Phụ lục-cách pha 1 số dd đệm và phương pháp thí nghiệm

82

CHƢƠNG 5: PHỤ LỤC

5.1. Cách pha một số hóa chất

5.1.1. Cách pha dung dịch đệm [4,6]

* Dung dịch đệm acid citric - Na2HPO4 (pH 3, 4, 5)

- Dung dịch acid citric 0,1M: Hòa tan 10,504g acid citric (C6H8O7) trong

500ml nước cất (dung dịch a)

- Dung dịch Na2HPO4 0,2M: Hòa tan 71,7g Na2HPO4. 12H2O trong 500ml

nước cất (dung dịch b)

Dung dịch đệm acid citric - Na2HPO4 có pH khác nhau phụ thuộc vào số ml

dung dịch a và số ml dung dịch b với tổng thể tích 100ml

Acid citric 0,1M

(dd a, ml)

Na2HPO4 0,2M

(dd b, ml) pH

79,45 20,55 3,0

61,45 38,55 4,0

48,50 51,50 5,0

* Dung dịch đệm phosphate (pH 6, 7, 8)

- Dung dịch NaH2PO4 0,2M: Hòa tan 27,8g NaH2PO4 trong 500ml nước cất

(dung dịch a)

- Dung dịch Na2HPO4 0,2M: Hòa tan 71,7g Na2HPO4. 12H2O trong 500ml

nước cất (dung dịch b)

Dung dịch đệm phosphat có pH khác nhau phụ thuộc vào số ml dung dịch a

và số ml dung dịch b với tổng thể tích 200ml

NaH2PO4 0,2M

(dd a, ml)

Na2HPO4 0,2M

(dd b, ml) Nước (ml) pH

87,7 12,3 100 6,0

39,0 61,0 100 7,0

5,3 94,7 100 8,0

83

5.1.2. Cách pha một số hóa chất khác [4,6]

- Thuốc nhuộm Bradford: Hòa tan 10mg Coomassive Brilliant Blue vào

50ml etanol 96o, thêm 100ml H3PO4 85%, định mức với nước cất đến 1000ml.

- Dung dịch Albumin 100 µg/ml: cân 10mg Albumin pha với nước cất thành

100ml

- Dung dịch Na2HPO4 1/15M: hoà tan 5,96g Na2HPO4.12H2O trong nước

thành 250 ml

- Dung dịch KH2PO4 1/15M: hoà tan 0,9072g KH2PO4 trong nước thành

100ml

- Dung dịch đệm Sorensen 1/15M, pH 7.6: trộn 177ml dung dịch Na2HPO4

1/15M và 23 ml dung dịch KH2PO4 đo và chỉnh lại pH cho đúng.

- Dung dịch Casein 1%: đun sôi cách thuỷ 1g Casein trong đệm Sorensen

đến tan hoàn toàn rồi sau đó định mức bằng đệm Sorensen cho đủ 100ml.

- Dung dịch TCA (tricloro acid) 10%: hoà tan 10g TCA trong nước cho đủ

100ml

- Dung dịch NaOH 0,5N: hoà tan 10g NaOH trong nước cho đủ 500 ml

- Dung dịch HCl 0,2N: trộn 4,25ml HCl đậm đặc với nước cho đủ 250 ml

- Dung dịch tyrosin 20mM: khuấy nghiền 0,118 g tyrosin trong dung dịch

HCl 0,2N vừa đủ 50ml

- Dung dịch tyrosin chuẩn 1mM: pha loãng 5 ml tyrosin 20mM trong HCl

0,2N thành 100 ml.

5.2. Xây dựng đƣờng chuẩn Bradford

Bảng 5.1. Tương quan giữa giá trị ∆OD với nồng độ albumin

Ống nghiệm số 1 2 3 4 5 6

Nồng độ protein

(μg/ml) 0 10 20 30 40 50

OD595nm 0,051 0,070 0,084 0,099 0,110 0,125

ΔOD 0 0,019 0,033 0,048 0,059 0,074

84

y = 0,0015x

R2 = 0,9907

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

0 10 20 30 40 50 60

Nồng độ protein (µg/ml)

∆O

D

Đồ thị 5.1. Sự tương quan giữa giá trị ∆OD và nồng độ albumin

Bảng 5.2 . Giá trị OD tương ứng khi xác định hàm lượng protein trong lá trà

nguyên liệu

Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3

OD595nm 0,119 0,119 0,120

ΔOD 0,068 0,068 0,069

Hàm lượng protein trong

nguyên liệu suy ra từ đường

chuẩn (µg/ml)

45,33 x 50 =

2266,5

45,33 x 50 =

2266,5

46 x 50 =

2300

Hàm lượng protein trong

nguyên liệu suy ra từ đường

chuẩn (mg/ml)

2,27 2,27 2,30

5.3. Các số liệu thực nghiệm

Bảng 5.3. Giá trị OD tương ứng khi xác định hoạt độ PPO trong nguyên liệu

OD420nm KC OD420nm TN ∆OD

Mẫu 1 0,016 0,321 0,305

Mẫu 2 0,018 0,327 0,309

Mẫu 3 0,019 0,349 0,330

85

Bảng 5.4. Giá trị OD tương ứng khi xác định pH tối ưu cho hoạt động của PPO

pH OD420nm KC OD420nm TN ∆OD ∆OD TB

3

0,008 0,166 0,158 0,158

± 0,002

0,007 0,164 0,157

0,010 0,170 0,160

4

0,011 0,250 0,239 0,238

± 0,002

0,010 0,245 0,235

0,012 0,251 0,239

5

0,010 0,330 0,320 0,322

± 0,006

0,010 0,327 0,317

0,011 0,340 0,329

6

0,015 0,232 0,217 0,218

± 0,001

0,015 0,232 0,217

0,016 0,235 0,219

7

0,017 0,164 0,140 0,151

± 0,003

0,019 0,172 0,153

0,017 0,170 0,160

8

0,018 0,099 0,081 0,090

± 0,005

0,017 0,112 0,095

0,017 0,110 0,093

Anova: Single Factor

SUMMARY

Groups Count Sum Average Variance se

3 3 3356,8905 1118,9635 116,5370 10,80

4 3 5038,8693 1679,6231 266,3703 16,32

5 3 6826,8551 2275,6184 1947,8330 44,13

6 3 4614,8410 1538,2803 66,5926 8,16

7 3 3201,4134 1067,1378 599,3332 24,48

8 3 1901,0601 633,6867 1664,8146 40,80

ANOVA

Source of Variation SS df MS F P-value F crit

Between Groups 4919341,122 5 983868,2244 1266,3807 6,70064E-16 3,105875

Within Groups 9322,961539 12 776,9134616

Total 4928664,083 17

86

Bảng 5.5. Giá trị OD tương ứng khi xác định ảnh hưởng của pH đến độ bền

của PPO

pH OD420nm KC OD420nm TN ∆OD ∆OD TB

3

0,008 0,054 0,046 0,045

± 0,003

0,010 0,052 0,042

0,008 0,055 0,047

4

0,010 0,159 0,149 0,154

±0,006 0,012 0,172 0,160

0,010 0,163 0,153

5

0,011 0,331 0,320 0,322

±0,002 0,011 0,332 0,321

0,012 0,336 0,324

6

0,015 0,236 0,221 0,219

±0,005 0,017 0,240 0,223

0,018 0,231 0,213

7

0,019 0,172 0,153 0,155

±0,007 0,020 0,170 0,150

0,020 0,183 0,163

8

0,019 0,118 0,099 0,100

±0,002 0,018 0,116 0,098

0,019 0,121 0,102


SUMMARY


3 3 954,0636042 318,0212014 349,61106 18,70

4 3 3265,017668 1088,339223 1548,2775 39,35

5 3 6819,787986 2273,262662 216,42589 14,71

6 3 4643,109541 1547,70318 1398,4442 37,40

7 3 3293,286219 1097,762073 2314,0922 48,11

8 3 2113,074205 704,3580683 216,42589 14,71

ANOVA


Between Groups 6943231,211 5 1388646,242 1378,7019 4,02872E-16 3,105875

Within Groups 12086,55371 12 1007,212809

Total 6955317,765 17

87

Bảng 5.6. Giá trị OD tương ứng khi xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt động

của PPO

Nhiệt độ (oC) OD420nm KC OD420nm TN ∆OD ∆OD TB

20

0,014 0,331 0,317 0,317

± 0,003 0,014 0,328 0,314

0,015 0,334 0,319

30

0,014 0,378 0,364 0,359

± 0,004 0,014 0,372 0,358

0,014 0,369 0,355

40

0,017 0,225 0,208 0,206

± 0,003 0,018 0,225 0,207

0,017 0,220 0,203

50

0,024 0,198 0,174 0,173

± 0,003 0,024 0,194 0,170

0,023 0,198 0,175

60

0,023 0,164 0,141 0,139

± 0,005 0,029 0,162 0,133

0,024 0,167 0,143

70

0,030 0,141 0,111 0,109

± 0,003 0,030 0,136 0,106

0,029 0,139 0,110

80

0,030 0,098 0,068 0,070

± 0,003 0,029 0,097 0,068

0,028 0,102 0,074


SUMMARY


20 3 6713,780919 2237,926973 316,3147665 17,79

30 3 7611,30742 2537,102473 1048,833173 32,39

40 3 4367,491166 1455,830389 349,6110577 18,70

50 3 3667,844523 1222,614841 349,6110577 18,70

60 3 2946,996466 982,3321555 1398,444231 37,40

70 3 2310,954064 770,3180212 349,6110577 18,70

80 3 1484,09894 494,6996466 599,3332418 24,48

ANOVA


Between Groups 10256446,85 6 1709407,808 2712,264151 1,24609E-20 2,84773

Within Groups 8823,51717 14 630,2512265

Total 10265270,36 20

88

Bảng 5.7. Giá trị OD tương ứng khi xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền

của PPO

Nhiệt độ (oC) OD420nm KC OD420nm TN ∆OD ∆OD TB

30

0,014 0,345 0,331 0,328

± 0,003 0,015 0,340 0,325

0,014 0,343 0,329

40

0,015 0,323 0,308 0,307

± 0,002 0,016 0,321 0,305

0,018 0,325 0,307

50

0,016 0,256 0,240 0,234

± 0,007 0,019 0,254 0,235

0,017 0,243 0,226

60

0,015 0,112 0,097 0,095

± 0,003 0,017 0,114 0,097

0,018 0,110 0,092

70

0,016 0,061 0,045 0,048

± 0,004 0,016 0,062 0,046

0,019 0,071 0,052

80

0,018 0,045 0,027 0,030

± 0,003 0,017 0,047 0,030

0,018 0,050 0,032


SUMMARY


30 3 6961,130742 2320,376914 466,1480769 21,59

40 3 6501,766784 2167,255595 116,5370192 10,80

50 3 4954,063604 1651,354535 2513,869986 50,14

60 3 2021,201413 673,7338045 416,2036401 20,40

70 3 1010,600707 336,8669022 715,870261 26,76

80 3 628,975265 209,6584217 316,3147665 17,79

ANOVA


Between Groups 13179160,4 5 2635832,081 3479,689377 1,5706E-18 3,10587524

Within Groups 9089,8875 12 757,490625

Total 13188250,3 17

89

Bảng 5.8. Giá trị OD tương ứng khi xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền

của PPO theo thời gian

Nhiệt độ

(oC)

Thời gian

(phút) OD420nm KC OD420nm TN ∆OD ∆OD TB

60

0

0,014 0,378 0,364

0,359±0,005 0,014 0,372 0,358

0,014 0,369 0,355

5

0,014 0,354 0,340

0,337±0,003 0,015 0,352 0,337

0,014 0,348 0,334

10

0,017 0,291 0,274

0,272±0,004 0,015 0,282 0,267

0,015 0,289 0,274

15

0,019 0,228 0,209

0,205±0,004 0,017 0,221 0,204

0,019 0,220 0,201

20

0,018 0,202 0,184

0,187±0,007 0,017 0,212 0,195

0,021 0,202 0,181

25

0,018 0,137 0,119

0,120±0,001 0,017 0,137 0,120

0,022 0,142 0,120

30

0,015 0,112 0,097

0,095±0,003 0,017 0,114 0,097

0,018 0,110 0,092

35

0,018 0,097 0,079

0,074±0,005 0,017 0,090 0,073

0,02 0,090 0,070

40 0,018 0,082 0,064 0,065±0,001

90

0,018 0,083 0,065

0,019 0,084 0,065

70

0

0,014 0,378 0,364

0,359 ± 0,005 0,014 0,372 0,358

0,014 0,369 0,355

5

0,017 0,183 0,166

0,166 ± 0,003 0,017 0,186 0,169

0,019 0,182 0,163

10

0,016 0,104 0,088

0,087 ± 0,001 0,019 0,107 0,088

0,018 0,104 0,086

15

0,018 0,085 0,067

0,067 ± 0,003 0,018 0,088 0,070

0,017 0,082 0,065

20

0,018 0,084 0,066

0,065 ± 0,003 0,018 0,080 0,062

0,016 0,083 0,067

25

0,015 0,076 0,061

0,060 ± 0,002 0,016 0,076 0,060

0,017 0,075 0,058

30

0,018 0,062 0,044

0,049 ± 0,005 0,016 0,070 0,054

0,016 0,065 0,049

35

0,018 0,052 0,034

0,037 ± 0,003 0,018 0,057 0,039

0,018 0,055 0,037

40

0,018 0,042 0,024

0,028 ± 0,003 0,017 0,047 0,030

0,016 0,045 0,029

91

80

0

0,014 0,378 0,364

0,359 ± 0,005 0,014 0,372 0,358

0,014 0,369 0,355

5

0,017 0,128 0,111

0,118 ± 0,006 0,017 0,138 0,121

0,015 0,138 0,123

10

0,018 0,048 0,030

0,030 ± 0,001 0,016 0,045 0,029

0,015 0,046 0,031

15

0,016 0,042 0,026

0,026 ± 0,004 0,017 0,040 0,023

0,016 0,046 0,030

20

0,019 0,040 0,021

0,025 ± 0,005 0,017 0,041 0,024

0,015 0,045 0,030

25

0,016 0,035 0,019

0,020 ± 0,003 0,016 0,039 0,023

0,018 0,036 0,018

30

0,017 0,028 0,011

0,008 ± 0,003 0,019 0,024 0,005

0,019 0,026 0,007

35

0,017 0,022 0,005

0,005 ± 0,001 0,016 0,022 0,006

0,015 0,020 0,005

40

0,016 0,020 0,004

0,005 ± 0,001 0,017 0,023 0,006

0,016 0,020 0,004

92

Bảng 5.9. Giá trị OD tương ứng khi xác định ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến

hoạt độ của PPO

Nồng độ

cơ chất (mM) OD420nm KC OD420nm TN ∆OD ∆OD TB

10

0,009 0,102 0,093 0,093

± 0,008 0,009 0,095 0,086

0,008 0,109 0,101

20

0,012 0,125 0,113 0,115

± 0,003 0,010 0,129 0,119

0,010 0,124 0,114

30

0,011 0,171 0,160 0,161

± 0,001 0,014 0,176 0,162

0,014 0,176 0,162

40

0,013 0,260 0,247 0,243

± 0,005 0,015 0,253 0,238

0,015 0,260 0,245

50

0,020 0,348 0,328 0,330

± 0,002 0,018 0,347 0,329

0,017 0,349 0,332

60

0,019 0,343 0,324 0,328

± 0,008 0,017 0,354 0,337

0,020 0,343 0,323

70

0,023 0,352 0,329 0,331

± 0,002 0,020 0,351 0,331

0,025 0,358 0,333

80

0,025 0,347 0,322 0,326

± 0,008 0,027 0,362 0,335

0,024 0,345 0,321

90

0,027 0,368 0,341 0,335

± 0,007 0,028 0,355 0,327

0,027 0,363 0,336

100

0,030 0,354 0,324 0,326

± 0,005 0,028 0,351 0,323

0,027 0,359 0,332

93


SUMMARY


10 3 1978,7986 659,5995 2813,5366 53,04

20 3 2445,2297 815,0766 516,0925 22,72

30 3 3420,4947 1140,1649 66,5926 8,16

40 3 5159,0106 1719,6702 1115,4258 33,40

50 3 6989,3993 2329,7998 216,4259 14,71

60 3 6954,0636 2318,0212 3046,6106 55,20

70 3 7017,6678 2339,2226 199,7777 14,13

80 3 6911,6608 2303,8869 3046,6106 55,20

90 3 7095,4064 2365,1355 2513,8700 50,14

100 3 6918,7279 2306,2426 1215,3146 34,86

ANOVA


Between Groups 13118907 9 1457656,32 988,22 1,756E-24 2,392814

Within Groups 29500,514 20 1475,03

Total 13148407 29

Bảng 5.10. Giá trị OD tương ứng khi xác định động học phản ứng của PPO theo

thời gian

Thời gian

(phút)

OD420nm OD420nm TB

Lần 1 Lần 2 Lần 3

0 0,012 0,016 0,014 0,014±0,002

5 0,351 0,353 0,349 0,351±0,002

10 0,428 0,431 0,426 0,428±0,003

15 0,435 0,436 0,431 0,434±0,003

20 0,434 0,431 0,429 0,431±0,003

25 0,429 0,429 0,426 0,428±0,002

30 0,418 0,422 0,418 0,419±0,002

35 0,406 0,410 0,401 0,406±0,005

40 0,396 0,393 0,384 0,391±0,006

45 0,382 0,386 0,379 0,382±0,004

50 0,379 0,380 0,376 0,378±0,002

55 0,377 0,380 0,376 0,378±0,002

60 0,369 0,372 0,372 0,371±0,002

94

Bảng 5.11. Giá trị OD tương ứng khi xác định ảnh hưởng của acid ascorbic đến hoạt

độ của PPO

Nồng độ

acid ascorbic

(mM)

OD420nm

KC

OD420nm

TN ∆OD ∆OD TB

HđC

(UI/gNL)

0

0,016 0,215 0,199 0,197

± 0,003

1392,23

± 24,48 0,018 0,211 0,193

0,017 0,216 0,199

1

0014 0,188 0,174 0,173

± 0,002

1222,61

± 12,24 0,014 0,185 0,171

0,015 0,189 0,174

5

0,014 0,029 0,015 0,017

± 0,002

117,79

± 10,80 0,013 0,030 0,017

0,014 0,032 0,018

10

0,013 0,016 0,003 0,003

± 0,001

23,56

± 4,08 0,014 0,018 0,004

0,013 0,016 0,003

50

0,015 0,015 0,000 0,001

± 0,001

4,71

± 4,08 0,014 0,015 0,001

0,013 0,014 0,001

100

0,014 0,014 0,000 0,000

± 0,000

0,00

± 0,00 0,014 0,014 0,000

0,014 0,014 0,000


SUMMARY


0 3 4176,678 1392,226 599,3332 24,48

1 3 3667,845 1222,615 149,8333 12,24

5 3 353,3569 117,7856 116,537 10,80

10 3 70,67138 23,55713 16,64815 4,08

50 3 14,13428 4,711425 16,64815 4,08

100 3 0 0 0 0,00

ANOVA


Between Groups 6531323 5 1306265 8718,119 6,36921E-21 3,105875

Within Groups 1798 12 149,8333

Total 6533121 17

95

Bảng 5.12. Giá trị OD tương ứng khi xác định ảnh hưởng của acid citric đến hoạt

độ của PPO

Nồng độ

NaCl

(mM)

OD420nm

KC

OD420nm

TN ∆OD ∆OD TB

HđC

(UI/mlddE)

0

0,016 0,215 0,199 0,197

± 0,003

1392,23

± 24,48 0,018 0,211 0,193

0,017 0,216 0,199

1

0,014 0,194 0,180 0,180

± 0,003

1274,44

± 17,79 0,014 0,192 0,178

0,014 0,197 0,183

5

0,014 0,166 0,152 0,156

± 0,004

1100,12

± 24,82 0,015 0,174 0,159

0,014 0,170 0,156

10

0,014 0,145 0,131 0,130

± 0,001

921,08

± 8,16 0,015 0,144 0,129

0,015 0,146 0,131

50

0,015 0,110 0,095 0,098

± 0,004

694,94

± 24,82 0,014 0,112 0,098

0,015 0,117 0,102

100

0,014 0,108 0,094 0,092

± 0,003

650,18

± 18,7 0,014 0,103 0,089

0,015 0,108 0,093


SUMMARY


0 3 4176,678 1392,2261 599,33324 24,48

1 3 3823,322 1274,4405 316,31477 17,79

5 3 3300,353 1100,1178 615,98139 24,82

10 3 2763,251 921,08363 66,592582 8,16

50 3 2084,806 694,93522 615,98139 24,82

100 3 1950,53 650,17668 349,61106 18,70

ANOVA


Between Groups 1382010 5 276401,95 646,85325 3,72341E-14 3,105875

Within Groups 5127,629 12 427,3024

Total 1387137 17

96

Bảng 5.13. Giá trị OD tương ứng khi xác định ảnh hưởng của NaCl đến hoạt độ

của PPO

Nồng độ

acid citric

(mM)

OD420nm

KC

OD420nm

TN ∆OD ∆OD TB

HđC

(UI/gNL)

0

0,016 0,215 0,199 0,197

± 0,003

1392,23

± 24,48 0,018 0,211 0,193

0,017 0,216 0,199

1

0,015 0,199 0,184 0,182

± 0,003

1286,22

± 24,48 0,016 0,194 0,178

0,014 0,198 0,184

5

0,017 0,198 0,181 0,180

± 0,002

1274,44

± 14,71 0,016 0,194 0,178

0,016 0,198 0,182

10

0,015 0,182 0,167 0,166

± 0,001

1170,79

± 8,16 0,014 0,179 0,165

0,014 0,179 0,165

50

0,015 0,152 0,137 0,134

± 0,003

949,35

± 17,79 0,016 0,150 0,134

0,014 0,146 0,132

100

0,015 0,143 0,128 0,129

± 0,002

911,66

± 12,24 0,015 0,143 0,128

0,015 0,146 0,131


SUMMARY


0 3 4176,678 1392,2261 599,33324 24,48

1 3 3858,657 1286,2191 599,33324 24,48

5 3 3823,322 1274,4405 216,42589 14,71

10 3 3512,367 1170,7892 66,592582 8,16

50 3 2848,057 949,35218 316,31477 17,79

100 3 2734,982 911,66078 149,83331 12,24

ANOVA


Between Groups 567049,7 5 113409,94 349,34188 1,46665E-12 3,105875

Within Groups 3895,666 12 324,63884

Total 570945,4 17

97

Bảng 5.14. Sự thay đổi OD420nm theo thời gian trong chế biến trà đen (mẫu TN)

Thời gian (phút) Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3

0 0,300 0,297 0,311

5 0,315 0,314 0,330

10 0,340 0,337 0,340

15 0,365 0,360 0,369

20 0,388 0,384 0,385

25 0,412 0,398 0,401

30 0,436 0,430 0,434

35 0,464 0,461 0,466

40 0,484 0,483 0,481

45 0,507 0,498 0,500

50 0,522 0,516 0,52

55 0,538 0,532 0,538

60 0,555 0,549 0,557

Bảng 5.15. Sự thay đổi OD420nm theo thời gian trong chế biến trà xanh (mẫu TN)

Thời gian (phút) Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3

0 0,373 0,369 0,372

5 0,374 0,367 0,373

10 0,373 0,369 0,375

15 0,372 0,368 0,374

20 0,372 0,368 0,375

25 0,373 0,369 0,373

30 0,373 0,369 0,373

35 0,373 0,367 0,375

40 0,374 0,369 0,374

45 0,372 0,368 0,375

50 0,372 0,368 0,375

55 0,374 0,368 0,373

60 0,374 0,369 0,373

98

Bảng 5.16. Giá trị OD tương ứng khi xác định hoạt độ của chế phẩm PPO thô từ lá

trà nguyên liệu

Mẫu OD420nm

KC

OD420nm

TN ∆OD

Hoạt độ

chung

(UI/ml ddE)

Thể tích

dung dịch

enzyme (ml)

Khối lượng

PPO thô (g)

1 0,013 0,032 0,019 38 10 0,1661

2 0,012 0,032 0,02 40 10 0,1763

3 0,015 0,035 0,020 40 10 0,1756

Bảng 5.17 . Giá trị OD tương ứng khi xác định hàm lượng protein trong chế phẩm

PPO thô từ lá trà

Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3

OD595nm 0,08 0,084 0,082

ΔOD 0,029 0,033 0,031

Hàm lượng protein trong CPE

suy ra từ đường chuẩn (µg/ml)

19,33 x 20=

386,60

22 x 20 =

440

20,67 x 20 =

413,40

Hàm lượng protein trong CPE

suy ra từ đường chuẩn (mg/ml) 0,387 0,440 0,413

5.4. Xác định sự tƣơng quan giữa nồng độ và độ hấp thu cực đại của

benzoquinon ở bƣớc sóng 420nm [2]

Bảng 5.18. Sự tương quan giữa nồng độ và độ hấp thu cực đại của benzoquinon ở bước

sóng 420nm

Nồng độ

benzoquinon

(mM)

9 18 27 36 45 54 63 72 81 90

OD420nm 0,045 0,096 0,138 0,183 0,226 0,272 0,321 0,356 0,408 0,454

99

y = 0,005x

R2 = 0,9994

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

0,50

9 18 27 36 45 54 63 72 81 90 99

Nồng độ benzoquinon (mM)

OD

42

0m

m

Đồ thị 5.2. Sự tương quan giữa giá trị OD và nồng độ benzoquinon

5.5. Phƣơng pháp tách chiết dung dịch enzyme ficin từ sung và bromelin từ

dứa [4,7]

- Tách chiết enzyme ficin từ quả sung: cân khoảng 20g quả sung, cắt nhỏ,

nghiền với 20ml nước cất, lọc qua vải thường, dịch lọc đem ly tâm với tốc độ

12000 vòng/5 phút, thu dịch nổi chứa enzyme ficin

- Tách chiết enzyme bromelin: cân khoảng 20g quả thơm đã gọt bỏ vỏ,

nghiền trong cối với 20ml nước cất, lọc qua vải thường, dịch lọc đem ly tâm với tốc

độ 12000 vòng/5 phút, thu dịch nổi chứa enzyme bromelin

5.6. Phƣơng pháp xác định hoạt độ protease của enzyme ficin và bromelin theo

Anson [4,6]

- Nguyên tắc:

Cho protease tác dụng với cơ chất là casein (hoặc hemoglobin), sản phẩm tạo

thành là các peptid ngắn hay acid amin, trong các loại acid amin, tyrosin chiếm đa

số. Xác định tyrosin bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin, từ đó xác định hoạt độ

protease theo định nghĩa:

100

Hoạt độ của protease được biểu thị là số micromole tyrosin sinh ra do thuỷ

phân Casein bởi 1ml dung dịch hay 1 mg chế phẩm protease trong thời gian 1 phút

ở điều kiện chuẩn (35,50C, pH 7.6)

- Tiến hành thí nghiệm

Bảng 5.19. Phương pháp xây dựng đường chuẩn tyrosin

Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5

Dung dịch tyrosin chuẩn 1mM (ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

Dung dịch HCl 0,2N (ml) 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0

Dung dịch NaOH 0,5N (ml) 2 2 2 2 2 2

Thuốc thử Folin (ml) 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6

Lượng tyrosin (mol) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

Lắc và để yên 10 phút đem đo mật độ quang ở bước sóng 660 nm

Vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên mật độ quang (OD) theo lượng tyrosin ở các ống.

Bảng 5.20. Phương pháp xác định lượng tyrosin trong dung dịch nghiên

cứu

Dung dịch hoá chất Ống nghiệm

Thử thật (3 ống) Thử không (3 ống)

Casein 1% (ml) 5 5

TCA 10% (ml) 0 5

Dịch enzyme mẫu (ml) 1 0

Lắc đều và giữ ở 35,5oC, trong 30 phút

TCA 10% (ml) 5 0

Dịch enzyme mẫu (ml) 0 1

Lọc, lấy 1ml dịch lọc thực hiện phản ứng màu

Dịch lọc (ml) 1 1

Dung dịch NaOH 0.5N (ml) 2 2

Thuốc thử Folin (ml) 0.6 0.6

Lắc đều, để yên 10 phút, đo OD ở bước sóng 660 nm

101

- Cách tính: Hoạt độ protease:

Hoạt độ protease (UI/ml) = vt

KVx

.

..

x: số mol tyrosin suy ra từ đường chuẩn

V: tổng thể tích hỗn hợp phản ứng enzyme (11 ml)

v: thể tích dịch lọc đem phân tích (1ml)

K: độ pha loãng mẫu

t: thời gian phản ứng (30 phút)

1 UI (Anson) = 1 mol Tyrosin/ml/phút ;

hoặc = 1 mol/mg/phút

* Kết quả xây dựng đƣờng chuẩn tyrosin

y = 1,3367x

R2 = 0,994

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

Nồng độ tyrosin (µmol)

∆O

D

Đồ thị 5.3. Sự tương quan giữa giá trị ∆OD và nồng độ tyrosin

Bảng 5.21. Tương quan giữa giá trị ∆OD với nồng độ tyrosin

Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5

Lƣợng tyrosin (μmol) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

OD660nm 0,027 0,319 0,610 0,860 1,110 1,310

ΔOD 0,000 0,292 0,583 0,833 1,083 1,283

102

* Kết quả xác định hoạt độ chung của enzyme bromelin và ficin

Bảng 5.22. Kết quả đo OD khi xác định hoạt độ chung của enzyme bromelin

và ficin

Mẫu Độ pha

loãng

OD660nm Lượng tyrosin

suy ra từ

đường chuẩn

(µmol)

Bromelin 10

Thử thật Thử

không

Lần 1 0,413 0,218

0,145

Lần 2 0,405 0,216

Lần 3 0,416 0,218

OD660nm TB 0,411 0,217

ΔOD 0,194

Ficin 1

Lần 1 0,605 0,438

0,139

Lần 2 0,602 0,431

Lần 3 0,606 0,435

OD660nm TB 0,604 0,435

ΔOD 0,186

Bảng 5.23. Kết quả xác định hoạt độ chung của enzyme bromelin và ficin

Mẫu x (μmol) V

(ml) t (phút) K

v

(ml)

Hoạt độ chung

(UI/gNL)

Bromelin 0,145 11 30 10 1 4,25

Ficin 0.139 11 30 0 1 0,37

103

5.4. Một số hình ảnh minh họa

Hình 5.1. Phản ứng xúc tác bởi PPO trên cơ chất catechol

1. Dung dịch trước phản ứng

2. Dung dịch sau phản ứng

Hình 5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sẫm màu của khoai tây

1. Mẫu đặt ở nhiệt độ phòng

2. Mẫu xử lí ở nhiệt độ 100oC


104

Hình 5.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sẫm màu của táo tây

1. Mẫu đặt ở nhiệt độ phòng



Hình 5.4. Ảnh hưởng của pH đến sự sẫm màu của khoai tây

1. Mẫu không xử lí

2. Mẫu xử lí ở pH 2



105

Hình 5.5. Ảnh hưởng của pH đến sự sẫm màu của táo tây





Hình 5.6. Ảnh hưởng của hóa chất đến sự sẫm màu của khoai tây


2. Mẫu xử lí với acid ascorbic

3. Mẫu xử lí với acid citric

4. Mẫu xử lí với NaCl

106

Hình 5.7. Ảnh hưởng của hóa chất đến sự sẫm màu của táo tây


2. Mẫu xử lí với acid ascorbic

3. Mẫu xử lí với acid citric

4. Mẫu xử lí với NaCl

Hình 5.8. Ảnh hưởng của enzyme đến sự sẫm màu của khoai tây


2. Mẫu xử lí với bromelin

3. Mẫu xử lí với ficin

107

Hình 5.9. Ảnh hưởng của enzyme đến sự sẫm màu của táo tây


2. Mẫu xử lí với bromelin

3. Mẫu xử lí với ficin

Hình 5.10. Chế phẩm PPO thô từ lá trà

1 2 3

Documents

Phụ lục-cách pha 1 số dd đệm và phương pháp thí nghiệm