PRACTICA DEMOSTRATIVA EN PROCESAMIENTO DE MUESTRA Y CONCEPTOS BÁSICOS DE MICROSCOPIA ELECTRÓNICA

PRESENTADO A:Gerardo Andrés Torres Rodríguez

Magister

PRESENTADO POR:Melissa Trujillo Erazo

Carlos Andrés Robles GiraldoAlberto Moncayo Fernández

UNIVERSIDAD DEL CAUCAFACULTAD DE CIENCIAS NATURALES EXACTAS Y DE LA EDUCACIÓN

DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍAPOAPAYAN, CAUCA

2011

PRACTICA DEMOSTRATIVA EN PROCESAMIENTO DE MUESTRA Y CONCEPTOS BÁSICOS DE MICROSCOPIA ELECTRÓNICA

La microscopia electrónica de barrido ha revolucionado el estudio biológico, ya que permite observar la ultraestructura celular tanto animal como vegetal. Basándose en la emisión de electrones a gran velocidad es posible obtener un poder de resolución increíble y una visualización de materiales a escala de nanómetros, sin embargo el tamaño debe ser de un tamaño muy reducido y de espesor manométrico, por lo que es necesario utilizar técnicas muy complejas para preparar una muestra y lograr la mejor precisión posible, son muchos los tipos de preparación y tinción de muestras, en este caso se trabajaran la inclusión en parafina y resina, deshidratación de materiales, tinciones específicas, conservación de estructuras intracelulares, cortes y fijación de preparaciones. Tanto para microscopio electrónico de trasmisión como óptico de investigación.

OBGETIVOS Obtener el conocimiento básico en el procesamiento de muestras

Biológicas para microscopía electrónica.

Observar las diferentes aplicaciones de la microscopía electrónica en investigación en ciencias biológicas.

Estar en capacidad de conocer y diferenciar el Poder de resolución del Microscopio Óptico versus el electrónico y su aplicación en los estudios de la Ultraestructura.

Analizar los diferentes tipos de tinciones y preparaciones de muestras tanto para TEM como Microscopio Óptico de investigación.

METODOLOGIA

La totalidad dela practica se realiza de manera demostrativa, ya que los equipos utilizados necesitan de un grado de preparación o capacitación, también debido al valor y exactitud de los mismos, igualmente el manejo del microscopio electrónico y la preparación de las tinciones es realizado por estudiantes de semestres avanzados y profesores especializados en el tema.

MICROSCOPIO ELECTRONICO DE TRANSMISIÓN (TEM)

Microscopio electrónico de transmisión (TEM, por sus siglas en inglés, o MET, en español), las bases teóricas desarrolladas entre 1931 y 1933 por Ernst Ruska y sus colaboradores, la construcción del primer microscopio electrónico de transmisión en 1939 por Siemens, ocupando el lugar del invento del siglo. El principio fundamental se basa en la teórica cuántica de que los electrones exhiben propiedades tanto de onda y partículas a la vez, Como consecuencia se puede hacer que un haz de electrones se comporte como un haz de radiación electromagnética. En un microscopio electrónico los electrones se producen generalmente en un filamento, normalmente de tungsteno, parecido al de una bombilla, mediante un proceso conocido como emisión termoiónica o bien mediante emisión de campo. Los electrones emitidos se aceleran entonces con ayuda de un potencial eléctrico (medido en V, o voltios) y se focalizan mediante lentes electrostáticas o electromagnéticas, como resultado alcanzan una velocidad similar a la de la luz.

Estructura

Debido a que los electrones tienen una longitud de onda mucho menor que la de la luz visible, pueden mostrar estructuras mucho más pequeñas.

Las partes principales de un microscopio electrónico de transmisión son:

Cañón de electrones: consiste en un filamento de tungsteno o bien una fuente de hexaboruro de lantano (LaB6), conectando dicho cañón a una fuente de alto voltaje (~120kV para muchas aplicaciones) comenzará a emitir electrones hacia el vacío,

Las lentes del magnéticas: permiten realizar la convergencia de los haces y el control del ángulo de la misma. Dicho control se ejerce modificando la cantidad de corriente que fluye a través de las lentes cuadrupolares y hexapolares y permite modificar los aumentos del TEM. La lente cuadrupolar consiste en un conjunto de cuatro bobinas situadas en los vértices de un cuadrado. La lente hexapolar simplemente incrementa el grado de simetría del campo resultante. Típicamente un TEM contiene tres conjuntos de lentes, se denominan respectivamente lentes condensadoras o condensador, lentes de objetivo o simplemente objetivo y lentes de proyección o proyector. Las lentes condensadoras se encargan de la formación inicial del haz tras la emisión de los electrones. Las lentes de objetivo focalizan el haz sobre la muestra y finalmente las lentes de proyección se encargan de expandir el haz reflejado hacia la pantalla de fósforo u otro dispositivo de visualización tal como película. Los aumentos del TEM vienen dados por la razón de las distancias entre la muestra y el plano imagen del objetivo.

Sistema de vacío: Para conseguir el flujo ininterrumpido de electrones, el TEM debe operar a bajas presiones, típicamente en el orden de 10 − 4 a 10 − 8 kPa. La necesidad de esto se debe a dos razones: primero, permitir una diferencia de voltaje entre el cátodo y tierra sin que se produzca un arco voltaico. Segundo, reducir la frecuencia de las colisiones de los electrones con los átomos del aire a niveles despreciables. Ya que el TEM, contrariamente a un CRT, es un sistema que debe permitir la reposición de componentes, la inserción de muestras y, particularmente en modelos antiguos, el cambio de carrete de película, se hace imprescindible la posibilidad de reproducir el vacío regularmente. Por ello los TEMs están equipados con sistemas de bombeo completos y su sellado de vacío no es permanente.

El sistema de planos filmados o visualización: en un TEM puede consistir en una pantalla de fósforo para observación directa por el operador y opcionalmente en un sistema de registro de imágenes tales como película o una retina CCD combinada con una pantalla de fósforo. Normalmente

El microscopio electrónico de transmisión emite un haz de electrones dirigido hacia el objeto que se desea aumentar. Una parte de los electrones rebotan o son absorbidos por el objeto y otros lo atraviesan formando una imagen aumentada de la muestra.

MICROSCOPIO ÓPTICO DE ALTA RESOLUCIÓN

Consiste en una modificación de las piezas ópticas del microscopio óptico corriente, mejorando el poder de resolución ya sea mediante la utilización de un haz de luz más brillante, mejora en la calidad de resolución de los objetivos al modificar la estructura molecular de las lentes, evitando la menor absorbancia de luz posible, otro sistema agregado consiste en lentes que focalizan la imagen evitando la difracción de la misma mejorando el poder de resolución, por último, una cámara de fotográfica instalada en la parte superior capta la imagen y la trasfiere a una computadora para mejoras aún más la nitidez, contraste, tono, eliminando el exceso de colorante de la fotografía, es básicamente una herramienta como Photoshop, Corel Photo-Paint, entre otras.

COMPARACION DE CARACTERISTICAS ENTRE TEM Y OM-HD

El gran poder de resolución del TEM

Como toda la materia, los electrones exhiben propiedades tanto de onda como de partícula (como ya propuso Louis-Victor de Broglie. Como consecuencia se puede hacer que un haz de electrones se comporte como un haz de radiación electromagnética. La longitud de onda del electrón se obtiene igualando la ecuación de De Broglie a la energía cinética de un electrón. Debe introducirse una corrección relativista adicional, ya que los electrones en un equipo TEM alcanzan velocidades próximas a la de la luz c.

El haz de electrones está formado de una de las partículas más pequeñas conocidas, por lo que el límite de resolución del TEM, teóricamente llega hasta el nivel cuántico, es decir los átomos y el especio entre ellos. Actualmente ya se alcanzó dicho límite de observación con el microscopio más avanzadado del mundo (Titan 80-300 Cubed), su poder de resolución es tal que logra ver el espacio entre átomos, se habla de una resolución cercana a 10-10 nm. Sin embargo, nuevas investigaciones hablan de la generación de microscopios “fuerza jet” los jet son partículas del átomo mucho más pequeñas que el electrón a una escala de picometros (10-12 nm) la obtención de dichas partículas se logra mediante la colisión de electrones a velocidad de la luz, por lo que ofrece una posibilidad de ver el interior de un átomo.

Grafica de comparación tamaños de partículas atómicas: Elaborada con Corel-Draw x3 2000.

TECNICAS DE FIJACIÓN, INCLUSIÓN Y PREPARACIÓN DE MUESTRASMICROSCOPIO ELECTRONICO DE TRANSMISIÓN (TEM)

Fijación: Consiste en la aplicación de sustancias a los tejidos para proporcionarles rigidez, preservación de estructuras internas y externas y en algunos casos servir de tinciones. La mayoría de las sustancias utilizadas son orgánicas, pero de carácter toxico e incluso cancerígenas; se dividen en fijadores simples y mezclas fijadoras:

Fijadores simples

Alcohol etílico: Fija por deshidratación en 70 y 90°.Es un buen elemento para preservar moléculas, como ciertas enzimas, propiedades antigénicas, glucógeno, pigmentos y para las extensiones citológicas, se puede utilizar como persevante de muestras, tiene inconvenientes como endurecimiento y retracción de tejidos, carece de efecto mordiente.

Etanol: CH3-CH2-OH

Ácido acético: Su proceso de fijación consiste en cambiar el estado coloidal de las proteínas, se utiliza en concentraciones que van desde 1 y 5° es un fijador ideal para ácidos nucleico y nucleoproteínas, sin embargo cabe destacar la destrucción de las mitocondrias y mala fijación de membranas y citoplasma.

Ácido acético: CH3COOH

Acido pícrico: La fijación produce sales de tipo picrato que coagulan las proteínas, se suele usar en concentraciones de 2% en soluciones de ácido pícrico. Preserva bien la estructura celular, no produce retracciones cuando el tiempo de fijación es óptimo, preserva bien glucógeno y lípidos. Es un buen fijador para tinciones generales puesto que favorece la unión de los colorantes. Hay que eliminarlo completamente antes de proceder a la inclusión en ceras como la parafina.

Ácido pícrico: C6H2OH(NO2)3

Formaldehido: Actúa mediante la formación de puentes entre las moléculas tisulares. Se utiliza a concentraciones próximas al 4 %. Es un fijador ampliamente usado por la buena preservación del tejido, actúa como conservante, produce poca retracción tisular, es un buen fijador para lípidos, es compatible con la mayoría de las tinciones histológicas, incluidas las de inmunocitoquímica e hibridación de ácidos ribonucleicos. Normalmente se usa en solución tamponada e isotónica.

Formaldehído: CH2=O

Glutaraldehído. Forma puentes entre las moléculas de los tejidos. Se usa a una proporción de entre el 0,5 y el 3 %. Tiene una alta capacidad para preservar la estructura celular, por lo que es el fijador de referencia para observación de ultraestructura celulares con el microscopio electrónico. Pero hay que tener cuidado con su baja penetración tisular y puede producir retracciones. Se usa en soluciones tamponadas isotónicas.

Glutaraldehído.

Tetróxido de osmio. Forma puentes entre moléculas. Se emplea al 1 % en soluciones tamponadas. Es buen fijador de la ultraestructura de la célula por lo que se emplea habitualmente para las observaciones con el microscopio electrónico. Es un buen fijador para grasas y membranas celulares. Por su fuerte carácter oxidante no se usa para tinciones convencionales, excepto para las impregnaciones argénticas como el método de Golgi.

Tetróxido de osmio. OsO4.

Mezclas fijadoras

Son mezclas que se utilizan para fijar varios tejidos o estructuras a la vez mediante la aplicación de una sola mezcla compuesta de varios fijadores o utilizadas sucesivamente en el tiempo.

Líquido de BOUIN: Está formado por ácido pícrico, formaldehído y ácido acético glacial. Es una solución muy utilizada para el procesamiento de tejidos que se incluirán en parafina (ver capítulo de inclusión) y a cuyas secciones se le pueden aplicar un amplio espectro de tinciones. Es muy útil para tejidos blandos y embriones, y preserva bien el núcleo y el glucógeno. Hay que tener cuidado con el tiempo de fijación, que no debe exceder de 48 h en el caso de fijaciones por inmersión. Tras la fijación las muestras de tejido se pueden conservar en alcohol de 70°. No está recomendado para el riñón ni para el estudio de mitocondrias. Antes de la inclusión en parafina es conveniente eliminar el ácido pícrico

mediante lavados en alcohol de 70° porque puede hacer que no se produzca una buena inclusión o que las tinciones no sean adecuadas.

Karnoy: Es un buen fijador para el glucógeno, para los hidratos de carbono simples y para las proteínas fibrosas. Es bueno para visualizar los ácidos nucleicos, aunque no la morfología nuclear, y para los grumos de Nissl del sistema nervioso. Puede producir retracciones tisulares. Está formado por etanol absoluto 60 %, cloroformo 30 % y ácido acético glacial 10 %.

Mezclas con formaldehído: El formaldehído es quizá el fijador más usado hoy en día, tanto para técnicas histológicas rutinarias como para otras como la inmunocitoquímica o la hibridación de ácidos nucleicos. Lo más frecuente es utilizarlo en solución al 4 % junto con otros fijadores. Por ejemplo, el Bouin. Se suelen disolver en soluciones tamponadas que tienen una osmolaridad similar a la del tejido que se pretende fijar. Para fijaciones de tejidos destinados a microscopía electrónica se suelen utilizar soluciones fijadoras que contienen formaldehído y glutaraldehído. La función del formaldehído es iniciar una fijación rápida, por su mayor capacidad de penetración, mientras que el glutaraldehído realizará una fijación más poderosa, pero más lenta que afectar a la estructura tisular puesto que el formaldehído ya ha realizado una fijación previa.

Glutaraldehído-tetróxido de Osmio: Los fijadores en combinación no tienen necesariamente que usarse al mismo tiempo. Es habitual que los tejidos destinados a microscopía electrónica sean inicialmente fijados en glutaraldehído (1 al 3 %) y para formaldehído (2 al 4 %), para posteriormente ser postfijados en tetróxido de osmio al 1 % en solución tamponada. Este último es un buen preservador de la ultraestructura celular, sobre todo membranas, en cooperación con los aldehídos. Esto es importante porque el proceso para microscopía electrónica supone incubar el tejido en solventes orgánicos y polimerización de resinas a 60 °C, durante las cuales el tejido debe ser preservado.

La Inclusión: Es el método más común de endurecer el tejido y consiste en infiltrar la muestra con sustancias líquidas que tras un proceso de polimerización o enfriamiento se solidifican, sin afectar a las características del tejido. Cuando se quieren hacer secciones para su observación con el microscopio óptico los medios de inclusión más frecuentemente usados son la parafina o la celoidina, mientras que si vamos a realizar observaciones con el microscopio electrónico la inclusión se realiza con resinas, principalmente de tipo acrílicas o epoxy. La mayoría de las sustancias utilizadas en la inclusión son hidrosolubles por lo que no afectan la estructura, luego si queremos que la sustancia en la que vamos a incluir ocupe todo el tejido tenemos que eliminar el agua y sustituirla por un líquido miscible con nuestro medio de inclusión, esto con el objetivo de eliminar posibles zonas no accesibles a las resinas y ocasionar un deterioro interno.

Imagen tomada de: http://webs.uvigo.es/mmegias/6-tecnicas/2-inclusiones.php

Inclusión en resina: Para la observación de la ultraestructura celular es necesario hacer secciones de tejidos muy delgados denominados ultrafinas, del orden de nanómetros, y usar un microscopio electrónico de transmisión, por lo que se debe incluir el material en sustancias muy duras como los son las resinas epoxy y en menor medida las acrílicas como el metacrilato, ambas se infiltran en el interior del tejido y luego se polimerizan conservando la ultraestructura celular. Primero se realiza la fijación con glutaraldehido y una postfijación con tetróxido de osmio, aseguramos una fuerte fijación para preservar la ultraestructura celular y que no perderemos los lípidos que forman las membranas celulares durante el proceso de inclusión, gracias al tetróxido de osmio. Se corta las muestras en pequeños bloque de 2mm, deshidrata la muestra con alcoholes en degradación creciente hasta alcohol 100°, la polimerización se realiza a 60°C y se le añaden aceleradores y plastificadores para aumentar la dureza.

Imagen tomada de: http://webs.uvigo.es/mmegias/6-tecnicas/2-inclusionenresina.php

Congelación: De los tejidos previamente fijados permite la obtención de secciones que pueden ir desde unas 50 µm hasta nm, para lo que se utilizan diferentes aparatos: microtomo de congelación para secciones de decenas de µm, criostato para secciones de entre 5 y 20 µm y ultracriotomo para secciones ultrafinas del orden de nm. Para evitar los daños que se producen durante los procesos de congelación, formación de cristales de hielo que nos agujerean los tejidos, se han de tener en cuenta dos procesos: a) Anticongelantes que impidan la formación de cristales. El crioprotector más usado es la sacarosa al 30 %, aunque también se usa el dimetil sulfóxido, el glicerol, etilén glicol y otros. La elección de uno u otro depende del tipo de muestra y de la técnica que se vaya a usar. b) Una congelación lo más rápida posible, por ejemplo, con nitrógeno líquido. Cuanto más rápida es la congelación menores son las dimensiones de los cristales de agua formados.

El corte de materiales se realiza en el ultramicrotomo se corta material incluido en resinas y se obtienen secciones del orden de nanómetros de grosor, para observar con el microscopio electrónico de transmisión.

Ultracriotomo: Su uso no está muy extendido pero se suele emplear cuando se necesitan secciones del orden de nanómetro de material que no se debe incluir, para observar con el microscopio electrónico de transmisión.

TECNICAS DE FIJACIÓN, INCLUSIÓN Y PREPARACIÓN DE MUESTRASMICROSCOPIO OPTICO DE ALTA RESOLUCIÓN (OM-HR)

La mayoría de las muestras para microscopio óptico no necesitan una fijación o postfijación, sin embargo si es necesario algún tipo de coloración, la rigidez del material esta proporcionado por la parafina por lo que se facilita su manipulación y corte.

Tinciones: Existen muchísimas técnicas de tinción para microscopia óptica, su importancia radica en la especificad, para teñir los diferentes componentes de la célula animal como vegetal. La mayoría de las técnicas se basas en la capacidad que tiene los metales en oxidarse dejando rastros visibles en la estructura molecular de las células, también algunas bases y ácidos proporcionan coloración a macromoléculas y compuestos biológicamente importantes. En este caso se trabajara con el Alcian Blue y Lugól, dos de las más utilizadas a nivel de investigación de tejidos vegetales.

Alcian Blue: Es un grupo de polivalentes colorantes básicos que son solubles en agua. El color azul se debe a la presencia de cobre en la molécula. La solución al 3% de ácido acético (pH2.5), Alcian blue identifica tanto compuestos sulfatados y mucopolisacáridos carboxilado ácido y sulfatado y carboxilado sialomucinas (glicoproteínas). Se cree que forman los vínculos con la sal grupos ácidos de mucopolisacáridos ácidos. En los tejidos vegetales tiñes las paredes celulares, esporangios y algunos tejidos.

Lugól: Es un compuesto de alcoholes secundarios y algunas bases, por lo que tiende a reaccionar con la cromatina tiñendo los núcleos de la célula, también la membrana plasmática

El corte de la muestras de realiza en un micrótomo, se obtienen secciones de 5 a 20 µm de grosor, para observar con el microscopio óptico. Vibratomo: Corta material no incluido, aunque sí fijado o duro, en secciones de 30 a centenares de µm de grosor, para observar con el microscopio óptico. Microtomo de congelación: Con él se consiguen secciones de 30 a unas 100 µm de material congelado para su observación con el microscopio óptico. Criostato: Consigue secciones a partir de material congelado y se obtienen grosores de 10 a 40 µm, para observar con el microscopio óptico.

Luego de cortado el material, se coloca el corte en agua tibia, por la densidad de la parafina tiende a flotar, la parafina se funde dejando la muestras intacta, la cual es tomada con un portaobjetos y se adhiere al mismo, finalmente se procede a la observación.

Inclusión en parafina: Para la observación de materiales en el microscopio óptico se utiliza, la parafina y en menor volumen la celoidina. La parafina es un compuesto saturado de hidrocarburos que le otorgan un estado sólido con un punto de fusión entre 40 y 70° por lo que en lo preferible se debe utilizar con un punto superior o igual a 60°, la parafina es inmiscible con el agua por lo que se debe primero remplazar el agua con algún solvente orgánico, en este caso es el etanol, el proceso se lleva a cabo por deshidratación en alcoholes, en degradación creciente hasta alcohol 100°, luego se trasfiere la muestras hasta una solución intermedia inmiscible a el alcohol y el agua, por lo que se utiliza benceno, xileno o tolueno, que a las vez actúan como aclarante, por lo que nos podemos cerciorar de la penetración total de la sustancia en el material. No se debe deja mucho tiempo en la solución intermedia ya que el xileno o tolueno, endurecen demasiado y ocasionaría problemas a la hora de realizar el corte.

Imagen tomada de: http://webs.uvigo.es/mmegias/6-tecnicas/2-inclusionenparafina.php

Corte de muestras

Las características tisulares y celulares microscópicas internas se observan con microscopios ópticos o electrónicos de transmisión (excepto si queremos ver superficies, para lo que usamos el microscopio electrónico de barrido). Con estos aparatos sólo se pueden observar grosores muy pequeños de tejido por problemas de difusión y penetración de la luz en el caso de los microscopios ópticos y de penetración de los electrones en el caso del microscopio electrónico de transmisión. Por tanto tenemos que hacer secciones de los tejidos que queremos estudiar, que pueden ir desde un grosor de unos cuantos nanómetros hasta centenares de micras. Algunos tejidos como los vegetales, por sus características celulares, permiten su observación en secciones de cientos de micras. Como hemos mencionado en los capítulos anteriores, podemos decir que cuanto más delgada queramos hacer una sección de tejido más endurecido ha de estar dicho tejido. La dureza de los tejidos depende de sus características (por ejemplo, las paredes celulares hacen a los vegetales tejidos duros), de la fijación que hayamos realizado y sobre todo del material en que hayamos incluido dicho tejido. Una manera más directa de endurecer el tejido es mediante congelación.

Los aparatos mecánicos para hacer secciones de un grosor de micrómetros se denominan microtomos y existen diferentes tipos según el grosor que queramos conseguir en nuestras secciones, el medio de inclusión en el que se encuentre el tejido o si se ha endurecido por congelación o por inclusión. Los aparatos utilizados para cortes ultrafinos se denominan ultramicrotomos, sus cortes se miden a escala de nanómetros.

Micrótomo para parafina: Los cortes están medidos a escala de micrómetros, funciona mecánicamente o accionado por algún sistema eléctrico, para mejorar la calidad del corte.

Ultramicrotomo: Su exactitud de corte es posible gracias a un sistema piezoeléctrico que desplaza la cuchilla de corte en nanómetros, las cuchillas varían en cuanto a la dureza del material que se pretende cortar y van desde diamante, tungsteno y vidrio templado.

Conclusiones

La microscopia electrónica de transmisión ofrece hasta un millón de veces más resolución que la microscopia óptica.

La inclusión de un material biológico en un resina o polímeros de alta densidad permite realizar cortes muy preciosos y una mejor conservación de muestras biológicamente importantes

BIBLIOGRAFIA

Le´muis,Ronald. Medical-histology, editorial, Leconte, parís, Francia, 2001, pág. 123, 124, 127,223.

http://ussc.org/histology/tecnicasytienciones/alcainblue,lugol/composicionesycaracteristicasespecificas.hkk5php

http://wikipedia/microscopioelectronicodetransmision/estructurayfunciones/hdpp23ff

http://webs.uvigo.es/mmegias/6tecnicas/inclusionesenparafina,resinaycortedemuestras.php