8/13/2019 PNAS 1995 Proc. Natl. Acad

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P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USAV o l . 9 2 , p p . 7 9 6 - 8 0 0 , J a n u a r y 1 9 9 5M e d i c a l S c i e n c e s

I n s i t u d e t e c t i o n , by s p i n t r a p p i n g , o f h y d r o x y l r a d i c a l markersproduced from i o n i z i n g r a d i a t i o n i n t h e tumor o f a l i v i n g m o u s eHOWARD J . H A L P E R N * t , CHENG Y U * t , EUGENE B A R T H * , MIROSLAV P E R I C * , A N D GERALD M. R o S E N I I* D e p a r t m e n t o f R a d i a t i o n a n d C e l l u l a r O n c o l o g y , U n i v e r s i t y o f C h ic a g o, C h ic a g o, I L 6 0 6 3 7 ; 1 D e p a r t m e n t o f P h a r m a c e u t i c a l S c i e n c e s , P r o g r a m i nP h a r m a c o l o g y a n d T o x i c o l o g y , U n i v e r s i t y o f M a r y l a n d S c h o o l o f P h a r m a c y , B a l t i m o r e , MD 2 1 2 0 1 ; a n d I l R e s e a r c h S e r v i c e , V e t e r a n s A f f a i r s M e d i c a l C e n t e r ,B a l t i m o r e , MD 2 1 2 0 1C o m m u n i c a t e d b y U . F a n o , T h e J a m e s F r a n c k I n s t i t u t e , T h e U n i v e r s i t y o f C h i c a g o , C h i c a g o , I L , O c t o b e r 3 , 1 9 9 4 ( r e c e i v e d f o r r e v i e wJ u n e 1 7 , 1 9 9 4 )ABSTRACT H y d r o x y l r a d i c a l s a r e t h o u g h t t o b e r e s p o n -s i b l e f o r t h e t o x i c i t y a s s o c i a t e d w i t h i o n i z i n g r a d i a t i o n i nt i s s u e s . M e a s u r e m e n t s o f h y d r o x y l r a d i c a l s g e n e r a t e d b yi o n i z i n g r a d i a t i o n i n c e l l u l a r s y s t e m s h a v e f a i l e d t h u s f a r t oe l u c i d a t e h i g h e r - l e v e l h o m e o s t a t i c r e s p o n s e s t o t h i s a n d o t h e rr e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s . C a r e f u l a s s e s s m e n t o f p r i o r i n d i r e c th y d r o x y l r a d i c a l a s s a y s i n l i v i n g t i s s u e s i n d i c a t e s t h a t t h e y a r ep r o n e t o a v a r i e t y o f a r t i f a c t s , m a k i n g a l l b u t t h e m o s tq u a l i t a t i v e r e l a t i o n s h i p s d i f f i c u l t t o e s t a b l i s h . T h i s p a p e rd e s c r i b e s t he d e t e c t i o n o f h y d r o x y l r a d i c a l s p r o d u c e d d u r i n gr a d i a t i o n i n t h e l e g t u m o r o f a l i v i n g m o u s e , w h e r e t h e f r e er a d i c a l s e v o l v e ; d e t e c t i o n u s e s l o w - f r e q u e n c y e l e c t r o n p a r a -m a g n e t i c r e s o n a n c e i n c o m b i n a t i o n w i t h i n v i v o s p i n t r a pp i n g .T o o u r k n o w le d ge , t h i s i s t h e f i r s t r e p o r t o f s u c h a d i r e c tm e a s u r e m e n t o f f r e e r a d i c a l p r o d u c t i o n i n t h e t i s s u e s o f al i v i n g a n i m a l .I o n i z i n g r a d i a t i o n g e n e r a t e s h y d r o x y l r a d i c a l s f r o m w a t e rt h r o u g h a p r o c e s s i n v o l v i n g a t l e a s t t w o s t e p s . T h e h i g h e s t -y i e l d p r o d u c t s a r e c o m m o n l y c h a r a c t e r i z e d a s f o l l o w s ( 1 )

H20 + h v H20 + e ( - > e a qH20t+ H20-* HO. + H 3 0 +

A l t h o u g h s i m i l a r e v e n t s a r e b e l i e v e d t o o c c u r i n l i v i n g t i s s u e se x p o s e d t o i o n i z i n g r a d i a t i o n , b i o c he m i c a l h o me o s t a t i c m e c h -a n i s m s a f f e c t t h e n e u t r a l i z a t i o n o f f r e e r a d i c a l s b e f o r e t h e y c a ne x e r t t h e i r e f f e c t s 2 , 3 ) . E l uc i d a t i o n o f s u p r a c e l l u l a r a s p e c t s o ft h e s e p a t h w a y s r e q u i r e s d i r e c t q u a n t i t a t i o n o f h y d r o x y l r a d i c a la n d o t h e r f r e e r a d i c a l s i n l i v i n g t i s s u e s . F o r e x a m p l e , d o e sr a d i a t i o n - i n d u c e d h y p e r e m i a l e a d t o a n i n c r e a s e o r d e c r e a s e i nt h e p r o d u c t i o n o f h y d r o x y l r a d i c a l s i n a s u b s e q u e n t r a d i a t i o nd o s e ? T i s s u e m e a s u r e m e n t s o f t h e s e e f f e c t s a r e n e c e s s a r y t ob r i d g e t h e g a p b e t w e e n c e l l u l a r a n d a n i m a l m o d e l s i n a s s e s s i n gt h e b i o l o g i c a l e f f e c t s o f i o n i z i n g r a d i a t i o n a n d t h e p h y s i o l o g i cr e s p o n s e s t o t h i s o x i d a n t s t r e s s .T h e s u b s t a n t i a l t e c h n i c a l d i f f i c u l t i e s i n v o l v e d h a v e p r e v i -o u s l y p r e v e n t e d d i r e c t m e a s u r e m e n t s o f h y d r o x y l r a d i c a l s i nl i v i n g t i s s u e . T h e p r o b l e m , s i m p l y s t a t e d , l i e s i n d e t e c t i n g , i na l i v i n g s y s t e m , a f r e e r a d i c a l t h a t r e a c t s w i t h e v e r y t h i n g i tcomes i n c o n t a c t w i t h a t n e a r d i f f u s i o n - c o n t r o l l e d r a t e s .B i o c h e m i c a l a s s a y s - i n c l u d i n g e t h y l e n e g e n e r a t i o n b y h y -d r o x y l r a d i c a l w i t h m e t h i o n a l ( 4 ) , m e t h a n e f o r m a t i o n f r o mr e a c t i o n w i t h d i m e t h y l s u l f o x i d e 5 , o r t h e p r o d u c t i o n o fc a r b o n d i o x i d e f r o m h y d r o x y l r e a c t i o n w i t h b e n z o a t e 6 ) - a r ei m p o s s i b l e i n l i v i n g t i s s u e a n d p r o b l e m a t i c i n v i t r o . T h ep r o d u c t i o n o f 8 - h y d r o x y g u a n i n e i n t i s s u e e x t r a c t s o r i t s mon-i t o r i n g i n t h e u r i n e o f l i v i n g a n i m a l s i s a n o n s p e c i f i c m a r k e r o fo x i d a t i v e s t r e s s s i n c e t h e p r e s e n c e o f o th e r m u t a g e n s n o td i r e c t l y a s s o c i a t e d w i t h h y d r o x y l r a d i c a l p r o d u c t i o n ( 7 - 9 ) may

g i v e t h e s a m e r e s u l t . T h e s a m e h o l d s f o r t h i o b a r b i t u r i c a c i d -r e a c t i n g s u b s t a n c e s ( 1 0 ) . F o r t h e b e t t e r p a r t o f a d e c a d e , weh a v e r e f i n e d t e c h n i q u e s t o a l l o w t h e d e t e c t i o n o f f r e e r a d i c a l si n l i v i n g a n i m a l s ( 1 1 - 1 3 ) , a n d n ow w e r e p o r t o u r i n i t i a l i n v i v oi n s i t u e x p e r i m e n t s d e t e c t i n g f r e e r a d i c a l s we b e l i e v e a r ed e r i v e d f r o m h y d r o x y l r a d i c a l s p r o d u c e d i n a n i r r a d i a t e dt u m o r o f a l i v i n g m o u s e .A m o n g t h e a v a i l a b l e m e t h o d s f o r i d e n t i f y i n g f r e e r a d i c a l s ,s p i n t r a p p i n g a n d d e t e c t i o n w i t h EPR s p e c t r o s c o p y h a s r e -c e i v e d c o n s i d e r a b l e a t t e n t i o n ( 1 4 - 1 7 ) . An E P R - s i l e n t n i t r o n eo r n i t r o s o c o m p o u n d r e a c t i n g w i t h a n i n i t i a l u n s t a b l e f r e er a d i c a l f o r m s a r e l a t i v e l y l o n g - l i v e d n i t r o x i d e f r e e r a d i c a la d d u c t - t h u s t r a p p i n g t h e e l e c t r o n s u n p a i r e d m o m e n t-w h i c h c a n b e d i r e c t l y o b s e r v e d i n t u r b i d s o l u t i o n s w i t h E PRs p e c t r o s c o p y a t a m b i e n t t e m p e r a t u r e ( 1 8 - 2 3 ) . S p i n t r a p p i n go f f e r s t h e o p p o r t u n i t y t o m e a s u r e a n d d i s t i n g u i s h s i m u l t a -n e o u s l y among a v a r i e t y o f i m p o r t a n t b i o l o g i c a l l y g e n e r a t e df r e e r a d i c a l s . H o w e v e r , c o n v e n t i o n a l X - b a n d E PR s p e c t r o s -c o p y i s s e n s i t i v e t o f r e e r a d i c a l s o n l y t o w i t h i n t h e f i r s tm i l l i m e t e r o f t h e s u r f a c e o f l i v i n g t i s s u e ( 2 4 ) . T e c h n i q u e s t oo v e r c o m e t h i s l i m i t a t i o n - r a p i d f r e e z i n g ( 2 5 ) , s a m p l e g r i n d i n g( 2 6 , 2 7 ) , c h e m i c a l e x t r a c t i o n o f s p i n - t r a p p e d a d d u c t s ( 2 8 ) , o rm e a s u r e m e n t s i n b i l e ( 2 9 , 3 0 ) o r b l o o d ( 3 1 ) o b t a i n e d f r o ml i v i n g a n i m a l s - a r e s u b j e c t t o a r t i f a c t s t h a t may m a s k t h eu n d e r l y i n g p h y s i o l o g y . T h e k e y t o d e t e c t i n g f r e e r a d i c a l sd i r e c t l y i n l i v i n g t i s s u e i s b a s e d o n d e v e l o p i n g a n E PR s p e c -t r o s c o p y c a p a b l e o f i d e n t i f y i n g t h e s e s p e c i e s d e e p i n e i t h e rhuman o r a n i m a l t i s s u e s ( 1 2 ) .D e t e c t i o n o f f r e e r a d i c a l s d e e p i n human t i s s u e s a n d t u m o r sr e q u i r e s r e s o r t i n g t o much l o w e r f r e q u e n c i e s t h a n a r e a v a i l a b l ew i t h t h e c o n v e n t i o n a l 1 0 - G H z X - b a n d s p e c t r o m e t e r , n a m e l y ,i n t h e r a n g e o f 1 0 0 t o 3 0 0 MHz ( 3 2 - 3 4 ) . To a c h i e v e t i s s u ep e n e t r a t i o n a n d f r e e r a d i c a l d e t e c t i o n i n human o r g a n s w ec h o s e t o d e v e l o p a b i n i t i o a l o w - f r e q u e n c y EPR s p e c t r o m e t e r( 1 2 ) . T h e f r e q u e n c y u s e d , 2 5 0 MHz, p e r m i t s m e a s u r i n g f r e er a d i c a l s a t a d e p t h o f 7 c m i n t i s s u e ( 1 2 , 3 2 - 3 4 ) , t h e r e b ya l l o w i n g d e t e c t i o n o f r a d i c a l s i n t h e t i s s u e w h e r e t h e y e v o l v e .T h i s a p p r o a c h m i n i m i z e s a r t i f a c t s a f f e c t i n g t e c h n i q u e s w i t hc o n v e n t i o n a l X - b a n d E PR s p e c t r o m e t e r s . R e c e n t l y we r e -p o r t e d t h e u s e o f s p i n t r a p p i n g t o i m a g e a n d i d e n t i f y h y d r o x y lr a d i c a l s p r o d u c e d b y i o n i z i n g r a d i a t i o n i n 1 0 - m l v o l u m e s o fb u f f e r e d s o l u t i o n s ( 3 5 ) . T h e s e s o l u t i o n s m i m i c t h e d i f f i c u l ts p e c t r o s c o p i c p e n e t r a b i l i t y o f l i v i n g t i s s u e . T h e same l o w -f r e q u e n c y - 2 5 0 - M H z - s p e c t r o m e t e r d e s c r i b e d h e r e a n d 5 , 5 -A b b r e v i a t i o n s : DMPO, 5 , 5 - d i m e t h y l - 1 - p y r r o l i n e 1 - o x i d e ; 4 - P O B N ,a - ( 4 - p y r i d y l 1 - o x i d e ) - N - t e r t - b u t y l n i t r o n e ; 4 - P O B N - C H O H ) C H 3 ,a - h y d r o x y e t h y l - ( 4 - p y r i d y l 1 - o x i d e ) m e t h y l - N - t e r t - b u t y l n i t r o x i d e ;DTPA, d i e t h y l e n e t r i a m i n e p e n t a a c e t i c a c i d .t T o w h o m r e p r i n t r e q u e s t s s h o u l d b e a d d r e s s e d .t P r e s e n t a d d r e s s : N o r r i s C a n c e r R e s e a r c h I n s t i t u t e , D e p a r t m e n t o fR a d i a t i o n O n c o l o g y , 1 4 4 1 E a s t L a k e A v e n u e , L o s A n g e l e s , C A9 0 0 3 3 . P r e s e n t a d d r e s s : D e p a r t m e n t o f P h y s i c s a n d A s t r o n o m y , C a l i f o r n i aS t a t e U n i v e r s i t y a t N o r t h r i d g e , 1 8 1 1 1 N o r d h o f f S t r e e t , N o r t h r i d g e ,C A 9 1 3 3 0 .

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T h e p u b l i c a t i o n c o s t s o f t h i s a r t i c l e were d e f r a y e d i n p a r t b y p a g e c h a r g ep a y m e n t . T h i s a r t i c l e m u s t t h e r e f o r e b e h e r e b y m a r k e d a d v e r t i s e m e n t i na c c o r d a n c e w i t h 1 8 U . S . C . 1 7 3 4 s o l e l y t o i n d i c a t e t h i s f a c t .

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P r o c . N a t l . A c a d S c L USA 9 2 ( 1 9 9 5 ) 7 9 7d i p e r d e u t e r o m e t h y l - 2 , 3 , 3 , 4 , 4 - 2 H 5 ) - 1 - p y r r o l i n e 1 - o x i d e D M P O - d 1 1 ) a n d 5 , 5 - d i m e t h y l - ( 2 , 3 , 3 - 2 H 3 ) - 1 - p y r r o l i n e 1 - o x i d e D M P O - d 3 ) s p i n t r a p s w e r e u s e d . D e u t e r a t i o n s i m p l i f i e d t h es p e c t r a l s i g n a t u r e D M P O - d 3 ) , a n d f u l l d e u t e r a t i o n (DMPO-d 1 l ) i n c r e a s e d t h e s i g n a l i n t e n s i t y . T h i s a l l o w e d t h e d e f i n i t i o no f t h e B r e i t - R a b i s p e c t r o s c o p i c s h i f t s i n t h e s p e c t r a o f s p i n -t r a p a d d u c t s a n d t h e i r d e t e c t i o n w i t h a s l i t t l e a s 1 5 Gy o fr a d i a t i o n . T h e s e s t u d i e s e s t a b l i s h e d t h e p o s s i b i l i t y o f i n v i v os p i n t r a p p i n g ( 3 5 ) .

S p i n t r a p p i n g i n v i v o i s r e s t r i c t e d b y t h e m o d e s t s i g n a l f r o ml o w - f r e q u e n c y EPR a n d b y t h e l o w c o n c e n t r a t i o n o f f r e er a d i c a l s w h o s e b i o l o g i c h a l f - l i f e i s l i m i t e d ( 3 5 ) . D e u t e r a t i o n o ft h e s p i n t r a p e n h a n c e s t h e s e n s i t i v i t y t o w a r d s u p e r o x i d e a n dh y d r o x y l r a d i c a l s , b u t t h e s t a b i l i t y o f t h e s p i n - t r a p a d d u c t ss e e m s i n s u f f i c i e n t t o a l l o w t h e i r i d e n t i f i c a t i o n i n t h e r e d u c t i v ee n v i r o n m e n t o f l i v i n g t i s s u e s ( 3 5 , 3 6 ) . H o w e v e r , r e c e n t r e p o r t s( 3 7 , 3 8 ) s u g g e s t e d t h a t n i t r o x i d e s , d e r i v e d f r o m t h e s p i nt r a p p i n g o f a l k y l f r e e r a d i c a l s b y a - p h e n y l - N - t e r t - b u t y l n i t r o n e P B N ) , m i g h t b e s t a b l e i n v i v o , t h e r e b y i n c r e a s i n g t h e c u m u -l a t i v e n i t r o x i d e c o n c e n t r a t i o n . We d e t e r m i n e d t h a t a d d i t i o n o fe x c e s s e t h a n o l t o a n h y d r o x y l r a d i c a l - g e n e r a t i n g s y s t e m p r o -d u c e s a - h y d r o x y e t h y l r a d i c a l s ( 3 9 ) . I n t h e p r e s e n c e o f a - ( 4 -p y r i d y l 1 - o x i d e ) - N - t e r t - b u t y l n i t r o n e 4 - P O B N ) , we o b s e r v e da n EPR s p e c t r u m c h a r a c t e r i s t i c o f a - h y d r o x y e t h y l - ( 4 - p y r i d y l1 - o x i d e ) m e t h y l - N - t e r t - b u t y l n i t r o x i d e [ 4 - P O B N - C H O H ) -C H 3 ] ( 4 0 , 4 1 ) . T h i s r e a c t i o n a p p e a r s s p e c i f i c f o r t h e h y d r o x y lr a d i c a l . T h e s e c o n d - o r d e r r a t e c o n s t a n t f o r t h e r e a c t i o n o fa - h y d r o x y e t h y l w i t h 4-POBN w a s c a l c u l a t e d t o b e 3 . 1 x 1 0 7M-1 s - 1 ( 4 1 ) . I n a d d i t i o n , 4-POBN-CH(OH)CH3 d i s p l a y e dr e m a r k a b l e s t a b i l i t y , a p p e a r i n g t o b e r e l a t i v e l y u n a f f e c t e d b yt h e p r e s e n c e o f h i g h f l u x e s o f s u p e r o x i d e a n d o f o t he r p o t e n -t i a l r e d o x - a c t i v e a g e n t s ( 4 0 ) . F i n a l l y , t h e 4 - P O B N / E t O Hs p i n - t r a p p i n g s y s t e m p r o v e s t o b e 1 0 t i m e s more s e n s i t i v e t oh y d r o x y l r a d i c a l f o r m a t i o n t h a n i s DMPO/EtOH ( 4 1 ) , t h u ss e r v i n g a s a n e x c e l l e n t s p i n - t r a p p i n g s y s t e m t o d e t e c t h y d r o x y lr a d i c a l w h i c h m i g h t e v o l v e f r o m t h e r a d i a t i o n o f a m u r i n etumor i n a l i v i n g m o u s e . We c h o s e a n e x t r e m i t y t u m o r s y s t e mf o r t h e s e i n i t i a l e x p e r i m e n t s t o d e l i v e r h i g h , t o x i c d o s e s o fr a d i a t i o n t o a s u b s t a n t i a l b u l k o f t i s s u e w i t h m i n i m a l e f f e c t o nt h e p h y s i o l o g y o f t h e r e s t o f t h e a n i m a l .

M A T E R I A L S AND METHODSM a t e r i a l s . D i e t h y l e n e t r i a m i n e p e n t a a c e t i c a c i d D T P A )was p u r c h a s e d f r o m S i g m a . M o n o b a s i c a n d d i b a s i c s o d i u mp h o s p h a t e w e r e p u r c h a s e d f r o m J . T . B a k e r . B u ff e r s w e r ep a s s e d t h r o u g h a c o l u m n l o a d e d w i t h C h e l e x 1 0 0 f r o m B i o -R a d . T h e y w e r e t i t r a t e d t o a pH o f 7 . 8 a n d a d j u s t e d t o ac o n c e n t r a t i o n o f 5 0 m M . R e a g e n t g r a d e e t h y l a l c o h o l ( 2 0 0p r o o f ) w a s p u r c h a s e d f r o m M i d w e s t G r a i n P r o d u c t s ( P e k i n ,I L ) ; ( 1 - 1 3 C ) e t h y l a l c o h o l C H 3 1 3 C H 3 O H ) was p u r c h a s e d f r o mC a m b r i d g e I s o t o p e L a b o r a t o r i e s C a m b r i d g e , M A ) ; a n d4-POBN w a s p u r c h a s e d f r o m A l d r i c h a n d u s e d w i t h o u t f u r t h e rp u r i f i c a t i o n . 3 - T r i m e t h y l a m i n o m e t h y l - 2 , 2 , 5 , 5 - t e t r a m e t h y l - 1 -p y r r o l i d i n y l o x y l i o d i d e w a s s y n t h e s i z e d a c c o r d i n g t o t h e m e t h -

o d s o f S . P o u , P . L . D a v i s , G . L . W o l f , a n d G . M . R . u n p u b -l i s h e d r e s u l t s ) . U s e o f t h e c h e l a t o r DTPA a n d e l i m i n a t i n gm e t a l i o n s f r o m b u f f e r s w i t h C h e l e x 1 0 0 e n s u r e d t h e s t a b i l i t yo f o u r s p i n - t r a p p i n g s o l u t i o n s b e f o r e t h e i r u s e .I n s t r u m e n t a l C o n d i t i o n s . A l o w - f r e q u e n c y EPR s p e c t r o m -e t e r p r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( 2 2 ) was o p e r a t e d a t 2 6 0 M Hz g =2 f i e l d o f 9 3 G ) . A t t h i s f r e q u e n c y , t h e s k i n d e p t h 3 7s e n s i t i v i t y ) i s a p p r o x i m a t e l y 7 c m o f t i s s u e . T h e s p e c t r o m e t e rc o n s i s t s o f a l u m p e d - c i r c u i t p a r a l l e l i n d u c t a n c e a n d c a p a c i -t a n c e r e s o n a t o r w i t h a s i n g l e - t u r n i n d u c t a n c e p r o v i d e d b y t h es a m p l e h o l d e r . T h e b a l a n c e d c a p a c i t i v e c o u p l i n g , a d j u s t a b l ee l e c t r o n i c a l l y , a l l o w s c o r r e c t i n g f o r a n i m a l m o t i o n a n d m i c r o -p h o n i c - i n d u c e d v a r i a t i o n s i n t h e c o u p l i n g o v e r f r e q u e n c yr a n g e s o f s e v e r a l h u n d r e d H z . T h e r e s o n a t o r f o r t h e s e e x p e r -i me n t s w a s f a b r i c a t e d f r o m ABS p l a s t i c r e s i n G PX 3 7 0 0

G e n e r a l E l e c t r i c ) e l e c t r o p l a t e d w i t h c o p p e r a n d g o l d G e n -e r a l S u p e r p l a t i n g , E a s t S y r a c u s e , N Y ) . I t s s e n s i t i v e v o l u m ec o n s i s t s o f a c y l i n d e r 1 . 5 cm t h i c k a n d 1 . 6 cm i n d i a m e t e r . T h i sv o l u m e i s j u s t s u f f i c i e n t t o a c c o m m o d a t e t h e m o u s e l e g a n d i t st u m o r . T h e r e s o n a t o r c h a r a c t e r i s t i c s p r o v i d e , f o r t h e m o u s el e g a n d t u m o r , a r a d i o f r e q u e n c y m a g n e t i c f i e l d ( B 1 ) o f 0 . 2 7 G ,w i t h a p o w e r o f 1 5 m W, a t a l o a d e d Q ( q u a l i t y f a c t o r ) o fa p p r o x i m a t e l y 1 8 0 . T h e m o d u l a t i o n f r e q u e n c y w a s 5 . 1 2 k H z ,w i t h a f i e l d a m p l i t u d e o f 1 . 2 G . D a t a a c q u i s i t i o n w a s a c c o m -p l i s h e d u n d e r t h e c o n t r ol o f a m i c r o c o m p u t e r . S p e c t r a w e r eo b t a i n e d w i t h 2 4 6 p o i n t s p e r s c a n , 2 s c a n s p e r s p e c t r u m . T h et i m e c o n s t a n t a n d p o i n t a c q u i s i t i o n t i m e w e r e 0 . 1 s , y i e l d i n g as p e c t r a l a c q u i s i t i o n t i m e o f a p p r o x i m a t e l y 1 m i n .M o d e l S a m p l e P r e p a r a t i o n . To a 0 . 7 5 - m l s a m p l e o f 5 0 mMs o d i u m p h o s p h a t e b u f f e r 4-POBN 2 5 0 mM), e t h y l a l c o h o l( 0 . 8 5 M ) , a n d DTPA ( 1 m M ) w e r e a d d e d a n d s u b j e c t e d t o 3 0 0 0Gy o f r a d i a t i o n f r o m a G a m m a c e l l 2 2 0 6 0 C o s m a l l v o l u m er a d i a t o r A E C L , V i l l e d e L a v a l l e , P Q , C a n a d a ) a t a d o s e r a t eo f 2 . 1 G y / s . T h e s a m p l e w a s e x p o s e d i n a p o l y e t h y l e n e v i a l a n dt r a n s f e r r e d t o a s e c o n d v i a l t h a t p a r t i a l l y a p p r o x i m a t e l y 25b y v o l u m e ) f i l l e d t h e r e s o n a t o r i n s t a l l e d i n t h e l o w - f r e q u e n c yEPR s p e c t r o m e t e r . A s e c o n d s a m p l e w a s p r e p a r e d a s a b o v eb u t s u b s t i t u t i n g ( 1 - 1 3 C ) e t h y l a l c o h o l f o r n a t u r a l - a b u n d a n c ee t h y l a l c o h o l .Mouse Tumor R a d i a t i o n C o n d i t i o n s . T h e t u m o r m o d e l i nt h e s e e x p e r i m e n t s w a s t h e NFSa f i b r o s a r c o m a ( 4 2 ) , w h o s ei n i t i a l c e l l s w e r e k i n d l y p r o v i d e d b y C a t h e r i n e Mason a n dL u k a M i l a s o f t h e M . D . A n d e r s o n H o s p i t a l , H o u s t o n . C e l l s( 0 . 5 - 1 . 0 x 1 0 6 ) w e r e i m p l a n t e d s u b c ut a n e o us l y i n t h e l e g s o fC3 H m i c e a n d g r o w n t o a d i a m e t e r o f 1 2 m m . F o r a l le x p e r i m e n t s , t h e t u m o r - b e a r i n g C 3 H / s e d mouse w a s a n e s t h e -t i z e d w i t h d i a z e p a m ( 2 0 m g / k g ) a n d k e t a m i n e ( 4 5 m g / k g ) f o ri r r a d i a t i o n a n d s p e c t r a l a c q u i s i t i o n . S e v e r a l e x p e r i m e n t s w e r ep e r f o r m e d w i t h 3 - t r i m e t h y l a m i n o m e t h y l - 2 , 2 , 5 , 5 - t e t r a m e t h y l -1 - p y r r o l i d i n y l o x y l i o d i d e t o m o n i t o r t h e e f f l u x f r o m t h e t u m o ro f a s t a b l e n i t r o x i d e c o m p o u n d w i t h a p h a r m a c o l o g i c c o m -p a r t m e n t a l d i s t r i b u t i o n s i m i l a r t o t h a t o f 4-POBN-C H O H ) C H 3 . On t h e b a s i s o f o c ta n ol p a r t i t i o n c o e f f i c i e n t s( s e e b e l o w ) b o t h t h i s n i t r o x i d e a n d t h e s p i n - t r a p a d d u c ta p p e a r t o b e q u i t e h y d r o p h i l l i c . A v o l u m e o f 0 . 2 m l o f 3 0 mMs o l u t i o n o f t h i s n i t r o x i d e w a s i n j e c t e d d i r e c t l y i n t o t h e t u m o ra n d s p e c t r a w e r e o b t a i n e d . T h e s p i n - t r a p p i n g s o l u t i o n c o n -s i s t e d o f 5 0 mM s o d i u m p h o s p h a t e b u f f e r w i t h 5 0 0 mM4 - P O B N , 1 . 7 M e t h y l a l c o h o l , a n d 1 mM DTPA. A v o l u m e o f0 . 2 3 m l o f t h e s p i n - t r a p p i n g s o l u t i o n w a s i n j e c t e d i n t r a t u m o r -a l l y i n 3 0 s w i t h v e r y m o d e s t l o s s , l e s s t h a n 0 . 0 4 m l . F o r o n eg r o u p o f e x pe r i m e nt s m o n i t o r i n g t h e n i t r o x i d e e f f l u x f r o m at u m o r a f t e r i n t r a t u m o r a l i n j e c t i o n s a n d f o r e x p e r i m e n t s w i t ht h e s p i n - t r a p p i n g s o l u t i o n , a t o u r n i q u e t o f 0 - s i l k s u t u r e w a sa p p l i e d t o t h e l e g p r o x i m a l t o t h e t u m o r a n d p u l l e d t i g h t 5 0 sa f t e r t h e s t a r t o f t h e i n t r a t u m o r a l i n j e c t i o n . T h e mouse w a sp l a c e d i n a G a m m a c e l l 2 2 0 6 0 C o r a d i a t o r p r o d u c i n g a d o s e o f2 . 1 0 . 2 G y / s a t t h e t u m o r . A c y l i n d e r o f l e a d a n d C e r r o b e n d( l e a d / t i n / b i s m u t h a l l o y ) s h i e l d e d t h e m o u s e , r e d u c i n g t h ed o s e t o i t s b o d y b y a f a c t o r o f 4 0 ( 5 . 3 h a l f - v a l u e l a y e r s ) . Endc a p s o n t h e s h i e l d w e r e s p l i t a n d a h a l f c i r c l e w a s h o l l o w e df r o m e a c h s i d e , a l l o w i n g p a s s a g e o f t h e mouse t h i g h . T h ee x p o s e d t u m o r w a s w r a p p e d i n 0 . 5 c m o f t i s s u e - e q u i v a l e n tm a t e r i a l ( S u p e r f l a b ; A l i m e d , D e d h a m , M A) t o a l l o w d o s eb u i l d u p . A i r w a s c i r c u l a t e d i n t h e r a d i a t o r d u r i n g i r r a d i a t i o n .T h e mouse d i d n o t l i e d i r e c t l y o n m e t a l s u r f a c e s . P r i o rm e a s u r e m e n t s u n d e r s i m i l a r c o n d i t i o n s i n d i c a t e t h e mousec o r e t e m p e r a t u r e t o h a v e r e m a i n e d a b o v e 3 2 C . R a d i a t i o nb e g a n 5 m i n a f t e r t h e i n j e c t i o n b e g a n . T h e e x p o s u r e l a s t e d 2 3m i n a n d 4 8 s , p r o d u c i n g a d o s e o f 3 0 0 0 3 0 0 G y .Tumor S p e c t r a l A c q u i s i t i o n C o n d i t i o n s . F o r t u m o r r a d i a -t i o n m e a s u r e m e n t s , t h e s p e c t r o m e t e r w a s r o u g h l y t u n e d w i t ht h e a n e s t h e t i z e d mouse i n p l a c e a n d i t s t u m o r w a s c e n t e r e d i nt h e r e s o n a t o r p r i o r t o s p i n - t r a p i n j e c t i o n a n d t u m o r r a d i a t i o n .T h u s , t h e s p e c t r a l s e n s i t i v i t y i s l o c a l i z e d t o t h e h e a v i l y i r r a d i -

M e d i c a l S c i e n c e s : H a l p e r n e t a L

8/13/2019 PNAS 1995 Proc. Natl. Acad

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7 9 8 M e d i c a l S c i e n c e s : H a l p e r n e t a La t e d tumor a n d t h e l e g i n t h e i m m e d i a t e v i c i n i t y . T h e mousew a s g e n t l y r e s t r a i n e d i n a s p e c i a l a c r y l i c i m m o b i l i z a t i o n j i gd e s i g n e d t o m e c h a n i c a l l y d e c o u p l e t h e l i v i n g a n i m a l s a m p l ef r o m t he r e s o n a t o r . T h e e l a s t o p l a s t l i m b r e s t r a i n t s a l s ow r a p p e d a b o u t p e g s t h a t f i t t i g h t l y i n t o h o l e s i n t h e j i g , a l l o w i n ga r e p r o d u c i b l e s e t u p . A f t e r r a d i a t i o n , t h e mouse w a s t r a n s -p o r t e d f r o m t h e r a d i a t o r a n d i t s t u m o r w a s i n s t a l l e d i n t h eEPR r e s o n a t o r . S p e c t r a l a c q u i s i t i o n b e g a n 8 . 5 m i n a f t e r t h ee n d o f r a d i a t i o n . T h e mouse l e g a n d t u m o r t e m p e r a t u r e w a sm a i n t a i n e d a t 3 7 . 0 0 . 5 C b y r a d i a n t h e a t i n g f r o m t w oo p p o s e d h e a t l a m p s .S p e c t r a l S i m u l a t i o n . T h e E PR s p e c t r u m o b t a i n e d f r o m t h er a d i a t e d s a m p l e , i n c l u d i n g 4-POBN a n d t h e n a t u r a l -a b u n d a n c e c a r b o n e t h y l a l c o h o l i n b u f f e r , w a s s i m u l a t e d w i t ha s p e c t r a l m o d e l c o n s i s t i n g o f s i x l i n e s e a c h ( a n i t r o g e n t r i p l e ta n d ( 3 - h y d r o g e n d o u b l e t ) , a s t h e s p e c t r u m e x p e c t e d f r o m4 - P O B N - C H O H ) C H 3 . E a c h l i n e c o n s i s t e d o f a w e i g h t e d sumo f L o r e n t z i a n a n d G a u s s i a n l i n e s 9 0 L o r e n t z i a n , 10G a u s s i a n ) w i t h 1 - G p e a k - t o - p e a k l i n e w i d t h s . As d e t a i l e de l s e w h e r e ( 3 5 ) , l o w - f r e q u e n c y s p e c t r a d i s p l a y l a r g e B r e i t - R a b is h i f t s i n t h e i n d i v i d u a l s p e c t r a l l i n e p o s i t i o n s r e l a t i v e t o s p e c t r ao b t a i n e d a t h i g h f r e q u e n c y . T h e s e s h i f t s w e r e e v a l u a t e d b yu s i n g t h e f u l l B r e i t - R a b i h y p e r f i n e m a t r i x . B e c a u s e t h e c u m -b e r s o m e B r e i t - R a b i m a t r i x s o l u t i o n s m a d e i t e r a t i v e f i t t i n gd i f f i c u l t f o r t h e a c t u a l s p l i t t i n g s w i t h g i v e n h y p e r f i n e c o n -s t a n t s , t h e g o o d n e s s - o f - f i t o f t h e s i m u l a t i o n w a s j u d g e db y e y e . A 1 2 - l i n e s p e c t r u m d e s c r i b e s t h e 4 - P O B N - 1 3 C H O H ) -C H 3 [ a - h y d r o x y - ( a - 1 3 C ) e t h y l - ( 4 - p y r i d y l 1 - o x i d e ) m e t h y l - N -t e r t - b u t y l n i t r o x i d e ] s p e c t r u m w i t h t h e a d d i t i o n a l a - 1 3 C s p l i t -t i n g . A 25 G a u s s i a n c o m p o n e n t f o r e a c h 1 - G l i n e w i d t h g a v ea n o p t i m a l f i t .O c t a n o l P a r t i t i o n C o e f f i c i e n t M e a s u r e m e n t . H P L C - g r a d ew a t e r J . T . B a k e r ) w a s m i x e d w i t h EtOH 5 a n d 1 0 ,v o l / v o l ) a n d 4-POBN ( 2 5 0 a n d 5 0 0 mM, r e s p e c t i v e l y ) a n d t h et w o s o l u t i o n s were i r r a d i a t e d t o 3 0 0 0 G y . T h e r e s u l t i n gs o l u t i o n s were s e p a r a t e d i n t o t w o s a m p l e s e a c h . S p e c t r a f r o mo n e o f e a c h s u b s a m p l e s w e r e o b t a i n e d f r o m a s t a n d a r d X - b a n ds p e c t r o m e t e r J E O L J E S M E - 1 X ) o p e r a t e d a t 1 -mW p o w e r ,0 . 5 - G m o d u l a t i o n f i e l d , 1 0 0 - k H z m o d u l a t i o n f r e q u e n c y , a n d at i m e c o n s t a n t o f 1 s , r e q u i r i n g 4 m i n f o r a 5 0 - G f i e l d s w e e p . T h es e c o n d s u b s a m p l e w a s m i x e d 50 v o l / v o l w i t h o c t a n o l a n dm a n u a l l y s h a k e n i n a b e a k e r f o r 3 0 m i n . A n i d e n t i c a l v o l u m eo f t h e w a t e r l a y e r t h a t f o r m e d i n t h e b e a k e r a f t e r s h a k i n g wasu s e d f o r E PR s p e c t r a . T h e h e i g h t s o f t h e s p e c t r a w e r e m e a -s u r e d . T h e o c t a n o l p a r t i t i o n c o e f f i c i e n t was t h e d i f f e r e n c e o ft h e s p e c t r a l h e i g h t s d i v i d e d b y t h e h e i g h t o f t h e i n i t i a l w a t e rs a m p l e . T h e o c t a n o l p a r t i t i o n c o e f f i c i e n t o f t h e q u a t e r n a r yammonium n i t r o x i d e was o b t a i n e d s i m i l a r l y .

RESULTS A N D DISCUSSIONT h e s p e c t r u m o b t a i n e d f r o m 4-POBN p l u s EtOH i r r a d i a t e dw i t h 3 0 0 0 G y i n b u f f e r i s s h o w n i n F i g . 1 A a b o v e a s i m u l a t i o no f t h e s p e c t r u m b a s e d o n t h e h y p e r f i n e s p l i t t i n g c o n s t a n t s AN= 1 5 . 8 + 0 . 1 G a n d A H = 2 . 5 + 0 . 1 G , w h i c h i s c o n s i s t e n t w i t ht h o s e o b t a i n e d a t c o n v e n t i o n a l f r e q u e n c i e s ( X - b a n d ) f o r4 - P O B N - C H O H ) C H 3 A N = 1 5 . 7 5 G a n d A H = 2 . 4 G ) ( 4 1 ) .S u b s t i t u t i n g C H 3 1 3 C H 2 O H f o r EtOH i n t h e a b o v e r e a c t i o np r o d u c e d t h e s p e c t r u m o f F i g . 1 B , w h i c h i s s h o w n a b o v e as p e c t r a l s i m u l a t i o n b a s e d on s p l i t t i n g c o n s t a n t s AN = 1 5 . 8 +0 . 1 G , A H = 2 . 5 0 . 1 G , a n d A 1 3 c = 4 . 0 0 . 2 G . A g a i n , t h e s ea r e c o n s i s t e n t w i t h X - b a n d m e a s u r e m e n t s A N = 1 5 . 7 5 G , AH= 2 . 4 G , a n d A 1 3 c = 3 . 7 5 G ) o f a 4 - P O B N / C H 3 1 3 C H 2 O Hs a m p l e s u b j e c t e d t o h y d r o x y l r a d i c a l s p r o d u c e d i n a n e n t i r e l yd i f f e r e n t f a s h i o n ( 4 1 ) . T h i s s u b s t i t u t i o n v e r i f i e s t h a t t h e s p e c -trum f r o m t h e i r r a d i a t e d s o l u t i o n o b t a i n e d f r o m E t O H / 4 -POBN a r i s e s f r o m i t h e r e a c t i o n o f h y d r o x y l w i t h EtOH t og i v e a - h y d r o x y e t h y l r a d i c a l a n d i i t h e s p i n t r a p p i n g o fa - h y d r o x y e t h y l r a d i c a l b y 4 - P O B N . I n b u f f e r , t h e h a l f - l i f e o f4 - P O B N - C H O H ) C H 3 s i g n a l was f o u n d t o b e 9 d a y s . We

A

B

F I G . 1 . ( A ) L o w - f r e q u e n c y E PR s p e c t r u m f r o m 4 - P O B N / 5E t O H / 1 mM DTPA i n s o d i u m p h o s p h a t e b u f f e r s u b j e c t e d t o 3 0 0 0 G yo f y r a d i a t i o n . S i m u l a t i o n o f t h e d a t a w i t h l i t e r a t u r e h y p e r f i n e s p l i t t i n gc o n s t a n t s ( 3 0 ) i s s h o w n u n d e r t h e s p e c t r a l d a t a . T h e b e s t s p l i t t i n gc o n s t a n t s w e r e AN = 1 5 . 8 + 0 . 1 G a n d A H = 2 . 5 0 . 1 G , c o n s i s t e n tw i t h p u b l i s h e d v a l u e s f o r t h e s p l i t t i n g s f o r 4 - P O B N - C H O H ) C H 3 : AN= 1 5 . 7 5 G,AH = 2 . 4 G ( 4 1 ) . ( B ) L o w - f r e q u e n c y EPR s p e c t r u m f r o ma 1 - m l s a m p l e p r e p a r e d a s d e s c r i b e d f o r A e x c e p t t h a t C H 3 1 3 C H 2 0 Hw a s s u b s t i t u t e d f o r E t O H . S p e c t r a l a c q u i s i t i o n w a s a l s o u n d e r i d e n t i c a lc o n d i t i o n s . T h e s i m u l a t i o n o f t h e s p e c t r u m i s s h o w n b e l o w t h e s p e c t r a ld a t a . T h e s p l i t t i n g c o n s t a n t s w e r e AN = 1 5 . 8 + 0 . 1 G,AH = 2 . 5 0 . 1G , a n d A 1 3 C = 4 . 0 0 . 3 G , a g a i n c o n s i s t e n t w i t h t h o s e p r e v i o u s l yp u b l i s h e d v a l u e s a t X - b a n d : AN 1 5 . 7 5 G , AH = 2 . 4 G , a n d A 1 3 C =3 . 7 5 G ( 4 1 ) .m e a s u r e d t h e o c t a n o l p a r t i t i o n c o e f f i c i e n t o f 4-POBN-CH(OH)CH3 t o b e 0 . 2 2 0 . 0 1 . T h a t o f t h e q u a t e r n a r yammonium n i t r o x i d e was < 0 . 0 2 . B o t h a r e t h e r e f o r e h y d r o -p h i l i c .I n a s e r i e s o f p r e l i m i n a r y e x p e r i m e n t s ( d a t a n o t s h o w n )w h e r e t h e t u m o r w a s r a d i a t e d w i t h 3 0 0 0 G y , r e q u i r i n g a p p r o x -i m a t e l y 2 5 m i n , n o E PR s i g n a l w a s d e t e c t e d . We c o n j e c t u r e dt h a t o n c e w e i n j e c t e d 4-POBN i n t o t h e t u m o r , r a p i d d i s t r i b u -t i o n f r o m t h e s i t e o f i n j e c t i o n m a d e i t d i f f i c u l t t o d e t e c t

P r o c . N a t l . Acad S c i . USA 9 2 ( 1 9 9 5 )

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P r o c . N a t L Acad S c i . USA 9 2 ( 1 9 9 5 ) 7 9 94-POBN-CH(OH)CH3 i n t h e t u m o r 2 5 m i n l a t e r . I n o t h e rs t u d i e s we w e r e a b l e t o c h a n g e t h e h a l f - l i f e o f c e r t a i n n i t r o x -i d e s i n t i s s u e p e r f u s a t e b y s t o p p i n g p e r f u s a t e f l o w ( 1 1 ) . Tod e t e r m i n e w h e t h e r a s i m i l a r a p p r o a c h c o u l d h e l p m a i n t a i n t h eEPR s i g n a l i n t i s s u e f o r o u r i n v i v o s t u d i e s , we i n j e c t e d ac h a r g e d n i t r o x i d e ( 0 . 2 m l o f 3 0 mM 3 - t r i m e t h y l a m i n o m e t h y l -2 , 2 , 5 , 5 - t e t r a m e t h y l - 1 - p y r r o l i d i n y l o x y l i o d i d e ) , w h o s e o c t a n o lp a r t i t i o n c o e f f i c i e n t m i m i c s t h a t o f 4 - P O B N - C H O H ) C H 3 ,i n t o a 1 2 - m m NFSa f i b r o s a r c o m a i m p l a n t e d i n t h e l e g o f aC3 H m o u s e . T h e s i g n a l h a l f - l i f e w a s f o u n d t o b e 8 m i n .H o w e v e r , a t o u r n i q u e t , c o n s i s t i n g o f h e a v y s u r g i c a l s u t u r e( 0 - s i l k ) p l a c e d p r o x i m a l t o t h e t u m o r , i n c r e a s e d t h e h a l f - l i f e t o3 5 m i n .W i t h t he m o u s e a n e s t h e t i z e d , a 12-mm t u m o r i n t h e l e g w a si n j e c t e d d i r e c t l y w i t h a s o l u t i o n ( 0 . 2 m l ) o f 4-POBN/EtOH 5 0 0 mM 4-POBN i n 5 0 mM s o d i u m p h o s p h a t e b u f f e r c o n -t a i n i n g 1 mM DTPA a n d 1 . 7 M E t O H ) . T h e t o u r n i q u e t w a si m m e d i a t e l y a p p l i e d t o t h e l e g j u s t p r o x i m a l t o t h e t u m o r . T h em o u s e w a s t h e n f i t t e d i n t o i t s r a d i a t i o n s h i e l d , e x p o s i n g o n l yt h e l e g c o n t a i n i n g t h e t u m o r , a n d t h e t u m o r w a s t r e a t e d w i t h3 0 0 0 Gy o f r a d i a t i o n . A f t e r t r e a t m e n t , t h e t u m o r - b e a r i n gp o r t i o n o f t h e m o u s e l e g w a s f i t t e d i n t o a r e s o n a t o r i n t h el o w - f r e q u e n c y EPR s p e c t r o m e t e r ( F i g . 2 ) a n d EPR s p e c t r aw e r e r e c o r d e d . T h e s p e c t r u m i s s h o w n i n F i g . 3 w i t h as i m u l a t i o n a s i n F i g . 1 A . We c o n t i n u e d t o r e c o r d s p e c t r a f o ra n o t h e r 2 0 m i n , u n t i l n o i s e c o m p l e t e l y o v e r w h e l m e d t h ec h a r a c t e r i s t i c s i g n a l o f 4 - P O B N - C H O H ) C H 3 . R a d i a t i o n o f

F I G . 2 . Mouse l e g tumor s i t u a t e d i n t h e l o w - f r e q u e n c y E PRs p e c t r o m e t e r r e s o n a t o r . W i t h c u r r e n t i m mo b i l iz a t i on t he tumor c o u l db e r e p r o d u c i b l y p l a c e d i n t h e r e s o n a t o r , a n d s p e c t r a l a c q u i s i t i o n wasb e g u n 3 min a f t e r t h e a n i m a l w a s b r o u g h t i n t o t h e s p e c t r o m e t e r r o o m .A n a d d i t i o n a l 2 m i n was necessary f o r a n i m a l t r a n s i t .

F I G . 3 . S p e c t r u m o b t a i n e d f r o m a 1 2 - m m - d i a m e t e r NFSa t u m o r i nt h e l e g o f a m o u s e s i t u a t e d a s s h o w n i n F i g . 2 i n t h e r e s o n a t o r o f t h el o w - f r e q u e n c y EPR s p e c t r o m e t e r . T h e t u m o r w a s i n j e c t e d w i t h 0 . 2 m lo f 4-POBN ( 5 0 0 mM)/EtOH 1 0 , v o l / v o l ) i n 5 0 mM s o d i u mp h o s p h a t e b u f f e r , a t o u r n i q u e t w a s a p p l i e d p r o x i m a l t o t h e t u m o r , a n dt h e t u m o r w a s s u b j e c t e d t o 3 0 0 0 Gy o f r a d i a t i o n o v e r 2 4 m i n . T h em o u s e w a s t r a n s p o r t e d t o t h e l o w - f r e q u e n c y EPR s p e c t r o m e t e r a n ds p e c t r a w e r e o b t a i n e d u n d e r a c q u i s i t i o n c o n d i t i o n s d e s c r i b e d i n t h et e x t . T h e l o w e r t r a c e i s a s i m u l a t i o n a s d e s c r i b e d f o r F i g . 1 A .t h e t u m o r i n t h e a b s e n c e o f t h e 4 - P O B N / E t O H m i x t u r e f a i l e dt o p r o d u c e a n E PR s p e c t r u m .T h e a c q u i s i t i o n o f t h e s p e c t r a l s i g n a l h a s i n v o l v e d a d m i n -i s t e r i n g e x t r e m e l y h i g h d o s e s o f r a d i a t i o n - a t o t a l o f 3 0 0 0 Gyo v e r 2 4 m i n . U s i n g w a t e r G v a l u e s f o r h y d r o x y l r a d i c a lp r o d u c t i o n , t h i s d o s e c o rr e s p on d s t h e p r o d u c t i o n o f 3 6 , u Mh y d r o x y l r a d i c a l p e r m i n , t h r e e o r d e r s o f m a g n i t u d e h i g h e rt h a n t h e d o s e g i v e n i n a s i n g l e c l i n i c a l f r a c t i o n o f r a d i a t i o n( 4 3 ) . F u r t h e r w o r k i s n e c e s s a r y t o o p t i m i z e t h e t r a d e - o f fb e t w e e n t h e i n c r e a s e i n s i g n a l w i t h i n c r e a s i n g d o s e a n d t h ed e c a y o f t h e s i g n a l d u r i n g t h e d o s e d e l i v e r y t i m e . D e u t e r a t e ds p i n t r a p s w i t h i n c r e a s e d s i g n a l p e r s p i n - t r a p a d d u c t m o l e c u l es h o u l d y i e l d a d d i t i o n a l s e n s i t i v i t y . M o s t i m p o r t a n t l y , t h e c u r -r e n t s p e c t r o m e t e r o p e r a t e s a t a f r e q u e n c y a l l o w i n g d e t e c t i o no f f r e e r a d i c a l s i n t i s s u e s much l a r g e r t h a n a 1 2 - m m m o u s e l e gt u m o r . A t l e a s t t w o a n d p o s s i b l y t h r e e o r d e r s o f m a g n i t u d e i ns e n s i t i v i t y s h o u l d b e r e g a i n e d b y o p e r a t i n g w i t h a c o r r e s p o n d -i n g l y l a r g e r t u m o r s a m p l e .P r e v i o u s i n v e s t i g a t i o n s , i n w h i c h s p i n t r a p s w e r e i n j e c t e di n t o a n i m a l s a n d i s o l a t e d p r e p a r a t i o n s f r o m t h e s e a n i m a l sw e r e p l a c e d i n t o c o n v e n t i o n a l E PR s p e c t r o m e t e r s , s e t t h es t a g e f o r t h e s t u d i e s r e p o r t e d i n t h i s c o m m u n i c a t i o n . To o u rk n o w l e d g e , t h i s i s t h e f i r s t t i m e f r e e r a d i c a l s h a v e b e e n s p i nt r a p p e d i n v i v o a n d r e c o r d e d i n s i t u i n a l i v i n g a n i m a l . Wer e c o g n i z e t h a t t h e d o s e s o f r a d i a t i o n r e q u i r e d t o d e t e c th y d r o x y l r a d i c a l s i n t h i s m o u s e m o d e l w e r e w e l l a b o v e t h et h e r a p e u t i c r a n g e u s e d t o k i l l t u m o r s . N e v e r t h e l e s s , we v i e wt h i s w o r k a s a f i r s t s t e p t o t h e u n d e r s t a n d i n g o f t h e i m p o r t a n tr o l e f r e e r a d i c a l s p l a y i n m a n y p h y s i o l o g i c p r o c e s s e s .X - r a y s w e r e d i s c o v e r e d 9 9 y e a r s a g o ( 4 4 ) . W i t h i n a y e a r t h e yw e r e a p p l i e d t o human b r e a s t c a n c e r a s a l o c a l t o x i n ( 4 5 ) . T h e yw e r e s o o n f o u n d t o b e m u t a g e n s ( 4 6 ) . D e s p i t e n e a r l y a c e n t u r yo f x - r a y u s e a s a n a n t i n e o p l a s t i c a g e n t a n d 5 7 y e a r s o f i t s k n o w nr o l e a s a m u t a g e n , t h e m e c h a n i s m s o f x - r a y d a m a g e i n v i v o a r ea m a t t e r o f d e b a t e . P a r t o f t h i s p r o b l e m l i e s i n t h e d i f f i c u l t y i n

M e d i c a l S c i e n c e s : H a l p e m e t a l

8/13/2019 PNAS 1995 Proc. Natl. Acad

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