FACULTAD DE CIENCIAS Y FILOSOFÍADEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA, BIOLOGÍA MOLECULAR Y FARMACOLOGÍA

SECCION BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR

PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

PRÁCTICA 3: BUFFERS

TAMPONES O BUFFERS:

a) Ácidos y bases : La comprensión de los conceptos de ácido y base es esencial para el entendimiento de las propiedades biológicas y del comportamiento bioquímico de las moléculas orgánicas. Las macromoléculas poseen características fisicoquímicas que son muy importantes en la homeostasis; por ejemplo: las cargas eléctricas son importantes en las catálisis enzimáticas, así como en la estabilidad de las proteínas y ácidos nucleicos.

En general, se define un ácido como un donador de protones y una base como un aceptor de protones.

b) Constante de disociación: En sistemas cerrados todas las reacciones químicas son reversibles y en la naturaleza muchas de ellas lo son. Los productos formados por los reactantes reaccionan para dar nuevamente origen a los reactantes originales esto ocurre incluso cuando los reactantes están formando más productos. Luego de cierto tiempo las reacciones directa e inversa ocurrirán a la misma tasa. Cuando esto ocurre, se dice que la reacción ha alcanzado el equilibrio y éste se designa como Keq.

Un donador de protones y su aceptor de protones correspondiente conforman un par conjugado acido-base. El Acido acético, un donador de protones y el anión acetato, su aceptor de protones correspondiente constituyen por ejemplo un par conjugado relacionado por la siguiente reacción:

CH3COOH ==== H+ + CH3 COO-

Cada ácido tiene una tendencia característica para perder sus protones en solución acuosa. Cuanto más fuerte el ácido, mayor la tendencia a perder su protón. La tendencia de cualquier ácido (HA) a perder su protón y formar su base conjugada (A-) está definida por la constante de disociación (Ka) para la reacción reversible:

HA === H+ + A-

La cual es:

La constante de equilibrio para las reacciones de ionización se llama constante de disociación, y se designa como:

KaLas constantes de disociación de algunos ácidos se muestran en la siguiente figura:

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c) Tampones, Buffers o Amortiguadores : El buen funcionamiento de los sistemas biológicos requiere de un control estricto del pH. Las enzimas son bastante sensibles a cambios de pH; tienen una actividad enzimática máxima a un pH característico llamado óptimo fuera del cual su actividad se ve afectada notablemente. Los organismos tienen un control muy estricto de pH; por ejemplo, la regulación del pH del suero (pH sérico) es necesaria para la supervivencia; el organismo mantiene el pH sérico en el rango de 7,4 +/- 0,4. Valores de pH fuera de este rango pueden ser perjudiciales para el organismo.

Un tampón es una solución que ante la adición de cantidades pequeñas de H+ o de OH- se resiste a cambios dramáticos de pH. Los tampones comunes están formados por dos sustancias: un ácido y su base conjugada:

Si tomamos el logaritmo de la constante de

disociación descrita mas arriba: Ka: log Ka = log H+ + log A- - log HA

Reordenando: log H+ = log Ka - log A- + log HA

Multiplicando por -1: -log H+ = -log Ka + log A- - log HA

De donde: pH= pKa + log A- / HA

Que en su forma general es: pH = pKa + log Aceptor de protones

Donador de protones

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Esta es la ecuación de Henderson-Hasselbalch, y permite calcular la relación molar entre una sal y un ácido que forman parte de un tampón para un pH y pK determinados.

Una solución buffer o tampón puede consistir en un acido débil y su sal (pH de 1 -7) o una base débil y su sal (pH 7-14) dependiendo del pH deseado para la solución buffer. La clave para comprender la acción de un buffer es recordar que un acido débil (o base débil) solo está disociada en una proporción muy pequeña mientras que las sales están completamente disociadas. La combinación resultante del ácido débil y su sal completamente disociada resulta en una solución tampón con el ácido mayormente en su forma molecular, una gran proporción del ión común de la sal y una pequeña proporción del ión H+. Podemos ignorar la gran proporción del ión positivo de la sal.

d) Las curvas de titulaci ó n revelan el pKa de los ácidos débiles .La titulación se usa para determinar la cantidad de un ácido en una solución dada. Un volumen medido de un ácido es titulado con una solución de una base fuerte de concentración conocida. La base es añadida en pequeños incrementos hasta que el ácido es consumido (neutralizado) comprobando esto con un indicador o pHmetro. La concentración original del ácido puede ser calculada a partir del volumen y concentración de la base usada.

PROBLEMAS

1. Si el pKR del ácido acético (CH3-COO-) es 4.8, y el de la metil amina (CH3-NH3+) es

10.6, ¿cómo explica que el pK1 (COO-) de la glicina sea 2.34 y el pK2 (NH3+) sea

9.60?

2. ¿Cuáles son las concentraciones de ácido acético y acetato en un tampón acetato 0,2M, pH 5,0? El Ka para el ácido acético es 1,7 x 10-5.

3. Suponga que prepara un tampón a partir de un ácido débil 0.10 M y una sal de sodio 0.10 M. Asuma que el pKa es 3,0. ¿Cuál es el pH del tampón?

4. El plasma sanguíneo contiene carbonatos (fundamentalmente HCO3- y CO2) en

concentración 2,52 x 10-2M.

¿Cuál es la relación HCO3-/CO2 y la concentración de cada uno a pH 7.40?

¿Cuál será el pH si se añade un ácido 10-2M en condiciones en las cuales el incremento de CO2 no puede ser liberado?

5. Teniendo en cuenta los valores de pK del fosfato, ¿cuánto cambiará el pH de 50 ml de una solución de fosfato 0.02M, pH 7.5 si le agregamos 1 ml de HCl 0.05N?

6. A UD le encargan preparar buffer fosfato 150 mM, pH 7.5 pero para hacerlo sólo tiene NaH2PO4 0.1M y una solución de NaOH 0.1N. ¿Cuál será el volumen que requiere de ambas soluciones?

7. Teniendo en cuenta los valores de pK del fosfato, ¿cuánto cambiará el pH de esta solución si le agregamos 1 ml de HCl 0.05N?

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8. ¿Cuál será el volumen que se requiere de Na2HPO4 0.2M y de HCl 0.05N para preparar 50 ml de buffer fosfato 0.1M, pH 7.5?

9. Teniendo en cuenta los valores de pK del fosfato, ¿cuánto cambiará el pH de esta solución si le agregamos 1 ml de NaOH 0.1N?

10. Si el pH del agua es 7.0, ¿cuál es el pH de 50 ml de agua luego de habérsele adicionado 1 ml de HCl 0.05N?

11. Si el pH del agua es 7.0, ¿cuál es el pH de 50 ml de agua luego de agregársele 1 ml de NaOH 0.1N?

12. ¿Cuáles son las diferentes especies iónicas que tiene la Glicina? a los siguientes pHs: 1, 2.34, 6, 9.6 y 12.

13. ¿Cuáles son las diferentes especies iónicas que tiene la Lisina? a los siguientes pHs: 1, 2.2, 8.95, 10.53 y 12.

14. Cuáles son las diferentes especies iónicas que tiene el Acido aspártico? a los siguientes pHs: 1, 1.9, 3.6, 7, 9.6 y 12.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

1. Preparar 100ml de una solución de tampón fosfato 0.02M, pH 7.5 a partir de una solución de Na2HPO4 0.1M y una solución de NaH2PO4 0.05M. Medir el pH en el potenciómetro. Separar en dos beakers de 50ml. Preparar otros dos beakers con 50ml de agua destilada.

En el Beaker 1:a) Agregar 1ml de HCl 0.1N al tampón fosfato. Medir nuevamente el pH. b) Medir el pH de 50ml de agua destilada. Agregar 1ml de HCl 0.1N al agua y nuevamente medir el pH.En el beaker 2:c) agregar 1 ml de una solución de NaOH 0.1N, al tampón fosfato mezclar y medir el pH d) Agregar 1ml de NaOH 0.1N al agua y nuevamente medir el pH.

2. En los beakers conteniendo el tampón fosfato del ejercicio anterior seguir agregando según corresponda 1ml de HCl 0.1N ó NaOH 0.1N , al tampón fosfato mezclar y medir el pH luego de cada ml. Repetir 10 veces.

3. Medir el pH de una solución NaH2PO4 0.1M. Conociendo el pK de fosfato, ¿cuál será la relación ácido base que existe en esta solución para que tenga el pH que usted ha medido?

Cuestionario e informe

1) Indique las reacciones involucradas en cada experimento.

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2) Efectúe los cálculos para la determinación de las cantidades a usarse de las diferentes soluciones.

3) Anote las lecturas obtenidas en el potenciómetro.

4) ¿Cómo reaccionaron las soluciones tampón al añadírseles ácido o base?¿Cómo cambió el pH?

5) ¿Cambió el pH del agua al añadírsele HCl o NaOH?

6) ¿Fue la respuesta del tampón a la adición de ácido o base, igual a la respuesta del agua?

7) Grafique la respuesta del buffer ante la adición de diferentes cantidades de ácido o base (ejercicio 2)

Ionizaciones del ácido fosfórico

H3PO4 + H2O H2PO4–

+ H3O+ 1° ionizaciónH2PO4 + H2O HPO4

–2 + H3O+ 2° ionización

HPO4-2 + H2O PO4-3 + H3O+ 3° ionización

Acido fosfórico Constante de ionización pKac

1° ionización K1 = 1,1 x 10-2 1,962° ionización K2 = 1,57 x 10-7 6,823° ionización K3 = 3,6 x 10-13 12,44

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