаторная фаговая библиотека, любез-но предоставленная профессором университета г. Абердина У. Харрисом [6], и комбинаторная фагмидная библиотека scFv мыши, сконструированная в Филиале института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН [7]. Процедуру биопаннинга проводили согласно [6].

Результаты исследований и их обсуждение.Биоимиджинг опухолевых клеток с использованием фаговых антител и наноча-

стиц золота.Целью данного этапа работы являлось получение мини-АТ на мембранные структуры

опухолевых клеток, синтез конъюгатов мини-АТ с золотыми нанооболочками (НО) и примене-ние данных нанокомплексов для мечения опухолевых клеток.

В качестве АГ использовали целые клетки линии СПЭВ. СПЭВ – клеточная линия почек эмбриона свиньи; морфология – эпителиоподобная, способ культивирования – моно-слойный. На поверхности экспонированы опухолевые АГ лейковирусов (Мезон–Пфайфер-по-добных) и онкорнавирусов А и С.

Мини-АТ на клетки СПЭВ были получены из овечьей комбинаторной фаговой библи-отеки. Для получения мини-АТ было проведено 3 раунда селекции, полученные специфичные фаги были проверены методом дот-анализа. В качестве вторичной метки использовали кроли-чьи антифаговые АТ, меченные золотыми НО.

На первом шаге клетки СПЭВ инкубировали с мини-АТ. Затем меченые фаговыми АТ (опыт) и немеченые (контроль) клетки инкубировали с конъюгатами золотых НО с кро-личьими антифаговыми АТ. Конъюгаты золотых НО с антифаговыми АТ биоспецифически связывались лишь с клетками, на поверхности которых присутствовали мини-АТ, а в случае «контроля» биоспецифического мечения не происходило.

Фотографии клеток СПЭВ, меченых НО, были получены методом темнопольной ми-кроскопии. Данный метод позволяет регистрировать только рассеянный свет от исследуемого объекта, что делает его очень удобным для визуализации клеток, меченных ЗНЧ. Фотографии получали с помощью микроскопа Leica DM 2500, оборудованного цветной ПЗС-камерой, с ис-пользованием объектива 40×. Все изображения меченых и контрольных клеток получали при одинаковых условиях освещения.

На рис. 1a,б приведены темнопольные снимки исходных клеток СПЭВ и золотых НО на ядрах из двуокиси кремния, соответственно. НО интенсивно рассеивают свет и выглядят на фотографиях как цветные пятна с диаметром около 1 мкм. Стоит отметить, что реальный размер НО гораздо меньше (около 140 нм). Как можно заметить, на снимках исходных клеток СПЭВ (рис. 1а) подобные цветные пятна не встречаются.

На рис. 1в,г приведены темнопольные фотографии клеток СПЭВ, которые инкубиро-вали только с конъюгатами НО с антифаговыми АТ (в), а также клеток СПЭВ, которые сначала инкубировали с мини-АТ и затем с конъюгатами НО (г). На темнопольных изображениях от-четливо видна разница между специфически (мини-АТ + конъюгат), неспецифически (только конъюгат НО с антифаговыми АТ) мечеными и немечеными клетками.


107

(a) (б)

(в) (г)

Рис. 1. Темнопольные изображения исходных клеток СПЭВ (a), золотых НО на

ядрах из двуокиси кремния (б), исходных клеток СПЭВ, инкубированных с конъюгатами золотых НО (негативный контроль, в), и клеток СПЭВ, которые инкубировали с мини-АТ и затем с конъюгатами золотых НО (г). На вставке показан увеличенный фрагмент, на котором отчетливо видно рассеяние от адсорбированных золотых НО.

Получение мини-антител к поверхностным антигенам Azospirillum brasilense Sp245 и их использование для детекции микробных клеток

Значительный интерес, на наш взгляд, представляет изучение возможности получе-ния мини-АТ на азотфиксирующие бактерии рода Azosp�r��um, участвующие в ассоциативных взаимоотношениях с растениями, для решения вопросов быстрой идентификации бактерий в окружающей среде. В связи с этим, основная задача данного этапа наших исследований заклю-чалась в получении фаговых АТ на АГ клеточной поверхности типового штамма A. bras��ense Sp245 с использованием овечьей фаговой библиотеки, а также изучение возможности их при-245 с использованием овечьей фаговой библиотеки, а также изучение возможности их при-менения при анализе поверхностных АГ клеточных структур и детекции клеток с помощью микроскопических методов.

Нами было проведено 3 раунда селекции мини-АТ на целые клетки A. bras��ense Sp245 и 1 раунд селекции на ЛПС и флагеллин клеток этого штамма с использованием клонов, об-ладающих более высокой чувствительностью и продуктивной активностью. Титр полученных фаговых мини-АТ составил 1:8000.

Электронно-микроскопическую идентификацию взаимодействия клеток A. bras��ense Sp245 с мини-АТ проводили с помощью электронного микроскопа Libra 120 (Carl Zeiss, Гер-245 с мини-АТ проводили с помощью электронного микроскопа Libra 120 (Carl Zeiss, Гер-Carl Zeiss, Гер- Zeiss, Гер-Zeiss, Гер-, Гер-мания). Фотографии, полученные с использованием электронной микроскопии, представлены на рис. 2. Как видно из рисунков, полученные нами фаговые мини-АТ располагаются по всей


108

клеточной поверхности в случае ЛПС и, вероятно, на «обломке» жгутика в случае с флагел-лином. Из данного эксперимента можно сделать вывод, что на основе мини-АТ и КЗ можно разработать тест-систему для изучения клеточной поверхности бактерий.

а бРис. 2. Электронно-микроскопическое выявление АГ клеточной поверхности A.

bras��ense S�245с помощью мини-АТ на ЛПС (а) и флагеллин (б).

Затем мы использовали полученные мини-АТ на целые клетки A. bras��ense Sp245 для идентификации азоспирилл на поверхности корня пшеницы. На рис. 3 приведена микрофото-графия корневого волоска, полученная на конфокальном лазерном микроскопе TCS SP5 (Leica, Германия). Выявление бактериальных клеток проводили последовательной инкубацией пре-парата корней пшеницы с азоспириллами (7 суток), мини-АТ на A. bras��ense Sp245 (сутки), кроличьими антифаговыми АТ (сутки) и козьими антикроличьими АТ, меченными флуорес-центным красителем Alexa Fluor 594 (Invitrogen, США).

Рис. 3. Выявление клеток A. bras��ense S�245 на поверхности корневого волоска пшеницы (конфокальная микроскопия).

Мы полагаем, что представленные в настоящем разделе результаты могут быть ис-пользованы для создания теста быстрой детекции микробных клеток и оценки экспонирован-ности тех или иных антигенных детерминант на клеточной поверхности бактерий [8-10].

Работа поддержана грантом РФФИ 12-04-00629-а.

Библиографический список1. Smith G.P. Filamentous phage fusion: Novel expression vectors that display cloned anti-

gens on the surface of the virion surface // Science. – 1985. – V. 228. – P. 1315-1317.2. McCafferty J., Griffiths A.D., Winter G., Chiswell D.J. Phage antibodies: Filamentous

phage displaying antibody variable domains // Nature. – 1990. – V. 348. – P. 552-554.3. Тикунова Н.В., Морозова В.В. Фаговый дисплей на основе нитчатых бактериофагов:

применение для отбора рекомбинантных антител // Acta Naturae. – 2009. – № 3. – С. 22-31.4. Paoli G., Brewster J.D. Identification of the surface antigen recognized by a L�ster�a

mono�ytogenes-specific phage-displayed antibody fragment and its presence in different physiologi-


109

cal conditions // J. Rapid Meth. Automat. Microbiol. – 2007. – V. 4. – P. 74-83.5. De Greeff A., van Alphen L., Smith H.E. Selection of recombinant antibodies specific for

pathogenic Strepto�o��us su�s by subtractive phage display // Infect. Immun. – 2000. – V. 68. – P. 3949-3955.

6. Charlton K.A., Moyle S., Porter A.J.R., Harris W.J. Analysis of the diversity of a sheep antibody repertoire as revealed from a bacteriophage display library // J. Immunol. – 2000. – V. 164. – P. 6221-6229.

7. Ламан А.Г., Шепеляковская А.О., Улитин А.Б., Маркова Е.В., Мареева Т.Ю., Бы-стров Н.С., Бровко Ф.А., Несмеянов В.А. Получение мини-антител против гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека с использованием библиотеки scFv мыши // Био-орг. химия. – 2002. – Т. 28. – С. 126-134.

8. Dykman L.A., Staroverov S.A., Guliy �.I., Ignatov �.V., Fomin A.S., Vidyasheva I.V., Karavaeva �.A., Bunin V.D., Burygin G.L. Preparation of miniantibodies to Azosp�r��um bras��ense Sp245 surface antigens and their use for bacterial detection // J. Immunoassay Immunochem. – 2012. – V. 33. – P. 115-127.

9. Староверов С.А., Видяшева И.В., Фомин А.С., Василенко О.А., Малинин М.Л., Га-балов К.П., Богатырев В.А., Дыкман Л.А. Разработка иммунозолотых диагностических си-стем для идентификации возбудителя туберкулеза in s�tu // Российский ветеринарный журнал. – 2011. – № 2. – С. 29-32.

10. Khanadeev V.A., Khlebtsov B.N., Staroverov S.A., Vidyasheva I.V., Skaptsov A.A., Ili-Khanadeev V.A., Khlebtsov B.N., Staroverov S.A., Vidyasheva I.V., Skaptsov A.A., Ili- V.A., Khlebtsov B.N., Staroverov S.A., Vidyasheva I.V., Skaptsov A.A., Ili-V.A., Khlebtsov B.N., Staroverov S.A., Vidyasheva I.V., Skaptsov A.A., Ili-.A., Khlebtsov B.N., Staroverov S.A., Vidyasheva I.V., Skaptsov A.A., Ili-A., Khlebtsov B.N., Staroverov S.A., Vidyasheva I.V., Skaptsov A.A., Ili-., Khlebtsov B.N., Staroverov S.A., Vidyasheva I.V., Skaptsov A.A., Ili-Khlebtsov B.N., Staroverov S.A., Vidyasheva I.V., Skaptsov A.A., Ili- B.N., Staroverov S.A., Vidyasheva I.V., Skaptsov A.A., Ili-B.N., Staroverov S.A., Vidyasheva I.V., Skaptsov A.A., Ili-.N., Staroverov S.A., Vidyasheva I.V., Skaptsov A.A., Ili-N., Staroverov S.A., Vidyasheva I.V., Skaptsov A.A., Ili-., Staroverov S.A., Vidyasheva I.V., Skaptsov A.A., Ili-Staroverov S.A., Vidyasheva I.V., Skaptsov A.A., Ili- S.A., Vidyasheva I.V., Skaptsov A.A., Ili-S.A., Vidyasheva I.V., Skaptsov A.A., Ili-.A., Vidyasheva I.V., Skaptsov A.A., Ili-A., Vidyasheva I.V., Skaptsov A.A., Ili-., Vidyasheva I.V., Skaptsov A.A., Ili-Vidyasheva I.V., Skaptsov A.A., Ili- I.V., Skaptsov A.A., Ili-I.V., Skaptsov A.A., Ili-.V., Skaptsov A.A., Ili-V., Skaptsov A.A., Ili-., Skaptsov A.A., Ili-Skaptsov A.A., Ili- A.A., Ili-A.A., Ili-.A., Ili-A., Ili-., Ili-Ili-neva E.S., Bogatyrev V.A., Dykman L.A., Khlebtsov N.G. Quantitative cell bioimaging using gold nanoshell conjugates and phage antibodies // J. Biophotonics. – 2011. – V. 4. – P. 74-83.

USING THE COMBINATORIAL PHAGE LIBRARY TO OBTAIN ANTIBODIES TO WHOLE CELLS

Dykman L.A., Staroverov S.A., Shchyogolev S.Yu., Bogatyrev V.A.

Key words: phage ��sp�ay, b�opann�ng, b�o�mag�ng, Azosp�r��um bras��ense

The art��e presents �ata on the use of phage ��sp�ay te�hn�que to obta�n the ant�bo��es to who�e �e��s an� the use of phage m�n�-ant�bo��es for �e��s �ete�t�on.

УДК 577.27

ТЕХНОЛОГИЯ ФАГОВОГО ДИСПЛЕЯ АНТИТЕЛ

Дыкман Л.А., доктор биологических наук, с.н.с.Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАНТел. +7(8452)970403, E-mail [email protected]

Ключевые слова: фаговый дисплей, нит�атые бактериофаги, комбинаторные библи-отеки миниантител, биопаннинг

�редставлены современные данные об использовании фагового дисплея антител в


110

медико-биологи�еских исследованиях.

Антитела (АТ) являются одним из эффекторных компонентов иммунной системы. Высокоспецифичное, высокоаффинное взаимодействие АТ с антигенами (АГ) позволяет ис-пользовать их в исследовательских, аналитических и терапевтических целях. Исторически первым источником АТ была сыворотка иммунных животных и человека. Получаемые таким образом АТ содержат набор иммуноглобулинов разных классов и подклассов, специфично уз-нающих «свой» АГ. Различные АТ сыворотки узнают несколько эпитопов АГ. Таким образом, сыворотка полиспецифична, что в ряде случаев является недостатком. Дальнейшим развитием способов получения АТ явилось создание гибридомной технологии [1], которая позволяет по-лучать АТ, продуцируемые одним клеточным клоном, узнающие один эпитоп и сохраняющие свои свойства во многих генерациях гибридной клетки (моноклональные АТ). К достоинствам моноклональных АТ можно отнести высокую специфичность, химическую однородность, воз-можность получения в больших количествах. К недостаткам – то, что технология получения моноклональных АТ разработана для мышей и крыс и является трудноприменимой в случае АТ человека, в то время как для терапии требуются именно человеческие иммуноглобулины. Затруднения возникают и в тех случаях, когда иммунизация животных по какой-либо причине невозможна или не удается преодолеть недостаток иммуногенности потенциальных АГ.

Для разрешения этой проблемы в настоящее время предложены методы молекуляр-ного клонирования фрагментов генов АТ. Одним из таких методов является техника фагового дисплея АТ, впервые предложенная в работе [2]. Эти исследователи показали возможность по-лучения одноцепочечных последовательностей, составленных из вариабельных доменов АТ, в составе гибридного белка оболочки фага. Они же продемонстрировали возможность высоко-эффективной аффинной селекции клонов, несущих антигенспецифические одноцепочечные АТ (миниантитела).

Основой метода является создание комбинаторной библиотеки, в которой вариабель-ные участки легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов соединены случайным образом и пред-ставлены на поверхности нитевидного бактериофага. Каждый бактериофаг, как и В-лимфоцит, экспрессирует АТ единственной специфичности. При достаточно большом размере библио-теки репертуар вариабельных участков будет сравним с репертуаром АТ в организме. Фаги, несущие АГ-связывающие фрагменты АТ (scFv, Fab) нужной специфичности, могут быть ото-браны на иммобилизованном АГ.

Создание фагового дисплея АТ обязательно включает следующие этапы: выделение мРНК из иммунных или интактных лимфоцитов, синтез на этой матрице вариабельных фраг-ментов генов легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов, объединение генов легких и тяже-лых цепей с помощью олигонуклеотидного линкера, клонирование этих генов в фаг, инфици-рование этим вектором E. �o�� (рис. 1). В результате таких манипуляций получают библиотеки, в которых комбинации легких и тяжелых цепей экспрессируются в составе фагового белка в виде одноцепочечных АТ, гетеродимеров или отдельных растворимых молекул.


111

Рис. 1. Схема конструирования фаговой библиотеки антител.

В технологии фагового дисплея чаще всего используют нелизирующие нитевидные фаги (М13, f1, fd и др.). Их вирион содержит кольцевую одноцепочечную ДНК, генетическая организация и последовательность которой известна для многих представителей данной груп-пы фагов. Размер генома составляет около 6000 нуклеотидов. Капсид вирусной частицы устро-ен одинаково у представителей всей группы и образован 5 структурными белками. Во всех сконструированных к настоящему времени фаговых библиотеках фрагменты АТ экспрессиру-ются в составе гибридных белков на основе капсидного белка g3p. G3p является самым боль-шим из структурных белков нитевидных фагов (406 аминокислотных остатков, М = 42 КДа). Он состоит из двух доменов: С-концевой домен встраивается в вирион и играет роль в сборке полноценного вириона, а N-концевой домен выполняет функцию адсорбции на F-пилях бак-терии-хозяина. Хотя для конструирования фаговых библиотек успешно использовалось вве-дение целевых последовательностей по нескольким разным сайтам, минимальное влияние на инфекционность вириона оказывали вставки, отстоящие на несколько аминокислотных остат-ков от N-конца белка. Лабильность конформации белка g3p и его терминальное расположение на вирионе являются благоприятными факторами для использования его в качестве основы для конструирования гибридных белков, особенно в тех случаях, когда не требуется получать большое количество копий гибридного белка в составе каждого вириона.

К достоинствам метода фагового дисплея можно отнести возможность отбора кло-нов-продуцентов миниантител �n v�tro, минуя стадию иммунизации животных, возможность получения АТ к аутоантигенам, токсинам и слабоиммуногенным соединениям, отсутствие не-обходимости использования лабораторных животных и поддержания долговременных культур клеток эукариот, сокращение времени получения индивидуальных клонов до 10-14 дней по сравнению с несколькими месяцами в случае гибридомной технологии, относительную про-стоту получения миниантител и их низкую себестоимость, возможность создания гибридных


112

молекул АТ с маркерными белками.Фаговый дисплей – молекулярная техника, которая позволяет экспрессировать чуже-

родные белки на поверхности фаговых частиц. Фаги, трансформированные таким образом, становятся способны не только экспрессировать и переносить чужеродные белки, но и спо-собны к дальнейшей репликации чужеродной ДНК. Фаговый дисплей значительно расширяет число нуклеотидных последовательностей, которые могут быть преобразованы в популяции различных пептидов и белков, позволяя отбирать те из них, которые имеют интересующие ис-следователя свойства. Первые опыты фагового дисплея включали варианты только с одним экс-прессированным на поверхности фаговой частицы пептидом на фоне всей популяции белков фагов дикого типа (пептидные библиотеки) [3]. В настоящее время масштабы и возможности метода значительно увеличились. Естественные и синтетические пептиды, белки и белковые домены, а также синтетические АТ можно экспрессировать на поверхности фаговых частиц.

И для обычной гибридомы и для фаговых АТ источником материала является обшир-ное разнообразие репертуара АТ млекопитающих. Фундаментальное различие в том, что для производства АТ посредством гибридомной технологии применяют иммортализацию проду-цирующих АТ В-клеток, в то время как фаговый дисплей АТ использует гены, которые кодиру-ют вариабельные участки АТ. V-гены млекопитающих, которые кодируют вариабельные обла-сти АТ, являются источником материала для конструирования фаговых библиотек АТ. Библи-отеки по существу разделяются на две категории в зависимости от того, получены эти гены из неиммунизированных животных (сингл-пот библиотеки) или животных, иммунизированных целевым АГ (постиммунные библиотеки).

В широком смысле и фаговый дисплей и АТ, полученные посредством гибридомной технологии, могут использоваться в одном диапазоне применений, например ELISA, вестерн-блоттинг и иммуноцитохимия. Однако фаговый дисплей имеет некоторые преимущества в сравнении с гибридомной технологией. Одно из ограничений гибридомной технологии состо-ит в том, что использование гибридомных АТ должно вестись при параметрах, приближенных к физиологическим, что может быть неудобным для некоторых исследуемых объектов. Техно-логия фагового дисплея позволяет изолировать АТ с достаточной связывающей способностью при любых физиологических условиях.

Кроме иммуноанализа, миниантитела используют в иммунотерапевтической практике [4], в протеомике [5], в технологиях создания биосенсоров [6]. Обширную информацию о ме-тоде и вариантах его применения можно почерпнуть в обзорах [7-12].

Работа с библиотекой сводится к тому, чтобы изначальное большое разнообразие ре-комбинантных клонов уменьшить до разумного количества, которое можно детально анализи-ровать. Основа процедуры скрининга – аффинная селекция (биопаннинг) и она имеет несколь-ко базовых шагов (рис. 2):

1) амплификация начальной библиотеки;2) инкубация фаговых частиц с иммобилизованным АГ;3) отмывка и удаление несвязавшихся фаговых частиц;4) элюция связавшихся фагов;5) инфицирование элюированными частицами клеток-хозяев и дальнейшая их ампли-

фикация либо индивидуальное расселение колоний.


113

Рис. 2. Схема биопаннинга

Раунды аффинной селекции (биопаннинга), усиливающие селектированную библио-теку, повторяются, как правило, от 3 до 6 раз. В конечном счете, отбирают отдельные клоны фагов, имеющие наибольшее сродство к АГ.

Используются различные формы отбора фага, включая прямое связывание фага с АГ, присоединенным к матриксу (на колонке) или же сорбированным на чашках или иммунотъю-бах (основной способ), или с АГ на поверхности клеток. Причем при получении АТ к гапте-нам, последние приходится предварительно конъюгировать с белком-носителем.

В последние годы только на фармацевтическом рынке США продается более 14 анти-тел, антигенсвязывающие домены которых получены методом фагового дисплея [13]. Все это объясняет факт притока крупных компаний, таких как Morphosys GmbH (Германия; http://www.morphosys.com); Cambridge Antibody Technology (Великобритания; http://www.catplc.co.uk) и Dyax (США; http://www.dyax.com) и др., в область разработки и применения комбинаторных фаговых библиотек фрагментов антител.

Работа поддержана грантом РФФИ 12-04-00629-а.

Библиографический список1. Kohler G., Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predeter-

mined specificity // Nature. - 1975. - V. 256. - P. 495-497.2. McCafferty J., Griffiths A.D., Winter G., Chiswell D.J. Phage antibodies: Filamentous

phage displaying antibody variable domains // Nature. - 1990. - V. 348. - P. 552-554.3. Smith G.P. Filamentous phage fusion: Novel expression vectors that display cloned anti-

gens on the surface of the viron // Science. - 1985. - V. 228. - P. 1315-1317.4. Harris W.J., Cunniugham C. Antibody therapeutics. - Berlin: Springer-Verlag, 1995, - 150 p.5. Liu B., Marks J.D. Applying phage antibodies to proteomics: Selecting single chain Fv


114

antibodies to antigens blotted on nitrocellulose // Anal. Biochem. - 2000. - V. 286. - P. 119-128.6. Stich N., Gandhum A., Matyushin V., Raats J., Mayer C., Alguel Y., Schalkhammer T.

Phage display antibody-based proteomic device using resonanace-enhanced detection // J. Nanosci. Nanotechnol. - 2002. - V. 2 - P. 375-381.

7. Winter G., Griffiths A.D., Hawkins R.E., Hoogenboom H.R. Making antibodies by phage display technique // Ann. Rev. Immunol. - 1994. - V. 12. - P. 433-455.

8. Smith G.P., Petrenko V.A. Phage display // Chem. Rev. - 1997. - V. 97. - P. 391-410.9. Willats W.G.T. Phage display: Practicalities and prospects // Plant Mol. Biol. - 2002. - V.

50. - P. 837-854.10. Clark M. V gene selection �n v�tro (phage libraries) – making assembled repertoires of

antibody heavy and light chain variable domains // In: John Humphrey Advanced Lecture Series in Im-munology: Immunology in Health and Disease / Eds. Asherson G., McMichael A.F.R.S., Nesmeyanov V. - London, Moscow, 2002.

11. Yau K.Y.F., Lee H., Hall J.C. Emerging trends in the synthesis and improvement of hapten-specific recombinant antibodies // Biotechnol. Adv. - 2003. - V. 21. - P. 599-637.

12. Тикунова Н.В., Морозова В.В. Фаговый дисплей на основе нитчатых бактериофа-гов: применение для отбора рекомбинантных антител // Acta Naturae. - 2009. - № 3. - С. 22-31.

13. Azzazy H., Highsmith W. Phage display technology: clinical applications and recent in-Azzazy H., Highsmith W. Phage display technology: clinical applications and recent in-novations // Clin. Biochem. - 2002. - V. 35. - P. 425-445.

ANTIBODY PHAGE DISPLAY TECHNOLOGY

Dykman L.A.

Key words: phage ��sp�ay, fi�amentous ba�ter�ophage, �omb�nator�a� ��brar�es, b�opann�ng

The art��e presents the �urrent �ata on the use of ant�bo�y phage ��sp�ay �n b�ome��a� resear�h.

УДК 619:616-07

БОКСЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ. ОСНОВЫ ЭКСПЛУАТАЦИИ И ОБСЛУЖИВАНИЯ.

Ененко А.А., начальник аналитической лаборатории ЗАО «Ламинарные системы», г.МиассТел. +7(3513)54-47-44

Деятельность химических, радиологических, бактериологических и других лаборато-рий связана с использованием различного рода защитного лабораторного оборудования. Тра-диционным было использование активной вытяжной системы, которая, до определенного вре-мени, была единственным средством удаления и контроля распространения аэрозолей агентов, образующихся в процессе работы. Однако на сегодняшний день только вытяжной вентиляции недостаточно для обеспечения безопасной работы персонала, и защиты окружающей среды. Помимо этого остро стоит вопрос об организации области пространства с чистой воздушной


115

средой, необходимой для предупреждения попадания на продукт аэрозольных загрязнений из окружающей среды.

Современный рынок защитного лабораторного оборудования представляет широкий спектр продуктов, относящихся к лабораторной безопасности, которые, однако, можно разде-лить на 3 основные группы: химические вытяжные шкафы; ламинарные укрытия (или лами-нарные боксы), и боксы микробиологической безопасности.

Химические вытяжные шкафы (рис. 1, а) по сути, представляют собой улучшен-ную версию вытяжных зонтов, подключаемых к активной вытяжной системе. Принцип работы шкафа заключается в удалении паров вредных веществ из рабочей камеры в жестко подклю-ченную активную систему вытяжной вентиляции, с помощью направленного внутрь шкафа через рабочий проем воздушного потока. Вытяжной шкаф обеспечивает только защиту опера-тора от паров и аэрозолей вредных веществ, с которыми производится работа.

а б Рис. 1. а – химический вытяжной шкаф, б – ламинарное укрытие.

Ламинарные укрытия (или ламинарные боксы) (рис. 1, б) предназначены для созда-ния беспылевой абактериальной воздушной среды и применяются при оснащении отдельных рабочих мест медицинских, фармацевтических и других учреждений с высокими требовани-ями к чистоте воздуха в рабочей зоне. Бокс используется при работе с препаратами и бакте-риальными культурами, не представляющими угрозы здоровью оператора, когда необходима защита рабочего материала от загрязнения из окружающей среды, или работа с объектом тре-бует стерильной рабочей зоны. Воздух из помещения проходит через HEPA фильтр и подается в рабочую камеру однонаправленным вертикальным ниспадающим потоком. Из рабочей зоны воздух попадает обратно в помещение. Следует отметить, что ламинарное укрытие не обеспе-чивает защиты ни оператора, ни окружающей среды.

Наиболее востребованным типом защитного лабораторного оборудования сегодня являются боксы микробиологической безопасности. Даже среди специалистов в области инженерного обеспечения биологической безопасности существует путаница в терминах, ка-сающихся БМБ. Это связанно с тем, что на сегодняшний день в РФ не существует единой согласованной системы нормативно технической документации, определяющей минимум тех-нических и эксплуатационных характеристики БМБ, а также регламентирующий порядок экс-


116

плуатации и проведения проверок. С 1 декабря 2011 года в силу вступил новый российский стандарт ГОСТ Р ЕН 12469-

2010 «Биотехнология. Технические требования к боксам микробиологической безопасности», который является прямым переводом европейской нормы EN 12469-2000. Данный документ определяет технические требования, конструкцию БМБ, а так же состав, периодичность и ме-тодики проверок эксплуатационных характеристик БМБ. Согласно новому стандарту отличи-тельной особенностью всех боксов микробиологической безопасности является возможность работы с потенциально опасными и опасными микроорганизмами. Также стандарт разделяет все БМБ на три класса.

БМБ I класса (по ГОСТ Р ЕН 12469-2010) – это БМБ с рабо�им проемом, �ерез кото-рый оператор может проводить манипуляции внутри бокса. Бокс должен быть сконструиро-ван таким образом, �то бы обеспе�ивать защиту оператора от выброса диспергированных контаминированных �астиц, образовавшихся внутри бокса. Это достигается с помощью на-правленного внутрь бокса �ерез рабо�ий проем воздушного потока, с последующей его филь-трацией и удаления из бокса.

Таким образом, БМБ I класса предназначен для обеспечения защиты оператора и окружающей среды при работе с вредными для здоровья человека агентами. Действие бокса основано на принудительном удалении опасных веществ из рабочей зоны через НЕРА фильтр и выбросе их обратно в помещение или во внешнюю вытяжную систему. При работе с двумя агентами исключается их перекрестная контаминация за счет создания восходящего потока воздуха. Схема потоков воздуха БМБ I класса приведена на рис.2,а.

а б вРис.2. а – БМБ I класса, б – БМБ II класса, в – БМБ III класса.

БМБ II класса (по ГОСТ Р ЕН 12469-2010) – это БМБ с рабо�им проемом, �ерез ко-торый оператор может проводить манипуляции внутри бокса. Бокс должен быть сконстру-ирован таким образом, �то бы оператор был защищен, риск загрязнения продукта и пере-крестного загрязнения низок, а удаление возникающих загрязнений обеспе�ивалось с помощью профильтрованного воздушного потока, циркулирующего внутри бокса, а также с помощью фильтрации удаляемого из бокса воздуха.

Другими словами, БМБ II класса предназначен для защиты оператора и окружающей


117

среды от контаминации диспергированными аэрозольными частицами, возникающими при выполнении работ с биологическими агентами и микроорганизмами внутри камеры бокса, а также для защиты рабочих агентов от внешней и перекрестной контаминации.

Принцип действия бокса основан на принудительной рециркуляции части воздуха в замкнутом объеме через НЕРА фильтр. Воздух, проходя через приточный НЕРА фильтр, очи-щается от аэрогенных загрязнений и подается в рабочую зону однонаправленным нисходящим потоком, тем самым создавая в камере бокса чистую воздушную среду и предотвращая пере-крестную контаминацию. Часть нагнетаемого вентилятором в камеру повышенного давления воздуха (обычно около 30%) через выпускной НЕРА фильтр выбрасывается в помещение. Из-за искусственно созданного разряжения происходит подсос воздуха в рабочую камеру через рабочий проем. Благодаря этому устанавливается воздушная завеса, обеспечивающая защиту оператора, см. рис. 2,б.

Наконец БМБ III класса (по ГОСТ Р ЕН 12469-2010) – БМБ, в котором рабо�ая зона полностью изолирована, а оператор отделен от рабо�его места физи�еским барьером (т.е. пер�атки механи�ески соединены с боксом). �рофильтрованный воздух постоянно поступает в бокс, а удаляемый из БМБ воздух фильтруется для предотвращения попадания микроорга-низмов в окружающую среду.

Принцип действия бокса основан на принудительной подаче очищенного воздуха в рабочую камеру с последующим удалением контаминированного воздуха через двухступен-чатую систему очистки. Воздух, проходя через НЕРА фильтр, очищается от аэрогенных за-грязнений и подается в рабочую зону однонаправленным нисходящим потоком. Воздух из рабочей камеры удаляется в помещение или систему вытяжной вентиляции, предварительно пройдя двухступенчатую очистку. Манипуляции с рабочим материалом осуществляются через перчатки.

Важным вопросом, касающимся БМБ, являются проверки эксплуатационных харак-теристик боксов. Основными документами, обязательными для исполнения и регламентиру-ющими эксплуатацию и минимум проверок БМБ при работе с микроорганизмами различных групп патогенности, являются Санитарные Правила.

СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)» и СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп пато-IV групп пато- групп пато-генности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» требуют проводить проверку скорости входящего потока и контроля целостности фильтра боксов микробиологической без-опасности II класса. Безусловно, скорость входящего потока является основным фактором, определяющим защиту оператора, однако при этом методика измерения скорости входящего потока СП 1.3.1285-03 и СП 1.3.2322-08 не регламентируется.

Существует распространенное заблуждение, что скорость входящего потока в боксах II класса равномерна вдоль всего рабочего проема. Это не так. Рассмотрим подробнее вопрос определения скорости входящего потока воздуха в БМБ.

В боксах I класса, как известно, рециркуляция воздуха отсутствует, т.е. весь воздух, проходящий через вентилятор, выбрасывается наружу, предварительно пройдя через НЕРА фильтр. В таких боксах входящий поток образуется из-за создания вентилятором разряжения во всем объеме камеры бокса. Вследствие этого скорость входящего потока примерно одина-кова во всем сечении рабочего проема и допускает непосредственные измерения с помощью термоанемометра в плоскости рабочего проема.

В боксах II класса, в отличие от боксов I класса, изоляция оператора от продукта, а также продукта от окружающей среды осуществляется с помощью так называемой воздушной завесы. Эта завеса возникает в результате слияния потоков входящего и нисходящего воздуха


118

в области рабочего проема. Входящий поток возникает как компенсация той части воздуха, которая выбрасывается из бокса в атмосферу, предварительно пройдя через выпускной НЕРА фильтр (см. рис. 2б). Оставшаяся часть воздуха продолжает циркулировать в боксе. В результа-те наличия в рабочей камере бокса нисходящего потока, а также в результате конструктивных особенностей, разряжение возникает только вдоль узких зон (перфорации), расположенных в плоскости столешниц. По этой причине распределение скорости потока по высоте рабоче-го проема имеет крайне неоднородный характер: наибольшая скорость потока наблюдается у нижней границы рабочего проема, наименьшая — у верхней. Прямое измерение скорости потока с помощью термоанемометра, в данном случае, может привести к неправильным ре-зультатам, т.к. результат измерения сильно зависит от места расположения чувствительного элемента анемометра при измерении. Для того что бы избежать подобной неопределенности, средняя скорость входящего потока в БМБ II класса определяется как отношение объемного расхода входящего воздуха к полной площади рабочего проема, а оценка средней скорости входящего потока сводится к оценке объемного расхода воздуха. Вследствие того, что входя-щий и выходящий потоки равны, оценка расхода входящего воздуха может определяться путем оценки расхода выходящего воздуха.

Рис. 3 Распределение потоков воздуха внутри БМБ II класса. 1, 2 – передняя и за-дняя перфорации соответственно, 3, 4 – эпюры скоростей потоков воздуха с внутренней и наружной стороны рабочего проема (рисунок взят из книги «Чистые помещения. Про-блемы, теория, практика.» под ред. А.Е.Федотова).

Помимо обеспечения защиты оператора и окружающей среды, БМБ II класса также обеспечивает защиту рабочего материала от внешней и перекрестной контаминации. Эта за-щита осуществляется с помощью создания однонаправленного нисходящего потока чистого воздуха, прошедшего через приточный НЕРА фильтр. Требований к скорости нисходящего по-тока СП 1.3.1285-03 и СП 1.3.2322-08 не предъявляют, в то время как её величина является важным фактором, влияющим на эффективность работы бокса.

ГОСТ Р ЕН 12469-2010 в свою очередь строго регламентирует не только процедуру проверки скорости входящего потока в БМБ I и II классов, но также процедуру проверки ско-I и II классов, но также процедуру проверки ско- и II классов, но также процедуру проверки ско-II классов, но также процедуру проверки ско- классов, но также процедуру проверки ско-рости и однородности нисходящего потока воздуха в камере бокса, методику исследования целостности НЕРА фильтра и процесс визуализации потоков, создаваемых при работе бокса. Эти проверки формируют необходимый минимум испытаний, пройдя который бокс микробио-


119

логической безопасности может считаться безопасным для работы.Характерной особенностью рекомендаций СП 1.3.1285-03 и СП 1.3.2322-08, касаю-

щейся применения БМБ, является разделение всех БМБ II класса на типы А и В. Даная клас-сификация боксов производится согласно американскому стандарту NSF/ANSI 49-2009 и по-явилась в российских документах из рекомендаций ВОЗ. Новый российский стандарт ГОСТ Р ЕН 12469-2010 не производит деления боксов микробиологической безопасности на типы.

В основе разделения боксов на типы А и В лежит их разделение по доле воздуха, рециркулируемого обратно в камеру бокса и помещение установки. В большинстве БМБ II класса только часть воздуха из камеры бокса удаляется через вытяжной НЕРА фильтр. Некото-рая часть воздуха, в зависимости от конструкции бокса, продолжает рециркулировать в боксе, проходя через приточный НЕРА фильтр, и подаваясь в камеру бокса. Так, например, в боксах II класса типа A2 процент рециркуляции составляет 70%, в то время как в боксах II класса типа В1 – 30%.

В БМБ II класса типа В2 рециркуляция воздуха в камеру или помещение отсутствует, т.е. 100% воздуха из рабочей камеры бокса, пройдя через НЕРА фильтр, удаляется в атмос-феру через вытяжной воздуховод. Такая организация потоков более безопасна в плане работы с ПБА высокой группы патогенности, а также позволяет вести работу в боксе с небольшими дозами летучих газообразных веществ, которые не задерживаются НЕРА фильтрами. К недо-статкам использования БМБ II класса типа В2 можно отнести необходимость организации по-II класса типа В2 можно отнести необходимость организации по- класса типа В2 можно отнести необходимость организации по-стоянного притока воздуха в помещение установки бокса для компенсации значительного количества удаляемого воздуха.

Отдельно следует остановиться на проверке целостности НЕРА фильтров и герметич-ности их уплотнений. НЕРА фильтры играют ключевую роль во всех БМБ. От их качества, а также от качества их установки зависит не только чистота воздуха в камере бокса, т.е. защита продукта от внешней контаминации, но и защита окружающей среды от аэрозолей ПБА. Про-верка целостности НЕРА фильтров является важным и ответственным моментом при обеспе-чении биологической безопасности всего учреждения. Следует отметить, что согласно ГОСТ Р ЕН 12469-2010 все типы боксов микробиологической безопасности должны оснащаться НЕРА фильтрами класса не ниже H14 по ГОСТ Р ЕН 1822-1. При этом в СП 1.3.1285-03 и СП 1.3.2322-08, регламентирующих использование БМБ в лабораториях, речь идет только о филь-трах тонкой очистки (ФТО), которые, согласно ГОСТ Р 51251-99 «Фильтры очистки воздуха. Классификация. Маркировка.», имеют существенно меньшую эффективность фильтрации по сравнению с НЕРА фильтрами, выделенными в отдельный класс.

Процедура исследования целостности с использованием микробиологических аэрозо-лей для таких фильтров нецелесообразна по причине того, что средний диаметр частиц микро-биологического аэрозоля существенно превышает размер частиц, на которых НЕРА и ULPA фильтры имеют наименьшую эффективность. Для оценки целостности НЕРА фильтров и ка-чества их уплотнений применяются методы с использованием синтетических полидисперсных аэрозолей, например диэтилгексил себацинат (DEHS), диоктилфталат (D�P) или полиальфа-D�P) или полиальфа-) или полиальфа-олифин (PA�), и дискретных счетчиков частиц либо специальных фотометров аэрозолей. Ме-PA�), и дискретных счетчиков частиц либо специальных фотометров аэрозолей. Ме-), и дискретных счетчиков частиц либо специальных фотометров аэрозолей. Ме-тодики таких проверок изложены во многих мировых стандартах, например в ГОСТ Р ИСО 14644-3-2007 «Чистые помещения и связанные с ними контролируемые среды. Часть 3. Мето-ды испытаний», Приложение В.6. Недостатками этих методов являются относительная слож-ность предварительных расчетов и дороговизна оборудования, необходимого для проведения проверок.

Важную роль при проверке эксплуатационных характеристик играет т.н. визуализация потоков или дымовой тест. Дымовые тесты позволяют визуально оценить характер движения


120

потоков воздуха, сильно подверженных внешнему влиянию, в боксе и вблизи него. К примеру, использование нагревательного оборудования внутри бокса может привести к дестабилизации однородного нисходящего потока, тем самым увеличив вероятность перекрестной контами-нации. Такие нарушения потока могут быть исследованы только с помощью дымовых тестов.

Основным инструментом, с помощью которого осуществляется проверка и настройка потоков воздуха в боксах микробиологической безопасности, является термоанемометр. Раз-решающая способность такого анемометра составляет 0,01 м/с, чего вполне достаточно для проверок эксплуатационных характеристик боксов. Диапазон измерения термоанемометров – от 0 до 20 м/с, а относительная погрешность не превышает 5%. Использование крыльчатых анемометров, а так же трубок Пито для измерения скоростей потоков воздуха в БМБ не допу-скается в виду их недостаточной точности и разрешающей способности при работе с малыми скоростями потоков.

Использование того или иного типа оборудования предполагает применение своей уникальной методики, каждая из которых имеет свои плюсы и минусы.

Таким образом, БМБ являются первой ступенью в обеспечении инженерного контроля распространения микроорганизмов различных групп патогенности. И при правильной эксплу-атации способны эффективно обеспечивать не только защиту окружающей среды, но и защиту оператора от продуктов, с которыми производится работа. Правильная эксплуатация, помимо всего прочего, подразумевает проведение периодических проверок эксплуатационных харак-теристик боксов. К сожалению, действующие нормативные документы, регламентирующие эксплуатацию боксов, устарели и не содержат достаточной информации об этих проверках. В связи с этим назрела необходимость разработать дополнительные документы, в которых будут четко сформулированы состав и методики проверок боксов микробиологической безопасно-сти.

Библиографический список1. Национальный Стандарт Российской Федерации ГОСТ Р ЕН 12469-2010 «Биотех-

нология. Технические требования к боксам микробиологической безопасности»// Стандартин-форм 2010, 48с.

2. Санитарно-эпидемиологические правила. «Безопасность работы с микроорганиз-мами I – II групп патогенности (опасности)»// СП 1.3.1285-03. М:. Госсанэпиднадзор России; 2003, 82с.

3. Санитарно-эпидемиологические правила. «Безопасность работы с микроорганиз-мами I – II групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней»// СП 1.3.2322-08. М:. Роспотребнадзор; 2008, 76с.

4. Laboratory Biosafety Manual. 3d edition. World Health �rganization. Geneva; 2004. 186 p.5. Тюрин Е.А., Иванов С.А., Маринин Л.И., Дятлов И.А., Ляпин М.Н. Боксирующие

устройства, используемые при проведении работ с биологическими агентами I–II групп пато-I–II групп пато-–II групп пато-II групп пато- групп пато-генности//Проблемы особо опасных инфекций. Выпуск 4 (106). С. 23.

6. Biosafety Cabinetry: Design, Constructions, Performance, and Field Sertification. NSF/ANSI 49 – 2009. NSF International Standard/ American National Standard. 2009. 148 p.

7. Онищенко Г.Г., Кутырев В.В, редакторы. Биологическая безопасность. Термины и определения. Саратов: «Приволжское издательство»; 2006. 112 с.

MICROBIOLOGICAL SAFETY CABINETS. OPERATION AND MAINTENANCE BASICS.


121

Enenko A.

Key words: ba�ter�ophages, b�o�og��a� safety, m��rob�o�og��a� safety �ab�nets, fume hoo�s, �am�nar �ow hoo�s, LAMSYSTEMS, app��at�on of m��rob�o�og��a� safety �ab�nets.

The present art��e �s �on�erne� w�th the term�no�ogy an� ��ent�fi�at�on of m��rob�o�og��a� safety �ab�nets, regu�atory �o�uments wh��h �es�r�be the requ�rements for m��rob�o�og��a� safety �ab�nets, operat�on an� ma�ntenan�e regu�at�ons of m��rob�o�og��a� safety �ab�nets.

УДК 577.27

ТЕХНОЛОГИЯ ФАГОВОГО ДИСПЛЕЯ И ЕЕ ПРИЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ И ПРОФИЛАКТИКИ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЧЕЛОВЕКА

Ильичев А.А., доктор биологических наук, профессор, [email protected]Карпенко Л.И., доктор биологических наук, доцент, [email protected]Щербакова Н.С., научный сотрудник, тел. 8(383) 363-48-13, [email protected]ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора

Техника фагового дисплея дает возможность проводить скрининг гигантских репер-туаров биологических молекул при помощи конструирования библиотек, которые благодаря формату дисплея, позволяют применять чрезвычайно быструю и эффективную процедуру се-лекции специфических лигандов. В 1985, Дж. Смит (Smith, 1985) впервые сообщил, что пепти-Smith, 1985) впервые сообщил, что пепти-, 1985) впервые сообщил, что пепти-ды и полипептиды могут быть экспонированы на поверхности фаговых частиц, при встройке кодирующих последовательностей ДНК в ген поверхностного белка p3 нитчатого бактериофа-p3 нитчатого бактериофа-3 нитчатого бактериофа-га fd. Аналогичная работа на белке pP8 была выполнена в ГНЦ ВБ «Вектор» (Ильичев и др., 1989). При этом, если место встройки пептида выбрано правильно, то химерная фаговая части-ца остается инфекционной и может быть размножена в подходящем бактериальном штамме. Кроме того было показано, что фаг, несущий определенный пептид, может быть выделен из большого количества фагов дикого типа при помощи афинной селекции (Parmley & Smith, 1988). Чередование циклов селекции и размножения приводит к образованию фаговой смеси, содержащей большое количество фаговых частиц, экспонирующих тот же самый пептид.

Применение этого принципа привело к конструированию больших коллекций химер-ных фагов, в которых каждый фаг экспонировал отличный от других пептид, т.е. пептидных фа-говых библиотек (Scott & Smith, 1990; Felici et al., 1991). В принципе такие пептидные реперту-Scott & Smith, 1990; Felici et al., 1991). В принципе такие пептидные реперту- & Smith, 1990; Felici et al., 1991). В принципе такие пептидные реперту-Smith, 1990; Felici et al., 1991). В принципе такие пептидные реперту-, 1990; Felici et al., 1991). В принципе такие пептидные реперту-Felici et al., 1991). В принципе такие пептидные реперту- et al., 1991). В принципе такие пептидные реперту-et al., 1991). В принципе такие пептидные реперту- al., 1991). В принципе такие пептидные реперту-al., 1991). В принципе такие пептидные реперту-., 1991). В принципе такие пептидные реперту-ары могут служить источником лигандов практически для любых рецепторов. После изоляции фагов, несущих нужный лиганд, аминокислотная последовательность отобранных пептидов определяется секвенированием химерных капсидных генов и сравнение аминокислотного со-става отобранных пептидов позволяет идентификацию консенсусной последовательности, т.е. консервативных аминокислотных остатков, необходимых для связывания данного рецептора.

В докладе будут рассмотрены предложения технологии фагового дисплея для диагно-стики и лечения инфекционных и соматических заболеваний человека. Будут доложены ре-зультаты работы ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» в данном направлении.


122

УДК 619:616 -07

СОЗДАНИЕ БИОПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ БАКТЕРИОФАГОВ DESULFOVIBRIO DESULFURICANS И ПЕРСПЕКТИВЫ

ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

Карамышева Н. Н., ассистент, Natali – [email protected]Васильев Д. А., доктор биологических наук, профессор,Золотухин С. Н., доктор биологических наук, профессор 8(8422)55-95-47, [email protected]ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина»

Ключевые слова: Desu�fov�br�o �esu�fur��ans, биопрепарат, бактериофаги.Работа посвящена созданию биопрепарата на основе бактериофагов Desu�fov�br�o �esu�fur��ans и определения перспектив дальнейшего использования.

Введение. Бактерии, относящиеся к роду Desu�fov�br�o, являются основными возбу-дителями анаэробной коррозии металлов развивающейся в процессе их жизнедеятельности. Создание биопрепарата на основе полученных бактериофагов и внедрение его в производство может разрешить создавшуюся проблему.

Материалы и методы исследований. Штамм Desu�fov�br�o �esu�fur��ans subsp. �e- �esu�fur��ans subsp. �e-�esu�fur��ans subsp. �e- subsp. �e-subsp. �e-. �e-�e-su�fur��ans (Be�jer�n�k 1895) K�uyver et van N�e� 1936 VKM B-1799 полученный из музея ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН Московская обл., г. Пущино, а также 9 штаммов бактерий, выделенных из объектов окружающей среды, типирование которых позволило отнести их к роду Desu�fov�-br�o, бактериофаги Ddr 57 – УГСХА и Ddu 48 – УГСХА.

Работа выполнена на базе научно-исследовательского инновационного центра микро-биологии и биотехнологии УГСХА.

Результаты исследований и их обсуждение.Результаты исследования способности бактериофагов специфически лизировать бак-

териальные клетки использована нами при конструировании диагностического биопрепара-та. Для этого на основе выделенных бактериофагов необходимо было изучить следующие их биологические свойства: спектр литической активности; специфичность действия; морфоло-гию негативных колоний; чувствительность к воздействию хлороформа.Изучение биологиче-ских свойств выделенных бактериофагов проводили по методам, предложенным М. Адамсом (1973), Д.М. Гольдфарбом (1961), И.М. Габриловичем (1973), Е.П. Розановой (1978), С.Н. Зо-лотухиным (2007).

При определении активности фага по методу Аппельмана в 11 пробирок равного диа-метра наливают по 9 мл жидкой среды Постгейта В. В первую пробирку вносили 1мл изучае-мого фага, тщательно перемешивали содержимое флакона и новой пипеткой переносили 1 мл смеси в следующую пробирку до получения полного ряда десятикратных разведений. Затем во все пробирки, начиная с последнего разведения, вносили по 0,2 мл индикаторной культуры D. �esu�fur��ans, выращенной на жидкой среде Постгейта В. Пробирки инкубировали при 30°С и просматривали на наличие просветления среды и обесцвечивания черного придонного осадка в опытных пробирках и роста культуры в контрольных пробах. Учет результатов был начат через 24 часа. Среда оставалась прозрачной, а осадок поменял цвет с черного на белый в про-бирках с разведениями 10-8 и 10-9, что указывало на отсутствие роста индикаторной культуры бактерий штамма Desu�fov�br�o �esu�fur��ans subsp. �esu�fur��ans (Be�jer�n�k 1895) K�uyver et van N�e� 1936 VKM B-1799 (таблица 1).


123

Таблица 1 – Литическая активность фагов D. �esu�fur��ans по Аппельману№ п/п Название фага Литическая активность по Аппельману

1 Ddu 48-УГСХА 10-9

2 Ddr 57-УГСХА 10-8

Морфологию негативных колоний бактериофагов изучали с помощью метода агаро-вых слоев по Грациа. В пробирку с 2,5 мл 0,7% агаризованной средой Постгейта «В», расплав-ленной и остуженным до 45 ºС 0,7% агаризованной средой Постгейта В вносили 0,2 мл фага в разведении 10-7 (для получения изолированных негативных колоний) и 0,2 мл двухсуточной бульонной культуры референс штамма D. �esu�fur��ans VKM B-1799. Содержимое пробирки тщательно перемешивали вращением между ладонями и выливали на поверхность 2% агари-зованной среды Постгейта В. После застывания агара чашки инкубировали в анаэростат при температуре 30ºС и атмосферном давлении «– 1 атм». Просмотр результатов осуществляли через 24-48 ч. Негативные колонии бактериофагов характеризовались следующими параме-трами: Ddr 57-УГСХА. Колонии диаметром 8 мм полностью прозрачны, без зоны вторичного лизиса; Ddu 48-УГСХА колонии диаметром 6 мм характеризуются наличием прозрачного цен-Ddu 48-УГСХА колонии диаметром 6 мм характеризуются наличием прозрачного цен- 48-УГСХА колонии диаметром 6 мм характеризуются наличием прозрачного цен-тра и мутной зоной вторичного лизиса на периферии (рисунок 1).

Рисунок 1 – Негативные колонии бактериофагов Ddr 57-УГСХА

Определению устойчивости бактериофагов к прогреванию проводили по следующей методике: бактериофаги разводили 1:10 в жидкой среде Постгейта «В» (рН 7,2-7,4). Затем про-бирки с разведенными фагами прогревали прогревали в ультратермостате при температуре от 50°С до 80°С с интервалом 5 °С в течение 30 минут. Параллельно ставили контроль – фаги, разведенные 1:10 без прогревания. После воздействия температуры активность бактериофагов определяли по методу Грациа. Учет результатов проводили по истечению 24 часов при темпе-ратуре 30°С.

В результате исследований устойчивости бактериофагов к прогреванию было уста-новлено, что прогревание фагов Ddr 57 – УГСХА и Ddu 48 – УГСХА при температуре 55-60 °С не оказало влияния на содержание активных корпускул фага в 1 мл. Дальнейшее повышение температуры приводило к снижению активности фага. При прогревании фага температурой 65 ºС количество негативных колоний насчитывалось 5х109 корпускул фага. Прогревание выше


124

75 ºС полностью инактивировало исследуемый бактериофаг. Результаты представлены в та-блице 2.

Таблица 2 – Изменение титра бактериофагов при увеличении температуры куль-тивирования.

Температура, ºС Титр бактериофага Ddr 57-УГСХА Титр бактериофага Ddu 48 -УГСХА55 3х109 2х109

60 3х109 2х109

65 5х108 4х108

70 5х108 4х108

75 5х108 4х108

80 - -Контроль фага 3х109 2х109

Полученные данные свидетельствуют об устойчивости фагов к воздействию темпера-туры до 75º С. При температуре от 76ºС фаги Ddr 57 – УГСХА и Ddu 48 – УГСХА теряли свою активность и полностью погибали при температуре выше 80ºС.

Определение чувствительности бактериофага и бактерий проводили путем обработки фаговой суспензии хлороформом в соотношении 1:10 при постоянном встряхивании. Контро-лем служила пробирка с бактериофагом, необработанным хлороформом. После воздействия хлороформа активность бактериофага определяли по методу Грациа. Бактериофаг Ddr 57 – УГСХА проявил выраженную устойчивость к воздействию хлороформа в течение 30 минут, а бактериофаг Ddu 48 – УГСХА в течение 20 минут (таблица 3).

Таблица 3 – Устойчивость выделенных фагов к воздействию хлороформа.

№ ФагКоличество активных корпускул фага в 1 мл Кон-

трольОбработка

10 мин.Обработка



30 мин.Обработ-ка 40 мин.

1 Ddr 57-УГСХА 3х109 3х109 3х109 3х109 - 3х109

2 Ddu 48УГСХА 2х109 2х109 2х109 - - 2х109

Полученный фаголизат проверяли на стерильность путем посева на среду Постгей-та «В» для выявления сульфатвосстанавливающих бактерий. Исследования показали, что об-работка фаголизата хлороформом с последующим центрифугированием освобождает его от бактериальных клеток при сохранении активного фага. Для проверки активности фаголизата суточную культуру сульфатвосстанавливающих бактерий высевали на жидкую среду Постгей-та «В» с дрожжевым экстрактом и на 12 ч помещали в термостат при 30°С. Затем в культуру бактерий, находящуюся в ранней экспоненциальной фазе роста, вносили фаголизат в количе-стве 1 мл на 9 мл культуры и дополнительно инкубировали в течение 12 ч. Через 12 ч делали высев на агаризованную среду Постгейта «В». Чётко выраженные негативные пятна появля-лись через 24 ч.

Спектр литической активности является характерной особенностью штаммов фага, и его используют для их идентификации. Определение спектра литической активности прово-дили методом нанесения фага на газон бактериальной культуры (С. Н. Золотухин, 2007). Для изучения спектра литической активности двух селекционированных фагов (Ddu 48 – УГСХА, Ddr 57 – УГСХА), были использованы 1 референс штамм и 9 полевых штаммов D. �esu�fur�-. �esu�fur�-�esu�fur�-cans.


125

На поверхность агаризованной среды Постгейта «В» в чашках Петри пастеровской пипеткой наносили 3-4 капли 24-х часовой бульонной культуры исследуемых микроорганиз-мов. Затем равномерно распределяли по поверхности среды стерильным шпателем. Чашки оставили при комнатной температуре для подсушивания на 15-20 минут. На поверхность засе-янной среды по секторам наносили бактериофаг, а затем инкубировали в анаэробных условиях при температуре 30 °С, оценку результатов проводили через 24-48 ч. Результаты опытов по-казали, что штамм фага Ddr 57 – УГСХА, лизировал 8 из имеющихся у нас 10 штаммов (80%), фаг Ddu 48 – УГСХА лизировал 6 из 10 штаммов (60%) (таблица 4).

Таблица 4 – Спектр литической активности фагов по отношению к штаммам№ п/п

Название фага Количество испытан-ных штаммов

Количество лизируе-мых штаммов

Процент лизируемых штаммов

1 Ddr 57-УГСХА 10 8 80%2 Ddr 57-УГСХА 10 8 80%3 Ddu 48 - УГ- 48 - УГ-

СХА10 6 60%

4 Ddu 48 -УГСХА 10 6 60%

Видовая специфичность фагов используется в практике для дифференциации бакте-рий. Эта способность фагов определяется, прежде всего, сродством их к рецепторам лизируе-мых бактерий.

Определение видовой специфичности изучаемых бактериофагов (Ddu 48 – УГСХА, Ddr 57 – УГСХА) проводили путём нанесения фага на газон культуры. На поверхность в чашках Пе-три пастеровской пипеткой наносили 3-4 капли 24-х часовой бульонной культуры исследуемых микроорганизмов. Затем равномерно распределяли по поверхности среды стерильным шпателем. Чашки оставляли при комнатной температуре для подсушивания на 15-20 минут. На поверхность засеянной среды пастеровской пипеткой легким прикосновением капли наносили бактериофаги Ddu 48 – УГСХА, Ddr 57 – УГСХА и наклоняли, чтобы капли стекли, а затем инкубировали в анаэростате при температуре 30 °С. Оценку результатов проводили через 24-48 часа. Выбор ви-дового состава бактерий, для проверки специфичности фага, обусловлен способностью данных бактерий к анаэробному типу дыхания.

В результате изучения специфичности бактериофагов по отношению к представите-лям других родов и видов бактерий: – установили строгую специфичность фагов. Опыт по определению специфичности бактериофагов (Ddr 57 – УГСХА, Ddu 48 – УГСХА) показал, что оба бактериофага строго специфичны по отношению к D. �esu�fur��ans и не лизируют другие виды и роды бактерий (таблица 5).

Таблица 5 – Специфичность, выделенных бактериофагов№ п/п Вид бактерий Ddr 57-УГСХА Ddu 48 -УГСХА

1 Desu�fov�br�o �esu�fur��ans + +2 Desu�fov�br�o su�fo��smutans – –3 Desu�fov�br�o g�gas – –4 Desu�fov�br�o spp. – –5 ��ostr��um perfr�ngens – –6 Fusoba�ter�um nu��eatum – –7 La�toba��us spp. – –8 Ba��us �ereus – –

Примечание – «–»– отсутствие лизиса, «+»– наличие лизиса культуры.


126

Заключение. Таким образом, проведённые исследования по изучению биологических свойств бактериофагов Ddr 57 – УГСХА, Ddu 48 – УГСХА показали, что полученные фаги отвечают все технологическим параметрам для изготовления биопрепарата с целью профи-лактики коррозии металлов.

Библиографический список1. Bodily H., Updyke E.L., Mason J.�. (ed). Diagnostis procedures for bacterial, mycotis

and parasitis infections, 5 th ed., American Public Health Association, Inc., New York, 2007.2. Back A.E., �berhoter T.R., J.Clin Microbiol, 7, 312-313 (2008).3. У.Хейс «Генетика бактерий и бактериофагов» М.1965г.

УДК 579.66

КЛАССИФИКАЦИЯ ПРАКТИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ БИОПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ БАКТЕРИОФАГОВ

Климовский А.Б., кандидат физико-математических наук,начальник управления, администрация города Ульяновскател. 8 (9510) 95-16-58, [email protected]Викторов Д.А., кандидат биологических наук,Васильев Д.А., доктор биологических наук, профессорТел. 8(8422) 55-95-47, [email protected]ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина»

Ключевые слова: бактериофаги, биопрепараты, практи�еское применение, класси-фикация, схема.

В работе предлагается принцип классификации практи�еского применения препара-тов на основе бактериофагов по трем основаниям, каждое из которых имеет несколько зна-�ений.

Актуальность темыОдним из ведущих направлений современной микробиологии и биотехнологии явля-

ются исследования бактериофагов. Это связано с всё больше возрастающим интересом к бак-териофагам с точки зрения их практического применения в целях диагностики, профилактики и лечения инфекционных заболеваний в различных отраслях медицины, сельского хозяйства и промышленности [1, 2, 3].

Однако, несмотря на то, что в большинстве случаев перспективы разработки и приме-нения препаратов на основе бактериофагов предопределяются их конкретными потребитель-скими свойствами, обуславливающими их безопасность, высокую эффективность, дешевизну и простоту в применении, остаётся актуальной проблема выявления новых сфер их практиче-ского применения, решение которой позволит рассмотреть инновационные направления даль-нейшего развития биотехнологий, основанных на использовании бактериофагов.

Авторами предлагается принцип классификации применения бактериофагов по трем основаниям – цель применения (для чего применяется), объект применения (на ком (чем) при-


127

меняется), направленность применения (для какой части (процесса) объекта применяется). Если представить каждое основание, как ось (измерение), а значение основания координа-той, то все применения бактериофагов можно представить, как отдельные ячейки трехмерного куба.

цель

объект

направленность

Для сокращения обозначений основание классификации обозначим первой буквой: цель – Ц, объект – О, направленность – Н. По каждой оси (основанию) предлагается опреде-лить несколько (координат) разделов, обозначаемых цифрой:1-я ось – Цели (1) – профилактика (предупреждение, предотвращение);

(2) – диагностика (выявление);(3) – лечение (устранение)

2-я ось – Направления (1) – внутреннее состояние (здоровье, пригодность);(2) – внешнее состояние (внешность, поверхность)(3) – потребление (питание);(4) – выделение (отходы)

3-я ось – Объекты (1) – люди;(2) – животные (включая птиц, рыб, насекомых);(3) – растения;(4) – неживые объекты (здания, оборудование)

Схему, базирующуюся на данном способе классификации, можно графически изобра-зить или в виде куба, состоящего из – 3 х 4 х 4 = 48 ячеек (элементов), или на плоскости в виде таблицы 4 х 12 = 48 ячеек.

В результате, каждая из ячеек (элементов) на пересечении значений трёх осей (осно-ваний) соответствует конкретному назначению биопрепарата, в частности:

Н1О1 – медицина (здоровье людей), Н1О2 – ветеринария (здоровье животных), Н2О1 – косметика (внешность людей), Н3О1 – пищевая промышленность (питание людей), Н3О2 – производство кормов (питание животных), Н3О3 – производство удобрений (питание растений), Н3О4 – покрытия (внешность объектов), и т.д.


128

Или по трем основаниям, например: Ц1Н1О1 – для профилактики здоровья людей, Ц2Н1О2 – для диагностики состояния животных, Ц3Н3О1 – для обеззараживания пищи людей, Ц1Н2О2 – для предотвращения заражения (защиты) кожи животных, Ц3Н2О4 – для обеззараживания поверхности зданий (оборудования), Ц2Н4О4 – для выявления зараженности отходов производства, и т.д.Предлагаемая классификация удобна тем, что, используя её графическое изображе-

ние, можно «распределить» по сферам применения бактериофагов любую относящуюся к ис-пользованию бактериофагов информацию, например:

- научные (исследовательские) группы, занимающиеся бактериофагами в произ-водственном или научном учреждении;

- бактериафаги;- организации-исследователи фагов;- производители фагов;- потребители фагов;- и т.п.

Кроме указанной развернутой классификации, авторами предлагается упрощенная (свернутая) классификация по двум основаниям (критериям):

1. Первый критерий – цель применения препаратов на основе бактериофагов:1.1. Индикация, идентификация бактерий 1.2. Мониторинг бактериальных агентов 1.3. Деконтаминация2. Второй критерий – объекты, на которые направлено использование препаратов

на основе бактериофагов: 2.1. Люди 2.2. Животные (включая птиц, рыб, насекомых)2.3. Растения 2.4. Пищевые продукты 2.5. Неживые объектыГрафически данный способ классификации представляет собой таблицу 3 х 5 ячеек,

каждая из которых определяет отдельную отрасль (группу отраслей) применения препаратов на основе бактериофагов:


129

Цели(1) – индикация, иден-

тификация (2) – мониторинг (3) – деконтаминация

Объ

екты

(1) – людиДиагностика бактери- бактери-бактери-альных заболеваний

человека

Мониторинг бактери-альных заболеваний

человека

Лечение и профилак-тика бактериальных

заболеваний человека(2) – животные (включая птиц,

рыб, насеко-мых)

Диагностика бактери- бактери-бактери-альных заболеваний

животных

Мониторинг бактери-альных заболеваний

животных

Лечение и профилак-тика бактериальных заболеваний живот-

ных

(3) – растенияДиагностика бакте- бакте-бакте-

риальных поражений растений

Мониторинг бакте-риальных поражений

растений

Лечение и профилак-тика бактериальных поражений растений

(4) – пищевые продукты

(А) Выявление воз-будителей бактериаль-

ной порчи пищевых продуктов;

(Б) Выявление воз-будителей пищевых токсикоинфекций

(А) Мониторинг воз-будителей бактериаль-

ной порчи пищевых продуктов;

(Б) Мониторинг воз-будителей пищевых токсикоинфекций

Деконтаминация (са-нация) пищевых про-

дуктов:(А) от возбудителей

бактериальной порчи;(Б) от возбудителей

пищевых токсикоин-фекций

(5) – неживые объекты

Выявление патоген-ных бактерий на про-изводстве, в медицин-

ских учреждениях, учреждениях обще-ственного питания и

пр.

Мониторинг патоген-ных бактерий на про-изводстве, в медицин-

ских учреждениях, учреждениях обще-ственного питания и

пр.

Деконтаминация (са-нация) помещений,

оборудования, инвен-таря и пр.

Библиографический список1. Гольдфарб Д.М. Бактериофагия / Д.М. Гольдфарб // М.: Медгиз. – 1961. – 225 с.2. Каттер Э. Бактериофаги : биология и практическое применение / Э. Каттер, А. Су-

лаквелидзе; пер. с англ.: коллектив пер.; науч. ред. рус. изд. А.В. Летаров. – Москва: Научный мир, 2012. – 636 с.

3. Ревенко И.П. Бактериофаги и их использование в ветеринарной практике. – Киев: Урожай. – 1978. – С. 41-88.

CLASSIFICATION OF PRACTICAL APPLICATION OF BIOLOGICAL PRODUCTS OF BACTERIOPHAGE-BASED

Klimovsky A.B., Viktors D.A., Vasilyev D.A.

Keywords: ba�ter�ophages, b�o�og��s, pra�t��a� app��at�on, the ��ass�fi�at�on s�heme.Th�s paper proposes a pra�t��a� app��at�on of the pr�n��p�e of ��ass�fi�at�on of �rugs base�

on ba�ter�ophages on three groun�s, ea�h of wh��h has severa� mean�ngs.


130

УДК 578.81:579.67

ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА БАКТЕРИОФАГОВ LISTERIA MONOCYTOGENES

Ковалева Е.Н., кандидат биологических наук, доценттел. 8(8422) 55-95-47, [email protected]Васильев Д.А., доктор биологических наук, профессортел. 8(8422) 55-95-47, [email protected]Сульдина Е.В., аспирант, [email protected]Имамов М.А., аспирант, [email protected]ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина»

Ключевые слова: L�ster�a mono�ytogenes, бактериофаг, пищевое сырье, контамина-L�ster�a mono�ytogenes, бактериофаг, пищевое сырье, контамина- mono�ytogenes, бактериофаг, пищевое сырье, контамина-mono�ytogenes, бактериофаг, пищевое сырье, контамина-, бактериофаг, пищевое сырье, контамина-ция.

В статье рассматриваются аспекты контаминации пищевого сырья и продуктов бактериями вида L�ster�a mono�ytogenes. В ка�естве инактивирующего средства предложены бактериофаги и представлена методика их выделения с помощью индуцирующих факторов из лизогенных культур. Определены некоторые биологи�еские свойства полу�енного изолята.

Начиная с середины 80-х гг. годов XX столетия листериозу людей стали уделять все большее внимание. Это обусловлено лавинообразным появлением вспышек листериоза, свя-занных с употреблением пищевых продуктов контаминированных листериями. Ухудшает си-туацию и то, что болезнь протекает очень тяжело, как у новорожденных, их матерей, так и у пожилых людей [3, 4, 5, 9]. Продукты питания могут быть контаминированы листериями из-за некачественного пищевого сырья, используемого в процессе приготовления пищи. В первую очередь вызывают опасение те продукты, которые употребляются в необработанном виде – охлажденные свежие салаты, овощи, фрукты [7, 9].

Тем самым актуальна проблема профилактики инфицирования листериями пищево-го сырья и продуктов питания, возникает необходимость своевременной детекции указанных бактерий. Бактериофаги являются простым и надежным инструментом для реализации данной цели [4, 5, 7, 8].

Цели и задачи исследованияЦелью работы является разработка схемы выделения бактериофага L.mono�ytogenes

методом индукции из лизогенных культур и изучение некоторых биологических свойств полу-ченного изолята.

Для достижения поставленной цели необходимо подобрать оптимальные параметры воздействия индуцирующих факторов на бактериальную клетку и взаимодействия бактери-альных клеток и фаговых корпускул, определить рациональный метод очищения фаголизата.

Материалы и методыВ работе использовали тест-штамм бактерий вида L.mono�ytogenes 766, индикатор-

ный референс-штамм 9-127 (I серотип) из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизо-I серотип) из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизо- серотип) из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизо-отологии и ВСЭ Ульяновской ГСХА им. П.А. Столыпина.

Выделение и изучение биологических свойств фага проводили по методам, предло-женным Н.А. Капыриной [1], M.R.J. Clokie, A.M. Kropinski [6], Э.Каттер, А. Сулаквелидзе [2], C.P. Sword, M.J. Pickett [10].

Результаты исследованийВ качестве тест-штамма для оптимизации параметров индукции использова-


131

ли вирулентный штамм L.mono�ytogenes – 766, индикаторным служил референс-штамм L.mono�ytogenes 9-127. В качестве индуцирующего агента использовали ультрафиолетовые лучи (УФ-лучи), источником которых служила ртутно-кварцевая лампа, дающая не менее 90 % излучаемой энергии в виде УФ-лучей с длиной волны 254 нм.

Облучению подвергали 4-х часовую бульонную культуру тест-штамма L.mono�ytogenes – 766, выращенную при 28°С. Перед облучением бактерии разводили в слабощелочном фос-фатном буфере (pH-7,6) в отношении 1:100. Разведенную бактериальную взвесь выливали в чашку Петри с таким расчетом, чтобы толщина облучаемого слоя не превышала 2 мм. Чашки с культурой помещали на расстоянии 40 см от источника излучения и облучали с экспозицией (с) – 20; 30; 40; 60. Для более равномерного воздействия УФ-лучей на бактериальные клетки чашки во время облучения периодически покачивали.

После облучения 50 мкл культуры вносили в мясопептонный бульон комнатной тем-пературы. Облученные листериозные культуры инкубировали при 28°С в течение 16 часов, после чего полученные лизаты пропускали через бактериальные фильтры с диаметром пор 0,2 мкм, выдерживали сутки при комнатной температуре, а затем исследовали на присутствие в них бактериофага. Во время облучения, с целью предохранения обработанных культур от фотореактивации, все манипуляции проводили в затемненном помещении [1, 10].

Выявление индуцированных фагов проводили методом «стекающей капли» с индика-торным штаммом L.mono�ytogenes 9-127. Учет результатов осуществляли после 24-х часового инкубирования в термостате при 28°С. Присутствие бактериофага, определяли по наличию прозрачной «дорожки», хорошо видимой на матовом фоне роста бактерий (рис. 1).

Морфологию негативных колоний фага изучали при посевах методом агаровых слоев. Для этого в пробирку с расплавленным и остуженным до 46 – 48°С 0,7 % мясопептонным ага-ром вносили 1 мл фага и 0,2 мл 18-часовой бульонной индикаторной культуры L.mono�ytogenes. Содержимое пробирки тщательно перемешивали и выливали на поверхность 1,5 % мясопеп-тонного агара. После застывания агара чашки помещали в термостат.

Учет производили через 12 – 18 часов инкубации при температуре 28°С. Негативные колонии оценивали по размеру, характеру края, прозрачности, наличию вторичного роста и характеру роста культур вокруг колоний.


132

Рис. 1 – Дорожки лизиса на сплошном бактериальном газоне индикаторной куль-туры L.mono�ytogenes 9-127

Негативные колонии, образуемые изучаемым листериозным бактериофагом, были округлой формы с ровными краями в диаметре от 0,7 до 1 мм, непрозрачные, с зоной вторич-ного роста.

Выводы. В результате проведенных исследований выделен бактериофаг бактерий вида L.mono�ytogenes. Экспериментально установлено, что для выделения листериозного бак-териофага методом индукции из лизогенных культур наилучшим образом подходит жидкая слабощелочная среда, время экспозиции – 30 с, расстояние до источника излучения – 40 см. Негативные колонии изучаемого бактериофага мелкие, округлые, непрозрачные, с зоной вто-ричного роста.

Библиографический список1. Капырина, Н.А. Изучение листериозного бактериофага и использование его для

идентификации возбудителя болезни / Н.А. Капырина // Автореф. дис. … канд. биол. наук. – Покров, 1973. – 22 с.

2. Каттер Э. Бактериофаги : биология и практическое применение / Э. Каттер, А. Су-лаквелидзе; пер. с англ.: коллектив пер.; науч. ред. рус. изд. А.В. Летаров. – Москва: Научный мир, 2012. – 636 с.

3. Листерии и листериоз / И.А. Бакулов, Д.А. Васильев, Д.В. Колбасов [и др.] // моно-графия. – Ульяновск, УГСХА, 2008. – 168 с.

4. Bacteriophage P100 for control of L�ster�a mono�ytogenes in foods: genome sequence, bioinformatic analyses, oral toxicity study, and application / R.M. Carlton [et al.] / Regulatory Toxi-cology and Pharmacology. – 2005. – 43. – P. 301 – 312.

5. Biocontrol of L�ster�a mono�ytogenes on fresh-cut produce by treatment with lytic bac-teriophages and a bacteriocin / B. Leverentz [et al.] // Appl. and Environ. Microbiol. – 2003. – 69, N


133

8. – P. 4519 – 4526.6. Clokie, M.R.J. Bacteriophages: methods and protocols, volume 1: isolation, characteriza-

tion, and interactions / M.R.J. Clokie, A.M. Kropinski. – 2009, Humana Press. – 301 p.7. Guenther, S. Bacteriophage biocontrol of L�ster�a mono�ytogenes on soft ripened white

mold and red-smear cheeses / S. Guenther, M.J. Loessner // Bacteriophage: Landes Bioscience. – 2011. – P. 94 – 100.

8. Loessner, M.J. Bacteriophage typing of L�ster�a species / M.J. Loessner, M. Busse // Appl. and Environ. Microbiol. – 1990. – 56, N 6. – P. 1912 – 1918.

9. McLauchlin, J. Aspects of the epidemiology of human L�ster�a mono�ytogenes infections in Britain 1967 – 1984; the use of serotyping and phage typing / J. McLauchlin, A. Audurier, A.G. Taylor // J. Med. Microbiol. – 1986. – 22. – P. 367 – 377.

10. Sword, C.P. The isolation and characterization of bacteriophages from L�ster�a mono�y-togenes / C.P. Sword, M.J. Pickett // J. gen. Microbial. – 1961. – 25, N 2. – P. 241 – 248.

ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF BACTERIOPHAGES LISTERIA MONOCYTOGENES

Kovaleva E.N., Vasiliev D.A., Suldina E.V., Imamov M.A.

Keywords: L�ster�a mono�ytogenes, the ba�ter�ophage, foo� raw mater�a�s, �ontam�nat�on.The paper ��s�usses aspe�ts of �ontam�nat�on of foo� pro�u�ts an� raw mater�a�s ba�ter�um

L�ster�a mono�ytogenes. As a means of �na�t�vat�ng phages an� suggeste� the te�hn�que of the�r se�e�t�on by �n�u��ng fa�tors of the �ysogen�� u�tures. I�ent�fie� some of the b�o�og��a� propert�es of the �so�ate.

УДК 578.81:579.67

РАЗРАБОТКА БИОПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ ЭНТЕРОКОККОВЫХ ФАГОВ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ ENTEROCOCCUS FAECALIS

Ковалева Е.Н., кандидат биологических наук, доцент, [email protected]Золотухин С.Н., доктор биологических наук, профессортел. 8(8422) 55-95-47, [email protected]Васильев Д.А., доктор биологических наук, профессор, [email protected]ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина»

Ключевые слова: биопрепарат, бактериофаг, E.fae�a��s, детекция.

В статье рассматриваются технологи�еские параметры (время пассажа, множе-ственность инфекции) создания биопрепарата на основе выделенных и изу�енных энтерокок-ковых бактериофагов с целью детекции бактерий вида E.fae�a��s.

Энтерококки в настоящее время являются одними из самых часто встречающихся возбудителей нозокомиальных инфекций. Тем не менее, наибольшую опасность вызывает не столько широкая распространенность этих микроорганизмов, сколько их устойчивость к боль-шому спектру антибактериальных препаратов [1, 5, 6]. Поскольку из биологического материа-


134

ла чаще всего выделяют Entero�o��us fae�a��s, то в большинстве случаев приходиться иденти-фицировать именно этот вид [1, 7].

Благодаря специфичности действия бактериофаги используются как для определения видовой принадлежности микроорганизмов, так и для детекции бактерий в объектах внешней среды [2, 3, 7].

Целью работы является разработка технологических параметров изготовления и кон-троля биопрепарата энтерококковых бактериофагов для детекции бактерий вида E.fae�a��s.

Материалы и методыВ работе использовали 2 энтерококковых бактериофага и референс-штамм бактерий

вида E.fae�a��s - № 189 и из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ Ульяновской ГСХА им. П.А. Столыпина.

Изучение биологических свойств фага проводили по методам, предложенным С.Н. Золотухиным [2], Э.Каттер, А. Сулаквелидзе [3].

Результаты исследованийНа основании полученных данных были отобраны два изолята энтерококковых фагов

EF – 4 и EF – 5 для конструирования биопрепарата [4].Опытным путем определяли оптимальное соотношение между временем пассажа и

активностью фагов. Для этого в пробирки с 4,5 мл мясопептонного бульона добавляли по 0,2 мл индикаторной культуры и 0,2 мл изучаемого бактериофага. Параллельно ставили контроль: мясопептонный бульон, засеянный индикаторной культурой без фага. Посевы инкубировали при температуре 37°С в течение 4, 6, 8, 10 или 12 часов. После наступления лизиса пробирки с фагами обрабатывали хлороформом в соотношении 1:10. Литическую активность полученных фаголизатов исследовали методами Аппельмана и Грациа (табл. 1).

Таблица 1 – Зависимость активности фагов от времени пассажа

Фаги ВариантВремя

пассажа, часов

Литическая активность

по методу Аппельмана по методу Грациа

EF – 4

1 4 10-9 2 х 109

2 6 10-10 2 х 1010

3 8 10-9 4 х 109

4 10 10-9 3 х 109

5 12 10-9 3 х 109

EF – 5

1 4 10-8 7 х 108

2 6 10-10 1 х 1010

3 8 10-10 1 х 1010

4 10 10-9 3 х 109

5 12 10-9 2 х 109

Установлено, что оптимальное время пассажа при температуре 37°С для фагов EF – 4 и EF – 5 составляет 6 часов.

Опытным путем определяли, при каком варианте множественности инфекции про-исходит максимальное увеличение титра бактериофага в лизате. Оптимальное соотношение между количеством фага и культуры составляет 1:3, активность при этом от 4 х 109 до 1 х 1010 по методу Грациа (табл. 2).


135

Таблица 2 – Зависимость активности фагов от множественности инфекции

Фаги ВариантКоличество мл Активность фагов, количество

активных корпускул в 1 млФага Культуры

EF – 4

1 0,2 0,2 2 х 109

2 0,2 0,4 3 х 109

3 0,2 0,6 4 х 109

4 0,2 0,8 3 х 109

5 0,2 1,0 2 х 109

EF – 5

1 0,2 0,2 2 х 109

2 0,2 0,4 3 х 109

3 0,2 0,6 1 х 1010

4 0,2 0,8 2 х 109

5 0,2 1,0 2 х 109

Для приготовления индикаторных фагов использовали фаголизаты EF – 4 УГСХА и EF – 5 УГСХА после 5 пассажей. В качестве индикаторной культуры для обоих бактериофагов использовали штамм E.fae�a��s № 189.

Из полученного объема отбирали пробу каждого фага по 5 мл для определения чисто-ты физических свойств, титра фага по отношению к эталонной культуре, спектра литической активности и специфичности. Исследования показали эффективность применения бактерио-фагов EF – 4 и EF – 5 для детекции бактерий вида E.fae�a��s.

ВыводыТаким образом, оптимальными технологическими параметрами для изготовления

биопрепарата с высокой литической активностью являются: соотношение количества фаговых корпускул к количеству бактериальных клеток индикаторного штамма бактерий вида E.fae�a��s 1:3, время инкубации при температуре 37оС – 6 часов. Для освобождения фаголизатов от жиз-неспособных бактерий необходимо применение хлороформа (соотношение 1:10 в течение 30 минут).

Библиографический список1. Дехнич, А.В. Современные методы идентификации энтерококков / А.В. Дехнич,

Р.С. Козлов, О.У. Стецюк // Антибиотики и химиотерапия. – 1996. – т. 41. – № 3. – С.32 – 39.2. Золотухин, С.Н. Создание и разработка схем применения диагностических биопре-

паратов на основе выделенных и изученных бактериофагов энтеробактерий / С.Н. Золотухин // Автореф. дис. … д-ра биол. наук. – Ульяновск, 2007. – 39 с.

3. Каттер Э. Бактериофаги : биология и практическое применение / Э. Каттер, А. Су-лаквелидзе; пер. с англ.: коллектив пер.; науч. ред. рус. изд. А.В. Летаров. – Москва: Научный мир, 2012. – 636 с.

4. Ковалева, Е.Н. Биопрепарат энтерококковых бактериофагов / Е.Н. Ковалева // Ма-териалы международной научно-практической конференции молодых ученых «Роль молодых ученых в развитии АПК». – М., 2011. – С. 165 – 169.

5. Epidemiology of antimicrobial resistance in enterococci of animal origin / E. Hershberger [et al.] // J. of Antimicrob. Chemother. – 2005. – 55, № 1. – P. 127 – 130.

6. Genetic variation and evolution of the pathogenicity island of Entero�o��us fae�a��s / Sh.M. McBride [et al.] // J. of Bacteriol. – 2009. – 191, № 10. – P. 3392 – 3402.


136

7. Identification and analysis of recombineering functions from Gram-negative and Gram-positive bacteria and their phages / S. Datta [et al.] // PNAS. – 2008. – 105, № 5. – P. 1626 – 1631.

THE DEVELOPMENT OF BIOPREPARATION BASED OF THE ENTEROCOCCAL PHAGES TO DETECT ENTEROCOCCUS FAECALIS

Kovaleva E.N., Zolotukhin S.N., Vasiliev D.A.

Keywords: b�opreparat�on, ba�ter�ophage, E.fae�a��s, �ete�t�on.

The art��e �ea�s w�th the te�hno�og��a� parameters (t�me of the passage, the mu�t�p��ty of the �nfe�t�on) the b�opreparat�on base� on the �so�at�on an� stu�y of the entero�o��a� ba�ter�ophages w�th the purpose of the �ete�t�ng ba�ter�um E.fae�a��s.

УДК 615.453.6/615.014.21/581.81

РАЗРАБОТКА ТВЕРДЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ НА ОСНОВЕ КОМПЛЕКСНЫХ ПОЛИВАЛЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ

БАКТЕРИОФАГОВ

Ковязина Н.А., кандидат фармацевтических наукКазьянин А.В., доктор медицинских наук, профессорНиколаева А.М., доктор биологических наукФункнер Е.В., кандидат медицинских наукФилиал ФГУП «НПО Микроген» Минздрава России «Пермское НПО «Биомед»,

г.Пермь.тел. (342)262-32-75, [email protected]

Ключевые слова: бактериофаг, биодоступность, капсулы, конструирование, лити-�еская активность, таблетки, фармакокинетика.

Статья посвящена разработке твердых лекарственных форм бактериофагов. Выяв-лена высокая биодоступность оригинального состава таблеток и капсул в сравнении с жид-ким препаратом. В результате проведенных исследований разработан алгоритм конструиро-вания твердых лекарственных форм бактериофагов: сумма предложенных конструктивных подходов и технологи�еских схем позволит расширить ассортимент оте�ественных, высоко-эффективных, экологи�ески безопасных антибактериальных препаратов.

Введение. В условиях возрастания антибиотикорезистентности микроорганизмов бак-териофаги начинают занимать все большее место в лечебной практике [2]. Совершенствование способов получения бактериофагов, особенно выпуск их поливалентных и комбинированных разновидностей, способствует существенному расширению диапазона их литической актив-ности и стимулирует разработку разнообразных лекарственных форм. Однако, не смотря на это, традиционной формой выпуска бактериофагов остается жидкий препарат во флаконах, за исключением таблетированных фагов кишечной группы. Переход на выпуск таблетированных


137

и капсулированных препаратов диктуется необходимостью стабилизации литической активно-сти фагов, а также для придания препарату лучшего товарного вида, для уменьшения объемов при транспортировке и хранении препарата.

Учитывая неуклонный рост потребности рынка в жидком бактериофаге - более чем в 10 раз возросла реализация за последние 5 лет, чрезвычайно актуально расширение ассорти-мента поливалентных фаговых препаратов [3].

Цель работы. Разработка твердых желудочно-резистентных лекарственных форм на основе комплексных поливалентных препаратов бактериофагов для лечения инфекционных заболеваний.

Материалы и методы исследований. В работе использованы жидкие комплексные бактериофаги: 1) Секстафаг® – смесь фаголизатов бактерий Staphy�o�o��us aureus, Strepto�o��us spp., K�ebs�e��a pneumon�ae, Pseu�omonas aerug�nosa, E�her��h�a coli, Proteus spp., (Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный, раствор для приема внутрь, местного и наружного приме-нения ФСП ЛС-001049-140212); 2) Интести-бактериофаг – смесь фаголизатов бактерий – S. �exner� I, II, III, IV и VI типов и S. sonne�, S. paratyph� A, S. paratyph� В, S. t�ph�mur�um, S.�nfant�s, S.�ho�erasu�s, S. oran�enburg, S. enter�t��s; Es�her��h�a �o��, Proteus vu�gar�s и m�rab��s, Strepto-.�ho�erasu�s, S. oran�enburg, S. enter�t��s; Es�her��h�a �o��, Proteus vu�gar�s и m�rab��s, Strepto-�ho�erasu�s, S. oran�enburg, S. enter�t��s; Es�her��h�a �o��, Proteus vu�gar�s и m�rab��s, Strepto-, S. oran�enburg, S. enter�t��s; Es�her��h�a �o��, Proteus vu�gar�s и m�rab��s, Strepto-S. oran�enburg, S. enter�t��s; Es�her��h�a �o��, Proteus vu�gar�s и m�rab��s, Strepto-. oran�enburg, S. enter�t��s; Es�her��h�a �o��, Proteus vu�gar�s и m�rab��s, Strepto-oran�enburg, S. enter�t��s; Es�her��h�a �o��, Proteus vu�gar�s и m�rab��s, Strepto-, S. enter�t��s; Es�her��h�a �o��, Proteus vu�gar�s и m�rab��s, Strepto-S. enter�t��s; Es�her��h�a �o��, Proteus vu�gar�s и m�rab��s, Strepto-. enter�t��s; Es�her��h�a �o��, Proteus vu�gar�s и m�rab��s, Strepto-enter�t��s; Es�her��h�a �o��, Proteus vu�gar�s и m�rab��s, Strepto-; Es�her��h�a �o��, Proteus vu�gar�s и m�rab��s, Strepto-Es�her��h�a �o��, Proteus vu�gar�s и m�rab��s, Strepto- �o��, Proteus vu�gar�s и m�rab��s, Strepto-�o��, Proteus vu�gar�s и m�rab��s, Strepto-, Proteus vu�gar�s и m�rab��s, Strepto-Proteus vu�gar�s и m�rab��s, Strepto- vu�gar�s и m�rab��s, Strepto-vu�gar�s и m�rab��s, Strepto- и m�rab��s, Strepto-m�rab��s, Strepto-, Strepto-Strepto-�o��us spp., Staphy�o�o��us aureus, Pseu�omonas aerag�nosa (Интести-бактериофаг, раствор для приема внутрь и ректального введения ФСП ЛС 001999-121212). Для введения в композиции бактериофаг предварительно концентрировали в 100 раз с применением метода мембранной ультрафильтрации. Специфическую (литическую) активность бактериофагов оценивали по степени разведения исходного фага по Аппельману (отрицательная степень десятичного раз-ведения от 10-2 до 10-5, вызывающая полный лизис культуры) [1]. Фармакокинетику гранулиро-ванного и жидкого бактериофага изучали на белых мышах после однократного перорального введения препарата в количестве, эквивалентном 10 дозам для человека. Клинический матери-ал (кровь, моча и кал), собранный до перорального введения препаратов и в течении 72 часов, разводили в питательном бульоне и обрабатывали хлороформом. Пробы наносили на газон тест-культуры соответствующего микроорганизма. По числу колоний фагов определяли вре-менные промежутки обнаружения бактериофагов при их выведении. Распадаемость твердых лекарственных форм оценивали согласно ГФ ХI.

Результаты исследований и их обсуждение. Для получения высокоактивной твердой лекарственной формы, исходная субстанция (бактериофаг) должна быть: 1) адаптирована к современным возбудителям за счет ежегодного обновления фаговых рас и пополнения произ-водственной коллекции свежевыделенными штаммами; 2) с литической активностью не ниже 10-5 и высокой степенью очистки – остаточный белок не более 800 мкг [6].

Изучение влияния факторов сушки и кислотоустойчивости на стабильность концен-трата устанавливает наиболее лабильные и стабильные компоненты комплексного препарата. Показывает возможность таблетирования или капсулирования предварительно высушенного концентрата в смеси наполнителей. Проведенные нами исследования показали в комплексных препаратах Секстафаг® и Интести-бактериофаг лабильность стафилококкового и стрептокок-кового фага к технологическим факторам, что свидетельствовало о необходимости его пред-варительной стабилизации наполнителями [4,5].

Структурирование твердой фармацевтической композиции и формирование системы доставки кишечнорастворимой фармацевтической композиции бактериофагов являются взаи-мосвязанными этапами создания высокоактивной лекарственной формы. Получение твердых лекарственных форм бактериофагов покрытых кишечнорастворимой оболочкой (таблетки, гранулы, пеллеты, капсулы, микрокапсулы) усложняет технологический процесс производ-ства, поэтому актуальным является создание защитных желудочно-резистентных структур


138

бактериофагов за счет оптимального подбора наполнителей (создание каркаса избирательной распадаемости таблетированных фагов; формирование носителей, обволакивающих фаги, что способствует сохранению активности после воздействия кислой среды желудочного сока) и капсулирование или таблетирование кишечнорастворимого гранулята. В результате изучения влияния вспомогательных веществ на стабильность бактериофагов, соотношение бактерио-фага и наполнителей, очередности введения компонентов наполнителя в бактериофаги вида таблетирования – подобрана оптимальная композиция состава таблеток и оптимизирована тех-нология таблетируемой массы [4]. Одна таблетка массой 0,17 г или капсула, содержащая 0,17 г гранул эквивалентна по объему 20 мл жидкого коммерческого фага. Оригинальность разрабо-таного состава и технология желудочно-резистентных таблеток с секстафагом и сальмонеллез-ным бактериофагом подтверждена патентом РФ № 2410084 «Фармацевтическая композиция на основе секстафага (Пиобактериофага поливалентного) или бактериофага сальмонеллезного и способ её получения».

При подборе технологических параметров получения гранулята и изучении литиче-ской активности бактериофагов в композиции установлено, что составы без высушивания не обеспечивали стабильность компонентов бактериофагов в процессе хранения. Наилучшие технологические свойства и сохранение литической активности компонентов комплексного поливалентного бактериофага в композиционной массе обеспечивало сублимационное высу-шивание. Оптимизация технологических параметров таблетирования комплексных бактерио-фагов установила прямое влияние массы таблетки на кислотоустойчивость – таблетки массой более 150 мг обладают большей желудочной резистентностью. Двояковыпуклая форма повы-шает желудочную резистентность таблетированного бактериофага в отличие от плоскоцилин-дрической и в сравнении с жидким препаратом. Изучение влияния давления прессования на активность фагов показало компрессионную устойчивость бактериофага [4,5].

Исследована биодоступность твердых лекарственных форм бактериофагов комплексных бактериофагов в таблетированной и капсулированной форме. Исследования «in v�tro» показали, что в таблетированной и капсулированно форме сохранение активности комплексного бактериофага после воздействия кислой среды в 6,5 раза выше, чем в жидкой [4,5]. Таким образом, твердые лекарственные формы обладают выраженной кислотоустойчи- твердые лекарственные формы обладают выраженной кислотоустойчи-востью в сравнении с жидким коммерческим препаратом. При исследовании фармакокинети-ки гранулированного с желудочно-резистентными наполнителями и жидкого коммерческого секстафага на лабораторных животных установлено, что при пероральном введении бакте-риофагов гранулят обеспечивает сохранение их литической активности в 3 раза больше, чем жидкий препарат [5]. Проведенные биофармацевтические исследования показали, что разра-ботанный состав для таблетированной и капсулированной лекарственной формы комплексно-го бактериофага является более эффективным, чем жидкий препарат: обеспечивает стабиль-ность компонентов секстафага в соляной кислоте желудочного сока и длительную циркуляцию бактерифагов в организме человека (пролонгированность антибактериального эффекта).

Изучение влияния температуры хранения на стабильность компонентов секстафага играет немаловажную роль как для производителей медицинских иммунобиологических пре-паратов, так и для всех звеньев товаро-проводящей цепи (дистрибьюторы, аптеки) и потреби-телей. Исследования показали, что хранение таблеток в герметичных стеклянных флаконах или полимерных банках при пониженных температурах (5±3)°С и ниже не сопровождалось инактивацией бактериофагов. При повышенной температуре (35±1)°С значительное снижение активности препарата отмечали только через 1,5-2 недели. Установлено, что при комнатной температуре (23±3)°С допустимо хранить таблетки не более 1 месяца. При хранении разрабо-танных таблетированных и капсулированных препаратов Секстафаг®, Интести-бактериофаг


139

при температуре (5±3)ºС наблюдалось сохранение активности в течение 18 месяцев.В результате проведенных исследований разработан представленный на рисунке алго-

ритм конструирования твердых лекарственных форм бактериофагов.

Рис. 1. Алгоритм разработки твердых лекарственных форм комплексных поли-валентных бактериофагов.

Заключение. Таким образом, разработана рациональная методология конструирова-ния твердых лекарственных форм бактериофагов: сумма предложенных конструктивных под-


140

ходов, технологических схем позволяет расширить ассортимент отечественных, высокоэффек-тивных, экологически безопасных антибактериальных препаратов.

Библиографический список1. Адамс, М. Бактериофаги. – [Методы изучения вирусов бактерий] – М., 1961. - 527 с.2. Ворошилова, Н.Н Эпидемиологическая и клиническая эффективность препаратов

бактериофагов при лечении и профилактике инфекционных заболеваний / Н.Н. Ворошилова, Т.Б. Казакова, Г.Г. Боговазова, Э.В. Алферова // Создание и перспективы применения медицин-ских иммунобиологических препаратов: Материалы конференции. – Пермь, 2008. С. 91-94.

3. Казьянин, А.В. Бактериофаги: опыт производства и применения / А.В. Казьянин, Е.В. Орлова, М.Г. Ефимова и др., // Фармация, № 3, 2010. – С.36-37.

4. Ковязина, Н.А. Разработка состава и технологии желудочно-резистентных таблеток «Секстафаг» / Н.А. Ковязина, В.И. Решетников, Е.В. Функнер, М.Г. Ефимова // Фармация, № 7, 2008. - С.36-39.

5. Ковязина, Н.А. Характеристика свойств таблетированной лекарственной формы по-ливалентных бактериофагов / Н.А. Ковязина, Е.В. Функнер, О.И. Шитова и др., // Биопрепара-ты, № 2, 2010. - С.18-21.

6. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств (Иммунобиологические лекарственные препараты). Часть 2 – Москва.: Гриф и К. 2012.-536с.

DEVELOPMENT OF SOLID DOSAGE FORMS ON THE BASE OF COMPLEX POLYVALENT BACTERIOPHAGE PREPARATIONS

Kovyazina N.A., Kazyanin A.V., Nikolaeva A.M., Funkner E.V.

Key words: ba�ter�ophage, b�oava��ab��ty, �apsu�es, �es�gn, �yt�� a�t�v�ty, tab�ets, pharma�ok�net��s.

The art��e �s �evote� to the �eve�opment of so�� osage forms of ba�ter�ophages. H�gh b�oava��ab��ty of the or�g�na� �ompos�t�on of the tab�ets an� �apsu�es as �ompare� w�th the ��qu�� rug has been revea�e�. As a resu�t of the resear�hes �on�u�te� the a�gor�thm �es�gn of so�� osage forms of ba�ter�ophages has been �eve�ope�: �n the sum the propose� �onstru�t�ve approa�hes an� the te�hno�og��a� s�hemes enab�e us to exten� the range of �omest��, h�gh-performan�e, env�ronmenta��y safe ant�ba�ter�a� �rugs.

УДК 578.232.4

ПСЕВДОЛИЗОГЕННЫЕ АССОЦИАЦИИ ВИРУЛЕНТНОГО БАКТЕРИОФАГА G7C И ШАММА-ХОЗЯИНА E. COLI 4S .

1,2Летарова М.А., 1Стрелкова Д.А., 2Бакумова А.Д., 1Куликов Е.Е., 1Голомидова А.К., 1Прохоров Н.С., 3Кутузова Н.М.1,2Летаров А.В.1 – ФГБУН «Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН», 117312, г. Москва, Проспект 60-летия Октября, д. 7, корп. 2, +7(499) 135-21-392 – ГБОУ «Школа-Интернат Интеллектуал», 121357, г. Москва, ул. Кременчугская, д. 13. +7(499) 445-52-103 – ГБОУ ВПО «Московский педагогический государственный университет»


141

г. Москва. ул. Малая пироговская д.1. стр.1. +7(499)245-03-10

Ключевые слова: N4-подобный бактериофаг, подовирус, псевдолизогенные ассо-4-подобный бактериофаг, подовирус, псевдолизогенные ассо-циации, Es�her��h�a coli.

В работе исследовано образование и развитие метастабильных, перевиваемых на плотных средах ассоциаций облигатно-вирулентного N4-подобного бактериофага G7� и его хозяина.

Введение.Бактериофаги являются естественными индигенными компонентами симбиотических

микробных систем человека и животных. Особенностью кишечной экосистемы лошади явля-ется преобладание вирулентных бактериофагов, что относится также и к популяциям фагов E. coli, которые обнаруживаются у некоторых животных в достаточно большом титре до 107 Б.О.Е. грамм фекалий. В то же время титры колифагов подвергаются значительным колебани-ям (более 4 порядков в течение недели; Golomidova et al. 2007, Куликов с соавт. 2007), падая в определенные периоды до весьма низких значений (при использовании любой конкретной тест-культуры для мониторинга) При этом общий титр E. coli составляет около 106 К.О.Е./ г. Штаммовое разнообразие колиформных бактерий чрезвычайно высоко - в кишечнике одной лошади могут содержаться первые сотни различных штаммов (Golomidova et al. 2007, Исаева с соавт. 2010). Также известно (Golomidova at. all,2007), что спектр хозяев большинства кишеч-ных колифагов, выделенных от лошадей, достаточно узок, вплоть до того, что хозяином может являться единственный штамм кишечной палочки. Обнаружено, что эти вирулентные бакте-риофаги могут длительное время обнаруживаться в кишечнике лошади, так, например, пока-зана персистенция бактериофага Lc3 у лошади в течение трех лет (Голомидова с соавт. личное сообщение). Таким образом популяции индивидуальных колифагов в экосистеме кишечника лошади часто оказываются в ситуации, когда общая плотность доступных хозяев падает ниже критической (Kasman 2005), что должно было бы приводить к элиминации этих фагов. Одним из возможных объяснений длительного существования штаммов вирулентных бактериофагов в экосистеме кишечника лошади может быть образование ими так называемых псевдолизо-генных ассоциаций (ПА) с хозяевами, которые могут существовать в виде локальных (микро)колоний. В таких ПА должны создаваться следующие условия:

1.Все время существование ассоциации обеспечивается рост клеток, чувствительных к данному бактериофагу.

2. Поддерживается высокая плотность популяции E. coli, достаточная для поддержа-ния фага в литическом цикле.

3. ПА должна быть стабильна.4. ПА должна иметь способность к пролиферации.В этой работе мы исследовали возможность формирования и свойства ПА на модели

системы бактериофаг G7C – Е. сoil 4s, которая была выделена из образца фекалий лошади и детально охарактеризована, включая определение полной последовательности генома фага (Kulikov et al. 2012)

Материалы и методы.Штаммы бактерий и бактериофагов и их культивирование.В работе использовали штамм E. coli 4s и N4 – подобный бактериофаг G7C из коллек-E. coli 4s и N4 – подобный бактериофаг G7C из коллек-. coli 4s и N4 – подобный бактериофаг G7C из коллек-coli 4s и N4 – подобный бактериофаг G7C из коллек- 4s и N4 – подобный бактериофаг G7C из коллек-s и N4 – подобный бактериофаг G7C из коллек- и N4 – подобный бактериофаг G7C из коллек-N4 – подобный бактериофаг G7C из коллек-4 – подобный бактериофаг G7C из коллек-G7C из коллек-7C из коллек-C из коллек- из коллек-

ции лаборатории. Кроме того использовали Т5 – подобный фаг MPC600, также выделенный нами от лошадей, который обладал способностью инфицировать дериваты E. coli 4s, рези-s, рези-, рези-


142

стентные к фагу G7C, но не исходный штамм. Для культивирования фага MPC600 использо-G7C, но не исходный штамм. Для культивирования фага MPC600 использо-7C, но не исходный штамм. Для культивирования фага MPC600 использо-C, но не исходный штамм. Для культивирования фага MPC600 использо-, но не исходный штамм. Для культивирования фага MPC600 использо-MPC600 использо-600 использо-вали штамм E.coli C600. Бактерии выращивали на питательной среде LB следующего состава: триптон (Pronadisa) – 10г, дрожжевой экстракт (Pronadisa), - 5г, NaCl – 5г, вода до 1 л. Агаризо-Pronadisa) – 10г, дрожжевой экстракт (Pronadisa), - 5г, NaCl – 5г, вода до 1 л. Агаризо-) – 10г, дрожжевой экстракт (Pronadisa), - 5г, NaCl – 5г, вода до 1 л. Агаризо-Pronadisa), - 5г, NaCl – 5г, вода до 1 л. Агаризо-), - 5г, NaCl – 5г, вода до 1 л. Агаризо-NaCl – 5г, вода до 1 л. Агаризо- – 5г, вода до 1 л. Агаризо-ванная среда, LBsoft содержала 0,6% агар-агара, твердый LB – 1%.

Анализ состава ПА.В некоторых случаях (см. результаты) определяли отношение фаг/клетки. Для это-

го приготовляли суспензию псевдолизогенной ассоциации (ПА) в физиологическом растворе, фаг высевали в разведениях на газон штамма-хозяина до отдельных бляшек, а клетки шпате-лем до получения отдельных колоний

Для получения субклонов бактерий из ПА клетки отмывали от экзогенного фага с по-мощью инактивирующего свободные вирусные частицы экстракта чая (de Sigueira et al. 2006). Вирицидный экстракт готовили следующим образом: 10 г листьев чая заливали 100 мл кипя-щей стерильной воды, настаивали в сухожаровом шкафу при 100°С в плотно закрытом флако-не 30 мин, фильтровали через бумажный, а затем через мембранный фильтр, с порами 0,44 мкм или автоклавировали. Экстракт хранили при +4°С.

Получение отдельные бляшек бактериофагов производилось методом посева двой-ным слоем на питательную среду. Получение газонов также производилось с помощью метода «двойного слоя», только без добавление бактериофага.

Пассирование ассоциаций с помощью стерильных зубочисток или стерильных гемато-критных капилляров, путем перекалывания с одной чашки Петри с агаром на другие, с твердой средой или преформированным газоном.

ПЦР и анализ его результатовПЦР ставили в объеме 20 мкл, на амплификаторе BioRad 1852000. Для детекции фага

использовали праймеры на ген 50 (g50D 5� GCCCATGCGTATTCACAA и g50R 5� CCATAGC-g50D 5� GCCCATGCGTATTCACAA и g50R 5� CCATAGC-50D 5� GCCCATGCGTATTCACAA и g50R 5� CCATAGC-D 5� GCCCATGCGTATTCACAA и g50R 5� CCATAGC- 5� GCCCATGCGTATTCACAA и g50R 5� CCATAGC-g50R 5� CCATAGC-50R 5� CCATAGC-R 5� CCATAGC- 5� CCATAGC-CCATAGC-GTGTGTTACCGA).

Анализ продуктов ПЦР проводили методом электрофореза в 1 %-ном агарозном геле с добавлением 0,1% раствора бромистого этидия. Просматривали гели на трансиллюминаторе при длине волны 254 н.м. или 312, в зависимости от концентрации материала.

Получение псевдолизогенных асоциаций.Фаг G7C был рассеян до отдельных бляшек. Из некоторых, случайно выбранных бля-G7C был рассеян до отдельных бляшек. Из некоторых, случайно выбранных бля-7C был рассеян до отдельных бляшек. Из некоторых, случайно выбранных бля-C был рассеян до отдельных бляшек. Из некоторых, случайно выбранных бля- был рассеян до отдельных бляшек. Из некоторых, случайно выбранных бля-

шек с помощью стерильной зубочистки, на чашку с твердым агаром, были перенесено содер-жимое бляшек. На чашке наблюдался рост бактерий.

Эти культуры переносили на чашки с газоном исходного штамма. Если в популяции наблюдался бактериофаг, то на газоне вокруг места посева образовывалась зона лизиса.

Одна итерация называлась поколением. Всего было протестировано 53 ассоциаций (ПА) в 12 поколениях.

Результаты.В каждом поколении учитывалось количество ПА, выделяющих детектируемый фаг.Из 53 ПА к четвертому поколению большинство прекратило выделять фага, но шесть

ПА продолжали выделять фага вплоть до 15 поколения (Рис. 1)


143

Рис.1. Изменение количества ассоциаций, выделяющих фаг, в череде поколений при тестировании на газонах E.col� 4s и 4sAs (информацию об этом штамме см. ниже)

Были проанализированы свойства субклонов бактерий из пяти ПА, которые сохраняли способность выделять фага к 12 поколению. Определили их чувствительность к исходному фагу G7C.

Было обнаружено, что не смотря на активное выделение фага, субклоны ПА из поко-лений с высокими номерами (6-7) не чувствительны с исходному фагу.

При рассеве суспензии исходного штамма E.coli 4s на фаговый агар, содержащий фаг G7C было обнаружено, что в культуре всегда присутствуют устойчивые клетки с частотой око-7C было обнаружено, что в культуре всегда присутствуют устойчивые клетки с частотой око-C было обнаружено, что в культуре всегда присутствуют устойчивые клетки с частотой око- было обнаружено, что в культуре всегда присутствуют устойчивые клетки с частотой око-ло 10-4 (что значительно выше обычной частоты фагоустойчивых мутантов). Этот дериват мы обозначили 4sR. В отличии от штамма 4s, 4sR оказался чувствителен к фагу МРС600.

Тестирование субклонов ПА обнаружило, что практически все они чувствительны к МРС600 и при этом часто выделяют фага на своих собственных газонах, а на газонах исходно-го штамма-хозяина фага не выделяют. При дальнейшем исследовании было обнаружено что:

-Все субклоны ПА чувствительны к фагу MPC600-Несмотря на вирицидную обработку суспензии перед посевом, некоторые субклоны

содержат ассоциированный с ними фаг- Все субклоны способны расти на фаговом агаре с G7C- В 7 пассаже появляются субклоны, на которых фаг G7C способен образовывать мел-G7C способен образовывать мел-7C способен образовывать мел-C способен образовывать мел- способен образовывать мел-

кие бляшки. В 8 пассаже такие субклоны преобладают, что, однако, не сопровождается увели-чением титра фага, детектируемого на газоне штамма 4s.

Таким образом, при образовании и развитии ПА изменяются и фаги и клетки. Для дальнейшего исследования этого являения мы выбрали такой субклон, на котором растет фаг, содержащийся в ПА (далее –phi 8810), но не растет исходный фаг G7C. Этот штамм мы назва-phi 8810), но не растет исходный фаг G7C. Этот штамм мы назва- 8810), но не растет исходный фаг G7C. Этот штамм мы назва-G7C. Этот штамм мы назва-7C. Этот штамм мы назва-C. Этот штамм мы назва-. Этот штамм мы назва-ли 4sAs Производные этого штамма, резистентные к фагу phi8810 (а равно и к исходному фагу G7C) были называны 4sAR. Мы исследовали эффективность посева (относительно штаммов, на которых получены соответствующие лизаты) фагов G7C и phi8810 и MPC600 на газонах штаммов E.coli 4s, 4sAs, 4sR и 4sAR. (Табл. 1).


144

ЭП, бактериофагиШтаммы G7C Phi8810 MPC6004s 1,0 10-5 04sAS 10-6 1,0 1,04sR 0 Л 1,04sAR 0 0 1,0С600 0 0 1,0Табл. 1. Эффективность посева (ЭП) бактериофагов на различных штаммах

E.col� относительно штаммов, использованых для приготовления соответствующих ли-.col� относительно штаммов, использованых для приготовления соответствующих ли-col� относительно штаммов, использованых для приготовления соответствующих ли- относительно штаммов, использованых для приготовления соответствующих ли-затов. Л – зона лизиса наблюдается при нанесении на газон капли концентрированного лизата, но при разведении фага отдельных бляшек не образуется.

Анализ морфологии фагов с помощью трансмиссионной электронной микроскопии показал, что фаг phi8810 морфологически неотличим от исходного фага G7C. Это подтверж-phi8810 морфологически неотличим от исходного фага G7C. Это подтверж-8810 морфологически неотличим от исходного фага G7C. Это подтверж-G7C. Это подтверж-7C. Это подтверж-C. Это подтверж-. Это подтверж-дается также данными ПЦР. Таким образом, фаг phi 8810 не является контаминантом, но пред-phi 8810 не является контаминантом, но пред- 8810 не является контаминантом, но пред-ставляет собой дериват фага G7C с измененным спектром хозяев. Исследование профилей белков этих фагов с помощью ДСН-ПААГ электрофореза также не выявило между ними раз-личий.

Морфология клеток различных дериватов E.coli 4s, полученных в этой работе, также не различалась (по данным световой микросокпии), однако исходный штамм 4s и штамм 4sAs обладали способностью формировать крупны агрегаты клеток, причем у 4sAs эти агрегаты иногда достигают размеров, различимых невооруженным взглядом. При этом все эти штам-мы практически не образуют биопленок на поверхности пластика иммунологических плашек (данные не приведены).

Выводы.1. Выявлен один из механизмов длительного поддержания вирулентных бактериофа-

гов в ПА.2. Развитие ПА бактериофага G7C и штамма E. coli 4s сопровождается увеличением

разнообразия штаммов бактерии и фага, по сравнению с исходными компонентами.3. Этот механизм может принимать участие в формировании и поддержании высокой

внутривидовой гетерогенности популяций E. coli в кишечнике лошадей.

Список литературы:1. Golomidova A, Kulikov E, Isaeva A, Manykin A, Letarov A. The diversity of coliphages

and coliforms in horse feces reveals a complex pattern of ecological interactions. // Appl Environ Microbiology. 2007. 73:5975–5981

2. Куликов Е.Е., Исаева А.С., Роткина А.С., Маныкин А.А. и Летаров А.В. Биоразно-образие и динамика бактериофагов в фекалиях лошадей. // Микробиология. 2007. 76, 271-278

3. Исаева А.С., Куликов Е.Е, Тарасян К.К., Летаров А.В. Новый метод высокоразре-шающего геномного ПЦР-фингерпринтинга энтеробактерий. // Acta naturae. 2010. 2 (1), 82-87

4. Kasman LM. Barriers to coliphage infection of commensal intestinal flora of laboratory mice. // Virol J. 2005 Apr 15;2:34.

5. Kulikov E., Kropinski A.M., Golomidova A.K. , Isolation and characterization of a novel indigenous intestinal N4-related coliphage vB_EcoP_G7C. // Virology. 2012. 426 (2012) 93–99

6. de Siqueira RS, Dodd CE, Rees CE. Evaluation of the natural virucidal activity of teas for use in the phage amplification assay. // Int J Food Microbiol. 2006. �ct 1;111(3):259-62.


145

УДК 577.152.3

ЭНДОЛИЗИН БАКТЕРИОФАГА Т5 КАК ПОТЕНЦИАЛЬНЫЙ ЭНЗИБИОТИК

Микулинская Г.В., кандидат биологических наук, Филиал Института биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, г. Пущино, [email protected]Зимин А.А., кандидат биологических наук, [email protected]Степная О.А., доктор биологических наук, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им Г.К. Скрябина РАН, г. Пущино

Ключевые слова: эндолизин, бактериофаг Т5, L-аланоил-D-глутаматпептидаза, энзибиотики

Был изу�ен спектр антибактериального действия нового эндолизина бактериофага Т5 - катионозависимой L-аланоил-D-глутаматпептидазы. �оказано, �то фермент специфи-L-аланоил-D-глутаматпептидазы. �оказано, �то фермент специфи--аланоил-D-глутаматпептидазы. �оказано, �то фермент специфи-D-глутаматпептидазы. �оказано, �то фермент специфи--глутаматпептидазы. �оказано, �то фермент специфи-�ески разрушает пептидогликан грамотрицательных бактерий, относящийся к типу А1γ. �оказано, �то фермент полностью лизирует живые клетки бактерий в присутствии по-лимиксина В. Это позволяет прогнозировать применение данного белка как энзибиотика на-правленного действия.

Введение. Эндолизины – группа белков, кодируемых бактериофагами и разрушаю-щих пептидогликан клеточной стенки бактерии на конечной стадии литического цикла раз-вития фага. По типу связей, гидролизуемых в пептидогликане, эндолизины делят на 5 клас-сов: 1) мурамидазы; 2) литические трансгликозилазы; 3) N-ацетил-β-D-глюкозаминидазы; 4) N-ацетилмурамил-L-аланинамидазы и 5) пептидазы [1,2]. В настоящее время в связи с по--ацетилмурамил-L-аланинамидазы и 5) пептидазы [1,2]. В настоящее время в связи с по-L-аланинамидазы и 5) пептидазы [1,2]. В настоящее время в связи с по--аланинамидазы и 5) пептидазы [1,2]. В настоящее время в связи с по-явлением большого числа антибиотикоустойчивых патогенов литические ферменты бактери-офагов рассматриваются в качестве альтернативы антибиотикам для лечения и профилактики инфекций бактериальной природы.

Эндолизины характеризуются определенным спектром антибактериального действия, не зависящим от чувствительности бактерии к антибиотикам. Спектр антибактериального действия эндолизина определяется типом фермента, составом компонентов клеточной стенки, а также конфигурацией субстрата. Избирательность действия эндолизина фага С1 на стреп-тококки позволяет его использовать в качестве профилактического средства для предотвра-щения колонизации этими бактериями мукозного эпителия верхних дыхательных путей [3]. Специфичность другого фагового эндолизина к B.anthra��s позволяет использовать его в диа-гностике [4]. Лизоцим бактериофага Т4 был успешно использован для защиты картофеля от вредной бактерии Erw�n�a �arotowora [5]. Относительно фаговых эндолизинов в литературе часто употребляется термин «энзибиотики».

Целью настоящей работы стал анализ спектра антибактериального действия нового эндолизина бактериофага Т5 и исследование возможности его применения в качестве лизиру-ющего агента.

Материалы и методы. С целью определения спектра антибактериального дей-ствия эндолизина клетки ночной культуры бактерий убивали автоклавированием, промывали и суспендировали в реакционном буфере (50 mM Tris-HCl, pH 8.2, содержащем 0.1% Tритон X-100) до концентрации ~2∙108 к.о.е./мл. Реакцию начинали добавлением фермента. Литиче-скую активность измеряли по уменьшению оптической плотности при 450 нм в 1-см акрило-

Степная О.А.


146

вых кюветах при комнатной температуре. За единицу активности принимали такое количество фермента, которое катализирует убывание оптической плотности на 1 ОЕ в минуту.

С целью проверки действия эндолизина на живые клетки бактерий ночную культу-ру E. coli суспендировали в реакционном буфере (50 mM Tris-HCl, pH 8.2, содержащем 0.1% Tритон X-100) до концентрации ~2∙108 к.о.е./мл. Один образец обрабатывали полимиксином В (конечная концентрация 40 мкг/мл), второй – чистым препаратом эндолизина (конечная кон-центрация 40 мкг/мл), третий – обоими агентами в тех же концентрациях. Контролем служи-ли необработанные клетки. Все образцы инкубировали сутки при 37°С, после чего отбирали аликвоты, соответствующие 107 исходных клеток, и выращивали газоном на LB-агаре в тече-LB-агаре в тече--агаре в тече-ние ночи.

Результаты и их обсуждение. Эндолизин бактериофага Т5 был успешно клонирован в клетках E.coli и очищен до электрофоретически гомогенного состояния [6]. Была исследова-на активность эндолизина бактериофага Т5, изучены важнейшие биохимические и физические свойства фермента [7]. Фермент является Ca2+-зависимой L-аланоил-D-глутаматпептидазой, однако относится к семейству цинк-содержащих пептидаз семейства М15 клана МD [6-7]. Это первый пример L-аланоил-D-глутаматпептидазы, обнаруженной у вирулентного фага, инфи-L-аланоил-D-глутаматпептидазы, обнаруженной у вирулентного фага, инфи--аланоил-D-глутаматпептидазы, обнаруженной у вирулентного фага, инфи-D-глутаматпептидазы, обнаруженной у вирулентного фага, инфи--глутаматпептидазы, обнаруженной у вирулентного фага, инфи-цирующего грамотрицательную бактерию.

Для определения спектра антибактериального действия фермента была проверена его способность гидролизовать пептидогликаны различного строения. Среди бактерий, выбран-ных для лизиса, были как грамположительные, так и грамотрицательные с различной струк-турой пептидогликана и клеточной стенки (Таблица 1). Все препараты грамотрицательных бактерий были подвержены быстрому лизису. Среди проверенных грамположительных видов только препараты клеток B. subt��s были подвержены слабому лизису (скорость на четыре порядка меньше максимальной), остальные грамположительные клетки не лизировались во-обще. Таким образом, было показано, что фермент специфичен к пептидогликану грамотрица-тельных бактерий, который относится к одному типу - A1γ - и не содержит ни тейхоевых, ни тейхуроновых кислот, характерных для клеточных стенок грамположительных бактерий.

Таблица 1. - Действие пептидазы бактериофага Т5 на гетерологичные микроор-ганизмы

Организм Тип пептидогликана Относительная скорость лизиса, Ед/мг белка

Es�her��h�a �o�� K-12 A1γ (1.12±0.12)∙104

Pe�toba�ter�um �arotovorum A1γ (1.01±0.15)∙104

Pseu�omonas put��a A1γ (1.35±0.18)∙104

Proteus vu�gar�s A1γ (1.19± 0.20)∙104

Proteus m�rab��s A1γ (1.04±0.15)∙104

Ba��us subt��s A1γ 0.48±0.05L�ster�a mono�ytogenes A1γ 0.016±0.001Staphy�o�o��us aureus A3α 0.0�or�neba�ter�um xeros�s A1γ 0.0M��ro�o��us �uteus А2 0.0

Как правило, для проникновения «изнутри» клетки сквозь внутреннюю мембрану клетки-хозяина к слою пептидогликана эндолизину необходим гидрофобный белок холин, второй компонент двухбелковой системы фаголизиса клетки. Однако, эндолизины способны разрушать пептидогликан клеточной стенки и в одиночку, будучи добавленными «извне» в


147

виде очищенного рекомбинантного белка. Прежде всего, это характерно для эндолизинов, специфичных к пептидогликану грамположительных бактерий. В некоторых случаях грамо-трицательные микроорганизмы на определенных стадиях роста также подвержены лизису эндолизинами [5]. Однако в целом применение подобных белков против грамотрицательных микроорганизмов осложняется строением клеточной стенки последних, а именно наличием наружной плазматической мембраны.

Одним из способов пермеабилизации наружной мембраны, обеспечивающей эндоли-зину доступ к субстрату – пептидогликану – и дальнейший лизис клетки, является применение антибиотиков, нарушающих мембрану [8]. В этом случае можно говорить о синергическом действии эндолизина с антибиотиком.

Мы использовали полимиксин В – пептидный антибиотик, который может связываться с фосфолипидами наружной мембраны и увеличивать ее проницаемость. На рисунке 1 видно, что полимиксин в концентрации 40 мкг/мл ингибирует рост клеток, не лизируя их (оптическая плотность не падает). Однако совместное использование эндолизина и полимиксина приводит к полному лизису клеток. При этом контрольные (ничем не обработанные) клетки и клетки, обработанные препаратом эндолизина, образуют сплошной газон.

Рис. 1. Выживаемость клеток E.coli под действием эндолизина. На рисунке пред-ставлены фрагменты чашек, инкубированных с: А – очищенным эндолизином (концен-трация 40 мкг/мл), В – полимиксином В (концентрация 40 мкг/мл), С – полимиксином В и эндолизином (концентрация каждого 40 мкг/мл), D – контрольные клетки.

Таким образом, можно говорить о бактериолитическом действии эндолизина на гра-мотрицательные клетки, опосредованном пермеабилизацией наружной мембраны полимикси-ном В.

Заключение. Исследования, проведенные в целях изучения спектра бактериолитиче-


148

ского действия фермента, показали, что пептидаза бактериофага Т5 специфична к клеточным стенкам грамотрицательных микроорганизмов, пептидогликан которых относится к одному типу - A1γ - и не содержит ни тейхоевых, ни тейхуроновых кислот, характерных для клеточ-A1γ - и не содержит ни тейхоевых, ни тейхуроновых кислот, характерных для клеточ-1γ - и не содержит ни тейхоевых, ни тейхуроновых кислот, характерных для клеточ-γ - и не содержит ни тейхоевых, ни тейхуроновых кислот, характерных для клеточ- - и не содержит ни тейхоевых, ни тейхуроновых кислот, характерных для клеточ-ных стенок грамположительных бактерий. Среди грамотрицательных микрорганизмов есть и патогенные для животных и человека, а также растений (Pseudomonas, Klebsiella, Proteus, Shigella, Aeromonas, Vibrio cholerae, Yersinia, Salmonella, Campylobacter jejuni, Citrobacter, Ser-, Aeromonas, Vibrio cholerae, Yersinia, Salmonella, Campylobacter jejuni, Citrobacter, Ser-Aeromonas, Vibrio cholerae, Yersinia, Salmonella, Campylobacter jejuni, Citrobacter, Ser-, Vibrio cholerae, Yersinia, Salmonella, Campylobacter jejuni, Citrobacter, Ser-Vibrio cholerae, Yersinia, Salmonella, Campylobacter jejuni, Citrobacter, Ser- cholerae, Yersinia, Salmonella, Campylobacter jejuni, Citrobacter, Ser-cholerae, Yersinia, Salmonella, Campylobacter jejuni, Citrobacter, Ser-, Yersinia, Salmonella, Campylobacter jejuni, Citrobacter, Ser-Yersinia, Salmonella, Campylobacter jejuni, Citrobacter, Ser-, Salmonella, Campylobacter jejuni, Citrobacter, Ser-Salmonella, Campylobacter jejuni, Citrobacter, Ser-, Campylobacter jejuni, Citrobacter, Ser-Campylobacter jejuni, Citrobacter, Ser- jejuni, Citrobacter, Ser-jejuni, Citrobacter, Ser-, Citrobacter, Ser-Citrobacter, Ser-, Ser-Ser-ratia, Escherichia, Proteus, Providencia, Acinetobacter, Moraxella, Flavobacterium, Agrobacterium tumefaciens и другие). Наличие вызываемых грамотрицательными бактериями заболеваний делает эндолизин Т5 потенциальным бактериолитическим средством довольно узкого спектра действия, особенно перспективным в случаях, когда применение антибиотиков нежелательно или неэффективно.

В качестве пермеабилизующего мембрану грам-отрицательной бактерии агента нами были использован полимиксин В. Однако, это не единственный способ пермеабилизации мем-браны. Можно выделить еще несколько подходов: физические или химические методы воздей-ствия на клетку –обработка ЭДТА, триполифосфатом натрия, нагрев, изменение pH, обработка ультразвуком, - а также создание химерных конструкций на основе эндолизина, слитого с до-менами определенного типа или антимикробными пептидами, обеспечивающими транслока-цию через наружную мембрану. Это относительно новый подход, однако известны случаи, когда создание химерных белков помогало модулировать активность эндолизинов, изменять их специфичность и направленно бороться с патогенами [1].

Библиографический список1. Borysowski, J. Bacteriophage endolysins as a novel class of antibacterial agents/ J.

Borysowski, B. Weber-Dabrowska, A. Górski // Exp. Biol. Med. (Maywood) - 2006. – v. 231. – p. 366-377.

2. Loessner, M. J. Bacteriophage endolysins-current state of research and applications/ M. J. Loessner // Curr. �pin. Microbiol. – 2005. – v. 8. – p. 480-487.

3. Nelson, D. Prevention and elimination of upper respiratory colonization of mice by group A streptococci by using a bacteriophage lytic enzyme // D. Nelson, L. Loomis, V. A. Fischetti// Proc. Natl .Acad. Sci. USA - 2001. – v. 98. – p. 4107-4112.

4. Schuch, R. A bacteriolytic agent that detects and kills Ba��us anthra��s/ R. Schuch, D. Nelson, V. A. Fischetti// Nature. – 2002. – v. 418. – p. 884-889.

5. During, K. Transgenic potato plants resistant to the phytopathogenic bacterium E. �arotovora/ K. During, P. Porsch, M. Fladung, H. Lorz // Plant J. – 1993. – v. 3. – p. 587-598.

6. Mikoulinskaia, G. V. Identification and characterization of the metal ion-dependent L-alanoyl-D-glutamate peptidase encoded by bacteriophage T5 / G. V. Mikoulinskaia, I. V. �dinokova, A. A. Zimin et al. // FEBS J. – 2009. – v. 276. – p. 7329-7342.

7. Mikoulinskaia, G. V. L-Alanoyl-D-Glutamate Peptidase (Bacteriophage T5) / G. V. Mikoulinskaia, I. V. �dinokova, A. A. Zimin, �. A. Stepnaya // Handbook of Proteolytic Enzymes: III edition by Neil D. Rawlings and Guy S. Salvesen - �xford: Academic Press, 2013. - p. 1407-1410.

8. Begunova, E. A. The effect of the extracellular bacteriolytic enzymes of Lysoba�ter sp. on gram-negative bacteria / E. A. Begunova, �. A. Stepnaia, I. M. Tsfasman, I. S. Kulaev // Microbiology - 2004. – v. 73. – p. 320-325.


149

BACTERIOPHAGE T5 ENDOLYSIN AS A POTENTIAL ENZYBIOTIC

Mikoulinskaia G.V., Zimin A.A., Stepnaya О.А.

Keywords: en�o�ys�n, ba�ter�ophage T5, L-a�anoy�-D-g�utamate pept��ase, enzyb�ot��s

The range of ant�ba�ter�a� a�t�on of new ba�ter�ophage T5 en�o�ys�n – �at�on-�epen�ent L-a�anoy�-D-g�utamate pept��ase - was �nvest�gate�. It was shown that the enzyme �s spe��fi� to the �e�� wa��s of the Gram-negat�ve m��roorgan�sms, �onta�n�ng pept��og�y�an of A1γ type. It was shown that the enzyme �omp�ete�y �yses ��ve ba�ter�a �e��s after po�ymyx�n B treatment. It makes T5 pept��ase a potent�a� �an��ate for the use as an enzyb�ot�� of ��re�te� a�t�on.

УДК 578.81, 578.52, 615.076.7

ПЦР-СИСТЕМА ТИПИРОВАНИЯ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ БАКТЕРИОФАГОВ PSEUDOMONAS AERUGINOSA

Мирошников К.А., кандидат биологических наук, и.о. зав. лабораториейФГБУН «Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» РАН, [email protected]Сыкилинда Н.Н., кандидат биологических наук, старший научный сотрудник ФГБУН «Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» РАН, [email protected]Куликов Е.Е., кандидат биологических наук, старший научный сотрудник ФГБУН «Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского» РАН, [email protected]Дурманова З.В., ведущий инженер ФГБУ «НЦЭСМП» МЗ РФ тел. 7(499) 241-31-05, [email protected]Цыганова М.Р., аспирант ФГБУН «Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» РАНДарбеева О.С., кандидат медицинских наук, главный эксперт ФГБУ «НЦЭСМП» МЗ РФ

Ключевые слова: бактериофаги, Pseu�omonas aerug�nosa, фаготерапия, генотипи-Pseu�omonas aerug�nosa, фаготерапия, генотипи- aerug�nosa, фаготерапия, генотипи-aerug�nosa, фаготерапия, генотипи-, фаготерапия, генотипи-рование, полимеразная цепная реакция

В ходе данной работы разработана �ЦР-тестовая система определения таксономи-�еской принадлежности бактериофагов P.aerug�nosa в контексте возможности использова-P.aerug�nosa в контексте возможности использова-.aerug�nosa в контексте возможности использова-aerug�nosa в контексте возможности использова- в контексте возможности использова-ния фагов в терапевти�еских препаратах

Введение: Для терапии синегнойных инфекций успешно применяются бактериофаги, в том числе и промышленно выпускаемые. Принципы селекции терапевтических бактерио-фагов в настоящее время в основном эмпирические, и не имеется строгой описательной базы, основанной на генетических данных. Некоторые из требований, предъявляемых к бактерио-фагам, используемым в составе терапевтических смесей, неразрывно связаны с изучением их генома. Знание полной последовательности генома фага позволяет проверить наличие генных


150

модулей рекомбинации или транспозиции, свойственных умеренным фагам, генов факторов вирулентности или токсинов. Однако полное секвенирование геномов остается достаточно дорогой процедурой, особенно с учетом быстро меняющихся составов фаговых препаратов при адаптации их к новым штаммам патогенных микроорганизмов. В качестве более дешевой и технологичной альтернативы предложена система быстрого типирования имеющихся и �e novo выделяемых бактериофагов Pseu�omonas aerug�nosa на основе ПЦР-анализа, и на этом основании приведение состава терапевтических смесей фагов к оптимуму по генетическому составу. Сконструированная нами система быстрого отнесения на основе ПЦР-анализа имею-щихся и �e novo выделяемых бактериофагов синегнойной палочки P.aerug�nosa к определен-ным группам позволяет определить пригодность тестируемого бактериофага к применению в составе терапевтических смесей фагов.

Результаты исследований и их обсуждение:1. Анализ геномов бактериофагов P. aeruginosa.На сегодняшний день в GenBank содержится более 60 полных геномов бактериофа-GenBank содержится более 60 полных геномов бактериофа- содержится более 60 полных геномов бактериофа-

гов P.aerug�nosa, что составляет 4% всех полностью секвенированных фагов. Практически ис-ключительно в состав известных фаговых коктейлей входят бактериофаги �au�ov�ra�es (хво-статые). Имеющиеся в базе данных GenBank бактериофаги этого отряда можно подразделить следующим образом (табл.1):

Таблица 1. - Свойства групп известных бактериофагов P.aerug�nosa

№ Группа фагов СемействоРазмер генома,

т.п.оЧисло

геномовЖизненный

цикл

1 φKZ-подобные Myov�r��ae 211-316 6 Литический

2 PB1- подобные Myov�r��ae 65-66 8 Литический

3 KMV- подобные Po�ov�r��ae 42-43 8 Литический

4 N4- подобные Po�ov�r��ae 74 2 Литический

5 YuA- подобные S�phov�r��ae 59-59 3 Литический

6 LUZ24- подобные Po�ov�r��ae 45 2 Варьирует

7 D3- подобные S�phov�r��ae 56-57 6 Умеренный

8 P2- подобные Myov�r��ae 35-36 2 Умеренный

9 119X- подобные Po�ov�r��ae 42-43 2 Умеренный

10 Лямбдоидные S�phov�r��ae 43-44 2 Умеренный

11 F10- подобные S�phov�r��ae 39-40 2 Умеренный

12 F116- подобные S�phov�r��ae 65 1 Умеренный

13 транспозоны S�phov�r��ae 37-39 5 Умеренный

Частичное секвенирование �e novo выделенных из природных источников бактерио-фагов P.aerug�nosa показывает, что в подавляющем большинстве случаев их можно отнести к одному из вышеописанных видов. Таким образом, можно сделать некоторые предварительные выводы по пригодности тех или иных бактериофагов для терапевтических приложений:


151

1. Группы фагов 1-4 с достаточно высокой степенью уверенности можно тестировать в качестве составной части фаговых коктейлей.

2. Фаги из групп 5-8 можно рассматривать как кандидатные. Однако следует учиты-вать генетически заложенную возможность лизогенной конверсии и проводить интенсивную проверку на проявление умеренных свойств на широком спектре штаммов.

3. Фаги групп 9-13, способные к активной интеграции-транспозиции и токсической конверсии бактерий, должны быть исключены из использования в терапевтических целях.

За исключением фагов-транспозонов группы 13, объединяемых преимущественно по типу действия, а не по формально таксономическому родству, и отчасти группы 1, имеющей широкую вариабельность геномов на нуклеотидном уровне, выделенные группы бактериофа-гов сохраняют весьма высокую консервативность геномов. Основные различия геномов, опре-деляющие принадлежность фага к отдельному виду, обычно находятся в высоко-вариативной области ранних генов, определяющих взаимодействия с клеточными системами хозяина, а также в генах хвостовых фибрилл и шипов, обусловливающих опознавание рецепторов на по-верхности клеток-хозяев.

2. Разработка ПЦР-системы определения генетической принадлежности бактериофа-гов

Анализ геномов бактериофагов показывает, что наиболее консервативными внутри каждой группы являются гены, кодирующие белковые продукты, формирующие структурные компоненты частицы фагов – икосаэдрическую головку (капсид) и хвост. Во всех случаях в качестве реперных консервативных генов были использованы гены мажорных или минорных белков капсидов. Были сконструированы и оптимизированы последовательности праймеров для всех групп литических бактериофагов, и проведены ПЦР с использованием модельных фагов для определения оптимальных условий реакции.

Во всех случаях специфических праймеров к конкретным группам фагов образование единичного продукта со сходным количественным выходом наблюдалось в диапазоне темпе-ратур отжига 57-64 оС и концентрации Mg2+ 0,5 – 2,0 мМ. Установленная последовательным разбавлением матрицы чувствительность ПЦР-системы соответствует концентрации бактери-офага 2 пг в пробе. Таким образом, минимально определяемой с помощью ПЦР тест-системы концентрацией бактериофагов в растворе примерно является 103 частиц бактериофага в 1 мл раствора. Внесение «искусственного загрязнения» - бактериальной ДНК E.�o�� в реакционную смесь в количестве до 200 нг заметного влияния на чувствительность реакции не оказывает. Тестирование селектривности ПЦР-системы было проведено в отношении тех групп бакте-риофагов P.aerug�nosa, для которых имеются репрезентативные коллекции, включающие не менее 10 бактериофагов, принадлежащих к определенной группе. В случае KMV-подобных, РВ1-подобных и YuA-подобных фагов ПЦР тест давал положительный сигнал в случае всех бактериофагов коллекции.

3. ПЦР-проверка наличия бактериофагов в коммерческих терапевтических пре-паратах.

Разработанные реакционные смеси для ПЦР-тестирования для всех основных извест-ных типов литических бактериофагов, наличие которых с наибольшей вероятностью можно ожидать в промышленных терапевтических смесях фагов против псеводомонадных инфекций, были применены к промышленно производимым смесям лекарственных препаратов. Для про-мышленных терапевтических смесей синегнойных бактериофагов, предоставленных ГИСК им. Тарасевича, были получены следующие результаты:

№1 - Бактериофаг синегнойный, Нижний Новгород, 100 мл, партия 11.07 KMV


152

№2 - Бактериофаг синегнойный, Нижний Новгород, 100 мл, партия 06.08 KMV №3 - Бактериофаг синегнойный, Нижний Новгород, 100 мл, партия 08.08 KMV№4 - Бактериофаг синегнойный, Нижний Новгород, 100 мл, партия 11.08 KMV №5 - Бактериофаг синегнойный, �ермь, 20 мл, партия 01.10 KMV+ φKZ№6 - Бактериофаг синегнойный, �ермь, 20 мл, партия 02.10 KMV+ φKZ

Таким образом, во всех смесях было установлено наличие Po�ov�r��ae KMV-подобных бактериофагов, и в двух смесях – наличие Myov�r��ae φKZ – подобных фагов. Обе группы фа-φKZ – подобных фагов. Обе группы фа-KZ – подобных фагов. Обе группы фа-гов принадлежат к вирулентным, допустимым к применению в терапевтических смесях.

4. Титрование терапевтических смесей на штаммах P.aeruginosa и ЭМ-анализ. Принимая во внимание широкий штаммовый диапазон действия терапевтических

смесей (больше, чем для каждого из известных индивидуальных бактериофагов), деклариро-ванное наличие в смесях нескольких типов фагов, и ограничение ПЦР-системы по чувстви-тельности (уверенное определение фагов в концентрации > 103 бое), мы провели титрование терапевтических смесей для оценки количества негативных колоний (НК) различной морфо-логии. По результатам эксперимента в препаратах 1-4 достоверно подтверждается подавляю-щее количественное преимущество KMV-подобных фагов, что соответствует результатам ис-ходного ПЦР-теста. Были проведены ПЦР-тесты с материалом, взятым из индивидуальных НК. Было еще раз подтверждено наличие KMV-подобных фагов во всех смесях и установлено наличие φKZ-подобных фагов в смесях №5 и 6. Поскольку титрование смесей в большин-φKZ-подобных фагов в смесях №5 и 6. Поскольку титрование смесей в большин-KZ-подобных фагов в смесях №5 и 6. Поскольку титрование смесей в большин-стве случаев давало несколько типов НК (бляшек) на газоне клеток P.aerug�nosa, была про-ведена ЭМ-визуализация бактериофагов, входящих в состав смесей. Наблюдения подтвердили наличие во всех смесях бактериофагов семейства Po�ov�r��ae, относящихся к группе KMV-подобных, и крупных Myov�r��ae бактериофагов, относящихся к группе φKZ- подобных, в материале препаратов 5 и 6.

Помимо этого, как в материале терапевтических смесей, так и в материале нега-тивных колоний наблюдалось небольшое количество бактериофагов более мелких Myov�r��ae и небольших S�phov�r��ae бактериофагов, причем в материале некоторых негативных колоний были выше и концентрация примесных бактериофагов, и их разнообразие. ПЦР-сигнала до-полнительно обнаруженные бактериофаги не дают, то есть либо их концентрация составляет величину ниже предела детекции ПЦР-системы, либо эти фаги относятся к группам, на геном которых детекционная система не разрабатывалась. Мы предположили следующие причины присутствия неидентифицированных бактериофагов в терапевтических смесях:

1. Поскольку состав образцов фаговых препаратов, из которых составляется терапев-тическая смесь, охарактеризован недостаточно, возможно, что в образцах содержатся фаги не-скольких видов. Такие фаги менее активны, и их влияние на общую активность препарата невелико. Однако так как это тоже псевдомонадные фаги, в культуре ферментации они также размножаются. Вероятно, на некоторых штаммах активность таких минорных фагов возрас-тает, и в материале бляшек их пропорция более заметна.

2. Все известные геномы штаммов P.aerug�nosa содержат в своем составе груп-пы генов, идентифицируемые как профаги, т.е. лизогены, захваченные в ходе эволюции. В литературе обсуждается возможность активации профагов как одного из ответов бактерий на массовую инфекцию бактериофагами. Генетика умеренных фагов, а тем более профагов P.aerug�nosa изучена плохо, поэтому детекции таких вторичных фагов системой ПЦР не про-исходит.

Оба этих эффекта требуют дальнейшего углубленного изучения, однако следует заметить, что и доля таких «вторичных» фагов, и их активность значительно ниже, чем лити-


153

ческих KMV- и φKZ-подобных фагов, составляющих основное содержание терапевтических смесей.

Заключение: На основе обобщенных геномных данных создана унифицированная ПЦР-система, которая позволяет определять групповую принадлежность бактериофагов P. ae-ae-rug�nosa, выделенных �e novo и находящихся в плохо охарактеризованных коллекциях без про-ведения длительных культуральных работ, электронной микроскопии и полной расшифровки последовательностей геномов. Определение таксономической принадлежности бактериофа-гов P.aerug�nosa позволяет оценить возможность использования этих фагов в терапевтических препаратах

PCR SYSTEM FOR GENOTYPING OF THERAPEUTIC PSEUDOMONAS AERUGINOSA BACTERIOPHAGES

Miroshnikov K.A., Sykilinda N.N., Kulikov E.E., Durmanova Z.V., Tsyganova M.R., Darbeeva O.S.

Keywords: ba�ter�ophages, Pseu�omonas aerug�nosa, phage therapy, genotyp�ng, po�ymerase �ha�n rea�t�on

The goa� of the present work �s the �es�gn of P�R-test�ng system ��re�te� for taxonom�� eterm�nat�on of P.aerug�nosa ba�ter�ophages for use �n therapeut�� preparat�ons.

УДК 619:579

РАЗРАБОТКА ПАРАМЕТРОВ УСКОРЕННОЙ ИНДИКАЦИИ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI О157 C ПОМОЩЬЮ РЕАКЦИИ НАРАСТАНИЯ

ТИТРА ФАГА

Молофеева Н.И., кандидат биологических наук, доцентВасильев Д.А., доктор биологических наук, профессор8(8422) 55-95-47, [email protected] Золотухин С.Н., доктор биологических наук, профессортел. 8(8422) 55-95-47, [email protected]ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина»

Ключевые слова: индикация, бактерии, бактериофаги, реакция нарастания титра фага.

Работа посвящена разработке технологи�еских параметров по ускоренной иденти-фикации бактерий рода Es�her��h�a �o�� О157 с помощью реакции нарастания титра фага.

Введение. Escherichia coli являются распространенными возбудителями инфекцион-Escherichia coli являются распространенными возбудителями инфекцион- coli являются распространенными возбудителями инфекцион-coli являются распространенными возбудителями инфекцион- являются распространенными возбудителями инфекцион-ных заболеваний желудочно-кишечного тракта у животных и человека [5, 6].

В научной литературе имеется большое число сообщений о заболевании людей, про-текающих в тяжелой форме, вызванных Е. coli сероваром �157, который образует шигоподоб-�157, который образует шигоподоб-157, который образует шигоподоб-


154

ный вероцитотоксин [5, 7]. Вспышки этой инфекции, зарегистрированы во многих странах Северной и Южной Америки, Австралии, Европы, Азии, Африки и в нашей стране. Эшерихии серогруппы О157 вызывают у молодняка животных диарею, геморрагический энтероколит и отечную болезнь у поросят [6]. Так как основным резервуаром инфекции является крупный и мелкий рогатый скот, свиньи, реже лошади, олени, птица, то особенно опасны для людей пищевые продукты, полученные от этих животных [8], а также растительные продукты, вы-ращенные на полях, куда мог вывозиться, необеззараженный навоз, от животных-носителей этотого серовара эшерихий. По данным J. Tuttle (1999) в ноябре 1992 года - феврале 1993 года наблюдалась вспышка (более 700 случаев) на Западе США, вызванная Es�her��h�a coli О157, связанная с гамбургерами, приготавливаемых в ресторанах. Исследования показали, что для заражения человека достаточна инфицирующая доза не превышающая 700 бактерий.

В последнее время совершенствованию методов лабораторной диагностике инфек-ций, вызываемых Es�her��h�a coli О157 уделяется большое внимание. Современные методы иммунодиагностики (ПЦР и ИФА), предлагаемые для индикации этих бактерий, хотя и явля-ются высокоспецифичными и чувствительными, но сложность методик, высокая стоимость оборудования и реактивов, делает их пока недоступными для большинства лабораторий. В лабораторной практике для ускоренного обнаружения микроорганизмов в патологическом ма-териале и объектах внешней среды, а также для их быстрого типирования, предложены инди-каторные бактериофаги [2, 3, 4]. Методы фагодиагностики просты в постановке, специфичны, не требуют больших затрат времени, материалов и общедоступны.

Цель и задачи исследования. Разработка параметров и технологических приёмов по индикации и идентификации E.�o�� серогруппы О157 с помощью реакции нарастания титра фагов (РНФ). В связи с этим при выполнении работы решались следующие задачи: выделить и изучить основные биологические свойства (морфология негативных колоний, литическая активность и ее диапазон, специфичность, температурная устойчивость, устойчивость к хло-роформу) селекционированных изолятов, активные в отношении штаммов Е. �o�� 157 и раз-работать схему ускоренной индикации бактерий E.�o�� О157 в объектах ветеринарного надзора с помощью РНФ и использованием созданного биопрепарата.

Материалы и методы исследованийШтаммы. В работе использованы гомологичные - 6 штаммов E. coli �157, так и ге-

терологичные - 67 штаммов E.�o��, в том числе 12 штаммов получены из лаборатории ООИ центра санэпиднадзора Ульяновской обл, 56 штаммов E.�o�� выделены нами из хозяйств Мо-сковской, Ульяновской и Самарской области. Помимо этого, при определении специфично-сти бактериофагов использовались 71 штамм других видов бактерий – представители родов: Proteus, Citrobacter, Morganella, Klebssiella, Salmonella, Staphylococcus, Pseudomonas, Bacillus, полученные из музея кафедры. Они обладали типичными для данных культур биологическими свойствами. Объектами исследования явились фаги E coli �157, выделенные нами из объектов внешней среды хозяйств Ульяновской и Самарской областей.

Питательные среды и реактивы. Мясо-пептонный бульон (МПБ), мясо-пептонный агар (МПА); полужидкий агар, пептонная вода.

Приборы и оборудование. Термостаты ТС-80М-2; микроскопы МБИ-3, лупа биноку-лярная МБС-9, ультратермостаты УТ-15У4,2; вакуумный насос Mezmolnice (Чехословакия), центрифуги лабораторные ОПн-8УХЛ4,2 и ЦЛС-3; аппарат ультрафиолетового облучателя крови «Изольда» с ртутной лампой ДРБ8-1; холодильники бытовые, колбы мерные, пипетки пастеровские, пипетки мерные на 1,0; 2,0; 5,0 см3, чашки Петри, пробирки, стандарты мутно-сти на 0,5 и 1,0 млрд. микробных клеток.

Методы. При работе с бактериями все посевы инкубировались при температуре 37°С


155

в течение 24-48 часов, а при работе с бактериофагами в течение 16-20 часов. Методические указания «по методам выделения и идентификации энтерогеморрагической кишечной палочки E coli �157:Н7», МУК 4.2.992-00. Исследования фагов проводили общепринятыми методами Грация [1].

Результаты исследований и их обсуждениеДля выполнения цели исследований необходимо было первоначально выделить и из-

учить искомый бактериофаг, поэтому первым этапом нашей работы была попытка выделить бактериофаги E.�o�� О157 из имеющихся у нас штаммов бактерий E.�o�� О157. Используя стро-гую специфичность селекционированных нами бактериофагов по отношению к патогенным штаммам E.�o�� О157 мы разработали схему выделения и ускоренной идентификации этих микроорганизмов

При разработке оптимальных условий постановки РНФ необходимо прежде всего: а) иметь биопрепарат из штаммов бактериофагов, обладающих строгой специфичностью и наибольшим совместным спектром литической активности; в) определить количественный показатель реакции, имеющий диагностическое значение; с) определить оптимальное время, обеспечивающее полноценное взаимодействие фага с бактериями. Нами было установлено, что спектр активности бактериофагов Е-61 и Е-67 УГСХА равен 100%, они обладают высокой литической активностью по Аппельману 10-7 и по Грациа от 1,5х109 до 3,2х109, а также высо-кой температурной устойчивостью до 800 С и проявили 100 % устойчивость к воздействию хлороформа в течение 40 минут.

Для определения параметров постановки РНФ и разработки количественного пока-зателя реакции, имеющего диагностическое значение, проводили по методу, предложенному Гольдфарбом [3]. Проведены эксперименты с использованием МПБ контаминированного 18 часовыми референс культурами E.�o�� О157 штамм РЛ для фага Е-61 УГСХА и E.�o�� О157 штамм №51659 для фага Е-67 УГСХА различным числом (от 101 до 1х105 м.к./мл). В качестве контроля использовали интактный МПБ.

Учет результатов проводили через 12-16 часов инкубирования. С этой целью подс-чтывали число негативных колоний фага, выросших на питательной среде в опытной пробе и в контроле (контроль титра фага). Оценку РНФ проводили согласно таблицы 1. В случае наличия в исследуемом материале свободного фага число корпускул свободного фага число корпускул фага на чашке подсчитывали и вычитали из числа корпускул индикаторного фага в опытных чашках. Разницу сравнивали с контролем. При высоком титре свободного фага (сплошной лизис индикаторной культуры) реакция не учитывалась. РНФ, оцененная как со-мнительная, не имела диагностического значения.

Таблица 1. - Показатели увеличения титра фага в РНФУвеличение количества частиц бактериофага в опытной по от-

ношению к его контролю Оценка результатов

Увеличение до 2.5 разУвеличение до 5 раз

Увеличение в 5 и более раз

ОтрицательнаяСомнительная

Положительная

В случае наличия в исследуемом материале свободного фага число корпускул фага. По результатам проведенных опытов установлено, что количество фаговых частиц более чем в 5 раз превышает количество фаговых частиц в контрольных пробах при контамнации МПБ E.�o�� О157 в концентрации 103 микробных клеток эшерихий в 1 мл МПБ.

Для установления оптимального времени, обеспечивающего наиболее полноценное


156

взаимодействие фага с бактериями, необходимо было провести эксперименты на тест- объекте по выявлению наиболее эффективного временного показателя взаимодействия фага и индика-торной культуры при сохранении остальных параметров (температурный режим, концентра-ция бактериальной культуры и фаговых корпускул в 1 мл) постановки РНФ. В качестве тест-объекта использовали МПБ, оптимальное время экспозиции выбирали из шести следующих параметров:

˗ в предварительном подращивании исследуемого материала в течение 5, 16, 24 часов при температуре 37°С, после добавления фагов смесь выдерживали в течение 5 часов при тем-пературе 37°С;

˗ в увеличении времени контакта исследуемого материала с фагом до 10, 16 и 24 часов при температуре 37 С.

Для изучение чувствительности РНФ в зависимости от времени подращивания МПБ контаминировали бактериями E.�o�� О157 в контаминации 101-105м.к/м и инкубировали в тер-мостате при температуре 37°С в течение 5, 16 и 24 часов. Результаты исследования представ-лены в таблице 2.

Таблица 2. - Чуствительность РНФ в зависимости от времени подращивания ис-следуемого материала, контаминированного E.�o�� О157

№

п.п.

Варианты исследований

Минимальное количество эшерихий, обнаруживаемое с

помощью

Время, затраченное на проведение исследований (в

часах)Длительность подращивания исследуемого

материала

РНФбак. метод

РНФбак. метод

часы МПБ МПБ МПБ МПБ

Е-615 103 104 22 9616 102 н.о 32 н.о24 102 н.о 40 н.о

Е-675 103 104 22 9616 102 н.о 32 н.о24 102 н.о 40 н.о

Установлено, что при подращивании материала в течение 5-ти часов позволяет обна-ружить эшерихии с помощью РНФ в концентрации 103 м.к./мл. При подращивании исследу-емого материала в течение 16 часов чувствительность реакции повышается и позволяет об-наружить бактерии в количестве 102 м.к/мл. На проведение исследования затрачивается 32 часа. Бактериологическим методом это же количество эшерихий обнаружить не удавалось. При подращивании исследуемого материала в течение 24 часов чувствительность реакции не увеличивается, также позволяет обнаружить бактерии в количестве 102 м.к/мл. На проведение этого варианта реакции необходимо 40 часов.

Во втором варианте опыта МПБ, контаминированный E.�o�� О157 штаммами РЛ и №51659 от 101 до105 м.к./мл не подращивали, а увеличивали время контакта материала с фагом до 10, 16, 24 часов. Результаты представлены в таблице 3.


157

Таблица 3 - Чуствительность РНФ в зависимости от времени инкубирования ис-следуемого материала с фагом Е-61 УГСХА

№п.п.

Варианты исследований

Минимальное количество эшерихий, обнаруживаемое

с помощью

Время, затраченное на проведение исследований (в

часах)Длительность подращивания исследуемого

материала

РНФ бак. метод РНФ бак. метод

часы МПБ МПБ МПБ МПБ

Е-6110 103 104 22 9616 102 н.о 32 н.о24 102 н.о 40 н.о

Е-6710 103 104 22 9616 102 н.о 32 н.о24 102 н.о 40 н.о

По результатам изучения чувствительности РНФ в зависимости от времени инкуби-рования исследуемого материала с фагом установлено, что увеличение времени до 10-ти часов позволяет обнаружить эшерихии с помощью РНФ в концентрации 103 м.к./мл. При инкубиро-вании исследуемого материала с фагом в течение 16 часов чувствительность реакции повы-шается, что позволяет обнаружить бактерии в количестве 102 м.к/мл. На проведение исследо-вания затрачивается 32 часа. Бактериологическим методом это же количество эшерихий обна-ружить не удавалось. При инкубировании с фагом исследуемого материала в течение 24 часов чувствительность реакции не увеличивается и позволяет обнаружить бактерии в количестве 102 м.к./мл.. На проведение этого варианта реакции необходимо 40 часов. Бактериологическим методом E.�o�� О157 удавалось обнаружить в концентрации 104 м.к./мл, на проведение иссле-дования затрачивается 96 часов.

На основании наших данных, считаем, что наиболее эффективными являются режи-мы РНФ при 5 часовой экспозиции исследуемого материала с фагом, когда удается провести индикацию бактерий в количестве 103 в миллилитре исследуемого субстрата, на исследование которого затрачивается 16-18 часов, поэтому данный режим используем в дальнейших иссле-дованиях, хотя наиболее эффективным по чувствительности является инкубирование исследу-емого материала с фагом в течение 16 часов на которое затрачивается до 32 часов.

Библиографический список 1. Адамс М. Бактериофаги (перевод с англ.)//М., 1961.-521 С. 2. Ганюшкин В.Я. Реакция нарастания титра фага при диагностике паратифа поросят.

// Ветеринария. № 3, 1967, с. 69-71.3. Гольдфарб Д.М. Бактериофагия.// М.: Медгиз., 1961, -297С.4. Ляшенко Е.А., Золотухин С.Н.. Васильев Д.А. Разработка и применение фагово-

го биопрепарата для диагностики клебсиеллезной инфекции // Вестник ветеринарии, Том 59, Ставрополь, 2011 с. 90-92.

5. Покровский В.И., Полоцкий Ю.Е., Ющук Н.Д., Бондаренко В.М. // Журн. микро-биол., № 4, 1989, с. 80-87.

6. Тугаринов О.А., М.К.Пирожков, Ю.А.Малахов Сборник научных трудов. //М.:ВГНКИ, Т.62, 2001, с. 68-75.


158

7. Ратинер Ю.А., Канарейкина С.К., Бондаренко В.М. // Журнал микробиологии., № 5, 1976, с. 117-121.

8. Armstrong G.L., Hollingsworth J., Morris J.G. Persistence of Eschericia coli �157:H7 in dairy cattle and the dairu farm environment. // Epidemiol. Rev., V. 18, 1996, р. 29 - 51.

9. Tuttle J., Gomez T., Doyle M.P., Wells J.G., Zhao T., Tauxe P.V., Griffin P.M. Enterohem-orrhagic Escherichia coli. // Epidemiol.fnd Infec., - V. 122, №2, 1999, р.185-192.

THE DEVELOPMENT OF PARAMETERS OF THE ACCELERATED IDENTIFICATION OF BACTERIA ESCHERICHIA COLI О157 WITH THE

HELP OF THE REACTION OF RISE OF TITRE OF THE PHAGE

Моlofeeva N.I., Vasilev D.А., Zolotukhin S.N.

Кey words: ��ent�fi�at�on, ba�ter�a, ba�ter�ophages, the rea�t�on of r�se of t�tre of the phage.

The work �s �evote� to the �eve�opment of te�hno�og��a� parameters on the a��e�erate� ��ent�fi�at�on of ba�ter�a of the genus Es�her��h�a �o�� О157 w�th the he�p of the rea�t�on of r�se of t�tre of the phage.

УДК 619:579

ПРИМЕНЕНИЕ РЕАКЦИИ НАРАСТАНИЯ ТИТРА ФАГА ДЛЯ ИНДИКАЦИИ АЭРОМОНАД В РЫБНОЙ ПРОДУКЦИИ

Насибуллин И.Р., соискатель,, [email protected]Горшков И.Г., научный сотрудник, [email protected]Куклина Н.Г., научный сотрудник, [email protected] Викторов Д.А., кандидат биологических наук,старший научный сотрудник, [email protected]Васильев Д.А., доктор биологических наук, профессорТел. 8(8422) 55-95-47, [email protected]Нафеев А.А., доктор медицинских наук, [email protected]

Ключевые слова: Aeromonas, бактериофаги, биопрепарат, индикация, реакция на-, бактериофаги, биопрепарат, индикация, реакция на-растания титра фага.

Авторами выделены бактериофаги бактерий вида Aermonas hy�roph��a, исследованы их основные биологи�еские свойства и разработан диагности�еский биопрепарат. На основе созданного биопрепарата предложен новый метод индикации Aeromonas hy�roph��a с приме-Aeromonas hy�roph��a с приме- hy�roph��a с приме-hy�roph��a с приме- с приме-нением реакции нарастания титра фага.

Введение. Бактерии рода Aeromonas широко распространены в окружающей среде и известны как возбудители аэромоноза – инфекционного заболевания многих видов рыб и других гидробионтов. Аэромоноз встречается повсеместно и наносит значительный экономи-ческий ущерб рыбоводческим хозяйствам. Контаминированная аэромонадами рыбная продук-


159

ция представляет собой источник серьезных заболеваний человека и животных. При возникновении в хозяйстве аэромоноза на него накладывают карантин, выпол-

няют ветеринарно-санитарные и рыбоводно-мелиоративные мероприятия согласно действу-ющей инструкции [3, 4]. Для лечения аэромоноза рыб в хозяйствах применяют антибиотики широкого спектра действия и другие антисептические средства. Согласно инструкции активно применяются такие препараты как: дибиомицин, бацилихин, ветдипасфен, кронолактон, фура-золидон, хлорная и гашенная известь. Все эти препараты накапливаются в тканях рыб и других гидробионтов и попадают в дальнейшем в пищевое сырье и продукцию.

Применение этих препаратов приводит к уничтожению полезной сапрофитной микро-флоры водоемов, микрофлоры кишечника рыб и гидробионтов, появлению антибиотикорези-стентных бактерий. Меры профилактики согласно инструкции требуют от хозяйств проведения ряда сложных и затратных мероприятий, связанных с дезинфекцией бассейнов и инвентаря, созданием оптимальных зоогигиенических, гидрологических и гидрохимических условий [3].

Диагноз на аэромоноз устанавливают на основании эпизоотологических данных, кли-нических признаков болезни, патологоанатомических изменений, а также результатов бакте-риологического исследования [4].

Индикация и идентификация аэромонад является трудоемким и длительным (до 120 часов) процессом. Типирование до рода Aeromonas требует применения сложных и дорогосто-ящих сред и проведения ряда узких тестов, что обуславливает недостоверность исследования. Внутривидовая идентификация из-за незначительных различий между видами сложна и может служить причиной ошибок.

В связи с этим возникла необходимость использования новых методов индикации бактерий рода Aeromonas, обладающих следующими критериями: кратчайшие сроки исследо-вания, простота в применении, высокая чувствительность и специфичность. Для этих целей нами разработан биопрепарат на основе выделенного и изученного бактериофага Ф43-УГСХА и параметры его применения в схеме реакции нарастания титра фага (РНФ).

Материалы и методы исследования.В качестве исходного материала при выделении бактериофагов были использованы

103 пробы воды водоемов Ульяновской области. В качестве индикаторной культуры исполь-зовали референс-штамм A.h.-43, полученный из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Ульновской ГСХА им. П.А. Столыпина. Посевы инкубировали при температуре 35 ºС в течение 24-48 часов. Выделение и изучение биологических свойств фагов проводили по методам Д.М. Гольдфарба (1961), И.П. Ревенко (1978), И.М. Габриловича(1973), С.Н. Золотухина (2007), Д.А. Викторова (2011). Для полу-чения негативных колоний бактериофагов использовали метод агаровых слоев по Грация. По-вышение литической активности проводили пассированием на индикаторной культуре. Ли-тическую активность определяли методами Аппельмана и Грации. Для определения спектра литической активности применяли референс-штамм и выделенные нами ранее 14 полевых штаммов. Для определения специфичности использовали штаммы бактерий других родов: Proteus, Morgane��a, K�ebss�e��a, Ba��us, ��troba�ter, Yers�n�a, Pseu�omonas, полученные из му-зея кафедры. Все штаммы обладали типичными биологическими свойствами. Реакцию нарас-тания титра фага проводили по методам В.Д. Тимакова, Д.М. Гольдфарба и В.Я. Ганюшкина.

Результаты исследований.Препарат бактериофага Ф-43 УГСХА обладает всеми необходимыми для проведения

РНФ свойствами: титр бактериофага 2 х 10-8, спектр литической активности 86,7 %, строгая специфичность по отношению к бактерии A. hy�roph��a.

В результате серии исследований была разработана схема постановки РНФ с исполь-


160

зованием биопрепарата бактериофага Ф-43 УГСХА, представленная на рисунке № 1.

Рисунок № 1. Схема реакции нарастания титра фага для индикации Aeromonas hy�roph��a.

Исследуемый материал весом 5 г растирается в фарфоровой ступке и вносится в кол-бы, содержащие по 50 мл питательного бульона (МПБ). Содержимое колб культивируется в течении 5 часов при 28 ºС для предварительного подращивания бактерий. На каждую иссле-дуемую пробу отводится три пробирки: №1- предназначена для опытной пробы, №2- является контролем на свободный фаг, №3- контроль титра индикаторного фага. Исследуемый материал разливается по 9 мл в пробирки №1 и №2, пробирки №3 содержат 9 мл МПБ. В пробирки №1 и №3 добавляется по 1 мл бактериофага Ф43- УГСХА в рабочем разведении (титр бактериофага 104), а пробирки №2-1 мл МПБ. Все пробы инкубируются в термостате при температуре 28 ºС 7 часов. Параллельно ставится контроль стерильности сред. После инкубации из пробирок бе-рутся пробы по 0.25 мл, вносятся в пробирки с 4,5 мл МПБ и обрабатываются фильтрованием через бактериальные фильтры или хлороформом 1:10 в течении 20 минут. Далее содержимое пробирок исследуется методом агаровых слоев по Грации. Чашки инкубируют 12 часов при 28 ºС.

Реакция считается положительной при нарастании титра фага в 5 и более раз.Заключение.Таким образом, разработанная схема РНФ с использованием биопрепарата бактери-

офага Ф-43 УГСХА позволяет проводить индикацию Aeromonas hy�roph��a в различных объ-ектах количестве от 103 м.к./мл в течении 24 часов.

Метод РНФ с использованием биопрепарата бактериофага Ф-43 УГСХА имеет ряд су-щественных преимуществ: время на исследование сокращается до 24 часов, реакция обладает


161

высокой чувствительностью, высокой специфичностью, не требует выделения культуры чи-стой культуры возбудителя, не требует дорогостоящего оборудования и материалов, методика достаточно проста.

Все перечисленное позволяет судить о высокой экономической эффективности метода РНФ в сравнении с существующими методами индикации аэромонад [2].

Библиографический список1. Викторов, Д.А. Разработка методов диагностики, лечения и профилактики псевдо-

моноза рыб с использованием биопрепарата на основе бактериофагов / Д.А. Викторов, О.А. Тен, И.И. Богданов // Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии: Материалы III-й Международной научно-практической конференции моло-III-й Международной научно-практической конференции моло--й Международной научно-практической конференции моло-дых учёных Молодёжь и наука XXI века, Ульяновск, 2010. – Т. 3. – С. 6-8.

2. Ганюшкин В.Я. Бактериофаги и их применение в ветеринарии.- Ульяновск, 1988, с.45.

3. Инструкция о мероприятиях по борьбе с аэромонозом карповых рыб, Минсельхоз-прод России, Департамент ветеринарии, 1998.

4. Методические указания по лабораторной диагностике аэроманоза карпов, Госагро-пром СССР, М.,1986.

APPLICATION OF THE METHOD OF REACTION OF RISE OF TITRE OF PHAGE TO DISPLAY AEROMONADS IN FISH PRODUCTS

Nasibullin I.R., Gorshkov I.G., Кuk��na N.G., V�ktorov D.А., Vas��ev D.А., Nafeev A.A.

Key words: Aeromonas, ba�ter�ophages, b�o�og��a� pro�u�t, �n��at�on, response phage t�ter r�se.

The authors ��ent�fie� ba�ter�ophages of ba�ter�a spe��es Aermonas hy�roph��a, �nvest�gate� the�r bas�� b�o�og��a� propert�es an� �eve�ope� ��agnost�� b�opreparat�on. �n the bas�s of �reate� preparat�on a new metho� of �n��at�on of Aeromonas hy�roph��a w�th the use of the rea�t�on of r�se of t�tre of the phage was suggeste�.

УДК 619:616-07

ПОЛУЧЕНИЕ СУХИХ ЛЕЧЕБНЫХ ПРЕПАРАТОВ БАКТЕРИОФАГОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КОМПОНЕНТОВ КОММЕРЧЕСКИХ КОРМОВ

Перелыгин В.В., кандидат биологических наук, снс, тел. 8 (4967) 36-00-27, [email protected] Светоч Э.А., доктор ветеринарных наук, профессор, ГНЦ ПМБ, тел. 8(4967) 36-00-79, [email protected] Похиленко В.Д., доктор технических наук, Веревкин В.О. кандидат медицинских наук, Воложанцев Н.В. кандидат биологических наук, [email protected]


162

ФБУН «ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора

Ключевые слова: Бактериофаги, обезвоживание, инкапсулирование, компоненты кормов, ле�ебный препарат, энтеробактерии.

Работа посвящена биотехнологии приготовления сухих ле�ебных препаратов бакте-риофагов на основе компонентов коммер�еских кормов для ле�ения и профилактики заболева-ний, вызванных патогенными энтеробактериями. �олу�енные композиции фагов и препараты ле�ебных кормов были исследованы на лабораторных животных и птице при разли�ных усло-виях введения, в том �исле и при предъявлении �ерез корм. Во всех слу�аях полу�ены положи-тельные результаты, однозна�но свидетельствующие о высокой эффективности композиции специфи�еских бактериофагов (SG-3, SG-6, �11 и F62), а также (V7811, V7817), инкорпориро-SG-3, SG-6, �11 и F62), а также (V7811, V7817), инкорпориро--3, SG-6, �11 и F62), а также (V7811, V7817), инкорпориро-SG-6, �11 и F62), а также (V7811, V7817), инкорпориро--6, �11 и F62), а также (V7811, V7817), инкорпориро-�11 и F62), а также (V7811, V7817), инкорпориро-11 и F62), а также (V7811, V7817), инкорпориро-F62), а также (V7811, V7817), инкорпориро-62), а также (V7811, V7817), инкорпориро-V7811, V7817), инкорпориро-7811, V7817), инкорпориро-V7817), инкорпориро-7817), инкорпориро-ванных в состав сухих кормов, для ле�ения и профилактики сальмонеллезной и эшерихиозной инфекций у животных и птицы

Введение. Одним из основных источников кишечных заболеваний человека являются продукты питания, в том числе продукты птицеводства (мясо и яйцо), инфицированные пато-генными микроорганизмами, особенно представителями родов Sa�mone��a и Es�her��h�a.

Использование антибиотиков для борьбы с кишечными инфекциями в настоящее вре-мя не рационально по причине высокой вероятности спонтанного появления антибиотико-резистентных патогенов бактериальной природы. В качестве альтернативы антибиотикам в последние годы активно рассматриваются бактериофаги - вирусы, специфически лизирующие бактериальные клетки патогенных микроорганизмов [1, 2].

Бактериофаги могли бы способствовать получению экологически чистых продуктов птицеводства, если бы существовали малозатратные и масштабируемые технологии приготов-ления препаратов бактериофагов.

Для достижения высокого уровня сохраняемости биологических свойств бактериофа-гов на технологических стадиях получения препарата и в процессе его хранения и применения требуется использовать недорогие, но эффективные защитные соединения.

Бактериофаги, должны быть также защищены от действия клеточных и гуморальных факторов иммунитета, литических секретов и ферментов внутренней (полостной) среды орга-низма. Высока вероятность, что защита бактериофагов может быть достигнута при инкапсули-ровании или иммобилизации фаговых частиц на различных носителях, включая природные и синтетические полимеры органической природы. Например, для обработки поверхности кож-ных покровов успешно использовали бактериофаги, защищенные органическими полимера-ми, такими как карбоксиметилцеллюлоза, гидроксиэтилцеллюлоза, хитозан [1,2]. Цель иссле-дования - разработать доступную технологию приготовления сухих препаратов бактериофагов с использованием природных компонентов, традиционно входящих в состав кормов.

Материалы и методы исследований. Из основ науки ангидробиоинженерии [3] сле-дует, что для обратимой консервации микроорганизмов, включая бактериофаги и вирусы, из них следует удалить приемлемым способом избыток влаги.

Для обезвоживания бактериофагов был использован контактно-сорбционный метод высушивания [4,5], который по своей сути близок к методу «L-высушивания». В качестве по-L-высушивания». В качестве по--высушивания». В качестве по-глотителей влаги применены высушенные растительная мука или соевый протеин, мелкие или крупные фракции стандартного корма для животных и птицы. Такого рода сухие вещества после смешивания в определенном соотношении с фаговой суспензией связывают основную массу воды. Сорбированная вода затем удаляется другим способом, обеспечивая кондиции готового продукта по остаточной влажности (8-10%). Сухие препараты, содержащие жизне-


163

способные бактериофаги, используются как добавки к корму, либо непосредственно в виде корма, что определяется дозой бактериофагов в соответствии с установками по профилактике и лечению.

Другим способом обезвоживания является сублимационное высушивание на лабо-раторных установках в соответствии с выбранными режимами. Подобранное сочетание за-щитных соединений позволяет получить после высушивания до 50% жизнеспособных бак-териофаговых частиц. Лиофилизированные препараты хорошо диспергируются в воде, они пригодны для инъекционного введения, для выпаивания, а также могут использоваться для аэрозольной обработки животных и птицы.

Методика сублимационного высушивания была использована для получения препа-ратов с высокой концентрацией бактериофагов. Способ лиофилизации, однако, не всегда при-годен для сушки бактериофагов из-за отсутствия достоверных данных об оптимальном уровне остаточной влажности в сухих препаратах различных бактериофагов.

В качестве защитных соединений применены протеины (соевый белок), растительная мука, органические полимеры (декстраны, полиглюкин, крахмал, поливинилпирролидон), а также известные природные соединения, которые часто используются в виде кормовых доба-вок. Эти соединения обволакивают частицы бактериофагов и защищают их от действия внеш-них неблагоприятных факторов, а также при действии кислот в желудочно-кишечном тракте животного или птицы.

Бактериофаги, лизирующие бактерии Sa�mone��a Enter�t��s, Sa�mone��a Typh�mur�um, Sa�mone��a He��e�berg, Sa�mone��a Ga��narum-pu��orum, Sa�mone��a �ho�erae su�s, Es�her��h�a coli, были выделены из фекальных масс птицы и сточных вод убойных цехов птицефабрик. В качестве лечебного фагового препарата использовали смесь очищенных специфических анти-сальмонеллезных бактериофагов (SG-3, SG-6, F62, С11 и BМ), которая была включена в состав гранул (частиц) приготовленного корма.

Бактериофаги размножали на культуре чувствительных бактерий S.Еnter�t��s в жид-кой питательной среде. Концентрацию бактериофагов определяли при титровании препаратов на культуре тех же бактерий и выражали в бляшко-образующих единицах (БОЕ). Титры исход-ных фаговых препаратов находились в пределах 1´1012 - 1´1014 БОЕ.

Результаты и их обсуждение. В процессе разработки технологии получения сухих препаратов проведено изучение выживаемости фагов в гранулах комбикорма с использовани-ем бактериофага Г-1, специфичного в отношении S.Enter�t��s, взятого в концентрации 1´1011 БОЕ/мл.

Препараты бактериофагов при использовании компонентов кормов, получали мето-дом экструзии с последующим дроблением до достижения оптимального размера частиц (2-3 мм). Инструментальный контроль уровня остаточной влажности осуществляли как в процессе обезвоживания, так и при закладке бактериофаговых препаратов на хранение для последую-щего использования.

Обезвоживание фаговой суспензии проводили в смесителе контактно-сорбционным способом с использованием комбинаций различных носителей.

Проведенные исследования показали, что контактно-сорбционное высушивание су-спензии бактериофагов на комбинациях носителей в целом дает неплохие результаты. Выжи-ваемость бактериофагов в зависимости от варианта композиции составляла от 4,3 до 17, 3%, что сравнимо с результатами, получаемыми в таких условиях для клеток бактерий [6]. Низкая выживаемость фага при использовании сорбента - Ti�2 объясняется пересушиванием матери-ала (о.в. 0,79%), что необходимо учитывать при создании сухих бактериофаговых препаратов.

Уровень инактивации бактериофагов в процессе хранения был оценен после исследо-


164

вания герметично укупоренных кормовых препаратов, находившихся при температуре от 2 до 8 °С в течение 60 дней. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1. - Сохранение жизнеспособности бактериофагов при хранении

№ ПрепаратВес про-

бы, мг

Титр фага в препарате, БОЕ Выживае-мость

%до хранения через 60 дней

1 Фаг + соевая мука 50 2,9´108 4,4´108 100

2 Фаг + ПВП + соевая мука 50 2,1´108 5,0´108 100

3Фаг + смесь

корм: соевая мука (1:1)*

108 2,0´108 2,7´108 100

4Фаг + смесь

корм: соевая мука (1:1)**

104 1,7´108 3,9´108 100

* - выдавлено �ерез “фильеры”, гранулы высушены в токе горя�его воздуха.** - выдавлено �ерез “фильеры”, гранулы высушены на окиси алюминия.

Из приведенных в таблице 1 результатов следует, что бактериофаги, инкорпорирован-ные в гранулы соевого комбикорма, способны сохранять жизнеспособность, и практически не инактивируются в течение 60 дней при температуре от 2 до 8 °С.

Комплексные препараты бактериофагов, подтвердившие стабильность при длитель-ном хранении, были использованы для лечения экспериментальных сальмонеллезной инфек-ции и колисептицемии у белых мышей и бройлерных цыплят.

Для моделирования сальмонеллезной инфекции у цыплят был выбран штамм S.Enter�t��s 92, вирулентные свойства которого изучены ранее на белых мышах. При заража-ющей дозе 1,2´107 ж.м.к. оказались инфицированными сальмонеллами 66,6 % цыплят. Исходя из этих данных, для заражения цыплят выбрана доза около 1´108 ж.м.к.

В опытах на белых мышах установлено, что лечение экспериментального сальмонел-леза путем выпаивания им суспензии бактериофагов является не эффективным, в то время как скармливание фагов с гранулами корма позволяет вылечить 40-50% зараженных животных.

В опытах на бройлерных цыплятах, взятых в количестве 60 особей, все цыплята по-лучили на второй день жизни per os около 6,9х107 клеток S.Enter�t��s 92. Контрольная группа лечения не получала, а опытная имела свободный доступ к кормовым гранулам, содержащим 2 х108 БОЕ/г фаговых частиц, в течение последующих 25 дней. По окончании эксперимента в нелеченной (контрольной группе) культура сальмонелл обнаружена у 30 особей в селезенке и у 19 - в печени, в то время как в группе, потреблявшей бактериофаг в составе корма, были по-ражены только 2 особи (селезенка) и одна (печень).

Полученные результаты свидетельствуют об эффективном действии фагового препа-рата, предъявленного в составе лечебного корма, для профилактики сальмонеллеза у цыплят.

Заключение. В результате проведенных исследований разработаны лечебные формы бактериофаговых препаратов, пригодные для профилактики и лечения сальмонеллеза птиц на основе компонентов коммерческих кормов:

Сухой лиофилизированный концентрат бактериофагов (1010-1011 БОЕ/г) во флаконах и ампулах, пригодный для приготовления жидких и инкапсулированных сухих препаратов ле-чебно-профилактического направления.

Сухая гранулированная лечебная добавка, содержащая бактериофаги (108-109 БОЕ/г)


165

для использования с комбикормом. Готовый комбикорм, содержаший иммобилизованные бак-териофаги в дозировке (106-107 БОЕ/г), достаточен для профилактического и лечебного дей-ствия. Срок хранения препаратов лечебных кормов не менее 6 месяцев, препаратов, лиофили-зированных в герметично укупоренных флаконах, - не менее одного года при 2-10 °С.

Библиографический список1. Stanford K, McAllister TA, Niu YD et al. �ral delivery systems for encapsulated bacterio-

phages targeted at Escherichia coli �157:H7 in feedlot cattle // J Food Prot. 2010 Jul;73(7):1304-12.2. Ghanbari Hossein A., Averback Paul . Composition containing bacteriophage and meth-

ods of using bacteriphages to treat infections// US Patent 6,121,036 September 19, 20003. Crowe JH, Hoekstra FA, Crowe LM.. Anhydrobiosis //Annu Rev Physiol. 1992; 54:579-

99. 4. Светоч Э.А., Перелыгин В.В., А.Н.Панин и др. Биопрепарат на основе фагов для

профилактики и лечения сальмонеллеза животных //Патент РФ N 2232808, 2004 5. Светоч Э.А., Перелыгин В.В., А.Н.Панин и др. Биопрепарат на основе фагов для

профилактики и лечения колибактериоза (эшерихиоза) животных //Патент РФ N 2244747, 2004 . 6. Перелыгин В.В. и др. Способ контактной сушки микроорганизмов. Описание изо-

бретения // патент N2067114, 1996.

OBTAINING DRY THERAPEUTIC PREPARATIONS OF BACTERIOPHAGES WITH USING THE COMPONENTS

OF COMMERCIAL FODDERS

Perelygin V.V., Svetoch E.A., Pokhilenko V.D., Volozhantsev N.V.

Key words: ba�ter�ophages, �ehy�rat�on, en�apsu�at�on, the �omponent of fo��ers, thera-peut�� preparat�on, enteroba�ter�um.

Work �s �e��ate� to the �reat�on of the b�ote�hno�ogy of the preparat�on of the �ry thera-peut�� preparat�ons of ba�ter�ophages on the bas�s of the �omponents of �ommer��a� fo��ers for treatment an� prevent�ve ma�ntenan�e of the ��seases of those �ause� by pathogen�� enteroba�ter�a. The obta�ne� �ompos�t�ons of phages an� the preparat�ons of therapeut�� fo��ers were on the�r bas�s �nvest�gate� on �aboratory an�ma�s an� b�r� w�th the var�e� �on��t�ons of �ntro�u�t�on, �n��u��ng w�th the presentat�on through the fo��er. In a�� ases was obta�ne� the pos�t�ve resu�ts, wh��h test�fy about the h�gh effi��en�y of the �ompos�t�on of spe��fi� ba�ter�ophages (SG-3, SG-6, �11 an� F62), an� a�so (V7811, V7817) the �n�orporate� �nto the �ompos�t�on �ry fo��ers for the treatment an� the preven-t�ve treatment of sa�mone��os�s an� esсher�h�os�s �nfe�t�ons �n an�ma�s an� b�r�


166

УДК 619:616

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ САЛЬМОНЕЛЛЕЗНЫХ ФАГОВ ПРИ ПЕРЕРАБОТКЕ ПТИЦЫ

Подзорова Ю.А., ветеринарно-санитарный врачСерегин И.Г., кандидат ветеринарных наук, профессор Логинов И.А., кандидат биологических наук, доцент Московский государственный университет пищевых производств

Ключевые слова: птица, переработка, вода, бактериофаги, сальмонеллы, тушки, по-луфабрикаты, безопасность, токсикоинфекции.

Работа посвящена изу�ению возможности применения сальмонеллезных фагов при переработке птицы и производстве пти�ьих полуфабрикатов. В экспериментальных условиях установлено, �то при использовании бактериофагов в питьевой воде для бройлеров перед убоем и добавлением в воду охлаждающих тушки �анов, зна�ительно снижается содержание гомологи�ных микроорганизмов в тушках и полуфабрикатах из птицы.

Введение. Основной задачей ветеринарной службы предприятий мясной промышлен-. Основной задачей ветеринарной службы предприятий мясной промышлен-ности является охрана населения от болезней, общих для животных и человека, в том числе от токсикоинфекций различной этиологии. В последние годы токсикоинфекции стали представлять определенную проблему для человека, так как до сих пор они широко распространены во всех странах мира и достаточно часто у детей имеют летальный исход. Чаще всего регистрируют массовые вспышки токсикоинфекций сальмонеллезной этиологии при употреблении птичьего мяса и яичных продуктов.

Сальмонеллезом заражаются все виды домашней птицы. С развитием промышленного птицеводства изменились условия содержания птицы и концентрация поголовья в помещеньях, что способствует перезаражению поголовья и увеличению сальмонеллоносительства у птицы.

При убое птицы, в партии которой имелись переболевшие или носители, происходит контаминация сальмонеллами других тушек здорового поголовья. Такие тушки или полуфабрикаты представляют биологическую опасность для человека и могут быть причиной массовых вспышек токсикоинфекций сальмонеллезной этиологии. В мясе птицы чаще всего обнаруживают S.pu��orum, реже - S.enter�r��s, S. typh�mur�um и др.[1, 2].Инфицирование птицы сальмонеллами обычно происходит при напольном содержании на птицефермах и при кон-вейерной переработке с использованием технических средств для снятия перьев и чанов с охлажденной водой. Если в начале смены контаминация тушек сальмонеллами до снятия пера выявляется у 1,3-3,6 % убитой птицы, то после тепловой обработке и снятия пера - у 2,8-12,2%, а после охлаждения в чане с водой – 22,4-36,6 % тушек. В конце смены контаминация тушек сальмонеллами возрастает в 1,5-2 раза и более [2, 3].

В производственных условиях обеззараживание воды в чане проводят с помощью раствора хлорной извести или надуксусной кислоты. Но эти химические вещества небезопасны для человека, поэтому использование их во многих странах, в том числе и в России, ограничено. По нашему мнению, перспективным для снижения контаминации птицы сальмонеллами может быть применение фагов к наиболее распространенным и опасным для человека сальмонеллам при подготовке птицы к убою и при охлаждении тушек в чане с водой.

Бактериофагами называют вирусы бактерий, которые имеют резко выраженные паразитические свойства, обеспечивающие возможность их размножения и сохранность в клетках гомологичных видов микроорганизмов.


167

Фаги специфичны и активны только для гомологичных микроорганизмов, они безвредны для животных, птицы и человека. Бактериофаги успешно применяются в медицине и ветеринарии, в пищевой и косметической промышленности. Их обычно обнаруживают в сточных водах. Фаги обладают активностью при температуре 10-42°С и способны лизировать гомологичные бактериальные клетки в разведениях до 1:10-8–1:10-12 [4, 5].

Мы изучили эффективность применения сальмонеллезных бактериофагов при подготовке бройлеров к убою и переработке на конвейерных линиях с использованием охлаждения тушек в чане с водой.

Материалы и методы. В работе использовали фаги, гомологичные S. pu��orum, S.enter�t��s, S.typh�mur�um, S.�ub��n. Активность сальмонеллезных фагов определяли методом Аппельмана – последовательным разведением фагов в МПБ и культивированием на гомологичных клетках сальмонелл.

Микробиологические исследования тушек кур и полуфабрикатов из них проводили согласно ГОСТ 21237-75 «Мясо. Метод бактериологического анализа», ГОСТ 7702-23-93 «Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты птицы. Метод выявления сальмонелл» и методических рекомендаций «Лабораторная диагностика сальмонеллезов человека и животных» (1990).

На первом этапе бройлерам через рот вводили 48 – часовую культуру сальмонелл, а сальмонеллезные фаги добавляли в питьевую воду в разведении 1:10-4- 1:10-5 в течение двух суток перед убоем. Контролем служили цыплята-бройлеры, получавшие питьевую воду без бактериофагов. После убоя цыплят проводили микробиологические исследования содержимого кишечника и определили наличие сальмонелл, гомологичных и гетерологичных применяемым фагам.

На втором этапе были отобраны тушки бройлеров, свободных от сальмонелл, поверхность которых экспериментально контаминировали культурами, гомологичными фагам. Затем подопытные тушки опускали в емкость с водой, содержащей сальмонеллезные фаги в концентрации 1:10-4-1:10-5. Контролем служили тушки бройлеров, которые после контаминирования сальмонеллами опускали в воду без добавления фагов.

Микробиологическим исследованиям подвергали все подопытные и контрольные тушки бройлеров, а также полуфабрикаты из них до обработки фагами и после нее ежедневно в течение 5 суток.

Результаты исследования. Полученные результаты исследования показали, что при выпаивании сальмонеллезных фагов через 24-36 часов достигается обеззараживание содержимого кишечника от гомологичных клеток сальмонелл. Только в отдельных пробах содержимого толстого отдела кишечника были обнаружены S. pu��orum. В содержимом кишечника контрольных бройлеров выявляли S. pu��orum (28,7% проб), S.enter�t��s (17,6%), S. typh�mur�um (7,2%), S. �ub��n (3,7%).

При исследовании тушек бройлеров, контаминированных сальмонеллами и хранившихся при комнатной температуре (15-18˚С), после обработки водой с фагами число сальмонеллезных клеток на поверхности кожи через 12 часов сократилась на 32,9 - 41,2% по сравнению с контролем. Через 24 часа хранения количество гомологичных сальмонелл со-кратилось на 44,7 - 46,9%. На тушках, хранившихся при 18-20°С, снижение клеток сальмо-°С, снижение клеток сальмо-, снижение клеток сальмо-льмо-нелл через 12 часов достигло 85,8% по сравнению с контролем, через 24 часа – до 89,6%, через 48 часов – до 92,2%. При дальнейшем повышении температуры хранения количество гомологичных сальмонеллезных клеток на поверхности тушек, обработанных водой с фагами, снижалось до 98,2 - 98,9%. Однако, при хранении тушек бройлеров после обработки фагами при температуре 4˚С число сальмонеллезных клеток сокращалось в течение 1-5 суток только на 2,8 - 4,4% по сравнению с контролем. Близкие к этому получены результаты исследования


168

полуфабрикатов из подопытных и контрольных тушек бройлеров (окорочка, бедра, грудная часть, шея, крылья и др.).

Заключение. На основании полученных данных можно заключить, что сальмонеллезные фаги при выпаивании в течение двух суток в титре 1:10-4-1:10-5 через 24-36 часов ликвидирую или значительно снижают сальмонеллоносительство гомологичных культур у цыплят-бройлеров. При убое таких бройлеров предупреждается или снижается контаминация сальмонеллами других тушек птицы данной партии.

Обработка тушек водой с сальмонеллезными фагами при хранении в остывшем состоянии снижает контаминацию поверхности гомологичными клетками сальмонелл на 32,9 - 98,9% по сравнению с контролем.

В зависимости от активности, сальмонеллезные фаги добавляются в питьевую воду для птицы или в чан с водой для охлаждения тушек из расчета разведения 1:10-4-1:10-5 или 1 мл фагов на 10-100 литров воды. Сальмонеллезные фаги не опасны для птицы и человека, поэтому ограничения в применении не имеют.

Библиографический список1. Бой Кикимото Б.Б., Обеззараживание тушек птицы с помощью бактериофагов,

Материалы научной конференции по вет-санэкспертизе, посвященные 100-летию Тетерника Д.М., М. 1999, 75с.

2. Бой Кикимото Б.Б., Профилактика токсикоинфекции сальмонеллезной этиологии тушек птицы с использование бактериофагов, автореферат кандидатской диссертации, М. 2001, 20с.

3. Серегин И.Г., Никитченко В.Е., Никитченко Д.В., Ветсанэкспертиза продуктов убоя животных и птицы., М.:РУДН, 2010.

4. Флерова А.Д., Серегин И.Г., Линев С.В., Новое в применении бактериофагов, Вест-ник РУДН – 2008, 4-с54-57.

5. Флерова А.Д., Изучение качества и безопасности колбасных изделий при использо-вании сальмонеллезных бактериофагов, автореферат кандидатской диссертации, М. 2011, 24с.

УДК 578.81:[613.292+579.674]:608.3

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БАКТЕРИОФАГОВ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ИНФИЦИРОВАНИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫМИ ПАТОГЕНАМИ

И ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОЙ КОНТАМИНАЦИИ ПРОДУКТОВ ПИТАНИЯ (ПО ДАННЫМ ПАТЕНТОВ

НА ИЗОБРЕТЕНИЯ)

Рубальский О.В., доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО АГМА Минздрава России, (8512) 52-35-99, [email protected]Алешкин А.В., доктор биологических наук, ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора, (495) 452-07-88, [email protected]Афанасьев С.С., доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ, ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора, (495) 452-18-16, [email protected]Алешкин В.А., доктор биологических наук, профессор, ФБУН «МНИИЭМ им.


169

Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора, (495) 452-18-16, [email protected]Франк Н.В., ФГБОУ ВПО АГУ, +7-917-198-85-35, [email protected]Афанасьев М.С., доктор медицинских наук, профессор кафедры, ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» Минздрава России, +7-916-685-52-38, [email protected]Караулов А.В., доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН, ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» Минздрава России, +7-903-515-71-36, [email protected]Рубальский Е.О., ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора, (495) 452-18-16, [email protected]Рубальский М.О., ООО НПП «ВИТАФАГ», (8512) 47-87-47, [email protected]

Ключевые слова: бактериофаги, пищевая промышленность, продукты питания, биологи�ески активные добавки к пище, патент, изобретение.

В настоящее время в России и за рубежом проводится активный поиск новых бакте-риофагов и разработка композиций на их основе с целью использования в пищевой промыш-ленности. Формируется новая ниша на рынках технологи�еских вспомогательных средств и биологи�ески активных добавок к пище на основе бактериофагов, �то приводит к необходи-мости правовой охраны создаваемых объектов промышленной собственности.

Одними из первых предложили использовать бактериофаги в пищевой промышлен-ности российские ученые. В 1978 году А.М. Колодкин и Ю.А. Колодкин предложили при вы-работке сыров, творога одновременно с закваской вносить в молочную смесь набор штаммов стафилококкового бактериофага для подавления развития патогенных форм стафилококка [1].

В связи с нарастающей неэффективностью химических консервантов уже более 10 лет за рубежом начались разработки и выдаются патенты на изобретения в области использования бактериофагов для обработки продуктов питания [2, 3, 4].

Для обработки пищевых продуктов предлагались бактериофаги (в том числе полива-лентные бактериофаги) против сальмонелл, бактериофаг против Listeria monocytogenes, коли-фаг [2, 5, 6, 7, 8].

Наиболее детально композиция на основе бактериофагов, предназначенная для пре-дотвращения бактериальной контаминации продуктов питания и упаковочных материалов, описана в изобретении, правообладателем которого является Ecolab Inc. (США) [9].

В состав композиции кроме бактериофагов в количестве 105-1011 БОЕ/мл входят бу-ферный агент, обеспечивающий pH от 4 до 9, стимулятор, который может включать поверх-pH от 4 до 9, стимулятор, который может включать поверх- от 4 до 9, стимулятор, который может включать поверх-ностно-активное вещество, кальций, магний, жирную кислоту, терпен, терпеноид, глицерин и пропиленгликоль, а также дополнительные загущающие вещества и пенообразователи. Дан-ный состав композиции обеспечивает сохранение активности бактериофагов в течение не ме-нее 14 дней.

Согласно проанализированным патентам обработка пищевых продуктов фагосодер-жащими композициями может производится различными методами: внесением во фруктовые и овощные соки, опрыскиванием, обработкой туманом, погружением, замачиванием, нанесе-нием пленки [2, 9].

Другим направлением использования бактериофагов в пищевой промышленности яв-ляется разработка фагосодержащих биологически активных добавок к пище.

В России в 1999 году был выдан патент ЗАО «Биофит» на биологически активную добавку к пище в виде таблетки, содержащей криопорошки овощного и/или ягодного, и/или фруктового сырья, и/или бахчевых, и/или бобовых, и/или овощной зелени, и/или зерновых,


170

и/или их зародышей, и/или водорослей, и/или скорлупы, и/или растительного лекарственно-го сырья, и/или панцирей ракообразных, и/или рептилий, и/или раковин моллюсков. В каче-стве дополнительных ингредиентов данная запатентованная биологически активная добавка к пище содержит фаги, например, антистафилококковый бактериофаг[10].

В 2009 году в России были запатентованы варианты биологически активных доба-вок, содержащих видоспецифические вирулентные бактериофаги и бактериофаги с индуци-рованной вирулентностью с литической активностью 10-4 по Аппельману в отношении тест-штаммов и выделенных из организма человека изолятов бактерий в фильтрате фаголизата или фильтрате концентрата фаголизата, или в сухой биомассе фильтрата фаголизата нелизогенных бактерий. В качестве бактериофагов в состав данных биллогически активных препаратов мо-гут быть включены стафилококковый бактериофаг, стрептококковый бактериофаг, коли бак-териофаг, протейный бактериофаг, синегнойный бактериофаг, сальмонеллезный бактериофаг, шигеллезный бактериофаг, энтерококковый бактериофаг и клебсиеллезный бактериофаг [11, 12].

Перечень целевых добавок согласно этим запатентованным изобретениям обеспечи-вает получение биологически активных добавок к пище в виде суспензии, порошка, таблеток и капсул.

Таким образом в России и за рубежом активно проводятся как поиск новых бакте-риофагов, пригодных для использования в пищевой промышленности, так и разработка эф-фективных фагосодержащих композиций, что свидетельствует о развивающейся новой нише пищевых добавок и биологически активных добавок к пище.

Библиографический список1. Способ подавления развития патогенных форм стафилококка в сыре [Текст] : ав-

торское свидетельство 910144 СССР : МПК3 А 23 С 19/00 / Колодкин А. М., Колодкин Ю. А. ; заявитель Иркутский государственный университет им. А.А. Жданова. – № 2656626/28 ; заявл. 10.08.1978 ; опубл. 07.03.1982, Бюл. 9

2. Bacteriophage composition useful in treating food products to prevent bacterial contami-nation [Text] : patent US6461608 : IPC A 23 L 3/3463, A 23 L 3/3571, A 61 K 35/74, C 12 N 15/09, C 12 N 7/02, A 01 N 63/00 / Averback P., Gemmell J. – US20000718093 20001122 ; filed 22.11.2000 ; pub. date 08.10.2002

3. Method for storing food and agricultural products [Text] : patent GEU2003972 : IPC A 23 L 3/00 / Kalandarishvili L. – GE2002AU01099U 20021114 ; filed 14.11.2002 ; pub. date 10.04.2003

4. Bacteriophage composition useful in treating food products to prevent bacterial contami-nation [Text] : patent NZ549568 : IPC A 23 L 3/3463, A 61 K 35/74, C 12 N 7/00 / Averback P., Gemmell J. ; assignee Nymox Pharmaceutical Corp. – NZ20010549568 20011115 ; filed 22.11.2000 ; pub. date 31.01.2008

5. Separated coliphage and application as biological fungicide in foods and anti-infection contamination thereof [Text] : patent CN101220349 : IPC A 01 N 63/00, A 23 L 3/3463, A 61 K 35/76, A 61 P 31/04, C 12 N 7/00 / Zhiying Zhang, Lei Liu ; assignee Zhuhai Jinping Technologies Co., Ltd. – CN20071031415 20071116 ; filed 16.11.2007 ; pub. date 16.07.2008

6. Separated Listeria monocytogenes bacterial virus and uses thereof [Text] : patent CN101220350 : IPC A 01 N 63/00, A 23 L 3/3463, A 61 K 35/76, A 61 P 31/04, C 12 N 7/00 / Zhiying Zhang, Lei Liu ; assignee Zhuhai Jinping Technologies Co., Ltd. – CN20071031416 20071116 ; filed 16.11.2007 ; pub. date 16.07.2008

7. Salmonella bacteriophage and application thereof [Text] : patent CN102041247 : IPC A 23 L 3/3571, C 12 N 7/00, C 12 R 1/92 / Hongduo Bao [et al.] ; assignee Jiangsu Academy of Agri-


171

cultural Sciences. – CN20101508259 20101015 ; filed 15.10.2010 ; pub. date 07.11.20128. Bacteriophage and antibacterial composition comprising the same [Text] : patent

US2013022579 : IPC A 61 K 35/76, A 61 P 31/04, C12N7/00 / In Hye Kang [et al.] ; assignee CJ Cheiljedang Corporation. – US201213621730 20120917 ; filed 24.12.2008 ; pub. date 24.01.2013

9. Bacteriophage treatment for reducing and preventing bacterial contamination [Text] : pat-ent US2009246336 : IPC A 23 L 3/3571, A 61 K 35/76, B 65 B 55/00, C 02 F 3/34 / Burnett S. L. [et al.] ; assignee Ecolab Inc. – US20080054806 20080325 ; filed 25.03.2008 ; pub. date 01.10.2009

10. Биологически активная пищевая добавка в дозированной форме [Текст] : пат. 2129393 Рос. Федерация : МПК A 23 L 1/30, A 61 K 35/78 / Груздева А. Е. [и др.] ; заявитель и патентообладатель ЗАО «Биофит». – № 98107741/13 ; заявл. 23.04.1998 ; опубл. 27.04.1999

11. Композиция на основе бактериофага (варианты) [Текст] : пат. 2366437 Рос. Федера-ция : МПК A 61 K 35/74, A 61 P 31/04 / Алешкин В. А. [и др.] ; заявитель и патентообладатель ООО «Амфита». – № 2007139680/15 ; заявл. 29.10.2007 ; опубл. 10.09.2009, Бюл. № 25

12. Иммунобиологический бактерицидный препарат (варианты) [Текст] : пат. 2366708 Рос. Федерация : МПК C 12 N 7/00, A 61 K 35/76, A 61 P 31/04 / Алешкин В. А. [и др.] ; за-явитель и патентообладатель ООО «Амфита». – № 2007139681/13 ; заявл. 29.10.2007 ; опубл. 10.09.2009, Бюл. № 25

BACTERIOPHAGES APPLICATION FOR BACTERIAL PATHOGENS INFECTION PROPHYLAXIS AND BACTERIAL CONTAMINATION

PREVENTION FOR FOOD (ACCORDING TO PATENTS FOR INVENTION)

Rubalsky O.V., Aleshkin A.V., Afanas’ev S.S., Aleshkin V.A., Frank N.V., Afanas’ev M.S., Karaulov A.V., Rubalsky E.O., Rubalsky M.O.

Key words: ba�ter�ophages, foo� �n�ustry, foo�, ��etary supp�ement, patent, �nvent�on.

Nowa�ays �n Russ�a an� �n other �ountr�es �s �arry�ng out a�t�ve�y seek�ng of new ba�ter�ophages an� �eve�opment thereof �ompos�t�ons for use �n the foo� �n�ustry. A new n��he �s forme� �n the market of pro�ess�ng a��s an� ��etary supp�ements, base� on ba�ter�ophages, wh��h resu�ts to ne�ess�ty for �reate� �n�ustr�a� property prote�t�on.

СРЕДСТВА ИНДИВИДУАЛЬНОЙ ЗАЩИТЫ НОВОГО ПОКОЛЕНИЯ ДЛЯ РАБОТЫ С ПАТОГЕННЫМИ БИОЛОГИЧЕСКИМИ АГЕНТАМИ

(ПБА) I-IV ГРУППЫ ПАТОГЕННОСТИ ОДНОРАЗОВОГО И МНОГОРАЗОВОГО ПРИМЕНЕНИЯ

Тараканов А.А., директор ООО «Лаборатория технологической одежды»Тел: +7 (3513) 545402, 527272, e-mail: [email protected]

Ключевые слова: противо�умная одежда, комплектность, применяемые материа-лы.

Работа посвящена вопросу разработки средств индивидуальной защиты нового по-


172

коления для работы с �БА I-IV группы патогенности (противо�умной одежды). Дано описа-I-IV группы патогенности (противо�умной одежды). Дано описа--IV группы патогенности (противо�умной одежды). Дано описа-IV группы патогенности (противо�умной одежды). Дано описа- группы патогенности (противо�умной одежды). Дано описа-ние используемого материала для изготовления противо�умной одежды и его преимущества, даны рекомендации по обработке изделий, представлен список изделий, одобренных после проведенных испытаний рядом ведущих институтов России, определена область применения противо�умной одежды.

ООО «Лаборатория Технологической Одежды» (LAMSYSTEMS) разрабатывает и го-LAMSYSTEMS) разрабатывает и го-) разрабатывает и го-товит к серийному выпуску средства индивидуальной защиты нового поколения для работы с патогенными биологическими агентами (ПБА) I-IV группы патогенности одноразового и многоразового применения.

При разработке средств индивидуальной защиты ООО «Лаборатория Технологической Одежды» основывалось на действующих санитарных правилах СП 1.3.1285-03 и рекоменда-циях сотрудников учреждений Роспотребнадзора (Управления, Центры гигиены и эпидемио-логии, противочумные институты, противочумные станции), федеральных государственных учреждений науки, научно-исследовательских институтов РАМН, профильных научно-иссле-довательских институтов России.

В процессе разработки специалисты сошлись во мнении, что в зависимости от харак-тера выполняемой работы и степени ее опасности для персонала, необходимо утвердить не-сколько типов защитной одежды:

I тип – обеспечивает защиту кожных покровов рук, поверхности тела, лица, органов дыхания, органов зрения;

II тип – обеспечивает защиту кожных покровов рук, поверхности тела, лица, органов дыхания;

III тип – обеспечивает защиту кожных покровов рук, поверхности тела;IV тип – обеспечивает защиту поверхности тела.Изделия, разрабатываемые ООО «Лаборатория технологической одежды», предназна-

чены для защиты кожных покровов рук и поверхности тела.Основной упор при разработке изделий был посвящен подбору качественного мате-

риала, способного защитить поверхность тела человека от ПБА I-IV группы патогенности в случае биологической аварии.

Для изготовления СИЗ по типу противочумных костюмов наряду с использованием хлопчатобумажных тканей для изготовления многоразовой одежды было предложено исполь-


173

зовать ткани из непрерывных синтетических микрофиломентных нитей с заданными барьер-ными свойствами и отсутствием пылеворсоотделения, а для одноразовой одежды нетканые материалы (на основе термоскрепленного полипропилена) с мембранным покрытием.

От материала, используемого для изготовления противочумной одежды, зависит каче-ство защиты оператора, работающего с ПБА I-IV группы патогенности. В текущих условиях пыление, легкое проникновение жидкостей и микроорганизмов ограничивает использование тканей из хлопка в современных лабораториях в качестве одежды и укрывных материалов.

По сравнению с одноразовой одеждой, костюмы из синтетических микрофиломент-ных нитей имеют преимущества по своим защитным свойствам и высокому уровню комфорта.

Современные СИЗ для работы с ПБА I-IV группы патогенности должны обладать сле-дующими преимуществами:

· устойчивость к проникновению микробов, бактерий, вирусов, · устойчивость к проникновению жидкостей (таких как вода, кровь, йод и др.);· стойкость ко всем видам механического воздействия;· защита от ворса, пыли, пуха и других мелких частиц;· износоустойчивость к стиркам и автоклавированию.Для того чтобы считать изделия пригодными для использования в качестве СИЗ для

работы с ПБА I-IV группы патогенности было принято решение об утверждении методики ис-I-IV группы патогенности было принято решение об утверждении методики ис--IV группы патогенности было принято решение об утверждении методики ис-IV группы патогенности было принято решение об утверждении методики ис- группы патогенности было принято решение об утверждении методики ис-пытаний для проверки свойств изделий. Методики представлены в таблице 1.

Таблица 1№ п/п Критерий оценки Методика оценки

1 Микробная проницаемость в сухом состоянии В соответствии со стандартом ЕН ИСО 22612

2 Микробная чистота В соответствии со стандартом ЕН ИСО 11737-1

3 Чистота в части инородных частиц

В соответствии со стандартом ИСО 9073-10.Международный стандарт ИСО 9073-10 предусма-тривает проведение испытаний в ламинарном шкафу. Важно подтвердить, что ламинарный поток сохраня-ется в том случае, когда оборудование, необходимое для проведения испытаний, располагается в шкафу

4 Пылеворсоотделение

В соответствии со стандартом ИСО 9073-10. При-мечание - Международный стандарт ИСО 9073-10 предусматривает проведение испытаний в ламинар-ном шкафу

5 Прочность на разрыв В соответствии со стандартом ЕН ИСО 13938-1

6 Прочность на растяжениеВ соответствии со стандартом ЕН 29073-3 (в сухом состоянии в продольном и поперечном направлени-ях)

В результате испытаний материала, выбранного специалистами ООО «Лаборатория Технологической Одежды» для производства многоразовой одежды для работы с ПБА I-IV группы патогенности, тесты показали, что средняя бактериальная проницаемость данного ма-териала в сухом состоянии 154 КОЕ. Поскольку параметр бактериальной проницаемости один из основных параметров в организации защитных свойств противочумного костюма специ-алисты сошлись во мнении, что применения данного материала допустимо для производства противочумных комплектов нового поколения.

Тестовые партии средств индивидуальной защиты нового поколения в виде противо-


174

чумных халата, комбинезона, капюшона, пижамы и других изделий многоразового и одно-разового применения были направлены в ФКУЗ Волгоградского НИПЧИ Роспотребнадзора и ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» на проведение испытаний. В результате тестирования про-дукции ООО «Лаборатория технологической одежды» большинство изделий получили поло-жительный отзыв.

ФКУЗ Волгоградского НИПЧИ Роспотребнадзора провел тестирование изделий из микрофиломентных нитей в отношении использования различных дезинфектантов и способов обработки. В результате испытаний было выявлено, что изделия многоразового применения выдерживают способы обработки, указанные в таблице 2.

Таблица 2 Способы обработки

1. Обеззараживание в соответствии с требованиями СП 1.3.1285-03 с использованием автоклавирования 1-2Атм. - 1-2ч.

2. Замачивания в перекиси водорода и хлорамине в соответствие с СП 1.3.1285-03 3. Обработка хлорапином 3% - 120 минут.4. Обработка септолетом 1% - 60 минут.5. Обработка Форэкс-хлор комплитом 0,2% - 60минут.

Полученные результаты свидетельствуют о возможности использования данных пре-паратов для обеззараживания изделий многократного использования без потери первоначаль-ных защитных свойств материала

Изделия одноразового использования также могут быть обеззаражены в соответствии с требованиями СП 1.3.1285-03 с использованием автоклавирования 1-2Атм. 1-2ч., замочены в перекиси водорода и хлорамине в соответствие с СП 1.3.1285-03, после чего утилизированы.

В таблице 3 представлены изделия, одобренные ФКУЗ Волгоградского НИПЧИ Ро-спотребнадзора и ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» после проведения испытаний.

Таблица 3 - Одобренные изделияДец. но-

мерОписание Эскиз

Одежда многоразового использованияКБ.18 Комбинезон без капюшона пояс из боко-

вых швов.Материал 100% полиэфир+антистатическая нить


175

БХ.ТГ.1 Бахилы на твердой подошве, с гипало-ном, с застежкой молнией.Материал 100% полиэфир+антистатическая нить

КБ.Ш7 Комбинезон с капюшоном.Материал 100% полиэфир+антистатическая нить

ШЛ.Р.11 ШлемМатериал 100% полиэфир+антистатическая нить

ХЛ.21 Халат тип I (застежка кнопки)Материал 100% полиэфир+антистатическая нить.


176

ХЛ.20(Э-11-2)

Халат тип I на завязках.Материал 100% полиэфир+антистатическая нить.

Одежда одноразового использованияШЛ.03 Шлем без молнии одноразовый, ткань

SMS.42

ШП.Р1 Шапочка с резинкой одноразовая, ткань SMS.42

КБ.О.01 Комбинезон с капюшоном, материал SMS.42

БХ.О.01 Бахилы на завязках материал SMS.42


177

Арт. 88808 KIMTECH PURE* A5 Стерильные бахи-лы

Перчатки анатомические особо прочные DERMAGRIP HIGH RISK P�WDER FREE

В отношении некоторых изделий мнения ФКУЗ Волгоградского НИПЧИ Роспотреб-надзора и ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» разошлись. Результат представлен в таблице 4.

Таблица 4 - Изделия, по которым мнения специалистов разошлисьНаименова-

ние Эскиз Разночтение ПримечаниеВНИПЧИ Микроб

КЛ.ФТ.01 Пододеж-ный трико-таж, мате-риал Футер Пенье

Нельзя использо-вать.Нельзя снимать специальную одеж-ду через голову.

Допустимо использова-ние, доработ-ка не требу-ется.

Возможно вы-полнение дан-ного изделия с застежкой спе-реди (молния, кнопки)

ХЛ.О.01(Э-119) Халат хи-рургический материал SMS 42

Нельзя использо-вать.Если изменить конструкцию и сделать завязки как на противочумном халате, то можно использовать для работы с ПБА.

Д о п у с т и м о использова-ние.

9332 Респи-ратор 3М

Не включен в спи-сок разрешенной спецодежды СП 1.3.1285-03

Допустимо использова-ние


178

Маска пластмассо-вая для за-щиты лица с 10 пленками

Нельзя использо-ватьНе обеспечивает герметичность

Допустимо для II-IV группы пато-генности

На основании полученных данных ООО «Лаборатория Технологической Одежды» приступило к доработке изделий. Описание и эскизы доработанных изделий представлены в таблице 4.

Таблица 5 - Доработанные изделия№ п/п Описание Эскиз

1 Бахилы с защитой от промокания

2 Шлем с разъемной молнией


179

3 Пижама (нательное белье) с длинной застежкой

4 Пижама (нательное белье) с короткой застежкой

5

Комбинезон без капюшона с добавлением фильтромодуля для снижения температуры пододежного пространства и двойная планка без кнопок


180

6

Комбинезон с капюшоном с добавлением фильтромодуля для снижения температуры пододежного пространства и двойная планка без кнопок

В настоящее время ООО «Лаборатория Технологической Одежды» направило пред-ложение на проведение тестирования средств индивидуальной защиты нового поколения для работы с ПБА I-IV группы патогенности ряду учреждений Роспотребнадзора (Управления, Центры гигиены и эпидемиологии, противочумные институты, противочумные станции), фе-деральных государственных учреждений науки, научно-исследовательских институтов РАМН, профильных научно-исследовательских институтов России.

На основании заключений и предложений, полученных от специалистов ведущих го-сударственных учреждений страны в области обеспечения биологической безопасности, про-тивочумные комплекты будут доработаны и запущены в серийное производство.

В основу работы был положен принцип, при котором специалисты, выполняющие ра-боты с ПБА I-IV группы патогенности, непосредственно участвуют в создании средств инди-видуальной защиты нового поколения, что позволяет говорить о том, что изделия будут макси-мально приспособлены к условиям эксплуатации при выполнении каждого конкретного типа работ и будут соответствовать требованиям конечных пользователей.

DISPOSABLE AND REUSABLE PERSONAL PROTECTIVE EQUIPMENT FOR THE NEW GENERATION OF PATHOGENIC BIOLOGICAL AGENTS

(PBA) 1-4 PATHOGENICITY GROUP

Tarakanov A.A.

Key words: Ant�-P�ague ��oth�ng, �omp�eteness, the mater�a�s use�.

Th�s paper a��resses the �eve�opment of a new generat�on of persona� prote�t�ve equ�pment for use w�th PBA 1-4 pathogen��ty group (ant�-p�ague ��oth�ng). There �s a �es�r�pt�on of the mater�a� use� for the manufa�ture of ant�-p�ague ��othes an� h�s a�vantages, re�ommen�at�ons on the pro�ess�ng of pro�u�ts, g�ven a ��st of pro�u�ts approve� after the tests, ��ent�fy areas of ant�-p�ague ��oth�ng.


181

УДК 619:616

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БАКТЕРИОФАГОВ ПРИ РЕАЛИЗАЦИИ ЖИВОЙ ПРУДОВОЙ РЫБЫ

Туганова М.М., магистрСерегин И.Г., кандидат ветеринарных наук, профессорМосковский государственный университет пищевых производств

Ключевые слова: вода, рыба, бактериофаги, бактериальное обсеменение, возбудите-ли токсикоинфекций, безопасность.

Работа посвящена изу�ению возможности применения сальмонеллезных, эшерихи-озных, псевдомонозных бактериофагов при транспортировке и реализации живой прудовой рыбы. В экспериментальных условиях установлено, �то с помощью бактериофагов в коли�е-стве 1х10-4-1х10-5 можно снизить коли�ество гомологи�ных фагам микроорганизмов в воде и мясе рыбы из торговых емкостей при температуре около 10-15оС.

Введение. Бактериофаги, как «пожирателей бактерий» относят к особым представите-лям царства вирусов, которые могут использовать бактериальные клетки для увеличения своей популяции. Бактериофаги, при взаимодействии с гомологичными бактериальными клетками, вызывают их разрушение, при котором в каждой бактерии образуются 10 - 200 новых фагов. Полный цикл действия фагов с момента заражения бактерии до появления новых популяций фаговых частиц составляет 10-40 минут, в зависимости от температуры воды.

С момента открытия Эрнестом Ханкиным (1896 г.) первых фагов, уже известно около 400 видов «пожирателей микробных клеток». Они успешно применяются в медицине, ветери-нарии, в пищевой и косметической промышленности. Бактериофаги используются при лече-нии гнойных ран, при диагностике болезней и идентификации микроорганизмов. Кроме того, имеются сообщения (Бой К.К., 2001; Флерова А.Д., 2011) об использовании сальмонеллезных и эшерихиозных фагов при переработке птицы и выработке колбасных изделий.

Известно, что источником возбудителей токсикоинфекций (сальмонеллы, патогенные эшерихии, псевдоманады и др.) достаточно часто отмечают рыбу, добытую из водоемов, в ко-торую попадают стоки с ферм, от жилых массивов или боенских предприятий. Поэтому, с це-лью повышения биологической безопасности прудовой рыбы, необходим поиск методов сни-жения контаминации ее возбудителями пищевых инфекций другими микроорганизмами, явля-ющимися опасными для потребителей. По нашему мнению, одним из путей решения данной проблемы, является использование бактериофагов при перевозке и реализации живой рыбы. Бактериофаги безвредны, не оказывают отрицательного влияния на живой организм, они со-храняют биологическую активность при 10-42оС. Лизирующая способность различных бакте-риофагов, сохраняется при их разведении до 1х10-6-1х10-12. Вместе с тем работ, посвященных использованию фагов для снижения уровня микробной безопасности товарной живой рыбы до сих пор в литературных источниках не выявлено, что и послужило основанием для наших исследований.

Материалы и методы исследований. Работа выполнена в экспериментальных услови-ях при обработке фагами воды в цистернах и торговых емкостях с живым карпом, предназна-ченным для продажи населению. Предварительно бактериофаги были получены из сточных вод, идентифицированы и оценены по активности общепринятыми методами. В опытах при-меняли сальмонеллезные фаги к S. enter�t��s и S. typh�mur�um, а также к E. сoli (О26, О57) и Ps. аerug�nosa. Активность используемых фагов составляла 1х10-5 – 1х10-9. Бактериофаги добавля-ли в воду с рыбой при температуре 10-15оС из расчета их содержания около 1х10-4 – 1х10-5 или 1 мл специально подготовленных бактериофагов добавляли в 10-100 л воды, а на 1 тонну воды


182

до 100 мл фагов. Отбор проб воды и рыбы для исследования проводили 2 раза в сутки в тече-ние 48 часов, при содержании рыбы в воде в транспортных цистернах и торговых емкостях при температуре 12-15оС. Контролем служили цистерны и торговые емкости с живой рыбой, в воду которых фаги не добавляли. При этом из подопытных и контрольных объектов делали микробиологические посевы воды и спинных мышц рыбы с целью определения общей бак-териальной загрязненности и наличия бактерий рода сальмонелла, эшерихия и псевдомонас.

Результаты исследований и их обсуждение. Проведенные микробиологические иссле-дования показали, что при добавлении сальмонеллезных, эшерихиозных и псевдомонозных фагов в воду с товарной живой рыбой, обеспечивает снижение общей бактериальной загряз-ненности воды на 17,6-21,9% и тканей рыбы на 11,4-13,6% по сравнению с контрольными образцами воды и рыбы. При этом, гомологичные к фагам клетки сальмонелл, эшерихий и псевдомонад в подопытных емкостях не выделяли, а в контрольных образцах воды и рыбы отдельные из них выявляют 42-67% проб. В подопытных емкостях с водой живая рыба про-являла все признаки биологической активности с нормальным движением жаберных крышек и плавников. Такая рыба плавала спинкой вверх, сохраняя при этом чистую и плотно приле-гающую чешую, естественную ее окраску. За этот период в контрольных емкостях отдельные экземпляры карпа снижали плавательную активность, и изменяли свое расположение в воде, группируясь при этом в верхних слоях воды. При лабораторном исследовании спинных мышц подопытной и контрольной рыбы физико-химические показатели не имели выраженных отли-чий. Вместе с тем, в мясе рыбы из емкостей с водой, обработанной фагами, общая микробная загрязненность была на 11,4-13,6% ниже по сравнению с мясом рыбы из контрольных емко-стей. Рыба, изъятая из емкостей с водой, обработанной фагами, в снулом виде приобретала от-дельные признаки порчи на 11-13 часов позже, по сравнению с рыбой, изъятой из контрольных емкостей.

Заключение. Добавление сальмонеллезных, эшерихиозных и псевдоманозных фагов в количестве 1х10-4 – 1х10-5 в емкости с водой при перевозке и реализации рыбы, обеспечивает снижение бактериального загрязнения не только воды, но и рыбы. При этом, культуры гомоло-гичные фагам сальмонелл, эшерихий коли и псевдомонад в опытных объектах практически не выявляются, что способствует сохранности снулой рыбы более длительный срок без призна-ков порчи. Эти данные дают основания считать, что использование различных бактериофагов при перевозке и реализации живой рыбы имеет перспективу для повышения биологической безопасности рыбы и рыбных продуктов, в том числе с целью профилактики токсикоинфекций у людей употребляющих рыбу, хранившуюся определенное время в торговых емкостях в жи-вом виде. Однако, режимы применения бактериофагов при перевозке и реализации прудовой рыбы, необходимо совершенствовать до получения оптимальных результатов ее обеззаражи-вания.

Библиографический список1. Сулаквелидзе А., «Бактериофаги. Биология и практическое применение», 20122. Бой Кикимото Баширу Бависе, «Профилактика токсикоинфекций сальмонеллезной

этиологии тушек птицы с использованием бактериофагов», автореферат кандидатской диссер-тации, 2001

3. Голубев В.Н., Назаренко Т.Н., Цыбулько Е.И., «Обработка рыбы и других морепродуктов»4. ГОСТ 24896-81 Рыба живая. Технические условия5. Флерова А.Д., «Изучение качества и безопасности колбасных изделий при исполь-

зовании сальмонеллезных бактериофагов», автореферат кандидатской диссертации, 20116. Хейс У. Генетика бактерий и бактериофагов, пер. с англ., М., 20017. Элизабет Кюттер Фаговая терапия: бактериофаги как анибиотики (PHAGE

THERAPY: BACTERI�PHAGES AS ANTIBI�TICS Elizabeth Kutter, Evergreen State College, �lympia, WA 98505 – Nov., 1997 ).

183

содержание:Горшков И.Г, Куклина Н.Г., Викторов Д.А., Насибуллин И.Р., Васильев Д.А., Золо-тухин С.Н.ВЫДЕЛЕНИЕ БАКТЕРИОФАГОВ AEROMONAS SALMONICIDA 3

Горшков И.Г., Куклина Н.Г., Викторов Д.А., Насибуллин И.Р., Васильев Д.А., Золо-тухин С.Н.ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ БАКТЕРИОФАГОВ ДЛЯ ИНДИКАЦИИ ПА-ТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ РОДА AEROMONAS 5

Гринева Т.А., Викторов Д.А., Васильев Д.А.ОПТИМИЗАЦИЯ СХЕМЫ ВЫДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИОФАГОВ PSEUDOMONAS CHLORORAPHIS 7

Затевалов А.М., Киселева И.А., Копанев Ю.А., Алешкин А.В., Афанасьев С.С., Селькова Е.П.ВЛИЯНИЕ БАКТЕРИОФАГОВ НА МИКРОФЛОРУ ТОЛСТОЙ КИШКИ 9

Капустин А. В., Моторыгин А. В.ЗНАЧЕНИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ФАГОВ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ BACILLUS ANTHRACIS 14

Катаева Л. В., Вакарина А. А.ОЦЕНКА ЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ НЕКОТОРЫХ БАКТЕРИОФАГОВ 17

Кудрякова Т.А., Македонова Л.Д., Гаевская Н.Е., Качкина Г.В.БАКТЕРИОФАГИ ПАТОГЕННЫХ ДЛЯ ЧЕЛОВЕКА ВИБРИОНОВ 22

Ленев С.В.БАКТЕРИОФАГИ ПРИ САЛЬМОНЕЛЛЕЗЕ КУР 26

Лыско К.А., Игнатьев Г.М., Отрашевская Е.В.ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКИЕ ПРЕПАРАТЫ БАКТЕРИОФАГОВ: КРАТ-КИЙ ОБЗОР 30

Ляшенко Е.А., Васильев Д.А., Золотухин С.Н.ИНДИКАЦИЯ БАКТЕРИЙ РОДА KLEBIELLA,С ПОМОЩЬЮ СПЕЦИФИЧЕ-СКИХ БАКТЕРИОФАГОВ, В ОБЪЕКТАХ ВЕТЕРИНАРНОГО НАДЗОРА 36

Мидленко В.И., Золотухин С.Н., Шевалаев Г.А., Ефремов И.М., Пичугин Ю.В.МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ БАКТЕРИОФА-ГОВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ С ИНФЕКЦИОННЫМИ ОСЛОЖНЕНИЯМИ В КЛИНИКЕ ТРАВМАТОЛОГИИ И ОРТОПЕДИИ 40

184

Насибуллин И.Р., Куклина Н.Г., Горшков И.Г., Викторов Д.А., Васильев Д.А., На-феев А.А.ИССЛЕДОВАНИЕ ЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ БАКТЕРИОФАГОВ AEROMONAS HYDROPHILA 45

Парамонова Н.А., Викторов Д.А., Васильев Д.А., Золотухин С.Н.О ПЕРСПЕКТИВАХ ФАГОДИАГНОСТИКИ ФЛАВОБАКТЕРИОЗОВ РЫБ 47

Пименов Н.В.БАКТЕРИОФАГИ В БОРЬБЕ С САЛЬМОНЕЛЛЕЗОМ ПТИЦ 51

Пугачев В.Г., Тотменина О.Д., Тимакова О.И., Агиенко А.И., Юшков Ю.Г., Леонов С.В., Селиверстова Н.А.ИССЛЕДОВАНИЕ ФАРМАКОКИНЕТИКИ САЛЬМОНЕЛЛЁЗНЫХ БАКТЕРИ-ОФАГОВ В ОРГАНИЗМЕ ЦЫПЛЯТ КРОССА ИЗА 55

Романова Л.В., Мишанькин Б.Н., Кудрякова Т.А., Бородина Т.Н., Македонова Л.Д., Гаевская Н.Е., Качкина Г.В.МОЛЕКУЛЯРНОЕ ТИПИРОВАНИЕ (RAPD-АНАЛИЗ) ДНК- СОДЕРЖАЩИХ БАКТЕРИОФАГОВ ПАТОГЕННЫХ ИЕРСИНИЙ 60

Скобликов Н.Э., Зимин А.А. ОПЫТ ПРИМЕНЕНИЯ НЕТРАНСДУЦИРУЮЩИХ БАКТЕРИОФАГОВ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ТЕРАПИИ КИШЕЧНОГО ЭШЕРИХИОЗА СВИНЕЙ 64

Слободенюк В.В., Воропаева Е.А., Алешкин В.А., Афанасьев С.С., Караулов А.В., Афанасьев М.С.ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ БАКТЕРИОФАГОВ В ПРОФИЛАКТИКЕ И ЛЕЧЕНИИ НОЗОКОМИАЛЬНЫХ ОСЛОЖНЕНИЙ В ХИРУРГИИ 68

Плешакова В.И., Степанов Д.Н.ФАГОТЕРАПИЯ САЛЬМОНЕЛЛЁЗА КУР С УЧЕТОМ ОСОБЕННОСТЕЙ ТЕХ-НОЛОГИИ ВЫРАЩИВАНИЯ ПТИЦЫ 73

Фурсова Н.К., Карцев Н.Н., Ивашов С.В., Светоч Э.А. АНТИБИОТИКОУСТОЙЧИВОСТЬ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПАТОГЕНОВ: ЭВО-ЛЮЦИОННЫЕ МЕХАНИЗМЫ И КЛИНИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ 77

Храмов М. В., Костенко Ю. Г., Воложанцев Н.В., Перелыгин В.В., Веревкин В.Н., Светоч Э.А.ИЗУЧЕНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ БАКТЕРИОФАГОВ ДЛЯ ОБ-РАБОТКИ ПТИЦЫ ЗАРАЖЕННОЙ САЛЬМОНЕЛЛЕЗОМ 82

Doskar J., Varga M., Maslanova I., Pantucek R., Mosa M.BACTERIOPHAGE TRANSDUCTION OF MOBILE GENETIC ELEMENTS IN METHICILLIN-RESISTANT STAPHYLOCOCCUS AUREUS 87

Pantucek R., Petras P., Doskar J., Ruzickova V., Bostik J., Mosa M.COMPARISON OF IN VITRO LYTIC ACTIVITIES OF THREE BACTERIOPHAGE PREPARATIONS STAFAL®, STAPHYLON® AND PYOBACTERIOPHAGUM LIQUIDUM AGAINST METHICILLIN RESISTANT STAPHYLOCOCCUS AUREUS 91

Алешкин А.В., Воложанцев Н.В., Светоч Э.А., Афанасьев С.С., Веревкин В.В., Ва-сильев Д.А., Золотухин С.Н., Киселева И.А.СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫЙ ПРОДУКТ ПИТАНИЯ «ФУДФАГ» В ПРОФИЛАК-ТИКЕ ПИЩЕВЫХ ИНФЕКЦИЙ 93

185

Васильева Ю.Б., Васильев Д.А., Семанина Е.Н.ТЕХНОЛОГИЯ КОНСТРУИРОВАНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКОГО БИОПРЕПА-РАТА НА ОСНОВЕ БАКТЕРИОФАГОВ BORDETELLA BRONCHISEPTICA И ПЕРСПЕРТИВЫ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ 99

Григорьев В.В., Афанасьев С.С., Алешкин А.В., Селькова Е.П.ГИГИЕНИЧЕСКИЕ ТРЕБОВАНИЯ К РАЗМЕЩЕНИЮ, УСТРОЙСТВУ, ОБО-РУДОВАНИЮ, КОНТРОЛЮ И ЭКСПЛУАТАЦИИ АСЕПТИЧЕСКИХ И КОН-ТРОЛИРУЕМЫХ ОБЪЕКТОВ .В.Т.Ч. И ПРИ РАБОТАХ С БАКТЕРИОФАГАМИ 104

Дыкман Л.А., Староверов С.А., Щеголев C.Ю., Богатырев В.А.ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КОМБИНАТОРНЫХ ФАГОВЫХ БИБЛИОТЕК ДЛЯ ПО-ЛУЧЕНИЯ АНТИТЕЛ К ЦЕЛЫМ КЛЕТКАМ 105

Дыкман Л.А.ТЕХНОЛОГИЯ ФАГОВОГО ДИСПЛЕЯ АНТИТЕЛ 109

Ененко А.А.БОКСЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ. ОСНОВЫ ЭКСПЛУА-ТАЦИИ И ОБСЛУЖИВАНИЯ. 114

Ильичев А.А., Карпенко Л.И., Щербакова Н.С.ТЕХНОЛОГИЯ ФАГОВОГО ДИСПЛЕЯ И ЕЕ ПРИЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ДИАГНО-СТИКИ И ПРОФИЛАКТИКИ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЧЕЛОВЕКА 121

Карамышева Н. Н., Васильев Д. А., Золотухин С. Н.СОЗДАНИЕ БИОПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ БАКТЕРИОФАГОВ DESULFOVIBRIO DESULFURICANS И ПЕРСПЕКТИВЫ ЕГО ИСПОЛЬЗОВА-НИЯ 122

Климовский А.Б., Викторов Д.А., Васильев Д.А.КЛАССИФИКАЦИЯ ПРАКТИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ БИОПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ БАКТЕРИОФАГОВ 126

Ковалева Е.Н., Васильев Д.А., Сульдина Е.В., Имамов М.А.ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА БАКТЕРИОФАГОВ LISTERIA MONOCYTOGENES 130

Ковалева Е.Н., Золотухин С.Н., Васильев Д.А.РАЗРАБОТКА БИОПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ ЭНТЕРОКОККОВЫХ ФАГОВ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ ENTEROCOCCUS FAECALIS 133

Ковязина Н.А., Казьянин А.В., Николаева А.М., Функнер Е.В.РАЗРАБОТКА ТВЕРДЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ НА ОСНОВЕ КОМ-ПЛЕКСНЫХ ПОЛИВАЛЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ БАКТЕРИОФАГОВ 136

Летарова М.А., Стрелкова Д.А., Бакумова А.Д., Куликов Е.Е., Голомидова А.К., Прохоров Н.С., Кутузова Н.М., Летаров А.В.ПСЕВДОЛИЗОГЕННЫЕ АССОЦИАЦИИ ВИРУЛЕНТНОГО БАКТЕРИОФАГА G7C И ШАММА-ХОЗЯИНА E. COLI 4S 140

Микулинская Г.В., Зимин А.А., Степная О.А.ЭНДОЛИЗИН БАКТЕРИОФАГА Т5 КАК ПОТЕНЦИАЛЬНЫЙ ЭНЗИБИОТИК 145

Мирошников К.А., Сыкилинда Н.Н., Куликов Е.Е., Дурманова З.В., Цыганова М.Р., Дарбеева О.С.ПЦР-СИСТЕМА ТИПИРОВАНИЯ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ БАКТЕРИОФАГОВ PSEUDOMONAS AERUGINOSA 149

186

Молофеева Н.И., Васильев Д.А., Золотухин С.Н.РАЗРАБОТКА ПАРАМЕТРОВ УСКОРЕННОЙ ИНДИКАЦИИ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI О157 C ПОМОЩЬЮ РЕАКЦИИ НАРАСТАНИЯ ТИТРА ФАГА 153

Насибуллин И.Р.,Горшков И.Г.,Куклина Н.Г.,Викторов Д.А.,Васильев Д.А.ПРИМЕНЕНИЕ РЕАКЦИИ НАРАСТАНИЯ ТИТРА ФАГА ДЛЯ ИНДИКАЦИИ АЭРОМОНАД В РЫБНОЙ ПРОДУКЦИИ 158

Перелыгин В.В.,Светоч Э.А.,Похиленко В.Д.,Веревкин В.О.,Воложанцев Н.В.ПОЛУЧЕНИЕ СУХИХ ЛЕЧЕБНЫХ ПРЕПАРАТОВ БАКТЕРИОФАГОВ С ИС-ПОЛЬЗОВАНИЕМ КОМПОНЕНТОВ КОММЕРЧЕСКИХ КОРМОВ 161

Подзорова Ю.А.,Серегин И.Г.,Логинов И.А.ИСПОЛЬЗОВАНИЕ САЛЬМОНЕЛЛЕЗНЫХ ФАГОВ ПРИ ПЕРЕРАБОТКЕ ПТИЦЫ 166

Рубальский О.В., Алешкин А.В., Афанасьев С.С., Алешкин В.А., Франк Н.В., Афа-насьев М.С., Караулов А.В., Рубальский Е.О., Рубальский М.О. 169

Тараканов А.А.СРЕДСТВА ИНДИВИДУАЛЬНОЙ ЗАЩИТЫ НОВОГО ПОКОЛЕНИЯ ДЛЯ РАБОТЫ С ПАТОГЕННЫМИ БИОЛОГИЧЕСКИМИ АГЕНТАМИ (ПБА) I-IV ГРУППЫ ПАТОГЕННОСТИ ОДНОРАЗОВОГО 171

Туганова М.М., Серегин И.Г.ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БАКТЕРИОФАГОВ ПРИ РЕАЛИЗАЦИИ ЖИВОЙ ПРУДО-ВОЙ РЫБЫ 181

Documents

Бактериофагиphages-research.ru/part_2.pdf · 2013. 7. 18. · Бактериофаги в медицине и ветеринарии 5 УДК 619:616-07 ПЕРСПЕКТИВЫ