2016.06.17JEMS・MMS研究会 第68回定例会

提案

「変異原物質の閾値に関する共同研究」

須藤 鎮世（就実大学）

捏造された直線閾値なしモデル

（Linear no-threshold model = LNT）

1928: MullerはX線が突然変異を起こすことを発見

1934: 国際放射線防御委員会（ICRP)閾値：500 mGy/年

1945: 広島・長崎に原子爆弾投下

1946: Mullerにノーベル賞、閾値なし！と断言

石油成金のロックフェラー財団とマラーの結託

1954: 米国科学アカデミーに遺伝学委員会設置

まともな議論なし、データなし

グラス：閾値なしモデルは実験データがなく主に

ヒット説に基づいている

1956: 直線閾値なしモデルを勧告し、根拠の提示を拒否

Muller自説を通すためには誇大・歪曲を辞さな人、

優生学の信者、精子銀行の創設者

直線閾値なしモデルの捏造の根拠

1. Mullerはノーベル賞受賞講演前に「閾値あり」の論

文を読んでいた。しかし、閾値なしと宣言

2. 遺伝学委員会の16名の委員のうち12名の遺伝学者に

宿題：全アメリカ人に0.1 Svを照射したら何人の子

供に変異が生じるか？ 3人回答辞退、9名が回答

ばらつき大 → 小さな値の3名分を削除、6名分採用

3. 6名分は5,000,000前後で一致、差は1桁という

範囲：500,000〜50,000,000

実際の値：100,000〜200,000,000

(広島・長崎の結果：遺伝的影響はなし）

4. その他、閾値なしモデルを支持する実験データ無し

原爆被爆者について行なわれた遺伝調査

① 出生時の障害 77,000人（1948－1954）

② 性比 140,000人（1948－1966）

③ 染色体異常 16,000人（1967－1985）

④ 生化学的タンパク質調査 23,000人（1975－1984）

⑤ 死亡率調査 80,000人（1946－継続中）

⑥ DNA調査 1,000家族（1995 - 継続中）

⑦ 臨床健康調査 10,000人（2002－2006：継続中）

被曝による遺伝的影響は検出されない

直線閾値なしモデルの化学発癌への転用

1.1956年6月12日、直線閾値なしモデルの勧告

（ショウジョウバエの生殖細胞で実験）

Anonymous. Science, 123, 1157–1164, 1956.

2. 1956年6月13日、New York Times 1面トップで報道

(ロックフェラー財団の所有）

3. 1958: The National Council of Radiation

Protection and Measurement (NCRPM) 、放射線によ

る発癌（体細胞）に 直線閾値なし仮説を採用

4. 1958: FDA, Delaney Clause デラニー条項を制定。

食品中に発癌性物質の使用/検出されてはならない

→ このゼロリスク法案は1996年に廃棄

5.1972: EPA：発癌剤に閾値なしを適用した。同時に

リスク-ベネフィットの考えを導入、今日に至る

米国科学アカデミーの直線閾値なしという主張0.1 Sv以下を一纏め（統計的まやかしの手段とか）算数メモリ(低線量を矮小化）2 Svまでの表示(問題は＜100 mSv、Downturnを隠蔽）直線より直線-2次曲線がよく合致

時計文字盤作業女工の骨肉腫

被爆者の生涯調査がLNTという主張3 Svまでの表示(Downturnを隠蔽）直線より直線-２次曲線が合致低線量では信頼限界の外

放射線影響研究所:生涯調査のベイズ法による新分析シグモイド曲線、Downturnの顕現、閾値、ホルミシス、0.4 Gy以下で7/12点が信用限界の内 (LNTでは1点）

原虫ではγ線で増殖が促進ハエではγ線1 Svが閾値Mullerの閾値なしは誤り

マウスのγ線生涯照射で自然線量の170-1,700倍なら長生き

広島・長崎の被曝者の白血病では閾値が設定でき、それは約 1 Sv

広島・長崎の被曝者の固形癌では投下後に入市した者Bより頻度が低く、入市者Bはさらに対照群 Aより頻度が低い

アメリカにおける室内ラドンレベルと肺癌は逆相関を示し、LNT とは相反する。ホルミシスが見られる。

寿命延長

寿命短縮自然放射能

放射線照射でホルミシスの例

ホルミシスは種々の生物、種々の現象（増殖、遺伝毒性、寿命、発癌などで見られる：生体防御機構の一環だろう

放射線の影響の主体は活性酸素(ROS)の発生生体には防御機構（ROS消去、DNA修復、アポトーシス、

免疫機構）で対処できる＝適応応答(ホルミシス）免疫機構で記憶細胞が抗原刺激を記憶するように、

ホルミシスではエピジェネティックに記憶か？

線量・線量率で左右に振れる

適応応答(ホルミシス）はどのような時に見られるのか

1. 低用量では有益(+)、高用量で有害（ー）な反応2. 低用量の前処理で、次の高用量には耐性が増す3. A物質で前処理で、次のB物質処理に耐性が増す

直線閾値なしモデルはどんなに微量でも有害と規定、反応は必ず0点より上の右上がり直線を想定する

放射線ホルミシスがある化学ホルミシスもある

変異原ホルミシスを検討しようin vitro 小核ホルミシスを検討しよう

用量設定のため細胞毒性試験で検証しよう

直線閾値なしモデルは変異原や発癌剤に適用でるか？

実験例： 細胞毒性試験 (150203)： 同仁試薬

HeLa S3細胞、5,000 cells/50 μL well、50 μL の被験物質処理、96 well plate使用、3 wells/dose、24時間後、同仁試薬 （Cell Counting Kit-8 ）10 μL 添加、37℃、2 hr 保温

マイクロタイタープレートリーダーーで450 nmの吸光度測定

最大無作用量NOAELの濃度を決める目的であるが、

低濃度で、細胞増殖の刺激が見られる：ホルミシス

試験法概略（in vitro小核）第一三共、五十嵐美由紀

細胞 CHU/IU TK6培地 10%FBS添加MEM 10%FBS添加RPMI1640培養容器 6 cm 培養皿 パルス処理：15 mL 培養

チューブ連続処理:25 cm2 フラスコ

細胞計測（例） ・血球計算盤（共通） ・ATP assay (ルミテスター、キッコーマン㈱）

・トリパンブルー排除法による画像解析（Vi-CELL、ベックマンコールター：電気インピーダンス）

毒性評価の方法 RCC, RICC, RPD（計画書参照）処理時間 代謝活性化6 h 代謝活性化3 h

非代謝活性化6 h 非代謝活性化3 h非代謝活性化24 h 非代謝活性化

RCC: Relative cell count

RPD: Relative population doubling

RICC: Relative increase in cell count

試験法概略（in vitro小核）田辺三菱製薬、武藤重治: 1-CHU/IU

細胞 CHU/IU

培地 10%FBS添加MEM

培養容器 10 cm 培養皿

24 well プレート

細胞計測（例） ベックマン・コールター Multisizer3またはZ1）

毒性評価の方法 相対細胞増殖率（RICC）

処理時間 非代謝活性化 6 + 20 h

非代謝活性化 26 h

陰性対照：DMSO, 生食、蒸留水、陽性対象： MMC, Col

培地：445 mL MEM、50 mL FBS、5 mLのKM液

播種：4×104 cells/mLの細胞懸濁液を0.5 mL/well (24 well plate）

処理液組成： DMSO使用、792 μL培地+8 μL被験物質液→500 μL使用

生食・水、720 μL培地+80 μL被験物質液→500 μL使用

試験法概略（in vitro小核）田辺三菱製薬、武藤重治 : 2-TK6

細胞 TK6培地 10%ウマ血清添加RPMI1640培養容器 75 cm2フラスコ

24 well プレート細胞計測（例） ベックマン・コールター Multisizer3またはZ1）毒性評価の方法 相対細胞増殖率（RICC）

処理時間 非代謝活性化 4+22 h 非代謝活性化 26 h

陰性対照：DMSO, 生食、蒸留水、陽性対象： MMC, Col培地：435 mL RPMI1640 、50 mL HS、5 mLのPC/SM液、5 mL Na-

pyruvate （100 mmol/L)、5 mL L-glutamnine （200 mmol/L)播種：4×105 cells/mL for 4+22 h、または3×105 cells/mL を0.5 mL/well (24 well plate）で播種する処理液組成：DMSO使用、735 μL培地+15 μL被験物質液→500 μL使用

生食・水、600 μL培地+150 μL被験物質液→500 μL使用

試験法概略（CytB使用in vitro小核）食薬センター、山影康次

細胞 CHU/IU TK6培地 10%CS添加MEM 10%FBS添加RPMI1640培養容器 6 cm 培養皿 パルス処理：15 mL 培養

チューブ連続処理:25 cm2 フラスコ

細胞計測（例） ・血球計算盤？（共通） ・ベックマンコールター？

毒性評価の方法 Replication Index（RI）＋

処理時間 詳細は略

非代謝活性化28* h 非代謝活性化の場合**

* 1.2×104個/mLの細胞懸濁液とし、5 mL（6×104個）/皿、2日後に実験連続28 h with CytB (3 μg/mL)

** 14×104個/mL 、最終細胞密度：約10×104個/mL、詳細は略

＋ RI =処理群[（2核細胞数＋2x多核細胞数）／全細胞]/対照群 x 100

試験法概略（in vitro小核）ビー・エム・エル 、関 博

細胞 CHU/IU

培地 10%CS添加MEM

培養容器 継代 25 cm2培養フラスコ

処理 6 cm 培養皿

細胞計測（例） ・播種 血球計算盤

・処理 細胞計数-ScepterTM2.0

毒性評価の方法 RICC 相対的細胞数増加

（Relative increase in cell count）

細胞計数装置 ScepterTM2.0 -319-905 PHCC20060 .......... ¥198,000

マイクロピヘット感覚で細胞の計数が可能

わすか50 Lのサンプルで手軽に細胞の濃度管理が可能

計数方式には電気的検知帯法(コールター法)を採用

測定可能細胞数：10,000~500,000個/mL

3-319-901 計測チップ(50枚入)PHCC60050.................... ¥19,800

（株） テックジャム

試験法概略（in vitro小核）武田薬品、橋本 清弘

細胞 TK6 （ATCCより購入）

培地 10%ウマ血清添加RPMI1640

Na-pyruvate 2 mM、PC/SM 100 U/mL final

培養容器 6ウェルプレートに 3 mL/mLの細胞懸濁液

（1×105cells/mLに調整）を播種

細胞計測（例） コールターカウンター

コールターカウンター使用不可の時、血球計算盤

毒性評価の方法 ICHS2Rガイドライン：Relative Population

処理時間 非代謝活性化3 h処理、21 h回復

非代謝活性化24 h処理

試験法概略（in vitro小核）花王、大士

細胞 CHL/IUコメント：ホルミシスにp53が関与している可能性を考えるのであれば、CHLよりもp53コンピテントなTK6細胞が良いかもしれません

培地 MEM with 10%FBS培養容器 6 well plate細胞計測 全自動細胞カウンター TC20 (BioRad社)毒性評価の方法 RICC：Relative increase in cell count

処理時間 代謝活性化 6 h + 18 h回復非代謝活性化 24 h

TC20試料：10 μL哺乳動物細胞を30秒でカウントオートフォーカス付き顕微鏡6～50μmの細胞径の細胞をカウント5X104～1×107 cells/mL の濃度範囲に対応

変異原物質の閾値に関する共同研究の提案

In vitro小核試験の前段階として、用量を決めるこのとき、細胞増殖を指標としたホルミシスを検討する

低用量では有益(+)、高用量で有害（ー）な反応は？

できるだけ簡単な系を用いる・非代謝活性化、連続処理を行う・CHLを用いる（要すればTK6細胞を用いる）・ 細胞播種24時間後に、被験物質で24時間処理した後、

細胞数を数える

自分で最もやりやすい方法を用いる （要議論）・ 播種細胞数の測定（例：血球計算板）・ 細胞増殖の測定(生化学的、コールター、、、）

被験物質として同一MMCを用いる（要議論）

納得のゆくまで実験を繰り返し、濃度を絞り込む

参加希望者/思案中の方

＜2016年6月18日（土）＞8:00～8:30 フリータイムにご参集ください

（場所は追って連絡）

45回JEMSで発表予定ですので、参加希望者は和文・英文の氏名、所属を用意してください

発表は共同研究の趣旨と締め切りまでに得られた予備データなどで適宜、構築します。

A proposal for a collaborative study of thresholds in

mutagenesis and some preliminary supportive data

revealed by cell growth as an indicator

皆様の積極的なご参加を期待します