1 Tube per test

Product catalog No: 25242­00

Rea T­CountCD4/CD3Reagent

                                                                    

   Manufactured by 

     Rea T­Count Reagent­ CD4/CD3

1. INTENDED USE

The Rea T­Count reagent is a two color immunofluorescence reagent for   the   labeling   and   identification   of   helper/inducer   (CD3+CD4+)   T lymphocytes combined with a precise number of  fluorescent counting beads  for  absolute  CD4+ and CD3+ T­Cell  counts.    This   reagent   is intended  for   flow cytometry  based analysis   in  unlysed human whole blood samples.

2. BACKGROUND

The Rea T­Count reagent contains fluorescently labeled antibodies that bind   to   CD3   and   CD4   antigens   found   on   the  surface   of   circulating leukocytes. The CD3 antigen is a complex of at least six proteins known collectively as the T­cell receptor (TCR) complex. The antibody used in this   reagent  binds  to   the 20kDa  ε   chain  of   this  complex.  The CD4 

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antigen is a 59kDa protein.  It   interacts with class II molecules of  the major  histocompatibility   complex  and   is   the  primary   receptor   for   the Human Immunodeficiency Virus (HIV).Cells   that  are  both  CD3+ and CD4+ are  identified  as helper/inducer lymphocytes. Decreased CD4+CD3+ cell counts have been associated with some forms of immunodeficiency. 

3. Rea T­Count Reagent

The Rea T­Count reagent contains dried down reagents formulated in buffered saline,  sodium azide and stabilizers.  The   reagent  has CD4 monoclonal antibody (clone RPA­T4)  labeled with Phycoerythrin (PE) and   CD3   (clone   UCHT1)   monoclonal   antibody   labeled   with   PE­Dyomics649.

The  monoclonal  antibodies used   in   the Rea T­Count  were  assigned these   specificities   at   the   8th   International   Workshop   on   Human Leukocyte   Differentiation   Antigens.   A   precise   number   of   fluorescent counting   beads   are   included   in   each   tube   to   allow   single­platform determination of absolute CD4+ and T­cell  counts. The Rea T­Count 

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reagent   is   provided   in   dried   form   and   dispensed   in   FACSCountTM 

compatible  sample  tubes with  each unit   containing one  ready­to­use test.

Precautions

1. Warning: The Rea T­Count reagent contains sodium azide. Sodium azide is harmful  if swallowed. Wear suitable protective clothing. If swallowed,  seek  medical  advice   immediately.  Contact  with  acids liberates toxic gas. Azides should be flushed with large amounts of water during disposal to avoid deposits in lead or copper plumbing.

2. Warning:   All   blood   specimens   are   considered   bio­hazardous. Handle   them as  if   they are  capable  of   transmitting  infection and dispose   off   with   proper   precautions   and   in   accordance   with governmental regulations.

3. The addition of precise volume of blood is critical to obtain correct results.   Use   a   calibrated   pipette   and   operate   according   to   the manufacturer’s instructions.

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Storage and Handling

1. Store the reagent at room temperature in a dry place. Do not use the reagent after the expiry date on the label.

2. Do not freeze Rea T­Count reagent.3. The Rea T­Count reagent is light sensitive. Do not expose to direct 

light either during storage or when mixed with blood.

4. INSTRUMENT

The Rea T­Count   reagent   is  designed   to  be  used  on FACSCountTM 

manufactured by Becton Dickinson equipped with a convection cooled 540nm  laser   that   is  capable  of  detecting   two   fluorescent  colors  and measures relative cell size. The CD3 cells fluoresce red and CD4 cells fluoresce yellow. This instrument can be used for enumerating absolute lymphocyte   counts   namely;   helper/inducer   (CD3+CD4+).Instrument should   be   calibrated   by   setting   photomultiplier   tube   voltages, fluorescence   compensation,   and   checking   instrument   sensitivity according to the manufacturer’s guidelines.

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5. SPECIMEN COLLECTION

The blood sample should be collected in a sterile blood collection tube containing   K3EDTA.   Follow   the   collection   tube   manufacturer’s guidelines for the minimum volume of blood to be collected.

The anti­coagulated blood must be stored at room temperature (20°C ­ 25°C) and should be stained and analyzed within 24 hours of draw.  

Refrigerated,   hemolyzed,   and   previously   fixed   blood  specimens   can yield erroneous results and should be rejected.

6. PROCEDURE

Reagent Provided

1. Rea­T Count Reagent­ Part No: 25242­002. ReaFix Fixative solution (10X concentrate)­ Part No.:25325­003. ReaFix Diluent Solution­ Part No.:25326­00

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Refer to the ReaFix Fixative solution (10X) package insert for dilution instructions and warnings.

Reagents and materials required but not provided

1. Blood collection tube containing K3EDTA2. Calibrated pipettes3. Vortex mixer4. Becton Dickinson FACSCountTM  Instrument (Becton Dickinson Cat 

No: 337858)5. Sheath fluid (Becton Dickinson FACSFlow™ Catalog No. 340398 or 

equivalent)6. BD FACSCountTM Control kit (Becton Dickinson Cat No: 340166)7. BD FACSCountTM Reagent CD4/CD3 Kit to set up controls (Becton 

Dickinson Catalog No. 342512)

Preparation of Control Samples

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Follow   Manufacturer   instructions   for   setting   up   the   control   in   the FACSCountTM  Instrument  (Use BD FACSCountTM  Reagent  for setting the control)

Preparation of the patient samples

1. Blood samples must be collected in a (K3EDTA) vacutainer tube and be stored no longer than 48 hours at room temperature.

2. Take one reagent tube per patient from the foil bag containing the Rea T­count tubes. Reseal the foil bag and return unused reagent pairs to the appropriate place. DO NOT refrigerate the reagents.

3. Label the reagent with the sample number found on the blood tube.4. Mix patient blood by inverting the tube 5 times.5. Reverse Pipette 50 µL of whole blood into the reagent tubes. Use a 

new pipette tip for each tube.6. Cap the tubes and vortex vigorously for 30 seconds.7. Incubate   for   60   minutes   at   room  temperature.  Place   the   reagent 

tubes in the workstation and close the cover to protect the reagents from light.

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8. Uncap tubes and pipette 450 µL of ReaFix fixative solution into the reagent   tube.  Use  a  new  pipette   tip   for  each   tube.  Refer   to   the ReaFix Fixative solution (10X) package insert for dilution instructions to prepare 1X working ReaFix Fixative Solution

9. Recap the tubes and vortex for 15 seconds.10. Run the tubes on the FACSCountTM within 24 hours of preparation. 

Store samples at room temperature in the workstation until they are run on the instrument. Vortex upright for 5 seconds before running.

Entering patient information

1. Press [sample].2. Enter or verify reagent lot code and bead counts as provided on Rea T­

Count pouch.3. Press [confirm]4. Enter the patient accession number

Running patient samples

1. Vortex the reagent pairs for 15 seconds.

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2. Uncap the reagent tube and place the reagent tube in the sample holder so the CD4 tube is in the run position.

3. Press [run]

4. After a successful run the results will print out. If the sample fails review reported error and refer to BD FACSCountTM guide to rectify problem.

5. The patient results are displayed on the screen and automatically printed.

6. The sample printout contains the following information:

7. Reagent information­reagent lot code and reference bead counts entered for the sample run.  (This number should match the reagent lot code for the control run.)

8. Date (mm / dd / yy) and time the patient sample was run9. Control information­control run results, date controls were run, reagent lot 

code entered for the control run, control lot code.10. Patient accession number11. Patient results 

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12. Absolute Counts ­ cells/µl of CD4 & CD313. A sample report is attached below (Figure 1)14. Remove the reagent tube, recap the reagent tube and discard in the 

biohazard waste container.15. Repeat above steps until all patient samples have been run.16. Discard the reagent pair in an appropriate biohazard container.17. Shut down instrument as per manufacturer’s instructions.18. A sample report is generated after every sample run. The sample 

report is attached below (Refer Figure 1).

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Figure 1: Patient Sample Report

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7. LIMITATIONS

   1. The Rea T­Count reagent has only been validated with K3EDTA or K2EDTA treated whole blood.

8. WARRANTY

This product is warranted only to conform to the quantity and contents stated on the label at the time of delivery to the customer. There are no warranties, expressed or implied, that extend beyond the description on the label of the product. ReaMetrix sole liability is limited to replacement of   the product.  ReaMetrix   is  not   liable   for  property  damage,  personal injury, or economic loss caused by the product. 

Note: FACSCountTM is a registered trade name of Becton­Dickinson. 

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Manufactured by ReaMetrix India Pvt. Ltd.Manufacturing License Number: KTK/25/519/200650­B, II Phase, Peenya Industrial AreaPeenya, Bangalore 560058, IndiaPh: +91­80­28378693/5, Fax: +91­80­41172451E­mail: info@reametrix.com, 

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www.reametrix.com

Rev No. 3.0,  14­Oct­09

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