1

Doktori (Ph.D.) értekezés

Poli(ADP-ribóz) polimeráz (PARP) szerepe a bőr ultribolya (UV) fény indukálta károsodásában

Dr. Csete Béla

Interdiszciplinális doktori iskola vezető: Dr. Sümegi Balázs, egyetemi

tanár

Alprogramvezető: Dr. Farkas Beatrix, egyetemi tanár

Dr. Battyáni Zita, egyetemi docens

Pécsi Tudományegyetem

2009.

2

Tartalomjegyzék

Bevezetés 2.

Célkitűzések 10.

I. Anyag és módszer 12.

I/1. Állatkísérletek 12.

I/2. Klinikai tünetek értékelése 24.

II. Eredmények 30.

III. Összefoglalás 45.

III/1. Témában elért új eredmények 46.

Irodalomjegyzék 56.

Rövidítések jegyzéke 66.

Köszönetnyilvánítás 67.

A szerző közleményeinek jegyzéke 68.

A szerző kongresszusi előadásainak jegyzéke 70.

Táblázatok és Ábrák 72.

3

Bevezetés

A bőr multifunkcionális „interface” a külvilág és a szervezet között. A

környezeti tényezők (légköri szennyeződés, inszoláció fokozódása, az

ózonlyuk növekedése, stb.), valamint az életmódbeli szokások (nyári, téli

üdülés, hétvégi szabadtéri tevékenység, mesterséges ultraibolya (UV)

besugárzás rendszeres igénybevétele, stb.) radikális változása az UV-fény

okozta bőrkárosodás pontos patomechanizmusának megismerését, valamint

ezáltal a folyamat megelőzésére és kezelésére szolgáló eljárások

kidolgozását világszerte a bőrgyógyászat egyik vezető kutatási területévé

tette.

Az UV fény három különböző tartományra osztható. Így az UVA 320-400 nm

(ezen belűl UVAI: 340-400 nm, UVAII: 320-340 nm), az UVB: 290-320 nm és

az UVC: 200-290 nm formájában lett meghatározva (Diffey 2002). Ismert,

hogy az UV-sugarak hullámhossz-dependens módon penetrálnak a bőrbe,

vagyis a hullámhossz növekedésével a behatolás mélysége nő. A rövidebb

hullámhosszú UVB-sugárzás főleg az epidermiszben abszorbeálódik, és ott

dominálóan a keratinocitákkal lép interakcióba. A hosszabb hullámhosszú

UVA-tartomány a mélybe penetrál, és az epidermisz mellett érinti a dermális

sejtek funkcióját is (Höningsmann 2002). Az UVA- és UVB-tartomány káros

hatása additív jellegű és kumulálódik (Lim és mtsai. 2001, Kurtmann 2001)

(1.ábra).

Annak ellenére, hogy a Földet érő elektromágneses hullámból az UVA-

tartomány aránya lényegesen magasabb (95%), mint az UVB-é, a

biológiailag káros hatások kiváltását dominálóan az UV-fény UVB-

4

tartományával hozzák összefüggésbe (Elmets és mtsai. 2001, Cole 2001,

Lim és mtsai. 2001).

Az UV-fény legtöbb, bőrben jelentkező kóros biológiai hatásának fő

molekuláris „targetje” a DNS. Az epidermisz számos kromoforral

(nukleinsavak, urokainsav, aromás aminosavak, melanin prekurzorok, stb.)

rendelkezik, melyek a fény UV-tartományát elnyelik, és fotokémiai reakción

keresztül a bőr biológiai károsodását idézhetik elő (Hönigsmann 2002). Az

UV-fény direkt DNS-károsító hatása során dominálóan ciklobután-pirimidin-

dimerek (CPD), valamint pirimidin (6-4) pirimidon fotoproduktumok

képződnek (Freeman és mtsai. 1989, Hemminki és mtsai. 2001). A direkt

DNS-károsodás kiváltásában az UVB- és a rövid UVA- (UVA-II)

tartománynak van szerepe (Young és mtsai. 1998) A fény UVA-I tartománya

főleg indirekt módon, ROS indukció által fejti ki hatását, mely a DNS

oxidációja mellett, a lipid-peroxidációban, a fehérjék oxidációjában, a

transzkripciós faktorok aktivációjában, DNS-törések előidézésében nyilvánul

meg (Krutmann és mtsai. 1997). A fény UVB-tartománya szintén képes ROS

képződést indukálni, direkt hatása mégis a DNS-fototermékek (timin-

dimerek), egyesláncú DNS-törések képződésén, a DNS-repair enzimek

aktivációján keresztül jelentősebb (Katiyar és mtsai. 2000, Berton és mtsai.

1997, Krutmann 2001, Mitchell és mtsai. 2001). Az epidermisz sejtjeiben

bekövetkező DNS-károsodás mértéke jól követhető az akut UV-fény stressz

hatására létre jött apoptótikus keratinocyták („sunburn sejtek”) kvantitatív

meghatározásával (Ziegler és mtsai. 1994).

Az UV-sugárzás direkt és indirekt DNS-t károsító hatása a bőrben gyulladás,

fototoxikus reakció, immunszupresszió, „photoaging”, fotokarcinogenezis és

5

számos egyéb elváltozás formájában nyilvánul meg (Krutmann 2001, Kulms

és mtsa. 2000, Yarosh és mtsai. 2001, Maccarrone és mtsai. 1997,

Steenvoorden és mtsai. 1997) (2. Ábra). Általában az UV-sugárzás akut

tüneteinek kiváltásáért, amely dominálóan az epidermális keratinocitákra

kifejtett különböző mértékű citotoxikus károsodás következménye, a fény

UVB-tartományát teszik felelőssé (Elmets és mtsai. 2001, Lim és mtsai.

2001). A napégés, számos jelátviteli útvonalon keresztül, önmaga elégséges

lehet az évekkel, évtizedekkel később manifesztálódó melanoma és nem-

melanoma bőrtumorok (carcinoma spinocellulare, carcinoma basocellulare)

indukciójához. A krónikus fénykárosodás, vagy „photoaging” kiváltásában az

UV-fény mindkét tartományának szerepe van, hiszen hatásuk additív, mégis

az UVA jelentőségét emelik ki. Az UV-fény okozta öregedés („photoaging”)

és fotokarcinogenezis (melanoma malignum, carcinoma basocellulare illetve

spinocellulare) legkifejezettebben az I-II bőrtípusú (fehér, érzékeny bőr)

kaukázusiaknál jelentkezik (Young és mtsai. 1996, Katiyar és mtsai. 2000,

Kraemer 1997, Farkas és mtsai. 2002).

Az életkor meghosszabbodása, valamint a természetes (napfény) és a

mesterséges (pl. szolárium) UV-expozíció növekedése által kiváltott

fénykárosodás világszerte a jó- és rosszindulatú bőrtumorok előfordulási

gyakoriságának progresszív emelkedéséhez vezetett A malignus bőrtumorok

incidenciája az utóbbi 30 évben hazánkban is drámaian emelkedett, s ez a

tendencia jelenleg is folytatódik. Míg az epidermális eredetű laphám

carcinoma és a basocelluláris carcinoma patogenézisében a krónikus (élet

során összeadódó) napfény expozíciónak, addig malignus melanoma

6

esetében inkább az ismétlődő, rövid expozíciós idejű, intenzív napégéseknek

lehet szerepe.

Fenti tényezők miatt a fényvédő készítmények iránti követelmények

megnőttek. A teljes spektrumú védelem (UVA, UVB) alkalmazása feltétlenül

indokolttá vált (Lim és mtsai. 2001). A jelenleg meglévő, és a fényvédők

használatát sok esetben akadályozó mellékhatások (fototoxikus, fotoallergiás

reakció, színező hatás, nem megfelelő konzisztencia, stabilitási problémák)

kiküszöbölése fontos feladat (Lim és mtsai. 2001). A kutatás az eddigiektől

merőben eltérő, új típusú fényvédő készítmények (pl.: a DNS-repair

kapacitást támogató T4V (T4N5) liposzómális endonukleáz, az IL-12, PARP-

gátlók) előállítása irányába folyik (Yarosh és mtsai. 2001, Schwartz és mtsai

2002, Farkas és mtsai. 2002). A cél a megelőzés és a hatékony védelem

által a bőrtumor-incidencia növekedésének megállítása (Lim és mtsai 2001).

A rendelkezésünkre álló új molekulákkal munkánk célja elsősorban az akut

és krónikus UV-fény okozta károsodás kialakulásának megelőzésében

szerepet játszó szabályzó mechanizmusok vizsgálata, valamint a bőr

védelmét elősegítő illetve károsító folyamatok farmakológiai

befolyásolhatóságának tanulmányozása volt.

A bonyolult védelmi funkció érvényesüléséhez az alapvető celluláris

folyamatokat (proliferáció, differenciálódás, túlélés, apoptózis) szabályozó,

számos jelátviteli rendszer korrekt működése szükséges. Jelen munkában a

nagyszámú jelátviteli folyamatból, melyek az UV-fény indukálta

bőrelváltozások kialakulásában részt vesznek a poli(ADP-ribóz) polimeráz

(PARP) enzim aktivitás és annak szabályozásával összefüggő

mechanizmusokat kívántam vizsgálni.

7

A poli(ADP-ribóz) polimeráz az eukarióta sejtekben (kivéve az

élesztősejteket) nagy mennyiségben (körülbelül 106 molekula/sejt) jelenlevő

nukleáris, 116 kD molekulasúlyú enzim, amely meglehetősen hosszú

féléletidejű fehérje. A PARP három fő doménból áll: az N-terminális DNS-

kötő domén (DBD), az automodifikációs domén (AMD) és a C-terminális

katalitikus domén. A DBD-n belül két cink-ujj felelős a DNS kötésért és

néhány fehérje-fehérje kölcsönhatásért. A DBD ezen kívül tartalmaz egy

nukleáris lokalizációs szignál (NLS) régiót, amelyen belül a kaszpáz hasító

hely (DEVD) is található. Az automodifikációs domén tartalmaz egy BRCT

(breast cancer susceptibility protein C terminus) szakaszt, amely számos

DNS repair és sejtciklus fehérjében közös. A PARP a különböző fehérje-

fehérje kölcsönhatásokban a BRCT szakaszon keresztül vesz részt. Az

enzim C-terminális részén található aktív hely, az eukariótákban rendkívül

konzervált, 50 aminosavból álló szekvencia úgy is ismert, mint „PARP

névjegy” (Virág és mtsa. 2002).

Amennyiben a sejtet különböző behatások (pl.: alkiláló szerek, ionizáló

sugárzás, UV-sugárzás vagy szabadgyökök, stb) károsítják, a PARP gyorsan

odakötődik a DNS lánctörések helyére, automodifikáción megy keresztül,

amely a célfehérjén (leggyakrabban magán az enzimen) hosszú, elágazó

láncú poli(ADP-ribóz) polimerek képződéséhez vezet. A folyamathoz NAD+

használódik fel szubsztrátként, amely végeredményben az intracelluláris

NAD+ deplécióját okozza (Lindahl és mtsai. 1995, Burkle 2001, Virág és

mtsa. 2002). A képződő negatív töltésű PARP azután leválik a DNS-

végekről, elősegítve a DNS-repair folyamatát (Lindahl és mtsai. 1995). A

poli(ADP-ribóz) in vivo rövid életű, mert a poli(ADP-ribóz) glükohidroláz

8

(PARG) gyorsan (2-5 perccel a polimer képződése után) lebontja (Bernardi

és mtsai. 1997). A PARP-nak ez az oda-vissza kötődése a DNS lánctörés

helyén annak a hipotézisnek a megszületéséhez vezetett, hogy a PARP és a

poli-ADP-riboziláció különböző, kromatinhoz kötött működésekben is

szerepet játszik (de Murcia és mtsai. 1997, Kanai és mtsai. 2000). A PARP

automodifikációja megváltoztatja az enzim affinitását a DNS lánctörésekhez,

valamint azt a képességét, hogy más, a DNS-repair-ben részt vevő

fehérjékkel versenyezzen (Lindahl és mtsai. 1995, D’Amours és mtsai. 1999).

A PARP különböző biológiai folyamatokban játszott lehetséges funkciójába

azok az in vitro kísérletek nyújtottak sokoldalú betekintést, amelyekben NAD+

analógokat alkalmaztak a poli-ADP-riboziláció gátlására (például:

nikotinamid, benzamid és származékai). A tanulmányok szerint a kémiai

gátlószerek hatékonyan képesek megakadályozni a NAD+ deplécióját, és

túlérzékennyé tenni a sejteket a DNS-károsító szerekre, valószínűleg a

károsodott DNS kijavítását késleltetve (D’Amours és mtsai. 1999, Shall

1995). Ezek az anyagok valóban gátolják a PARP aktivitást, ugyanakkor a

normális sejtmetabolizmust is befolyásolják más NAD+-dependens

folyamatokat érintve (Milam és mtsai. 1984).

Annak ellenére, hogy az elmúlt évtizedben számos szervvel és szövettel

(szív, vázizom, központi idegrendszer, vese, bél, izület, szem, stb.)

kapcsolatos vizsgálatok történtek a PARP szerepére vonatkozóan(Zhang

2002, Virág és mtsa. 2002, Szabados és mtsai. 2000.). A bőr az ilyen irányú

kutatásokból gyakorlatilag kimaradt. A PARP aktivációnak a bőrelváltozások

patomechanizmusában betöltött jelentőségével kapcsolatban csak nagyon

szórványos adatok találhatók az irodalomban, a PARP aktiváció bőrben

9

történő szabályozásával (PARP-gátlók hatása) kapcsolatos vizsgálatokra

vonatkozó keresésünk pedig eredménytelenül zárult. A PARP bőrben

betöltött szerepére vonatkozó eddigi ismereteinket a következőkben tudjuk

összefoglalni. Keratinocitákon végzett vizsgálatokkal mutatták ki, hogy a

peroxinitrit és a hidrogén-peroxid a HaCaT sejtekben PARP aktivációt idéz

elő, amely hozzájárul a peroxinitrit által okozott citotoxicitáshoz (Szabó C. és

mtsai. 1998), ill. Hinshaw és mtsai. a kén-mustárral (DNS károsító szer)

kiváltott fokozott PARP-szintézisről számoltak be (Hinshaw és mtsai. 1999).

Később, in vivo oxazolonnal előidézett kontakt dermatitisz kapcsán (Szabó E.

és mtsai. 2001), ill. egérbőr mustárolajjal történő kezelése során (Virág és

mtsai. 2002) észleltek PARP aktivációt. Virág és mtsai. az epidermisz bazális

rétegében, immunhisztokémiai vizsgálattal, monoklonális poli-ADP-ribóz

ellenes antitestet használva észleltek kifejezett keratinocita festődést.

Ugyanezen kísérlet során, a mustárolajjal kezelt bőrben, poliklonális

antinitrotirozin antitestet használva, az epidermális és dermális sejtekben

jelentős nitrotirozin képződést figyeltek meg, mely alapján feltételezték a

peroxinitrit jelenlétét Vizsgálataik alapján arra következtettek, hogy a PARP

aktiváció egyik mechanizmusa a PARP direkt aktivációja lehet az alkilált DNS

által, valamint az intracutan peroxinitrit képződés is hozzájárulhat az enzim

aktivációjához (Virág és mtsai. 2002).

Annak ellenére, hogy az UV-fény DNS-károsító hatása (Hemminki és mtsai.

2001, Freeman és mtsai. 1989), valamint a PARP DNS-lánctörésre történő

aktivációja (Benjamin és mtsai. 1980, Satoh és mtsa. 1992, Lindahl és mtsai.

1995) jól ismert, az UV-besugárzást követően a PARP bőrben betöltött

szerepére vonatkozóan ismereteink hiányosak. Ezért érdemesnek látszott,

10

hogy kutatásom egyik legfontosabb céljává tenni az UV-expozíciót követő

PARP-aktiválás kimutatását, valamint azt, hogy direkt bizonyítékokat

szolgáltassak a PARP-gátlás vagy reguláció protektív hatására.

11

Célkitűzések

Munkánk célja a bőr különböző környezeti stresszhatásokkal szembeni,

illetve a már kialakult kóros állapotok helyreállításában részt vevő poli(ADP-

ribóz) polimeráz (PARP) enzim szerepének és farmakológiai

befolyásolhatóságának tanulmányozása volt.

A környezeti stresszhatások közül érdeklődésünk középpontjába a fény

ultraibolya (UV) tartománya került. Ismert, hogy az élet során elszenvedett

fénykárosodás kumulálódik. A civilizált világban az életkor

meghosszabbodásával a természetes (napfény) és mesterséges (pl.

szolárium) UV-expozíció által kiváltott fénykárosodás mértéke jelentősen nő.

A fentiek következtében, az UV-fény okozta jó- és rosszindulatú (melanoma,

és nem-melanoma típusú) bőrtumorok előfordulási gyakoriságának

progresszív növekedése már jelenleg is világszerte megoldandó problémát

jelent. Az új molekulák (immunstimulánsok, DNS-protektív anyagok, stb.)

előállításával és alkalmazásával várható a hatékonyabb prevenciós

lehetőségek számának növekedése illetve a kóros állapotok jelenleginél

korszerűbb diagnosztikus és terápiás megoldása.

A rendelkezésünkre álló új molekulákkal célunk elsősorban az akut és

krónikus UV-fény károsodás kialakulásának megelőzésében szerepet játszó

szabályzó mechanizmusok vizsgálata, valamint a bőr védelmét elősegítő,

protektív, illetve károsító folyamatok farmakológiai befolyásolhatóságának

tanulmányozása volt.

A megvalósításhoz egyszerű, ugyanakkor jól reprodukálható modelleket

próbáltunk használni, amelyek mind sejtszinten, mind pedig a bőr, mint szerv

12

szintjén biztosítják a fiziológiás és patológiás történések vizsgálhatóságát, és

magukban foglalják a gyakorló klinikus számára az alkalmazás potenciális

lehetőségét.

A fentiek alapján tanulmányozni kívántuk:

1. PARP-regulátor/inhibitor általi szabályzás vizsgálata a bőr akut és Krónikus UV-irradiáció elleni védelmében

• A poli-ADP-riboziláció jelentősége a bőr UV-fény indukálta károsodásában

• PARP aktivitás in vitro és in vivo vizsgálata

• PARP-regulátor/inhibítor antieritematogén, DNS-protektív, immunoprotektív hatásának vizsgálata

2. PARP-regulátor/inhibítor szerepe az UVA- és UVB-fény indukálta

karcinogenezis elleni védelemben

13

I. Anyag és módszer

A vizsgálatok végzéséhez PTE ÁOK Régionális Etikai Bizottsága

engedélyével, valamint beteg információs és beleegyező nyilatkozattal

rendelkeztünk.

I./1. Állatkísérletek

A kísérleteket az „European Community guiding principles for the care and

use of laboratory animals” szabályai szerint, állatetikai engedély birtokában

végeztük. Egy-egy kísérleti sorozatban az állatok életkor és súly szerint

lényeges eltérést nem mutattak.

I./1.1. Akut és krónikus fénykárosodás vizsgálata „hairless”

egérmodellen

A lokálisan alkalmazott PARP-regulátor (különböző koncentrációban BGP-

15M hatóanyagot tartalmazó krém) dermatológiai hatásának vizsgálatához

(akut és krónikus UV-fény expozíciós kísérletek) hairless CRL:hr/hr BR Hr1,

(Charles River Ltd., Németország) szőrtelen egereket használtunk (3. Ábra).

Az általunk használt egerek lényeges tulajdonsága, hogy

immunkompetensek, spontán malignus tumor képződésre nem hajlamosak,

és jóindulatú papillómák is csak nagyon idős korban jelentkeznek az

állatokon (Sundberg 1994). Az egerek hátán az epidermisz vastagsága

megközelítőleg 30 µm (két sejtsoros), az epidermális sejtek „turnover” ideje

1-2 hét. A szőrtelensége miatt kifejezett UV-abszorpciót mutató epidermisz

alkalmassá teszi ezt az egértípust az UV-fény hatásának (pl. az akut, vagy a

krónikus fénykárosodás, fotokarcinogenezis, stb.) modellezésére (De Gruijl

14

és mtsa. 1995). Kísérleteinkhez 5-8 hetes, 18-26 g súlyú, nőstény egereket

használtunk. Az állatokat kórokozó mentes környezetben, 12 órás periódikus

(sötét/világos) megvilágítás alkalmazásával, 22-25°C-on, 50-70%

páratartalom mellett, általánosan használt egértápon és csapvíz itatással

tartottuk. Az állatok egyéni identifikálása a fülön történő jelöléssel, a

ketreceké pedig kártyával történt.

I./1.2. Lokális kezeléshez alkalmazott készítmények

BGP-15M (PARP-regulátor) az O-(2-hidroxi-3-piperidino-propil) piridin-3-

karboxil sav amidoxim monohidroklorid sója. A molekula, amelyet lokális

alkalmazásra állítottak elő, az orális, szisztémás alkalmazásra szánt

dihidroklorid sóval szemben a BGP-15M jelölést kapta (előállító: N-GENE

Res. Lab., New York). A lokális készítményre vonatkozó adatokat az előállító

bocsátotta rendelkezésünkre. Vizes oldata enyhén savas kémhatású (pH

5,6). Por formában fehér, nem higroszkópos kristályos anyag. Vízben

oldódik. A BGP-15M két enantiomert (+ és -) tartalmaz, a molekula chilaris

centruma mentén. A BGP-15M jelölés egyben a racem keverékre utal. A

kísérletekhez előállított krém 5-20% koncentrációban tartalmazott BGP-15M-

t. Az elvégzett stabilitási (fotostabilitási) vizsgálatok alapján a BGP-15M a

krémben stabilnak bizonyult. A preklinikai biztonsági vizsgálatok (toxikológia,

mutagenitás, farmakológia, farmakokinetika) dominálóan orális adást

követően, bizonyos esetekben dermális kezeléshez társulva (pl. akut

dermális toxicitás egérben, szőrtelen egérben, akut dermális irritáció nyúlban,

szubakut (28 napos) dermális toxicitás két hetes követéssel patkányban)

15

történt. Az ismertetett adatok alapján a krém formula a biztonsági vizsgálatok

során lokális (eritéma, ödéma), és szisztémás (letalitás, belszervi

makroszkópos és mikroszkópos eltérések, testsúly csökkenés) kóros

elváltozásokat nem okozott.

BGP-15M lokális készítmény vivőanyaga olaj a vízben (O/V) típusú, kis

zsírtartalmú kenőcs (desztillált víz, glicerin, sztearin, cetil-sztearil-alkohol,

fehér vazelin, folyékony paraffin, lecitin, polietilénglikol-cetilsztearil éter

(etoxiszáma 6) polietilénglikol-cetilsztearil éter (etoxiszáma 25) (Ph.Hg.VII.

szerinti magyar névvel feltüntetve).

Az „AS” jelzésű készítményt kísérleteinkben kontrollként használtuk. A

kereskedelmi forgalomban kapható, Mexoryl® SX komponense által az UVA

tartományban is hatékony, fotostabil fényszűrőt tartalmazó, SPF (Sun

Protection Factor) 30 és anti UVA/UVB jelzésű (széles spektrumú, a fény

UVB és UVA tartományát lefedő), korszerű fényvédőt választottuk ki

referencia készítményként, és jelöltük ”AS”-sel. A kontroll készítmény

összetétele a következő: desztillált víz, octocrilen, ciclopentasiloxan, titán-

dioxid, glicerin, propilénglikol, izohexadekán, sztearin, butil-

metoxidibenzoilmetán, oktil-palmitát, sztearil-heptanoát, PVP/eikozén

kopolimer, nátrium-cetil-foszfát, jojoba, tokoferol-acetát, metilcellulóz

propilénglikol éter, fenoxietilalkohol, sztearil-kaprilát, polietilénglikol

sztearinsav észtere (100 etilénoxid csop.), etil-p-hidroxi benzoát,

trietanolamin, dimethikonol, szilikon olaj, propil-p-hidroxi benzoát,

tereftalidén-dikámfor-szulfon sav, akrilátok/C10-30 alkil-akrilát krosszpolimer,

dinátrium-EDTA, butirospermum parkii, cetil-alkohol, metil-p-hidroxi benzoát,

16

butil-p-hidroxi benzoát, alumínium-hidroxid, glicerilmonosztearát, parfüm

(C9794/1). (Ph.Hg.VII. szerinti magyar névvel feltüntetve).

A szőrtelen egerek törzsén kialakított egy, vagy több tesztterületet BGP-15M

tartalmú krémmel (hatóanyag tartalom: 5%, 10%, 15%, 20% BGP-15M),

illetve hatóanyagmentes vivőanyagával (vehikulum), vagy az ”AS”-sel jelölt

készítménnyel, 2 mg/ testfelszín cm2 krém egyenletes felvitelével kezeltük.

Az UV-fény akut károsító hatásának vizsgálata során az állatokat az UV-fény

expozíció előtt 15 perccel, egyszeri kezelésben részesítettük. Az UV-

besugárzás krónikus hatásának tanulmányozására végzett kísérletekben az

egerek tesztterületeit heti 5 alkalommal, egymást követő napokon, az UV-

irradiáció előtt 15 perccel, azonos időben és módon kezeltük.

I./1.3. Szőrtelen egerek UV-fény kezelése

Az UV-irradiáció kivitelezéséhez mesterséges (UVB- és UVA-tartományban

sugárzó) és természetes fényforrást (Nap) használtunk. Az UVB-

expozícióhoz a széles spektrumú UV21 Philips lámpát (13 cső, csőtípus: F

85/100 W, emissziós spektrum: 285-350 nm, peak: 310-315 nm, Waldmann

Medizintechnik, Villingen-Schwenningen) alkalmaztunk UVB-sugárzóként. Az

UVA-irradiációt Waldmann UV 8001K széles spektrumú UVA-készülékkel

(csőtípus: WF 85/100 W, emissziós spektrum: 320-400 nm, peak: 365 nm,

Waldmann Medizintechnik, Németország) végeztük.

A sugárzás méréséhez IL 700 spektroradiométert (koszinusz korrekciós SEE

detektorral) használtunk.

17

A természetes fénnyel, a napfénnyel végzett UV-expozíció paramétereinek

meghatározása a beeső teljes fotonszám mérése alapján Brewer MK3

Spektrofotometerrel és Brewer szoftverrel (Sci-Tec, USA) történt. (A mérések

végzéséért ezúttal szeretnénk köszönetet mondani Tóth Zoltánnak,

Országos Meterológiai Szolgálat Légkörfizikai Intézet, Budapest.) Az aktuális

maximális irradianciát és a biológiailag effektív intenzitásokat a fény UVB-

tartományának 287-320 nm hullámhosszúságú, valamint az UVA-tartomány

321-363 nm hullámhosszúságú részére adtuk meg. Hazánkban, a fény UVB-

tartományában az irradiancia maximális értéke: 1,2-1,3 J/cm2/h, az UVA-

tartományában pedig: 8,5-8,6 J/cm2/h.

A vizsgálat időpontjában a fény UVB-tartományában (287-320 nm-re

integrálva) az irradiancia maximális értéke: 1,08 J/cm2/h volt. A vizsgálat

időpontjában a fény UVA-tartományában (321-363 nm-re integrálva) az

irradiancia maximális értéke: 8,3 J/cm2/h-nak bizonyult. Ez az érték 321-380

nm tartományban 13 J/cm2/h.

A biológiailag effektív intenzitások: UVB (287-320 nm): 0,07 J/cm2, UVA

(321-363 nm): 0,015 J/cm2. A számítások végzéséért szeretnénk köszönetet

mondani Erostyák Jánosnak (PTE Kísérleti Fizikai Tanszék, Pécs).

Az állatokat a besugárzáshoz a mesterséges UV-fényforrástól 30 cm-re

helyeztük el. A bőrfelszínen mért sugárzás intenzitás alapján határoztuk meg

az egyes kísérlet során a sugárzó által leadandó dózist. (A sugárzó és a

spektroradiométer kalibrálása, az előírás szerinti rendszeres időszakonként,

a szakszerviz által történt.) Minden egyes kísérlet előtt meghatároztuk a

minimális eritéma dózist (MED), amelyet mJ/cm2, illetve J/cm2-ben adtunk

meg.

18

A szoláris UV-fény kezeléshez az állatokat speciális egérlapon rögzítettük,

amely biztosította a tesztterület standard kezelését és a környező bőr

biztonságos takarásának megoldását. Az UVA-besugárzás, valamint a

szoláris expozíció esetén az állatokat a hőhatástól alulról, átfolyásos

vízhűtéssel működő rendszerrel védtük.

Az UVA-fénnyel, a krónikus fénykárosodás megítélésére (pl.:

fotokarcinogenezis tanulmányozásához) végzett kísérletek során, a

besugárzási idő csökkentése céljából „forszírozott UVA”-kezelést, vagyis

pszorálen (8-metoxi-psoralen (8-MOP), Geroxalen® oldattal fényérzékenyített

tesztterületeket sugaraztunk be (Lowe és mtsai. 1987). A 8-MOP oldattal

történt ecsetelés és az UVA-irradiáció között 30 perc telt el.

A napfény expozíciót felhőmentes nyári napon 12-13 óra között végeztük. Az

előkísérletek során határoztuk meg mindazon feltételeket, amelyek az állatok

számára az általunk megítélt legkíméletesebb eljárást biztosították.

I./1.4. A minimális eritéma dózis (MED) meghatározása szőrtelen

egereken

A minimális eritéma dózis (MED) alatt azt az UVB-fény által közvetített

energiamennyiséget értjük, amely a bőr minimális eritémás reakciójának

előidézéséhez szükséges (Lowe 1990). A MED meghatározásához az

egerek fedetlen bőrén kialakított 6 db, egyenként 0,25 cm2 területű

tesztterületet emelkedő dózisú (0,12 J/cm2-től induló) UVB-fénnyel

sugaraztuk be. A MED leolvasása 24 órával az UVB-besugárzást követően,

19

ugyanazon személy által történt (az interperszonális eltérések elkerülése

céljából).

I./1.5. UVB-expozíció akut hatásának vizsgálata PARP-regulátorral

kezelt egérbőrön

Az egerek hátán (thoracalis régió), a reakciómentes, ép bőrön, 2 x 1,44 cm2-

es nagyságú, egymás alatt elhelyezkedő (egymástól legalább 0,8 cm

távolságra levő), tesztterületet alakítottunk ki, és használtunk a kísérletekben

(antieritematogén koncentráció meghatározásra, fényvédő hatás

összehasonlító vizsgálatára UVB-tartományban, stb.) - az állatok számát az

egyes kísérleteknél tüntettük fel. Az egerek kezeléséhez a PARP-regulátor

BGP-15M tartalmú krémet (hatóanyagtartalom: 5%, 10%, 15% és 20%)

alkalmaztuk, illetve vivőanyagát használtuk. Az egerek krémmel történő

előkezelését 1.2. pontban leírtak szerint végeztük. Ezt követően az állatokat

egyszeri, eritémát okozó UVB-irradiációban részesítettük. Az alkalmazott

MED dózisának meghatározása 24 órával a kísérlet előtt 3 állaton történt. A

környező bőrfelszíneket az UV-behatástól takarással védtük. A negatív

kontroll csoportot a krémmel nem kezelt, UV-expozícióban nem részesült

állatok képezték. Az irritatív hatás vizsgálatára 20% BGP-15M tartalmú

krémmel kezelt, UV-expozícióban nem részesült állatok csoportja szolgált.

Az UVB-irradiáció után közvetlenül, a BGP-15M krémet, illetve vivőanyagát

az állatok bőréről eltávolítottuk.

A vizsgálatokat az egerek I.-VI. csoportjával (jelölés: /1= felső, /2= alsó

tesztterület) végeztük, melyek a következő kezelésben részesültek: I.: I./1.:

20

vivőanyag + UVB, I./2: 5% BGP-15M + UVB; II.: II./1.: vivőanyag + UVB, II./2:

10% BGP-15M + UVB; III.: III./1.: vivőanyag + UVB, III./2: 15% BGP-15M +

UVB; IV.: IV./1.: vivőanyag + UVB, IV./2: 20% BGP-15M + UVB; V.: 20%

BGP-15M; VI.: kezeletlen, negatív kontroll. A tesztterületek elrendezésével

biztosítani kívántuk az esetleges individuális különbségekből adódó eltérések

minimálisra csökkentését. A lokálisan alkalmazott PARP-regulátor hatásának

vizsgálatához a bőrmintákat az UVB-besugárzás után közvetlenül, vagy 24

óra elteltével excízióval nyertük. Az állatokat cervicalis dislocatioval

pusztítottuk el.

I./1.6. Egérbőr kezelése a PARP-regulátor és ismert fényvédő faktorú

készítmény antieritematogén hatásának összehasonlító

vizsgálatához

A BGP-15M antieritematogén hatását a forgalomban kapható, széles

spektrumú (UVA és UVB tartományban ható), általunk ”AS”-sel jelölt,

fényvédő készítménnyel hasonlítottuk össze.

Az egerek háti felszínén kialakított 1,44 cm2-es tesztterületek közül a

proximálisat „AS” jelzésű krémmel, a disztálisat pedig 10%, 15%, vagy 20%

BGP-15M tartalmú krémmel kezeltük az egymáshoz viszonyított

antieritematogén hatás megítéléséhez. Az egyes készítmények, kísérleti

körülményeink között, az eritéma kialakulására kifejtett gátló hatásának

meghatározásához a proximális tesztterületet UVB-irradiációban

részesítettük (pozitív kontroll), a disztális tesztterületet pedig „AS” jelzésű,

vagy 15% BGP-15M krémmel kezeltük. A tesztterületeket egyszeri, 2 MED

dózissal UVB-irradiációban részesítettük, a környező bőr takarással

biztosított védelme mellett. A MED meghatározása (I./1.4. pont) a kísérlet

21

előtt 24 órával, 3 állaton történt. Negatív kontrollként kezeletlen, UVB-

expozícióban nem részesült egerek csoportja szolgált. A krémet az állatok

bőréről az UVB-irradiáció után közvetlenül eltávolítottuk.

A kezelés alapján a vizsgálatokhoz az állatok következő csoportjait

használtuk: I.: I/1.:AS + UVB, I./2.:10% BGP-15M+UVB; II.: II./1.:AS + UVB,

II./2.: 15% BGP-15M+UVB; III.: III/1.: AS+UVB, III./2.: 20% BGP-15M+UVB;

IV.: IV./1.: UVB, IV./2.: AS+UVB; V.: V./1.: UVB, V./2.: 15% BGP-15M+UVB;

VI.: kezeletlen, negatív kontroll csoport. A tesztterületek elrendezésével

biztosítani kívántuk az esetleges individuális reakciókülönbségből adódó

eltérések minimálisra csökkentését. Az antieritematogén hatást az UVB-

besugárzás után 24 és 48 órával vizsgáltuk.

I./1.7. Szőrtelen egerek kezelése PARP-regulátorral szoláris-expozíció akut

hatásának vizsgálatához

A PARP-regulátor, a napfény akut károsító hatásával szembeni fotoprotektív

tulajdonságának vizsgálatához a szőrtelen egerek csoportjait 10%, 15%,

vagy 20% BGP-15M tartalmú krémmel, valamint vivőanyagával és az

ismertettek alapján kezeltük. Az állatok felhőtlen nyári napon, délben (12-13

óra), speciálisan erre a célra kialakított (hőhatást csökkentő rendszer)

körülmények között (I./1.3. pont) részesültek a tesztterületeken 1 órán

keresztül természetes napfény expozícióban. Az egerek a napoztatási idő

alatt mért irradiancia alapján összesen 8,3 J/cm2/h UVA és 1,08 J/cm2/h UVB

dózisú sugárzást kaptak. Az állatokat a tesztterületek kivételével az UV-

fénytől védtük. Negatív kontrollként kezeletlen, az UV-fénytől a teljestest

22

takarásával védett (sham-irradiált) egerek szolgáltak. A BGP-15M krémet,

illetve vivőanyagát az állatok bőréről az UV-irradiáció után közvetlenül

eltávolítottuk.

A kezelés alapján az egerek következő csoportjait használtuk: I.: I./1: 10%

BGP-15M + UV, I./2.: vivőanyag + UV; II.:II/1.: 15% BGP-15M + UV, II./2.:

vivőanyag + UV; III.: III./1: 20% BGP-15M + UV, III./2.: vivőanyag + UV; IV.:

15% BGP-15M; V.: kezeletlen, negatív kontroll. Az állatok egy részét

közvetlenül az UV-expozíció után cervicalis dislocatioval elpusztítottuk, a

tesztterületekből nyert bőrmintákat további feldolgozásig fagyasztva (-70°C)

tároltuk. A fennmaradó egerek bőrén az UV-irradiáció után 24 órával

végeztünk vizsgálatokat.

I./1.8. Szőrtelen egerek kezelése PARP-regulátorral UVB-expozíció

krónikus hatásának vizsgálatához

A PARP-regulátor, BGP-15M protektív hatását a krónikus UVB-irradiáció

bőrelváltozásokat előidéző tulajdonságával szemben, azonos életkorú (6

hetes), 18-21g súlyú, nőstény szőrtelen egereken vizsgáltuk. Az egerek

hátán (n=20 állat/csoport), a középvonalban 12 x 18 mm-es tesztterületet

alakítottunk ki, melyet 15% BGP-15M tartalmú krémmel, vagy annak

vivőanyagával (n=20 állat) előkezeltünk. Az állatok az előkezelés után napi

egyszeri, 1 MED UVB-besugárzást kaptak, heti öt egymást követő napon

keresztül. A MED dózisának meghatározása 24 órával a kísérlet elkezdése

előtt 5 egéren történt. Az állatok tesztterületen kívül eső bőrét takarással

védtük az UV-sugárzással szemben. Tíz egér nem részesült kezelésben. Ez

23

a csoport volt a negatív kontroll. A kontroll csoportba tartozó egerek

bőrállapota (makroszkópos és mikroszkópos) szolgált a „photoaging” (fény

általi öregedés) mentes kronológiai öregedés („aging”) követésére. Öt állatot

a tesztterületnek megfelelően 15% BGP-15M tartalmú krémmel kezeltünk

(UVB-fénytől védve) az irritatív vagy allergiás reakciók vizsgálata céljából. Az

UVB-irradiáció után közvetlenül a BGP-15M krémet, ill. vivőanyagát az

állatok bőréről eltávolítottuk.

A kialakított vizsgálati csoportok a következők: I.: 15% BGP-15M + UVB; II.:

vivőanyag + UVB; III.: 15% BGP-15M; IV.: kezeletlen, negatív kontroll. Az

állatokat 32 héten át kezeltük és követtük. A 6. héttől kezdve az egyes

csoportokból cervicalis dislocatioval elpusztított egerek bőrmintáin

hisztológiai, immunhisztokémiai és elektronmikroszkópos vizsgálatokat

végeztünk.

I./1.9. Szőrtelen egerek kezelése PARP-regulátorral UVA-expozíció

krónikus hatásának vizsgálatához

A PARP-regulátor BGP-15M potenciális fotoprotektív tulajdonságát a

krónikus UVA-irradiáció által a szőrtelen egerek bőrében előidézett

változásokra („photoaging” és fotokarcinogenezis) „forszírozott-UVA”

kezelésben részesített (1.3. pont), azonos korú (7 hetes), nőstény egereken

vizsgáltuk. Az egerek hátán 2,25 cm2 (1,5x1,5 cm) tesztterületek (n=2)

kerültek kialakításra. Az állatokat 8-metoxipsoralen (8-MOP, Geroxalen®,

Gerot Pharmazeutika, Wien) 0,15%-os oldatának használatával

fényérzékenyítettük. Az egerek előkészítése a kísérlethez a

24

következőképpen történt: 5 µl/cm2 8-MOP oldattal a tesztterületeket

bekentük, az egereket sötétbe helyeztük, majd 30 perc múlva, a 15% BGP-

15M tartalmú krémmel, vagy annak vivőanyagával kezeltük és 15 perc

elteltével UVA-irradiációban részesítettük. Az állatok UVA- és a „forszírozott-

UVA” kezeléssel (8-MOP + UVA) szembeni érzékenységének vizsgálatára

külön állatcsoportot állítottunk be (krémkezelést nem kaptak). További, 15%

BGP-15M tartalmú krémmel kezelt (UVA-expozíciótól védett) egerek

szolgáltak az esetlegesen fellépő irritatív, vagy allergiás reakció vizsgálatára.

A fentiek mellett kezeletlen kontroll csoportot használtunk. Az egerek heti 5

alkalommal, napi 0,5 J/cm2 UVA-besugárzást kaptak 26 héten keresztül. Az

állatok tesztterületen kívül eső bőrét takarással védtük. Az UVA-irradiáció

után közvetlenül a kezelésre használt krémeket (BGP-15M tartalmú, illetve

vivőanyag) az állatok bőréről eltávolítottuk.

A kezelés szerint az állatokat a következő csoportokba osztottuk: I.:I./1.: 8-

MOP + UVA, I./2.: UVA; II.: II./1.: 8-MOP + vivőanyag + UVA; II./2.: 8-MOP +

15% BGP-15M krém + UVA ; III.: III./1.: 8-MOP + vivőanyag, III./2.: 15%

BGP-15M krém; IV.: kezeletlen kontoll (n=6 egér/csoport). A kontroll

csoportba tartozó egerek bőrállapota szolgált a kronológiai öregedés

követésére. A rendszer összeállítása lehetővé tette az egerek UVA- és

„forszírozott-UVA” érzékenységének (makro- és mikromorfólógiai)

megítélését, valamint az önkontrollos elhelyezés az esetleges individuális

különbségekből adódó eltérések minimálisra csökkentését. Az egereket 26

héten át kezeltük és követtük. A 26. hét végén cervicalis dislocatioval

elpusztított egerekből vett bőrmintákat használtuk a hisztológiai és

immunhisztokémiai vizsgálatokhoz.

25

I./2. Klinikai tünetek értékelése

I./2.1. Klinikai vizsgálatok akut és krónikus UV-expozícióban

A különböző kezelésben részesült egerek tesztterületeinek bőrállapotát

vizuálisan és dermatoszkóppal vizsgálva összehasonlítottuk a kezeletlen

kontroll állatokéval. Az akut UV-expozíció által kiváltott fénykárosodás klinikai

tüneteit (eritéma, ödema, vezikula, bulla, erózió) az UV-besugárzás után

közvetlenül és 24 órával azt követően, öt fokozatú skála (0-4 pont) szerint

értékeltük (I/2.2. pont) és tüntettük fel az egérkövetési lapokon.

A krónikus UVB- és UVA-besugárzás során a szőrtelen egerek tesztterületeit

hasonló módon, a kezelések előtt, hetente 5 alkalommal, valamint a

kísérletek befejezésekor vizsgáltuk. A klinikai tünetek (eritéma, pigmentáció,

erózió, exulceráció) intenzitását (I/2.2. pont) értékeltük. Az átmérő ≥1 mm

nagyságú tumorokat vettük figyelembe és tüntettük fel. Az észlelteket az

egérkövetési lapon regisztráltuk. Az egyes csoportok bőrstátuszában

bekövetkezett változásokat átlagosan 4 hetente, valamint a kísérlet végén

fotódokumentációval rögzítettük.

I./2.2. Klinikai tünetek értékelése pontszámmal

A klinikai tünetek meglétének és intenzitásának értékeléséhez öt fokozatú

skálarendszert használtunk. A tünetek súlyosságát 0-4 ponttal: 0 = nincs, 1 =

nagyon enyhe, 2 = enyhe, 3 = közepesen súlyos, 4 = súlyos fejeztük ki.

26

Eritémára vonatkoztatva: 0 = nincs, 1 = nagyon enyhe (alig észlelhető), 2 =

enyhe (jól látható), 3 = közepesen súlyos (vörös), 4 = súlyos (mélyvörös);

ödémára: 0 = nincs, 1 = nagyon enyhe (alig megítélhető), 2 = enyhe (érintett

terület előemelkedő széllel bír), 3 = közepesen súlyos (a bőr szintje fölé

emelkedik <1mm-rel), 4 = súlyos (>1mm-rel emelkedik a bőr szintje fölé).

A krónikus UVB- és UVA-besugárzás során a szőrtelen egerek

tesztterületein a klinikai tüneteket (eritéma, pigmentáció, erózió, exulceráció)

hasonló módon értékeltük. A krónikus UVA-besugárzás során hat fokozatú

skálát alkalmaztunk (0 = nincs - 5 = nagyon súlyos).

I./3. PARP enzim auto-ADP-ribozilációjának vizsgálata Western-blot

analízissel

A PARP auto-ADP-ribozilációját különböző bőrmintákban (kezeletlen, nem

besugárzott; 15% BGP-15M tartalmú krémmel kezelt; 15% BGP-15M

tartalmú krémmel, vagy vivőanyaggal előkezelt és UV-fénnyel besugárzott)

határoztuk meg (Szabados és mtsai. 2000). A bőrmintákat (20-22 mg/minta)

250 µl 50 mM Tris pufferben (pH 7,8) Ultra-Turrax készülékben

homogenizáltuk, majd 8 M karbamid tartalmú 2x Laemmli puffer 250 µl-ének

hozzáadását követően Potter-Elvehjem teflonos homogenizátorban

(Wheaton) tovább homogenizáltuk, majd centrifugáltuk (5 perc, 10.000 rpm).

A mintákban levő fehérjéket SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel (8%-os

gél) szeparáltuk és nitrocellulóz membránra blottoltuk (Western-blot analízis)

(Szabados és mtsai. 2000). Az ADP-ribozilált fehérjék kimutatására anti-

ADP-ribóz monoklonális antitestet (Dr. Alexander Berkley, Heidelberg és Dr.

Masanao Miva, Tsukuba bocsátotta rendelkezésünkre) és anti-egér IgG

27

peroxidáz komplexet (Sigma, München) használtunk. Az antitest-antigén

komplex megjelenítését ECL (Enhanced Chemiluminescence) módszerrel

végeztük. A Western-bloton kapott jelek kvantitatív meghatározása „Image

Tool (Version 1.27) image processing” programmal (University of Texas,

Health Science Center, San Antonio) történt.

I./4. „Sunburn” sejtek kvantítatív meghatározása

A „sunburn” sejtek UV-fény expozicíó hatására a bőrben megfigyelhető

apoptótikus keratinociták. A „sunburn” keratinociták a környező sejtektől

különálló, lekerekedett alakú, zsugorodott, eozinofil citoplazmával,

vakuolumokkal rendelkező, kondenzált, piknotikus sejtmaggal bíró sejtek

(Ziegler és mtsai. 1994). A jellegzetes morfológiai elváltozásokkal rendelkező

„sunburn” sejteket felhasználják a fénykárosodás mértékének

megítélésében.

Az eozinofilen festődő, nukleusz nélküli, vagy piknotikus maggal rendelkező

„sunburn” sejtek számát a szövetminták 10%-os pufferolt formalinban fixált,

paraffinba ágyazott, He-festett, 4 µm-es metszetein, a bazálmembrán 250

µm-es szakasza (kalibrált ocular, Periplan GF 10x/20 Leitz, Nürnberg) feletti

interfollikuláris epidermiszben, 400x nagyítás mellett (Diaplan

fénymikroszkóp, Leitz, Nürnberg) határoztuk meg. Az állatonként 16

látótérben (80 látótér/csoport) vizsgált „sunburn” sejtek számának átlagát 1

mm hosszúságú epidermiszre vonatkoztatva (átlag ± SEM/mm epidermis)

adtuk meg.

28

I./5. Hisztológiai vizsgálatok

A vizsgálatokhoz a szövetmintákat narkózisban, vagy az állatok cervicalis

dislocatioval történő elpusztítása után nyertük. Az így kapott anyagot, vagy

azonnal feldolgoztuk, vagy a további feldolgozásig -70°C-on tároltuk.

Kimetszés után közvetlenül a bőrminták egy részét Tissue Freezing

Mediumot (Cambridge Instruments, Heidelberg) használva beágyazóként,

folyékony nitrogénben lefagyasztottuk. A blokkokat feldolgozásig -70°C-on

tároltuk. Az immunhisztokémiai vizsgálatokhoz 6 µm-es metszeteket

készítettünk (-24°C, Reichert-Jung Cryocut 1800 kriosztát, Leica, Nusslock).

Másrészt, a szövetmintákból formalinos fixálás (fedeles beágyazó

kazettában, (Bio-Optica, Milánó), 4,5% pufferolt formalin, pH 7,0, 9-24 h),

paraffinba való beágyazás (Citadel 1000 víztelenítő automata (Shandon,

Runcorn), 22 h, felszálló alkohol sor: 50% etilalkohol, 70% etilalkohol, 80%

etilalkohol, 96% etilalkohol, aceton, amilacetát + paraffinolaj (1:1), xylol

(Reanal, Budapest), paraffin (tissuewax, olvadáspont: 52-54°C, (Medite,

Burgdorf)) történt. Rotációs mikrotómmal (Leica RM 2135 rotációs mikrotóm,

Nusslock) 4 µm-es (felvétel és tárgylemezre olvasztás, 56°C, 30 min.)

metszeteket készítettünk. A festések előtt deparaffinálást és rehidrálást (xilol

2x10 min., abszolut alkohol, 96% alkohol 2x, 80% alkohol, 70% alkohol, 50%

alkohol), majd 3x csapvizes öblítést végeztünk (Mikkel 1994, Luna 1968).

29

I./5.1. Hematoxilin-eozin (He) festés

A metszeteket hematoxilin oldattal (Merck, Darmstadt) 8 percig festettük,

majd kékítést (2 min., csapvíz) követően a további festést eozin oldattal

(Merck, Darmstadt) szintén 8 percig végeztük. A víztelenítéshez felszálló

alkoholsort (70% etilalkohol 2x, 90% etilalkohol, 96% etilalkohol 2x, abszolut

alkohol 2x, abszolút alkohol+xilol 1:1 arányú keveréke, xilol 2x) használtunk.

A készítményt Pertex oldattal (Medite, Burgdorf) fedtük (Mikkel 1994, Luna

1968).

I./5.2. Fontana-Masson festés

A melanin kimutatására paraffinos metszeteken argentaffin reakciót

végeztünk Fontana-Masson módszere szerint (Krobock és mtsai. 1978).

Deparaffinálást és rehidrálást követően a metszeteket 2%-os AgNO3 oldattal

(Reanal, Budapest) inkubáltuk (szobahő, 2h), majd mosás után hidegen

telített (5%) nátriumtioszulfát oldattal (Reanal, Budapest) kezeltük (szobahő,

2 min.), folyó csapvizes mosás (30 min.) után háttérfestésként Mayer-féle

kármint (Merck, Darmstadt) alkalmaztunk (3 min.). Dehidrálást követően a

fedés Pertex oldattal (Medite, Burgdorf) történt.

I./5.3. Orcein-Giemsa festés

A rugalmas rostok vizsgálatára paraffinos metszeteken Orcein-Giemsa

festést végeztünk (Krobock és mtsai. 1978). Deparaffinálást és rehidrálást

30

követően a metszeteket orcein (Merck, Darmstadt) savanyított alkoholos

oldatával festettük (20 min.). Abszolut alkohollal való differenciálás, Giemsa

oldattal (Reanal, Budapest) történő háttérfestés (5 min.) és dehidrálás után, a

fedés Pertex oldattal (Medite, Burgdorf) történt.

I./6. Immunhisztológiai vizsgálatok

Az egérbőrből nyert, 6 µm-es kriosztátos metszeteket üveg tárgylemezen,

hideg acetonban (4°C, 10 min.) fixáltuk. A szövetminták minőségének

ellenőrzésére a metszeteken hematoxilin-eozin festést végeztünk. Az

immunhisztokémiai reakcióhoz anti-poli-ADP-ribóz poliklonális antitestet

(hígítás: 1:1000 TBS-ben, Biomol, Hamburg) használtunk, az inkubációt

szobahőmérsékleten, 60 percig végeztük, és a streptavidin-biotin-peroxidáz

módszert alkalmaztuk (H2O2/aminoetilkarbazol (AEC) előhívás, Immunotech

Universal kit (Immunotech, Marseilles)). Negatív kontrollként nem immunizált

egér hasűri folyadéka szolgált (Mikel 1994).

I./7. Elektronmikroszkópos vizsgálatok

Elektronmikroszkópos vizsgálathoz a frissen eltávolított bőrmintákat 12-24

órán át, 4°C-on Karnovszky fixálóban (1% paraformaldehid és 2,5%

glutáraldehid keveréke, Reanal R, SERVA) inkubáltuk, majd 1%-os

ozmiumtetroxidban utófixáltuk (90 min.). Dehidratáció után az anyagot

Araldit-be (Fluka) ágyaztuk. Az ultravékony metszeteket uranil acetáttal és

ólom citráttal (MERCK) kontrasztosítottuk, és JEOL 1200 EX II

transzmissziós elektromikroszkópon vizsgáltuk (Pease 1964).

31

II. Eredmények

1. PARP-regulátor szerepe a bőr UV-fény károsodása elleni

védelemben

2. PARP-regulátor hatásának vizsgálata UV-fény indukálta

karcinogenezisben

Napjainkban a bőr vonatkozásában a legjelentősebb környezeti DNS

károsító faktor a napfény UV tartománya. Egyszeri, magas dózisú napfény-

expozíció alkalmazásával vizsgáltuk a PARP-regulátor (5-20% BGP-15M

hatóanyag tartalmú krém) potenciális DNS-protektív hatását

immunkompetens hairless (szőrtelen) egérmodellen. Az UV-sugárzás által az

egérbőrben indukált akut DNS-károsodás mértékét a bőrben képződött

egyes láncú DNS-törések mennyiségének meghatározásával, továbbá az

UV-irradiáció által okozott DNS-károsodás markereként nyilvántartott

epidermális „sunburn” sejtek (apoptótikus keratinociták) képződésének

kvantitatív, valamint ultrastruktúrális vizsgálatával jellemeztük.

II./1.1. PARP-regulátor hatása az UV-sugárzás indukálta egyes láncú

DNS törések képződésére a bőrben

Az egyes láncú DNS törések meghatározását DNS-lánc szétcsavarodásán

alapuló fluoreszcenciás módszerrel végeztük. Mint ismert, a DNS a törések

környezetében szétcsavarodik és csak a sérülés mentes régiókban marad

meg kettős láncú formában. Ugyanakkor a kettős láncú DNS-hez kötődő

32

ethidium-bromid fluoreszcenciája sokkal magasabb, mint hasonló

körülmények között az egyes láncúé.

Az egyszeri, magas dózisú, természetes UV-expozíció (napfény) akut bőr

DNS-károsító hatását szőrtelen egérmodellen vizsgáltuk.

Rendszerünkben a napfény expozícióban nem részesült, kezeletlen egerek,

valamint a 15% BGP-15M tartalmú krémmel kezelt csoport bőrmintáiban a

DNS nagy része (átlagosan 80%) károsodást nem szenvedett, kettős láncú

DNS-nek bizonyult. Ugyanakkor az intenzív napfény expozíciónak (egy óra

alatt 8,3 J/cm2 UVA és 1,08 J/cm2 UVB) kitett egérbőrben a vivőanyaggal

kezelt mintákban az egyes láncú DNS törések mennyiségének jelentős

megnövekedése következtében, a nem károsodott DNS aránya 30% alá

csökkent (1. Táblázat). A napfény behatás előtt PARP-regulátorral (15%

BGP-15M tartalmú krém) végzett lokális előkezelés az intenzív UV-sugárzás

által indukált nagyfokú DNS-károsodás mértékét szignifikánsan (p<0,01)

csökkentette, a mintákban (n=5) az ép DNS aránya meghaladta az 50%-ot

(4. Ábra).

II./1.2. PARP-regulátor hatása az akut UVB-sugárzás indukálta

„sunburn” sejtek képződésére

Az apoptótikus sejthalál egyik prototípusának tartott „sunburn” sejtképződés

kvantitatív meghatározásával vizsgáltuk egérbőrben, az elszenvedett UV-

fény károsodás mértékét. Rendszerünkben (I./1.5. pont) a PARP-regulátorral

vagy a hatóanyagot nem tartalmazó vivőanyaggal előkezelt egércsopotok

tesztterületeiben egyszeri, eritémát okozó (2 MED) UV-irradiáció hatására

33

jelentkezett „sunburn” sejtek (apoptótikus keratinociták) számát hasonlítottuk

össze az UV-sugárzástól védett (kezeletlen) kontroll állatok bőrében

észleltekkel. A „sunburn” sejtek kvantitatív meghatározását 24 órával az

UVB-expozíció után vett bőrmintákból készült, hematoxilin-eozinnal festett

hisztológiai készítményekben vizsgáltuk.

Az UVB-besugárzástól védett, kontroll állatok bőrmintáiban az epidermisz 1

milliméteres bazálmembrán feletti szakaszán a „sunburn” sejtek átlagos

száma 0,5 ± 0,2 volt (2. Táblázat). Az UV-expozíció hatására a vivőanyaggal

kezelt bőrben, az ugyanekkora epidermisz szakaszon megfigyelhető

„sunburn” sejtek száma hetvenötszörösére (37,4 ± 1,4 sejt/mm) nőtt, ami

kifejezett DNS-károsodásra utalt (5. Ábra). A PARP-regulátorral történt

előkezelés már az 5% BGP-15M hatóanyag tartalom mellett szignifikánsan

(p<0,01) csökkentette az UVB-besugárzás által indukált apoptótikus

keratinociták képződését (8,8 ± 0,4 sejt/mm epidermisz), ami a szer

magasabb koncentrációinál (10% és 15%) még kifejezettebben érvényesült

(1,6 ± 0,3 és 1,1 ± 0,4 sejt/mm epidermisz) (6. Ábra). A 15% BGP-15M

tartalmú krém előkezelés 34-szeres védelmet mutatott az egyszeri, eritémát

okozó (2 MED) UVB-sugárzás apoptótikus sejthalált kiváltó hatásával

szemben. Amennyiben az UVB védelmi képesség megítélésének elterjedt

módját, a protektív faktort használjuk, úgy a PARP-regulátor (15% BGP-15M

tartalmú krém) protektív faktora a „sunburn” sejt képződésre: 34 (2.

Táblázat).

Az apoptótikus keratinociták számával meghatározott, UVB-expozíció

indukálta DNS-károsodásra vonatkozó eredmények összhangban vannak a

napfény által okozott, a bőrben képződött egyes láncú DNS törések

34

kvantitatív vizsgálatával kapott adatokkal, és a PARP-regulátor feltételezett

fotoprotektív tulajdonságát véli alátámasztani.

II./1.3. PARP-regulátor hatásának ultrastruktúrális vizsgálata az akut

UVB-sugárzás indukálta DNS-károsodásra a bőrben

A lokálisan alkalmazott PARP-regulátor hatását az akut UVB-irradiáció által

okozott fénykárosodás ultrastruktúrális eltéréseit frissen eltávolított bőrminták

ultravékony metszeteiben transzmissziós elektronmikroszkóppal vizsgáltuk.

A kezeletlen, UV-fénytől védett szőrtelen egerek bőrmintáiban kóros

ultrastruktúrális eltérést nem észleltünk. Ugyanakkor az eritémát okozó (2

MED) UVB-besugárzásban részesült (vivőanyaggal előkezelt) egérbőrben a

felszíni hámréteg bazális és szuprabazális sejtrétegében az apoptózis

ultrastruktúrális jeleit mutató sejteket detektáltunk (7. Ábra). A kromatin

marginális kondenzációját, részleges nukleáris fragmentációt, a mag

zsugorodását, perinukleáris ödémát és az intercelluláris kapcsolat részleges

felbomlását lehetett megfigyelni. Az elváltozás megfelelt a „sunburn” sejtekre

jellemzőknek (7. Ábra). A lokálisan alkalmazott PARP-regulátorral (BGP-15M

tartalmú krémmel) előkezelt, UVB-irradiációban részesített állatok

bőrmintáiban apoptózisra jellemző sejtkárosodást az elektronmikroszkópos

feldolgozás során nem észleltünk (8. Ábra).

Az akut UV-expozícióval végzett ultrastruktúrális vizsgálatok eredményei

további adatot szolgáltattak a PARP-regulátor DNS-protektív szerepére.

35

II./1.4. PARP auto-ADP-ribozilációja és regulációja UV-besugárzott

bőrben

A poli(ADP-ribóz) polimeráz, egy olyan evoluciónárisan konzervatív nukleáris

enzim, mely az eukarióta sejtekben a környezeti (pl. UV-sugárzás) és

endogén genotoxikus hatásokkal szembeni DNS-károsodást elhárító

rendszer ismert szabályzó faktora (D’Amours és mtsai. 1999). A nagyfokú

DNS-károsodás, amely direkt módon, túlméretezett PARP-aktivációhoz

vezet, a nukleáris fehérjék fokozott poli-ADP-ribozilációja, valamint a PARP

auto-ADP-ribozilációja által előidézi a NAD+ és az ATP deplécióját, a sejt

energia metabolizmusának károsodását, és ezáltal a sejtfunkciók különböző

mértékű zavarát eredményezheti.

Az egyszeri, magas dózisú, természetes UV-expozíció akut DNS-károsító

hatása által a szőrtelen egérbőrben indukált PARP-aktiváció mértékét az

enzim auto-ADP-ribozilációjának mérésével határoztuk meg. Kísérleti

körülményeink között (I./1.7. pont) az egér csoportok tesztterületeinek az UV-

expozíció előtt különböző koncentrációjú BGP-15M tartalmú krémmel történő

kezelésével a PARP-regulátor enzimaktivitásra kifejtett hatását vizsgáltuk. A

PARP auto-ADP-ribozilációjának meghatározását az UV-irradiáció (napfény

expozíció) után közvetlenül eltávolított bőrmintákban végeztük. Western-blot

technikát alkalmaztunk, az ADP-ribozilált fehérjéket anti-poli(ADP-ribóz)

monoklonális antitesttel (peroxidáz komplex) detektáltuk, „ECL”-módszerrel

láthatóvá tettük, valamint „Image-Tool (verzió 1.27) image processing”

programmal a jelintenzitás erősségének mértékét kvantitatív módon

36

meghatároztuk (3. Táblázat). A továbbiakban immunhisztokémiai technikával

vizsgáltuk a bőrminták epidermális sejtjeiben a PARP ADP-ribozilációját.

II./1.5. PARP auto-ADP-ribozilációjának vizsgálata Western-blot

analízissel akut UV-fény expozícióban részesült egérbőrben

Kísérleti körülményeink között (I./1.7. pont) a kezeletlen szőrtelen egerek

bőrmintáiban az ADP-riboziláció mértéke (Western-blot jel) a nehezen

detektálható tartományba esett, ami arra utalt, hogy az UV-irradiációtól

védett állatok bőrében a PARP aktivációs szignál intenzitása (DNS törések

mennyisége) gyakorlatilag elenyésző volt (9. Ábra és 3. Táblázat). Az egy

órás napfény expozícióban részesült, vivőanyaggal előkezelt állatokból

származó bőrmintákban a PARP enzim auto-ADP-ribozilációja az UV-

sugárzástól védett kontroll bőrben meghatározott érték 25x-re nőtt.

Ugyanakkor a ≥ 10% BGP-15M tartalmú krémmel végzett előkezelés

hatására az UV-expozíció által kiváltott fokozott ADP-riboziláció mértéke, a

Western-blot analízissel kapott jelek intenzitásának kvantitatív

meghatározása alapján, több mint 50%-kal csökkent. A BGP-15M lokális

alkalmazásával, UV-besugárzás hatására a bőrben létrejött extrém magas

PARP-aktivitás (a PARP-enzim auto-ADP-ribozilációjával mérve) szignifikáns

mértékben (p<0,01) csökkent.

37

II./2. PARP-regulátor a bőr akut fénykárosodására kifejtett hatásának

klinikai vizsgálata

II./2.1. PARP-regulátor hatásának vizsgálata egyszeri UVB-expozíció

indukálta akut klinikai tünetekre

A lokális BGP-15M-kezelés potenciális fotoprotektív hatását szőrtelen egerek

bőrén, az egyszeri, eritematogén (2 MED) UVB-irradiáció által kiváltott, akut

fénykárosodás (dermatitis solaris) klinikai tüneteinek öt fokozatú skálán

történő értékelésével vizsgáltuk. A különböző koncentrációjú (5%, 10%, 15%

és 20%) BGP-15M tartalmú krémmel, illetve vivőanyaggal előkezelt

tesztterületeken az UVB-irradiáció után 24 órával jelentkezett klinikai tünetek

(eritéma, ödéma, vezikula, bulla, erózió) súlyosságát vizuálisan és

dermatoszkóppal határoztuk meg (10. Ábra). Az egyszeri, 2 MED UVB-

besugárzás hatására a vivőanyaggal kezelt csoportban 5 állatnál a

tesztterületen intenzív bőrpír (eritéma pont: 3), valamint enyhe ödéma

(pontérték: 2), egy állatnál pedig jól definiálható eritéma (pontérték: 2)

jelentkezett. Az alkalmazott kísérleti feltételek mellett > 5% BGP-15M

tartalmú krémmel végzett előkezelés teljes mértékű védelmet mutatott az

UVB-irradiáció indukálta akut klinikai tünetek kialakulásával szemben. Az

egerek 5% BGP-15M lokális kezelésben részesült tesztterületén egy állatban

jól definiálható eritéma és nagyon enyhe ödéma (pontérték: 2, illetve 1),

valamint két további esetben bizonytalan eritéma (pontérték: 1) jelentkezett.

A vizsgálat során a tesztterületeken (BGP-15M-krémmel kezelt UVB-

besugárzott és nem besugárzott) irritációra utaló elváltozást nem észleltünk.

38

Az alkalmazott kísérleti körülmények között a BGP-15M ≥ 10%

koncentrációban fotoprotektívnek bizonyult (10. Ábra). A továbbiakban ezt

tekintettük a BGP-15M antieritematogén koncentrációjának.

II./2.2. PARP-regulátor hatásának vizsgálata UVB-expozíció indukálta

akut hisztológiai elváltozásokra bőrben

A különböző koncentrációjú BGP-15M tartalmú krémmel, illetve vivőanyaggal

előkezelt (I/1.5. pont) egerek tesztterületének bőréből 24 órával az UV-

besugárzás után vett, valamint a negatív kontrollként szolgáló kezeletlen

állatok bőréből nyert szövetmintákat formalinos fixálást, paraffinos

beágyazást, He-festést követően vizsgáltuk. A vivőanyaggal előkezelt UVB-

expozícióban részesített bőrminták hisztológiai feldolgozása során a

kezeletlen kontrollhoz képest különböző mértékű, fénykárosodásra utaló

eltéréseket lehetett megfigyelni, melyek a következők voltak: számos,

eozinofil citoplazmával, piknótikus sejtmaggal rendelkező, vagy mag nélküli

apoptótikus keratinocita. A dermisz felső rétegében részben

perivaszkulárisan, részben a dermo-epidermális határ mentén ödémásan

fellazult alapállományban neutrofil granulociták láthatók, a papilláris réteg

erei dilatáltak, vér alakos elemeivel kitöltöttek, endotéljük duzzadt (11. Ábra).

A ≥ 10% BGP-15M tartalmú krémmel előkezelt állatok csoportjaiban a

kezeletlen kontroll bőrben észleltekhez képest lényeges kóros hisztológiai

eltérést nem találtunk.

A ≥ 10% BGP-15M tartalmú krémmel előkezelt, 2 MED UVB-besugárzott

bőrben a „sunburn” sejtek száma a bazális membrán 1 mm-es szakasza

39

feletti epidermiszben átlagosan egy-egy volt (2. Táblázat). Ugyanakkor a

vivőanyaggal kezelt, UVB-besugárzott állatok azonos hosszúságú

epidermisz szakaszában átlagosan 37 „sunburn” sejtet lehetett detektálni.

Amennyiben az UV-károsodás mértékét az egységnyi epidermiszben jelen

levő „sunburn” sejtek számával fejezzük ki, úgy a BGP-15M ≥ 10%

koncentrációban alkalmazva több mint harmincszoros védelmet jelent, az

egyszeri, eritematogén UVB-irradiáció károsító hatásával szemben (11.

Ábra).

II./2.3. PARP-regulátor antieritematogén hatásának összehasonlító

vizsgálata ismert fényvédő faktorú (SPF) készítménnyel

A BGP-15M tartalmú krémet ≥ 10% koncentrációban alkalmazva, egy

forgalomban levő, jól ismert, SPF (sun protection factor) 30 jelzésű, az UVB

és UVA tartományban védelmet biztosító (általunk ”AS”-sel jelölt)

készítménnyel hasonlítottuk össze antieritematogén hatás vonatkozásában.

A kísérletben egyszeri, eritematogén (2MED) UVB-besugárzást alkalmaztunk

(1.5. pont). Az egerek pozitív kontrollként használt, UVB-vel irradiált

tesztterületein (n=6) dermatitis szoláris klinikai tüneteit (eritéma pont: 3-2,

ödéma pont: 2-1) lehetett megfigyelni (12. Ábra). Az „AS”, illetve BGP-15M

előkezelésben részesült tesztterületeken az UVB-expozíció klinikai tünetet

nem okozott, a környező (UV-fénytől takarással védett) bőrrel, illetve a

negatív kontrollként használt állatok bőréhez hasonlítva makromorfológiai

eltérést nem észleltünk. Hisztológiai vizsgálattal „AS”, ill. BGP-15M

kezelésben részesített bőrmintákban lényeges kóros eltérést nem találtunk.

40

Az alkalmazott kísérleti körülmények között a ≥ 10% BGP-15M tartalmú krém

fotoprotektív hatása megegyezett az „AS” jelzésű, 30-as fényvédő faktorú

(SPF 30) készítményével.

II./2.4. PARP-regulátor fotoprotektív hatásának vizsgálata a bőr akut

szoláris károsodására

Szőrtelen egerek tesztterületeit magas dózisú szoláris UV-irradiációban

részesítettük. A maximális irradiancia a kísérlet időpontjában a fény UVB-

tartományában (287-320 nm-re integrálva): 1,08 J/cm2/h volt (hazánkban az

irradiancia maximális értéke: 1,2-1,3 J/cm2). Az UVA-tartományában (321-

363 nm-re integrálva): 8,3 J/cm2/h volt (hazánkban az irradiancia maximális

értéke: 8,5-8,6 J/cm2). A biológiailag effektív intenzitások: UVB (287-320

nm): 0,07 J/cm2, UVA (321-363 nm): 0,015 J/cm2. (A mérések az Országos

Meterológiai Szolgálat Légkörfizikai Intézetben, Budapest, a számítások a

PTE Kísérleti Fizikai Tanszékén történtek, Pécs).

Az állatok tesztterületei a napfény expozíció előtt 10%, 15%, illetve 20%

BGP-15M tartalmú krém, illetve vivőanyaggal előkezelésben részesültek

(1.5. pont) UV-besugárzástól védett, kezeletlen állatok csoportja szolgált

kontrollként. A tesztelt bőrterületek állapotát 24 órával az UV-irradiációt

követően vizsgáltuk.

A vivőanyaggal előkezelt, intenzív UV-sugárzásnak kitett tesztterületeken a

bőr a napégés klinikai tüneteit (lividvörös eritéma, súlyos ödéma, két esetben

bullaképződés mutatta (13. Ábra). Hisztológiailag a klinikai tüneteknek

megfelelően erodált, illetve ödémásan fellazult, csökkent magfestésű,

41

nekrotikus hámfelszínen nagy mennyiségű fibrincsapadék volt megfigyelhető.

A dermisz legfelső részében elhelyezkedő neutrofil granulociták és

magtörmelékeik denz, széles sávot képeztek (14. Ábra). Másrészről a ≥ 10%

BGP-15M tartalmú krémmel végzett előkezelés az intenzív UV-sugárzás által

indukált súlyos klinikai tüneteket kivédte (13. Ábra). A BGP-15M tartalmú

krémmel kezelt tesztterületeken a bőr sem a környező, UV-besugárzástól

takarással védett, sem az UV-expozícióban nem részesült állatok bőréhez

képest szabadszemmel megfigyelhető, vagy dermatoszkóppal detektálható

eltérést nem mutatott. A bőrminták hisztológiai feldolgozása során normális

anatómiai struktúrának megfelelő szövettani képet láttunk: két rétegből álló

hám, szerkezetében megtartott dermisz, az akut UV-károsodásra utaló

lobosodás jelei nélkül. Az UV-besugárzásban nem részesült kontroll

bőrmintákban kóros hisztológiai eltérést nem észleltünk.

II./3. PARP-regulátor hatása a bőr UVB-sugárzás indukálta

karcinogenezisére (hairless egérmodell)

A PARP-regulátor BGP-15M potenciális fotoprotektív tulajdonságát a

krónikus UVB-sugárzás hatására, a szőrtelen egerek bőrében kialakuló,

„photoaging”-hez, fotokarcinogenezishez vezető változások követésével

határoztuk meg. Klinikai, hisztológiai, immunhisztokémiai és ultrastruktúrális

vizsgálatokat végeztünk a következő egércsoportokban: I.: 15% BGP-15M +

UVB; II.: vivőanyag + UVB; III.: 15% BGP-15M; IV.: kezeletlen kontroll. Az

egereket 32 héten át, heti 5 alkalommal, 15% BGP-15M krém, vagy

vivőanyag előkezelés után 0,25 J/cm2/nap UVB-besugárzásban

42

részesítettük. A klinikai tüneteket a kezelések előtt vizsgáltuk, és átlagosan

2-4 hetente fotodokumentációval rögzítettük. A kezelés második hetétől a

vivőanyaggal előkezelt, UVB-besugárzott tesztterületen az eritémás, ödémás

tüneteket, az egyre mélyülő színű pigmentáció és infiltráció váltotta fel (15.

Ábra). A ≥ 1 mm tumorok időbeni jelentkezését, valamint a tumoros állatok

prevalenciáját a 16. Ábrán tüntettük fel. Az első tumort (átmérő: 1,1 mm)

vivőanyaggal kezelt, UVB-besugárzott szőrtelen egerek csoportjában (II.

csoport) a kezelés 18. hetében észleltük. A tumoros állat az észlelés

időpontjáig 22,5 J/cm2 összdózisú UVB-besugárzást kapott. A 15% BGP-

15M krémmel előkezelt egerek bőre elváltozást nem mutatott (17. Ábra). A

19. héten már 3 egéren lehetett 1-2 mm nagyságú, vörösesbarna színű,

félgömbszerűen kiemelkedő tumor jelentkezését megfigyelni, és a

feldolgozás során hisztológiailag igazolni. A 19. héttől kezdve a vivőanyaggal

kezelt, krónikus UVB-besugárzásban részesített egerekben progresszív

tumorképződést észleltünk. A vivőanyaggal kezelt, UVB-irradiált csoport

minden tagja a 23. hétre egy vagy több, klinikailag és hisztológiailag

verifikálható, spinocellularis carcinomá-val, illetve keratosis solaris-nak

megfelelő bőrelváltozással rendelkezett, ugyanakkor a PARP-regulátor, 15%

BGP-15M krémmel előkezelt egerek bőre enyhe fokú pigmentáción kívül más

eltérést nem mutatott. A 32. héten a vivőanyaggal előkezelt, krónikus UVB-

besugárzásban részesült állatok bőre a tesztterületen jelentősen

megvastagodott, sötétbarna-szürkés pigmentációt mutatott, felszíni

egyenetlenség jeleivel, különösen a multiplex tumorok környezetében (18.

Ábra). A tumorok fejlődése során az adott területen hiperpigmentáció és

depigmentáció egyaránt megfigyelhető volt. A 32. héten, a kísérlet

43

lezárásával, a 15 % BGP-15M krémmel előkezelt, és krónikus UVB-

expozícióban (összdózis: 39 J/cm2) részesített egércsoportban, a tesztterület

bőrét összehasonlítva a kezeletlen kontroll állatokéval, illetve a környező,

takarással védett bőrfelszínnel, barnás-vörös színű pigmentáción kívül egyéb

klinikailag értékelhető eltérést nem találtunk (18. Ábra). 8 hónap elteltével

tumorképződésre utaló klinikai tünetet az UVB-expozíciótól védett, BGP-15M

krémmel kezelt (III. csoport), illetve kezeletlen kontroll állatokon (IV. csoport),

valamint a krónikus UVB-expozícióban részesített, PARP-regulátorral (BGP-

15M krémmel) előkezelt szőrtelen egereken (I. csoport) nem lehetett

megfigyelni. Kísérleteink eredményei alapján megállapíthatjuk, hogy a

PARP-regulátor a krónikus UVB-expozíció fotokarcinogén hatását kivédte.

Az UV-expozíciótól védett, 15% BGP-15M krémmel kezelt állatokon (III.

csoport) a 32 hetes kezelés alatt irritatív vagy allergiás reakcióra utaló

eltérést nem észleltünk (18. Ábra).

A klinikai vizsgálattal megfigyelt tumorképződés hisztológiailag igazolást

nyert.

A 15% BGP-15M krémmel előkezelt, UVB-expozícióban részesített egerek

szövetmintáinak vizsgálati eredménye alapján, a PARP-regulátor gátolta az

UVB-fény által, a vivőanyaggal előkezelt mintákban megfigyelt, súlyos

fénykárosodásra (epidermisz kiszélesedése, akantózis, sejtes infiltráció,

rugalmas rostok fragmentációja, melaninakkumuláció) (19-22. Ábra) és

tumorképződésre (23. Ábra) utaló hisztológiai, immunhisztológiai (IL-10,

TNFα, és p53) (24-26. Ábra) és szubmikroszkópos (27. Ábra) elváltozások

kialakulását.

44

II./4. PARP-regulátor hatása a bőr UVA-sugárzás indukálta

karcinogenezisére („forszírozott UVA”-kezelés)

A PARP-regulátor BGP-15M potenciális fotoprotektív tulajdonságát a

krónikus „forszírozott UVA”-kezelés hatására a szőrtelen egerek bőrében

kialakuló, „photoaging”-hez, fotokarcinogenezishez vezető változások

követésével vizsgáltuk.

A klinikai tünetek (eritéma, pigmentáció, hámlás, erózió, kifekélyesedés)

súlyosságát 0-5 pontos skálán (nincs elváltozás - igen súlyos), a tumorok

(átmérő ≥ 1mm) jelentkezését naponta, a kezelések előtt szabad szemmel és

dermatoszkóppal végzett vizsgálat alapján regisztráltuk (4. Táblázat). Az

állatok I-IV. csoportjában (I.:I./1.: 8-MOP + UVA, I./2.: UVA; II.: II./1.: 8-MOP

+ vivőanyag + UVA; II./2.: 8-MOP + 15% BGP-15M krém + UVA; III.: III./1.: 8-

MOP + vivőanyag, III./2.: 15% BGP-15M krém; IV.: kezeletlen kontroll)

huszonhat héten keresztül értékelve a makromorfológiai elváltozásokat a

következő eredményt kaptuk: az első hónap végén, amikor az állatok 10

J/cm2 összdózisú UVA-besugárzást kaptak, a 8-MOP-pal fényérzékenyített

tesztterületeken intenzív (8-MOP + UVA: 4,0 ± 0,8) és (8-MOP + vivőanyag +

UVA:3,8 ± 0,7) eritéma, valamint egy-egy állaton erózió jelentkezett. A 15%

BGP-15M krémmel előkezelt, fényérzékenyített, UVA-besugárzott állatok

bőrén kóros elváltozást nem észleltünk (28. Ábra és 4. Táblázat). Irritatív,

vagy allergiás reakciót nem tudtunk megfigyelni.

Az idő előrehaladtával, a 3. hónap végére, az UV-besugárzott állatokon a

15% BGP-15M krémmel előkezeltek kivételével, a gyulladás mértéke egyre

kifejezettebbé vált (pontszám: 3 - 5) és egyre több állaton lehetett

45

exulcerációt (pontszám: 2 – 3) megfigyelni (29. Ábra és 4. Táblázat). Az első

tumor a 8-MOP + UVA-kezelt állaton a 14. héten jelentkezett (30. Ábra és 5.

Táblázat). A 4. hónap végére a 8-MOP + UVA-kezelésben részesült

csoportban mind a 6 állaton, a fényérzékenyítést nem kapott, UVA-

besugárzott csoportban 4/6 állaton és a vivőanyaggal előkezelt,

fényérzékenyített, és UVA-besugárzott csoportban pedig 5/6 állaton egy,

vagy több tumor jelentkezett (31. Ábra és 5. Táblázat). Az UVA-val kezelt

csoportban (I./2) a tumorok átmérőjének nagysága alig haladta meg az 1

mm-t és ebben a csoportban egy állat még az 5. hónap végén is tumor

mentes volt. Ugyanekkor végzett klinikai vizsgálattal a 15% BGP-15M

krémmel előkezelt, fényérzékenyített, UVA-besugárzott egerek bőre továbbra

is tünet mentesnek bizonyult (32. Ábra).

Több mint fél év elteltével (26. hét) az UVA-kezelésben részesült

csoportokban kifejezett pigmentációt találtunk (pontérték: 3,7± 0,5 ; 3,2 ± 1,1;

3,7± 0,4). A 15% BGP-15M krémmel előkezelt, UVA-besugárzott csoportban

enyhe fokú pigmentációt észleltünk (pontérték: 1,8 ± 0,4) (31. Ábra, 4.

Táblázat). A fényérzékenyített, UVA-besugárzott állatokon különböző

mértékű hegképződést lehetett megfigyelni a korábban exulcerált

területeken. A 15% BGP-15M krémmel előkezelt, fényérzékenyített, UVA-

besugárzott állatok kivételével az UVA-expozícióban részesült csoportokban

különböző nagyságú tumorokat észleltünk.

Önmagában, besugárzás nélkül a 8-MOP, a vivőanyag, vagy a PARP-

regulátor bőrelváltozást nem okozott (irritatív, vagy allergiás reakció nem

jelentkezett) (31. Ábra). A hisztológiai, immunhisztológiai és elektron-

mikroszkópos eredmények a klinikai képpel korreláltak (33-37. Ábra).

46

III. Összefoglalás

III/1. A PARP-regulátor BGP-15M DNS-protektív hatása a bőrben

Az UV-sugárzás által az egérbőrben indukált akut DNS-károsodás

mértékét a képződött egyes láncú DNS-törések mennyiségének

vizsgálatával azt találtuk, hogy az intenzív napfény expozíció a

szövetmintákban az ép, nem károsodott DNS-arányát 30% alá

csökkentette. Ugyanakkor a PARP-regulátor lokális alkalmazása kifejezett

védelmet biztosított a napfény UV-tartományának DNS-károsító hatásával

szemben. Az UV-irradiáció által okozott DNS károsodás hisztológiai

markereként nyilvántartott epidermális „sunburn” sejtek (apoptótikus

keratinociták) kvantitatív meghatározása során, az UV-besugárzott,

vivőanyaggal kezelt bőrben a kontrollhoz képest hetvenötszörösére

emelkedett „sunburn” sejtek száma. A „sunburn” sejt képződéssel

szemben a PARP-regulátor használata DNS-protektívnek bizonyult. A

PARP-regulátorral előkezelt bőrmintákban az apoptótikus keratinociták

száma közel azonos volt a kontroll bőrben észleltekkel. Az ultrastrukturális

vizsgálatok további adatokat szolgáltattak a PARP-regulátor DNS-

protektív szerepére.

III/2. A PARP-regulátor (BGP-15M) hatása az UV-besugárzás által

bőrben indukált immunszupresszióra

Az UV-fény ismert, negatív tulajdonságai között kiemelt jelentőségű a

fotokarcinogenezis „előszobája”-ként nyilvántartott fotoimmunszupresszív

hatás. A korszerű UV-tartományban fényvédő anyagokkal szemben elvárás,

hogy a bőr, mint immunszerv funkciójának fiziológiás működését biztosítsák,

vagyis megakadályozzák a fotoimmunszupresszió/moduláció kialakulását

(Lim és mtsai. 2001). Az UVB-besugárzás után észlelhető immunszupresszió

47

és gyulladás az epidermális sejtek által termelt citokinek (pl. IL-10, TNFα, IL-

6, IL-1, IL-12,stb) és biológiailag aktív anyagok modulációja (up-,down-

regulációja) révén manifesztálódik. Egérbőrben az IL-10 és TNFα citokineket

az UVB-fény indukálta immunszupresszió markereként tartják számon

(Kripke és mtsai. 1992). A PARP-regulátor (BGP-15M) fotoimmunprotektív

hatásának meghatározását az IL-10 és TNFα citokinek immunhisztokémiai

vizsgálatával végeztük. A vivőanyaggal előkezelt, UVB-besugárzott

mintákban az epidermális sejtek anti-IL-10 poliklonális antitesttel kifejezett

citoplazmatikus festődést mutattak az epidermisz teljes vastagságában.

Ugyanakkor a PARP-regulátorral kezelt mintákban szórványosan csak egy-

egy sejt festődött. A vivőanyaggal előkezelt, UVB-besugárzott bőrből készült

metszeteken anti-TNFα poliklonális antitesttel intenzív citoplazmatikus és

membránfestődést észleltünk. Az ödémásan kiszélesedett hámban részben

a bazális rétegben perinukleárisan intenzív, a felső sejtsorokban pedig

kevésbé kifejezett, diffúz, intracitoplazmális reakciót figyeltünk meg. A

papilláris dermisz legfelső rétegében közvetlenül a hám alatt elhelyezkedő

makrofágok is kifejezett festődést mutattak. A PARP-regulátorral előkezelt,

UVB-expozícióban részesült bőr epidermiszében, hasonlóan az UVB-

besugárzástól védett kontrollhoz, immunhisztokémiailag detektálható TNFα

szintézist nem észleltünk. Ezek a adataink azt mutatják, hogy a PARP-

reguláror (BGP-15M) lokális alkalmazása fotoimmunprotektív hatásúnak

bizonyult az UVB-irradiáció indukálta bőr-immunszupresszióval szemben.

48

III/3. A PARP-regulátor szerepe a bőr akut UVB-fény károsodás

elleni védelmében (klinikai és hisztológiai vizsgálatok)

A szőrtelen egerek bőrén különböző koncentrációjú BGP-15M tartalmú

krémmel előkezelt tesztterületeken, 2 MED UVB-irradiáció után 24 órával

jelentkezett klinikai tünetek (eritéma, ödéma, vezikula, bulla, erózió) alapján

határoztuk meg a PARP-regulátor antieritematogén koncentrációját.

A bőrminták hisztológiai feldolgozása során a vivőanyaggal előkezelt, UVB-

expozícióban részesített bőrben különböző mértékű, akut fénykárosodásra

utaló eltérést észleltünk. Számos, eozinofil citoplazmával, piknótikus

sejtmaggal rendelkező, vagy mag nélküli apoptótikus keratinocitát („sunburn”

sejtet), a dermisz felső rétegében, részben perivaszkulárisan, részben a

dermo-epidermális határ mentén ödémásan fellazult alapállományban

neutrofil granulocitákat, a papilláris rétegben dilatált, duzzadt endotélű, vér

alakos elemeivel kitöltött ereket lehetett látni. A ≥ 10% BGP-15M tartalmú

krémmel előkezelt állatok csoportjaiban lényeges kóros hisztológiai eltérést

nem találtunk. Amennyiben az UVB- károsodás mértékét az egységnyi

epidermiszben jelen levő „sunburn” sejtek számával fejezzük ki, úgy a BGP-

15M ≥ 10% koncentrációban alkalmazva több mint harmincszoros védelmet

jelent, az egyszeri, eritematogén UVB-irradiáció (vivőanyaggal kezelt bőrben

kifejtett) károsító hatásával szemben. Így az itt bemutatott eredmények a

lokálisan alkalmazott PARP-regulátor fotoprotektív hatását igazolták a bőr

akut UVB-fénykárosodása esetén.

III/4. PARP-regulátor antieritematogén hatásának összehasonlító

vizsgálata ismert fényvédő faktorú (SPF) készítménnyel

A BGP-15M tartalmú krém (≥ 10% koncentrációban alkalmazva)

antieritematogén hatását hasonlítottuk össze egy, a forgalomban levő, SPF

(Sun Protection Factor) 30 jelzésű, az UVB és UVA tartományban védelmet

biztosító (általunk ”AS”-sel jelölt) készítménnyel. Az „AS”, illetve BGP-15M

49

krém előkezelésben részesült tesztterületeken az UVB-expozíció klinikai

tüneteket nem okozott. Hisztológiai vizsgálattal az ”AS”-sel jelölt, ill. BGP-

15M krém kezelésben részesített bőrmintákban lényeges kóros eltérést nem

találtunk Ezen adatok jelzik, hogy az alkalmazott kísérleti körülmények között

a ≥ 10% BGP-15M tartalmú krém fotoprotektív hatása megegyezett az „AS”

jelzésű, 30-as fényvédő faktorú (SPF 30) készítményével.

III/5. PARP-regulátor hatása a szoláris UV-expozíció klinikai

tüneteire és a hisztológiai elváltozásokra

A vivőanyaggal előkezelt, intenzív napfény sugárzásnak kitett

tesztterületeken a bőr a napégés klinikai tüneteit (lividvörös eritéma, súlyos

ödéma, két esetben bullaképződés) mutatta. Hisztológiailag a klinikai

tüneteknek megfelelően erodált, illetve ödémásan fellazult, csökkent

magfestésű, nekrotikus hám felszínen nagy mennyiségű fibrincsapadék volt

megfigyelhető. A dermisz legfelső részében elhelyezkedő neutrofil

granulociták és magtörmelékeik sötét, széles sávot képeztek. Ugyanakkor a

≥ 10% BGP-15M tartalmú krémmel végzett előkezelés az intenzív szoláris

UV-sugárzás által indukált súlyos klinikai tüneteket kivédte. A PARP-

regulátor (BGP-15M krém ≥ 10%) fotoprotektívnek bizonyult, meggátolta az

intenzív UV-expozíció által indukált dermatitis solaris (napégés) klinikai és

hisztológiai tüneteinek megjelenését.

50

III/6. A BGP-15M krém protektív a krónikus UV-besugárzás indukálta

fotokarcinogenezis klinikai, hisztológai, immunhisztológiai és ultrastuktúrális

tüneteivel szemben

A 32 héten át, heti 5 alkalommal, 15% BGP-15M krém (vagy vivőanyag)

előkezelés után 0,25 J/cm2/nap UVB-besugárzásban részesített szőrtelen

egerek tesztterületein vizsgáltuk a PARP-regulátor hatását a krónikus

fénykárosodás elleni védelemben. Kísérleteink eredményei alapján a PARP-

regulátor lokális alkalmazása a krónikus UVB-expozíció (32 hét, UVB

összdózis: 39 J/cm2) fotokarcinogén hatását kivédte. A vivőanyaggal

előkezelt tesztterületeken a 18. héttől kezdve (UVB-dózis: 22,5 J/cm2 )

klinikailag 1-2 mm nagyságú, vörösbarna színű, félgömbszerűen kiemelkedő

tumorok jelentkeztek, amelyek hisztológiai vizsgálattal carcinoma

spinocellulare-nak bizonyultak. A 15% BGP-15M krémmel előkezelt egerek

bőrmintáinak hisztológiai feldolgozása során a kontroll bőrhöz képest az

epidermisz másfél-kétszeresére történő kiszélesedését lehetett megfigyelni,

a dermiszben lényeges kóros eltérést nem észleltünk. A vivőanyaggal kezelt,

UVB-irradiált csoport minden tagja a 23. hétre egy vagy több, klinikailag és

hisztológiailag verifikálható, spinocellularis carcinomával, illetve keratosis

solarisnak megfelelő bőrelváltozással rendelkezett, ugyanakkor a PARP-

regulátor, 15% BGP-15M krémmel előkezelt egerek bőre enyhe fokú

pigmentáción kívül más eltérést nem mutatott. A kísérlet befejezésekor a 32.

héten a vivőanyaggal előkezelt, krónikus UVB-besugárzásban részesült

állatok bőre a tesztterületen jelentősen megvastagodott, sötétbarna-szürkés

hiperpigmentációt és depigmentációt mutatott, felszíni egyenetlenség jeleivel,

különösen a multiplex tumorok környezetében. A 15% BGP-15M krémmel

51

előkezelt, és krónikus UVB-expozícióban (összdózis: 39 J/cm2) részesített

egércsoportban, a tesztterület bőrét összehasonlítva a kezeletlen kontroll

állatokéval, illetve a környező, takarással védett bőrfelszínnel, barnás-vörös

színű pigmentáción kívül egyéb klinikailag értékelhető eltérést nem találtunk.

Nyolc hónap elteltével tumor képződésre utaló klinikai, vagy hisztológiai

eltérést a BGP-15M krémmel előkezelt csoportban nem észleltünk. Az UVB-

expozíciótól védett (BGP-15M, ill kontroll csoport) állatokon spontán tumor

képződést nem lehetett megfigyelni. Irritatív, vagy allergiás reakciót a kísérlet

során nem észleltünk.

A krónikus fénykárosodás a vivőanyaggal előkezelt mintákban a 26. héten a

rugalmas rostok Orcein-Giemsa festéssel kimutatható károsodásában (nagy

gócokban fragmentáció és összecsapzódás), a 32. héten a tumorok körül az

elasztikus rostok megfogyatkozásában, és a kollagén rostok

felszaporodásában nyilvánult meg. A 15% BGP-15M krémmel előkezelt, és

UVB-irradiációban részesült egerek bőrmintáiban ugyanakkor megtartott, ill.

enyhén megfogyatkozott rugalmas rosthálózatot figyelhettünk meg, amit a

kronológiai öregedés hisztológiai jeleként értékeltünk. Amíg a vivőanyaggal

előkezelt mintákban a krónikus UV-expozíció hatására a dermiszben a

melanin a makrofágokban durva szemcsés formában, esetenként szabadon

a kötőszöveti alapállományban is megtalálható volt, addig a PARP-

regulátorral előkezelt egerek bőrében a melanin pigment a bazális réteg

egyes sejtjeiben gócosan jelent meg.

Immunhisztokémiai vizsgálattal a PARP-regulátorral előkezelt, krónikus UVB-

besugárzásban részesített bőrmintákban a bazális keratinociták p53

antitesttel csak elvétve adtak immunhisztológiai reakciót. A vivőanyaggal

52

előkezelt állatok bőrében a keratosis solarisnak megfelelő területeken foltos

p53 festődést kaptunk. Az invazív tumorokban a sejtek nagy része intenzív

p53 magpozitivitást adott. A precancerosus elváltozásokban megfigyelhető

„patch”-jelleg a klonális expanzióra utalt.

Elektronmikroszkópos vizsgálattal a vivőanyaggal előkezelt, 39 J/cm2 UVB-

expozícióban részesült egérbőrben a normál keratinocita struktúra részbeni

felbomlását, tonofibrillum fragmentumokhoz kötődve dezmoszóma struktúrát,

a perinukleáris régióban számfeletti centroszómákat, a sejtmagok nagy

részében durva, szabálytalanul összecsapzódott kromatin állományt

észleltünk. A szubmikroszkópos elváltozások jelentős része megfelelt a

carcinoma spinocellulare-ban látottaknak. A BGP-15M krémmel előkezelt,

UV-besugárzott bőrminták elektronmikroszkópos vizsgálata során egy

esetben sem észleltünk in situ, vagy invazív karcinomát.

A fenti eredmények némileg nem várható eredményt okoztak azaz a PARP

feltehetően nem komplett részleges gátlása A 32. héten az UVB expozicíót

megelőzően lokálisan alkalmazott PARP-regurátorral a krónikus UVB-

expozíció fotokarcinogén hatásának kivédését eredményezte. A hatás

feltehetően az UV expozicíóra bekövetkező, mások által is megfigyelt extra

PARP-aktiváció a BGP-15M-nek közel a normális szintre történő down-

regulációjával magyarázható.

53

III/7. PARP-regulátor hatásának vizsgálata UVA-sugárzás indukálta

fotokarcinogenezis klinikai tüneteire szőrtelen egérmodellen

A PARP-regulátor BGP-15M potenciális fotoprotektív tulajdonságát a

krónikus UVA- besugárzott, ill. 8-MOP (Geroxalen®) fényérzékenyített és

UVA- besugárzott szőrtelen egerek bőrében kialakuló, „photoaging”-hez,

fotokarcinogenezishez vezető változások követésével vizsgáltuk. A szőrtelen

egerek tesztterületei 26 héten át, heti 5 alkalommal, 15% BGP-15M krém

(vagy vivőanyag) előkezelés után 0,5 J/cm2/nap UVA-besugárzásban

részesültek. A klinikai tünetek (eritéma, pigmentáció, hámlás, erózió,

kifekélyződés) súlyosságát 0-5 pontos skálán, valamint a tumorok (átmérő ≥

1mm) jelentkezését vizsgáltuk a kezelések előtt. Az első tumort a 14. héten,

a fényérzékenyített és UVA-besugárzott a vivőanyaggal kezelt állaton

figyeltük meg. A 4. hónap végére a vivőanyaggal előkezelt, 8-MOP+UVA-

irradiációban részesült állatokon különböző nagyságú szoliter tumorokat

észleltünk. A PARP-regulátor lokális előkezelés fotoprotektívnek bizonyult

mind a 8-MOP-pal fényérzékenyített, mind pedig a „csak” UVA-besugárzott

(26 hét, összdózis: 65 J/cm2) állatok bőrében. A PARP-regulátor kivédte a

vivőanyaggal előkezelt, hasonló módon UV-expozíciónak kitett állatokban

klinikailag megfigyelt, és hisztológiailag igazolt tumorképződést.

A PARP-regulátorral előkezelt, UVA-besugárzott bőrmintákban hisztológiai

vizsgálattal a hám enyhe kiszélesedését (5-8 sejtréteg) és megtartott hám

struktúrát találtunk. Ugyanakkor a vivőanyaggal előkezelt, UVA-besugárzott

mintákban az epidermisz egyenetlenül akantótikusnak és

hiperkeratótikusnak, szegmentálisan parakeratótikusnak bizonyult a

hematoxilin-eozinnal festett metszetekben. Az epidermisz alsó részein a

szerkezet felbomlott, a magok polaritása megszűnt. Ezeken a területeken a

54

sejtmagok általában anapláziát, hiperkrom kromatin szerkezetet mutattak, és

nagyobb számban sejtoszlások is észlelhetők voltak. A bazális rétegben

kifejezett sejtproliferációt láttunk. A dermo-epidermális határ mentén főként

limfocitákból és hisztiocitákból álló lobosodást észleltünk.

A vivőanyaggal kezelt, UVA-besugárzott bőrmintákból készült hisztológiai

metszeteken Orcein-Giemsa festéssel a rugalmas rostok fragmentálódását

és összecsapzódását figyeltük meg a dermisz középső részében. A PARP-

regulátorral előkezelt UVA besugárzott bőrben (8-MOP+BGP-15M+UVA) az

elasztikus rostok száma minimális mértékben csökkent, a kollagén rostok

száma változatlan volt a kezeletlen, azonos korú kontroll bőrhöz viszonyítva.

Fontana-Masson festéssel kisebb mennyiségű melanin pigmentet tudtunk

fokálisan kimutatni a bazális és szuprabazális keratinocitákban. A

vivőanyaggal előkezelt, fényérzékenyített, UVA-besugárzott egérbőrben

Fontana-Masson festéssel fokálisan nagy mennyiségű melanint lehetett

kimutatni a bazális és szuprabazális keratinocitákban, az epidermisz alsóbb

sejtsoraiban, és a dermális makrofágokban tömeges melanin pigmentet

észleltünk. Ugyanakkor az UVA-fénnyel besugárzott bőrben kisebb

mennyiségben lehetett melanin pigmentet a hámban és az irhában

megfigyelni.

Immunhisztológiai vizsgálattal a 15% BGP-15M krémmel előkezelt, UVA-

besugárzott (8-MOP+BGP-15M+UVA), valamint az UV-expozícióban nem

részesült (8-MOP; 15% BGP-15M és kezeletlen kontroll) bőrmintákban p53

festődést nem észleltünk A vivőanyaggal előkezelt, UVA-besugárzott (8-

MOP+vivőanyag+UVA) részesített állatok bőrében a bazális sejtréteg

magjainak és a megbomlott szerkezetű hámrészletek tumorosan átalakult

sejtjeinek p53 akkumulációját igazoltuk.

Eletronmikroszkópos vizsgálattal a PARP-regulátorral (8-MOP+BGP-

15M+UVA) előkezelt és UVA expozicíóban részesült bőrben megtartott

szerkezetet láttunk, kóros ultrastruktúrális eltérés nélkül. A vivőanyaggal

55

előkezelt, UVA-besugárzott (8-MOP+vivőanyag+UVA) bőrminták

feldolgozása során már 4 hetes UVA-expozíciót (UVA-összdózis: 10J/cm2)

követően az intercelluláris rések kiszélesedését lehetett megfigyelni.

Az UVA-expozícióban nem részesült (8-MOP; 15% BGP-15M) bőrmintákban,

valamint a kezeletlen azonos korú kontroll állatok bőrében a mikroszkópos és

ultramikroszkópos vizsgálatok során kóros eltérést nem észleltünk.Ezek az

adatok jelzik, hogy PARP-regulátorral végzett kezelés protektívnek bizonyult

a több mint féléves UVA-besugárzás fotokarcinogén hatásával szemben.

A fenti adatok azt mutatják, hogy a PARP részleges gátlása jelentős

védelmet nyújthat akut és krónikus UV károsodás tüneteinek kialakulásával,

valamint fotokalcinogenésissel szemben, jelezve egy rendkívül fontos

területet PARP-inhibitorok klinikai alkalmazására. A BGP-15M krém jelenleg

NG-SUN néven fázis kettő vizsgálatokban vesz rész melynek kezdeti része

bíztató, így remélhetőleg belátható időn belül megjelenhet a klinikai

felhasználásban. Azaz az értekezésben bemutatott vizsgálatok ténylegesen

hozzájárulhatnak egy új típusú UV protektív anyag kifejlesztéséhez és a

gyógyászatba történő megjelenéséhez.

56

A témában elér új eredmények összefoglalása:

Igazolást nyert a BGP-15M PARP-regulátor

a, DNS-protektív hatása

b, fotoimmunoprotektív hatása UVB tartományban

c, fotoprotektív hatása megegyezik 30-as SPF faktorú gyári

készítménnyel

d, fotoprotektív hatása szoláris UV expozicióval szemben

e, protektív krónikus UVA-besugárzás indukálta carcinogenezisben

57

Irodalomjegyzék

[1] Affar E. B., Germain M., Winstall E., Vodenicharov M., Shah R. G.,

Salvesen G. S., Poirer G. G.: Caspase-3- mediated processing

poly(ADP-ribose) glycohydrolase during apoptosis. J. Biol. Chem.

(2001) 276:2935-2942.

[2] Benjamin R. C., Gill D. M.: ADP-ribosylation in mammalian cell ghosts.

Dependence of poly(ADP-ribose) synthesis on strand breakage in

DNA. J. Biol. Chem. (1980) 255:10493-10501.

[3] Bernardi R., Rossi L., Poirier G. G., Scovassi A. I.: Analysis of

poly(ADP-ribose) glycohydrolase activity in nuclear extracts from

mammalian cells, Biochem. Biophys. Acta. (1997) 1338:60-68.

[4] Bernstein E. F., Chen Y. Q., Kopp J. B., Fisher L., Brown D. B., Hahn P.

J., Robey F. A., Lakkakorpi J., Uitto J.: Long-term sun exposure

alters the collagen of the papillary dermis. Comparison of sun-

protected and photoaged skin by northern analysis,

immunohistochemical staining, and confocal laser scanning

microscopy. J. Am. Acad. Dermatol. (1996) 34:209-218.

[5] Bernstein E. F., Chen Y. Q., Tamai K., Shepley K. J., Resnik K. S.,

Zhang H., Tuan R., Mauviel A., Uitto J.: Enhanced elastin and fibrillin

gene expression in chronically photodamaged skin. J. Invest.

Dermatol. (1994) 103:182-186.

[6] Berton T. R., Mitchell D. L., Fischer S. M., Locniskar M. F.: Epidermal

proliferation but not the quantity of DNA photodamage is correlated

with UV-induced mouse skin carcinogenesis, J. Invest. Dermatol.

(1997) 109:340-347.

[7] Brash D. E., Ziegler A., Jonason A. S., Simon J. A., Kunala S., Leffell D.

J.: Sunlight and Sunburn in Human Skin Cancer: p53, Apoptosis, and

Tumor Promotion. Journal of Investigative Dermatology Symposium

Proceedings (1996) 1:136-142.

[8] Burkle A.: Physiology and pathophysiology of poly(ADP-ribosyl)ation.

Bioessays. (2001) 23:795-806.

58

[9] Cole C.: Sunscreen protection in the ultraviolet A region: how to

measure the effectinevess. Photodermatol. Photoimmunol.

Photomed. (2001) 17:2.

[10] Cruz P. D. Jr., Leverkus M., Dougherty I., Gleason M. J., Eller M., Yaar

M., Gilchrest B. A.: Thymidine dinucleotides inhibit contact

hypersensitivity and activate the gene for tumor necrosis factor α, J.

Invest. Dermatol., (2000) 114:253-258.

[11] D’Amours D., Desnoyers S., D’Silva I., Poirier G. G.: Poly(ADP-

ribosyl)ation reactions in the regulation of nuclear functions.

Biochem. J. (1999) 342:249-268.

[12] D’Amours D., Sallmann F. R., Dixit V. M., Poirer G. G.: Gain-of-fuction

of poly(ADP-ribose) polymerase-1 upon cleavage by apoptotic

proteases: implications for apoptosis. J. Cell. Sci. (2001) 114:3771-

3778.

[13] Dantzer F., Schreiber V., Niedergang C., Trucco C., Flatter E., De La

Rubia G., Oliver J., Rolli V., Menissier-de Murcia J., de Murcia G.:

Involvement of poly(ADP-ribose) polymerase in base excision repair.

Biochemie. (1999) 81:69–75.

[14] Daya-Grosjean L., Dumaz N., Sarasin A.:The specificity of p53 mutation

spectra in sunlight induced human cancers. Journal of

Photochemistry and Photobiology (1995) 28:115-124.

[15] de Gruijl F. R., Forbes P. D.: UV-induced skin cancer in hairless mouse

model. Bio. Essays. (1995) 17:651-660.

[16] de Murcia G., Huletsky A., Lamarre D., Gaudreau A., Pouyet J., Daune

M., Poirier G. G.: Modulation of chromatin superstructure induced by

poly(ADP-ribose) synthesis and degradation. J. Biol. Chem. (1986)

261:7011–7017 .

[17] de Murcia G., Menissier de Murcia J.: Poly(ADP-ribose) polymerase: a

molecular nick-sensor. Trends. Biochem. Sci. (1994) 19:172-176.

[18] de Murcia J. M., Niedergang C., Trucco C., Ricoul M., Dutrillaux B.,

Mark M., Oliver F. J., Masson M., Dierich A., LeMeur M.:

Requirement of poly(ADP-ribose) polymerase in recovery from DNA

59

damage in mice and in cells. Proc. Natl. Acad. Sci. (1997) 94: 7303-

7307.

[19] Diffey B. L.: What is light? Photodermatol. Photoimmunol. Photomed.

(2002) 18:68-74.

[20] Drazen D. L., Bilu D., Edwards N., Nelson R. J.: Disruption of poly

(ADP-ribose) polymerase (PARP) protects against stress-evoked

immunocompromise. Mol. Med. (2001) 7:761-766.

[21] Durkacz B. W., Lunec J., Grindley H., Griffin S., Horner O., Simm A.:

Murine melanoma cell differentiation and melanogenesis induced by

poly (ADP-ribose) polymerase inhibitors. Exp. Cell. Res. (1992)

202:287-291.

[22] Durkacz B. W., Omidiji O., Gray D. A., Shall S.: (ADP-ribose)n

participates in DNA excision repair. Nature (1980) 283:593-596.

[23] Elmets C. A., Singh D., Tubesing K., Matsui M., Katiyar S., Mukhtar H.:

Cutaneous photoprotection from ultraviolet injury by green tea

polyphenols. J. Am. Acad. Dermatol. (2001) 44:425-432.

[24] Farkas B., Magyarlaki M., Csete B., Németh J., Rablóczky Gy., Bernáth

S., Literáti Nagy P., Sümegi B.: Reduction of acute photodamage in

skin by topical application of a novel PARP inhibitor Biochem.

Pharmacol. (2002) 63:921-932.

[25] Farkas B., Sümegi B., Rablóczky Gy., Csete B., Hodosi B., Magyarlaki

M., Bernáth S., Literáti Nagy P.: Protecting effect of PARP inhibition

on UV light-induced skin damage. In: Zhang J. (ed), PARP as a

therapeutic target. Pharmacology & Toxicology Series, Boca Raton,

London, New York, Washington, CRC Press, (2002) pp:257-276.

[26] Faro R., Toyoda Y., McCully J., Jagtap P., Szabo E., Virág L., Bianchi

C., Levitsky S., Szabo C.: Protective effect on regional myocardial

function and infarct size induced by PJ34: a novel poly(ADP-ribose)

synthetase inhibitor. Ann. Thorac. Surg. (2002) 73: 575-581.

[27] Fisher G. J., Datta S. C., Talwar H. S., Wang Z. Q., Varani J., Kang S.,

Voorhees J. J.: Molecular basis of sun-induced premature skin

ageing and retinoid antagonism. Nature (1996) 379:335-339.

60

[28] Freeman S. E., Hacham H., Gange R. W., Maytum D. J., Sutherland J.

C., Sutherland B. M.: Wavelength dependence of pyrimidine dimer

formation in DNA of human skin irradiated in situ with ultraviolet light,

Proc. Natl. Acad. Sci. (1989) 86:5605-5609.

[29] Germain M., Affar E. B., D’Amours D., Dixit V. M., Salvesen G. S.,

Poirier G. G.: Cleavage of automodified poly(ADP-ribose)

polymerase during apoptosis. Evidence for involvement of caspase-

7. J. Biol. Chem. (1999) 274:28379-28384.

[30] Gilchrest B. A.: A review of skin ageing and its medical therapy. Brit. J.

Dermatol. (1996) 135:867-875.

[31] Gilchrest B. A.: Skin aging and photoaging : an overview. J. Am. Acad.

Dermatol. (1989) 21:610-613.

[32] Hemminki K., Xu G., Le Curieux F.: Ultraviolet radiation-induced

photoproducts in human skin DNA as biomarkers of damage and its

repair, IARC Sci. Publ. (2001) 154:69-79.

[33] Hinshaw D. B., Lodhi I. J., Hurly L. L., Atkins K. B., Dabrowska M. I.:

Activation of poly(ADP-ribose) polymerase in endothelial cells and

keratinocytes: role in an in vitro model of sulfur mustard-mediated

vesication. Toxicol. Appl. Pharmacol. (1999) 156:17-29.

[34] Horkay I., Varga L., Tamasi P., Gundy S.: Repair of DNA damage in

light sensitive human skin diseases. Arch. Dermatol. Res. (1978)

263:307-15.

[35] Horkay I.: Sun protection, sunscreens. Bőr. Vener. Szle. (1998) 74:83-

85.

[36] Hönigsmann H.: Erythema and pigmentation. Photodermatol.

Photoimmunol. Photomed. (2002) 18:75-81.

[37] Kanai M., Uchida M., Hanai S., Uematsu N., Uchida K., Miwa M.:

Poly(ADP-ribose) polymerase localizes to the centrosomes and

chromosomes. Biochem. Biophys. Res. (2000) 278:385-389.

[38] Katiyar S. K., Matsui M. S., Mukhtar H.: Kinetics of UV light-induced

cyclobutane pyrimidine dimers in human skin in vivo: an

immunohistochemical analysis of both epidermis and dermis.

Photochem. Photobiol. (2000) 72:788.

61

[39] Kim J. W., Kim K., Kang K., Joe C. O.: Inhibition of homodimerization of

poly(ADP-ribose) polymerase by its C-terminal cleavage products

produced during apoptosis. J. Biol. Chem. (2000) 275:8121-8125.

[40] Kim J. W., Won J., Sohn S., Joe C. O.: DNA-binding activity of the N-

terminal cleavage product of poly(ADP-ribose) polymerase is

required for UV mediated apoptosis. J. Cell. Sci. (2000) 113:955-961.

[41] Kraemer K. H.: Sunlight and skin cancer: another link revealed. Proc.

Natl. Acad. Sci. U S A. (1997) 94:11-14.

[42] Kripke M. L., Cox P. A., Alas L. G., Yarosh D. B.: Pyrimidine dimers in

DNA initiate systemic immunosuppression in UV-irradiated mice.

Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1992) 89:7516-7520.

[43] Kripke M. L.: Latency, histology, and antigenicity of tumors induced by

ultraviolet light in three inbred mouse strains. Cancer Res. (1977)

37:1395-1400.

[44] Krobock E., Rahbari H., Mehregan A. H.: Acid orcein and Giemsa stain.

Modification of a valuable stain for dermatological specimens. J.

Cutan. Pathol. (1978) 5: 37-38.

[45] Krutmann J., Croteau D. L., Bohr V. A.: Repair of oxidative damage to

nuclear and mitochondrial DNA in mammalian cells, J. Biol. Chem.

(1997) 272:25409.

[46] Krutmann J.: The role of UVA rays in skin aging, Eur. J. Dermatol.

(2001) 11:170-171.

[47] Kulms D., Schwarz T.: Molecular mechanisms of UV-induced apoptosis,

Photodermatol. Photoimmunol. Photomed. (2000) 16: 195-201.

[48] Lim H. W., Naylor M., Honigsmann H., Gilchrest B. A, Cooper K.,

Morison W., Deleo V. A., Scherschun L.: American Academy of

Dermatology Consensus Conference on UVA protection of

sunscreens: summary and recommendations, J. Am. Acad.

Dermatol. (2001) 44:505-508.

[49] Lindahl T., Satoh M. S., Poirier G. G., Klungland A.: Post-translational

modification of poly(ADP-ribose) polymerase induced by DNA strand

breaks. Trends. Biochem. Sci. (1995) 20:405-411.

62

[50] Lowe N. J., Dromgoole S. H., Sefton J.: Indoor and outdoor efficacy

testing of a broad spektrum sunscreen against ultraviolet A radiation

in psoralen-sensitized subjects. J. Am. Acad. Dermatol. (1987)

17:224-230.

[51] Lowe N. J.: Sun protection factor: Comparative techniques and

selection of UV sources. In: Sunscreens,development, evaluation

and regulatory aspects. eds. by Lowe N. J., Shaath N., Marcel D.,

New York, (1990) pp. 379-394.

[52] Luna L. G: Manual of histologic staining methods of the Armed Forces

Institute of Pathology. Third edition, McGraw-Hill New York, (1968).

[53] Maccarrone M., Catani M. V., Iraci S., Melino G., Agro A. F.: A survey of

reactive oxygen species and their role in dermatology, J. Eur. Acad.

Dermatol. Venereol. (1997) 8:185-202.

[54] Menisser-de Murcia J. M., Niedergang C., Trucco C., Ricoul M.,

Dutrillaux B., Mark M., Oliver F. J., Masson M., Dierich A., LeMeur

M., Walztinger C., Chambon P., de Murcia G.: Requirement of

poly(ADP-ribose) polymerase in recovery form DNA damage in mice

and in cells. Proc. Natl. Acad. Sci. (1997) 94:7303-7307.

[55] Mikel U. V.: Advanced laboratory methods in histology and pathology

Washington DC: Armed Forces Institute of Pathology and Armed

Registry of Pathology, (1994).

[56] Milam K. M., Cleaver I. E.: Inhibitors of poly(adenosine diphosphate-

ribose) synthesis: effect on other metabolic processes, Science.

(1984) 223:589-591.

[57] Mitchell D. L., Byrom M., Chiarello S., Lowery M. G.: Effects of chronic

exposure to ultraviolet B radiation on DNA repair in the dermis and

epidermis of the hairless mouse, J. Invest. Dermatol. (2001) 116:209-

215.

[58] Molinete M., Vermeulen W., Burkle A., Menissier de Murcia J., Kupper

J. H., Hoeijmakers J. H., de Murcia G.: Overproduction of the

poly(ADP-ribose) polymerase DNA-binding demain blocks alkylation-

induced DNA repair synthesis in mammalian cells. EMBO (Eur. Mol.

Biol. Organ.) J. (1993) 12:2109-2117.

63

[59] Oliver J. F., Menissier-de Murcia J., de Murcia G.: DNA Repair ’99

Poly(ADP-Ribose) Polymerase in the Cellular Response to DNA

Damage, Apoptosis, and Disease. Am. J. Hum. Genet. (1999)

64:1282-1288.

[60] Pacher P., Liaudet L., Soriano F. G., Mabley J., Szabo E., Szabo C.:

The Role of poly(ADP-ribose) polymerase in the development of

myocardial and endothelial dysfunction in diabetes mellitus.

Diabetes. (2002) 51: 514-521.

[61] Pacher P., Mabley J. G., Soriano F. G., Liaudet L., Komjati K., Szabo

C.: Endothelial dysfunction in aging animals: the role of poly(ADP-

ribose) polymerase activation. Br. J. Pharmacol. (2002) 135:1347-

1350.

[62] Pacher P., Mabley J. G., Soriano F. G., Liaudet L., Szabo C.: Activation

of poly(ADP-ribose) polymerase contributes to the endothelial

dysfunction associated with hypertension and aging. Int. J. Mol. Med.

(2002) 9:659-664.

[63] Pease, D. C.: Histological techniques for electron microscopy, 2nd Ed.,

Academic Press Inc, New York. (1964).

[64] Rigel D. S., Friedman R. J., Kopf A. W.: Lifetime risk for development of

skin cancer in the U.S. population: current estimate is now 1 in 5. J.

Am. Acad. Dermatol. (1996) 35:1012-1013.

[65] Rougier A.: Are UVA rays dangerous? In.:Protection of the skin

ultraviolet radiations. ed. by Rougier A. and Schaefer H.John Libbey

Eurotext, Montrouge, London, Rome, Paris, (1998) 1-9.

[66] Rünger T. M.: Role of UVA in the pathogenesis of melanoma and non-

melanoma skin cancer. Photodermatol. Photoimmunol. Photomed.

(1999) 15:212-216.

[67] Satoh M. S., Lindahl T.: Role of poly(ADP-ribose) formation in DNA

repair. Nature. (1992) 356:356-358.

[68] Satoh M. S., Poirier G. G., Lindahl T.: Dual function for poly(ADP-

ribose) synthesis in response to DNA strand breakage. Biochemistry.

(1994) 33:7099-7106.

64

[69] Satoh M. S., Poirier G. G., Lindahl T.: NAD(+)-dependent repair of

damaged DNA by human cell extracts. J. Biol. Chem. (1993)

268:5480-5487.

[70] Schwartz A., Stander S., Berneburg M., Bohm M., Kulms D., van Steeg

H., Grosse-Heitmeyer K., Krutmann J., Schwarz T.: Interleukin-12

suppresses ultraviolet radiation-induced apoptosis by inducing DNA

repair. Nat. Cell. Biol. (2002) 4:26-31.

[71] Shah G. M., Poirier D., Duchaine C., Brochu G., Desnoyers S., Lagueux

J., Verreault A., Hoflack J. C., Kirkland J. B., Poirier G. G.: Methods

for biochemical study of poly (ADP-ribose) metabolism in vitro and in

vivo. Anal. Biochem. (1995) 227:1-13.

[72] Shall S.: ADP-ribosylation reactions, Biochimie. (1995) 77:313-318.

[73] Sims J. L., Berger S. J., Berger N. A.: Poly-(ADP-ribose) polymerase

inhibitors preserve nicotinamide adenine dinucleotide and adenosine

5’-triphosphate pools in DNA-damaged cells: mechanism of

stimulation of unscheduled DNA synthesis. Biochemistry. (1983)

22:5188-5194.

[74] Smulson M., Istock N., Ding R., Cherney B.: Deletion mutants of

poly(ADP-ribose) polymerase support a model of cyclic association

and dissociation of enzyme from DNA ends during DNA repair.

Biochemistry. (1994) 33:6186-6196.

[75] Soriano F. G., Virag L., Jagtap P., Szabo E., Mabley J. G., Liaudet L.,

Marton A., Hoyt D. G., Murthy K. G., Salzman A. L.: Diabetic

endothelial dysfunction: the role of poly (ADP-ribose) polymerase

activation. Nat. Med. (2001) 7:108-113.

[76] Steenvoorden D. P. T., Beijersbergen G. M. J.: The use of endogenous

antioxidants to improve photoprotection, J. Photochem. Photobiol. B:

Biol. (1997) 41:1-10.

[77] Sundberg J. P.: Handbook of mouse mutations with skin and hair

abnormalities. CRC Press. Boca Raton, Ann Arbor, London Tokyo.

(1994) pp.:291-310.

[78] Szabados E., Literati-Nagy P., Farkas B., Sümegi B.: BGP-15, a

Nicotinic Amidoxime Derivate Protecting Heart from Ischaemia

65

Reperfusion Injury through Modulation of Poly (ADP-ribose)

Polymerase. Biochemical Pharmacology (2000) 59:937-945.

[79] Szabo C., Dawson V. L.: Role of poly(ADP-ribose) synthetase in

inflammation and ischeamia-reperfusion. Trends Pharmacol. Sci.

(1998) 19:287-298.

[80] Szabo C., Virag L., Cuzzocrea S., Scott G. S., Hake P., O’Connor M.

P., Zingarelli B., Salzman A., Kun E.: Protection against peroxynitrite-

induced fibroblast injury and arthritis development by inhibition of

poly(ADP-ribose) synthase. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1998)

95:3867-3872.

[81] Szabo C.: Potential role of the peroxynitrite-poly (ADP-ribose)

synthetase pathway in a rat model of severe hemorrhagic shock.

Shock (1998) 9:341-344.

[82] Szabo E., Virag L., Bakondi E., Gyure L., Hasko G., Bai P., Hunyadi J.,

Gergely P., Szabo C.: Peroxynitrite production, DNA breakage and

poly(ADP-ribose)polymerase activation in a mause model of

oxazolone-induced contact hypersensitivity. J. Invest. Dermatol.

(2001) 117:74-80.

[83] Vigh L., N. Literati P., Horvath I., Torok Zs., Balogh G., Glatz A., Kovacs

E., Boros I., Ferdinandy P., Farkas B., Jaszlits L., Jednakovits A.,

Koranyi L., Maresca B.: Bimoclomol: A nontoxic, hydroxylamine

derivative with stress protein-inducing activity and cytoprotective

effects. Nat. Med. (1997) 3:1150-1154.

[84] Virag L., Bai P., Bak I., Bakondi E., Szabo E., Liaudet L., Gergely P.,

Szabo C.: Inhibition of poly(ADP-ribose) polymerase attenuates

leukocyte migration in an ovalbumin-induced asthma model in

mice.(Abstract). FASEB J. (2002) 16: A674.

[85] Virag L., Salzman A. L., Szabo C.: Poly(ADP-ribose) synthetase

activation mediates mitochondrial injury during oxidant-induced cell

death. J. Immunol. (1998) 161:3753-3759.

[86] Virag L., Scott G. S., Cuzzocera S., Marmer D., Salzman A. L., Szabo

C.: Peroxynitrite-Induced Thymocyte Apoptosis: the Role of

66

Caspases and Poly (ADP-Ribose) Synthetase (PARS) Activation.

Immunology (1998) 94:345-355.

[87] Virag L., Szabo C.: The therapeutic potential of poly(ADP-Ribose)

polymerase inhibitors. Pharmacol. Rev. (2002) 4:375-429.

[88] Virag L., Szabo É., Bai P., Gergely P., Hunyadi J., Szabo C.: Nitric

oxide peroxynitrite-poly(ADP-ribose) polymerase pathway in the skin.

Exp. Dermatol. (2002) 11:189-202.

[89] Yarosh D., Klein J., O'Connor A., Hawk J., Rafal E., Wolf P.: Effect of

topically applied T4 endonuclease V in liposomes on skin cancer in

xeroderma pigmentosum: a randomised study. Lancet (2001)

357:926-929.

[90] Young A. R., Chadwick C. A., Harrison G. I., Nikaido O., Ramsden J.,

Potten C. S.: The similarity of action spectra for thymine dimers in

human epidermis and erythema uggest that DNA is the chromophore

for erythema. J. Invest. Dermatol. (1998) 111:982-988.

[91] Young A. R., Walker S. L.: Sunscreens: Photoprotection of non-

erythema endpoints relevant to skin cancer. Photodermatol.

Photoimmunol. Photomed. (1999) 15:221-225.

[92] Zdenko H., Wang Z. Q.: Functions of poly(ADP-ribose)polymerase

(PARP) in DNA repair, genomic integrity and cell death. Mut. Res.

(2001) 477:97-110.

[93] Zhang J., Li J. H.: Poly(ADP-ribose)polymerase inhibition by genetic

and pharmacological means. In: Szabó C (ed), Cell Death: the Role

of PARP. Pharmacology & Toxicology Series, Boca Raton, London,

New York, Washington, CRC Press, (2000) pp:209-230.

[94] Ziegler A., Jonason A. S., Leffell D. J., Simon J. A., Sharma H. W.,

Kimmelman J., Remington L., Jacks T., Brash D. E.: Sunburn and

p53 in the onset of skin cancer. Nature (1994) 372:773-776.

[95] Zingarelli B., Cuzzocrea S., Zsengeller Z., Salzman A. L., Szabo C.:

Protection against myocardial ischemia and reperfusion injury by 3-

aminobenzamide, an inhibitor of poly (ADP-ribose) synthetase.

Cardiovasc. Res. (1997) 36:205-215.

67

RÖVIDÍTÉSEK

8-MOP: 8-metoxipsoralen ABC: avidin-biotin complex ADP: adenozin monofoszfát ATP: adenozin trifoszfát AMD: automodifikációs domén BRCT: breast cancer susceptibility protein C terminus CPD: ciklobután-pirimidin-dimerek CTL: citotoxikus T limfocita DBD: DNS kötő domén DEVD: kaszpáz hasító hely DNS: dezoxiribonukleinsav ECL: enhanced chemiluminescence system He: hematoxillin-eozin IL-10: interleukin-10 MED: minimális eritéma dózis NAD+: nikotinsavamid NK sejtek: természetes ölősejtek NLS: nukleáris lokalizációs szignál PARG: poli(ADP-ribóz) glükohidroláz PARP: poli(ADP-ribóz) polimeráz RNS: ribonukleinsav ROS: reaktív oxigén gyök SIS: skin immune system SPF 30: sun protection factor TNFα: tumor nekrózis faktor-α UV: ultraibolya

68

Köszönetnyilvánítás

Ezúton szeretném köszönetemet és hálámat kifejezni mindazoknak, akik e

munka elvégzésében, Ph.D. értekezésem megírásában szakmai és baráti

tanácsaikkal segítettek.

Prof. Dr. Sümegi Balázsnak és a PTE ÁOK Biokémiai Intézet összes

dolgozójának, akik kutatói pályámon elindítottak és munkámat mindvégig

segítették.

Prof. Dr. Farkas Beatrixnak, a PTE Bőr-, Nemikórtani és Onkodermatológiai

Klinika tanszékvezető egyetemi tanárának, aki Ph.D. munkám megírására

ösztönzött és akinek vezetése alatt végeztem tudományos munkámat.

Dr. Magyarlaki Márta és Dr Zombai Erzsébet adjunktusnőknek a szövettani,

immunhisztológiai és elektronmikroszkópos felvételek elkészítéséért és

értékeléséért.

Stein Anikónak és Kavas Máriának a szőrtelen egerekkel végzett

kísérleteimben nyújtott segítségükért.

Hálámat szeretném kifejezni családomnak támogatásukért, megértésükért és

szeretetükért.

A kísérletekhez megvalósításához támogatást nyújtottak: az OTKA, az ETT,

a DAAD-MÖB, valamint az N-Gene Research Laboratórium.

69

A szerző tudományos közleményei:

Petykó Z., Lénárd L., Sümegi B., Hajnal A., Csete B., Faludi

B., Jandó G.: Learning disturbances in offspring of

Zidovudine (AZT) treated rats. Neurobiology 5:83, 1997.

Szabados E., Fischer G.,Toth K., Csete B., Nemeti B.,

Trombitás K., Habon T., Endrei D., Sumegi B.: Role of

reactive oxygen species and poly-ADP-ribose polymerase in

the development of AZT-induced cardiomyopathy in rat. Free

Radical Biology and Medicine 26:309, 1999.

Farkas B., Sümegi B., Csete B., Szekeres Gy.: Novel

poly(ADP)-ribose polymerase inhibitor with photoprotective

activity. J Invest Dermatol 113:438, 1999.

Farkas B., Sümegi B., Rablóczky Gy., Csete B., Hodosi B.,

Magyarlaki M., Bernáth S., Literáti Nagy P.: Protecting

utilities of PARP inhibitors. Chapter 13, CRC Press, Boca

Raton, 2001.

Farkas B., Magyarlaki M., Csete B., Németh J., Rabloczky

Gy., Bernáth S., Literáti Nagy P., Sümegi B.: Reduction of

acute photodamage in skin by topical application of a novel

PARP inhibitor. Biochem. Pharmacology, 63: 1-12, 2002.

B. Farkas, B. Sümegi, Gy. Rabloczky, B. Csete, B. Hodosi,

M. Magyarlaki, S. Bernáth, P. Literáti Nagy: Protecting Effect

of PARP Inhibition on Ultraviolet Light-Induced Skin Damage.

Pp.: 257-271, In: Edit.: Jie Zhang: PARP as a therapeutic

Target. CRC Press, London, New York, Washington, 2002

70

Csete B., Zombai E., Farkas B.: Human papilloma virus

infection leading to social exclusion. Ann. Dermatol.

Vénéréol. 129: 681, 2002.

Hodosi B., Csete B., Zombai E., Farkas B.: Chronic actinic

dermatosis combined with allergy against occupational

factors. Ann. Dermatol. Vénéréol. 129: 1724, 2002.

Csete B., Németh J., Farkas B.: Giant multiplex condiloma

acuminata, acanthosis nigricans, and insulin resistant

diabetes mellitus Ann. Dermatol. Vénéréol. 129: 842, 2002.

Farkas B., Csete B., Magyarlaki M., Bernáth S., Sümegi B.:

Topical Poly(ADP-Ribose) Polymerase (PARP) regulator and

its prospects for use. Ann. Dermatol. Vénéréol. 129: 91, 2002.

Csete B., Magyarlaki M., Rablóczky Gy., Sümegi B., Farkas

B.,: Novel Poly(ADP-Ribose) Polymerase (PARP) regulator in

sun protection J. Eur Acad Derm. Vener. 17 (Suppl. 1.) :64,

2003.

Csete B., Magyarlaki M., Farkas B.: Effect of PARP-regulator

in chronic UVA-damage JDDG Supplement 1: 16, 2003.

71

A szerző kongresszusi előadásainak jegyzéke: Csete B., Skuta G., Fischer G., Sümegi B.,: AZT induced

cardiomyopathy in rats. XIII. International Student

Conference, Istanbul, 1997.

Csete B., Farkas B., Sümegi B.: AZT induced mitochondrial

DNA fragmentation. Congress of Hungarian Dermatologycal

Society, Budapest, 1997.

Csete B., Péter I., Farkas B. : PCR-Chlamydia diagnosis by

psoriatic and autoimmun patients. Annual meeting of

Hungarian Dermatologycal Society, Lillafüred, 1998.

Csete B., Fábos B., Nagy Gy., Farkas B.: Therapyresistent

pyoderma gangrenosum treated with Sandimmun NeoralR.

Congress of Young Dermatologist, Kecskemét, 2000.

Csete Béla, Szabados Eszter, Farkas Betarix, Sümegi

Balázs: Role of PARP in the development of AZT induced

tissue damage. Annual meeting of Hungarian

Dermatologycal Society, Lillafüred, 2001.

Csete B., Zombai E., Farkas B.: Human papilloma virus

infection leading social exclusion. Annual meeting of

Hungarian Dermatologycal Society, Debrecen, 2002.

Csete B., Zombai E., Farkas B.: Humán papilloma virus

infection leading to social exclusion. XX. World Congress of

dermatology, 2002. Paris

72

Csete B., Zombai E., Farkas B.: Florid cutaneous and mucosal

papillomatosis. DUDG 2002. Düsseldorf

Csete Béla, Zombai Erzsébet, Kádár Zsolt, Farkas Beatrix:

Calcinosis cutis Congress of Hungarian Dermatologycal

Society, 2002. Budapest

Csete B., Magyarlaki M., Farkas B.: Effect of PARP-regulator

in chronic UVA-damage 42. Tagung der Deutschen

Dermatologischen Gesellschaft 2003. Berlin

Csete B., Zombai E., Farkas B. Társadalmi

kirekesztettséghez vezető florid cutan papillomatosis Annual

Meeting of Hungarian Dermatologycal Society, 2003. Szeged

Csete B., Magyarlaki M., Farkas B.: Effect of PARP-regulator

on UV light induced photodamage. Tagung der Deutschen-

Ungarischen Dermatologischen Gesellschaft 2004. Pécs

Csete B., Lengyel Zs., Kádár Zs., Battyáni Z.: Poly(Adenosine

Diphosphate-Ribose) Polymerase-1 expression in cutaneous

malignant melanomas as a new molekular marker of agressive

tumors. Pathol Ocol Res 2008. Aug. 28. ( Epub ahead of print)

73

1. Táblázat

PARP-regulátor (BGP-15M) hatása a bőr sejtjeinek napfény expozíció

indukálta DNS károsodására

Kezelés típusa (n = 5 állat / csoport)

Nem károsodott DNS %-os aránya a bőrben

Kezeletlen (kontroll) 80,7 ± 6

15% BGP-15M krém 78,1 ± 7

Vivőanyag + UV 26,5 ± 4**

15% BGP-15M + UV 52,4 ± 5*

Intenzív napfény expozíciónak kitett egérbőrben az egyes láncú DNS töréseket alkalikus pH-n történő, DNS lánc szétcsavarodásán alapuló, fluoreszcenciás módszerrel határoztuk meg. A kapott értékek (átlag ± SEM) a kettős láncú (nem károsodott) DNS %-os arányát fejezik ki. Az eltérés a vivőanyaggal (2 mg/cm2) előkezelt, napfény besugárzott mintákhoz képest szignifikáns, *p < 0,01, a kezeletlen kontrollhoz képest az eltérés **p < 0,001 szinten szignifikáns.

74

2. Táblázat

BGP-15M protektív hatása az UVB-indukálta, eritéma, ödéma és „sunburn” sejt képződésre egérbőrben

Különböző koncentrációjú BGP-15M krémmel, ill. vivőanyagával előkezelt, egyszeri UVB-irradiációban (2 MED) részesített egérbőrben észlelt klinikai tüneteket 5 pontos skála szerint értékeltük. A „sunburn” sejt képződés kvantitatív meghatározása He-festéssel, csoportonként 80 látótér vizsgálatával történt. A kapott értékek (átlag ± SD) 6 állatra vonatkoznak. A vivőanyaggal előkezelt UVB-irradiált bőrben észleltekhez képest az eltérés szignifikáns, *p < 0,01, ill. **p < 0,001.

Kezelés Eritéma

átlag ± SEM

Ödéma

átlag ± SEM

„Sunburn”-sejt/ mm epidermisz

átlag ± SD

Kezeletlen kontroll 0 0 0,5 ± 0,2

Vivőanyag + UVB 2,8 ± 0,2 1,2 ± 0,3 37,4 ± 1,4

5% BGP-15M + UVB 0,7 ± 0,3** 0,3 ± 0,2 * 8,8 ± 0,4*

10% BGP-15M + UVB 0 0 1,6 ± 0,3**

15% BGP-15M + UVB 0 0 1,1 ± 0,4**

75

3. Táblázat

BGP-15M krém kezelés hatása a bőr PARP-enzim poli ADP-ribozilációjára a bőrben

Kezelés formája

Jelintenzitás mértéke (átlag ± SEM)

Kezeletlen kontroll

2 ± 1

Vivőanyag + UV

51 ± 6**

10% BGP-15M krém + UV

23 ± 2*

Vivőanyag + UV

48 ± 4**

20% BGP-15M krém + UV

21 ± 3*

Vivőanyag + UV

47 ± 5**

PARP (pozitív kontroll)

52 ± 4

Különböző koncentrációjú BGP-15M krémmel, ill. vivőanyagával előkezelt (2mg/cm2), UV-besugárzott egérbőrben (n=5 állat/csoport) az ADP-riboziláció mértékét a Western-bloton kapott jelek intenzitásának kvantitatív meghatározásával („Image Tool image processing” program) végeztük. Az értékeket átlag ± SEM formájában fejeztük ki. Az eltérés a vivőanyaggal előkezelt, UV-besugárzott mintákhoz képest szignifikiáns, *p < 0,01. A kezeletlen kontrollhoz képest az eltérés **p < 0,001 szinten szignifikáns.

76

4. Táblázat

A BGP-15M kezelés hatása a bőr krónikus UVA-besugárzás indukálta klinikai tüneteire A PARP-regulátor hatását „forszírozott UVA”-kezelésben (8-MOP+UVA), ill. UVA-irradiációban részesített, vivőanyaggal, ill. 15%

BGP-15M krémmel előkezelt tesztterületeken vizsgáltuk (n=6 állat/csoport). A krónikus fénykárosodás klinikai tüneteit 6 fokozatú skálán (nincs-nagyon súlyos) értékeltük. A kapott értékeket átlag ± SEM formájában fejeztük ki.

Eritéma Pigmentáció Erózió Exulceráció Tumor - MOP MOP MOP - MOP MOP MOP - MOP MOP MOP - MOP MOP MOP - MOP MOP MOP - + VEH. BGP - + VEH. BGP - + VEH. BGP - + VEH. BGP - + VEH. BGP

Idő (hét)

UVA UVA UVA UVA UVA UVA UVA UVA UVA UVA UVA UVA UVA UVA UVA UVA UVA UVA UVA UVA 4 2.80 4.00 3.80 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.20 0.40 0.40 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 0.30 0.36 0.30 - - - - - 0.16 0.20 0.32 - - - - - - - - - 8 3.67 4.67 4.67 0.00 0.00 0.33 0.33 0.00 1.00 1.67 1.67 0.00 0.00 0.33 0.17 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 0.19 0.30 0.19 - - 0.19 0.30 - 0.25 0.19 0.19 - - 0.19 0.15 - - - - -

12 4.50 4.67 4.50 0.00 0.50 1.83 1.80 0.00 1.60 2.83 3.00 0.17 0.17 2.67 2.33 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 0.30 0.19 0.20 - 0.30 0.43 0.16 - 0.20 0.15 0.23 0.15 0.15 0.19 0.30 - - - - -

16 3.67 2.67 2.83 0.17 1.83 2.50 2.33 0.83 1.80 1.83 1.83 0.00 1.67 3.33 3.33 0.00 0.67 2.00 1.50 0.00 ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 0.19 0.19 0.15 0.15 0.15 0.30 0.19 0.15 0.16 0.15 0.15 - 0.19 0.30 0.30 - 0.19 0.33 0.30 -

20 2.33 1.67 1.83 0.00 2.33 3.00 2.83 1.17 0.40 0.83 0.67 0.00 1.67 2.50 2.50 0.00 1.50 3.67 3.17 0.00 ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 0.19 0.19 0.15 - 0.30 0.33 0.15 0.15 0.20 0.15 0.15 - 0.19 0.20 0.20 - 0.30 0.56 0.28 -

26 1.00 0.83 0.67 0.00 3.17 3.67 3.67 1.83 0.40 0.33 0.50 0.00 2.17 0.50 0.33 0.00 3.17 4.50 4.33 0.00 ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 0.23 0.15 0.19 - 0.43 0.19 0.19 0.15 0.20 0.19 0.20 - 0.15 0.20 0.19 - 0.36 0.30 0.30 -

Kez

elés

77

5. Táblázat

Tumorok előfordulása krónikus UVA-besugárzott szőrtelen egereken

n=6/csoport, UVA-kezelés formája: 5x0,5J/cm2/hét; időtartam: 26 hét; az élő, tumoros állatok számát tüntettük fel

Idő Kezelési formák

(hét)

MOP

UVA

-

-

UVA

-

MOP

UVA

Vivőa.

MOP

UVA BGP-15M

MOP

-

Vivöa.

-

-

BGP-15M

-

-

Kontroll

1. hét 0 0 0 0 0 0 0 2. hét 0 0 0 0 0 0 0 3. hét 0 0 0 0 0 0 0 4. hét 0 0 0 0 0 0 0 5. hét 0 0 0 0 0 0 0 6. hét 0 0 0 0 0 0 0 7. hét 0 0 0 0 0 0 0 8. hét 0 0 0 0 0 0 0 9. hét 0 0 0 0 0 0 0

10. hét 0 0 0 0 0 0 0 11. hét 0 0 0 0 0 0 0 12. hét 0 0 0 0 0 0 0 13. hét 0 0 0 0 0 0 0 14. hét 1 0 0 0 0 0 0 15. hét 4 2 3 0 0 0 0 16. hét 6 4 5 0 0 0 0 17. hét 6 4 5 0 0 0 0 18. hét 6 4 6 0 0 0 0 19. hét 6 5 6 0 0 0 0 20. hét 6 5 6 0 0 0 0 21. hét 6 5 6 0 0 0 0 22. hét 6 5 6 0 0 0 0 23. hét 6 5 6 0 0 0 0 24. hét 6 6 6 0 0 0 0 25. hét 6 6 6 0 0 0 0 26. hét 6 6 6 0 0 0 0

78

1. Ábra

Napfény penetrációja a bőrbe (hullámhossz növekedésével a penetráció mélysége nő)

800400200 500 600 700 900 1200

Ultraviolet Visible InfraredC B A

200 400 500 600 700 800 900 1200 nm C B A

S

ubcu

tis

D

erm

is

E

pide

rmis

Ultraibolya Látható Infravörös

79

2. Ábra

UV fény

DNS-károsodás

direkt (UVB) timin dimerek

indirekt (UVA)ROS

bőrsejt DNS

DNS-repair (NER)

DNS-károsodás akkumulációja

fotokarcinogenezis

A fény negatív hatásainak molekuláris mechanizmusa

80

3. Ábra

Hairless egér

81

4. Ábra PARP-regulátor (BGP-15M) hatása a napfény (UV-tartomány) indukálta DNS károsodásra a bőrben A 15% BGP-15M tartalmú krémmel vagy annak vivőanyagával (2mg/cm2) előkezelt, intenzív UV-expozíciónak kitett egérbőrben az egyes láncú DNS töréseket alkalikus pH-n történő, DNS-lánc szétcsavarodásán alapuló, fluoreszcenciás módszerrel határoztuk meg. A kapott értékek (átlag ± SEM) 5 állatból vett bőrmintára vonatkoznak, és a kettős láncú (nem károsodott) DNS %-os arányát fejezik ki. Az eltérés a vivőanyaggal előkezelt UV-besugárzott mintákhoz képest szignifikáns, *p < 0,01. A kezeletlen kontrollhoz képest az eltérés **p < 0,001 szinten szignifikáns.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

kezelés módja

Nem

kár

osod

ott D

NS

Kontroll 15% BGP-15M 15% BGP-15M+

UV

Vivőanyag+

UV

**

*

%

82

5. Ábra

PARP-regulátor hatása az UVB-sugárzás indukálta „sunburn” sejtek képződésére

Különböző koncentrációjú BGP-15M tartalmú krémmel, vagy annak vivőanyagával (2 mg/cm2) előkezelt, UVB-besugárzott (2 MED) bőrben a „sunburn” sejtek kvantitatív meghatározását 24 órával az UVB-expozíció után vett bőrmintákból készült hematoxilin-eozinnal festett metszetben, a bazálmembrán 250 µm-es szakasza feletti epidermiszben, 16 látótér/állat végeztük. A kapott értékek (átlag ± SD) öt állatból vett bőrmintára (80 látótér/csoport) vonatkoznak. Az eltérés a vivőanyaggal előkezelt, UVB-besugárzott mintákhoz képest * p < 0,01, ill. ** p < 0,001 szinten szignifikáns.

0

10

20

30

40

kezelés

"Sun

burn

" se

jtek

szám

a / m

m e

pide

rmis

z

Kontroll 5% BGP+

UV

Vivőanyag

**

*

%

**

10% BGP+

UV

15% BGP+

UV

83

6. Ábra

PARP-regulátor hatása a „sunburn” sejtek képződésére A 10 % BGP-15M krémmel (2), ill. vivőanyagával (3) előkezelt (2mg/cm2), UVB-besugárzott (2MED) egérbőr. 1: kezeletlen kontroll egérbőr: megtartott magszerkezetű keratinociták alkotják a hámot. 2: a hámban az alkotó sejtek struktúrája a kontrolléval megegyezik, „sunburn” sejt nem látható. 3: a hámban számos piknótikus, magfestés nélküli, ill. magtöredéket tartalmazó eozinofil „sunburn” sejt (nyilak) figyelhető meg. (He-festés, 400 x)

1

2

3

84

7. Ábra UVB-sugárzás indukálta akut fénykárosodás ultrastruktúrális vizsgálata egérbőrben A BGP-15M krém vivőanyagával előkezelt, egyszeri 2 MED UVB-irradiációban részesített hairless egér bőrének EM képe: A: a bazális sejtrétegben fragmentált sejtmaggal, kondenzált kromatin állománnyal rendelkező „sunburn” sejt látható. A környező sejtek felé az intercelluláris kapcsolat nagyrészt megszakadt. (5000 x) B: a perinukleáris zónában számfeletti centroszómák figyelhetők meg. (20.000 x)

1 A

1 B

85

8. Ábra PARP-regulátor hatásának ultrastruktúrális vizsgálata a bőr UVB-sugárzás indukálta akut fénykárosodásában Egyszeri, UVB-besugárzott (2 MED), 15% BGP-15M krémmel előkezelt egérbőr EM képe: A: mérsékelt intracelluláris ödéma (8000 x). B: a perinukleáris zónában számfeletti centroszóma nem látható (15.000 x)

1 A

1 B

86

9. Ábra

A PARP ADP-ribozilációjának meghatározása bőrben Western blot technikával

A PARP enzim ADP-ribozilációját a BGP-15M tartalmú krémmel, vagy annak vivőanyagával (2mg/cm2) előkezelt, napfény-expozíciónak kitett bőrből, közvetlenül a besugárzás után vett mintákban Western-blot analízissel határoztuk meg. Az ADP-riboziláció mértékét a Western-bloton kapott jelek intenzitása fejezi ki: kezeletlen, nem besugárzott (natív) egérbőr (1. oszlop); pozitív kontroll: ADP-ribozilált PARP (2. oszlop); vivőanyaggal előkezelt, UV-besugárzott egérbőr (3. és 5. oszlop); 10% BGP-15M krémmel előkezelt és UV-besugárzott (4. oszlop), valamint 20% BGP-15M krémmel előkezelt és UV-besugárzott bőr (6. oszlop).

87

10. Ábra

A PARP-regulátor hatása az egyszeri UVB-expozíció klinika tüneteire

BGP-15M tartalmú krémmel (5%, 10%, 15% és 20%) (A), ill. vivőanyagával (B) előkezelt (2mg/cm2), UVB-irradiált (2 MED) akut fénykárosodás klinikai tünetei az expozíció után 24 órával: 1-2 A: dermatitis solaris klinikai képe, 1B: enyhe eritéma, ödéma nélkül, 2B: tünetmentes bőr

1

A

B

2

A

B

88

11. Ábra A PARP-regulátor hatása a bőr akut fénykárosodására 15% BGP-15M krémmel (2), ill. vivőanyagával (3) előkezelt (2mg/cm2) UVB-besugárzott (2 MED) egérbőr: 1: kezeletlen kontroll: két sejtsoros hám. 2: megtartott szerkezetű hám, a dermiszben gyulladás nem látható. 3: ödémásan fellazult hámban számos, eozinofil festődésű, apoptótikus keratinocita („sunburn” sejt) látható, a papilláris dermiszben dilatált, duzzadt falú erek körül neutrofil granulociták. (He-festés, 200 x)

1

3

2

89

12. Ábra A PARP-regulátor antieritematogén hatásának összehasonlító vizsgálata ismert fényvédő faktorú készítménnyel PARP-regulátor antieritematogén hatásának összehasonlító vizsgálatát ismert fényvédő faktorú (SPF: 30, UVB/UVA), „AS” jelzésű készítménnyel végeztük (n=6 állat). 10% BGP-15M krémmel (B), ill. „AS” fényvédővel (A) előkezelt (2mg/cm2) és UVB-besugárzott (2 MED), valamint előkezelés nélkül UVB-irradiált (U) hairless egérbőr. 2-3 U: dermatitis solaris klinikai tünetei. 1-3 A,B: UVB-expozíció klinikai tünetet nem okozott. 1A-1B: 10% BGP-15M krém fotoprotektív hatása megegyezik az „AS” jelzésű, 30-as fényvédő faktorú készítményével.

1 2

B

A U

A

3

U

B 10% BGP-15M

+ UVB

90

13. Ábra

PARP-regulátor hatása a szoláris UV-expozíció akut klinikai tüneteire Az egerek (n=5/csoport) tesztterületei az intenzív napfény expozíció előtt 10%, 15%, illetve 20% BGP-15M tartalmú krém (A), illetve vivőanyag (B) előkezelésben részesültek. Hairless egér bőre 24 órával az UV-irradiáció után: B: napégés klinikai tünetei (lividvörös eritéma, súlyos ödéma), A: 15% BGP-15M tartalmú krémmel végzett előkezelés kivédte az intenzív UV-sugárzás akut bőrkárosító hatását.

A

B

15% BGP-15M

+ UV

Vehikulum

+ UV

91

14. Ábra PARP-regulátor hatása a napégés hisztológiai tüneteire 10% BGP-15M krémmel (2), ill. vivőanyagával (3) előkezelt (2mg/cm2), napfény-expozíciónak kitett egérbőr. 1: kezeletlen kontroll: megtartott szerkezetű hám, és irha. 2: kétmagsoros epidermis, a dermiszben gyulladás jelei nem észlelhetőek. 3: a hám nekrotizált, a felszínt vaskos fibrincsapadék borítja, alatta a dermisz felső részében széles sávban denz, főként neutrofil granulocitákból álló lobosodás figyelhető meg. (He-festés, 200 x)

1

2

3

92

15. Ábra PARP-regulátor hatása a bőr UVB-sugárzás indukálta krónikus fénykárosodására A két (1), illetve hat héten át (2) UVB-besugárzott (5x0,25J/cm2/hét), 15% BGP-15M krémmel ill. vivőanyagával előkezelt (2mg/cm2) hairless egerek (n=20 állat/csoport) tesztterületének klinikai vizsgálatával a vivőanyaggal kezelt bőrőn 1A: barnás-vörös eritéma, mérsékelt ödéma, 2A: vörösbarna, szürkésbarna pigmentáció és infiltráció figyelhető meg; a 15% BGP-15M krémmel előkezelt bőr 1B-2B: tünetmentes.

1 A 1 B

2 A 2 B

93

16. Ábra PARP-regulátor hatása a krónikus UVB-sugárzás indukálta fotokarcinogenezisre

32 héten át UVB-besugárzott (5x0,25J/cm2/hét), 15% BGP-15M krémmel (BGP-15M+UVB), ill. vivőanyaggal (vehikulum+UVB) előkezelt (2mg/cm2) hairless egerek bőrén vizsgáltuk a tumorok jelentkezését. A vízszintes tengelyen az időt, a függőleges tengelyen a tumoros állatok százalékos előfordulását tüntettük fel. A PARP-regulátorral kezelt állatokban a 32 hetes időtartam alatt tumor nem jelentkezett.

05

101520253035404550556065707580859095

100

0 6 12 18 19 20 21 22 23 32 hét

tum

oros

álla

tok

%

94

17. Ábra PARP-regulátor hatása a bőr UVB-sugárzás indukálta krónikus fénykárosodására (18.-23. hét) A 18 (1) illetve 23 héten át (2) UVB-besugárzott (5x0,25J/cm2/hét), 15% BGP-15M krémmel ill. vivőanyagával előkezelt (2mg/cm2) hairless egérek tesztterületének klinikai vizsgálata során, a vivőanyaggal előkezelt bőrön 1A: vörösbarnán pigmentált, infiltrált környezetben, 1,1 mm átmérőjű, félgömbszerűen kiemelkedő tumor, 2A: mediálisan, a felső és alsó harmadban 1,5 mm ill. 1,1 mm átmérőjű, szürkésbarnán pigmentált tumorok figyelhetők meg. 1B-2B: a 15% BGP-15M krémmel előkezelt bőr makromorfológiailag nem tér el a kezeletlen kontrolltól (2C).

1 A 1 B

2 A 2 C 2 B

95

18. Ábra PARP-regulátor hatása a krónikus UVB-sugárzás indukálta fotokarcinogenezisre a bőrben (32. hét) 1A: a 32 héten át vivőanyaggal (2mg/cm2) előkezelt, UVB-besugárzott (5x0,25J/cm2/hét) hairless egér tesztterületén számos, 0,5-3,0 mm átmérőjű, szürkés-lividbarnán pigmentált tumor figyelhető meg. 1B: A 15% BGP-15M krémmel előkezelt bőr enyhe fokú, vörösbarna pigmentációt mutat, fénykárosodásra utaló tünet nem látható. 2: vivőanyaggal előkezelt, fénykárosodott egérbőr dermatoszkópos képe.

1 A

2

1 B

96

19. Ábra

A PARP-regulátor hatása a krónikus UVB-sugárzás indukálta fénykárosodás hisztológiai tüneteire

A 18 héten át UVB-besugárzott (5x0,25J/cm2/hét), 15% BGP-15M krémmel (2), ill. vivőanyaggal (3) előkezelt (2mg/cm2) egérbőr. 1: kezeletlen kontroll egérbőr, kóros eltérés nélkül. 2: a hám enyhén kiszélesedett. 3: az akantótikus, erősen kiszélesedett epidermiszben a hám szerkezete gócosan felbomlott, a felszínen hiper- és parakeratózis, a dermisz középső részében nagygócos mononukleáris sejtekből álló lobosodás észlelhető. (He-festés, 100 x)

1 2

3

97

20. Ábra

A PARP-regulátor hatása a krónikus UVB-sugárzás indukálta fénykárosodás

hisztológiai tüneteire A 26. héten vett szövetmintában az UVB-besugárzott (5x0,25J/cm2/hét), vivőanyaggal előkezelt (2mg/cm2) egérbőrben, a dermiszben, a rugalmas rostok összecsapzódása és fragmentációja látható (1). A 32. héten vett bőrmintában a dermiszben a tumor környezetében a rugalmas rostok megkevesbedtek (2). (Orcein-Giemsa festés, 100 x)

2

1

98

21. Ábra

A PARP-regulátor hatása a krónikus UVB-sugárzás indukálta fénykárosodás

hisztológiai tüneteire

32 héten át UVB-besugárzott (5x0,25J/cm2/hét), 15% BGP-15M krémmel (2) ill. vivőanyaggal (3) előkezelt (2mg/cm2) egérbőr. 1: kezeletlen kontroll egérbőr, az irhában megtartott rugalmas rosthálózattal. 2: a rugalmas rostok enyhe fokú megkevesbedése figyelhető meg. 3: a keratosis solarisnak megfelelő hámelváltozás alatt, a dermisz középső részében, a rostok kifejezett fragmentációt és összecsapzódást mutatnak. (Orcein-Giemsa festés, 200 x)

3

2 1

99

22. Ábra

PARP-regulátor hatása a bőr krónikus UVB-sugárzás indukálta pigmentációjára 32 héten át UVB-besugárzott (5x0,25J/cm2/hét), 15% BGP-15M krémmel (2) ill. vivőanyaggal (3) előkezelt (2mg/cm2) egérbőr. 1: kezeletlen kontroll egérbőr, melanin pigment nélkül. 2: a bazális rétegben szakaszosan, illetve a dermisz felső részében melanofágokban figyelhető meg pigment tartalom. 3: az egyenetlenül kiszélesedett, és hiperkeratotikus hám bazális és szuprabazális részében, valamint a papilláris dermiszben nagy mennyiségű melanin tartalom mutatható ki. (Fontana-Masson festés, 100 x)

1

2

3

100

23. Ábra

A PARP-regulátor hatása a krónikus UVB-sugárzás indukálta fénykárosodás hisztológiai tüneteire

A 32 héten át UVB-besugárzott (5x0,25J/cm2/hét), 15% BGP-15M krémmel (2), ill. vivőanyaggal (3) előkezelt (2mg/cm2) egérbőr. 1: kezeletlen kontroll egérbőr, kóros eltérés nélkül. 2: a hám enyhén kiszélesedett, hipergranulózist mutat, a dermiszben kóros eltérés nem észlelhető. 3: a hám irregulárisan kiszélesedett, a szerkezet részleges, ill. teljes felbomlásával, atípusos sejtekből álló, a dermisz felső részébe infiltráló, leszakadó sejtcsoportokkal (invazív carcinoma spinocellulare), a tumor környezetében kifejezett lobosodással. (He-festés, 100 x)

1

2

3

101

24. Ábra PARP-regulátor hatása az akut UVB-sugárzás indukálta IL-10 expresszióra 15% BGP-15M krémmel (2), ill. vivőanyagával (3) előkezelt (2mg/cm2) UVB-besugárzott (2 MED) egérbőr: 1: kezeletlen kontroll egér bőrében a faggyúmirigyek aspecifikus festődése figyelhető meg, IL-10 expresszió nem látható. 2: a kétmagsoros epidermisz IL-10-re specifikus immunfestődést nem mutat. 3: az epidermisz sejtjei intenzív pozitív IL-10 festődést mutatnak. (Poliklonális IL-10 ellenes antitest, ABC-peroxidáz reakció, 200 x)

1

2

3

102

25. Ábra PARP-regulátor hatása az akut UVB-sugárzás indukálta TNFα expresszióra 15% BGP-15M krémmel (2), ill. vivőanyagával (3) előkezelt (2mg/cm2) UVB-besugárzott (2 MED) egérbőr. 1: kezeletlen kontroll egér: TNFα expressziójára utaló pozitív festődés nem látható. 2: a megtartott szerkezetű hámban TNFα expresszió nem észlelhető. 3: az ödémásan kiszélesedett hám keratinocitáiban részben intracitoplazmatikus, részben sejtfelszíni, változó intenzitású TNFα expresszió látható. (Poliklonális TNFα ellenes antitest, ABC-peroxidáz reakció, 400 x)

1

2

3

103

26. Ábra

PARP-regulátor hatása a bőr krónikus UVB-sugárzás indukálta p53 expressziójára

Kezeletlen kontroll egérbőr (1), 32 héten át UVB-besugárzott (5x0,25J/cm2/hét), 15% BGP-15M krémmel (2) ill. vivőanyaggal (3) előkezelt (2mg/cm2) egérbőr. 1-2: immunhisztokémiai vizsgálattal p53 expresszió nem látható. 3A: a keratosis solarisnak megfelelő epidermisz részletben foltos p53 nukleáris expresszió figyelhető meg. 3B: az invazív, dermiszbe infiltráló spinocellularis carcinoma sejtjei csaknem 100%-ban expresszálnak p53 antigént. (ABC-peroxidáz reakció, 200 x)

3A 3B

2 1

104

27. Ábra

PARP-regulátor hatása a bőr krónikus UVB-sugárzás indukálta fénykárosodásának ultrastruktúrális tüneteire

A BGP-15M krém vivőanyagával (2mg/cm2) előkezelt, 32 héten át UVB-besugárzott (5x0,25J/cm2/hét) egérbőr elektronmikroszkópos feldolgozása. A: több sejtrétegben a nukleáris kromatin eloszlás szabálytalan (3000 x). B: az intracelluláris térben mikrovillózus sejtfelszínek és kevés dezmoszóma látható (5000 x). C: számos centroszóma észlelhető a perinukleáris tág csatornák között (15000 x). D: a citoplazmában tonofibrillum fragmentumokhoz kötődve dezmoszóma struktúra figyelhető meg (6000 x).

A B

C D

105

28. Ábra

PARP-regulátor hatása a bőr „forszírozott UVA”-kezelés (8-MOP+UVA) indukálta krónikus fénykárosodás klinikai tüneteire

A hairless egerek tesztterületeit 4 héten át UVA-besugárzásban (5x0,5J/cm2/hét) (1A) részesítettük, melyet 8-MOP-pal történő fényérzékenyítés (1B) és 15% BGP-15M krémmel (2A) ill. vivőanyagával (2B) előkezelés (2mg/cm2) előzött meg. Egyes tesztterületek UVA-besugárzást nem kaptak (3). A „forszírozott UVA”-kezelés hatására a tesztterületeken (1B, és 2B) intenzív eritéma, ödéma jelentkezett erózióval. Az UVA-besugárzás (1A) kevésbé súlyos eritémát és ödémát idézett elő. A PARP-regulátor, 15% BGP-15M (2A) krém kivédte a Geroxalen® oldattal fényérzékenyített bőr, 10 J/cm2 UVA-sugárzás indukálta károsodását, normál egérbőr képe látható, úgymint az UVA-expozícióban nem részesült (3) tesztterületeken (2A, 3).

1 2

3

B

A

B

A

106

29. Ábra

PARP-regulátor hatása a bőr „forszírozott UVA”-kezelés (8-MOP+UVA)

indukálta krónikus fénykárosodás klinikai tüneteire (12. hét) A 12-hetes „forszírozott UVA”-besugárzás (30 J/cm2) után a PARP-regulátorral (15% BGP-15M krém) előkezelt tesztterület (2A) kivételével, ahol a normál bőr klinikai képét lehet megfigyelni, súlyos exulceráció jelentkezett (1B, 2B). Az UVA-besugárzott (1A) területen a fénykárosodás mértéke enyhébb. Az UVA-expozícióban nem részesült tesztterületeken (3) kóros eltérés nem volt.

1 2

3

B

A

B

A

107

30. Ábra

A PARP-regulátor hatása a „forszírozott UVA”-kezelés (8-MOP+UVA) indukálta fotokarcinogenezisre hairless egérmodellben

A hairless egerek tesztterületeit 8-MOP-pal történő fényérzékenyítést követően 15% BGP-15M krémmel, ill. vivőanyaggal előkezeltük, majd UVA-expozíciót (5x0,5J/cm2/hét) alkalmaztunk 26 héten át. A „forszírozott UVA”-kezelés hatására a vivőanyaggal (piros) előkezelt csoportban a 18. héttől tumorképződést észleltünk. A 26. hétre az UVA-sugárzásban részesített állatok mindegyike tumorral rendelkezett. A BGP-15M krémmel előkezelt (fekete) csoportban tumorképződést a vizsgált 26 hetes időszakban nem észleltünk.

17 18 19 20 21 22 23 24 25 26

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

*** * * *

Tum

orok

rela

tív g

yako

riság

a

hét

Chi^2 = 0; A1= 0, A2 = 0, x0= 20,1, p = 27,5

Logisztikus regresszió:

UVA+8-MOP

UVA+ 8-MOP+BGP-15M

hét

108

31. Ábra PARP-regulátor hatása a bőr „forszírozott UVA”-kezelés (8-MOP+UVA) indukálta krónikus fénykárosodás klinikai tüneteire (26. hét) A 26 hetes „forszírozott UVA”-besugárzás (65 J/cm2) hatására a tesztterületeken (1B, 2B) húzó hegképződés, sötétbarna, különböző nagyságú tumorok jelentkezése, kifejezett pigmentáció látható. A PARP-regulátorral (15% BGP-15M krém) előkezelt tesztterület (2A) a normál bőr klinikai képét mutatja. Az UVA-besugárzott bőrön (1A) a gyulladásos komponens kifejezettebb, mint a 8-MOP+UVA-kezelteken, egyébként az elváltozások hasonlóak. Az UVA-expozícióban nem részesült tesztterületeken (3) allergiás, vagy irritatív eltérés nem jelentkezett.

1 2

3

B

A

B

A

109

32. Ábra

A PARP-regulátor hatása az UVA–besugárzás indukálta fotokarcinogenezisre

egérbőrben

Kolmogorov-Smirnov 2 mintás próba: K=n×m×Dnm =36, K>30, p=0,05

A hairless egerek tesztterületeit az ábrán feltüntetett módon kezeltük. Az egerek 5x0,5J/cm2/hét UVA-expozícióban részesültek 26 héten át. Tumorképződést legelőször 35 J/cm2 UVA összdózisnál észleltünk a 8-MOP + UVA csoportban. 60 J/cm2 UVA-besugárzás után az 1.-3. csoportban minden állatban tumorképződést észleltünk. A 2.-3. csoportban 40 J/cm2 dózisnál a relatív gyakoriság ugrásszerű emelkedését figyeltük meg. A BGP-15M krémmel kezelt csoportban a vizsgálat folyamán tumorképződést nem tapasztaltunk.

20 30 40 50 60 70

0

1

2

3

4

5

6

4. 8-MOP + UVA + BGP-15M 3. 8-MOP + UVA + vivőanyag 2. 8-MOP + UVA 1. UVA

UVA dózis, J/cm2

Tum

orok

kum

ulat

ív re

latív

gya

koris

ága

110

33. Ábra PARP-regulátor hatása a bőr „forszírozott UVA”-kezelés (8-MOP +UVA) indukálta krónikus fénykárosodás hisztológiai elváltozásaira A hairless egerek tesztterületeit 26 héten át 8-MOP-pal történő fényérzékenyítést követően, 15% BGP-15M krémmel (2) ill. vivőanyagával (3) kezeltük (2mg/cm2), majd UVA-besugárzásban (5x0,5J/cm2/hét) részesítettük. 1: kezeletlen kontroll egérbőr. 2: a hám enyhén kiszélesedett, enyhe fokú hiperkeratózist mutat, az epidermiszben atípusos sejtek nem észlelhetők. 3: a kifejezett hiper- és parakeratotikus, akantótikus, erősen kiszélesedett epidermiszben a hám szerkezete gócosan felbomlott, in situ carcinomának megfelelő képet mutat. (He-festés, 100 x).

1 2

3

111

34. Ábra

A PARP-regulátor hatása a krónikus „forszírozott UVA”-kezelés indukálta rugalmas rost károsodásra egérbőrben

A hairless egerek tesztterületeit 26 héten át 8-MOP–pal történő fényérzékenyítést követően, 15% BGP-15M krémmel (2) ill. vivőanyagával (3) előkezeltük (2mg/cm2) és UVA-besugárzásban (5x0,5J/cm2/hét) részesítettük. 1: kezeletlen kontroll egérbőr: kronológiai öregedésnek megfelelően a rugalmas rostok megkevesbedése és enyhe feltöredezése, valamint a dermisz középső, alsó részében ciszták kialakulása látható. 2: a hám 5-8 sorosra kiszélesedett, a rugalmas rost hálózat enyhe fokú megkevesbedése figyelhető meg. 3: az in situ carcinoma környezetében rugalmas rost fragmentációt észleltünk. (Orcein-Giemsa festés, 100 x)

1 2

3

112

35. Ábra

PARP-regulátor hatása a bőr „forszírozott UVA”-kezelés (8-MOP+UVA) indukálta krónikus fénykárosodás hisztológiai elváltozásaira

A hairless egerek tesztterületeit 26 héten át 8-MOP–pal történő fényérzékenyítést követően, 15% BGP-15M krémmel (2) ill. vivőanyagával (3) kezeltük (2mg/cm2) és UVA-besugárzásban (5x0,5J/cm2/hét) részesítettük. 1: kezeletlen kontroll egérbőr: kronológiai életkornak megfelelő bőrszerkezet mellett pigmentet nem tartalmaz. 2: főként a hám bazális rétegében figyelhető meg a melanin pigment felszaporodása. 3: mind az epidermiszben, mind a dermiszben a melanofágokban jelentős a pigmentfelszaporodás. (Fontana-Masson festés, 100 x)

1

3

2

113

36. Ábra

PARP-regulátor hatása a bőr „forszírozott UVA”-kezelés (8-MOP+UVA)

indukálta p53 akkumulációjára

A hairless egerek tesztterületeit 26 héten át 8-MOP–pal történő fényérzékenyítést követően, 15% BGP-15M krémmel (2) ill. vivőanyagával (3) kezeltük (2mg/cm2) és UVA-besugárzásban (5x0,5J/cm2/hét) részesítettük. 1: kezeletlen kontroll egérbőr: p53 festődés nem figyelhető meg. 2: az enyhén kiszélesedett hámban atípusos sejtek nem észlelhetők, p53 nem mutatható ki. 3: kifejezett hiper- és parakeratotikus, akantótikus, erősen kiszélesedett epidermiszben a felbomlott szerkezetű atípusos sejteket tartalmazó részletek gócosan pozitív p53 magfestődést mutatnak. (Poliklonális p53 ellenes antitest, ABC-peroxidáz reakció, 200 x).

1

3

2

114

37. Ábra PARP-regulátor hatása a bőr „forszírozott UVA”-kezelés (8-MOP+UVA) indukálta ultrastruktúrális elváltozásaira

A hairless egerek tesztterületeit 8-MOP-pal történő fényérzékenyítést követően, 15% BGP-15M krémmel (2) ill. vivőanyagával (3) kezeltük (2mg/cm2) és UVA-besugárzásban (összdózis: 10J/cm2) részesítettük. 1: kezeletlen normál egérbőr EM képe: lényeges kóros eltérés nem látható (5000 x). 2: megtartott szerkezet, kóros eltérés nélkül (3000 x). 3: az intercelluláris rések kiszélesedése figyelhető meg (3000 x).

1 3

2