Langenbecks Arch Chir (1992) 377:341-344 Langenbecks Archly farChirurgie © Springer-Verlag 1992

Pneumokokkeninduzierte Septik imie bei normalen und bei splenektomierten Kaninchen J. Melissas, A. _Wasas, A. A. Wadee, E. Korkozoglou, P. Flessas

Abteilung fiir Chirurgie und Mikrobiologie, Medizinische Fakultfit, Universitfit von Witwatersrand und des Sfidafrikanischen Medical Council Human Immunology Unit, Abteilung ffir Pathologic, S.A.I.M.R., Johannesburg, R.S.A.

Eingegangen am: 9. April 1992

Induced pneumococcal septicaemia in normal and splenectomised rabbits

Abstract. A new rabbit model to study the consequences of splenectomy in host resistance to induced pneumococ- cal septicaemia is presented. A simple, fast, non-invasive and complication-free technique of bacterial inoculation into the rabbit airways, using transcutaneous cannula- tion of the trachea, is also described. Sixteen normal and 24 splenectomised animals were used. The optimal dose of pneumonococcus (serotype B, type Ill) was found to be t x I07 organisms. The above dose of bacteria given transtracheally failed to cause signs of pneumonia or death in any of the normal rabbits. However the same dose introduced using the same technique resulted repro- ducibly in the death of the low-resistance splenectomised animals.

Key words" Induced pneumococcal septicaemia - Host resistance - Transcutaneous tracheal cannulation - Splenectomy Rabbit

Zusammenfassung. Hier wird ein neues experimentelles Modell zur Untersuchung der immunologischen Abwehr nach provozierter Infektion des respiratorischen Systems mit Typ-3-Pneumokokken bei normalen und bei splenek- tomierten Versuchstieren vorgestellt. Eine einfache, schnelle, nichtinvasive und komplikationsfreie Technik zur Bakterieninokkulation in das respiratorische System des Kaninchens durch transkutane Kanfilierung der Tra- chea wird ebenfalls beschrieben. 16 normale und 24 splen- ektomierte Versuchstiere wurden benutzt. Die optimale Dosis yon Pneumokokken (Typ 3, Serotyp B), welche ei- ne Infektion im respiratorischen System verursacht, wur- de bei 1 • 107 Mikroben gefunden. Die oben genannte Dosis von transtracheal applizierten Bakterien ffihrte we-

Korrespondenz an: Professor Dr. J. Melissas, University of Crete, School of Health Sciences, Division of Medicine, Heraklion 714 09 Crete, Greece

der zu den Symptomen einer Pneumonie noch zum Tode irgendeines der normalen Kaninchen. Bei den resistenz- geschw/ichten splenektomierten Versuchstieren ffihrten jedoch die in gleicher Technik und Dosis transtracheal applizierten Bakterien zum Tode der Kaninchen.

Das Erkennen des fast immer zum Tode ftihrenden Syn- droms der Septik/imie nach Splenektomie lenkte unser Interesse auf die Untersuchung der Rolle der Milz in der Abwehr des Organismus bei Infektionen [3]. Gleichzeitig wurden verschiedene chirurgische Techniken mit dem Ziel der Erhaltung der Milz nach einer Verletzung und der Vermeidung einer Splenektomie vorgeschlagen und in der klinischen Praxis angewandt [6, 10].

Besonders wichtig ffir die genauen Beschreibungen dieser Techniken sind die experimentellen Untersuchun- gen der Mortalit/it nach einer provozierten Septikfimie bei den Versuchstieren, welche einer oder mehreren dieser Operationen unterzogen wurden [12].

Der statistische Vergleich der vorherigen Mortalit/it mit der, welche nach einer provozierten Septikfimie auf- tritt, und zwar bei normalen Versuchstieren und bei sol- chen, die nach einer Splenektomie fiber einen verminder- ten immunologischen Widerstand verffigen, gibt uns die MGglichkeit der detaillierten Untersuchung des graduel- len Schutzes, welchem jede einzelne dieser Techniken zur Rettung der Milz nach Infektionen anbietet [4, 14].

Die unter versuchsm/if3igen Bedingungen provozierte Septik/imie - ausgehend vom respiratorischen System - gleicht der Septik/imie, die beim Menschen nach einer Splenektomie auftritt.

Wir gehen davon aus, dab der von uns angewandte Applikationsweg zur Inokkulation der Bakterien dem Zustand eines Kranken mit dem Syndrom der Sepsis nach einer Splenektomie entspricht [9]. Andere Wege zur versuchsm/il3igen Provokation einer Septikfimie, z.B. mittels einer Inokkulation der Mikroorganismen fiber ve- nGse Zug/inge oder durch eine endoperitoneale Applika- tion der Mikroorganismen, werden als weniger repr/isen-

342

tativ fiir den Menschen angesehen, weil davon auszuge- hen ist, dab die Lungen fiber eine physiologische Ein- gangsbarriere gegenfiber Mikroorganismen verffigen [9, 11]. Das Ziel dieser Arbeit war die Erstellung eines expe- rimentellen Modells zur Untersuchung der Konsequen- zen einer provozierten Infektion im respiratorischen Sy- stem bei normalen und bei splenektomierten Kaninchen - ein Versuchstier, welches sich zur Untersuchung der Rolle der Milz in der Immunabwehr anbietet [I 3].

Die Untersuchung hatte 2 wichtige Aufgaben. Zum einen die Bestimmung der geeigneten Dosis von Pneumo- kokken (Typ 3), welche in die Trachea und die Lungen der Versuchstieren appliziert werden mul3, um bei den splenektomierten Versuchstieren mit der erniedrigten Im- munabwehr den Tod hervorzurufen und bei den norma- len Versuchstieren keine Wirkung zu zeigen; zum anderen die Entwicklung einer Technik zur Inokkulation der Mi- kroorganismen in das respiratorische System der Ver- suchstiere, die stabile und reproduzierbare Ergebnisse ge- wfihrt.

Material und Methode

40 weibliche erwachsene Kaninchen (New Zealand white rabbits) mit einem K6rpergewicht von 2,2-3,0 kg wurden ffir diese Studie verwendet. Die Tiere wurden in 2 Gruppen aufgeteilt: Die 1. Gruppe - 14 splenektomierte und 6 normale Versuchstiere - wurde zur experimentellen Bedarfsbestimmung der geeigneten Do- sis von Pneumokokken und zur Entwicklung der Inokkulations- technik der Mikroorganismen in den oberen Respirationstrakt ver- wendet. Die 2. Gruppe - 10 normale und 10 splenektomierte Ver- suchstiere - wurde zur Abklfirung der Reproduzierbarkeit der Er- gebnisse und ffir den statistischen Vergleieh der aufgetretenen Mor- talit/iten bei den normalen und den splenektomierten Versuchstieren benutzt.

Die Eingriffe wurden unter aseptischen Bedingungen durchge- ffihrt. Dabei wurde eine i.v. Allgemeinnarkose mit Saffan~ (c~-Ha- xalone 9 mg/ml und e-Hadalon 3 mg/ml) in einer Dosis von 0,5 ml zur Einleitung der Narkose und in Fortsetzung von 0,5-0,75 ml zur Erhaltung verwendet. Ein querer Sehnitt mit einer L/inge von 5 cm im oberen linken Quadranten des Abdomens wurde zur Laparoto- mie verwendet. Bei zusammen genommenen 24 Versuchstieren wurde die Milz entfernt, bei den anderen 16 Versuchstieren wurde nut eine einfache Ertastung des Organs vorgenommen (sham opera- tion). Die Operationswunde wurde jeweils schichtweise mit einer durchgehenden Naht aus absorbierbarem Material (Vicryl 3-0) ver- schlossen. Beim Hautverschlul3 wurde das gleiehe Material verwen- det.

Die Inokkulation der Pneumokokken ins respiratorische System erfolgte 3 Monate nach der Operation mit folgender Technik: Das Tier wurde mit 0,5 ml i.v. verabreichtem Saffan ~ bet/iubt und in Riickenlage mit iiberstrecktem Hals fixiert. Ein i.v. Katheter 18 SWG (Zelco, Johnson and Johnson, USA) wurde transdermal ca. 1 cm unterhalb des Larynx in die Trachea eingeffihrt. Der Me- tallfiihrer wurde entfernt und der Kunststoffkatheter wurde in der Trachea auf der H6he der Bifurkation belassen. Die Position des Katheters im respiratorischen System wurde durch Einblasen yon Luft in das System mittels einer 10-ml-Spritze und gleichzeitigem Abh6ren des Thorax des Versuchstiers iiberpriift. Typische auftre- tende Ger/iusche bestS.tigten uns die richtige Position im respiratori- schen System.

Danach wurde 1 cm 3 isotone Kochsalzl6sung, welche mit den Pneumokokken Typ 3 in der oben genannten Konzentration ver- setzt war, mittels einer 1 cm a fassenden Spritze und unter dement- sprechenden notwendigen Druck in das respiratorische System ge- spritzt, um auch in den Lungen verteilt zu werden. Die zunehmende

Aufteilung des Mittels geht nach der Methode vor sich, welche durch Livingston et al. beschrieben wurde [8, 9]. Danach wurde der Kunststoffkatheter entfernt und der Hals des Versuchstiers mit ei- nero Sprayverband bespriiht (spray band, Lebethica Ltd. R.S.A.).

Das Versuchstier wurde daraufhin in speziellen klimatisierten Versuchszellen isoliert und die Mortalit/it in den darauffolgenden 30 Tagen registriert.

Eine Obduktion, eine Pleurapunktion zur Gewinnung von Pleu- rafltissigkeit sowie eine Lungengewebsentnahme zur histologischen Untersuchung und zur Untersuchung in Kulturen wurden bei allen Versuchstieren vorgenommen, die zugrunde gegangen waren.

Zur statistischen Analyse der Ergebnisse und zum Vergleich der registrierten Mortalit/iten der normalen und der splenektomierten Versuchstieren der 2. Gruppe wurde der )~2-Test verwendet.

E r g e b n i s s e

Aus der 1. Gruppe haben sich 18 Versuchstieren nach dem Eingriff erholt, w/ihrend 2 Versuchstiere am ersten postoperativen Tag zugrunde gingen. Aus der 2. Gruppe haben sich alle Versuchstieren yon dem Eingriff erholt.

Tabelle 1 zeigt die aufgetretenen MortalitMen nach den verschiedenen Dosen von endotracheal applizierten Pneumokokken bei 6 normalen und 12 splenektomierten Tieren aus der 1. Gruppe.

Die Ergebnisse der Versuche aus dieser Gruppe ffihr- ten uns zur Erkenntnis, dab eine endotracheal applizierte Dosis yon 1 • 10 7 Mikroorganismen dazu fiihrt, dab alle splenektomierten Versuchstiere zugrunde gehen, w~h- rend dieselbe Dosis bei den normalen Versuchstieren kei- nerlei Wirkung zeigt. Diese Dosis wurde daraufhin bei allen Versuchstieren der 2. Gruppe benutzt. Tabelle 2 zeigt die aufgetretenen Mortalit/iten bei den 10 normalen und den 10 splenektomierten Versuchstieren der 2. Gruppe.

Die Obduktionen der zugrunde gegangenen Versuchs- tiere ergaben bei allen Versuchstieren eine makrosko- pisch sichtbare bilaterale Pneumonie. Pneumokokken Typ 3 fanden sich bei allen Untersuchungsergebnissen

Tabelle 1. Anzahl der Versuchstiere (VT), der Dosis und der Morta- lit/it

Anzahl Versuchstiere Bakterien- Mortalit/it (VT) dosis

3 Splenektomierte VT 10 s 1 VT 3 Splenektomierte VT 10 6 2 VT 3 Splenektomierte VT 107 3 VT 3 Splenektomierte VT 10 s 3 VT 3 Normale VT 107 0 VT 3 Normale VT 10 ~ 1 VT

Tabelle 2. Mortalit/it bei einer Bakteriendosis yon 107

Anzahl Versuchstiere Bakterien- Mortalit/it (VT) dosis

10 Normale VT 107 0 VT (0%) 10 Splenektomierte VT 10 v 9 VT (90%)

343

der geprfiften Kulturen aus den vorher gewonnenen Pleu- ralflfissigkeiten, aul3erdem best/itigten die histologischen Ergebnisse die makroskopischen Obduktionsbefunde (p<0,001).

Die aufgetretenen Unterschiede der Mortalit/iten zwi- schen den normalen und den splenektomierten Versuchs- tieren der 2. Gruppe wurden mittels des )~2-Tests gepriift, was ffir die Statistik sehr wichtig war.

Diskussion

Pneumokokken sind Mikroorganismen, welche sich bei mehr als 50% der Kranken mit dem Syndrom der Septik- /imie nach einer Splenektomie nachweisen lassen [7]. Die- ser Mikroorganismus wurde bier zur Untersuchung des Widerstands bei Versuchstieren mit provozierter Septi- k/imie verwendet [1].

Bis heute wurden verschiedene Versuchsmodelle zur Erklfirung der Wirkungsart der chirurgischen Techniken zur Rettung der Milz nach traumatischer Sch/idigung be- nutzt. Bei groBen Tieren, wie z.B. dem Hund [15], sind diese chirurgischen Eingriffe eine 1/ingst verwirklichte Technik. Aber die Untersuchung fiber die Wirkungen der provozierten Septik~mie und die statistische Auswertung bedarf notwendigerweise der Nutzung einer hohen An- zahl von Versuchstieren. Die Probleme, die hier auftra- ten, sind selbstverst/indlich vor allem auf die Kosten und die Probleme der geeigneten Rfiumlichkeiten zur Haltung der Versuchstiere zurfickzuffihren.

Bei kleineren Tieren wie z. B. der Maus [2] erlauben die Gr6Be des Tiers und die Kosten wesentlich gr6Bere Ver- suchsreihen. Die Milz dieser Tiere eignet sich jedoch nicht ffir gewisse Operationen, welche zur Rettung der Milz nach einer traumatischen Sch/idigung beim Menschen fiblich sind. So treten bei der Maus nach einer Unterbin- dung bzw. Unterbrechung der Milzarterie fast immer Thrombosen und Nekrosen der Milz auf [17]. Alle beim Menschen bis heute bekannten und gebr/iuchlichen ope- rativen Techniken sind jedoch beim Kaninchen anwend- bar.

Die Kosten und die Gr6Be der Versuchstiere erlauben gr613ere Versuchsreihen. Augerdem wurde das Kanin- chen bei vielen immunologischen Untersuchungen ver- wendet, u.a. auch bei der Beschreibung der Rolle der Milz im Immunabwehrsystem [13]. Das Kaninchen scheint somit ein ideales Versuchsmodell ffir die Erfor- schung der Anderungen immunologischer Parameter (Phagozytose, Antik6rperbildung) nach Operationen zur Erhaltung der Milz zu sein, gleichzeitig erlaubt es uns aber auch, die Abwehrmechanismen der Versuchstiere nach einer provozierten Septik/imie zu studieren, und es erm6glicht uns die Gewinnung von abschliel3enden Er- gebnissen zur Validit/it bei den jeweils angewandten, d. h. untersuchten, chirurgischen Techniken. Viele verschieden Zug/inge wurden bisher zur Provokation einer Septik- /imie bei Versuchstieren verwendet. Von diesen/ihnelt die Aufnahme der Mikroorganismen fiber das respirato- rische System in typischer Art und Weise einer Septik- /imie beim Menschen nach einer Splenektomie.

Die Untersuchung der provozierten Infektion im re- spiratorischen System beim Kaninchen setzte die Ent- wicklung einer Methode zur Inokkulation der Bakterien in die Trachea voraus, welche uns folgendes gew/ihrlei- stet: die Anwesenheit einer permanent konstanten An- zahl von Bakterien und einen notwendigen Druck zur Einbringung, damit die Mikroorganismen auch die A1- veolen der Lungen infizieren [16].

Diese Studie zeigt uns die M6glichkeit der Nutzung des Kaninchens fiir Experimente zur Provokation einer Infektion im respiratorischen System. Die Art und Weise der Inokkulation der Mikroorganismen in die Trachea mit der oben genannten Methode hat uns stabile und reproduzierbare Ergebnisse gebracht, und zwar bei nor- malen und bei splenektomierten Versuchstieren.

Die Einbringung der Pneumokokken Typ 3 in einer Dosis von 1 • 107 Mikroorganismen hatte einen signifi- kanten statistischen Unterschied in den Mortalit/iten zwi- schen den normalen Versuchstieren und den Versuchstie- ren mit einer erniedrigten Immunabwehr nach Splenek- tomie zur Folge. Die Studien zur Untersuchung der Ab- wehr nach einer provozierten Infektion des respiratori- schen Systems beim Kaninchen nach der erfolgten N/i- hung der Milz, einer partiellen Splenektomie, einer Auto- transplantation von Milzgewebe und der Unterbindung der Milzarterie sind in unserem Institut in Bearbeitung.

Diese Studie wurde von dem S.A. Medical Research Council und der Surgical Research Society (research scholarship) finanziert. Die Autoren bringen ihren Dank gegenfiber Herrn Prof. Dr. J. J. Koornhof, Chef des Mikrobiologischen Instituts an der Universit/it Witwatersrand, ffir die gegebenen Ratschl/ige und ffir die Bereitstel- lung der verwendeten Pneumokokken zum Ausdruck.

Literatur

1. Brown EJ, Hosea SW, Frank MM (1981) The role of the spleen in experimental pneumococeal bacteremia. J Clin Invest 67:975 -982

2. Chaudry IH, Tabata Y, Schleck S, Baue AE (1980) Effect of splenectomy on reticuloendothelial function and survival fol- lowing sepsis. J Trauma 20:649-656

3. Cooper MJ, Witliamson RCN (1984) Splenectomie, indications, hazards and alternatives. Br J Surg 71:173-180

4. Greco RS, Alvarez FE (1981) Intraportal and intrahepatic splenic autotransplantation. Surg 90:535-540

5. Horton J, Ogden ME, Williams S, Coln D (1982) The impor- tance of splenic blood flow in clearing pneumococcal organ- isms. Ann Surg 195:172-176

6. Keramidis DC (1979) The ligation of the splenic arteria in the treatment of traumatic rupture of the splen. Surgery 85: 530- 533

7. Krivit W, Giebink GS, Leonard AS (1979) Overwhelming post- splenectomy infection. Surg Clin North Am 59:223-233

8. Livingston CD, Levine BA, Sirinek KR (1983) Site of splenic autotransplantation affects protection from sepsis. Am J Surg 145:734 737

9. Livingston CD, Levine BA, Sirinek KR (1983) Improved sur- vival rate for intraperitoneal auto-transplantation of the spleen following pneumococcal pneumonia. Surg Gynecol Obstet 156:761-766

10. Oakes DD (1981) Splenic trauma. Curt Probl Surg 18:341-401 11. Offenbartl K, Gullstrand P, Alwmark A, Christensen P (1984)

Administration route and splenectomy effects on resistance to pneumococci in rats. APMIS 92:213-216

344

12. Pate1 J, Williams JS, Naim JO, Hinshaw JR (1982) Protection against pneumococcal sepsis in splenectomized rats by implan- tation of splenic tissue into an omental pouch. Surgery 91:638- 641

13. Richter M, Berry M, Barton P (1986) Cells involved in the immun response. J Immunol Immunopathol 38:101-110

14. Scher KS, Wriczynski AF, Scott-Conner C a'd (1984) Intraperi- toneal splenic implants do not alter clearance of pneumococcal bacteremia. AN Surg 51:269-271

15. Visagie W J, Tonder E van, Nel CJC (1980) Autotransplantation of splenic tissue into the omentum: A method of preserving splenic tissue. S Afr J Surg 19:119-122

16. White B. The bacteriological, biochemical and immunological characters and activities of diplococcus pneumonia, 2nd edn. Harvard University Press, Cambridge Massachusetts London, pp 182-184

17. Whitte CL, Whitte MH, Renert W, O'Mara RE, Lilien DL (1976) Splenic artery ligation in selected patients with hepatic cirrhosis and in Sprague-Dawley rats. Surg Gyneeol Obstet 142:1-12